CN107074976B - 同时阻断b7/cd28和il6/il6r/gp130信号通路的重组融合蛋白 - Google Patents

同时阻断b7/cd28和il6/il6r/gp130信号通路的重组融合蛋白 Download PDF

Info

Publication number
CN107074976B
CN107074976B CN201580059624.3A CN201580059624A CN107074976B CN 107074976 B CN107074976 B CN 107074976B CN 201580059624 A CN201580059624 A CN 201580059624A CN 107074976 B CN107074976 B CN 107074976B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fusion protein
bifunctional fusion
amino acid
seq
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201580059624.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107074976A (zh
Inventor
杨亚平
刘家望
宋楠萌
陈国强
张磊
车美英
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Beijing Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Hanmi Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Beijing Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Publication of CN107074976A publication Critical patent/CN107074976A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107074976B publication Critical patent/CN107074976B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Abstract

本发明公开了包含CTLA4分子胞外区及具有中和IL6活性的功能片段的双功能融合蛋白、其编码基因、含有该基因的载体、含有该载体的宿主细胞及含有该融合蛋白的药物组合物，所述具有中和IL6活性的功能片段是抗IL6单克隆抗体，其中CTLA4分子胞外区位于抗IL6单克隆抗体重链的N端，通过连接肽连接。本发明的双功能融合蛋白能同时阻断B7/CD28和IL6/IL6R/GP130信号通路，从而抑制炎症反应。

Description

同时阻断B7/CD28和IL6/IL6R/GP130信号通路的重组融合 蛋白
技术领域
本发明涉及同时阻断B7/CD28和IL6/IL6R/GP130信号通路的重组融合蛋白，具体而言，本发明涉及包含CTLA4分子胞外区、连接肽以及抗IL6单克隆抗体的双功能融合蛋白、编码该双功能融合蛋白的基因、含有该基因的载体、含有该载体的宿主细胞以及含有该双功能融合蛋白的药物组合物。
背景技术
类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性、进行性、系统性自身免疫性疾病，在全球人群中的发病率为0.5％-1％。其早期的症状表现为关节的肿胀、疼痛、活动困难等。随着病情的发展，关节会严重畸形甚至致残，并且有可能累及其它的组织和器官，引起肺间质病变、胸膜炎、心包炎、类风湿血管炎等疾病的发生。因此，及时有效地治疗对于阻止病程的发展、缓解症状、改善患者的生活质量意义重大。
传统的RA治疗主要采用非甾体类抗炎药物、糖皮质激素和缓解病情的药物。随着RA发病机理研究的深入，越来越多的生物制剂被用于RA的治疗，如抑制TNFα活性的TNFα的拮抗剂、针对B细胞的单克隆抗体利妥昔单抗(Rituximab)、抑制T细胞活性的阿巴他赛(Abatacept)、抑制IL-6信号通路的单克隆抗体妥珠单抗(Tocilizumab)、中和IL-1活性的阿那白滞素(Anakinra)等(Vierboom M，Breedveld E，Hart BA.Expert opinion on drugdiscovery.2012，7(4)：315-325)。生物制剂较传统RA治疗药物起效更加迅速、治疗周期更短、副作用更小。但是，不是所有的患者都能对生物制剂产生良好的应答。即使治疗RA的一线药物-TNFα的拮抗剂，也会有20-30％的患者应答不理想，或者在接受长期的TNFα的拮抗剂治疗后，效果逐渐下降(Gibbons LJ，Hyrich KL.Biodrugs，2009，23(2)：111-124)。
细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA4)，又名CD152，是一种白细胞分化抗原。CTLA4和CD28的配体均为B7分子，而CTLA4与B7分子结合后诱导T细胞无反应性，参与免疫反应的负调节。2005年上市的用于类风湿性关节炎治疗的阿巴西普(abatacept，商品名OrenciaTM，百时美施贵宝公司)是一种单功能融合蛋白，由2个CTLA4分子的胞外区(extracellular domain，ECD)与人IgG1的Fc段结合而成，通过竞争性阻断B7与CD28分子的结合，从而抑制T细胞增殖和激活(Genovese MC，Becker JC，Schiff M，et al.N.Engl.J.Med.，2005，353：1114-1123)。
IL6是一种由淋巴细胞、巨噬细胞、成纤维细胞分泌的参与多种生物学作用的细胞因子，它通过与IL6R和GP130形成复合物，激活信号通路。研究表明，RA患者滑液中IL6和IL6R的水平与滑膜炎症状和关节破坏程度相关。因此，阻断IL6信号通路是治疗RA的新思路。2010年，第一种抗IL6单克隆抗体Tocilizumab上市，它由罗氏公司研发，用于对TNF拮抗剂无效或中重度活动性类风湿性关节炎患者。临床应用结果显示，Tocilizumab能有效控制RA进程，并显示了良好的耐受性(Tadamitsu K，Int.Immu.，2010，22(5)：347-352)。
因此，采用联合给药的治疗模式，可能会增加某些慢性炎症如类风湿关节炎患者的临床获益。
联合给药需要依次注射两种或多种抗体，或将抗体做成同一种剂型。然而，一方面，依次注射抗体会降低患者的治疗依从性，并增加疼痛。另一方面，由于不同抗体的物化性质存在差异，很难或几乎不太可能将不同抗体做成同一种剂型。
鉴于此，发现新的靶点和开发新的RA治疗方案是解决目前RA治疗的发展方向。
发明内容
本发明提供了结合了抑制B7/CD28信号通路和抑制IL6/IL6R/GP130信号通路两种作用机制的RA治疗药物。
本发明的第一方面涉及一种双功能融合蛋白，其包含阻断B7/CD28信号通路的片段和阻断IL6/IL6R/GP130信号通路的片段。
在一个实施方案中，所述双功能融合蛋白还包含连接肽。
在一个实施方案中，阻断B7/CD28信号通路的片段通过连接肽连接于阻断IL6/IL6R/GP130信号通路的片段的N端。
在一个实施方案中，阻断B7/CD28信号通路的片段为CTLA4分子胞外区。
在一个实施方案中，阻断IL6/IL6R/GP130信号通路的片段为抑制IL6/IL6R/GP130信号通路活化的蛋白或功能域。
在一个实施方案中，双功能融合蛋白的抑制IL6/IL6R/GP130信号通路活化的蛋白或功能域为天然的或人工合成的具有IL6/IL6R/GP130信号通路阻断作用的氨基酸序列。
在一个实施方案中，双功能融合蛋白的抑制IL6/IL6R/GP130信号通路活化的蛋白或功能域为单克隆抗体或多克隆抗体或其功能片段、嵌合抗体、人源化抗体、完全人源抗体、单链抗体、双特异性抗体。
在一个实施方案中，双功能融合蛋白的抑制IL6/IL6R/GP130信号通路活化的单克隆抗体为抗IL6单克隆抗体、抗IL6R单克隆抗体、抗GP130单克隆抗体、抗IL6-IL6R复合物的单克隆抗体、抗IL6-GP130复合物的单克隆抗体、抗IL6R-GP130复合物的单克隆抗体、抗IL6-IL6R-GP130复合物的单克隆抗体，或其功能片段、嵌合抗体、人源化抗体、完全人源抗体、双特异性抗体。
在一个实施方案中，所述单克隆抗体为IgG、IgA、IgD、IgE、IgM抗体或者它们的杂合体。
在另一个实施方案中，所述单克隆抗体为IgG。
在一个实施方案中，所述功能片段为单一结构域抗体、单链抗体、单链可变片段(scFv)、Fab片段或F(ab’)2片段。
在一个实施方案中，双功能融合蛋白的抑制IL6/IL6R/GP130信号通路活化的单克隆抗体为抗IL6单克隆抗体。
在一个实施方案中，双功能融合蛋白的连接顺序为CTLA4分子胞外区、连接肽和抗IL6单克隆抗体重链。
在一个实施方案中，CTLA4分子胞外区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示或者是SEQ ID NO：1所示序列经替换、缺失、添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，如2、3、4、5、10、15、20、30、50个氨基酸残基，或者是与SEQ ID NO：1所示序列具有至少70％同一性并具有同等功能的氨基酸序列，如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％同一性。
在一个实施方案中，抗IL6单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或如SEQ ID NO：2所示的序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列，如2、3、4、5、10、15、20、30、50个氨基酸残基，或与SEQ ID NO：2序列具有至少70％同一性并具有同等功能的氨基酸序列，如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％同一性。
在一个实施方案中，抗IL6单克隆抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，或如SEQ ID NO：3所示的序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列，如2、3、4、5、10、15、20、30、50个氨基酸残基，或与SEQ ID NO：3序列具有至少70％同一性并具有同等功能的氨基酸序列，如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％同一性。
在一个实施方案中，连接肽的氨基酸序列长度为1-50个氨基酸，例如，所述连接肽的氨基酸序列长度为10、15、20、21、22、23、24、25或30个氨基酸，在另一个实施方案中，所述连接肽的氨基酸序列长度为25个氨基酸，在进一步的实施方案中，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
在一个实施方案中，CTLA4分子胞外区-连接肽-抗IL6单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，或如SEQ ID NO：6所示的序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列，如2、3、4、5、10、15、20、30、50个氨基酸残基，或与SEQ ID NO：6序列具有至少70％同一性并具有同等功能的氨基酸序列，如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％同一性。
本发明的第二方面涉及如上所述的双功能融合蛋白的编码基因。
在一个实施方案中，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7和8所示。
本发明的第三方面涉及一种有效连接有如上所述编码基因的重组载体。
在某些实施方案中，所述的载体为真核细胞表达载体，在某些实施方案中，所述的载体为经改造而具有两个表达框的载体X0GC。
本发明的第四方面涉及一种含有如上所述重组载体的宿主细胞。
本发明的第五方面涉及一种制备如上所述双功能融合蛋白的方法，所述方法包括：
(1)将如上所述编码基因克隆至真核表达载体中并转染至宿主细胞进行表达；和
(2)纯化所述双功能融合蛋白，
在一个实施方案中，所述真核表达载体为X0GC，在一个实施方案中，所述宿主细胞为HEK293-T或CHO细胞。
本发明的第六方面涉及一种活性成分为如上所述双功能融合蛋白的药物组合物。
本发明的第七方面涉及一种如上所述的双功能融合蛋白或如上所述的药物组合物在制备用于预防或治疗免疫性疾病、排斥反应和心脑血管疾病的药物中的用途。
在一个实施方案中，所述双功能融合蛋白或药物组合物用于制备预防或治疗下述疾病的药物：类风湿性关节炎、牛皮癣、I型糖尿病、多发性硬化症、自身免疫性脑脊髓炎、克罗恩氏病、系统性脉管炎、皮肌炎、混合结缔组织病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、红斑性狼疮、特发性血小板减少性紫癜、肾小球肾炎、痛风、器官移植的排斥反应、哮喘或动脉粥样硬化。
在一个实施方案中，所述双功能融合蛋白或药物组合物用于制备预防或治疗下述疾病的药物：骨性关节炎、银屑病关节炎、痛风性关节炎、幼年类风湿性关节炎、化脓性关节炎。
本发明的第八方面涉及一种如上所述的双功能融合蛋白或如上所述的药物组合物，其用于预防或治疗免疫性疾病、排斥反应和心脑血管疾病。
在一个实施方案中，所述的双功能融合蛋白或药物组合物用于预防或治疗下述疾病：类风湿性关节炎、牛皮癣、I型糖尿病、多发性硬化症、自身免疫性脑脊髓炎、克罗恩氏病、系统性脉管炎、皮肌炎、混合结缔组织病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、红斑性狼疮、特发性血小板减少性紫癜、肾小球肾炎、痛风、器官移植的排斥反应、哮喘或动脉粥样硬化。
在一个实施方案中，所述的双功能融合蛋白或药物组合物用于预防或治疗下述疾病：骨性关节炎、银屑病关节炎、痛风性关节炎、幼年类风湿性关节炎、化脓性关节炎。
本发明的第九方面涉及一种预防或治疗免疫性疾病、排斥反应和心脑血管疾病的方法，其包括施与受试者治疗有效量的如上所述的双功能融合蛋白或如上所述的药物组合物。
在一个实施方案中，所述方法用于预防或治疗下述疾病：类风湿性关节炎、牛皮癣、I型糖尿病、多发性硬化症、自身免疫性脑脊髓炎、克罗恩氏病、系统性脉管炎、皮肌炎、混合结缔组织病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、红斑性狼疮、特发性血小板减少性紫癜、肾小球肾炎、痛风、器官移植的排斥反应、哮喘或动脉粥样硬化。
在一个实施方案中，所述方法用于预防或治疗下述疾病：骨性关节炎、银屑病关节炎、痛风性关节炎、幼年类风湿性关节炎、化脓性关节炎。
本发明的第十一方面涉及一种试剂盒，其包含如上所述的双功能融合蛋白、如上所述的编码基因、如上所述的载体或如上所述的宿主细胞。
本发明的实验结果表明，该双功能融合蛋白能够同时阻断B7/CD28信号通路和抑制IL6/IL6R/GP130信号通路，动物模型中能有效地抑制关节炎症的发展，能实现比组成该融合蛋白的单个功能单元所能实现的治疗RA效果更强的治疗效果。本领域技术人员知晓，几个不同作用机理的药物联合使用或融合使用可能会出现拮抗、无关、累加或协同等不同的效果，两种或更多种药物联合使用或融合使用到底呈现何种相互作用只能通过具体的实验研究、付出大量劳动的情况下才能确定。由于人类机体的复杂性，尤其是对RA这样的发病机理极其复杂、发病机理尚未完全洞悉的全身性、免疫性疾病，药物即使联合使用或融合使用也罕有实现各个不同作用机理药物所能实现的治疗效果的完全累加或协同的效果，很多都呈现组合无关甚或拮抗的效果。本发明的双功能融合蛋白实现的对RA的增强的治疗效果为RA患者提供了一种治疗效果更佳优异的候选药物。同时，本发明的双功能融合蛋白同时作用于治疗RA的两个不同的靶点，降低了单一靶点治疗失败或效果不佳的机率，具有重要的经济意义和社会效益。与使用单功能的蛋白(例如CTLA4-Fc)情况相比，本发明可降低生产成本，并减少临床给药体积和频率，提高受试者顺从性，在免疫性疾病的预防和治疗上具有巨大的应用前景。
附图说明
图1：为本发明中重组双功能融合蛋白的结构示意图。
图2：为本发明中重组双功能融合蛋白的电泳检测。其中，泳道1为非还原的抗IL6单克隆抗体，泳道2为还原的抗IL6单克隆抗体，泳道3为非还原的CTLA4-抗IL6mAb，泳道4为还原的CTLA4-抗IL6mAb。
图3：为本发明中重组双功能融合蛋白与人IL6和小鼠IL6的结合。
图4：为本发明中重组双功能融合蛋白在小鼠的药时曲线和药代动力学参数。
图5：为本发明中重组双功能融合蛋白治疗后，CIA诱导的小鼠的关节炎症指数的变化结果。
具体实施方式
本发明的一个目的在于提供一种能够同时阻断B7/CD28和IL6/IL6R/GP130两条信号通路的双功能融合蛋白，图1为本发明中重组双功能融合蛋白的结构示意图。阻断B7/CD28信号通路的功能片段与阻断IL6/IL6R/GP130信号通路的功能片段有效连接，保持其各自的空间结构并发挥其各自的生理活性。所述阻断B7/CD28信号通路的功能片段与阻断IL6/IL6R/GP130信号通路的功能片段可以在不影响其各自功能的情况下直接融合在一起，也可以在所述两条功能片段之间或末端加入其它序列，如连接肽或有利于促进所述两条功能片段发挥其各自活性、或有利于引起其它生物学效应，如抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用和补体依赖的细胞毒性性作用、或有利于提高融合蛋白药代动力学性质的其他序列。
在一个实施方式中，所述阻断B7/CD28信号通路的功能片段是CTLA4分子或其功能片段。在一个实施方式中，所述阻断IL6/IL6R/GP130信号通路的功能片段是抗IL6单克隆抗体。在另外可选的实施方式中，所述阻断IL6/IL6R/GP130信号通路的功能片段是抗IL6R抗体、抗IL6-IL6R复合物的抗体、抗GP130抗体、抗IL6-GP130复合物的抗体、抗IL6-IL6R-GP130复合物的抗体或其功能片段。
在一个实施方式中，阻断B7/CD28信号通路的功能片段是CTLA4分子胞外区。本发明所用的术语“CTLA4分子胞外区”是指细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic Tlymphocyte-associated antigen 4，CTLA4)的胞外区。在某个实施方案中，人CTLA4蛋白的胞外区(ECD)序列如SEQ ID NO：1所示，其为人CTLA4蛋白的第37-161位氨基酸序列(Genbank登录号NM_005214.4)。当然，在保证所述CTLA4分子胞外区的生理活性的基础上，其氨基酸序列可以沿着人CTLA4蛋白的第37-161位氨基酸序列相应减少或增加一个或多个氨基酸残基。所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基也可以进行保守氨基酸的替换。保守氨基酸的替换是本领域公知的。
在某些实施方案中，本发明所用的术语“阻断IL6/IL6R/GP130信号通路的功能片段”是指靶向IL-6的免疫球蛋白或其修饰物、功能等同物、功能片段或变体。在某些实施方案中，阻断IL6/IL6R/GP130信号通路的功能片段为靶向IL-6的IgG抗体(抗IL-6单克隆抗体)。在某些实施方案中，所述IgG为嵌合的、人源化的或全人的IgG。在某些实施方案中，所述修饰物可以是化学修饰物，如酰基化、烷基化、PEG化产物，只要这些修饰物保留了靶向IL-6的能力即可。在某些实施方案中，所述功能等同物是指能够实现所述免疫球蛋白靶向结合IL-6能力的其他多肽片段。在某些实施方案中，所述功能片段是指保留了靶向IL-6的能力的蛋白质片段，如单一结构域抗体、单链抗体、单链可变片段(scFv)、Fab片段或F(ab’)2片段。在某些实施方案中，所述变体是指通过在一个或多个(几个)位置的一个或多个改变，即取代、插入和/或缺失而从亲本蛋白衍生的多肽。
在一个优选实施方式中，抗IL6单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，轻链如SEQ ID NO：3所示。当然，所述抗IL6抗体的氨基酸序列也不是唯一的，其可以选自具有中和IL6活性的单克隆抗体。所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基也可以进行保守氨基酸的替换。
在某些实施方案中，所述连接片段长度为1-50个氨基酸，如5-45个氨基酸、10-35个氨基酸，20-30个氨基酸，在某些实施方案中，所述连接片段长度为25个氨基酸，在某些实施方案中，所述连接片段的序列如SEQ ID NO：5所示。本发明所用的连接片段并无特殊限制，只要其起到间隔融合蛋白的两个组分，使各个组分能正确形成其各自的空间结构、保留其生物活性、细胞表达水平和热稳定性即可。
根据一种优选实施方式，本发明双功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3和6所示，或如SEQ ID NO：3和6所示序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列，如1、2、3、4、5、6、8、9、10、15、20、30、40、50个氨基酸残基，或与SEQ ID NO：3和6序列具有至少70％同一性并具有同等功能的氨基酸序列，优选地，本发明双功能融合蛋白的氨基酸序列为与如SEQ ID NO：3和6所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％或99.8％同一性并具有同等功能的氨基酸序列。
本发明使用的术语“同一性”具有本领域通常已知的含义，本领域技术人员也熟知测定不同序列间同一性的规则、标准。本发明用不同程度同一性限定的序列还必须要同时具有CTLA4分子胞外区或中和IL-17的活性。本领域技术人员公知如何利用上述活性筛选变体序列的方法和手段。本领域技术人员可以在本申请公开内容的教导下容易地获得这样的变体序列。
本领域技术人员知晓，虽然本发明在限定所述双功能融合蛋白时所用限定语为“包含”，但其并不意味着可以在所述双功能融合蛋白序列中任意加入与其功能不相关的其他序列。在制备复杂组成的融合蛋白时，为了保证融合蛋白各个组成成分的空间结构、生物活性，以及为了将所述各种组分适当的融合在一起，或为了增强所述融合蛋白的抗水解能力，本领域技术人员在制备所述融合蛋白时，会根据需对各个组分进行不同顺序或不同结构的组合，以及在所述融合蛋白的两端或连接处加入一个或多个额外的氨基酸残基，因此，如果用封闭式的表述来限定所述双功能融合蛋白将不能真实地覆盖这些情形。
另一方面，本发明提供了一种编码基因，其包含编码本发明双功能融合蛋白的核苷酸序列。
本领域技术人员知晓，虽然本发明在限定所述编码基因时所用限定语为“包括”，但其并不意味着可以在所述编码基因两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在所述编码基因的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定所述编码基因将不能真实地覆盖这些情形。
本领域技术人员公知，在不改变所编码的氨基酸的情况下，所述编码基因序列中的一个或多个密码子可以进行等义替换，如一个或几个密码子，如1、2、3、4、5、6、8、9、10、15、20、30、40、50个密码子。密码子使用表是本领域公知的。
根据一种优选实施方式，编码本发明融合蛋白以及分泌表达所需的信号肽序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
还一方面，本发明提供了一种重组载体，其含有有效连接其中的本发明双功能融合蛋白的编码基因。所述重组载体为重组表达载体，可以是原核表达载体也可以是真核表达载体，但优选真核表达载体，更优选用于哺乳动物真核表达的重组表达载体。
本发明所用的术语“有效连接”是指这样的连接方式，其中所述编码基因置于载体的适当位置，使得所述编码基因正确地、顺利地复制、转录或表达。
还一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其转化或转染有如上所述的重组载体，所述宿主细胞包括哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母菌细胞、昆虫细胞和植物细胞。
在一个优选的实施方案中，所述的宿主细胞包含CHO细胞、HEK293细胞、NSO细胞和SP 2/0细胞。
还一方面，本发明提供了一种制备本发明双功能融合蛋白的方法，其中，所述方法包括：(1)将上述方面的编码基因克隆至真核表达载体中并转染至宿主细胞进行表达；和(2)纯化所述双功能融合蛋白。优选地，所述纯化后的双功能融合蛋白的纯度为大于50％，更优选地，大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％。
还一方面，本发明提供了一种含有本发明双功能融合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。所述双功能融合蛋白可以是所述药物组合物的唯一活性成分，也可以是所述药物组合物活性成分之一，其他活性成分为可以与所述双功能融合蛋白组合使用的其他治疗剂。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物包含单次给药的剂型、局部给药的剂型和全身给药剂型。
又一方面，本发明提供了所述双功能融合蛋白或含有所述双功能融合蛋白的药物组合物在制备用于预防或治疗免疫性疾病、排斥反应和心脑血管疾病的药物中的用途。
在一个实施方案中，所述双功能融合蛋白或药物组合物用于制备预防或治疗下述疾病的药物：类风湿性关节炎、牛皮癣、I型糖尿病、多发性硬化症、自身免疫性脑脊髓炎、克罗恩氏病、系统性脉管炎、皮肌炎、混合结缔组织病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、红斑性狼疮、特发性血小板减少性紫癜、肾小球肾炎、痛风、器官移植的排斥反应、哮喘或动脉粥样硬化。
在一个实施方案中，所述双功能融合蛋白或药物组合物用于制备预防或治疗下述疾病的药物：骨性关节炎、银屑病关节炎、痛风性关节炎、幼年类风湿性关节炎、化脓性关节炎。
还一方面，本发明提供了所述双功能融合蛋白或含有所述双功能融合蛋白的药物组合物，其用于预防或治疗免疫性疾病、排斥反应和心脑血管疾病。
在一个实施方案中，所述双功能融合蛋白或药物组合物用于预防或治疗下述疾病：类风湿性关节炎、牛皮癣、I型糖尿病、多发性硬化症、自身免疫性脑脊髓炎、克罗恩氏病、系统性脉管炎、皮肌炎、混合结缔组织病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、红斑性狼疮、特发性血小板减少性紫癜、肾小球肾炎、痛风、器官移植的排斥反应、哮喘或动脉粥样硬化。
在一个实施方案中，所述双功能融合蛋白或药物组合物用于预防或治疗下述疾病：骨性关节炎、银屑病关节炎、痛风性关节炎、幼年类风湿性关节炎、化脓性关节炎。
又一方面，本发明提供了免疫性疾病、排斥反应和心脑血管疾病的预防或治疗方法，其包括向罹患所述疾病的患者或倾向于罹患所述疾病的人群给予治疗有效量的上述方面所述的双功能融合蛋白或含有所述双功能融合蛋白的药物组合物的步骤。
在一个实施方案中，所述方法用于预防或治疗下述疾病：类风湿性关节炎、牛皮癣、I型糖尿病、多发性硬化症、自身免疫性脑脊髓炎、克罗恩氏病、系统性脉管炎、皮肌炎、混合结缔组织病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、红斑性狼疮、特发性血小板减少性紫癜、肾小球肾炎、痛风、器官移植的排斥反应、哮喘或动脉粥样硬化。
在一个实施方案中，所述方法用于预防或治疗下述疾病：骨性关节炎、银屑病关节炎、痛风性关节炎、幼年类风湿性关节炎、化脓性关节炎。
本发明所用的术语“治疗有效量”是指在给药时，可以在受试者体内发挥药理作用的剂量。“治疗有效量”可以由本领域技术人员根据患者的情况如年龄、体重、疾病状态等容易地确定。
本领域技术人员知晓，虽然本发明上述内容中列出了本发明所述的双功能融合蛋白所能预防、治疗或改善的病状，但本发明的双功能融合蛋白所能处理的病状并不仅限于上述列出的具体病状，任何可以通过同时阻断B7/CD28和IL-6/IL-6R/GP130信号通路而获得预防、治疗或改善益处的病状都包括在本发明的保护范围之内。
本发明提供的双功能融合蛋白能够与B7以及IL6结合。治疗CIA诱导关节炎小鼠的研究显示，本发明提供的双功能融合蛋白显著地缓解病情的发展。显示本发明的双功能融合蛋白的结构组成形式保留了与天然蛋白相同的生物活性，也显示本发明的双功能融合蛋白在免疫调节特别是免疫抑制方面有潜在的应用价值。
根据本发明的上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
1)将CD28/B7和IL6/IL6R/GP130两条信号通路的阻断分子(人CTLA4的胞外区和抗IL6单克隆抗体)融合入一个分子进行表达和生产，与分别生产CTLA4蛋白的胞外区和抗IL6单克隆抗体相比，极大地降低了操作方法和生产成本；
2)将人CTLA4蛋白的胞外区和抗IL6单克隆抗体连接，体外结合实验显示本发明中的连接方式对CTLA4分子的胞外区与其配体CD80的结合，对抗IL6单克隆抗体与IL6的结合没有影响；
3)CIA小鼠模型实验结果显示，目的双功能蛋白能有效降低小鼠的炎症反应。
本发明的某些方面涉及如下实施方案：
项1、一种融合蛋白，其包含阻断B7/CD28信号通路的片段和阻断IL6/IL6R/GP130信号通路的片段。
项2、根据项1所述的双功能融合蛋白，其特征在于其还包含连接肽。
项3、根据项1或2所述的双功能融合蛋白，其特征在于阻断B7/CD28信号通路的片段通过连接肽连接于阻断IL6/IL6R/GP130信号通路的片段的N端。
项4、根据项1-3任一项所述的双功能融合蛋白，其特征在于阻断B7/CD28信号通路的片段为CTLA4分子胞外区。
项5、根据项1-4任一项所述的双功能融合蛋白，其特征在于阻断IL6/IL6R/GP130信号通路的片段为抑制IL6/IL6R/GP130信号通路活化的蛋白或功能域。
项6、根据项5所述的双功能融合蛋白，其特征在于双功能融合蛋白的抑制IL6/IL6R/GP130信号通路活化的蛋白或功能域为天然的或人工合成的具有IL6/IL6R/GP130信号通路阻断作用的氨基酸序列。
项7、根据项6所述的双功能融合蛋白，其特征在于双功能融合蛋白的抑制IL6/IL6R/GP130信号通路活化的蛋白或功能域为单克隆抗体或多克隆抗体或其功能片段、嵌合抗体、人源化抗体、完全人源抗体、单链抗体、双特异性抗体。
项8、根据项7所述的双功能融合蛋白，其特征在于双功能融合蛋白的抑制IL6/IL6R/GP130信号通路活化的单克隆抗体为抗IL6单克隆抗体、抗IL6R单克隆抗体、抗GP130单克隆抗体、抗IL6-IL6R复合物的单克隆抗体、抗IL6-GP130复合物的单克隆抗体、抗IL6R-GP130复合物的单克隆抗体、抗IL6-IL6R-GP130复合物的单克隆抗体。
项9、根据项6所述的双功能融合蛋白，其特征在于双功能融合蛋白的抑制IL6/IL6R/GP130信号通路活化的单克隆抗体为抗IL6单克隆抗体。
项10、根据项1-9任一项所述的双功能融合蛋白，其特征在于双功能融合蛋白的连接顺序为CTLA4分子胞外区、连接肽和抗IL6单克隆抗体重链。
项11、根据项1至10任一项所述的双功能融合蛋白，其特征在于CTLA4分子胞外区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示或者是SEQ ID NO：1所示序列经替换、缺失、添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列或者是与SEQ ID NO：1所示序列具有至少70％同一性并具有同等功能的氨基酸序列。
项12、根据项1至11任一项所述的双功能融合蛋白，其特征在于抗IL6单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示或者是SEQ ID NO：2所示序列经替换、缺失、添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列或者是与SEQ ID NO：2所示序列具有至少70％同一性并具有同等功能的氨基酸序列。
项13、根据项1至12任一项所述的双功能融合蛋白，其特征在于抗IL6单克隆抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示或者是SEQ ID NO：3所示序列经替换、缺失、添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列或者是与SEQ ID NO：3所示序列具有至少70％同一性并具有同等功能的氨基酸序列。
项14、根据项2至13任一项所述的双功能融合蛋白，其特征在于连接肽的氨基酸序列长度为1-50个氨基酸，优选地，所述连接肽的氨基酸序列长度为25个氨基酸，更优选地，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
项15、根据项1至14任一项所述的双功能融合蛋白，其特征在于双功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，或如SEQ ID NO：6所示的序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：6序列具有至少70％同一性并具有同等功能的氨基酸序列。
项16、一种编码基因，其编码项1-15所述的双功能融合蛋白。
项17、根据项16所述的编码基因，其特征在于编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：7和8所示。
项18、一种重组载体，其有效连接有项17所述的编码基因。
项19、一种宿主细胞，其转化或转染有项18所述的重组载体。
项20、一种制备项1至15任一项所述双功能融合蛋白的方法，所述方法包括：
(1)将项16或17所述编码基因克隆至真核表达载体中并转染至宿主细胞进行表达；和
(2)纯化所述双功能融合蛋白，
优选地，所述真核表达载体为X0GC，优选地，所述宿主细胞为HEK293-T和CHO。
项21、一种药物组合物，其活性成分为项1至15任一项所述的双功能融合蛋白。
项22、一种项1至15任一项所述的双功能融合蛋白或项21所述的药物组合物在制备用于预防或治疗免疫性疾病、排斥反应和心脑血管疾病的药物中的用途。
项23、根据项22所述的用途，其特征在于其用于制备预防或治疗下述疾病的药物：类风湿性关节炎、牛皮癣、I型糖尿病、多发性硬化症、自身免疫性脑脊髓炎、克罗恩氏病、系统性脉管炎、皮肌炎、混合结缔组织病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、红斑性狼疮、特发性血小板减少性紫癜、肾小球肾炎、痛风、器官移植的排斥反应、哮喘或动脉粥样硬化。
项24、根据项22所述的用途，其特征在于其用于制备预防或治疗下述疾病的药物：骨性关节炎、银屑病关节炎、痛风性关节炎、幼年类风湿性关节炎、化脓性关节炎。
项25、一种根据项1至15任一项所述的双功能融合蛋白或根据项21所述的药物组合物，其用于预防或治疗免疫性疾病、排斥反应和心脑血管疾病。
项26、根据项25所述的双功能融合蛋白或药物组合物，其特征在于其用于预防或治疗下述疾病：类风湿性关节炎、牛皮癣、I型糖尿病、多发性硬化症、自身免疫性脑脊髓炎、克罗恩氏病、系统性脉管炎、皮肌炎、混合结缔组织病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、红斑性狼疮、特发性血小板减少性紫癜、肾小球肾炎、痛风、器官移植的排斥反应、哮喘或动脉粥样硬化。
项27、根据项25所述的双功能融合蛋白或药物组合物，其特征在于其用于预防或治疗下述疾病：骨性关节炎、银屑病关节炎、痛风性关节炎、幼年类风湿性关节炎、化脓性关节炎。
项28、一种预防或治疗免疫性疾病、排斥反应和心脑血管疾病的方法，其包括施与受试者治疗有效量的项1至15任一项所述的双功能融合蛋白或项21所述的药物组合物。
项29、根据项28所述的方法，其特征在于其用于预防或治疗下述疾病：类风湿性关节炎、牛皮癣、I型糖尿病、多发性硬化症、自身免疫性脑脊髓炎、克罗恩氏病、系统性脉管炎、皮肌炎、混合结缔组织病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、红斑性狼疮、特发性血小板减少性紫癜、肾小球肾炎、痛风、器官移植的排斥反应、哮喘或动脉粥样硬化。
项30、根据项28所述的方法，其特征在于其用于预防或治疗下述疾病：骨性关节炎、银屑病关节炎、痛风性关节炎、幼年类风湿性关节炎、化脓性关节炎。
项31、一种试剂盒，其包含如项1-15任一项所述的双功能融合蛋白、如项16或17所述的编码基因、如项18所述的重组载体或如项19所述的宿主细胞。
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。本发明下述实施例中使用的各种抗体均来源于商业途径的标准抗体。
实施例
实施例1：重组CTLA4-抗IL6 mAb双功能融合蛋白表达载体的构建
1)CTLA4-抗IL6 mAb的氨基酸和编码核苷酸序列
人CTLA4蛋白的胞外区序列如SEQ ID NO：1所示，为人CTLA4蛋白的第37-161位氨基酸序列(Genbank登录号NM_005214.4.)。抗IL6单克隆抗体的氨基酸序列参照专利WO2010065072，其重链序列如SEQ ID NO：2所示，轻链序列如SEQ ID NO：3所示。表达融合蛋白所用信号肽序列如SEQ ID NO：4所示。连接肽为(G4S)5(SEQ ID NO：5)。CTLA4 ECD-连接肽-抗IL6mAb重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
编码信号肽-CTLA4 ECD-连接肽-抗IL6mAb重链的核苷酸序列经过哺乳动物细胞密码子偏好性的优化，序列如SEQ ID NO：7所示。编码抗IL6mAb轻链的核苷酸序列经过哺乳动物细胞密码子偏好性的优化，序列如SEQ ID NO：8所示。SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8由苏州金唯智生物科技有限公司合成，利用TA克隆引入pUC57载体并分别命名为pUC57-ctla4-anti-il6mAb hc和pUC57-anti-il6mAb lc。
2)CTLA4-抗IL6mAb表达载体的构建和转染质粒的准备
用pUC57-ctla4-anti-il6mAb hc质粒(苏州金唯智生物科技有限公司)做为模板，通过常规PCR扩增信号肽-人CTLA4 ECD-连接肽-抗IL6mAb重链的编码序列，所用上游引物带有HindIII酶切位点，序列为CCCAAGCTTGCCACCATGGGGG(SEQ ID NO：9)。下游引物带有EcoR I酶切位点，序列为CCGGAATTCTCACTTTCCTGGTGA(SEQ ID NO：10)。
用pUC57-anti-il6mAb lc质粒(苏州金唯智生物科技有限公司)做为模板，通过常规PCR扩增抗IL6mAb轻链的编码序列，所用上游引物带有Hind III酶切位点，序列为SEQ IDNO：9。下游引物带有EcoR I酶切位点，序列为CCGGAATTCTCAGCATTCGCCACGATTGAA(SEQ IDNO：11)。
将扩增得到的CTLA4-抗IL6mAb hc和抗IL6mAb lc编码序列经1％浓度的琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将回收获得的基因片段和本公司真核表达载体X0GC(专利US20100120089)用Hind III和EcoR I酶切后连接，获得重组质粒X0GC-ctla4-anti-il6mAbhc和X0GC-anti-il6mAb lc，分别将其转化大肠杆菌DH5α，获得重组菌DH5α/X0GC-ctla4-anti-il6mAb hc和DH5α/X0GC-anti-il6mAb lc。PCR筛选阳性克隆并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。
将阳性DH5α/X0GC-ctla4-anti-il6mAb hc和DH5α/X0GC-anti-il6mAb lc分别接种至1L LB/Amp液体培养基(组成为1％蛋白胨(BD公司)、0.5％酵母提取物(BD公司)、1％NaCl(国药集团化学试剂有限公司))，于37℃、180rpm条件下振荡培养过夜。第二天使用无内毒素质粒大提试剂盒(Qiagen，12381)提取质粒用于HEK293-T细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)转染。
实施例2：重组CTLA4-抗IL6mAb双功能融合蛋白的表达
1)HEK293-T细胞的细胞工厂的准备
将生长状态良好、汇合度95％以上的HEK293-T细胞以18×107个的接种量接种于十层细胞工厂(NUNC公司)，用含10％胎牛血清(购自Gibco公司)的DMEM培养基(购自Corning公司)培养，细胞工厂反复颠倒混匀后置于37℃、5％CO2培养箱内培养48小时，细胞贴壁完全、密度达到80％即可用于瞬时转染。
2)HEK293-T细胞的瞬时转染和表达
将X0GC-ctla4-anti-il6mAb hc和X0GC-anti-il6mAb lc重组质粒用0.22μm滤膜过滤后，分别吸取670μg滤液并混匀，加入66ml无血清DMEM培养基。往2660μg转染试剂PEI(购自Sigma公司)中加入等体积的无血清DMEM培养基，之后与质粒滤液混合，静置15分钟。将含有质粒与PEI的混合物加入到1.3升的无血清DMEM培养基内，充分混匀后缓慢加入细胞工厂内。将细胞工厂置于37℃、5％CO2培养箱内培养。4小时后，加入266ml Cell Boost 5(购自Thermo Fisher公司)，混匀后继续培养3-4天，之后，7000rpm条件下离心20分钟收集上清液用于目的蛋白的纯化。
实施例3：重组CTLA4-抗IL6mAb双功能融合蛋白的纯化
1)细胞表达发酵液的预处理
将收获的细胞培养上清液7000rpm离心20min去除沉淀。细胞发酵液上清液经0.45μm滤膜过滤后，30K膜包超滤浓缩并置换成20mM PB缓冲液加入150mM氯化钠，pH 7.4。在应用层析柱纯化之前以0.45μm滤膜过滤以去除沉淀物。此步骤操作在4℃下进行。
2)rProtein A亲和色谱纯化
采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(GE Healthcare)以及亲和色谱柱rProtein A Sepharose Fast Flow(16mm I.D.，10ml，GE Healthcare)于4℃下进行纯化。首先以流动相A即20mM PB缓冲液加入150mM氯化钠，pH7.4溶液平衡色谱柱，在基线稳定后将预处理后的细胞发酵液上清液进行上样，流速为5ml/min，并在上样后以流动相A进行冲洗，然后以不同缓冲液进行洗脱。首先以流动相B1冲洗5个柱体积；接着以流动相B2冲洗5个柱体积；然后以流动相B3洗脱5个柱体积，收集洗脱峰即为目的蛋白峰；最后以流动相B4冲洗5个柱体积。以上洗脱步骤流速都为5ml/min。流动相B1为在流动相A中添加0.5M精氨酸；流动相B2为20mM NaAc，pH4.5；流动相B3为100mM柠檬酸，pH3.0；流动相B4为100mM柠檬酸，pH 2.2。收集标示的洗脱峰并通过滴加1M NaAc将pH调整至5.0。
3)蛋白的离子交换色谱纯化
采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(GE Healthcare)以及强阴离子交换色谱柱HiTrap Q Sepharose FF(5ml，GE Healthcare)于4℃下进行纯化。首先以流动相A即20mM NaAc(pH 5.0)溶液平衡色谱柱，在基线稳定后将上一步骤中收集并调整pH后的洗脱液进行上样，流速为5ml/min。流穿峰含有目的蛋白，收集流穿峰并置换至PBS缓冲液中。目的蛋白经SDS-PAGE检测其纯度，如图2所示。
实施例4：重组CTLA4-抗IL6mAb双功能融合蛋白与人IL6、小鼠IL6的结合
用ELISA测定重组融合蛋白CTLA4-抗IL6mAb双功能融合蛋白与其抗原人IL6、小鼠IL6的结合能力。
该方法具体实施过程如下。用pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液在96孔高吸附酶标板(Costar，货号42592)上包被人IL6(北京义翘神州，货号10395-HNAE)或者小鼠IL6(北京义翘神州，货号50136-MNAE)，包被浓度为1μg/mL，包被量为100μL每孔，包被在4℃过夜进行。PBST(Sigma，货号P-3563)洗涤5次。用含1％BSA的PBST按300μL/孔封闭，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入稀释在含1％BSA的PBST里的不同浓度的重组CTLA4-抗IL6mAb双功能融合蛋白或者抗IL6mAb，每孔加入100μL，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。然后加入1∶2000稀释在含1％BSA的PBST里的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(Chemicon，货号AP309P)，每孔加入100μL，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入比色底物TMB(BD OptEIA，货号555214)，100μL/孔，室温显色10分钟。加入1M H2SO4，100μL/孔，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。
结果如图3所示，重组CTLA4-抗IL6mAb双功能融合蛋白具有与人IL6和小鼠IL6的结合活性。
实施例5：重组CTLA4-抗IL6mAb双功能融合蛋白与B7分子的结合
用流式细胞术检测重组融合蛋白CTLA4-抗IL6mAb双功能融合蛋白与高表达B7分子的Raji细胞的结合能力。
该方法具体实施过程如下。1000rpm离心5分钟收集传代培养的Raji细胞(ATCC，货号CCL-86)。用含2％FBS(GIBCO，货号10099141)的PBS(GIBCO，货号14190136)洗涤一次。将Raji细胞按每管1*106个细胞，重悬于200μL含2％FBS以及终浓度为0.5nM的重组CTLA4-抗IL6mAb双功能融合蛋白或者同型对照蛋白(人免疫球蛋白，江西博雅生物制药股份有限公司，国药准字S19993012)的冷PBS中。于冰上孵育30分钟。用含2％FBS的PBS洗涤两次。重悬于200μL含2％FBS以及1∶50稀释的FITC标记的抗人IgG抗体(北京中杉金桥，货号ZF0306)的冷PBS中。冰上避光孵育30分钟。用含2％FBS的PBS洗涤两次。再重悬于500μL含2％FBS的冷PBS中，该细胞悬液于流式细胞仪上进行检测分析。
结果如表1所示，重组CTLA4-抗IL6mAb双功能融合蛋白与高表达其配体B7分子的Raji细胞有很高的结合亲和力，与已上市药物Abatacept相近。
表1
Figure GPA0000224080660000181
实施例6：重组CTLA4-抗IL6mAb双功能融合蛋白小鼠体内的药代动力学研究
实验材料选用雌性BALB/c小鼠(8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司)。小鼠适应环境一周后，随机分组，每组18只。各组分别给予33nmol/kg重组CTLA4-抗IL6mAb双功能融合蛋白，采取三种给药途径给药：静脉注射、皮下注射或腹腔注射，10ml/kg体重，单次给药。静脉注射的组在0点，给药后5分钟、30分钟、1小时、3小时、6小时、10小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、168小时眼眶采血；皮下注射和腹腔注射的组别，在0点，给药后30分钟、1小时、3小时、6小时、10小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、168小时眼眶采血；每只小鼠均采血2次。不予抗凝，室温放置血样30分钟，待凝血后，3000rpm离心5分钟，得到的血清样品冷冻于-80℃保存。
ELISA分析血清样品，测定重组CTLA4-抗IL6mAb双功能融合蛋白的浓度。用pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液4℃过夜包被人重组IL6蛋白(北京义翘神州，货号10395-HNAE)于高吸附酶标板上。PBST洗涤。为了防止非特异性结合，用含5％脱脂奶粉的PBST封闭该板，PBST洗涤。然后加入用含10％混合小鼠血清、1％BSA的PBST稀释的待测血清样品孵育，25℃，1小时，PBST洗涤该板。加入稀释于含5％脱脂奶粉的PBST中的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(Chemicon，货号AP309P)，25℃，1小时，PBST洗涤该板。最后使用比色底物TMB(BDOptEIA，货号555214)进行显色，室温显色10分钟。加入1M H2SO4，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。
结果如图4所示，重组CTLA4-抗IL6mAb双功能融合蛋白，33nmol/kg，静脉、皮下和腹腔注射的半衰期T1/2分别为70.39小时、93.09小时和54.37小时；药时曲线下面积AUC分别为18485.69nM.hr、18334.27nM.hr和14404.16nM.hr；表观分布容积Vd分别为0.18L/kg、0.24L/kg和0.18L/kg，；清除率CL分别为0.0018L/hr/kg、0.0018L/hr/kg和0.0023L/hr/kg。
实施例7：重组CTLA4-抗IL6mAb双功能融合蛋白在II型胶原诱导的小鼠关节炎(CIA)模型中的药效研究
本实施例采用当前应用最为广泛的II型胶原诱导的小鼠关节炎(CIA)模型检测重组CTLA4-抗IL6mAb双功能融合蛋白的体内抗关节炎活性。
实验材料选用雄性DBA1/J小鼠(8周龄，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)。小鼠适应环境一周后，分为两组，一组作为对照，另一组建立CIA模型。CIA小鼠模型的建立经初次免疫和加强免疫。CIA模型建立具体实施过程如下：初次胶原免疫：70μg II型牛胶原(Chondrex，货号20022)与弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich，货号F5881)混合形成乳液，皮内注射于小鼠尾根部。三周以后，进行加强胶原免疫：70μg II型牛胶原与弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich，货号F5506)混合形成乳液，皮下注射于小鼠背部。每日观察免疫的小鼠情况。在7-10天之后，对产生四肢足爪红肿等临床性关节炎症状的小鼠随机分组，分成5组，每组6-7只。
分组后开始给药。分别给予药物溶媒(PBS)、Etanercept(33nmol/kg)、Abatacept(33nmol/kg)、抗IL6mAb(33nmol/kg)和重组CTLA4-抗IL6mAb双功能融合蛋白(33nmol/kg)，给药途径为腹腔注射，每两天给药一次，给药5次。自给药之日起，每两天称量一次体重，观察前后四肢足爪病变情况，并进行关节炎指数评分：0＝无红肿，1＝踝关节或者跗骨关节有红斑、轻微肿胀，2＝从踝关节到跗骨关节均有红斑、轻微肿胀，3＝从踝关节到跖骨关节均有红斑、中等程度肿胀，4＝踝关节、足爪包括趾骨关节均有红斑、严重程度肿胀或者四肢关节僵硬。小鼠四肢都给予评分，每只鼠的最大评分为16分。
实验结果如图5所示。在小鼠CIA模型中，重组CTLA4-抗IL6mAb双功能融合蛋白显示出了良好的抗关节炎效果，比治疗RA一线用药Etanercept，单功能CTLA4-Fc(Abatacept)和单功能抗IL6mAb的效果更好。

Claims (9)

1.一种双功能融合蛋白，其包含阻断B7/CD28信号通路的片段和阻断IL6/IL6R/GP130信号通路的片段，其中阻断B7/CD28信号通路的片段为CTLA4分子胞外区，其中阻断IL6/IL6R/GP130信号通路的片段为抑制IL6/IL6R/GP130信号通路活化的抗IL6单克隆抗体，其中CTLA4分子胞外区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中抗IL6单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示和抗IL6单克隆抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其中所述的双功能融合蛋白还包含连接肽，并且其中CTLA4分子胞外区通过连接肽连接于抗IL6单克隆抗体的重链的N端。
2.根据权利要求1所述的双功能融合蛋白，其特征在于连接肽的氨基酸序列长度为25个氨基酸。
3.根据权利要求2所述的双功能融合蛋白，其特征在于连接肽的氨基酸序列如SEQ IDNO：5所示。
4.根据权利要求1至3任一项所述的双功能融合蛋白，其特征在于双功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
5.一种编码基因，其编码权利要求1-4任一项所述的双功能融合蛋白。
6.根据权利要求5所述的编码基因，其特征在于编码基因包含如SEQ ID NO：7和8所示的核苷酸序列。
7.一种重组载体，其有效连接有权利要求5或6所述的编码基因。
8.一种宿主细胞，其转化或转染有权利要求7所述的重组载体。
9.一种权利要求1至4任一项所述的双功能融合蛋白在制备用于预防或治疗关节炎的药物中的用途。
CN201580059624.3A 2014-11-04 2015-11-02 同时阻断b7/cd28和il6/il6r/gp130信号通路的重组融合蛋白 Active CN107074976B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2014106129995 2014-11-04
CN201410612999 2014-11-04
PCT/CN2015/093581 WO2016070769A1 (zh) 2014-11-04 2015-11-02 同时阻断b7/cd28和il6/il6r/gp130信号通路的重组融合蛋白

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107074976A CN107074976A (zh) 2017-08-18
CN107074976B true CN107074976B (zh) 2020-10-09

Family

ID=55908574

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580059624.3A Active CN107074976B (zh) 2014-11-04 2015-11-02 同时阻断b7/cd28和il6/il6r/gp130信号通路的重组融合蛋白

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN107074976B (zh)
WO (1) WO2016070769A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022212513A1 (en) * 2021-03-31 2022-10-06 University Of Southern California Compositions and methods for modulating inflammatory and degenerative disorder

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1328571A (zh) * 1998-12-23 2001-12-26 辉瑞大药厂 抗ctla－4的人单克隆抗体
WO2010136480A1 (en) * 2009-05-28 2010-12-02 Glaxo Group Limited Antigen-binding proteins
CN102438653A (zh) * 2008-11-25 2012-05-02 奥尔德生物制药公司 预防或治疗恶病质、虚弱、疲劳和/或发烧il-6拮抗剂
WO2013041029A1 (en) * 2011-09-23 2013-03-28 Igenimed Pharmaceuticals Inc. Novel soluble ctla4 variants

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030044406A1 (en) * 2001-03-02 2003-03-06 Christine Dingivan Methods of preventing or treating inflammatory or autoimmune disorders by administering CD2 antagonists in combination with other prophylactic or therapeutic agents
CN104684582A (zh) * 2012-08-31 2015-06-03 戊瑞治疗有限公司 用结合群落刺激因子1受体(csf1r)的抗体治疗病状的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1328571A (zh) * 1998-12-23 2001-12-26 辉瑞大药厂 抗ctla－4的人单克隆抗体
CN102438653A (zh) * 2008-11-25 2012-05-02 奥尔德生物制药公司 预防或治疗恶病质、虚弱、疲劳和/或发烧il-6拮抗剂
WO2010136480A1 (en) * 2009-05-28 2010-12-02 Glaxo Group Limited Antigen-binding proteins
WO2013041029A1 (en) * 2011-09-23 2013-03-28 Igenimed Pharmaceuticals Inc. Novel soluble ctla4 variants

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CTLA4-Ig: a novel immunosuppressive agent;Nader Najafian,et al.;《Exp. Opin. Invest. Drugs》;20000930;第9卷(第9期);第2147-2157页 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2016070769A1 (zh) 2016-05-12
CN107074976A (zh) 2017-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6152433B2 (ja) 抗ｔｎｆ−抗ｉｌ−１７二重特異性抗体
CN108409860B (zh) 抗人白细胞介素-4受体α单克隆抗体、其制备方法和应用
JP7262597B2 (ja) 二重特異性抗体及びその作製方法と使用
KR102602539B1 (ko) Fc-융합 고친화성 IgE 수용체 알파 사슬
CN106336459B (zh) 抗人白细胞介素-17a单克隆抗体、其制备方法和应用
TW202330622A (zh) 具有經修飾重鏈恆定區之多特異性重鏈抗體
CN115894703A (zh) 具有经修饰重链恒定区的多特异性重链抗体
CN104231086B (zh) 双功能融合蛋白及其制备方法和用途
EP3101035B1 (en) Bifunctional fusion protein, preparation method therefor, and use thereof
JP2004515243A (ja) サイレント抗ｃｄ２８抗体およびその使用
CN107074976B (zh) 同时阻断b7/cd28和il6/il6r/gp130信号通路的重组融合蛋白
Xu et al. Structural and functional insights into a novel pre-clinical-stage antibody targeting IL-17A for treatment of autoimmune diseases
RU2656160C2 (ru) Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способный связываться с рецептором интерлейкина-6 человека
CN116744975A (zh) 白细胞介素21突变体以及其用途
CN109641958A (zh) huTNFR1相互作用的单价抑制剂
EP3211007A1 (en) Pharmaceutical composition for treating crohn's disease
CN111234021B (zh) 一种抗ccr5抗体及其在治疗肿瘤中的应用
WO2023138551A1 (zh) 抗cd3和抗cd20双特异性抗体及其用途
US20240034792A1 (en) Pd-1 antigen-binding protein and use thereof
US20210309735A1 (en) Anti-il-17a antibodies and use thereof
CA3194457A1 (en) Caninized antibodies to canine interleukin-31 receptor alpha
NZ791361A (en) Engineered anti-il-2 antibodies
CN114269788A (zh) 一种能够与人4-1bb结合的分子及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant