CN102030828B - 一种高亲和力的CTLA4-Ig融合蛋白突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有高亲和力的CTLA4-Ig融合蛋白突变体和其在制备治疗免疫排斥反应或者自身免疫性疾病药物中的用途。所述突变体包括CTLA-4膜外区的下述任何一个或多个氨基酸位点上的氨基酸取代。这些突变体与Abatacept相比具有更高的亲和力活性,能够更加有效的阻断共刺激因子对T细胞的激活。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程产品领域,更具体地,本发明公开了一种具有高亲和力的CTLA4-Ig融合蛋白突变体和其在制备治疗免疫排斥反应或者自身免疫性疾病药物中的用途。
背景技术
CTLA-4,即细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T Lymphocyte associate Antigen-4,又称CD152),是表达在活化T细胞表面的标志性分子之一。研究表明,该分子是维持体内T细胞稳定性的负调控因子,具有抑制活化T细胞增值的功能,与CD28构成了一对十分重要的免疫调节因子。目前,它被作为免疫抑制受体进行了广泛的研究,在临床上有可能作为抑制免疫排斥反应的制剂进行应用。
T细胞、抗原提呈细胞表面参与产生共刺激作用的分子统称为共刺激分子。目前公认最重要的共刺激通道为B7-CD28共刺激通路。B7位于抗原提呈细胞,与T细胞表面的CD28分子结合可以产生共刺激。当T细胞激活后,其细胞表面会出现另外一种可以与B7细胞结合的分子CTLA-4。CTLA-4与B7的亲和力很高,该分子与B7细胞结合后可以诱导B7细胞的调亡。因此目前认为它对T细胞激活有负调节作用,对于维持人体内免疫状态的平衡起重要作用。
CTLA-4是一种极性跨膜蛋白。将这种蛋白的膜外可溶性部分与抗体分子的Fc片段的编码区融合在一起构成的融合基因sCTLA4-Ig,插入适当的载体,导入适当的细胞后可以得到一种天然不存在的融合蛋白,它既有细胞表面受体预期原有配体结合的能力,又有抗体分子一样的可溶性。CTLA4-Ig融合蛋白半衰期和抗体分子接近,保持活性时间比较长。利用人源基因获得的蛋白分子在体内不会引起免疫反应。目前已经由多种类似的可溶性融合蛋白质被制备出来并成功地用于临床。CTLA-4的可溶性受体可以竞争性地与B7分子结合,而且其对B7的亲和力远远大于CD28,因此可以明显地抑制B7-CD28通道。
CTLA4-Ig融合蛋白也可以用于一些自身免疫性疾病的治疗。例如,类风湿关节炎是一种慢性自身免疫性疾病,它能引起关节炎症和畸形。同时也能引起周身系统性疾病,例如血管炎、身体局部出现类风湿性皮下小结、肺部疾病、血液紊乱和骨质疏松症。类风湿关 节炎是一种渐进发展的风湿性疾病,在发达国家中病人比例大概占2%。这种疾病的特点是持续不断的关节膜炎,破坏软骨和造成骨侵蚀,进而导致关节接合处外周发生结构性畸形。类风湿关节炎的症状包括关节肿胀、炎症、晨僵和疼痛。最终严重患者发展为结构性损坏,包括伴随骨侵蚀的关节损伤(Principals of Internal Medicine,Harrison,13.sup.thedition,pages 1648-1655)此外,患者呈现出其他各种器官损伤的并发症,包括皮肤、肾脏、心脏、肺、中枢神经系统和眼睛的损伤。
类风湿性关节炎被认为是一种T细胞介导的自身免疫病,其中涉及T淋巴细胞与抗原提呈细胞间的抗原非特异性相互作用。总体上说,T细胞的反应程度主要取决于T细胞表面分子与其配体相互作用所引导的共刺激反应。(Mueller,et al.,1989Ann.Rev.Immunol.7:445-480)关键的共刺激信号主要是由T细胞表面受体CD28和CTLA-4以及位于抗原提呈细胞上的配体,例如B7相关分子CD80和CD86决定(Linsley,P.and Ledbetter,J.1993Ann.Rev.Immunol.11:191-212)。
T细胞激活过程中缺少共刺激因子会导致无能T细胞反应(Schwartz,R.H.,1992 Cell71:1065-1068),使其不再对刺激发生反应。由于类风湿关节炎被认为是T细胞介导的免疫系统疾病,其中一种治疗策略是开发新的试剂用来阻断内源性的CD28或者CTLA-4与B7的结合。Abatacept由施贵宝公司开发,已经获得批准在美国用于治疗对抗TNFα治疗无效的类风湿性关节炎的病人。Abatacept是可溶性的CTLA-4分子与抗体Fc的融合蛋白,通过与内源性的CTLA-4受体分子竞争,阻断共刺激信号。Belatacept同样是由施贵宝公司开发,与Abatacept仅仅具有两个氨基酸的不同。
由于CTLA4-Ig融合蛋白的药理作用是通过竞争阻断共刺激因子对T细胞的激活,因此,如果开发出具有更高亲和力的CTLA4-Ig融合蛋白,不但可以显著提高抑制活性,更加有效的阻断共刺激因子对T细胞的激活,同时还可以降低使用剂量,降低治疗成本。
发明内容
本发明的申请人进行了大量的实验,采用基因工程技术构建了多种具有高亲和力的CTLA4-Ig融合蛋白突变体。这些突变体与Abatacept相比具有更高的亲和力活性,能够更加有效的阻断共刺激因子对T细胞的激活。高亲和力的CTLA4-Ig融合蛋白突变体可用于制备治疗免疫排斥反应或者自身免疫性疾病药物,与Abatacept相比,可以降低使用剂量,降低治疗成本。
本发明公开了:
1,一种高亲和力的CTLA4-Ig融合蛋白突变体,其特征在于所述突变体包括如SEQ ID NO:2所示的CTLA-4膜外区的下述任何一个或多个氨基酸位点上的氨基酸取代,所述位点为第29、61或104位氨基酸的位置。
2,上述的突变体,其特征在于所述一个或多个氨基酸位点上由脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸或丝氨酸取代。
3,上述1或2所述的突变体,其特征在于所述突变体的亲和力与Abatacept相比提高至少2倍。
4,上述3所述的突变体,其特征在于所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:6,7,11,13,15,16,18,19或20之一。
5,上述1或2所述的突变体,其特征在于所述突变体的亲和力与Abatacept相比提高至少4倍。
6,上述5所述的突变体,其特征在于所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:6,7,16,18,19或20。
7,上述1或2所述的突变体,其特征在于所述突变体的亲和力与Abatacept相比提高至少10倍。
8,上述7所述的突变体,其特征在于所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO 20。
9,一种制剂,含有上述1至8任一所述的突变体和可药用的载体。
10,上述1至9任一所述的突变体或其制剂在制备治疗免疫排斥反应或者自身免疫性疾病药物中的用途。
11,上述10的用途,其中自身免疫性疾病为类风湿关节炎。
更具体地,本发明的申请人通过大量实验,首先构建了CTLA-4膜外区基因和Fc区基因,然后将CTLA-4膜外区基因和Fc区基因融合表达、纯化,获得CTLA4-Ig融合蛋白。根据图1所示的氨基酸突变位点,采用overlapPCR的方式对CTLA4-Ig突变体进行构建,其构建与表达、纯化的方法与未突变的原本CTLA4-Ig融合蛋白相同。所述CTLA4-Ig突变体包括CTLA-4膜外区的下述任何一个或多个氨基酸位点上的氨基酸取代,所述位点为第29、51、53、61、95或104位氨基酸的位置,取代氨基酸为脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或丝氨酸。
对于本发明,任何合适的真核表达载体都可以使用,这些载体可以为pcDNA3.1(+),pDR1,pDHFF之一。
本发明的申请人对上述CTLA4-Ig突变体进行了biacore鉴定,实验结果表明,申请 人构建的原本CTLA4-Ig融合蛋白的亲和力与Abatacept的亲和力相似。相对于未突变的原本CTLA4-Ig融合蛋白或市售的Abatacept,提高亲和力程度较高的单点突变体为:第29位脯氨酸或赖氨酸取代(D29Y或D29K)的突变体,亲和力提高了约4倍;第61位脯氨酸取代(D61Y)或第104位谷氨酸或丝氨酸取代(D104E或D104S)的突变体,亲和力至少提高了2倍。提高亲和力程度较高的单点组合突变体为:第29位脯氨酸和第61位脯氨酸同时取代(D29Y,D61Y)的突变体,第61位脯氨酸和第104位谷氨酸同时取代(D61Y,D104E)的突变体,第29位脯氨酸和第104位谷氨酸同时取代(D29Y,D104E)的突变体,上述三个两单点组合突变体的亲和力提高了至少4倍;第29位脯氨酸、第61位脯氨酸和第104位谷氨酸三单点组合取代(D29Y,D61Y,D104E)的突变体亲和力提高最大,至少提高了18倍。
以上实验结果说明,高亲和力的CTLA4-Ig融合蛋白突变体,其最佳突变位点为第29,61或104位氨基酸位点,最佳取代的氨基酸为脯氨酸或谷氨酸。并且,多个单点组合突变体的亲和力要高于单点突变体。
本发明公开上述CTLA4-Ig融合蛋白突变体,可以和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效,制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂,优选水针或冻干制剂,对于本发明公开的上述CTLA4-Ig融合蛋白突变体的水针或冻干制剂,药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合,其中表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80);poloxamer(如poloxamer 188);Triton;十二烷基硫酸钠(SDS);月桂硫酸钠;十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸;Pluronics;MONAQUATTM等,其加入量应使CTLA4-Ig融合蛋白突变体颗粒化趋势最小,溶液稳定剂可以为糖类,包括还原性糖和非还原性糖,氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸,醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合,溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态,等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一,缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之。
上述制剂为包含CTLA4-Ig融合蛋白突变体的组合物,在对包括人在内的动物给药后,阻断共刺激因子对T细胞激活的效果明显。具体来讲,CTLA4-Ig融合蛋白突变体通过负调节T细胞激活作用,对治疗免疫排斥反应或者自身免疫性疾病有效,可以作为治疗上述疾病的药物使用。
本发明中CTLA4-Ig融合蛋白突变体及其组合物在对包括人在内的动物给药时,给药 剂量因病人的年龄和体重,疾病特性和严重性,以及给药途径而异,可以参考动物实验的结果和种种情况,总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是0.1~3000mg/天。
附图说明
图1.CTLA-4膜外区核苷酸序列和氨基酸序列。图中第一行序列表示CTLA-4膜外区的碱基序列,第二行序列表示氨基酸序列。其中有下划线的地方表示构建突变体的突变点,其碱基序列上对应的是其序列号。
图2.biacore检测Abatacept及CTLA4-Ig突变体。不同突变体按照相同浓度,等倍比稀释在50μl/min流速和25℃环境下进行检测。图中所示为,不同CTLA4-Ig突变体在相同浓度下的sensorgram图。WT,表示未突变的原本CTLA4-Ig融合蛋白。
具体实施方式
以下实施例仅对本发明进行进一步的说明,不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述,如那些用于构建载体和质拉的方法,将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的,并且在许多出版物中都有所描述,包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais,T.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2ndedition,Cold spring Harbor Laboratory Press.
实施例1.CTLA-4膜外区基因和Fc区基因的克隆
用淋巴细胞分离液分离健康人淋巴细胞,用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA,设计引物扩增CTLA-4膜外区基因(GeneID:1493),并用引物FC有义:GCCCAGATTCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGAC和FC反义:GAATTCTCATTTACCCGGAGACAGG扩增抗体Fc区。PCR反应均采用热启动,反应条件:94℃45秒,60℃45秒,72℃1分10秒,30个循环;72℃10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T(promega公司)载体中,测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2显示了CTLA-4膜外区的核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4分别显示了IgG1 Fc区的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/CT和pGEM-T/Fc。
实施例2.CTLA4-Ig融合蛋白的表达载体构建
设计引物将合成的信号肽序列SEQ ID NO:5与克隆出来的CTLA-4膜外基因片段进行overlapPCR,将连接测序正确的片段与抗体IgG1 Fc进行overlapPCR,装pGEM-T载体进 行测序。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoR I酶切CTLA4-Ig融合蛋白基因,经琼脂糖凝胶电泳纯化回收,与用HindIII和EcoR I酶切的质粒pcDNA3.1(+)(美国Invitrogen公司产品)进行连接,构建成真核表达载体pcDNA3.1(+),记作pcDNA3.1(+)(CTLA4-Ig)。
实施例3.融合蛋白的稳定表达与纯化
于3.5cm组织培养皿中接种3×105CHO-K1细胞(ATCC CRL-9618),细胞培养至90%-95%融合时进行转染:取质粒10μg(质粒pcDNA3.1(+)(CTLA4-Ig)10μg和20μlLipofectamine2000Reagent(Invitrogen公司产品)分别溶于500μl无血清DMEM培养基,室温静置5分钟,将以上2种液体混合,室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成,其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基,然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中,CO2孵箱培养4小时后补加2ml含10%血清的DMEM完全培养基,置于CO2孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600μg/ml G418选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆:羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板,4℃过夜,用2%BSA-PBS于37℃封闭2h,加入待测的抗性克隆培养上清或标准品(Abatacept),37℃温育2h,加入HRP-羊抗人Fc(CH2)进行结合反应,37℃温育1h,加入TMB于37℃作用5min,最后用H2SO4终止反应,测A450值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养,用Protein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化融合蛋白。将纯化的融合蛋白用PBS进行透析,最后以紫外吸收法定量。
实施例4.融合蛋白突变体的构建及表达
采用overlapPCR的方式对CTLA4-Ig突变体进行构建,其构建与表达、纯化的方法与原本CTLA4-Ig融合蛋白相同(如实施例1至3所述)。其中,CTLA-4膜外区的突变点选择见图1所示,突变体氨基酸序列见SEQ ID NO:6~20。
实施例5.CTLA-4/Ig突变体的biacore鉴定
将CM5芯片(GE公司)在50μl/min的PBS溶液(磷酸盐缓冲液)中25℃平衡30min,然后用100μl的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和100μl EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺)混合,以10μl/ml活化芯片8min。然后将终浓度为5μg/ml的CD86-Fc蛋白(R&D公司)以10μl/ml的流速包被芯片,最终ΔRu=100Ru。然后用PBS缓冲液50μl/min平衡10min。将待检测样品以等两倍比稀释五个浓度,50μl/min上样75sec,然后用PBS解离10min。图2显示了在相同样品浓度下biacore检测的sensorgram图;具体检测亲和力数值见表1。其中,我们构建的原本CTLA4-Ig融合蛋白的亲和力与Abatacept的亲和力相似。
相对于未突变的原本CTLA4-Ig融合蛋白,提高亲和力程度较高的单点突变体为:突变体CTmut1和CTmut2,亲和力分别提高了3.98和4.04倍;突变体CTmut6,亲和力提高了2.29倍;突变体CTmut10,亲和力提高了2.68倍。最终,亲和力提高最高的为三点组合突变体CTmut15,其亲和力最终提高了18.2倍。
相对于市售的Abatacept,提高亲和力程度较高的单点突变体为:突变体CTmut1和CTmut2,亲和力分别提高了4.24和4.31倍;突变体CTmut6,亲和力提高了2.44倍;突变体CTmut10,亲和力提高了2.86倍。最终,亲和力提高最高的为三点组合突变体CTmut15,其亲和力最终提高了19.4倍。
表一
实验误差采用SD表示,通过三次不同的实验确定。WT,表示未突变的原本CTLA4-Ig融合蛋白;abat,表示市售Abatacept;CTmut1~CTmut15,表示单点突变或单点组合突变的CTLA4-Ig融合蛋白突变体。
Claims (6)
1.一种高亲和力的CTLA4-Ig融合蛋白突变体,其特征在于所述突变体包括如SEQ IDNO:2所示的CTLA-4膜外区的第61位氨基酸位点上的氨基酸由酪氨酸取代所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:18,或SEQ ID NO:20所示。
2.权利要求1所述的突变体,其特征在于所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20所示。
3.权利要求2所述的突变体,其特征在于所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO 20所示。
4.一种制剂,含有上述1至3任一所述的突变体和可药用的载体。
5.权利要求1至4任一所述的突变体或其制剂在制备治疗免疫排斥反应或者自身免疫性疾病药物中的用途。
6.权利要求5的用途,其中自身免疫性疾病为类风湿关节炎。
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