KR20020007314A - Ｉｇｅ의 ｃ-엡실론-3 또는 ｃ-엡실론-4 도메인으로부터유도된 에피토프 또는 미모토프, 이들의 길항제 및 이들의치료학적 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 알레르기 질환을 치료, 예방, 또는 경감시키기 위한 신규한 약제를 제공하는 것에 관한 것이다. 특히, 상기 신규한 약제는 IgE의 Cε3 또는 Cε4 도메인으로부터 유도된 에피토프 또는 미모토프이다. 이들 신규 영역은 피동 또는 능동 면역 예방 또는 면역 치료 둘 모두의 표적일 수 있다. 본 발명은 또한 이들을 함유하는 약제 , 약제 조성물의 제조 방법 및 약제에서의 이들의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 IgE 영역과 결합할 수 있는 리간드 특히, 모노클로날 항체 및 피동 면역치료 또는 면역 예방에서의 이들 리간드의 용도는 본 발명의 일면을 형성한다.

Description

ＩＧＥ의 Ｃ-엡실론-3 또는 Ｃ-엡실론-4 도메인으로부터 유도된 에피토프 또는 미모토프, 이들의 길항제 및 이들의 치료학적 용도 {EPITOPES OR MIMOTOPES DERIVED FROM THE C-EPSILON-3 OR C-EPSILON-4 DOMAINS OF IGE, ANTAGONISTS THEREOF, AND THEIR THERAPEUTIC USES}

알레르기 반응에서, 알레르기와 관련된 공통적인 증상은, 면역세포로부터 알레르기 매개체 예컨데, 히스타민이 주변 조직 및 혈관구조내로 방출됨에 의해 비롯된다. 히스타민은 알레르겐 특이적 IgE와 상호작용에 그의 방출이 유발될 때까지 통상 비만세포 및 호염기구중에 저장된다. IgE이 알레르기 반응 예컨데, 천식, 음식물 알레르기, 아토피성 피부병, I형 과민증, 및 알레르기성 비염을 매개하는 기능을 갖는 것으로 알려져있다. B세포는 항원 예컨데, 꽃가루 또는 먼지진드기 알레르겐과 접촉하는 경우, 알레르겐 특이적 IgE의 합성을 개시한다. 다음, 알레르겐 특이적 IgE는 호염기구 및 비만세포상의 FcεRI 수용체 (고친화성 IgE 수용체)와 결합한다. 알레르겐과의 임의의 후속하는 접촉은, 이웃하는 IgE/FcεRI 복합체의 교차결합에 의한 비만세포 또는 호염기구로부터의 히스타민 방출의 개시를 유도한다 (Sutton and Gould, Nature, 1933, 366:421-428; EP 0477 231 B1).

모든 면역글로불린과 같이, IgE는 두개의 중쇄 및 두개의 경쇄를 포함한다. ε중쇄는 5개의 도메인으로 구성된다: 1개의 가변 도메인 (VH) 및 4개의 불변 도메인 (Cε1 내지 Cε4). IgE의 분자량은 약 190,000 Da이고, 중쇄는 약 550개의 아미노산이다. IgE의 구조(즉, PDB(Protein Data Bank, Research Collabirotory for Structural Bioinformatics; http:/pdb-browsers.ebi.ac.uk)에 1990년 10월 2일자에 기탁된 구조의 2IgE)는 문헌 (파드란 및 데이비스, Mol. Immunol., 23, 1063-75, 1986, 및 헬름 등.)에 기술되어 있다. 각각의 IgE 도메인은 2개의 β-시트로 구분되고 a 내지 f로 표지된, 7개의 연장된 (β-) 폴리펩티드 분절의 역평행 가닥이 납작하게 형성된 배럴로 구성된다. 4개의 β-가닥 (a, b, d 및 e)이 3개의 가닥 (c, f 및 g)(도 8 참조)의 제 2의 시트에 대해 스태킹된 하나의 시트를 형성한다. 각각의 β-시트의 형태는 각각의 시트내의 이웃하는 역평행 가닥으로부터의 아미노산 잔기 측쇄의 측면 패킹에 의해 유지된다 (그리고, 이들 가닥사이의 주쇄 수소결합에 의해 추가로 안정적이 된다). 연장되지 않은 (비-β-) 입체구조를 형성하는 잔기의 루프는, 역평행 β-가닥을 시트내에서 또는 대응하는 시트 사이에서연결한다. 가닥 a로부터 가닥 b까지의 연결을 A-B루프로 표지하는 것과 같은 방식으로 표지한다. 상기 A-B 루프 및 d-e 루프는 위상적으로 4가닥 시트에 속하며, 루프 f-g는 3가닥 시트에 속한다. 한쌍의 대응하는 시트의 사이의 계면은 구형 도메인의 소수성 내부를 제공한다. 이러한 수-불용성 즉, 주로 소수성 코어는 대응하는 β시트의 마주 접하는 잔기 측쇄의 밀접한 패킹에 의한 결과이다.

과거에, IgE 매개 히스타민 방출 기작을 방해하기 위해 디자인된 다수의 능동 또는 피동 면역치료적 접근이 연구조사되었다. 이러한 접근들은 IgE 또는 알레르겐/IgE 복합체가 FcεRI 또는 FcεRⅡ(저친화성 IgE 수용체) 수용체와 결합하는 것을 방해하거나, 피동적으로 투여된 항체를 방해하거나, 수용체와 경쟁적으로 결합하는 IgE 유도된 펩티드의 피동적 투여를 것을 방해하는 것을 포함한다. 또한, 몇몇 저자는, IgE로부터 유도된 특이적 펩티드를 면역반응을 저해하는 히스타민 방출을 자극하기 위해 활성 면역화에 사용하는 것을 기술했다.

이들의 연구조사 과정에서, 과거 당업자들은 많은 신규한 항알레르기 치료의 디자인에 직면하여 고려해야 만하는 연구과제 및 문제점에 봉착하게 되었다. 가장 위험한 문제중의 하나는 히스타민 방출 시그날에 IgE 교차결합이 포함되는 것에 관한 것이다. 활성 백신화 동안, 항-IgE 항체의 생성이, 알레르겐이 없음에도 이웃하는 IgE 수용체 복합체들의 교차결합에 의해 히스타민 방출을 그 자체로서 개시할 수 있다는 점이 가장 빈번한 문제이다. 이러한 현상은 아나필락시스원성으로 명명된다. IgE 측정 분석에 통상적으로 사용되는 많은 시판중인 항-IgE 모노클로날 항체가 아나필락시스원성이며, 따라서 환자에 투여되는 경우 쓸모없거나 위험하다.

항체가 아나필락시스원성인지 아닌지는 IgE 분자상의 표적 에피토프의 위치에 따라 결정된다. 그러나, 이러한 영역에 대한 현재의 지식 상태에 기초한 많은 과학적인 관심과 노력에도 불구하고, 임의의 항체 또는 에피토프의 특성 및 환자에 대한 긍정적 또는 부정적인 치료 효과에 대해 전혀 또는 거의 예측할 수 없다.

따라서, 안전하면서도 효과적이 되도록 하기 위해서는, 피동 투여되거나 백신 유도된 항체는 그 자체가 아나필락시스성이 되지 않으면서 히스타민 유발 경로를 방해할 수 있어야 한다. 본 발명은 이러한 모든 목적을 달성하며, 히스타민 방출을 저해할 수 있는 비-아나필락시스성 항체를 증가시킬 수 있는 약제를 제공한다. 이들 약제는 활성 백신의 기초를 형성하거나, 피동 면역치료를 위한 적절한 항체의 증가에 이용되거나, 치료 효과를 얻기 위해 그 자체가 피동 투여될수 있다.

IgE 매개 알레르기성 반응에 대해 몇가지 유리한 효과를 갖는 특이적 항-IgE 항체를 동정하기 위해 많은 연구가 당업자에 의해 수행되었다 (WO 90/15878, WO 89/04834, WO 93/05810). 이들 유용한 항체에 의해 인식되는 에피토프를 동정하여이러한 에피토프의 펩티드 미모토프를 생성시키고, 이를 항-IgE 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용하기 위한 시도가 있었다.

WO 97/31948은 이러한 유형의 연구를 기술하고 있으며, 또한 활성 백신화를 위한, 담체 분자와 컨쥬게이션된 Cε3 및 Cε4 도메인으로부터의 IgE 펩티드를 기술하고 있다. 이들 면역원은 백신화 연구에 이용될 수 있으며, 후속하여 생체내에서 히스타민 방출을 저해하는 항체를 생성할 수 있는 것으로 알려졌다. 이 연구에서, 활성 백신화 목적에 유용한 Cε3 도메인내에 함유된 IgE 펩티드와 결합할 수있는 것으로 알려진 모노클로날 항체 (BSW17)가 기술되었다.

EP 0 477 231 B1은 활성 백신화 면역예방에 이용되는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)과 컨쥬게이션된, IgE의 Cε4 도메인(잔기 497-506, 또한 스탄워쓰 데카펩티드로 알려짐)으로부터 유도된 면역원을 기술한다. WO 96/14333은 EP 0477 231 B1에 기술된 연구의 연속이다.

다른 접근은, 호염기구 또는 비만세포상의 저친화성 또는 고친화성 수용체와 IgE의 결합에 대해 경쟁하는, Cε3 또는 Cε4로부터 유도된 펩티드의 동정에 기초한다 (WO 90/15878, WO 89/04834, WO 93/05810).

본 발명은 알레르기 질환의 치료, 예방, 또는 개선을 위한 신규한 약제의 제공에 관한 것이다. 특히, 상기 신규한 약제는 IgE의 Cε3 또는 Cε4 도메인으로부터 유도된 에피토프 또는 미모토프이다. 이들 신규한 영역은 능동 및 피동 면역예방 또는 면역치료 둘 모두에 대한 표적일 수 있다. 본 발명은 또한 상기 약제의 생산 방법, 이들을 포함하는 약제 조성물, 이들의 약제 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 IgE 영역과 결합할 수 있는 리간드 특히, 모노클로날 항체, 및 피동 면역예방 또는 면역치료용 약제에서의 이들의 용도가 본 발명의 일 면을 형성한다.

본 발명은 활성 또는 피동 면역예방 또는 면역치료에 이용되는 IgE의 신규한 서열의 동정에 관한 것이다. 이들 서열은 이전에 항-알레르기 치료와 관련된 적이 없었다. 본 발명은, 표면에 노출된 것으로서 동정된 IgE의 연속 부분으로부터 단리된 특이적 에피토프와 자체로서 펩티드 그 자체를 제공하며, 또한 이들 신규한 것으로서 동정된 에피토프의 미모토프를 제공한다. 이들 펩티드 또는 미모토프는 알레르기의 치료에 단독으로 사용되거나, 백신에 사용되어 활성 면역예방 또는 면역치료 동안에 백신처리된 피험자로부터 알레르기 증상을 제한, 경감, 또는 제거하기 위하여 자가 항-IgE 항체를 유도하는데 이용될 수 있다.

놀랍게도, 본 발명의 펩티드에 의해 유도된 항-IgE 항체는, 비-아나필락시스원성이며 비만세포 및 호염기구로부터 IgE 매개된 히스타민을 블록킹할 수 있다.

본 발명에 따른 펩티드이며, 펩티드 개질의 기재가 되는 사람 IgE의 영역은하기 표 1과 같다:

표 1

펩티드	서열	서열 위치 및 IgE 도메인	서열번호
P5	RASGKPVNHSTRKEEKQRNGTL	Cε3	1
P6	GTRDWIEGE	Cε3	2
P7	PHLPRALMRSTTKTSGPRA	Cε3/Cε4	3
P8	PEWPGSRDKRT	Cε4(Pro451-Thr461)	4
P9	EQKDE	Cε4	5
P200	LSRPSPFDLFIRKSPTITC	Cε3	6
P210	WLHNEVQLPDARHSTTQPRKT	Cε4	7
1-90N	LFIRKS	Cε3	81
2-90N	PSKGTVN	Cε3	82
3-90N	LHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGS	Cε4	83
4-90N	SVNPGK	Cε4	84

이들 에피토프를 통합하는 펩티드는 본 발명의 바람직한 일면을 형성한다. 이들 에피토프와 동일한 특성을 갖는 미모토프, 및 IgE 분자의 콘텍스트내의 IgE 에피토프와 교차반응하는 면역반응을 일으키는 미모토프를 함유하는 면역원이 또한 본 발명의 일부를 구성한다.

따라서, 본 발명은 이들 IgE 에피토프 그 자체를 포괄하는 단리된 펩티드 및 임의의 이들의 미모토프를 포함한다. 미모토프는 천연 IgE 에피토프를 인식하는 항체에 의해 인식될 수 있을 정도로 천연 IgE 에피토프와 충분히 유사한 것을 의미하거나(참고문헌: Gheysen, H.M., et al., 1986, Synthetic peptides as antigens. Wiley, Chichester, Ciba foundation symposium 119, p130-149; Gheysen, H.M., 1986, Molecular Immunology, 23,7, 709-715); 적합한 담체와 결합되는 경우에 천연 IgE 에피토프와 교차반응하는 항체를 증가시킬 수 있는 것을 의미한다.

본 발명의 미모토프는 펩티드성이거나 비펩티드성이다. 상기 동정된 표면 노출 IgE 에피토프의 펩티드성 미모토프의 서열은 또한 천연 에피토프와 완전히 동일할 수 있다. 이러한 분자는 에피토프의 미모토프로 기술되는데, 이는 비록 두개의 분자가 동일한 서열을 공유하고 있더라도 미모토프는 전체 IgE 도메인 구조의 콘텍스트중에 존재하지 않으며, 천연 IgE 에피토프와는 다소 상이한 입체구조를 가질 수 있기 때문이다. 상기 동정된 선형 서열 (P1 내지 P7)이 IgE의 4차 구조내에 있는 경우에 IgE의 주요 서열내에서 이격되어 존재할 수 있는 다른 영역들과 인접하여 존재한다는 것이 또한 당업자에게는 자명하다. 이와 같이 예를 들어, P1의 미모토프는 이것이 P1의 분절 및 이들 이격된 아미노산 잔기를 구성하는 분절을 포함하거나 모방한다는 점에서 연속적이거나 비연속적일 수 있다.

본 발명의 미모토프는 IgE의 표면 노출 영역을 모방하지만, 이들 영역내에서 본 발명자의 주안점은 루프 구조와 상호연결될 수 있는 표면 노출 구역내의 영역이다. IgE 도메인의 구조는 문헌 ("Introduction to protein Structure", page 304, 2nd Edition, Branden and Tooze, Garland Publishing, New York, ISBN 0 8153 2305-0)에 기술되어 있으며, 2개의 대응하는 역평행 β-시트로 구성된 β-배럴을 형성한다 (도 8). 따라서, 미모토프는 이웃하는 시트로부터의 천연 아미노산 잔기 일 수 있는 N 또는 C 말단 연장부를 지닌 루프를 포함할 수 있다. 이것의 예로서, P100은 Cε3의 A-B 루프를 포함하고, P8은 Cε4의 A-B루프를 포함하며, P5은 Cε3의 C-D루프를 포함하고, P110은 Cε4의 C-D루프를 포함한다. 따라서, 이들 루프의 미모토프는 본 발명의 일면을 형성한다. 특히 바람직한 루프는 Cε3 또는 Cε4의 C-D 루프, 및 Cε4의 A-B 루프이다.

상기 동정된 IgE 에피토프의 펩티드 미모토프는, 선택된 아미노산의 첨가,결실, 치환에 의해 특정 목적에 따라 디자인 될 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 펩티드는 단백질 담체에 대한 컨쥬게이션을 용이하게 하기 위한 목적으로 개질될 수 있다. 예를 들어, IgE 에피토프에 시스테인 말단을 포함시키기 위한 어떠한 화학적 컨쥬게이션 방법이 요구될 수 있다. 또한, 단백질 담체와 컨쥬게이션된 펩티드가 펩티드의 컨쥬게이션된 말단으로부터 소수성 말단 원위를 포함하도록하여, 펩티드의 비컨쥬게이션 유리 말단부가 담체 단백질의 표면과 연결된 채로 존재하는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 펩티드의 입체구조 자유도를 감소시키며, 그 결과 펩티드가 전체 IgE 분자의 콘텍스트중에 발견되는 경우의 IgE 펩티드의 입체구조와 가장 밀접하게 유사한 입체구조로 존재할 가능성을 증가시킨다. 예를 들어, 상기 펩티드는 N-말단 시스테인 및 C-말단 소수성 아미데이티드 테일을 갖도록 변형될 수 있다. 또한, 하나 이상의 아미노산의 D-입체이성질체의 첨가 및 치환하여 예를 들어, 펩티드의 안정성을 증진시키기는데 유리한 유도체를 생성시킬 수 있다. 당업자는 이러한 개질된 펩티드, 또는 미모토프가 전체적으로 또는 부분적으로 비펩티드 미모토프일 수 있으며, 여기서 구성 잔기가 반드시 20개의 천연 발생 아미노산일 것이 요구되는 것이 아님을 알게될 것이다. 또한, 이들 펩티드는 당업계에 공지된 기술에 의해 고리화되어 펩티드 서열이 전체 IgE 분자의 콘텍스트중에 있는 경우의 형상과 매우 유사한 입체구조가 되도록 속박될 수 있다. 펩티드를 고리화시키는 바람직한 방법은 한쌍의 시스테인 잔기를 가하여 이황화 가교를 형성시키는 것을 포함한다.

또한, 당업자는 본 발명의 미모토프 또는 면역원이 상기 동정된 에피토프 보다 더 크며, 본원에 기술된 서열을 포함할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 미모토프는 한쪽 또는 양쪽 말단부에서 다수의 다른 천연 잔기의 N 말단 및/또는 C 말단 연장의 첨가로 구성될 수 있다. 또한, 펩티드 미모토프는 서열 배향이 역위되었다는 점에서 천연 IgE 서열의 리트로 서열이거나; 또는 상기 서열은 전체 또는 일부 이상에 D-입체이성질체 아미노산을 포함할 수 있다 (인버소 (inverso) 서열). 또한, 펩티드 서열은, 서열 배향이 역위되고, 아미노산이 D-입체이성질체 형태라는 점에서 리트로-인버소일 수 있다. 이러한 리트로 또는 리트로-인버소 펩티드는 비자기(non-self)라는 잇점이 있으며, 따라서 면역반응에서 자가-내성 (self-tolerance)의 문제를 극복할 수 있다 (예를 들어, P14c).

또한, 펩티드 미모토프는 그 자체가 예컨데, 파아지 디스플레이 방법을 사용하여 본 발명의 IgE 에피토프와 결합할 수 있는 항체를 사용함에 의해 동정될 수 있다 (EP 0 552 267 B1). 이 방법은 천연 펩티드 구조를 모방하는 다수의 펩티드 서열을 생성시키며, 이에 따라 항-천연펩티드 항체와 결합할 수 있으나, 이들 자체는 천연 IgE 펩티드와 현저한 서열 상동성을 공유하는 것이 반드시 요구되는 것은 아니다. 이러한 접근은 증가된 면역원성 특성 (예컨데, IgE 수용체 또는 항-IgE 항체에 대한 보다 더 고친화성 결합, 또는 IgE와 보다 더 고친화성으로 결합하는 폴리클로날 면역반응의 유도 가능성)을 지닌 펩티드의 동정을 가능하게 하거나, 천연 펩티드 서열의 사용과 관련될 수 있는 어떠한 잠재적인 자가-항원 내성의 문제를 극복할 수 있다. 또한, 이 기술은 인식된 미모토프 서열에서 화학적 특성을 공유한다는 관점에서 각각의 천연 펩티드에 대한 인식 패턴의 동정을 허용한다.

표 2

또한, 펩티드 미모토프는 이것의 항-IgE 펩티드 폴리클로날 항체에 대한 친화성을 증가시킴에 의해 펩티드의 면역원성을 증가시킬 목적으로 생산될 수 있으며, 그 효과는 당업계에 공지된 기술 예컨데, 바이오코어 실험(Biocore experiment)으로 측정할 수 있다. 이를 달성하기 위해, 펩티드 서열을 하기 일반 규칙을 따라 선별적으로 변화시킬 수 있다:

* 구조적 콘스트레인트를 유지하기 위해, 프로린과 글리신은 치환되면 않된다.

* 다른 위치는 유사한 생리화학적 특성을 지닌 아미노산에 의해 치환될 수 있다.

이와 같이, 각각의 아미노산 잔기는 그 아미노산과 가장 유사한 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 예를 들어, A는 하기 표에 기술된 바와 같이, V, L, 또는 I에 의해 치환될 수 있다.

표

특히 바람직한 IgE 펩티드는 P8 및 이것의 변형체 (예컨데, P14 또는 P14a)이다. 이들 펩티드는 담체와 결합하여 항-IgE 면역반응을 유도할 잠재성이 있으며, 이러한 반응은 사람 호염기구로부터 히스타민 방출을 저해할 수 있다. P8의 변형체 또는 미모토프는 면역반응을 유도할 수 있는 임의의 펩티드 기재 면역원으로서 주로 기술되며, 이러한 반응은 P8을 인식할 수 있다. 본 발명의 범위를 제한함이없이, P8의 몇가지 변형체가 하기 일반식으로 기술될 수 있으며, 여기서 특정 아미노산은 이들의 가장 유사한 카운터파트에 의해 치환될 수 있다. 이 기술을 사용하여, P8 펩티드 미모토프는 하기 일반식으로 기술될 수 있다:

P, X₁, X₂, P, X₃, X₄, X₅, X₆, X₅, X₅, 또는

P, X₁, X₂, P, G, X₄, R, D, X₅, X₅

상기식에서, X₁은 E, D, N 및 Q로부터 선택된 아미노산이고; X₂는 W, Y 및 F로부터 선택된 아미노산이며; X₃는 G 및 A로부터 선택된 아미노산이고, X₄는 S, T 및 M으로부터 선택된 아미노산이며; X₅는 R 및 K로부터 선택된 아미노산이고; X₆는 D 및 E로부터 선택된 아미노산이다.

P8 미모토프는 파아지 디스플레이 방법 (EP 0 552 267 B1)을 사용하여, 그 스스로가 P8와 결합할 수 있는 항체를 이용함에 의해 동정될 수 있다. 이러한 관점에서, 모노클로날 항체 예컨데, P14/23, P14/31 및 P14/33이 특히 적합하다.

따라서, 본 발명은 신규한 에피토프 및 이것의 미모토프, 및 알레르기의 예방 및 치료를 위한 약제 제조에서의 이들의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명의 하나 이상의 에피토프 또는 미모토프 및 담체 분자를 포함하는 면역원이, 알레르기의 면역예방 또는 면역치료를 위한 백신에서의 사용을 위해 제공된다. 따라서, 본 발명의 에피토프, 미모토프, 또는 면역원이 알레르기 질환의 약제, 및 치료 또는 예방에서의 사용을 위해 제공된다. 본 발명의 바람직한 면역원 및 백신은 P14를 포함하는 IgE 에피토프 P8, 또는 이것의 미모토프를 포함한다.

본 발명자들은 상기 에피토프 또는 미모토프가 제공되는 다른 방법들이 모노클로날 항체와의 결합 및 백신화 이후의 면역반응에 상당한 효과를 갖는 것을 밝혔다. 예를 들어, 고리화된 펩티드를 사용하는 경우, 루프의 길이 및 위상을 변형시키는 것이 고리화된 미모토프와 P14 모노클로날 항체 (P14/23, P14/31 또는 P14/33)의 결합에 상당한 효과를 가질 수 있다. 이와 같이, 본 발명자들은 고리화 부위를 선택하고 그 결과 고리화된 펩티드가 정확한 루프 구조중에 유지되며, 정확한 아미노산 잔기를 포함하는 신규한 시스템을 개발하였다. 이러한 방법에서, 펩티드는 이들이 전체 IgE 도메인의 콘텍스트중에 존재하는 경우에 정상적으로 채택하는 입체구조와 가장 밀접하게 유사한 구조로 속박될 수 있다. 따라서, 본 발명을 제한함이 없이, 이러한 새로운 규칙을 따르는 고리화된 미모토프는 본 발명의 바람직한 일면을 형성한다.

이러한 규칙을 만족하지 않는 잠정적인 미모토프 서열 또한 유용한 항혈청을 증가시킬 수 있다 (예를 들어, P14 및 P11), 이와 같이 하기 실시예는 단지 본 발명의 미모토프 유형의 하위-세트에 불과하다.

표 3

본 발명의 미모토프는, 천연 에피토프가 발견되는 전체 IgE 도메인으로부터의 영역과 유사할 정도로 작은 크기일 것이 예상된다. 따라서, 펩티드성 미모토프는 길이가 100 아미노산 미만, 바람직하게는 75 아미노산 보다 더 짧으며, 보다 더 바람직하게는 50 아미노산 미만, 및 가장 바람직하게는 4 내지 25 아미노산 미만의 길이이다. 바람직한 펩티드 미모토프의 구체적인 예는 P14 및 P11이며, 이들은 각각 13 및 23 아미노산 길이이다. 비-펩티드성 미모토프가 분자 용적 관점에서 이들의 펩티드성 카운터파트와 비교하여 보다 더 작은 크기일 것으로 보인다.

본 발명의 범주에 속하는 미모토프와 같은 특정 구성물의 상태를 확인하기 위해 이용되는 방법은 당업자에게 자명하다. 이러한 방법은 하기를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 잠정적 미모토프는 구성물의 면역원성을 확인하기 위해 분석될 수 있으며 (천연 IgE 분자와 교차반응하는 잠정적 미모토프에 의해 증가된 항혈청), 알레르기 이펙터 세포로부터 알레르기성 방출 매개체를 블록킹하는 기능이있다. 이들 반응의 특이성은 항혈청의 활성을 미모토프 그 자체 또는 천연 IgE, 및/또는 IgE내의 에피토프와 결합하는 것을 알려진 특이적 모노클로날 항체를 사용하여 항혈청의 활성을 블록킹함에 의한 경쟁 실험에 의해 확인될 수 있다. 경쟁 분석에서의 사용을 위한 이러한 모노클로날 항체의 구체적 예는 P14/23, P14/31 또는 P14/33을 포함하며, 이것은 P8의 미모토프로서의 잠정적인 미모토프의 상태를 확인한다.

본 발명의 일 구체예에서, 하나 이상의 IgE 에피토프 또는 미모토프가 담체분자와 결합하여 백신화 프로토콜을 위한 면역원을 형성하며, 여기서 담체 분자는 천연 IgE 분자와 무관한 것이 바람직하다. 미모토프는 화학적 공유 컨쥬게이션에 의하거나 유전자 조작된 융합 파트너의 발현에 의하거나, 임의적으로는 링커 서열에 의해 결합될 수 있다. 일 구체예로서, 본 발명의 펩티드는 융합 파트너와 함께 융합 분자중에 발현되며, 여기서 펩티드 서열이 융합 파트너의 주요 서열내에서 발견된다.

면역원성 담체와 펩티드의 공유결합은, 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 이와 같이 예를 들어, 직접 공유결합을 위해, 시판중인 헤테로양기능성 링커 예컨데, CDAP 및 SPDP를 제조자의 지시에 따라 사용하여, 카르보디이미드, 글루타르알데히드 또는 N-[γ-말레이미도부티릴옥시]숙신이미드 에스테르를 이용할 수 있다. 결합 반응 후, 면역원은 투석법, 겔 여과, 분획법 등에 의해 용이하게 단리 및 정제될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 본 발명자들은 펩티드 특히, 고리화된 펩티드가 아실히드라진 펩티드 유도체를 제조함에 의해 담체와 컨쥬게이션될 수 있음을 발견했다. 펩티드/단백질 담체 구성물은 하기와 같이 생성될 수 있다. 아실히드라진 유도체는 하기의 도식 1 고체상 펩티드 합성에 제시된 고체상에서 제조될 수 있다:

도식 1

이들 펩티드 유도체는, 당업계에 공지된 기술[문헌에 기술된 고체상 합성 방법 및 공정(Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach' by E.Atherton and R.C. Sheppard, IRL at Oxford University Press (1989)]을 통해 완전 자동화된 장치에서 폴리아미드 또는 폴리에틸렌글리콜-폴리스티렌 (PEG-PS) 지지체를 사용하여 공지의 'Fmoc' 방법을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 산 매개 절단은 선형의, 비보호된, 개질된 펩티드를 제공할 수 있다. 이것은 문헌 ('Methods in Molecular Biology, Vol. 35: Peptide Synthesis Protocols (ed. M.W. Pennington and B.M. Dunn), chapter 7, pp91-171 by D. Andreau et al)에 제시된 방법을 사용하여 이황화-가교결합된 개질된 에피토프를 생산하도록 용이하게 산화되고 정제될 수 있다.

이와 같이 합성된 펩티드는 하기 방법을 이용하여 단백질 담체와 컨쥬게이션될 수 있다.

아릴 알데히드 기능성의 유도는, 도식 2 (보다 더 구체적으로는 WO 98/17628 참조)에 도시된 바에 따라 제조된 숙신이미도 활성 에스테르 (BAL-OSu)를 이용하였다. 담체 예를 들어, BSA (소 혈청 알부민)의 아미노기를 50%까지 치환하는 것은 통상 수용성 개질된 단백질을 가져왔다. BSA의 보다 더 많은 치환은 불용성 구성물을 유도했다. BSA 및 BAL-OSu를 DMSO/완충액 (도식 참조)중에 같은 몰농도로 2시간 동안 혼합시켰다. 이러한 실험적으로 유도된 프로토콜은, 하기 도식 2/3 (개질된 담체의 제조) 중의 유리 아미노기에 대한 플루오레스카민 시험에 의해 결정되는 것과 같이, BSA를 50%까지 치환시켰다:

도식 2

도식 3

개질된 펩티드 및 유도 담체의 단순한 조합으로, 펩티드 담체 구성물을 투석에 의해 용이하게 단리할 수 있다(도식 4- 펩티드/담체 컨쥬게이트):

도식 4

본 발명의 면역원에 사용된 담체의 유형은 당업계에 공지이다. 담체의 기능은 IgE 펩티드에 대한 면역반응의 유도를 보조하기 위해 사이토카인 보조를 제공하는 것이다. 본 발명에 사용될 수 있는 담체의 비제한적인 목록은 하기를 포함한다: 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 혈청 알부민 예컨데, 소 혈청 알부민 (BSA), 비활성 세균성 독소 예컨데, 파상풍 또는 디프테리아 독소 (TT 및 DT), 또는 이것의 재조합 단편 (예를 들어, TT의 단편 C의 도메인 1, 또는 DT의 전위 도메인), 또는 투베르쿨린의 정제된 단백질 유도체 (PPD). 또한, 미모토프 또는 에피토프는 리포좀 담체와 직접 컨쥬게이션될 수 있으며, 이것은 또한 T-세포 보조를 제공할 수 있는 면역원을 포함할 수 있다. 미모토프 대 담체의 비는 1:1 내지 20:1이 바람직하며, 각각의 담체는 3 내지 15 펩티드를 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 구체에에서, 바람직한 담체는 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)로부터의 단백질 D이다 (EP 0 594 610 B1). 단백질 D는 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae)로부터의 IgD-결합 단백질이며, 포스그렌에게 특허 허여되었다 (WO 91/18926, EP 0 594 610 B1). 경우에 따라 예를 들어, 재조합 면역 발현 시스템에서, 단백질 D 예를 들어, 단백질 D 1/3^rd(단백질 D의 N-말단의 100-110개 아미노산을 포함(GB 9717953.5))을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명의 IgE 펩티드를 제공하는 다른 바람직한 방법은, 재조합 융합 단백질의 콘텍스트중에 존재한다. 예를 들어, EP 0 421 635 B는 외래 펩티드 서열을 바이러스 유사 입자로 제공하기 위한 키메라 헤파드나바이러스 코어 항원의 사용을 기술한다. 이와 같이, 본 발명의 면역원은 B형 간염 코어 항원으로 구성된 키메라 입자 중에 제공되는 IgE 펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 재조합된 융합 단백질은 본 발명의 미모토프 및 담체 단백질 예컨데, 인플루엔자 바이러스의 NS1을 포함할 수 있다. 본 발명의 일부를 형성하는 임의의 재조합적으로 발현된 단백질에 대해, 면역원을 엔코딩하는 핵산이 또한 본 발명의 일면을 형성한다.

본 발명에 사용된 핵산은 당업계에 공지된 고체상 방법을 사용함에 의해 용이하게 합성될 수 있다. 적합한 합성이, "T-boc" 또는 "F-moc" 공정에 의해 수행될 수 있다. 고리형 펩티드가 공지된 "F-moc" 방법 및 폴리아미드 수지를 사용하는 고체상 방법에 의해 완전 자동화 공정으로 합성될 수 있다. 또한, 당업자는 상기 방법을 매뉴얼에 따라 수행하는데 요구되는 실험실 공정을 알게될 것이다. 고체상 합성을 위한 기술 및 공정이 문헌('Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach' by E. Atherton and R.C. Sheppard, published by IRL at Oxford University Press (1989))에 기재되어 있다. 또한, 펩티드는 세균 또는 포유동물 세포주내에서 미모토프를 엔코딩하는 핵산 분자를 발현시킨 후, 발현된 미모토프를 정제하는 단계를 포함하는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 펩티드 및 단백질의 재조합 발현 기술은 당업계에 공지이며 문헌(Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook et al.,Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989))에 기재되어 있다.

본 발명의 면역원은, 미모토프 및 이것의 유사체를 포함하여 상기한 것과 같은 펩티드를 포함하거나, 면역학적 교차 반응성 유도체 또는 이것의 단편일 수 있다. 또한, 본 발명의 면역원 또는 펩티드, 미모토프 또는 이들의 유도체를 엔코딩하는 핵산의 부분이 본 발명의 일부를 구성한다.

따라서, 본 발명은 알레르기의 예방 또는 치료를 위한 약제 조성물의 제조에서의 신규한 에피토프 또는 미모토프 (상기 정의된 바와 같은)의 용도를 제공한다. 본 발명의 에피토프 또는 미모토프, 담체 분자를 포함하는 면역원은 또한 알레르기의 면역예방 또는 면역치료를 위한 백신에서의 사용을 위해 제공된다. 따라서, 본 발명의 미모토프, 펩티드 또는 면역원이 약제, 및 알레르기 질환의 의학 치료 또는 예방에서의 사용을 위해 제공된다.

본 발명의 백신은 보조제를 포함하는 것이 유리할 수 있다. 적합한 본 발명의 백신용 보조제는 IgE 펩티드 면역원에 대한 항체반응을 증가시킬 수 있는 보조제를 포함한다. 보조제는 당업계에 공지되어 있다(참고문헌: Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, Eds. Powell, M.F., and Newman, M.J., Plenum Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-X). 본 발명의 면역원과 함께 사용하기에 바람직한 보조제에는 알루미늄 또는 칼슘염 (수산화물 또는 인산염)이 포함된다.

본 발명의 백신은 통상 초회감작 용량 또는 추가 접종량 둘 모두로 투여된다. 추가 접종량은 적절한 간격으로 투여될 것이며, 바람직하게는 연주기로 또는 혈중 항체가 목적하는 수준 미만으로 저하되는 경우에 투여될 것이다. 추가 접종량은 초기 담체 분자 없이 펩티드로 구성될 수 있다. 이러한 추가투여 구성물은 택일적으로 담체를 포함하거나 어떠한 담체도 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 추가적인 면에서, 본원에 기술된 면역원 또는 백신의 약제에서의 사용이 기술된다.

본 발명의 백신 제조물은 상기 백신을 전신 또는 점막 경로를 통해 투여함에 의해, 알레르기에 감수성이거나 알레르기를 지닌 포유동물을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 이들의 투여는 점막내, 복강내, 또는 피내 또는 피하 경로를 통해 투여될 수 있다. 바람직한 투여 경로는 경피 경로 예를 들어, 피부 패치에 의한 것이다. 따라서, 본 발명의 펩티드, 면역원, 또는 리간드를 알레르기에 감수성이거나 알레르기 환자에게 투여하는 것을 포함하여 알레르기 치료 방법이 제공된다.

각각의 백신 용량에서 단백질의 함량은, 일반적인 백신 투여자에서 상당한 부작용이 없이 면역보호적 반응을 유도할 수 있는 양으로서 선택된다. 이러한 함량은 사용되는 구체적 면역원 및 이것이 어떻게 제공되는가에 따라 변화하는 양이다. 일반적으로, 각각의 용량은 단백질 1-1000 ㎍, 바람직하게는 1-500 ㎍, 보다 더 바람직하게는 1-100 ㎍, 가장 바람직하게는 1 내지 50 ㎍이다. 특정 백신의 최적 함량은 환자의 적절한 면역반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 피험자는 최초 백신화에 이어, 1회 이상의 추가 접종을 적절한 간격으로 투여받을 수 있다.

본 발명의 펩티드와 결합할 수 있는 리간드는 본 발명의 일번을 형성한다. 항체(또는 Fab 단편)가 이러한 리간드의 예이다. 알레르기의 치료 의학, 및 알레르기 치료용 약제의 제조에서의 리간드의 용도가 또한 제공된다. 본원에서 용어 "항체"는 유용한 항원결합 특이성이 있는 분자를 의미한다. 또한, 상기 용어가 항체와 동일하거나 극히 유사한 기능을 여전히 보유한 항체의 단편 또는 유도체를 포함함은 당업자에게 자명하다. 본원에서 이러한 단편 또는 유도체는 항체에 포함되는 것으로 의도된다.

모노클로날 항체가 특히 바람직한 리간드이다. 예를 들어, P14/23, P14/31 또는 P14/33은, P8 (P14 면역원으로 백신화 시킴에 의해 증가)을 인식하는 모노클로날 항체들이다. 이들 항체의 하이브리도마가 미생물기탁에 관한 부다페스트 협약에 따라 ECACC(European Collection of Cell Cultures, Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for AppliedMicrobiology Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, UK)에 각각 수탁번호 제 00012610호, 제 00012611호, 제 00012612로 2000년 1월 26자에 기탁되었다. 또한, 후속하는 알레르기 치료에 사용하기 위한 IgE의 신규한 미모토프의 동정에서의 이들 모노클로날 항체의 용도, 및 알레르기의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서의 상기 항체의 용도가, 본 발명의 중요한 일면을 형성한다. 이들 모노클로날 항체 모두 생체외에서 사람 호염기구로부터 히스타민 방출을 저해하는 기능을 하며, 또한 P14/23 및 P14/31은 생체내에서 피동적 피부 아나필락시스를 저해하는 것으로 밝혀졌다.

따라서, P14/23, P14/31 또는 P14/33과 결합할 수 있는 IgE Cε4의 미모토프, 및 이들 미모토프를 포함하는 면역원은 본 발명의 중요한 일면을 형성한다. P14/23, P14/31 또는 P14/33과 결합할 수 있는 미모토프를 포함하는 백신은 알레르기 치료에 유용하다.

또한, 본 발명의 펩티드 또는 면역원과 함께 백신화에 의해 하나의 동물에서 유도된 항체는, 다른 동물에서 알레르기의 예방 또는 치료를 위해 정제되고 피동적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 당업계에 공지된 방법으로 모노클로날 항체 하이브리도마(참고문헌: Koeler and Milstein, Nature, 1975, 256, p495), 인간화된 모노클로날 항체 또는 CDR 이식된 모노클로날의 제조에 사용될 수 있다. 이러한 항체는 피동적 면역예방 또는 면역치료에 사용되거나, IgE 펩티드 미모토프의 동정에 사용될 수 있다.

본 발명의 리간드는 알레르기의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있으므로,본 발명의 리간드를 포함하는 약제 조성물이 제공된다. 알레르기의 치료 또는 예방을 위한 바람직한 약제 조성물은, 모노클로날 항체 P14/23, P14/31 또는 P14/33를 포함한다.

본 발명은 진단 분석을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 다른 펩티드를 인식하는 리간드의 패널은 환자로부터 채취한 혈청중 항-IgE 역가를 분석하는데 사용될 수 있다. 또한, 상기 펩티드는 그 자체로서 혈중 항-IgE의 형을 정하는데 사용될 수 있다. 경우에 따라, 예를 들어 아토피성 환자에서 혈중 항-IgE 수준을 분석하는데 적합 할 수 있으며, 이와 같이 본 발명의 펩티드 및 폴리/모노-클로날 항체는 아토피 진단에 사용될 수 있다. 또한, 상기 펩티드는 환자에게 혈액을 재주입하기 전에 환자의 혈액으로부터 혈중 항-IgE를 제거하는데 이용될 수 있다.

또한, IgE 구조의 컴퓨터 모델을 사용하는 것을 포함하여 알레르기의 면역 예방 또는 치료를 위한 펩티드 면역원을 동정하는 방법, 및 표면 노출된 IgE 펩티드를 동정하는 방법이 본 발명의 일부를 형성한다. 이들 영역은 면역원으로 제형화되고 약제에 사용된다. 따라서, 알레르기 면역예방 또는 면역치료를 위한 펩티드 동정에서의 P14/23, P14/31 또는 P14/33의 용도가 본 발명의 일부를 형성한다.

백신 제조는 문헌에 기술되어 있다(New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978). 단백질의 거대분자와의 컨쥬게이션은 문헌에 기술되어 있다(Likhite, U.S. Patent 4,372,945 and by Armor et al., U.S. Patent4,474,757).

도면의 간단한 설명

도 1은 사람 IgE의 Cε3 및 Cε4의 표면 노출을 나타낸다(패들란 및 데이비스 모델 1986로부터 계산한 것임).

도 2는 P14 항혈청의 히스타민 방출 저해 및 아나필락시스원성을 도시한다. 양성 대조구로서 사용된 모노클로날 항체 즉, PTmAb0005 및 PTmAb0011을 1/100 및 1/500 (최종)으로 희석시킨 항-BSA 혈청에 1 ㎍/㎖의 농도로 가했다. 항 P14 항혈청을 1/100 및 최종 희석률 1/500로 가했다. 잔디 꽃가루에 감수성인 알레르기 환자로부터 세포를 채취하고, 잔디 꽃가루 알레르겐과 함께 배양하여 히스타민을 방출시켰다.

도 3은 항-P14 항혈청의 히스타민 방출 저해 및 아나필락시스원성을 도시한다. 다른 마우스로부터 P14 항혈청을 IgE 수용체-결합 ELISA로 측정한 것으로서 항-IgE 항체 약 1 ㎍/㎖을 함유하도록 다른 희석률(80X 또는 40X)로 가했다. 3개의 음성 대조군을 사용했다: 항-BSA 항혈청, 비-특이적 IgG1, 및 항-BSA 항혈청에서 희석시킨 비-특이적 IgG1의 혼합물. mAb11은 히스타민 방출을 저해하는 것으로 알려진 모노클로날 항체이며, 양성 대조구로 사용했다(2 ㎍/㎖ 가함).

도 4는 항-P14 항혈청의 히스타민 방출 저해 및 아나필락시스원성을 도시한다. 다른 마우스로부터의 항-P14 항혈청을 최종 희석률 1/50로 가했다. 모노클로날 항체를 분석 완충액 또는 항-BSA 혈청 1/50 희석액에 2 ㎍/㎖로 가했다. 3개의 음성 대조군을 사용했다: 항-BSA 항혈청, 비-특이적 IgG1, 및 항-BSA 항혈청에 희석시킨 비-특이적 IgG1의 혼합물. mAb11은 히스타민 방출을 저해하는 것으로 알려진 모노클로날 항체이며, 양성 대조구로 사용했다 (2 ㎍/㎖ 가함).

도 5는 항체반응 항-P11을 도시한다. 펩티드 P11을 4℃에서 하룻밤 카르보네이트 완충액에서 1 ㎍/㎖로 코팅시켰다. 플레이트를 포화시킨 후, 혈청의 2배 연속 희석액을 가하고 37℃에서 1시간동안 배양했다. 결합된 IgG를 비오티닐화된 항마우스 Ab 및 후속하여 스트렙토비딘-POD 및 TMB 기질로 측정했다. 측정 시점은, 도 5a는 제 1 백신화 후 14일, 및 제 2 백신화 후 14일; 도 5b의 경우 제 3 백신화 후 14일째 였다.

도 6은 항-P11 IgG 항-사람 IgE 역가를 도시한다. 사람 IgE를 1 ㎍/㎖로 코팅시켰다. 혈청 (대조군의 "BSA 풀")의 2배 연속 희석액 또는 PTmAb0005(양성 대조군 모노클로날 항체)을 37℃에서 1시간동안 배양했다. 결합된 IgG를 비오티닐화된 항-마우스 Ab로 검출했다.

도 7은 먼지진드기 알레르기 환자 (A10 및 A11) 및 잔디 꽃가루 알레르기 환자 (G8 및 G4)로부터 수득한 알레르기성 호염기구상에서, 항-P14 모노클로날 항체를 사용한 히스타민 방출 저해 연구를 나타낸다. PT11(PTmAb0011)을 양성 대조구로서 사용하고, IgG2a를 P14/23, P14/31 및 P14/33에 대한 이소타입 대조구로서 사용했다.

도 8은 IgE 도메인 구조를 도시한다. (a) 각각의 도메인은, 도시된 바와 같이 두개의 마주보는 β-시트로 구성된다(하나는 4개의 역평행 β-가닥 (4)이고 다른 하나는 3개의 역평행 β-가닥 (3)이다). (b) 상기 7개의 가닥을 도시된 바와같이 두개의 구분된 시트에서 a에서 f로 표지된 외곽선으로 표기한 화살표를 따라 국부 나타냈다. 상기 가닥의 결합성을 구부러진 화살표로 국부 나타냈다: 실선 화살표는 시트내의 루프를 나타내고, 점선 화살표는 시트간 루프를 나타낸다. IgG1 Fc 도메인 구조에서, 짧은 c' 가닥은 IgE Fc에 대해 예측한 바와 같이 C-D 루프의 일부를 형성한다.

도 9은 (a) 사람 IgG1 Fc (Cγ2 및 Cγ3 도메인)의 결정학적으로 측정된 구조로부터의 균등한 분절을 지닌 사람 IgE 도메인 Cε2, 3, 및 4의 A-B 루프 서열의 예상된 구조적 배열을 나타낸다. IgG1 구조중의 β-가닥은 밑줄 표시하였으며, a 및 b로 표지했다. 서열 블록 하부의 수직 화살표는 예상되는 최적의 고리화 위치를 나타내며, 도 10b에서 점선 및 실선으로 표지되고 결합된다. (b) 사람 IgG1 Fc를 지닌 사람 IgE Cε2, 3, 및 4의 c_d 루프의 예상된 구조적 배열을 나타낸다. IgG1 구조중의 β-가닥은 밑줄 표시하였으며, c, c' 및 d로 표지하고; 각각의 서열 분절의 말단부의 아미노산 잔기에 번호를 달았다. 빗금친 박스로 강조한 잔기는 (Cγ2 및 Cγ3)를 형성하거나, 루프내의 보호된 코어 (상동성 모델 정제 및 실험에 의해 Cε2, Cε3, 상동성 모델링에 의해 Cε4)를 형성할 것으로 예측되었다. 빗금이 없는 박스내의 잔기는 수용체 및/또는 항체에 의한 인식에 포함되는 것으로 예상된다. 서열 블록 하부의 수직 화살표는 예상되는 최적의 고리화 위치를 나타내며, 도 11b에서 점선 및 실선으로 표지되고 결합된다.

도 10에서, (a)는 Ig 불변 도메인의 시트-시트 계면에서의 A-B 헤어핀 구조에 대한 개략도이다. 인접한 역평행 β-가닥을 실선 화살표로 나타내고, a 및 b로표지했다. 가닥 a에 따른 잔기를 i로 표지하고, 가닥 b에 따른 잔기를 j로 표지했다. 잔기 i+n 및 j+m은 도메인 내의 시트-시트 계면의 일부를 형성한다(여기서, n 및 m은 0 또는 짝수이다). 잔기 i+n 및 j+m은 도메인의 용매 노출 표면의 일부를 형성한다(여기서, n 및 m은 홀수이다). A-B 루프는 검은색 화살표로 나타냈다. (b) A-B 헤어핀의 개략적인 구조는 도 10a와 같다 (여기서, 고리화에 적합한 잔기의 위치가 점선 또는 실선의 양쪽 화살표에 의해 연결된다).

도 11에서, (a)는 Ig 불변 도메인의 시트-시트 계면의 말단부의 C-D 헤어핀 구조의 개략도이다 (루프 및 지지 β-가닥). 대응하는 역평행 β-가닥을 실선 화살표로 나타내고, c 및 d로 표지했다. 가닥 c에 따르는 잔기를 i로 표지하고, d에 따르는 잔기를 j로 표지했다. 잔기 i+n 및 j+m은 도메인내의 시트-시트 계면의 일부를 형성한다 (여기서, n은 홀수이고 m은 짝수이다). 잔기 i+n 및 j+m은 도메인의 용매 노출 표면의 일부를 형성한다 (여기서, n은 0 또는 짝수이나, m은 홀수이다). 짧은 c' 가닥을 함유하는 상기 c_d 루프는 검은 화살표로 나타냈다. (b) c_d 헤어핀 구조의 개략도이다 (여기서, 고리화에 적합한 잔기 위치가 점선 또는 실선의 양쪽 화살표에 의해 연결된다).

하기 비제한적인 실시예를 통해 본 발명을 예시한다.

1. 활성 백신화 연구

실시예

1.1 펩티드 동정

펩티드를 하기 방법에 따라 동정했다.

사람 IgE의 모델링된 구조는 문헌(Padlan and Davies,Mol. Immunol., 23, 1063-75, 1986)에 기술되어 있다. 연속적이며 용매 노출된 펩티드를 동정했다. 이는 각각의 IgE 아미노산에 대한 접근가능성을 계산하기 위한 분자 시뮬레이션 소프트웨어(MSI)를 사용하여 수행했으며, 접근 가능한 표면을 5개 잔기의 슬라이딩 윈도우에 거쳐 평균화하였으며, 그 결과 80 Ų보다 더 큰 5-mer 초과의 평균을 갖는 IgE 펩티드의 영역을 동정했다.

상기 결과를 도 1에 나타냈다.

결과

도 1에 IgE에 대한 항체를 증가시키기 위한 면역원으로 사용될 수 있는 많은 천연 펩티드를 나타냈다.

표 4. 1986 패드란 및 데이비스 모델을 이용하는 천연 표면 노출 및 연속 IgE 펩티드.

상기 동정된 이들 펩티드에 부가하여, 하기 펩티드를 헬름 등의 IgE 모델 (1990년 10월 2일자에 PDB(Protein Data Bank, Research Collabarotory for Structural Bioinformatics; http:\pdb-browsers.ebi.ac.uk)에 기탁된 2IgE 모델)과 함께 동일한 선택 기준을 사용하여 동정했다.

표 5. 헬름 등의 1990 모델을 사용하여 동정된 펩티드

이들 펩티드 또는 이것의 미모토프를 면역원성 연구를 위해 합성하고 컨쥬게이션시켰다.

1.2 숙신이미드-말레이미드 교차-링커를 사용한 IgE 펩티드/단백질 D의 합성

단백질 D는 말레이미드-숙신이미드 교차-링커를 사용함에 의해 IgE 펩티드와 직접 컨쥬게이션될 수 있다. 이러한 화학은 숙신이미드기를 고정함에 의해 담체 잔기의 NH₂활성을 조절할 수 있다. 말레이미드기는 시스테인-결합 부위이다. 따라서, 하기 실시예의 목적을 위해, 컨쥬게이션되는 IgE 펩티드에 N-말단 시스테인을 첨가하는 것이 요구된다.

결합 시약은 선택적인 헤테로양기능성 교차-링커로서, 한쪽 말단은 숙신이미드 에스테르에 의해 단백질 담체의 아미노기를 활성화시키고, 다른 하나의 말단은 말레이미노기에 의해 펩티드의 설프히드릴기와 결합한다. 상기 반응은 하기의 도식와 같다:

a. 리신과 숙신이미드의 반응에 의한 펩티드의 활성화

b. 활성화된 단백질과 펩티드 시스테인의 말레이미노기에 의한 결합.

1.3 IgE 펩티드-단백질 D 컨쥬게이트의 제조

단백질 D를 pH7.2의 인산 완충염수중에 2.5 ㎎/㎖의 농도로 용해시켰다. 결합 시약(N-[γ-말레이미도부티릴옥시]숙신이미드 에스테르-GMBS)를 DMSO중에 102.5 ㎎/㎖의 농도로 용해시키고, 단백질 용액에 가했다. GMBS 1.025 ㎎을 단백질 D 1 ㎎에 대해 사용했다. 반응 용액을 실온에서 1시간 동안 배양시켰다. 부산물을 세파크릴 200HR 투과성 겔상에서의 탈염 단계에 의해 제거했다. 인산 완충염수 트원 80 0.1%를 pH6.8에서 용출액으로 사용했다. 활성화된 단백질을 수집하고 저장했다. 펩티드(표 4 또는 5에서 동정된 펩티드, 또는 이것의 유도체 또는 미모토프)를 0.1 M 아세트산중에 4 ㎎/㎖의 농도로 용해시켜 이황화 결합을 방지시켰다. 1개의 활성화된 단백질 D에 대해 2 내지 20개의 펩티드의 몰비로 결합시켰다. 펩티드 용액을 단백질에 천천히 가하고 혼합물을 25℃에서 1시간동안 배양했다. 결합 단계중에 pH를 6.6으로 유지했다. 시스테인(아세트산 0.1 M중에 4 ㎎/㎖의 농도로 용해된 활성 PD 1 ㎎당 시스테인 0.1 ㎎)을 pH 6.5, 25℃에서 30분간 가하여 퀸칭 단계를 수행했다. NaCl 150 mM 트윈 80 0.1%에 대한 2회의 투석을 수행하여 과량의 시스테인 또는 펩티드를 제거했다.

최종 단계로서 0.22 ㎛ 막을 통해 멸균 여과시켰다. 깨끗한 여과성 용액의 최종 생성물을 4℃에 보존했다. 펩티드/PD의 최종 비율을 아미노산 분석으로 측정했다.

유사한 방법으로, 본 발명의 펩티드를 BSA를 포함하는 다른 담체와 컨쥬게이션시킬 수 있다. 미리-활성화된 BSA는 피어스 인코포레이션 (Pierce Inc.)으로부터 입수할 수 있다.

P8 (P14, 서열번호 20; CLEDGQVMDVDLL) 및 P5 (P11, 서열번호 8; CRASGKPVNHSTRKEEKQRNGLL)의 미모토프를 합성하고 상기한 방법으로 단백질 D 및 BSA와 컨쥬게이션시켰다.

1.4 ELISA 방법

항-펩티드 또는 항-펩티드 담체 ELISA

항-펩티드 및 항-담체 면역반응을 하기 약술한 ELISA 방법을 이용하여 조사했다. 마이크로티터플레이트 (Nunc)를 PBS중의 특이적 항원으로 하기중 어느 하나와 함께 코팅시켰다 (4°하룻밤): 스트렙타비딘을 2 ㎍/㎖ (다음 비오티닐화된 펩티드 (1μM)와 함께 37℃에서 1시간)로 가하고, PBS 트원-20 0.1%로 3회 세척하였다. PBS-BSA 1%-트원 20 0.1% (포화 완충액)으로 플레이트를 37℃에서 1시간 포화시켰다. 2단계 희석 (포화 완충액내)중에 1°항체=혈청을 가하고, 37°에서 1시간 30분동안 배양했다. 3회 세척하였다. HRP와 결합된 2°항-마우스 Ig (또는 항-마우스 이소타입 특이적 모노클로날 항체)를 가했다. 37℃에서 1시간 배양했다. 5회 세척했다. TMB (BioRed)를 사용하여 암실에서 10분간 시현시켰다. 0.4N H₂SO₄로 블록 반응시켰다.

마우스 혈청에서 항-사람 IgE 반응성의 측정 방법 (IgE 플레이트 결합 ELISA)

ELISA 플레이트를 pH 9.6의 카르보네이트/비카르보네이트 코팅 완충액중에서 사람 키메라 IgE 1 ㎍/㎖로 37℃에서 1시간 또는 4℃에서 하룻밤 동안 코팅시켰다. 비-특이적 결합 부위를 5% w/v 마블 밀크 분말을 함유하는 PBS/0.05% 트원-20으로 37℃에서 1시간 동안 블록킹시켰다. 다음, PBS/0.05% 트원-20/1% w/v BSA/4% 신생 송아지 혈청중의 마우스 혈청의 연속 희석물을 37℃에서 1시간동안 가했다. 폴리클로날 혈청 결합을 염소 항-마우스 IgG-비오틴 (1/2000)에 이어 스트렙타비딘-HRP (1/1000)으로 측정했다. 컨쥬게이션된 항체를 TMB 기질로 450 nm에서 측정했다. PTmAb0011의 표준 곡선을 각각의 플레이트상에 포함시켜 혈청 샘플내의 항-IgE 반응성을 ㎍/㎖ 단위로 측정했다.

IgE와 미모토프 펩티드, 가용성 IgE 또는 PTmAb0011과의 경쟁적 결합

폴리클로날 마우스 혈청의 단일 희석물을 미리-블록킹시킨 폴리프로필렌 96-웰 플레이트중의 미모토프 펩티드 또는 사람 IgE의 단일 농도와 함께 혼합시켰다. 혼합물을 37℃에서 1시간동안 배양하고, IgE 코팅한 ELISA 플레이트에 37℃에서 1시간동안 가했다. 폴리클로날 혈청 결합을 염소 항-마우스 IgG-비오틴 (1/2000) 및 후속하여 스트렙타비딘-HRP (1/1000)으로 측정했다. 컨쥬게이션된 항체를 450nm에서 TMB 기질로 측정했다. 혈청과 PTmAb001의 IgE 결합에 대한 경쟁을 위해, 혈청 및 PTmAb0011-비오틴의 혼합물을 IgE-코팅된 ELISA 플레이트에 가했다. PTmAb0011 결합을 스트렙타비딘-HRP (1/1000)으로 측정했다.

1.5 사람 호염기구 분석

사람 호염기구 (HBA)를 사용하여 2가지 유형의 분석을 수행했다. 하나는 모노클로날 항체의 아나필락시스원성을 측정하기 위한 것으로서 단리된 PBMC에 항체를 가하는 단계를 포함하고; 다른 하나는 모노클로날 항체와 함께 HBA의 예비배양에 의한Lol P I(강력한 알레르겐)에 의해 유발된 히스타민 방출의 저해를 측정하는 것이다.

알레르기 공여자로부터 정맥을 통해, 헤파린을 포함시킨 튜브내로 채혈하고, 비-적혈구 세포를 정제했다. 세포를 HBH/HSA에서 1회 세척하고, 계수하며, HBH/HSA중에 ㎖당 2.0 ×10⁶의 세포 농도로 재현탁시켰다. 100 ㎕ 세포 현탁액을 100 ㎕ 희석된 시험 샘플 또는 모노클로날 항체를 함유하는 V자형 바닥 96-웰 플레이트 웰에 가했다. 각각의 시험 샘플을 각각의 희석액에 대해 6개 웰을 사용하여 희석 범위에 따라 시험했다. 웰 함유물을 플레이트 셰이커로 배양 전에 37℃에서30분간 신속하게 혼합했다.

각각의 혈청 희석물에 대해, 3개의 웰은 10 ㎕Lol p I추출물 (최종 희석 1/10000)을 가하여 유발시키고, 3개의 웰은 아나팔락시스원성의 평가를 위해 첨가된 10 ㎕ HBH/HSA를 포함하도록 했다. 웰 함유물을 플레이트 셰이커를 사용하여 37℃에서 30분간 신속하게 혼합했다. 배양물을 500g로 5분간 원심분리하여 최종 처리하였다. 시판되는 히스타민 EIA 측정 키트 (이뮤노테크)를 이용하여 히스타민을 분석하기 위해 상등액을 제거했다. 시험 샘플 없이 세포를 함유하는 대조 웰에 대해 자발적인 방출 및 유도된 방출을 측정했다. 세포 샘플을 2회의 동결/해동에 의해 용해시켜 세포중에 함유된 총 히스타민을 분석했다.

그 결과는 하기와 같다:

아나필락시스원성 분석

시험 샘플에 의한 히스타민 방출 =

시험 샘플로 처리한 세포로부터의 히스타민 방출 % - 자발적 히스타민 방출 %.

블록킹 분석

히스타민 방출의 저해도를 하기 식으로 계산할 수 있다:

저해 % =

1-(세포 처리된 시험 샘플로부터의 히스타민 방출*)x 100

(항원 자극된 세포로부터의 히스타민 방출*)

자발적인 방출에 대해 보정된 값

실시예 2.P14 컨쥬게이트 (P14-BSA, P14-BSA)를 지닌 마우스의 면역화에 의한 항-사람 IgE 항체의 생성의 유도

실시예 1에 기술된 미모토프 P14 (25㎍ 단백질/용량)을 포함하는 컨쥬게이트를 10 BalbC 마우스 그룹에 투여했으며, WO 95/17210중에 기술된 QS21 및 3D-MPL을 함유하는 수중유 에멀젼으로 보강시켰다. 14, 24, 및 72일째에 추가로 접종했으며, 각각의 면역화 후 14일째에 혈청을 채취했다. 항-펩티드 및 항-플레이트 결합 IgE의 면역반응을 실시예 1에 기술된 ELISA 방법을 이용하여 수행했다. 다음, 항혈청을 사람 알레르기 호염기구로부터의 히스타민 방출의 저해에서의 아나필락시스원성 및 기능 활성에 대해 시험했다 (실시예 1에 기술된 방법).

면역원성 결과

두개의 컨쥬게이트 즉, PD-P14 및 BSA-P14 모두가 항-P14 및 항-IgE 면역반응면역반응 수 있었다. 제 3 및 제 4 백신화 후 14일째에 측정한 것으로서, BSA-P14 컨쥬게이트에 의해 유도된 항-펩티드 및 항-IgE 반응의 결과를 표 6에 나타냈다. PTmAb0011은 IgE의 Cε2 도메인과 결합하는 것으로 알려진 모노클로날 항체이며, 항-IgE 반응을 ㎍/㎖로 정량하는데 이용할 수 있다.

표 6. BSA-P14 컨쥬게이트의 면역원성 결과

주: AV(평균), SD(표준편차), GM(기하평균)

대조구로서 BSA 단독으로 백신화시킨 마우스는 어떠한 검출할 수 있는 항-펩티드 또는 항-IgE 반응도 생성하지 않았다.

기능적 활성 결과

P14 백신화에 의해 증가된 항혈청은, 알레르겐에 의해 유발된 이후의 알레르기성 사람 호염기구로부터의 히스타민 방출 저해에 효능이 있다는 점에서 기능성임이 밝혀졌다 (도 2, 3 및 4 참조). 또한, 상기 혈청은 아나필락시스원성이 아님이 밝혀졌다 (도 2, 3 및 4 참조).

요약

P14 (P8의 미모토프)는 마우스에서 항-P14 및 항-IgE 항체의 고역가를 증가시킬 수 있었다. 이들 항체는 후속하여, 이들이 알레르기성 사람 호염기구로부터의 히스타민 방출을 저해하며, 아나필락시스원성이 아니라는 점에서 기능성이었다. 따라서, P14 및 P8은 알레르기의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.

실시예 3.P11 컨쥬게이트 (P11-BSA, P11-BSA)를 사용한 마우스의 면역화에 의한 항-사람 IgE 항체의 유도

사람 IgE 에피토프 펩티드 P11을 말레이미드-활성화된 BSA (피어스)와 결합시켰다 (BSA-CRASGKPVNHSTRKEEKQRNGLL). SBAS2로 제형화시킨 컨쥬게이트 25 ㎍을 8마리의 암컷 BALB/c 마우스에 0일째에 IM 주입하였다. 하나의 대조 마우스 군에 BSA/SBAS2를 주입했다. 혈액 샘플을 각각의 주입 후 14일 후에 채취했다 (혈청의 이용가능성을 증가시키기 위해 제 3 주입 후 24일째에 4번째 사육을 수행했다). 백신화에 의해 증가된 항-펩티드 및 항-IgE 항체를 실시예 1에 기술된 바와 같이ELISA로 측정했다.

결과

상동성 IgG 항-P11 반응을, 1회 주입후에 이미 측정할 수 있었으나, 제 2 및 제 3 주입 후에 추가로 증가했다 (도 5a 및 5b). 모든 마우스가 제 3 주입 후에 항-IgE 반응 (mAb005 균등물에서 발현된 것으로서 28 내지 244 ㎍/㎖ 범위)을 보였다 (도 6).

2. 에피토프 특이적 모노클로날 항체의 기능적 활성

실시예 4.P14에 대해 증가된 모노클로날 항체의 기능적 활성

P8 및 이것의 미모토프를 인식하는 모노클로날 항체를 공지된 방법을 사용하여 생성시켰다. 요약하면, 상기 1의 실시예들 중에 기술된 P14-BSA 컨쥬게이트를 QS21 및 3D-MPL을 함유하는 수중유 보조제와 함께 Balb/C 마우스 군으로 주입시켰다. 비장 세포를 취하고 이를 SP2/O B-세포 종양 세포주와 함께 윰합시키고, 상등액을 P14 및 IgE 둘 모두에 대한 반응성 대해 스크리닝하였다. 수개의 세포주가 생성되었으며, 이들 중 P14/23, P14/31 및 P14/33는 ECACC에 부다페스트 협약에 따라 2000년 1월 26일자에 각각 수탁번호 제 00012610호, 제 00012611호, 및 제 00012612호로 기탁되었다. 모든 3개의 모노클로날 항체가 IgE 및 특히 P14와 특이적으로 결합하는 것을 ELISA 결합 분석 및 모노클로날 항체와 IgE의 결합에 대한 P14 경쟁 분석으로 확인했다.

이들 모노클로날 항체의 기능적 활성을 실시예 1에 기술된 사람 호염기구 히스타민 방출 저해 검정에서 분석했다.

결과

모든 P14 모노클로날 항체를 4개의 다른 알레르기 환자로부터 채취한 호염기구상에서 실험했다(A 환자는 먼지 진드기 항원에 대해 알레르기성이고, G 환자는 잔디 꽃가루에 대해 알레르기성이었다). 생체외에서 히스타민 방출을 저해하는 것으로 알려진 P11 (PTmAb0011)을 양성 대조 항체로서 포함시켰다. 모든 3개의 P14 모노클로날 항체 (23, 31 및 33)가 알레르기성 호염기구로부터 히스타민 방출을 저해하는 효능이 있었다 (도 7 참조).

실시예 5.컨쥬게이트로 면역화시킨 마우스에 의해 유도된 항-IgE가 원숭이 피부 아나필락시스 모델에서의 국소 알레르기 반응을 블록킹할 수 있는 가능성

P14/23 및 P14/31을 또한 생체내 활성에 대해 시험했다. 요약하면, 아프리카 녹색 원숭이의 국부 피부 비만 세포를 잘라내고 항-NP IgE (세로테크사로부터 구입한 사람 IgE 항-니트로페닐아세틸 (NP)) 100 ng을 양쪽 팔에 피내 투여하여 감작시켰다. 24시간 후, 시험할 모노클로날 항체의 투여량을 한쪽 팔에 사람 IgE를 투여한 부위와 동일한 주입 위치에 주입했다. 같은 동물의 반대 팔의 대조 위치에 인산 완충염수 (PBS) 또는 비-특이적 사람 IgE (사람 사이토메갈로바이러스 (CMV) 또는 사람 면역결핍 바이러스 (HIV)에 대해 특이적)을 주입했다. 5시간 후, BSA-NP 컨쥬게이트 10 ㎎을 정맥내 주사하여 투여했다. 15 내지 30시간 후, 대조 동물은 밀리미터 단위로 측정가능한 크기로서 용이하게 관찰 할 수 있는 대체로 환상인 아나필락시스에 의한 부종을 일으켰다. 결과를, PBS 대조구와 비교하여 3개의 원숭이 군의 평균 부종 직경 또는 저해 %로서 나타냈다. 모노클로날 항체인PTmAb0011을 양성 대조로서 사용했다. SBmAb0006을 음성 대조로서 사용했다.

표 7. P14/23 결과

표 8. P14/31 결과

보다 더 높은 용량의 모노클로날 항체를 사용하는 경우에 아나필락시스의 완전한 저해가 관찰되는 바, 이들 항체는 생체내 투여시에 그 자체로서 아나필락시스원성인 것은 아니다.

실시예 6.IgE 미모토프의 구조

본 발명자들은 본 발명의 에피토프 또는 미모토프의 입체구조가 항-미모토프 항체반응 및 강력한 항-IgE 면역반응을 생성시키기 위한 펩티드의 능력 둘 모두에 대해 중요함을 밝혔다. 이와 같이, 본 발명자들은 펩티드 고리화의 최적 위치를 예측하는 구조적 규칙을 발견하였다. 이들 고리화 부위를 사용하는 펩티드는 본발명의 바람직한 일면을 형성한다.

IgE Fc의 완전한 구조가 결정되지 않았기 때문에, 본 발명자들은 현재의 가능한 모델 (상기 Helm 등, 상기 Padlan 및 Davis 등)을 IgG1의 Cγ2 및 Cγ3의 공지된 구조를 사용하여 개량했다(문헌: Deisenhofer J., 1981.Biochemistry, 20, 2361-2370). 또한, Cε2 도메인의 모델을 공지의 Ig 폴딩-단위 구조와 비교했다. 본 발명자들은 IgE Fc의 상동성 모델을 디자인하고, 말단부 및 인트라-시트(A-B 루프, 도 9a)의 대체적인 구조를 예측했다. 예상되는 IgE Fc A-B 및 C-D 루프가 이들의 지지 β-가닥과 함께 정의됨에 따라, 루프의 미모토프가 각각의 루프의 야생형 (WT) 주요 서열로부터 인접하는 β-가닥을 따르는 선택된 특이적 잔기 사이의 공유적 고리화에 의해 유도될 수 있다. 고리화는 시스테인 말단 사이의 이황화 결합에 의해 이루어져 시스타인이 되도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명자들의 구조적 배열(도 9a 및 9b)에 기초하여, 본 발명자들은 적합한 담체와 컨쥬게이션된 후에 미모토프에 의해 채택되는 입체구조가 이것의 모태가 되는 에피토프의 입체구조와 유사하게 될 가능성을 증가시키기 위해, 단순한 예측할 수 있는 규칙을 유도했다.

규칙 1

소수성 시스타인기가 두개의 시트 사이의 계면에 의해 형성되고 Ig 불변 영역의 수-불용성 코어에 속하는 WT β-가닥 잔기를 치환해야 한다.

규칙 2i

인트라-시트(예를 들어,A-B 루프)에 대해, 시스타인기는 인접하는 역평행β-가닥으로부터 유래되고 (도 8 참조), 시트의 동일한 면에서 함께 측면 패킹되는 WT 잔기를 치환해야 한다. 규칙 1에 따라, 이것은 시트의 도메인-내부면에 존재해야 한다. A-B 루프에 대한 이러한 규칙의 구조적 유도가 도 10a 및 10b에 개략적으로 도시되었다.

규칙 2ii

인트라-시트 루프 (예를 들어,C-D 루프)에 대해, 시스타인기는 하나의 가닥이 각각의 시트로부터 유래된 역평행 β-가닥상의 WT 잔기를 치환해야 한다. 규칙 1에 따라, 최적의 한 쌍을 형성하는 잔기가 마주하는 β-시트로부터 함께 패킹되고, 이에 따라 시트 사이의 계면의 일부를 형성한다. C-D 루프에 대한 이러한 규칙의 구조적 유도는 도 11a 및 도 11b에 개략적으로 도시되었다. 이를 따르는 잠정적인 미모토프 서열의 표에서, 최적의 것으로 예상되는 디자인에 밑줄을 그엇다. 각각의 서열 블록에서 점선 또는 실선은 최적의 고리화에 대해 선택된 잔기 위치를 연결하며, 이는 도 10b (A-B 루프에 대해) 및 도 11b (C-D 루프에 대해)중에 동일한 방법으로 제시되었다.

도 9a 및 도 9b에 제시된 서열 배열을 상기 규칙과 함께 이용하여, 본 발명자들은 표 9 내지 12의 펩티드 목록을 디자인 했다. 밑줄 표시한 (점선 또는 실선) 펩티드가 상기 규칙에 따르는 최적의 펩티드이며, 동일한 선들이 도 10b 및 도 11b에 제시되었다. 밑줄이 없는 서열은 미모토프이다.

표 9. IgE Cε3 A-B 루프 서열

표 10. IgE Cε4 A-B 루프 서열

표 11. IgE Cε3 C-D 루프 서열

표 12. IgE Cε4 C-D 루프 서열

Claims (35)

1. IgE의 Cε3 도메인의 단리된 표면 노출 에피토프를 포함하는 P5(서열번호 1)의 펩티드 또는 이것의 미모토프.
2. IgE의 Cε3 도메인의 단리된 표면 노출 에피토프를 포함하는 P6(서열번호 2)의 펩티드 또는 이것의 미모토프.
3. IgE의 Cε3 도메인과 Cε4 도메인 사이의 스패닝 영역의 단리된 표면 노출 에피토프를 포함하는 P7(서열번호 3)의 펩티드 또는 이것의 미모토프.
4. IgE의 Cε4 도메인의 단리된 표면 노출 에피토프를 포함하는 P8(서열번호 4)의 펩티드 또는 이것의 미모토프.
5. IgE의 Cε4 도메인의 단리된 표면 노출 에피토프를 포함하는 P9(서열번호 5)의 펩티드 또는 이것의 미모토프.
6. IgE의 Cε3 도메인의 단리된 표면 노출 에피토프를 포함하는 P200(서열번호 6)의 펩티드 또는 이것의 미모토프.
7. IgE의 Cε3 도메인의 단리된 표면 노출 에피토프를 포함하는 P210(서열번호 7)의 펩티드 또는 이것의 미모토프.
8. IgE의 Cε3 도메인의 단리된 표면 노출 에피토프를 포함하는 2-90N(서열번호 82)의 펩티드 또는 이것의 미모토프.
9. IgE의 Cε4 도메인의 단리된 표면 노출 에피토프를 포함하는 3-90N(서열번호 83)의 펩티드 또는 이것의 미모토프.
10. IgE의 Cε4 도메인의 단리된 표면 노출 에피토프를 포함하는 4-90(서열번호 84)의 펩티드 또는 이것의 미모토프.
11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드임을 특징으로 하는 미모토프.
12. 제 4항에 있어서, P8의 미모토프가 하기 일반식의 펩티드임을 특징으로 하는 펩티드:

    P, X₁, X₂, P, X₃, X₄, X₅, X₆, X₅, X₅

    상기식에서, X₁은 E, D, N 및 Q로부터 선택된 아미노산이고; X₂는 W, Y 및 F로부터 선택된 아미노산이며; X₃은 G 및 A로부터 선택된 아미노산이고, X₄는 S, T 및 M으로부터 선택된 아미노산이며; X₅는 R 및 K로부터 선택된 아미노산이고; X₆은 D 및 E로부터 선택된 아미노산이다.
13. 제 12항에 있어서, P8의 미모토프가 하기 일반식의 펩티드임을 특징으로 하는 펩티드:

    P, X₁, X₂, P, G, X₄, R, D, X₅, X₅

    상기식에서, X₁은 E, D, N 및 Q로부터 선택된 아미노산이고; X₂는 W, Y 및 F로부터 선택된 아미노산이며; X₄는 S, T 및 M으로부터 선택된 아미노산이고; X₅는 R 및 K로부터 선택된 아미노산이며; X₆은 D 및 E로부터 선택된 아미노산이다.
14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 펩티드 또는 미모토프, 및 추가로 담체 분자를 포함하는 알레르기 치료용 면역원.
15. 제 14항에 있어서, 담체 분자가 단백질 D 및 B형 간염 코어 항원으로부터 선택됨을 특징으로 하는 면역원.
16. 제 14항 또는 제 15항에 있어서, 면역원이 펩티드 또는 미모토프의 화학적컨쥬게이트이거나, 융합 단백질로서 발현됨을 특징으로 하는 면역원.
17. 제 14항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 또는 펩티드 미모토프가 담체의 주요 서열내에 존재함을 특징으로 하는 면역원.
18. 제 14항 내지 제 17항 중 어느 한 항의 면역원, 및 추가로 보조제를 포함함을 특징으로 하는 알레르기 치료용 백신.
19. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 펩티드를 인식할 수 있는 리간드.
20. 제 19항에 있어서, P14/23, P14/31 및 P14/33로부터 선택됨을 특징으로 하는 리간드 (상기 리간드는 부타페스트 협약에 따라 ECACC에 2000년 1월 26자로 각각 수탁번호 제 00012610호, 제 00012611호 및 제 00012612호로 기탁되었다).
21. 제 19항의 리간드를 포함하는 약제 조성물.
22. 제 20항의 리간드를 포함하는 약제 조성물.
23. 약제에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 펩티드.
24. 약제에 사용하기 위한 제 18항의 백신.
25. 약제에 사용하기 위한 제 14항 내지 제 17항 중 어느 한 항의 면역원.
26. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 펩티드의 알레르기의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조용 용도.
27. 약제에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 펩티드를 인식하는 리간드.
28. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 펩티드를 인식하는 리간드의 알레르기의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조용 용도.
29. P14/23, P14/31 또는 P14/33의 P8 미모토프의 동정을 위한 용도 (이들 리간드는 부페스트 협약에 따라 ECACC에 2000년 1월 26자로 각각 수탁번호 제 00012610호, 제 00012611호 및 제 00012612호로 기탁되었다).
30. P14/23, P14/31 또는 P14/33를 인식하는 펩티드 (이들 리간드는 부페스트 협약에 따라 ECACC에 2000년 1월 26자로 각각 수탁번호 제 00012610호, 제 00012611호 및 제 00012612호로 기탁되었다).
31. 제 30항의 펩티드를 포함하는 백신.
32. 제 14항 내지 제 17항 중 어느 한 항의 면역원을 제조하는 단계, 및 상기 면역원을 보조제와 함께 제형화시키는 단계를 포함하는 백신의 제조 방법.
33. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 펩티드를 환자에 투여하는 것을 포함하여, 알레르기 환자 또는 알레르기 감수성 환자를 치료하기 위한 방법.
34. 제 24항 또는 제 31항의 백신을 환자에 투여하는 것을 포함하여, 알레르기 환자 또는 알레르기 감수성 환자를 치료하기 위한 방법.
35. 제 21항 또는 제 22항의 약제 조성물을 환자에 투여하는 것을 포함하여, 알레르기 환자 또는 알레르기 감수성 환자를 치료하기 위한 방법.