KR100263359B1 - IgE 관련 알레르기 반응의 치료용 IgE의 입실론 사슬의 정상부로 구성된 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 IgE 관련 알레르기 반응에 대해 특히 사람에 이용할 수 있는 백신에 관계한다. 백신에는 IgE 분자의 입실론 사슬의 CH2-CH3 도메인의 전체 아미노산 서열 또는 이의 구조적으로 안정한 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하고 이 단백질은 선택적으로 하나이상의 이형운반체 단백질과 어쥬번트를 포함한다. 백신이 주입되면 어쥬번트의 유무에 관계없이 알레르기 환자의 혈장에 내생 항-IgE 항체의 농도가 상승한다. 사실 백신은 항체가 IgE 분자의 항원 특이성에 무관하기 때문에 모든 형의 IgE 관련 알레르기에 대해 사용될 수 있으나 개체의 전체 IgE량은 감소된다. 따라서, 백신은 상이한 유형 IgE 관련 알레르기를 가지는 개체의 치료에 이용되는 것을 목표로 한다. 항 IgE 항체의 농도증가는 항원 특이적 IgE의 량을 감소시키고 따라서 유선세포와 호염기성 백혈세포에서 유리되는 입자와 연관하여 저장 또는 생산된 생리학적으로 매우 활성있는 물질의 알레르기 관련 유리의 위험이 상당히 감소된다.

Description

IgE 관련 알레르기 반응의 치료용 IgE의 입실론 사슬의 정상부로 구성된 백신

도1a와 1b에서는 쥐-IgE와 사람 IgE(콘트롤)에 대한 항체 적정의 ELISA 측정에 의해 4개의 상이한 쥐에서 항체반응(항-IgE항체의 량)을 나타낸다.

도2는 다클론 항-IgE 항혈청의 주입시에 블랭크 면역화와 비교하여 백신처리된 쥐에서 IgE 유도 염증 반응의 억제를 나타낸다.

본 발명은 IgE-관련 알레르기 반응의 유도를 저해시키거나 이와 같은 증상을 경감시키기 위한 백신에 관계한다. 본 발명은 일반적으로 포유류, 적절하게는 사람에게 이용될 수 있는 백신에 관계되고, 본 발명은 사람에 이용될 수 있는 백신에 대해 상술하고 있다.

IgE(이뮤노글로블린E)은 사람 혈장에 통상 낮은 농도(10-40Ong/㎖)로 존재함에도 불구하고, 사람에게 있어서 과민성 반응의 주요 원인이 된다. 비만세포(mast cell)와 호염기성 백혈구에서 IgE에 대해 높은 친화력 수용체와 상호작용하기 때문에 이와 같은 특징이 나타낸다.

이와 같은 세포의 표면에서 알레르겐 결합으르 인한 두개의 IgE 수용체가 교차결합을 함으로써 히스타민, PAF(혈소판 활성인자), 헤파린, 호산구성 그리고 호중구성 임상세포에 대한 화학인자, 루코트리엔, 프로스타글란딘, 트롬복산과 같은 다수의 생리학적 활성물질 방출이 시작된다. 이와 갈은 중개물질들이 IgE 관련 알레르기 반응의 직접적인 증상(타입I 과민성)의 원인이 된다. 이에 속하는 질병으로는 천식, 털 알레르기, 꽃가루 알레르기, 음식 알레르기 및 습진 등이 있다.

생쥐, 쥐, 사람 등에서 수용체에 대해 단백질 및 유전자 수준에서 조사된 바 있다(Kinet et al. 1987; Shimizu et al. 1988; Tepler et al. 1989; Blank et al. 1989; Kinet et al. 1989). 이와 같은 수용체는 우리 신체내에 비만세포와 호염기성 백혈구에만 존재하는 것으로 보인다. 수용체는 세개의 상이한 소단위 즉 α, β ,γ 사슬로 구성된다. 대부분이 세포 외부에 위치하는 α 사슬이 IgE 분자와 상호 작용한다.

IgE에 대한 고친화성 수용체와의 상호 작용하는 IgE의 입실론(ε) 사슬의 부위에 대한 연구에서는 CH2와 CH3 도메인(CH는 중쇄에서 정상부분) H쇄 사이에 다소 넓은 76개의 아미노산이 IgE 분자와 고친화력 수용체 사이에 상호작용에 결정적인 역할을 하는 것으로 나타났다.

in vitro에서 CH2-CH3-CH4 부위(Helm et al., 1988)와 비교하였을 때 이와 같은 펩티드는 거의 1:1 비율로 IgE와 고친화성 수용체의 상호작용을 저해시킬 수 있는 것으르 보인다. 이 펩티드는 알레르겐 자극에 의해 IgE-관련된 발적반응을 저해시킬 수도 있는 것으로 나타났다. 그러나 이 경우에 동일한 저해효과를 나타나는 IgE보다 약 농도가 10배나 높다(Helm et al., 1989).

IgE 분자가 수용체에 결합할 때, 입실론(ε) 사슬의 특정부위는 IgE 분자의 동일부위내에 있는 에피토프에 상응하는 항체와 같은 다른 분자와의 상호작용을 방해받는다. 그다음, IgE 항체는 IgE 분자의 CH2-CH3 부위에 대응하는 IgG 항체 또는 이의 수용체에만 결합하기 때문에 이들 둘에 동시에 결합하지는 않는다. 위에서 설명하는 것과는 대조적으르, 수용체에 직접 상호작용을 할 수 있는 부위 밖의 에피토프에 결합하는 항체는 비만세포의 표면에 결합된 IgE 분자의 교차결합이 일어난다. 이 경우 항체를 주입한 피검자에 과민성 쇼크와 과립이 매우 강력하게 방출된다. 수용체 대조적으로 결합 단백질에 항체가 결합되면 이와 같은 수용체에 교차결합이 일어나지 않고, 즉각적인 반응이 일어나지는 않으나 효과는 더 오래 지속되어 자유로이 순환하는 IgE의 농도가 감소되게 된다. 이것으로 IgE 항체가 혈장에 더 이상 존재하지 않으며, 과립의 유리가 저해된다.

이와 같은 항-IgE 항체는 IgE-생산 B세포 집단을 영구히 제거시켜 IgE 합성을 좀더 오랫동안 억제시킬 수 있는 가능성을 증가시킨다. 알레르기를 일으킬 수 있는 꽃가루 노출시기에는 꽃가루 알레르기의 강한 반응의 원인이 되는 IgE에 이 항체가 결합하여, 이를 완전히 제거시킨다. 여러가지 관찰에 따르면 비-알레르기 개체에서는 내생 항-IgE 항체가 상대적으로 높은 농도로 존재하는데, 이는 유사한 알레르기-저해 효과를 가지는 것으로 보인다.

본 발명에 따른 백신 효과는 체내의 고유 IgE에 대한 면역반응을 유도시킬 수 있는 능력에 기초하고, 이로 인해 이들 수용체에 IgE 항체의 결합을 저해시킨다. 이로써, 비만세포에 저장된 알레르기 유도물질이 방출되는 것을 막을 수 있다.

A. 수용체 결합 펩티드와 다른 수용체 길항물질

현재 세계적으로 몇몇 연구집단에서 항원-특이적 IgE에 결합을 저해시키기 위한 IgE 수용체에 결합할 수 있는 짧은 펩티드 또는 다른 분자들을 준비하고 있다. 그 다음 이와 같은 물질은 알레르기 치료용 약물로도 이용될 수 있을 것이다.

이 경우에 문제점은 IgE 분자와 이들의 수용체 사이에 강력한 상호작용을 가지는 수용체에 대해 강력한 결합을 가지는 분자를 수득하는데 상당한 어려움을 가진다. 효과적인 물질을 얻기 위해서는, 수용체에 비가역적으로 결합하는 물질이어야 한다. 그러나 이와 같은 물질은 신체에서 공유적으로 결합하고 다른 구조적으로 유사한 물질을 차단시키기 때문에 상대적 독성을 갖는다. IgE의 α사슬은 더 큰 유전자 집단에 속하는데, 몇가지 상이한 IgE Fc 수용체를 얻을 수 있다. 이와 같은 수용체는 박테리아 감염에 대해 신체를 방어하는데 필수불가결한 것이다. 공유결합에 의해 활성화된 분자는 상대적으르 불안정하고 따라서, 비만세포와 호염기성 백혈구 세포에 연속적으로 IgE 수용체를 새로 생성되는 것을 완전하게 차단시키기 위해서는 상대적으로 높은 농도로 하루에 여러차례 투여해야 한다.

B. 알레르기 치료에 대한 항-IgE 단클론

미국의 생명공학 회사에서는 사람 IgE 분자의 IgE 수용체 결합부위에 대한 단클론항체를 쥐에서 생산시키는 것에 대해 연구하고 있다. 이와 같은 항체는 유전공학적으로 "후머나이즈"된 것으로, 즉 쥐 단클론의 일정부위에 해당되는 사람의 상응부위를 대체시키는 것이다. 그 다음 이들 항체는 주입에 사용하기 위해 대량 정제된 상태로 준비한다. 이와 같은 교화는 항체에 대해 신체의 면역반응을 감소시키기 위해 이용되는데 그렇지 않을 경우 제2 또는 제3 주입후에는 직접적으로 생명을 위협하는 복합물을 유도하는 대량 면역복합체가 형성되기 때문이다.

꽃가루 알레르기 환자를 치료하기 위해, 꽃가루의 농도가 높은 시기동안에 일주일에 한번 또는 여러차례 이와 같은 항체를 주입하는 것이 필수적이다. 단클론 항체를 주입하는 경우에 문제점은 기존에 체내에 전혀 노출이 안된 새로운 에피토프를 고농도 포함하고, 이와 같은 단클론 항체에 대해 높은 항체 역가가 상대적으로 빨리 얻어진다는 것이다. 이것은 아마도 쥐단클론 항체에 대해 동일한 방식으로 단클론 항체가 쥐 V-부위에 "프레임워크"를 가지기 때문에 면역복합체 형성에 의해 생명 위협 복합체를 형성할 수 있다. 이와 같은 복합체 형성을 피하기 위해, 치료동안에 변경될 수 있는 교화된 항체를 다량 이용할 필요가 있다. 매우 정확하게 주입하더라도 면역복합체가 형성될 위험이 있다.

C. 펩티드 백신(CH4-ε)

스탠워스 박사팀은 토끼 또는 쥐에서 면역화를 위한 이형수용체 단백질에 결합될 수 있는 사람 펩티드 이용에 관계하는 연구를 한다. 쥐를 치료하기 위해 토끼에서 이형 항혈청을 이용하였다. 면역반응을 나타내고 비특이적 펩티드인 항원을 주입한 토끼에서 ELISA에 의한 대부분의 공지된 방법으로는 어떠한 면역 반응도 감지할 수가 없다(Stanworth et al. 1990). 이와 같은 집단은 아래에서 상술하는 것과는 상이한 IgE의 수용체결합(CH2-CH3) 부분의 외부 짧은 펩티드를 이용한 것이다. 이와 같은 짧은 펩티드를 이용할 때의 흔한 단점은 스탠워스의 모델 시스템에서 매우 약한 면역반응으로 인한 것이 이유가 되고, 안정한 이차구조를 형성할 수 있는 가능성이 약하다는 것이다.

[발명의 목적]

본 발명의 목적은 사람을 포함하는 포유류에 IgE 유도 알레르기 반응의 유도 또는 이 증상의 경감시키도록 디자인된 백신을 제공하고 이 백신은 신체의 고유 IgE에 대해 면역반응을 일으키며, 이 백신이 IgE 수용체에 대한 IgE 항체의 결합을 저해시켜 비만세포에 저장된 알레르기 유도물질의 해리를 저해시키는 것이다.

본 발명에 따른 목적은 포유류의 IgE 분자의 ε사슬의 CH2-CH3 도메인의 전체 아미노산 서열을 가지는 단백질 또는 고유 또는 돌연변이 또는 다가형에서 12개 아미노산 이상을 포함하는 아미노산 서열로된 구조적 안전한 유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신에 의해 이루어지며, 이 단백질은 하나이상의 이인자형 수용체 단백질과 선택적으로 어쥬번트를 포함하여 결합된 형태가 될 수 있다.

본 발명은 포유류에서 IgE 유도성 알레르기 반응에 대한 백신제조를 위해 포유류에서 IgE 분자의 ε사슬의 CH2-CH3 도메인의 전체 아미노산 서열을 이용한 또는 이의 원형 또는 돌연변이형 또는 다가중합형에서 12개 아미노산 이상을 포함하는 아미노산의 구조적으로 안정한 소단위를 가지는 백신의 제조과정과 이의 용도에 관계한다.

CH2-CH3 도메인의 아미노산 서열(전체 서열 또는 이의 일부)에 "돌연변이"형이 있다는 의미는 직접 교환, 결손 및 삽입으로 인해 돌연변이가 일어났다는 것이다. "약한" 돌연변이형이란 아미노산 서열의 주요부분은 고유의 단백질 서열을 가지고, 이 기능상 효과는 고유서열의 것과 동일하거나 또는 약간 감소된 것이어서 "약한" 돌연변이형 아미노산 서열은 신체에 여전히 내성을 가지고, 고유의 형태와 유사하여, 본 발명에 따라 항원으로 활동하기 위해 수용체 단백질에 결합될 수도 있다는 것을 의미한다.

"강한" 돌연변이형은 고유의 아미노산에 아미노산 교환, 결신 또는 삽입에 의해 그 자체가 항원으로써 기능을 할 수 있는 것을 의미하는데 그 이유는 신체의 내성이 없는 돌연변이에 대해 새로운 T-세포 에피토프가 발생되고, 이 경우, 이인자형 수용체 단백질에 결합될 필요가 없다.

"다중합형"은 단백질의 아미노산 서열(전체 또는 일부)이 두개이상의 반복유닛을 포함하는 형태로 중합되어 이와 같은 과정에 따라 그 자체로 항원 역할을 할 수 있는 다중합형이 가능한 별도 유닛 사이에서 새로운 T-세포 에피토프가 발생할 수 있고, 따라서 이인자형 수용체 단백질에의 결합이 필요하지 않다.

본 발명의 적절한 구체예는 고유형태의 IgE 분자 ε사슬의 CH2-CH3의 아미노산 서열(전체 또는 일부)을 가지는 단백질의 이용에 관계하며, 이 단백질은 하나이상의 이인자형 수용체 단백질에 결합되어 있고, 따라서 본 발명은 다음의 특정 구체예로 설명한다.

본 발명은 IgE에 의한 알레르기 반응에 대한 면역화하는 기존의 방법에 연관된 문제를 해결하기 위한 전반적으르 새로운 개념에 기초하고, 본 발명의 백신은 신체의 고유 IgE에 대해 면역반응을 유도할 수 있다.

자연적으르 단클론 항-IgE 반응을 생성시키기 위해 신체를 자극하면, 면역반응을 자극할 수 있는 성질이 다소 약하기 때문에 전체적으로 종-특이적인 항체가 수득된다. 이와 같은 항체는 체내에서 순환하는 IgE에 결합되어, IgE 수용체에 결합하는 것을 저해시킨다. 면역반응이 다클론성이고, 동일한 이디오타입(항원결정기)을 가지는 분자의 수가 적다는 것을 항-이디오타입 반응 문제가 완전히 해결되었다는 것이다.

여기에서 상술하는 접근방식은 선행기술에서 시도되지 않았던 것으로, 신체 고유 IgE에 대해 강력한 IgG 반응을 어떻게 얻을 수 있는가의 문제에 연관된 것인데 그 이유는 출생이후 IgE 분자는 신체에 내성이 있는 것으로 면역학적으로 이에 대해 반응하지 않기 때문이다. 이와 갈은 문제를 해결하기 위해, 본 발명에 따라 여기에 사용된 것은 거의 알려지지 않는 면역시스템의 특징이나 이것이 이 문제해결의 유일한 길이고, 단클론 프르젝트에 영향을 줄 수 있다. 비-종간특이적 단백질에 CH2-CH3 부위(단백질)를 결합시킴으로써 신체고유 IgE에 대한 면역시스템의 내성이 방해받고, 이것은 수용체로 선택된 외부 분자에 대한 항체 반응만을 일으키는 비-내성화된 T-세포 집단의 재충전을 유도하나 종간 특이적인 분자에 대한 항체를 생산하는 B-세포에 도움이 된다. 수용체 단백질에 CH2-CH3 부위를 직접 결합시키면 이와 같은 효과를 얻을 수 있다.

이와 같은 현상의 결과는 유사한 접근방식의 시도를 한 연구집단이 왜 없었나를 설명해야 하는 면역학적 연구회에서 거의 무시되어 왔다. 발명자는 기존에 유사한 연구가 전혀 실행되지 않았기 때문에, 이와 같은 현상을 이용한 가능성에 대해 분석하였다. 펩티드의 결합에 연관된 연구에서 토끼, 쥐에 주입을 위해 사람 펩티드를 이용하였으나 동일종에서 얻은 펩티드는 이용하지 않았는데, 그 이유는 종간 특이적 분자에 대해서는 강력한 면역반응을 일으키지 않는다는 우세 의견에 따른 것이다.

본 발명에 따른 종간 특이적인 IgE에 대한 강력한 면역반응을 얻을 수 있다는 것을 확인하기 위하여, 쥐 균주를 쥐의 IgE의 전체 CH2-CH3 도메인에 결합된 수용체 분자를 포함하는 융합 단백질로 면역화시키는 실험을 실시하였다(실시예 2). 이들 쥐에서 쥐의 혈장에서 IgE 순환형과 같은 고유 쥐-IgE에 대한 강력한 항체반응을 얻을 수 있었다(4주후). ELISA로 측정하면 이와 같은 항체반응은 완전히 비특이적-종간 단백질(사람의 경우에 IgG)에 대해 얻을 수 있는 수준보다 훨씬 낮은 수준이 된다(도1).

스탠워스와는 대조적으로 발명자가 이와 갈은 강력한 면역반응을 얻는 이유는 아마도 약 10개 아미노산을 가지는 펩티드보다는 큰 부위(가령, 최고 CH2-CH3 전체 도메인까지)를 이용하였기 때문인 것으르 보인다. 이는 형성된 항체에 대해 휠씬 많은 에피토프가 얻어지고, 이와 같은 에피토프는 고유 IgE 분자와 같은 동일한 모양을 하고 있기 때문이다.

"이인자형 수용체 단백질"이란 수용체로 사용되는 단백질이 종에 상응하는 유사성을 가지지 않는 종간 특이적이 없는 단백질을 의미한다. 그러나 이와 같은 단백질에 노출되는 경우에 매우 강력한 면역반응을 일으키는 문제점이 있기 때문에 일반적으로 피해야 한다.

이인자형 수용체 단백질에 작은 펩티드를 결합시키면, 분자의 매우 한정된 부위에 대해 상대적으르 약한 면역반응을 얻을 수 있다. 매우 큰 펩티드는 펩티드에 대해서만 반응하고 고유 단백질에 상응해서는 반응이 일어나지 않는 면역반응을 유도한다.

또한 매우 강력한 면역 반응을 얻는 것이 중요한데, IgE 분자와 고친화성 수용체 사이에 상호작용에 대해 결합상수는 매우 높고 이는 1 ×10^-8내지 2.6 ×10^-10의 범위가 된다(Froese, 1980). 면역화후에 다클론 반응을 얻기 위해 CH2-CH3 부위내에 상이한 에피토프에 대해 몇가지 상이한 항체 반응은 동시에 동일한 IgE 항체가 결합할 수 있다. 프리 IgE의 매우 높은 복합 결합 강도를 얻기 위해 얻는다. 따라서 짧은 팹티드에 대해 형성된 항체 또는 단클론 항체의 경우와 비교하였을 때 항-IgE 항체는 상대적으로 용이하게 면역화된 개체의 프리 IgE와 경쟁할 수 있다. IgE와 고친화성 수용체 사이의 상호작용이 매우 강하기 때문에 상당히 중요하다. 전체적인 도메인 또는 이의 구조적으로 안정된 부분을 이용하는 발명적 아이디어는 전술한 것과 같은 펩티드 접근방식과 비교하여 전반적으로 신규한 개념과 큰 장점을 가진다.

펩티드에 대한 항체반응이 고유 단백질의 아미노산 부위에 대해 낮은 또는 친화력이 없는 것은 전체 도메인 또는 구조적으로 안정한 단위에 대한 항체반응은 기존의 것과 비교하면 결정적인 차이를 가져온다는 것을 의미한다.

IgE 분자의 CH2-CH3 부위(전술한 것과 같이 이인자형 CH4 펩티드)를 이용하는 경우에, 면역주사를 한 후에 신체는 IgE 수용체와 상호작용할 수 있는 IgE 분자에 대한 항체만을 만든다. 이론적으로는, CH3 도메인의 C-단부 또는 CH2 도메인의 N단부에 대해 직접적인 항체가 이와 같은 항체를 형성하는 포유류에 과민성 쇼크를 일으킬 수 있는 위험이 있다. 그러나, 항체의 가변부위는 전체 도메인의 크기에 상응하여 대부분의 경우에 수용체 결합의 공간적 저해가 이와 같은 항체의 경우에도 일어난다. 또한 면역반응이 이루어지는 동안, 상당수의 에피토프에 대해 지속적으로 항체가 생산되고 소수의 항체중에 하나만이 IgE 분자에 결합되는 가능성은 매우 낮다. 그러나, 테스트를 받은 많은 동물에서 이와 같은 면역화 효과가 감지되지 않는 것으로 나타났다(실시예 2). 혈액에 항-CH2-CH3 항체량이 많은 쥐에서는 어떠한 과민성 쇼크 증상이 나타나지 않았지만, 건강 측면에서는 사람 IgG로 면역화된 동물 또는 어쥬번트(항원없음)만으로 면역화된 동물과는 구별되지 않는다. 이것은 테스트 동물에서 매우 높은 항-IgE 역가를 가지더라도 이와 같은 면역화의 네가티브 효과가 감지되지는 않는다는 것을 의미한다. 따라서, 종-특이적 IgE에 대해 매우 높은 항-IgE 역가를 얻을 수 있는 것이다, 또한 이와 같은 쥐는 이와 같은 치료에 대한 어떠한 감지할만한 네가티브 효과를 나타내지 않는다는 것은 합병증없이 사람을 치료하는데 있어서 높은 치료 가능성을 가진다는 것을 의미한다. 또한 이와 같은 데이타로 볼때 쥐에서 IgE 수용체-결합 IgE가 실제로 존재하지 않는다는 것을 의미한다. 그렇지 않으면 항체의 역가가 아무리 낮더라도 이미 언급된 바와 같은 CH2와 CH3 도메인의 외부에 결합할 수 있는 항-IgE 항체의 강력한 과민성 반응이 유도될 수 있을 것이다. 이는 비만세포가 교차결합 항체의 농도가 아무리 낮더라도 이에 민감하기 때문이다. 기존의 연구에서 면역화시에, 항-IgE 역가가 높은 동물에서 항-IgE 항체 유도후에 비만세포 입자를 유리시키는 경향이 상당히 감소되는 것으로 나타났다(실시예 3; 도면 2). 발명자는 닭의 오브알부민에 대해 강력한 알레르기성이 있는 쥐의 치료와 연관된 더 많은 연구를 실행하고 있다. 쥐에서 지금까지 실행된 연구결과에 따르면 네가티브 효과가 나타나지 않는 강력한 면역반응을 얻을 수 있고, 최종적으로 쥐에서 다클론 활성물질의 첨가시에 입자의 유리가 상당히 감소되었기 때문에 몇가지 측면에서 가능성이 보인다.

이와 같은 유형의 백신은 특정 어려움에 직면하게 된다. 이 가능성의 영향을 주는 큰 문제는 신체에서 제거하는 것이 바람직한 물질의 농도이다. 이 경우 농노가 높으면 더 어렵다. 다른 이뮤노글로블린 이소타입이 선택되는 경우, 이들 항체는 일반적으로 혈장 농노가 더 높기 때문에 문제가 더 크다.

혈장수준이 낮기 때문에 IgE가 이상적이다. 정상적인 비-알레르기성 개체 집단에서 혈장수준은 10내지 400ng/㎖이다. 이 양은 우리 혈액에 있는 총 이뮤노글로블린 양의 0.01% 이하에 상응한다. 이 수준은 알레르기 개체에서 다소 증가하나 5㎍/㎖을 초과하지는 않는다. 비교를 목적으로 쥐에서 실행한 테스트를 언급하는데, 이뮤노글로블린의 L쇄중에 하나에 대한 항체를 이용하여, 이와 같은 형태의 이뮤노글로블린이 거의 부족한 동물에서 수득하였다. 이와 같은 테스트에서, 쥐의 총 이뮤노글로블린의 총량의 약 95%에 상응하는 양으로 쥐의 이뮤노글로블린의 k-사슬에 대한 단클론 항체를 주입함으로써, 쥐의 혈액에 있는 이들 항체를 거의 완전히 손실시켰다. 쥐에 나타나는 남아있는 항체는 거의 100%가 Igλ 타입이 된다(Igλ의 고유농도는 약 5%정도이다). 신체에서 상당히 높은 농도의 이물질을 제거해야 하는 경우에도 순환계에서 이물질이 완전히 제거하는 것이 가능하다.

강력한 자가면역성을 유도하는 장기간 효과에 대해 공지된 것이 없는 것이 또다른 가능성 있는 복합문제이다. 그러나, 이 경우에서 종특이적 항원에 대한 면역반응을 유도하기 위해 종간-특이성이 없는 분자에 대해 T-세포가 이용된다는 장점이 있다. 백신 프로그램이 종료되면, 몇달후에는 신체 고유 IgE에 대한 항체반응은 거의 감지불가능한 수준으로 서서히 감소하게 된다. 초기 백신화에 이용된 등일한 운반체 분자에 졀합된 CH2-CH3로 부팅을 시키지 않는 경우에 일어난다. 쥐에서 실시한 많은 연구에서도 이와 같은 현상이 나타나는데, 상이한 운반체에 결합된 헵텐에 대한 2차 면역반응은 전적으로 초기에 선택된 운반체 분자에 의존한다는 것을 볼 수 있다. 예견하지 못한 이유로 피검자가 이와 같은 면역화반응에 음성적으로 반응하는 경우, 면역화반응을 종료시키고, 항체역가는 몇개월이내에 감지 불가한 수준으로 도달하게 된다. 이는 신체 고유 IgE에 대한 단클론항체를 주입할 때의 경우와 유사하다.

몇가지 기술적면에서 항-알레르기 백신의 주요성분으로 이용된 결합 단백질은 두가지 다른 방법으로 준비될 수 있다. 한 방법은 진핵 또는 원핵 숙주세포에 소위 융합단백질로 불리는 이미 결합된 단백질의 생산과 관계 있다. 원핵숙주로는 통상적으로 대장균이 이용되고, 이스트 세포 또는 세포주와 같은 다수의 다른 시스템이 진핵세포숙주로 이용될 수 있다. 세포주는 곤충에서 사람에 이르기까지 다양하게 이용할 수 있다. 그러나 사람의 세포는 세포배양시에 사람 바이러스에 의한 오염 위험성이 항상 있기 때문에, 통상적으로 임상적으로 사용하는 것은 피하는 것이 좋다. 두번째 기술은 IgE 분자의 CH2-CH3 부위의 일부 또는 전체의 경우에 운반체 단백질과 종-특이적 활성성분에 직접 화학결합을 하는 것이 기초될 수 있다. 따라서, 단백질은 별도로 생산된다. 이 기술은 합성 펩티드로 면역화반응 및 작은 헵텐(단백질이 아닌 물질)으로 면역화반응에 통상적으로 이용될 수 있고, 이는 CNBr 과 같은 운반체 단백질의 화학적 활성에 기초하고, 그 다음 결합된 단백질 또는 펩티드와 활성화된 운반체와 혼합한다. 이들 두개는 각기 서로 공유결합될 수 있다.

면역 반응 촉진 물질(어쥬번트)과 가용성 또는 응집된 단백질 백신을 혼합한 다음, 피하, 복막 또는 근육내로 주입하여 면역화반응을 실시한다. 지금까지 연구된 바와 같이, 백신은 피하 또는 복막내로 주입될 수 있다. 이와 같은 테스트에서 쥐를 면역화시키는 경우에, 쥐 한마리당 100㎍ 항원이 이용되고, 상이한 쥐 균주에서 이 농도를 이용한 경우에 매우 강력한 면역반응을 얻을 수 있다(도면 1). 사람에서 알룸(Alum)과 같은 상대적으로 약한 비-독성 어쥬번트를 이용하거나 어쥬번트 첨가없이 응집된 단백질을 다량 이용하여 주입한다. 응집된 융합단백질은 단백질의 면역발생성을 증가시킨다.

또한 사람의 경우에 상당히 많은 양의 항원이 이용되는데, 가령 순수단백질 100-500㎎이 이용될 수도 있다. 기술적인 면에서, 매우 순수한 형태로 이들 융합단백질을 다량 얻는 것이 가능하기 때문에 어떤 더 큰 문제점은 연관되지 않는다. 현재, 사람 백신 및 쥐 백신을 소규모로 생산하는 데에는 많은 융합 단백질 변이체가 있다. 그러나, 사람 백신 분석은 상이한 쥐균주에서 현재 실행되고 있기 때문에 그 결과는 두고 보아야 한다.

강한 면역반응을 얻기 위해 3주 간격으로 처음에 반복 주입한다. 그 다음, 기존의 면역반응을 활성화시키고, 새로 도래되는 위험시기전에, 이와 같은 면역반응을 상당히 증폭시키기 위해, 꽃가루에 알레르기가 있는 개체에는 꽃가루가 날리는 시기의 몇주전에 면역주사를 실행해야 한다.

또한 종특이적 단백질 또는 단백질 단편에 결합된 이인자형 운반체 분자를 다수 이용하여 T-세포의 비율을 증가시킨다. 이는 사람 IgE 분자의 CH2-CH3 부위에 대한 항체를 생산하는 B세포를 돕게 된다. 면역화 과정이 개선되어 면역화 효과를 유지하면서, 면역화에 이용하는데 필요한 항체양이 감소될 것으로 기대된다. 후자의 경우에 강력한 어쥬번트가 이용되지 않고 사람에서 임상 테스트가 실행될 때까지, 즉각적인 이득이 되지는 않으며, 백신의 면역화반응성을 증가시키기 위해 모든 이용 가능한 방법을 사용하여야 한다.

전술한 것과 같이, 본 발명의 목적은 사람에 사용할 수 있는 백신제조에 관계한다. 그러나 본 발명의 영역내에서 IgE에 의해 조정되는 알레르기 반응에 대한 백신화가 경게적으로 중요한 다른 포유류 종에 관한 백신이 될 수도 있다. 이와 같은 종에는 개, 말, 돼지 등이 된다.

본 발명은 다음의 실시예로 더 상술한다.

사람과 쥐의 IgE의 ε사슬의 CH2-CH3의 융합단백질 제조생산

이 실시예에서는 종-특이적인 단백질 및 담체 단백질을 박테리아, 이 경우 대장균에서 생산하기 위한 시스템이 이용되었다. PCR 기술에 의해(중합효소 사슬반응), 사람과 쥐의 TgE ε사슬의 CH2-CH3 부위의 cDNA 서열을 클론시켜, 박테리아 숙주에서 융합단백질 생산을 위한 상업적으로 이용가능한 벡터에 결찰시킨다. 이용된 벡터는 cDNA 단편에 결찰시키기 위해 다른 리딩프레임을 가지는 1, 2, 3형태의 pGEX를 이용한다. 이 경우, 벡터는 직접적인 면역화반응을 위해 순수한 융합단백질을 다량 생산한다. 이 벡터에서, 기생충 쉬스토조마 자포니움(Schistosoma japoncium)에서 26kD 글루타티온-S-투란서퍼라제(Sj26)의 전체 코딩부위는 강력한 유도성 박테리아프로모터 뒤에 클론시킨다. 소위 tac-프로모터로 불리는 이 프로모터는 Iac 리프레서에 의해 음성적으로 조절된다. 다량의 단백질을 얻기 위해, IPTG(이소프로필-β-D-티오칼락토시드)를 이용하여 프로모터가 저해되는 것을 완화시킨다. Sj26 유전자의 C단부로 벡터의 CH2-CH3 단편을 결찰시킨 후에, 이 융합단백질을 생산하기 위해 대장균으로 벡터를 형질도입시킨다. 원하는 단편이 결찰된 벡터를 포함하고 있는 새로운 박테리아의 배양술은 박테리아 성장배지와 1:10으로 희석시키고, 2시간동안 추가 생장시킨다. 그다음, IPTG를 100μM로 첨가하고, 배양물은 4시간동안 교반하면서 추가 배양시킨다. 그다음, 박테리아는 원심분리로 수득하고, 세포 펠렛은 PBS로 3회 세척시킨다. 세포는 PBS+1% 트리톤 X-100으로 현탁시켜 5×15초간 초음파 파쇄하여 박테리아 세포를 파괴하여 세포로부터 단백질을 유리시킨다. 쥐와 사람 CH2-CH3 융합단백질의 경우에, 단백질은 세포내 결정으로 침전되고, 8M 요소를 포함하는 용액을 이용하여 용해시킨다. 사람 단백질은 순수 PBS에 대해 투석시켜, 완전히 용해시킨다. 현재까지 사람의 융합단백질에 대해 거의 100%의 정제될 수 있는 거대 스케일 정제 프로토콜을 얻는 작업이 진행중이다. 그러나 쥐의 CH2-CH3 융합단백질이 불용성이고 대부분의 단백질이 30분 내지 1시간동안 투석뒤에 침전될 수 있다. 이는 쥐에서 강력한 IgE 중개 염증반응을 차단시킬 수 있는 가능성 및 쥐 고유 IgE에 대한 강력한 항체반응을 얻는 가능성에 대해 연구되고 있다. 단백질의 나머지 50%는 상이한 박테리아 단백질 오염물질로 구성되고, 단일 단백질은 총 단백질의 10% 이하가 된다.

[실시예 2]

쥐의 면역화-면역반응 측정

면역화 또는 백신화는 백신을 형성하기 위해 실시예 1에서 준비된 융합단백질과 면역반응 강화물질(어쥬번트)과 혼합시켜 실행된다. 연구된 쥐에 가용성 응집단백질 혼합물을 백신과 함께 피하 또는 복막내로 주입시킨다. 이 테스트에서 면역화 경우와 쥐에서 각각 프루이트 컴플리트 어쥬번트와 인컴플리트 어쥬번트 0.2㎖에 쥐항원 약 100㎍의 양으로 이용한다. 이 농도와 어쥬번트를 이용하여, 상이한 쥐 균주에서 매우 강력한 면역반응을 얻을 수 있다.

도면 1a와 b에서, 균주당 4마리의 상이한 균주와 균주당 세마리의 상이한 쥐를 테스트한다. 네가티브 IgE에 대한 항체 역가는 ELISA에 의해 측정하였다. 이 검사는 ELISA 플레이트의 코팅을 위해 고유 IgE를 코팅 완충액(5㎍/㎖)에 넣어 이용하였다. 상이한 테스트 동물에서 쥐혈청을 연속적으로 희석(1/5)하여 ELISA의 발색반응을 검사하였다. 400nm에서 흡수값은 도면 1에 Y축에 나타낸다. 도면에서 희석비(1/5)는 우측으로 희석배수 증가시키면서 X축에 나타낸다.

4가지 상이한 쥐 균주(Lewis, Sprague Dawley, Wistar and Brown Norway)를 CH2-CH3 백신에 대한 반응능력을 좌측에서 분석하고 사람 IgG에 대해 우측에서 분석한다. 이용된 백신은 쥐의 CH2-CH3으로 사람 백신에 대해 전체적으로 상응하는 것이다. 이들 쥐에는 2회만 백신접종을 하는데 즉, 플루이트 컴플리트 어쥬번트와 단백질용액으로 백신화하고, 다음 2회 백신접종은 플루이트 인컴플리트 어쥬번트에서 동일한 단백질 용액으로 3주뒤에 실시한다. 제2차 백신접종 후 2주뒤에 쥐에서 혈액을 취한다. 혈액에서 항-IgE 항체의 양을 ELISA 검사를 이용하여 정량한다. 도면에서 명백히 볼 수 있는 바와 같이, 균주중 3가지만이 백신에 잘 반응하고, 4번째 균주는 소위 "비-반응균"이라고 불리는 친화종(congenic strain)으로써 통상적으로 사용되지 않는다. 이는 이들 쥐 균주는 면역시스템에 항원을 제공할 수 없고, 따라서, 원하는 알레르기 백신 효과를 얻기 위해서 이 쥐 균주에서 또다른 이형 단백질 운반체를 이용해야 한다는 것을 의미한다.

이들 초기 ELISA에서 보는 바와 같이, 쥐 IgE의 두 도메인에서만 매우 강력한 면역반응을 얻을 수 있는데 4개의 도메인에 상응하는 이는 사람 IgG에 대해 수득되는 조금 더 강한 반응과 비교할 수 있고, 이들이 가지는 크기는 4개 도메인에 상응하는 것이다. 매우 높은 항-IgE 역가를 나타내는 쥐에서는 네가티브 증상이 나타나지 않는다. 실제 이들은 플루이트 어쥬번트에서 정제된 PBS만으로 면역화되는 쥐와 구별할 수 없다(도면 1의 콘트롤, "블랭크" 표시).

[실시예 3]

쥐의 면역화-IgE가 조정하는 염증반응의 억제

강력한 IgE에 중개되는 염증 반응을 억제시키는 백신의 능력을 평가하기 위해 이 연구가 실행되었다. 에세이 시스템의 용도는 항-IgE 항체가 피부의 비만세포에 결합된 IgE 항체에 교차 결합된 능력을 가지고, IgE 분자에 결합되는 능력에 의해 입상물의 해리를 유도시키고, 이에 의해 항체가 주입되는 위치(피부)에서 강력한 염증반응을 야기시킨다. 이 실시예에서는, IgE의 전반적인 정상부위에 대한 다클론 항-IgE 항혈청을 만드는데 이용된다. 그러므로 이 결과로부터, 이 혈청은 교차 결합된 항체를 다량 포함하고 있다는 것을 확인할 수 있다. 염증반응의 강도는 발색반응으로 측정될 수 있다. 상이한 혈액 단백질의 침투성 및 이에 따른 누출은 염증이 야기된 위치에서 강하게 증가되었다. 테스트 쥐의 혈액에 1% 에반스 블루용액을 2시간전에 주입하고, 테스트동물의 피부에 블루존을 확인하는데, 염증반응이 강할수록 블루존 지역이 커진다. 도면 2에서 보는 바와 같이, 피부 제거하기 2시간전에 다클론 항-IgE 항혈청 농축용액 각 50㎕을 백신화된 쥐의 피부와 블랭크 면역화된 쥐에 4회 주입하고 염증지역을 측정한다. 콘트롤 주입은 쥐의 한 부위에는 IgE+항-IgE를, 또다른 한 부위에 PBS를 주입하는 것이다. 이와 같은 쥐의 일반적인 실시예는 도면에 나타내었고, 한 쥐는 플루이트 어쥬번트에 CH2-CH3 백신으로 면역화시키고, 또다른 콘트롤 쥐는 플루이트 어쥬번트에 PBS로 면역화시킨다. IgE+항 IgE 콘트롤 부위는 두 쥐에서 크기가 매우 유사하게 나타내나, 항 IgE 항체만을 주입한 지역은 백신주사를 맞는 쥐에서는 거의 나타나지 않는다. 항-IgE 항체는 블랭크-면역화된 쥐(콘트롤)에 대해서만 강력한 블루존을 유도한다. 이는 백신화된 쥐에서는 비만세포의 표면에 IgE 항체가 거의 완전하게 부족된다는 것을 나타내고, 이는 면역화반응에서 기대되는 것과 동일한 결과가 되며, 이들 쥐에서 고농도의 내생 항-IgE 항체가 발견되는 것으로 나타났다. 그러나, 이는 항 IgE 항체와 외부 IgE를 동시에 첨가하여, 정상적인 블루존을 유지시킬 수 있고, 원래 IgE가 없는 비만세포에 있는 비만세포 수용체에 다시 결합할 수 있기 때문에, 비만세포가 부족하지 않다.

본 작업은 새로운 쥐 모델에서 실행되는데 이는 매우 강력한 IgE 반응을 본 발명에 따른 쥐 백신에 상응하는 위스타 쥐에서 야기되었다(도면 1). 새로 개발된 과정에 따라(Diaz-Sanchez and Kemeny, 1981), 쥐의 면역화반응은 특이 항원으로 실시하는데 이 경우에는 오브알부민과 독소 리친을 이용한다. 몇주뒤에, 이들 쥐는 오브알부민에 대해 매우 강력한 IgE 반응을 얻을 수 있고 이 면역반응은 상당히 오래 지속된다. 이와 같은 프로토콜을 이용한 초기 연구결과는 양호하였다. 오브알부민 5㎎/㎖을 포함하는 용액 50㎕ 주입후에, 피부에서 강력한 염증반응을 유도시키는 능력에 대해 여러 쥐에서 분석하였다. IgE+항 IgE 및 이미 언급한 양성기준의 양에 2배가 되게 블루존이 나타났고, 이들 쥐는 오브알부민에 대해 상당한 알레르기를 가진다는 것을 나타낸다. 이와 같은 쥐는 현재 피부 알레르기 반응 차단시킬 수 있는 가능성 연구와 기관지 협착 및 다른 일반적인 알레르기 관련 증상의 연구에도 이용된다.

아래에는 본 발명과 선행기술의 기본적인 차이점은 4가지로 기술하였다.

1. 본 발명의 요점은 IgE 수용체와 상호작용에 직접 연관되는 IgE 분자의 도메인에 관한 것이고, 기존 연구에서는 CH4 도메인과 상호 작용하는 비-수용체에 관계되는 것이다.

2. 본 발명의 백신에는 하나이상의 이인자형 운반체에 결합된 종간-특이적 단백질 단편을 포함하고, 기존 연구와는 대조적으로, 다량의 강력한 면역 반응을 일으키고, 이때 백신은 결합된 펩티드가 주사된 종이외의 또다른 종(예를 들면 생쥐, 쥐, 토끼에서 사람 펩티드를 이용)의 입실론(ε) 펩티드로 만들어질 수 있다.

3. 전세계 몇몇 실험실에서 진행중인 단클론 프로젝트와는 대조적으로, 본 발명은 종간 특이적 단백질에 다클론성 면역반응의 발생에 기초하여 생명을 위협하는 염증반응을 유도하는 면역 복합체 관련 복합물이 형성되는 것을 대부분 피할 수 없는 것이기 때문에, 성공적인 결과를 얻을 가능성을 증가시킬 수 있다고 본다.

4. 본 발명에 따른 가장 중요한 차이는 백신으로써 전체적인 도메인 또는 구조적으로 안정한 일부(12개 아미노산 이하)로 만드는데 있다. 따라서, 고유 IgE에 대해 테스트 동물 시스템에서 강력한 다클론 반응을 유도할 수 있고 이것이 이와 같은 형태의 백신에 가장 중요한 특징이 된다. 면역주사 후 몇주뒤에 백신을 얻을 수 있는데, 이는 짧은 합성 펩티드로 만든 기존의 방법에 비하면 상당한 진보된 것을 의미한다.

Claims (4)

1. IgE-관련된 알레르기 반응에 대해 포유류를 면역화시키기 위한 백신에 있어서, 백신은 이뮤노겐으로써, 이뮤노겐 공액물은 문제의 포유류의 IgE 분자의 입실론 사슬의 정상부 CH2CH3 도메인의 전체 아미노산서열 또는 12개이상의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열로 된 단백질에 결합된 이형성(heterlogous) 운반체 단백질 구성되고, 포유류에 이뮤노겐 공액물질을 주사한 후에 고유 IgE에 대해 다클론성 항체를 생산하도록 하고, 이때 생산된 항체는 순환하는 고유 IgE에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 백신.
2. 제1항에 있어서, 이뮤노겐 공액물질은 운반체 단백질 및 IgE 분자의 입실론 사슬의 정상부 CH2CH3 도메인의 전체 아미노산 서열 또는 12개 이상의 아미노산으로 구성된 아미노산 서열간에 융합된 단백질인 것을 특징으로 하는 백신.
3. 제2항에 있어서, 융합 단백질은 원핵 세포 숙주에서 재조합 DNA 기술에 의해 만들어지는 것을 특징으로 하는 백신.
4. 제3항에 있어서, 원핵 세포 숙주는 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 백신.