CN1244803A - 可溶性ctla4突变型分子及应用 - Google Patents

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J·R·内姆拉
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Abstract

本发明提供了可溶性CTLA4突变型分子,与野生型CTLA4相比结合CD86抗原的亲合力较高。

Description

可溶性CTLA 4突变型分子及应用
贯穿本申请引用了多种出版物。这些公开了的完整出版物在此引入是为了更完整地描述本发明涉及领域的进展情况。发明背景
T淋巴细胞与抗原提呈细胞(APCs)间的抗原非特异性相互作用可引起导致T细胞对抗原应答的T细胞共刺激信号的产生(Jenkins andJohnson(1993)Curr.Opin.Immunol.5：361-367)。共刺激信号决定了T细胞对抗原应答的大小程度，以及该应管是否激活或灭活对抗原的后续应管(Mueller et al.(1989)Annu.Rev.Immunol.7：445-480)。
缺乏共刺激信号的T细胞的活化导致抑制性或无反应性T细胞应答(Schwartz，R.H.(1992)Cell 71：1065-1068)。一种关键的共刺激信号是由T细胞表面受体CD 28和CTLA 4与APC上B7(也称B7-1和B7-2，或CD 80和CD 86)相关分子之间的相互作用所提供(P.Linsley and J.Ledbetter(1993)Annu.Rev.Immunol.11：191-212)。
现在称为CD 80(B7-1)的分子当初曾被描述是一种人类B细胞相关的活化抗原(Yokochi，T.et al.(1981)J.Immunol.128：823-827；Freeman，G.J.et al.(1989)J.Immunol.143：2714-2722)，后来鉴定是相关T细胞分子CD 28和CTLA 4的反受体(Linsley，P.，etal.(1990)PNAS USA 87：5031-5035；Linsley，P.S.et al.(1991 a)J.Exp.Med.173：721-730；Linsley，P.S.et al.(1991 b)J.Exp.Med.174：561-570)。
近来，APC上的另一种CTLA 4 Ig的反受体被确定(Azuma，N.etal.(1993)Nature 366：76-79；Freeman(1993 a)Science 262：909-911；Freeman，G.J.et al.(1993 b)J.Exp.Med.178：2185-2192；Hathcock，K.L.S.，et al.(1994)J.Exp.Med.180：631-640；Lenschow，D.J.et al.，(1993)PNAS USA 90：11054-11058；Ravi-Wolf，Z.，et al(1993)PNAS USA 90：11182-11186；Wu，Y.et al.(1993)J.Exp.Med.178：1789-1793)。
这种分子现称为CD 86(Caux，C.，et al.(1994)J.Exp.Med.180：1841-1848)，也称为B 7-0(Azuma et al.，1993，上文)或B 7-2(Freeman et al，1993 a，上文)，其在胞外区与CD 80约有25％序列相同(Azuma et al.，1993，上文，Freeman et al.，1993a，上文，1993b，上文)。CD 86转染细胞可激发CD 28介导的T细胞应答(Azuma et al.，1993，上文；Freeman et al.，1993 a，1993 b，上文)。
CD 80和CD 86表达的比较一直是许多研究的主题(Azuma et al.1993，上文；Hathcock et al.，1994，上文；Larsen，C.P.，et al.(1994)J.Immunol.152：5208-5219；Stack，R.M.，et al.，(1994)J.Immunol.152：5723-5733)。现有资料表明：CD 80和CD86表达的调节不同，并提示：在免疫应答中CD 86的表达有助于促进CD 80的表达。
CD 28和CTLA 4的可溶形式已通过将CD 28和CTLA 4可变(v)样胞外区与免疫球蛋白(Ig)恒定区融合生成CD 28 Ig和CTLA 4 Ig而构建成功。CTLA 4 Ig结合CD 80+和CD 86+细胞的能力明显强于CD28 Ig(Linsley，P.et al.(1994)Immunity 1：793-80)。CTLA 4 Ig在体内和体外可阻断许多T细胞依赖的免疫应答(Linsley，et al.，(1991b)，上文；Linsley，P.S.et al.，(1992 a)Science 257：792-795；Linsley，P.S.et al.，(1992 b)J.Exp.Med.176：1595-1604；Lenschow，D.J.et al.(1992)，Science 257：789-792；Tan，P.et al.，(1992)J.Exp.Med.177：165-173；Turka，L.A.，(1992)PNAS USA89：11102-11105)。
Peach等(J.Exp.Med.(1994)180：2049-2058)鉴定出CTLA4胞外区中对强力结合CD 80分子十分重要的区域。具体而言，在互补决定区3(CDR 3)样区中的六肽基元(MYPPPY)被证实在所有CD28和CTLA 4家族成员中是完全保守的。丙氨酸扫描诱变法使CTLA 4中基元和CD 28 Ig中选择性残基突变会降低或消除与CD 80结合的能力。
还构建了CTLA 4和CD 28同源区域互换的嵌合分子。HS 4分子，HS 4A和HS 4B分子是将CTLA 4中CDR 3样区(其中包括含有一些非保守氨基酸残基的C末端延伸部分)移植在CD 28 Ig上构建而成的。这些同源突变物表现出对CD 80结合力明显高于CD 28。
另一组嵌合型同源突变物是将CTLA 4中CDR 1样区移植至HS 4和HS 4-A中而获得，CDR 1区在CD 28中是非保守的且推测其在空间位置上邻近CDR 3样区。这些嵌合型同源突变分子(称为HS 7和HS8)表现出更为强大的与CD 80结合的能力。
嵌合型同源突变分子还可通过将CTLA 4中CDR 2样区移植入HS 7和HS 8分子中而制备，但是这种结合物不能进一步增加对CD 80的亲合力。因此认为CTLA 4和CD 28中的MYPPPY基元在结合CD 80中十分关键，不过在CTLA 4中的CDR 1和CDR 3样区的某些非保守氨基酸残基在增加CTLA 4与CD 80结合力方面也起作用。
已表明CTLA 4 Ig可有效地阻断CD 80相关的T细胞共刺激作用但不能有效地阻断CD 86相关的应答。具有比野生型CTLA 4更高的结合CD 86亲和力的可溶性CTLA 4突变型分子已构建出来，与CTLA 4 Ig相比可能更好地阻断抗原特异性活化细胞的激活。
应用定点诱变和新的筛选程序鉴定出CTLA 4分子胞外区中能优先促进结合CD 86亲和力的几个突变。与先前的可溶性CTLA 4相比，这些分子将为治疗免疫抑制和癌症提供更好的药用组合物。发明概述
本发明提供了可溶性CTLA 4突变型分子，与野生型CTLA 4相比结合CD 86抗原的亲合力较高。
在本发明的一个实施方案中，CTLA 4突变型分子称为LEA 29Y。LEA 29Y结合CD 86的亲和力比野生型CTLA 4 Ig(下文指称作CTLA4 Ig)高2倍多。这种强力结合导致LEA 29Y对免疫应答的阻断效应较CTLA 4 Ig强达10倍多。
在本发明的另一个实施方案中，CTLA 4突变型分子称为L 106E。L 106E结合CD 86的亲和力也比野生型CTLA 4 Ig高。附图简述
图1显示LEA 29Y、L 106E及野生型CTLA 4 Ig与CD 86 Ig的平衡结合分析。LEA 29Y结合CD 86 Ig的能力明显强于L 106E或CTLA4 Ig。得出的平衡结合常数(Kd)如表1所示。LEA 29Y Kd(2.6)低于L 106E Kd(3.4)或CTLA 4 Ig kd(5.2)，这表明LEA 29Y与CD86 Ig结合力更高。这三种分子具有类似的与CD 80 Ig结合的平衡常数。
图2显示FACS分析结果表明LEA 29Y和L 106E与稳定转染人CD86的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)的结合力明显强于CTLA 4 Ig。每种蛋白与转染人CD 80的CHO细胞的结合力相等。
图3显示体外作用分析表明LEA 29Y在抑制PMA(十四酰佛波乙酸脂)处理的CD86+人T细胞的增殖作用方面比CTLA 4 Ig强10多倍。对PMA处理的CD 80+人T细胞的增殖作用的抑制效应两者更为接受。
图4显示在抑制异种刺激的人T细胞产生细胞因子IL-2，IL-4和K-干扰素的效应上，LEA 29Y比CTLA 4 Ig强10倍以上。
图5显示在抑制异种刺激的人T细胞产生细胞因子IL-2，IL-4和K-干扰素的效应上，LEA 29Y比CTLA 4 Ig强5～7倍。
图6显示在抑制PHA刺激的猴外周血单核细胞(PBMC′s)增殖的效应上LEA 29Y比CTLA 4 Ig强10倍以上。
图7列出编码可溶性CTLA 4分子的全部氨基酸序列。发明详述
本申请中所应用的如下词和句具有特殊含意。
在此所用的“CTLA 4突变型分子”是至少包含CTLA 4分子胞外区或其某个能识别和结合CD 86的部分的一种分子。该分子突变后表现为对CD 86的结合力高于野生型CTLA 4。它可以在其中或外接上一种生物或化学活性的非CTLA 4分子。它可能是可溶的(即，循环性的)或结合在表面上的。
在此所用的“野生型CTLA 4”是天然存在的CTLA 4或Linsley等(1989)，上文描述的CTLA 4 Ig。
为了使在此描述的发明得到更全面的理解，进行以下说明。发明内容
本发明提供了可溶性CTLA 4突变型分子，其结合CD 86的能力高于CTLA 4 Ig。具有比野生型CTLA 4结合CD 86更高能力的可溶性CTLA 4突变型分子应该比CTLA 4 Ig能更好地阻断抗原特异性活化细胞的激活。
在本发明的一个实施方案中，可溶性CTLA 4突变型分子具有图7所示的氨基酸序列。具体而言，第29位名为Xaa的氨基酸是选自丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。进一步第106位名为Yaa的氨基酸是选自谷氨酸和亮氨酸中。
  在本发明的另一个实施方案中，可溶性CTLA 4突变型分子包含187个氨基酸，如SEQ ID NO 1所示：始于第1位的丙氨酸止于187位的天冬酰胺。在这个方案中Xaa是酪氨酸，Yaa是谷氨酸(在此称LEA29Y)。或者，Xaa是丙氨酸，Yaa是谷氨酸(在此称L 106E)。
本发明进一步提供的可溶性CTLA 4突变型分子具有如图7所示的与CTLA 4突变体胞外区相应的第一氨基酸序列，对应于能改变CTLA 4突变型分子溶解性及和CD 86结合的亲和力、和/或效价的那部分的第二氨基酸序列。
  按照本发明的实践，该部分可能是免疫球蛋白恒定区或它的一部分。为了用于体内，最好是免疫球蛋白恒定区在受试者体内不引起有害的免疫反应。例如在临床应用上含有人或猴免疫球蛋白恒定区的突变分子是优选的。一种适宜的免疫球蛋白区是人类Cγ1。其它同型物也可以。另外其它弱的或非免疫原性免疫球蛋白恒定区也可以。
  本发明还提供了可溶性突变型CTLA 4 Ig融合蛋白，与野生型CTLA4相比可优先与CD 86抗原反应，该蛋白具有由如图7所示的CTLA 4突变分子胞外区组成的第一氨基酸序列，由人类免疫球蛋白如Cγ1的绞链区、CH2区和CH3区组成的第二氨基酸序列。
本发明还提供了一种可溶性CTLA 4突变型受体蛋白，其氨基酸序列如图7(SEQ ID NO：1)所示，它可优先识别、结合CD 86，亲和力至少是野生型CTLA 4的5倍。
  另外，本发明提供了一种可溶性CTLA 4突变型分子，包括187个氨基酸，如SEQ ID NO：1所示始于第1位的丙氨酸止于第187位天冬酰胺。
  进一步讲，本发明提供了一种可溶性CTLA 4突变型分子，其具有(a)膜糖蛋白如CD 28、CD 86、CD 80、CD 40和gp 39的第一氨基酸序列，其与第二氨基酸序列融合阻断T细胞增殖；(b)如图7所示的突变型CTLA 4胞外区片段的第二氨基酸序列，能阻断T细胞增殖；(c)第三氨基酸序列，其作为一种识别标志或增加分子的溶解性。例如：第三氨基酸序列可基本上由非免疫原性免疫球蛋白分子的绞链区、CH2区、CH3区的氨基酸残基组成。适宜的免疫球蛋白分子的例子包括但不仅限于人或猴免疫球蛋白如：Cγ1。其它同型也可以。
突变型CTLA 4(在此也称为CTLA 4突变型分子)可通过加入第二种分子变得可溶。第二种分子的作用可能是增加CTLA 4的溶解性或者作为识别标志。适宜的第二种分子的例子包括但不仅限于p 97分子、env gp 120分子、E7分子和ova分子(Dash，B.et al.J.Gen.Virol.1994June，75(pt 6)：1389-97；Ikeda，T.，et al.Gene，1994 Jan 28，138(1-2)：193-6；Falk，K.，et al.Cell.Immunol.1993 150(2)：447-52；Fujisaka，K.et al.Virology 1994 204(2)：789-93)。也可使用其它分子(Gerard，C.et al.Neuroscience 1994 62(3)：721；Byrn，R.et al.1989 63(10)：4370；Smith，D.et al.Science 1987 238：1704；Lasky，L.Science 1996 233：209)。
本发明进一步提供了编码本发明中的可溶性突变型CTLA 4分子氨基酸序列的核酸分子。在一个实施方案中，核酸分子为DNA(如cDNA)或其杂合体。或者核酸分子为RNA或其杂合体。
另外，本发明提供了一种含发明cDNA的质粒。还提供了一种宿主载体系统。该系统包含在适宜宿主细胞中构建的质粒。作为适宜宿主细胞的例子包括但不仅限于细菌细胞和真核细胞。
本发明进一步提供了产生蛋白质的方法，包括培养本发明的宿主载体系统以便在宿主内生成蛋白质，和回收所生成蛋白质。
另外，本发明提供了一种调节功能性CTLA 4和CD 28阳性T细胞与CD 86和/或CD 80阳性细胞间相互作用的方法，包括将CD 80和/或CD 86阳性细胞与本发明的可溶性CTLA 4突变型分子接触以便形成CTLA 4/CD 80和/或CTLA 4/CD 86复合体，该复合体可干扰内源性CTLA 4抗原与CD 80和/或CD 86的反应。在本发明的一个实施方案中，可溶性CTLA 4突变型分子是一种至少包含一部分突变型CTLA 4胞外区的融合蛋白。在另一个实施方案中，可溶性CTLA 4突变型分子是CTLA 4 Ig融合蛋白，其第一氨基酸序列包括相当于CTLA 4胞外区氨基酸序列的大约第1位到第125位氨基酸残基，其第二氨基酸序列包括相当于人免疫球蛋白γ如Cγ1的绞链区、CH2区、CH3区的氨基酸残基，如SEQ ID NO 1所示。
按照本发明的实践，将CD 86+细胞与可溶性CTLA 4突变型分子片断或其衍生物接触。另外，可溶性CTLA 4突变型分子是一种CD 28 Ig/CTLA 4 Ig融合蛋白杂合体，其第一氨基酸序列相当于CD 28受体胞外区的一部分，并融合到第二个相当于CTLA 4突变型受体胞外区一部分的氨基酸序列中(SEQ ID NO 1)，第三个氨基酸序列相当于人免疫球蛋白Cγ1的绞链区、CH2区和CH3区。
本发明进一步提供了一种治疗由CD 28和/或CTLA 4阳性细胞与CD 86/CD 80阳性树状细胞相互作用所介导的免疫系统疾病的方法。在一个实施方案中，T细胞相互作用被抑制。
该方法包括给受试者施用本发明的可溶性CTLA 4突变型分子来调节T细胞与CD 80和/或CD 86阳性细胞间的相互作用。按照本发明的实践，可溶性CTLA 4突变型分子可以是CTLA 4 Ig融合蛋白，或者是一种带有与突变CTLA 4相连的膜糖蛋白的突变CTLA 4杂合体。
本发明还提供了抑制受试者体内移植物抗宿主疾病的方法，包括给受试者应用本发明的可溶性CTLA 4突变分子同时配合应用与IL-4反应的配体。
本发明包括突变型CTLA 4分子与其它免疫抑制剂的联合应用，如：环磷酰胺(Mathiesen，“异种移植的成蚀质细胞瘤细胞在环磷酰胺A处理大鼠中枢神经系统中的延长存活和血管化”Cancer Lett.，44(2)，151-6(1989))、强的松、硫唑嘌呤和氨甲喋呤(R.Handschumacher“Chapter 53：免疫抑制药物”Pages 1264-1276)。其它免疫抑制剂也可以。原核细胞中CTLA 4突变型分子的表达
在某些意义上CTLA 4突变型分子在原核细胞中表达是优选的。
通常原核细胞主要代表是不同株的细菌，可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性的。一般优选的是革兰氏阴性细菌如大肠杆菌。其它菌株也可以。
编码CTLA 4突变型分子的序列可插入到原核细胞如大肠杆菌中表达外源性序列的载体当中。这些载体含有常用的原核细胞调控序列，在此指的是包括转录起始的启动子、任选具有操纵子，以及核糖体结合位点序列；常用的启动子有β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子系统(Chang et al，Nature 198：1056(1977))、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel et al.，Nucleic Acids Res.8：4057(1980))和λ噬菌体PL启动子以及N-基因核糖体结合位点(Shimatake et al.，Nature 292：128(1981))。
这些载体还含有复制起点和选择性标志，如决定对抗生素抗性的β-内酰胺酶或新霉素磷酸转移酶的基团，因此这些载体能在细菌中复制并且在氨苄青霉素或卡那霉素存在时，带有质粒的细胞能被选择出来。
可通过多种标准方法将表达质粒导入原核细胞中，包括但不仅限于CaCl2体克法(见Cohen，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1972)69：2110，and Sambrook et al.(eds.)，分子克隆：实验室手册，第二版，Cold SpringHarbor出版社，(1989))和电转化法。真核细胞中CTLA 4突变型分子的表达
按照本发明的实践，真核细胞也是适宜的宿主细胞。
真核细胞的例子包括某些动物细胞(原代的或永生化的)、酵母菌(如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))和植物细胞。用作宿主细胞的动物细胞例子有骨髓瘤、COS和CHO细胞，植物细胞例子包括烟草(整个植株或烟草愈伤组织)、玉米、大豆和水稻细胞。玉米、大豆和水稻的种子也可以。
编码CTLA 4突变型分子的序列可插入到在真核细胞宿主中表达外源序列的载体中。不同的真核细胞宿主其载体的调控元件可能不同。
常用的真核细胞调控序列包括与哺乳类细胞相容的启动子和控制序列，例如：CMV启动子(CDM 8载体)和鸟肉瘤病毒(ASV)启动子(πLN载体)。其它常用的启动子包括猴病毒40(SV 40)早、晚期启动子(Fiers et al.，Nature 273：113(1973))或其它病毒来源的启动子，如多瘤病毒、腺病毒2和牛乳头状瘤病毒。一种诱导性启动子如hMTII也可以使用(Karin，et al，Nature 299：797-802(1982))。
真核细胞中表达CTLA 4突变型分子的载体也可携带称作增强子区域的序列。这些增强子在优化基因的表达中起重要作用，可见于启动子的上游或下游。
编码CTLA 4突变型分子的序列能整合进入真核宿主细胞的基因组中并随着宿主基因组的复制而复制。或者是带有CTLA 4突变型分子的载体可能包含了允许染色体外复制的复制起点。
为了在酿酒酵母中表达所述序列，可采用内源酵母菌质粒2μ的复制起点。(Broach，Meth.Enz.101：307(1983)。或者采用酵母菌基因组中能促进自主复制的序列。(见：Stinehcomb et al.，Nature 282：39(1979))；Tschemper et al.，Gene 10：157(1980)；and Clarkeet al.，Meth.Enz.101：300(1983))。
酵母菌载体转录调控序列包括糖酵解酶合成的启动子(Hess et al.，J.Adv.Enzyme Reg.7：149(1968)；Holland et al.，Biochemistry17：4900(1978))。本领域中已知的其它启动子包括由CDM 8载体提供的CMV启动子(Toyama and Okayama，FEBS 268：217-221(1990)、3-磷酸甘油酸激酶启动子(Hitzeman et al.，J.Biol.Chem.255：2073(1980))以及其它的糖酵解酶启动子。
某些启动子是诱导性的，因为它们可被环境刺激或细胞生长培基所调控。这些诱导性启动子包括来自热休克蛋白、醇脱氢酶2、同种细胞色素C、酸性磷酸酶、与氨代谢有关的酶和利用半乳糖和麦芽糖的酶的基因的启动子。
调控序列也可能位于编码序列的3′末端。这些序列可能起稳定mRNA的作用。在几种酵母来源的或哺乳动物基因中紧接编码序列的3′未翻译区中可见到这些终止子。
植物和植物细胞载体的例子包括但不仅限于土壤杆菌(Agrobacterium)Ti质粒、花椰菜花叶病毒(CaMV)，蕃茄金黄色花叶病毒(TGMV)。
哺乳动物细胞宿主体系转化的一般情况已由Axel描述过(U.S.Patent No.4,399,216，1983年8月16日授权)。哺乳动物细胞转化方法包括但不仅限于磷酸钙转染法、微注射法、电转化法、病毒载体转导法。
外源性DNA序列导入植物和酵母菌基因组中的方法包括(1)机械法，如用微注射法将DNA注入单细胞或原生质体中；在DNA存在下将玻璃珠与细胞涡旋混合；或将DNA包被的金粒或钨粒射入细胞或原生质体中，(2)用聚乙二醇处理或高压电脉冲作用(电转化)制备可通透大分子的原生质体而导入DNA，(3)利用与原生质体融合的脂质体(含cDNA)。CTLA 4突变型分子的鉴定和回收
CTLA 4突变型分子的表达可用考马斯(Coomassie)染色的SDS-PAGE法和抗CTLA 4抗体免疫印迹法检测。用标准的蛋白纯化的方法如亲和色谱法或离子交换色谱法可有效地回收蛋白，可得到基本纯的产物(R.Scopes Protein Purification，Principles and Practice，ThirdEdition Springer-Verlag(1994))。基于CTLA 4 Ig密码子的诱变
在一个实施方案中，用定向诱变和新的筛选程序来鉴定CTLA 4分子胞外区的几处突变，这些突变能增加CTLA 4分子与CD 86的结合力，而只略微改变与CD 80的结合。在此方案中，发生突变的残基位于CDR1环中(25位丝氨酸～33位精氨酸)、C′链中(49位丙氨酸和51位苏氨酸)、F链中(95位赖氨酸、97位谷氨酸和98位亮氨酸)以及CDR 3中99位蛋氨酸一直到104位酪氨酸，105位酪氨酸一直到109位甘氨酸和G链中114位谷氨酰胺、116位酪氨酸和118位异亮氨酸。这些位点是根据对嵌合型CD 28/CTLA 4融合蛋白研究结果选出的(J.Exp.Med，1994，180：2049-2058)，并根据一种模型推测其氨基酸残基侧链暴露于溶剂中，并且在CD 28和CTLA 4之间某些位置不具氨基酸残基同一性或同源性。并且任何与这些鉴定的残基在空间上接近(5-20埃单位)的残基被认为是本发明的内容。
采用二步法合成和筛选与CD 86结合的亲和力改变了的可溶性CTLA 4突变型分子。实验要求首先合成一个CTLA 4胞外区特定密码子发生突变的文库，然后通过BIAcore分析法筛选出来用于鉴定改变了与CD 86或CD 80反应性的突变。发明优点
比野生型CTLA 4结合CD 86能力更高的可溶性CTLA 4突变型分子应该比CTLA 4 Ig能更好地阻断抗原特异性活化细胞的激活。
另外，生产CTLA 4 Ig费用很高。高亲合力的突变型CTLA 4 Ig有很强的免疫抑制活性，在临床上用明显低于CTLA 4 Ig用量的突变型CTLA 4 Ig分子就能获得同等程度的免疫抑制效果。可溶性CTLA 4突变型分子如LEA 29Y成本上将是切实可行的。
以下实例用来详解本发明并帮助本领域普通技术人员制备和应用。实例决不意味着限制本发明的范围。实施例1
常规体内、外研究表明：CTLA 4 Ig本身不能完全阻断抗原特异性活化T细胞的激活。体外研究CTLA 4 Ig和CD 80或CD 86特异性单克隆抗体对T细胞增殖的抑制作用表明：抗CD 80单克隆抗体不能增强CTLA 4 Ig的抑制作用，而抗CD 86单克隆抗体则可以，这表明：CTLA4 Ig在阻断CD 86相互作用上不是那么有效。这些资料支持Linsley等的早期发现(Immunity，1994，1：793-801)，即抑制CD 80介导的细胞应答所需CTLA 4 Ig的浓度低于抑制CD 86介导的应答所需的100倍左右。基于这些发现提出：比野生型CTLA 4结合CD 86能力更高的可溶性CTLA 4突变型分子应该比CTLA 4 Ig能更好地阻断抗原特异性活化细胞的激活。
为此目的，用定向诱变和新的筛选程序来鉴定CTLA 4分子胞外区的几处突变，这些突变能增加CTLA 4分子与CD 86的结合力而只略微改变与CD 80的结合。突变的残基位于CDR 1环中(25位丝氨酸～33位精氨酸)、C′链中(49位丙氨酸和51位苏氨酸)、F链中(95位赖氨酸、97位谷氨酸和98位亮氨酸)以及CDR 3中99位蛋氨酸一直到104位酪氨酸，105位酪氨酸一直到109位甘氨酸和G链中114位谷氨酰胺、116位酪氨酸和118位异亮氨酸。这些位点是根据对嵌合型CD28/CTLA 4融合蛋白研究结果选出的(J.Exp.Med，1994，180：2049-2058)，并根据一种模型推测其氨基酸残基侧链暴露于溶剂，并且在CD 28和CTLA 4之间某些位置不具氨基酸残基同一性或同源性。方法：基于CTLA 4 Ig密码子的诱变
设计诱变寡核苷酸PCR引物以使一特定密码子位置1和位置2的某个碱基发生随机突变，而位置3只能是鸟嘌呤或胸腺嘧啶(XXG/T)。照这样，编码一个氨基酸的特定密码子可随机突变成编码20种氨基酸的任何一个密码子。编码突变的PCR产物十分接近CTLA 4 Ig的CDR 3样环(MYPPPY)，用SacI/XbaI酶切，并且亚克隆进入同样切割的CTLA 4 Ig IILN表达载体中。对于发生在十分靠近CTLA 4 Ig CDR 1样环的突变，先通过PCR引物定点诱变法在该环5′端引入一个静止的NheI限制性位点。用NheI/XbaI酶切PCR产物并亚克隆进入同样切割的CTLA 4 Ig表达载体中。微量制备质粒cDNA：
培养96种转化的细菌克隆，每一克隆代表一个特定位点的单一突变，用Biorobot 9600(Qiagen)自动制备出cDNA。COS细胞转染：
用突变型CTLA 4 Ig瞬时转染24孔培养板中培养的COS细胞，3天后收集培养基。BIAcore分析：
条件化的COS细胞培养基进入BIAcore中流过带有CD 86 Ig或CD80 Ig的生物传感器芯片，根据突变型分子比野生型CTLA 4 Ig流速慢来鉴定突变型CTLA 4 Ig。测定相应于选定培养基样品的cDNA序列并制备出足够量的DNA以进行大规模的COS细胞瞬时转染，由此制备出突变型CTLA 4 Ig蛋白，紧接着对培养基中蛋白A的纯化。
BIAcore分析条件和平衡结合数据分析按照J.Greene等所描述方法(1996)JBC 271(42)：26762进行。BIAcore数据分析：
分析前使感应图基线与0反应单位(RU)一致。由于溶液之间容积折射率不同，样本流过模拟衍生流动细胞来决定本底RU值。平衡解离常数(Kd)是根据Req比C的曲线计算出：Req是稳态反应减去模拟衍生芯片的反应，C是被分析物摩尔浓度。用商用非线性曲线拟合软件(Prism Graph PAD软件)分析结合曲线。
首先，实验数据符合配体与受体一对一结合模式(单位点模式，即：单一朗缪尔系统，
Figure A9880205400161
)，平衡结合常数(Kd＝[A].[B]\[AB])根据方程R＝Rmax.C/(Kd+C)计算出来。其次，实验数据符合最简单的配体结合的两点模式(即：一个受体有两个无交叉作用非依赖性结合位点)，描述为方程R＝Rmax1.C\(Kd1+C)+Rmax2.C\(Kd2+C)。
通过对比实验数据直观分析和平方和的F检验来统计学分析这两种模式的拟合优度。除非两点模式适合度非常好(p＜0.1)，一般选择简单的单位点模式是最适合的。
用BIA 2.1软件(Pharmacia)分析结合和解离作用。可用两种方法计算结合率常数Kon，即均一单位点相互作用和平衡双位点相互作用法。对于单位点相互作用，Kon值根据方程Rt＝Req(1-exp-ks(t-to))计算，Rt是给定时间t内的反应；Req是稳态反应；to是注入开始时间；ks＝dR/dt＝kon.Ckoff，其中C是待分析物浓度，ks是根据单位点结合计算的。对于双位点相互作用，kon值根据方程Rt＝Req1(1-exp-ks1(t-to))+Req2(1-expks2(t-to))计算。每种模式的Kon值取决于Ks比C曲线的斜率(最大结合约70％)。
根据单位点模式(AB＝A+B)或双位点模式分析解离数据，根据最优合曲线计算出解离率常数(koff)。一般用单位点模式，除非偏差大于仪器本底(2-10RU，取决于仪器)时才用双位点模式。用t1/2＝0.693/koff计算受体占据半衰期。流式细胞术
鼠单克隆抗体L 307.4(抗-CD 80)购自Becton Dickinson(SanJose，加利福尼亚)，IT 2.2(抗-B7-0[CD 86])购自Pharmingen(San Diego，加利福尼亚州)。为了免疫染色，用含有10mM EDTA的磷酸缓冲液孵育CD 80和/或CD 86阳性的CHO细胞，将其从培养容器中移出。CHO细胞(1～10×105)先与单克隆抗体或免疫球蛋白融合蛋白在含10％胎牛血清(FBS)的DMEM中共育，然后洗涤，与异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠或羊抗人免疫球蛋白第二步试剂共育(Tago，Burlingame，加利福尼亚)。细胞最后洗一次后在FACScan上分析(Becton Dickinson)。
CTLA 4 Ig和突变分子结合恒定转染的CD 80和CD 86阳性CHO细胞的FACS分析法操作如下：(见图2)。
CD 80和CD 86阳性的CHO细胞与浓度不断增加的CD 28 Ig共育，洗涤后用异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白检测结合的免疫球蛋白融合蛋白。同法检测CTLA 4 Ig的结合。
图2中LEA 29Y(圆圈，O)和L 106E(三角形，△)结合的CHO细胞(1.5×105)与一定浓度CTLA 4 Ig(方块，■)23℃下，共育2小时后洗涤，再与异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白抗体共育。用FACScan分析共5000个活细胞的结合(单测定)，用PC-LYSYS数据直方图确定其平均荧光强度(MFI)。背景荧光用只与第二步荧光标记抗体共育的细胞测定(MFI＝7)，并以此校正所测数据。对照L6单克隆抗体(80μg/ml)的MFI小于30。这代表着四个独立的实验。功能测定：
人CD 4阳性细胞如本文所述分离。
用免疫磁性负选择法分离CD 4+T细胞(Linsley et al.，(1992)“CTLA 4和CD 28在活化T淋巴细胞上的共表达和功能协作”J.Exp.Med.176：1595-1604)。
如图3所示进行PMA和CD 80-或CD 86-的CHO细胞对T细胞刺激作用的抑制。为测定刺激作用，将PHA集落(Linslty et al.，(1991)“B细胞活化抗原B7对CD 28的结合共刺激T细胞增殖和IL-2mRNA积累”J.Exp.Med.173：561-570)以4×104/孔与照射过的CHO细胞刺激物共培养，对照无照射过的CHO细胞。CD 4+T细胞(8-10×104/孔)在有或无照射过的CHO细胞刺激物存在下，加1nM PMA培养72小时，在最后7小时内加入1μCi/孔的3[H]-胸苷测定增殖反应。用酶免疫测定仪(Biosource，Camariuo，California)测条件培养基(刺激24小时后收集的)中IL-2的产量。
图4和图5显示上述所制备的异种刺激人类T细胞的抑制作用，是用一种叫作PM的人类B细胞LCL系进行异种刺激。T细胞浓度为3×104/孔，PM浓度为8.0×103/孔。首次异种刺激6天后，在测同位素掺入7小时前用3H-胸苷处理细胞；再次异种刺激按下述方法进行。用LSM(Ficol)收集经首次异种刺激作用7天的T细胞，静置24小时，然后用与首次相同剂量的PM再刺激，3天后用放射性标记物处理细胞，并按上法收集。为测定细胞因子产量(图5)，建立了另一套同样的再次异种刺激板，3天后，按制造商推荐的条件，用Biosource试剂盒测试。
图6显示猴混合淋巴细胞反应(MLR)。将来自两只猴的PBMC′S用LSM提纯，然后分别以3.5×104/孔与2μg/ml PHA混合，刺激3天后，收集前16小时用放射性标记物处理。
              表I平衡结合常数
                CD 80 Ig(kd)             DC 86 Ig(kd)CTLA 4 Ig           0.925″0.025             5.2″1.38L 106 E             0.84″0.04               3.4″0.35LEA 29 Y            1.26″0.34               2.6″0.71BIAcoreTM分析：所有实验均在25℃温度下在BIAcoreTM或BIAcoreTM2000生物传感器上进行(Pharmacia Biotech AB，Uppsala)。用标准的N-乙基-N′-(二甲氨基丙基)碳化二亚胺N-羟基琥珀酰亚胺偶合物(Johnsson，B.，et al.(1991)Anal.Biochem.198：268-277；Khilko，S.N.，et al.(1993)J.Biol.Chem 268：5425-15434)将配体固定在研究级NCM 5号传感器芯片上(Pharmacia)。
                   序列说明(1)一般资料(i)申请人：Peach，Robert J.Namura，Joseph R.
          Linsley，Peter S.Bajorath，Jurgen(ii)发明名称：可溶性CTLA 4突变型分子及应用(iii)序列号：1(iv)通讯地址：
  (A)联系人：Bristol-Myers Squibb Company
  (B)街道：P.O.Box 4000
  (C)城市：普林斯顿
  (D)州：新泽西州
  (E)国：美国
  (F)邮政代号：08543-4000(v)计算机可读形式：
  (A)介质类型：软盘
  (B)计算机：IBM PC兼容机
   (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
   (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)本申请数据：
   (A)申请号：
   (B)申请日：
   (C)分类：(viii)律师/代理人资料：
   (A)姓名：Sorrentino，Joseph M.
   (B)注册号：32，598
   (C)参考/文挡号：ON 0152a(ix)电讯资料
   (A)电话：(609)252-3953
   (B)电传：(609)252-4526(1)SEQ ID NO：1信息：(i)序列特征：
(A)长度：561碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：非(iv)反义：非(vi)原始来源：
(A)有机体：Homo Sapiens(ix)特征：
(A)名称/关键词：CDS
(B)位置：1..561(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：GCA ATG CAC GTG GCC CAG CCT GCT GTG GTA CTG GCC AGC AGC CGAGGC   48Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser ArgGly1               5                  10                  15ATC GCC AGC TTT GTG TGT GAG TAT GCA TCT CCA GGC Xaa GCC ACTGAG  96Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Xaa Ala ThrGlu
         20                  25                  30GTC CGG GTG ACA GTG CTT CGG CAG GCT GAC AGC CAG GTG ACT GAAGTC 144Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr GluVal
     35                  40                  45TGT GCG GCA ACC TAC ATG ATG GGG AAT GAG TTG ACC TTC CTA GATGAT 192Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu AspAsp
 50                  55                  60TCC ATC TGC ACG GGC ACC TCC AGT GGA AAT CAA GTG AAC CTC ACTATC 240Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu ThrIle65                          70                          7580CAA GGA CTG AGG GCC ATG GAC ACG GGA CTC TAC ATC TGC AAG GTGGAG 288Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys ValGlu
             85                  90                  95CTC ATG TAC CCA CCG CCA TAC TAC CTG Yaa ATA GGC AAC GGA ACCCAG 336Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Yaa Ile Gly Asn Gly ThrGln
        100                 105                 110ATT TAT GTA ATT GAT CCA GAA CCG TGC CCA GAT TCT GAC TTC CTCCTC 384Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe LeuLeu
    115                 120                 125TGG ATC CTT GCA GCA GTT AGT TCG GGG TTG TTT TTT TAT AGC TTTCTC 432Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser PheLeu
130                 135                 140CTC ACA GCT GTT TCT TTG AGC AAA ATG CTA AAG AAA AGA AGC CCTCTT 480Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser ProLeu145                         150                         155160ACA ACA GGG GTC TAT GTG AAA ATG CCC CCA ACA GAG CCA GAA TGTGAA 528Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu CysGlu
            165                 170                 175AAG   CAA   TTT   CAG   CCT   TAT  TTT  ATT  CCC  ATC   AAT561Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
        180                 185

Claims (27)

1.结合CD 86的可溶性CTLA 4突变型分子，该CTLA 4突变型分子的氨基酸序列如图7所示，其中名为Xaa的第29位氨基酸选自丙氨酸和酪氨酸，名为Yaa的第106位氨基酸选自谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸和苏氨酸。
2.权利要求1的可溶性CTLA 4突变型分子，包括如SEQ ID NO：1所示的187个氨基酸，始于第1位的丙氨酸止于第187位的天冬酰胺。
3.权利要求1的可溶性CTLA 4突变型分子，其中Xaa是丙氨酸，Yaa是谷氨酸。
4.权利要求1的可溶性CTLA 4突变型分子，其中Xaa是酪氨酸，Yaa是谷氨酸。
5.一种可溶性CTLA 4突变型分子，其具有：
(a)相当于图7所示的CTLA 4突变型的胞外区的第一氨基酸序列；
(b)相当于改变CTLA 4突变型分子溶解性和与CD 86结合的亲和力和/或效价那部分的第二氨基酸序列。
6.权利要求5的可溶性CTLA 4突变型分子，其中所述部分是免疫球蛋白恒定区。
7.可与CD 86抗原反应的可溶性突变型CTLA 4 Ig融合蛋白，该蛋白具有由图7所示的CTLA 4突变型胞外区组成的第一氨基酸序列，和由人免疫球蛋白Cγ1中绞链区、CH2区和CH3区组成的第二氨基酸序列。
8.具有图7所示氨基酸序列的可溶性CTLA 4突变受体蛋白，其可识别和结合CD 86抗原。
9.包括SEQ ID NO 1中第1位丙氨酸到187位天冬酰胺的187个氨基酸的可溶性CTLA 4突变型分子。
10.编码相当于权利要求1的可溶性CTLA 4突变型分子的氨基酸序列的核酸分子。
11.权利要求10的cDNA。
12.包含权利要求11的cDNA的质粒。
13.在合适宿主细胞中包括权利要求12的质粒的宿主载体系统。
14.权利要求13的宿主载体系统，其中适宜的宿主细胞是细菌细胞。
15.权利要求13的宿主载体系统，其中适宜的宿主细胞是真核细胞。
16.生产蛋白质的方法，包括培养权利要求13的宿主载体系统以在宿主中产生蛋白质和回收生成的蛋白质。
17.调节功能性CTLA 4阳性T细胞与CD 80和CD 86阳性细胞间相互作用的方法，包括将CD 80和CD 86阳性细胞与权利要求1的可溶性CTLA 4突变型分子接触，以形成CTLA 4/CD 80和/或CTLA 4/CD 86复合体，该复合体干扰内源性CTLA 4抗原与CD 80和CD 86之间的反应。
18.权利要求17的方法，其中可溶性CTLA 4突变型分子是一种融合蛋白，至少包含突变型CTLA 4胞外区的一部分。
19.权利要求17的方法，其中可溶性CTLA 4突变型分子是CTLA4 Ig融合蛋白，其第一氨基酸序列包括相当于CTLA 4胞外区的氨基酸序列中大约第1位到第125位氨基酸残基，其第二氨基酸序列包括相当于SEQ ID NO 1所示人免疫球蛋白Cγ1绞链区、CH2区和CH3区的氨基酸残基。
20.权利要求17的方法，其中CD 86阳性细胞和可溶性CTLA 4突变型分子片段或其衍生物接触。
21.权利要求20的方法，其中CD 86阳性细胞是B细胞。
22.权利要求17的方法，其中CTLA 4阳性T细胞与CD 80和CD86阳性细胞间相互作用被抑制。
23.由T细胞与CD 80和CD 86阳性细胞相互作用介导的免疫系统疾病的治疗方法，包括给受试者施用权利要求1的可溶性CTLA 4突变型分子来调节T细胞与CD 86阳性细胞间的相互作用。
24.权利要求23的方法，其中可溶性CTLA 4突变型分子是CTLA4 Ig融合蛋白。
25.权利要求23的方法，其中可溶性CTLA 4突变型分子是突变的CD 28 Ig/CTLA 4 Ig融合蛋白杂合体。
26.权利要求23的方法，其中所说的T细胞相互作用被抑制。
27.受试者体内移植物抗宿主疾病的抑制方法，包括给受试者施用权利要求1的可溶性CTLA 4突变型分子和与IL-4反应的配体。
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