EA004228B1 - МОДУЛЯТОР ИММУННОГО ОТВЕТА α- МАКРОГЛОБУЛИНОВЫЙ КОМПЛЕКС - Google Patents

МОДУЛЯТОР ИММУННОГО ОТВЕТА α- МАКРОГЛОБУЛИНОВЫЙ КОМПЛЕКС Download PDF

Info

Publication number
EA004228B1
EA004228B1 EA200000974A EA200000974A EA004228B1 EA 004228 B1 EA004228 B1 EA 004228B1 EA 200000974 A EA200000974 A EA 200000974A EA 200000974 A EA200000974 A EA 200000974A EA 004228 B1 EA004228 B1 EA 004228B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
macroglobulin
group
biomolecule
stable complex
peptides
Prior art date
Application number
EA200000974A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200000974A1 (ru
Inventor
Сальваторе В. Пиццо
Ханне Грон
Original Assignee
Дюк Университи
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/282,826 external-priority patent/US6403092B1/en
Application filed by Дюк Университи filed Critical Дюк Университи
Publication of EA200000974A1 publication Critical patent/EA200000974A1/ru
Publication of EA004228B1 publication Critical patent/EA004228B1/ru

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81Protease inhibitors
    • C07K14/8107Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02Immunomodulators
    • A61P37/06Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Активация α-макроглобулина (αМ) нуклеофильным веществом с последующей инкубацией активированного αМ при повышенной температуре с биомолекулой приводит к ковалентному включению интактной биомолекулы в молекулу αМ, без использования протеиназ. Сформированный таким образом, структурно определенный и стабильный комплекс может быть использован как антиген для стимуляции иммунного ответа, например, в форме вакцины. Обеспечивается улучшенное представление антигена конкретных биомолекул, особенно тех, которые обладают слабой иммуногенностью, а также снижение иммунодоминантности конкретных эпитопов.

Description

Исследования, легшие в основу настоящего изобретения, были частично оплачены грантами Национального Института Здоровья № НЬ-24066 и СА-29589 и грантом Датского Исследовательского Совета № 11-0529-1. Правительство может иметь определенные права на настоящее изобретение.
Область применения
Настоящее изобретение в целом относится к иммунологии, а именно к антиген-а2-макроглобулиновым комплексам, к простому и воспроизводимому получению антиген-а2-макроглобулиновых комплексов, к последующему их применению, включая повышение иммунокомпетентности хозяина, и к получению и назначению вакцин для предотвращения и лечения болезненных состояний.
Уровень техники
Представление антигена и иммуногенность
Обычно антигены «представляются» иммунной системе с помощью антиген-представляющих клеток (АПК), к которым относятся, например, макрофаги, дендритные клетки и Вклетки, совокупно с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГ), которые экспонируются на поверхности АПК. Считается, что обычно природные антигены и молекулы, если они иммуногенны, захватываются и частично перевариваются АПК, таким образом, что небольшие фрагменты первоначального антигена экспрессируются на клеточной поверхности в окружении молекул главного комплекса гистосовместимости.
Также в настоящее время считают, что Тлимфоциты, в противоположность В-лимфоцитам, в значительной мере менее способны взаимодействовать с растворимыми антигенами. Обычно Т-лимфоциты нуждаются в том, чтобы антиген был соответствующим образом обработан и экспрессирован на поверхности АПК в окружении молекул ГКГ, как это отмечалось выше. Таким образом, Т-клетки, а именно, так называемые, Т-клеточные рецепторы, способны узнавать антиген в форме бимолекулярного лиганда, включающего обработанный антиген и одну или более молекул ГКГ. Помимо представления антигенов на молекулах ГКГ, АПК должны быть активированы для экспрессии костимуляторных молекул, таких как В7/В1, прежде чем сможет проявиться эффективная стимуляция Т-клеток.
Многие белковые эпитопы, включая эпитопы многих экзогенных и эндогенных белков, обычно не распознаются или слабо распознаются иммунной системой. Эти эпитопы вызывают слабый синтез антител или не вызывают его вовсе, то же относится и к другим типам иммунного ответа. Поэтому часто бывает сложным, а в некоторых случаях невозможным получить антитела к таким эпитопам. Напротив, некоторые эпитопы вызывают необычно сильный иммунный ответ, в некоторых случаях исключая (или частично исключая) другие эпитопы в пределах той же молекулы антигена. Такие эпитопы называют иммунодоминантными.
Отдельной проблемой является изготовление и способ назначения вакцин, в особенности вакцин, представленных пептидными антигенами. Традиционные способы изготовления таких вакцин, где антигены представлены на макромолекуле, путем конъюгации с белкомносителем или полимеризации, часто не дают результатов, так как такие антигены не всегда способны индуцировать ответ цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) ίη νίνο. В таких случаях обычно добавляют адъювант. Использование адъюванта при иммунизации усиливает гуморальный ответ, но дает смешанные результаты в отношении стимуляции специфического ответа ЦТЛ. К сожалению, популярные адъюванты, используемые на лабораторных животных, такие как полный адьювант Фрейнда, слишком токсичны и неприменимы на людях. В идеале, защита от вирусной инфекции наилучшим образом обеспечивается как гуморальным, так и клеточным иммунитетами, включая долговременную память и цитотоксичные Т-клетки.
Например, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), этиологический агент, наиболее тесно связанный с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД), стал одной из наиболее приоритетных целей при разработке вакцин. Преобладающая стратегия получения вакцины базируется на использовании оболочечных белковых анигенов др120 и др160 ВИЧ-1, полученных рекомбинантным путем. Однако обещания по их применению в вакцинах до сих пор не реализованы, хотя их и назначали вместе с эффективным адъювантами.
Усиленное представление антигена
Экспонирование антигена (сокращенно Аг) на АПК изучено подробно как ίη νίίτο, так и ίη νίνο [см. (1,2)]. Используемая методика включает инкапсуляцию Аг в липосоме (3,4), сшивку Аг с антителами к поверхностным белкам (5-9) и формирование иммунных комплексов для распознавания их РсВ (10). Еще один подход, заключающийся в обработке поверхности Вклеток моноклональными антителами (МАТ), узнающими конкретный Аг, также увеличивает возможности в представлении этого антигена (11).
Емкость различных АПК по Аг явно кореллирует с эффективностью представления (12), хотя концентрирование Аг или внутриклеточная сигнализация также могут давать вклад в этот процесс. В общем, размещение Аг на поверхности АПК явно усиливает иммунный ответ.
Тогда как В-клетки обладают специфическими рецепторами, поверхностными иммуноглобулинами (ИГ), для захвата Аг, которые они эффективно представляют, макрофаги и другие не В-клеточные АПК вынуждены использовать другие механизмы. Таковые могут включать фагоцитоз частиц или клеток с Аг и усиленный эндоцитоз опсонизированных Аг или иммунных комплексов. До сих пор механизмы эффективного поглощения и представления растворимых Аг такими не В-клеточными АПК у животных не вполне понятны. Возможно, процесс опосредован какими-либо рецепторами.
Среди АПК макрофаги вызывают особый интерес в силу той центральной роли, которую они играют в регуляции активности других клеток иммунной системы. Макрофаги действуют как эффекторные клетки при уничтожении микробных, а также и опухолевых клеток, и выделяют множество цитокинов, которые участвуют во многих аспектах иммунного ответа. Способность макрофагов регулировать широкий диапазон иммунологических событий в какой-то мере является функцией экспрессии ими поверхностных 1а антигенов. Экспрессия мембранных 1а антигенов является важным условием для индукции специфического Т-клеточного ответа на антиген (15). Эффективное усвоение и процессинг различных белков является главным вопросом в представлении антигенов макрофагами. Иммунная система вынуждена балансировать между способностью к взаимодействию с огромным количеством непохожих молекул с одной стороны и необходимостью эффективного ответа на очень малое количество антигена. Хотя макрофаги способны опробовать свое окружение через пиноцитоз, предполагается наличие более эффективного средства усвоения, такого как система, опосредованная рецептором (16). Размещение Аг на поверхностных рецепторах макрофагов или В-клеток либо путем искусственной сшивки, либо используя мембранные ИГ, усиливает эффективность представления (1, 16, 17); однако, природные системы представления антигена в макрофагах пока не идентифицированы.
Семейство α-макроглобулиновых белков α-Макроглобулины и компоненты комплемента С3, С4 и С5 составляют суперсемейство структурно родственных белков. Семейство α-макроглобулинов включает протеиназасвязывающие глобулины как с α1, так и с α2 подвижностью. Наиболее интенсивно изучали а2-макроглобулин (α2Μ) человека - крупный тетрамерный белок, способный ковалентно связывать другие белки (19-27) и таким образом размещать их на клеточной поверхности, «одетой» а2М рецепторами (27-30). Хотя размер и заряд могут влиять на связывание, а2М способен включать белки с нуклеофильными боковыми цепями аминокислот, относительно неселективным образом. Такая быстрая реакция ковалентного связывания ограничена, однако, отрезком времени, в ходе которого происходят конформационные изменения, в результате ко торых внутренний тиоэфир становится восприимчивым к нуклеофильной замене (20, 21, 31). Так, α2Μ, С3 и С4 являются эволюционнородственными тиоэфир-содержащими белками, которые подвергаются конформационным и функциональным изменениям в условиях ограниченного протеолиза (32, 33), приводя к возможности образования тиоэфир-опосредованных ковалентных связей с такими целевыми веществами как протеиназы, углеводы клеточной поверхности или иммунные комплексы, соответственно.
а2-Макроглобулин человека (а2М) является достаточно распространенным белком в плазме (2-5 мг/мл). Он состоит из четырех идентичных субъединиц, расположенных так, что они образуют двустороннюю молекулярную ловушку (34). Эта ловушка срабатывает, когда протеолитическое расщепление внутри высокочувствительного участка последовательности аминокислот - участка-наживки - инициирует электрофоретически детектируемое конформационное изменение, которое и приводит к захвату протеиназы (35). Получающийся при этом узнаваемый рецептором а2М эффективно усваивается макрофагами, дендритными клетками и другими клетками, которые экспрессируют а2М рецепторы [обзор в (36), см. также (37)], один из которых недавно клонировали, и последовательность его была установлена (38, 39). Реакция а2М с метиламином приводит, в сопровождении подобного конформационного изменения, к узнаваемой рецептором форме а2М. Обработанные метиламином или протеиназой а2М эквивалентны в отношении связывания, усвоения и сигнализации. Обработанные амином или обработанные протеиназой а2-макроглобулины обозначают как а2-макроглобулин* или сокращенно а2М*.
Узнаваемые рецептором α-макроглобулины из животных различных видов перекрестно-реагируют с примерно одинаковым сродством к а2М-рецептору независимо от используемой протеиназы [см. (36, 40, 41) для обзора]. Дополнительное связывание непротеолитических белков не влияет на скорость усвоения, даже если применяли искусственную поперечную сшивку (28, 29, 42). Поэтому, независимо от механизма связывания, белки, комплексующиеся с а2М*, могут быть эффективно усвоены.
Возможная роль а2-макроглобулина как средства доставки антигенов, гормонов или ферментов обсуждали ранее (43-47). Существует множество других исследований, подтверждающих роль а2М в иммуномодуляции [обзор в (48)].
Образование комплекса антиген-а2макроглобулин
Как описывалось выше, а также в цитированной литературе, антигены, которые сами не являются протеиназами, неспособны ковалентно связываться с а2-макроглобулинами путем совместной инкубации антигена с а2-макроглобулином. Ковалентное включение потенциального антигена в молекулу а2-макроглобулина требует участия протеолитического фермента для расщепления молекулы а2-макроглобулина, как необходимого предварительного этапа, который позволяет затем ее тиоловому эфиру реагировать с антигеном и таким образом связывать его. Хотя использование протеолитического фермента позволяет получать желаемые антиген-а2-макроглобулиновые комплексы ίη νίΐτο, необходимость его применения существенно вредит структурной и эпитопной целостности антигена, который планируется связать с а2-макроглобулином, поскольку он может быть подвергнут протеолизу с образованием мелких фрагментов в процессе получения комплекса или после связывания с а2-макроглобулином. Более того, протеолитический фермент сам всегда включен в состав комплекса, представляя собой серьезную стерическую помеху, и тем самым, ограничивая размер антигена, включаемого в комплекс, до примерно 40 кДа. Таким образом, легкое и воспроизводимое получение комплекса а2-макроглобулина с антигеном любого размера, например, для использования комплекса в качестве вакцины, не такое простое дело. Структура антигена может быть существенно изменена протеолитическим расщеплением, к тому же протяженность и чистота антигена и других компонентов, внедряющихся в α2макроглобулин, могут качественно и количественно влиять на образующийся комплекс.
Другие средства получения антиген-а2макроглобулиновых комплексов, также не являются простыми. Обработка а2-макроглобулина низкомолекулярным амином (нуклеофилом) чтобы расщепить тиоловый эфир, дает превращение в желаемую рецептор-узнаваемую форму а2-макроглобулина, однако, модифицированный амином тиоловый эфир не способен связывать антиген по глутамильному остатку тиоэфира. Некоторые исследователи оценивали способность обработанного амином (например, метиламином) а2-макроглобулина к связыванию антигена, включая протеазы. Когда а2М, обработанный метиламином, инкубировали с трипсином или эластазой в течение нескольких часов при 23°С (49, 50), образование ковалентной связи не наблюдалось. Таким образом, получение ковалентного антиген-а2М* комплекса в отсутствии протеиназы до сих пор не осуществлено.
Поэтому существует насущная необходимость в разработке простого и воспроизводимого способа получения ковалентного комплекса между а2-макроглобулином и требуемым антигеном без ограничения размера, избегая применения протеолитических ферментов, и при этом дающего вакцинный или другой материал, в котором антиген стабилен и структурно определен для использования в модуляции иммунного ответа. Именно эту задачу решает настоящее изобретение.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится в общем к модуляции иммунного ответа структурно определенным и стабильным антигеном, ковалентно связанным с рецептор-узнаваемой формой а2-макроглобулина (а2М*). Антиген-а2макроглобулиновый комплекс настоящего изобретения состоит из ковалентно связанных антигена и а2-макроглобулина с интактным участком-наживкой, антиген включается в активированную амином форму а2-макроглобулина нуклеофильной заменой в отсутствие протеолитического фермента. Антиген может быть ковалентно связан с глутамильным или цистеинильным остатком расщепленного тиолового эфира а2-макроглобулиновой молекулы, или с обоими. С комплексом могут быть связаны один или более антигенов. В частности, настоящее изобретение направлено на разработку простых и воспроизводимых способов получения ковалентного комплекса между антигеном и рецептор-узнаваемой формой а2-макроглобулина, в которых условия получения комплекса не угрожают целостности антигена. Комплекс, полученный описанным здесь способом, обеспечивает стабильный и определенный материал для использования его в качестве вакцины или другого реагента для регуляции иммунокомпетентности у животных или в системе ίη νίΐτο. Размер связываемого антигена не ограничивается. Более того, описываемый здесь комплекс может быть использован для повышения иммунного ответа других антигенов, обладающих низкой иммуногенностью, и в определенных условиях, для подавления иммунного ответа на конкретный антиген.
В противоположность предыдущему опыту по антиген-а2-макроглобулиновым* комплексам и методикам получения таких комплексов, где связывание достигается сопутствующим применением протеолитического фермента для расщепления а2-макроглобулина и приведения тиолового эфира в состояние, годное для реакции с антигеном, в практике настоящего изобретения антиген связывается с предварительно нуклеофил-активированнным а2-макроглобулином в отсутствие протеолитического фермента при повышенной температуре и соответствующей продолжительности инкубации для достижения желаемого связывания. Таким образом, а2-макроглобулин в комплексе настоящего изобретения имеет интактный участок-наживку. а2-Макроглобулин сначала может быть активирован низкомолекулярным амином, таким как аммиак, метиламин, этиламин, пропиламин и им подобные. Аммиак и метиламин являются предпочтительными. АнтиΊ ген может быть инкубирован с аминактивированным а2-макроглобулином при температуре от примерно 35 до 55°С и при соответствующей продолжительности реакции для достижения желаемого связывания. Выбор соответствующей температуры может быть сделан в зависимости от стабильности конкретного антигена. Например, при 50°С связывание может быть достигнуто за 1-5 ч, при 37°С связывание может быть достигнуто за 24 ч. Предпочтительные условия для антигена, стабильного при 50°С - 1-5 ч. Предпочтительные условия для антигена, стабильного при 37°С - 24 ч.
а2-Макроглобулин, используемый в настоящем изобретении, является нативным белком или полученным рекомбинантной техникой, с использованием хорошо известных способов молекулярной биологии. Подходящие антигены для связывания с а2-макроглобулином для получения комплекса настоящего изобретения включают нуклеофилы, включая пептиды, белки, углеводы, цитокины, факторы роста, гормоны, ферменты, токсины, нуклеиновые кислоты, такие как антисмысловые РНК, а также другие препараты или олигонуклеотиды.
С другой стороны, антиген может быть мягко окислен, например, Ν-хлорбензолсульфонамидом для увеличения количества антигена, связывающегося с а2-макроглобулином способом настоящего изобретения.
Комплекс, сформированный способом настоящего изобретения, может быть введен в культуру клеток или в животного-хозяина, или в целевую ткань или орган, где известно, что а2М* увеличивает представительность желаемого антигена и где будет формироваться соответствующий иммунный ответ.
Одно из преимуществ настоящего изобретения и его отличительная характеристика состоит в том, что комплекс, полученный путем ковалентного связывания а2М с данным антигеном способом, описанным здесь, может быть назначен в качестве вакцины без необходимости применения адъюванта. Принимая во внимание трудности, возникающие при включении адъюванта в состав вакцины, получение вакцин в соответствии с настоящим изобретением дает значительные преимущества и обещает быть гораздо более эффективным средством представления антигена, позволяющим избежать множества недостатков, таких как токсичность и тому подобное, которые проявляются в современных адъювантсодержащих рецептурах.
Кроме того, комплексы настоящего изобретения особенно практичны в силу их сродства к макрофагам и другим клеткам, которые связывают или усваивают а2М. Разнообразие антигенов, иммуногенных или иммуномодулирующих молекул, которые могут быть ассоциированы в комплекс настоящего изобретения, весьма велико и простирается от олигонуклео тидов, белков, пептидов, цитокинов, токсинов, ферментов, факторов роста, антисмысловой РНК и лекарственных препаратов, до других углеводов, которые могут проявлять некоторые желательные модулирующие эффекты на целевых клетках. Необходимо только иметь в составе нуклеофильную группу, такую как амин, сульфгидрил или гидроксил для замены амина а2-макроглобулина*. Поэтому, настоящее изобретение задумывалось как охватывающее эти вариации в пределах их принятого смыслового значения.
Еще одно преимущество настоящего изобретения состоит в том, что оно предусматривает независимое ориентирование рецепторсвязывающих а2М, а также комплексов настоящего изобретения, включающих эти компоненты, на эндоцитоз или клетки сигнализации и активации. Правильная активация АПК необходима для эффективного представления антигена и эффективной стимуляции общего иммунного ответа.
Предполагается, что может быть достигнута как положительная, так и отрицательная регуляция антигенности эпитопов. Например, если эпитоп более узнаваемый, антитела более эффективны в узнавании и связывании антигена. Усиление антигенности и способности к увеличению эффективности слабых антител у слабых или неэффективных эпитопов предполагает широкий диапазон применения не только, например, для получения вакцин для животных и людей, но также при получении антител, которые могут быть использованы в качестве реагентов для, помимо прочего, связывания, идентификации, характеризации и преципитации эпитопов и антигенов в исследовательских целях. Предпочтительно, способ настоящего изобретения усиливает иммуногенность данного антигена.
Однако настоящее изобретение предполагает и понижающую регуляцию, или суппрессию, иммунного ответа на иммунодоминантные эпитопы, путем предпочтительной стимуляции иммунного ответа на обычные эпитопы или путем введения агентов или факторов, избирательно подавляющих иммуногенность целевого эпитопа. Эта дополнительная возможность модуляции иммунного ответа может быть полезной, например, при иммунизации животных, включая людей, и также при получении антител, активных в отношении молчащих или слабых антигенных эпитопов. Такие антитела полезны также, помимо прочего, для связывания, идентификации, характеризации и преципитации эпитопов и антигенов ίη νίνο и ίη νίίτο.
Настоящее изобретение, описываемое здесь, предпочтительно также включает антитела, получаемые описанным здесь способом или в ответ на иммуногены, полученные как описано здесь, причем упомянутые антитела включают моноклональные, поликлональные и химер9 ные антитела, а также бессмертные линии клеток, которые продуцируют такие антитела, например, гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, которые узнают молекулы и другие интересующие антигены. Такие антитела могут быть получены преимущественно против эпитопов на антигенах, которые обычно суппрессированы или являются вторичными.
Настоящее изобретение охватывает также компоненты клеточной иммунной системы, например Т-лимфоциты с улучшенным ответом на такие антигены или иммуногены, фармацевтические композиции, содержащие антигены, антитела или компоненты клеточной иммунной системы, а также способы их применения.
Настоящее изобретение предполагает повышение эффективности иммунизации. Это может быть полезным не только при потенциальных терапевтических вмешательствах, например при вакцинации, но также для получения антител или праймированных лимфоцитов (Т или В) к слабым антигенам в исследовательских целях.
В соответствии с этим, основным объектом настоящего изобретения является структурно определенный и стабильный комплекс антигена с а2-макроглобулином для описанных здесь целей.
Другим объектом настоящего изобретения является стабильный комплекс, включающий одну или более интактных биомолекул и активированный а2-макроглобулин, в котором каждая из биомолекул ковалентно связана с аминокислотным остатком расщепленного тиолового эфира а2-макроглобулина. Биомолекула может быть связана с глутамильным остатком или цистеинильным остатком или с обоими. Биомолекула может быть пептидом, белком, углеводом, цитокином, фактором роста, гормоном, ферментом, токсином, анти-смысловой РНК, терапевтическим лекарственным средством, олигонуклеотидом, жиром, ДНК, антигеном, иммуногеном или аллергеном. Биомолекула может иметь молекулярный вес от примерно 0.5 до примерно 100 кДа.
Еще одним объектом настоящего изобретения является иммуноген, который включает антигенную молекулу, имеющую как минимум один эпитоп, в комплексе с а2-макроглобулином. Иммуноген представляет собой комплекс, полученный путем последовательных операций активирования а2-макроглобулина инкубацией с нуклеофильным веществом для образования нуклеофил-активированного α2макроглобулина, удаления избытка нуклеофильного вещества и инкубации нуклеофилактивированного а2-макроглобулина с биомолекулой.
Еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения ковалентного комплекса между одной или более интактными биомолекулами и а2-макроглобулином путем проведения следующих операций: 1) активация упомянутого а2-макроглобулина путем инкубации с нуклеофильным веществом для образования нуклеофил-активированного а2-макроглобулина; 2) удаление избытка нуклеофильного вещества и 3) инкубация нуклеофилактивированного а2-макроглобулина с упомянутой биомолекулой.
Еще одним объектом настоящего изобретения является иммуноген, который включает антигенную молекулу в комплексе с а2-макроглобулином, где антигенная молекула имеет как минимум один эпитоп, и где а2-макроглобулин способен связываться с а2-макроглобулиновым рецептором. В другом случае применения, способ представления слабо иммуногенного эпитопа на антигене, узнаваемом иммунной системой, путем получения комплекса с помощью реакции между молекулой упомянутого антигена и α2макроглобулином, экспонирования антигенпредставляющей клетки, несущей главный комплекс гистосовместимости, с комплексом и приведение в контакт упомянутой аннтигенпредставляющей клетки с лимфоцитами.
Еще одним объектом настоящего изобретения является вакцина, которая включает антиген-а2-макроглобулиновый комплекс, полученный способом настоящего изобретения. В еще одном случае применения, описан способ получения Т-лимфоцитов, узнающих антиген, включающий введение млекопитающему Т-лимфоцитов, праймированных эффективным количеством комплекса, включающего антиген и α2макроглобулин, и полученного в соответствии с настоящим изобретением, который способен связывать а2-макроглобулиновый рецептор, и сбор упомянутых Т-лимфоцитов из млекопитающего. В еще одном случае применения описан способ лечения или предотвращения инфекционного заболевания, аутоиммунного заболевания или рака у млекопитающих пациентов, нуждающихся в таком лечении или предотвращении, включающий назначение пациенту эффективного количества иммуногена, включающего комплекс, состоящий из антигена и α2макроглобулина в соответствии с настоящим изобретением, где а2-макроглобулин способен связывать а2-макроглобулиновый рецептор, в количестве, эффективном для модификации иммунного ответа на упомянутый антиген.
Следующим объектом настоящего изобретения является способ получения структурно определенного и стабильного комплекса конкретного антигена с а2-макроглобулином, который может быть проведен легко и воспроизводимо для различных целей, упомянутых здесь.
Еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения соответствующих комплексов, упомянутых выше, кото11 рый способствует улучшению иммунного узнавания и активации.
Еще одним объектом настоящего изобретения является способ и соответствующие комплексы, упомянутые выше, которые могут быть использованы для избирательной активации эпитопов в отличие от других, иммунодоминантных, эпитопов.
Еще одним объектом настоящего изобретения является способ простого получения клинически значительного количества антител к слабым антигенам.
Другие объекты и преимущества станут очевидны специалистам после ознакомления со следующим ниже подробным описанием, дополненным ссылками на соответствующие фигуры чертежей.
Краткое описание фигур чертежей
Фиг. 1 демонстрирует результаты электрофоретического анализа комплекса между меченным по Болтону-Хантеру 1251-лизоцимом куриного яйца и а2М*, сформированным при 50°С. Комплекс получали при 50°С, инкубируя лизоцим, меченный по Болтону-Хантеру с ΝΉ3обработанным а2М*, как описано в примере 1. В указанные моменты времени отбирали и замораживали аликвоты с тем, чтобы затем проанализировать их на электрофоретическую подвижность в неденатурирующем 4-15% ПААГ (полиакриламидном геле) (А) и отсканировать ΡΗΘ8ΡΗΘΚ1ΜΆ6ΕΚ. (В). Через 5 ч инкубации аликвоту подвергали гель-фильтрации и фракции, содержащие α2Μ (дорожки 9 и 10), объединяли. Концентрации образца были недостаточными для осаждения после продолжительной экспозиции при 50°С. Дорожки обозначаются следующим образом: 1, быстро мигрирующий а2М*; 2, медленно мигрирующий α2Μ; 3-5, а2М*, инкубированный с меченным по Болтону-Хантеру 1251-лизоцимом при 50°С 0, 5 и 24 ч, соответственно; 6-8, а2М* сам по себе, инкубированный при 50°С 0,5 и 24 ч, соответственно; 9, выделенный комплекс а2М*-лизоцим; 10, выделенный комплекс а2М*лизоцим, обработанный панкреатической эластазой свиньи.
Фиг. 2 демонстрирует результат электрофоретического анализа комплекса, полученного при 50°С, путем инкубации меченного по Болтону-Хантеру лизоцима и NН3-обработанного а2М*. В указанные моменты времени отбирали и замораживали аликвоты с тем, чтобы затем проанализировать их на электрофоретическую подвижность в 4-20% 8Ό8 ПААГ (денатурирующем полиакриламидном геле) (А) и отсканировать ΡΗΘ8ΡΗΘΒΙΜΆ6ΕΒ (В). Через 5 ч инкубации аликвоту подвергали гель-фильтрации и фракции, содержащие а2М, объединяли. Концентрации образца были недостаточными для осаждения после продолжительной экспозиции при 50°С. Дорожки обозначаются сле дующим образом: 1, меченный по БолтонуХантеру лизоцим; 2, восстановленный выделенный комплекс а2М*-лизоцим; 3, невосстановленный выделенный комплекс а2М*-лизоцим; 4-6, а2М*, инкубированный с меченным по Болтону-Хантеру лизоцимом при 50°С 0, 5 и 24 ч, соответственно; 7-9, а2М*, инкубированные при 50°С 0, 5 и 24 ч, соответственно.
Фиг. 3 демонстрирует результаты электрофоретического анализа комплекса. Полученного при 37°С путем инкубации меченного по Болтону-Хантеру лизоцима и NН3-обработанного а2М*. В указанные моменты времени отбирали и замораживали аликвоты с тем, чтобы затем проанализировать их на электрофоретическую подвижность в неденатурирующем 4-15% ПААГ (полиакриламидном геле) (А) и отсканировать ΡΗΘ8ΡΗΘΚ1ΜΆ6ΕΚ. (В). Дорожки обозначаются следующим образом: 1-3. а2М*, инкубированный с меченным по Болтону-Хантеру 125Ι-лизоцимом при 37°С 0, 5 и 24 ч, соответственно; 4-6. а2М* сам по себе, инкубированный при 37°С 0, 5 и 24 ч, соответственно.
Фиг. 4 демонстрирует результаты электрофоретического анализа комплекса, полученного при 37°С путем инкубации меченного по Болтон-Хантеру лизоцима и NΗ3-обработанного а2М*. В указанные моменты времени отбирали и замораживали аликвоты с тем, чтобы затем проанализировать их на электрофоретическую подвижность в 4-20% 8Ό8 ПААГ (денатурирующем полиакриламидном геле) (А) и отсканировать ΡΗΘ8ΡΗΘΒΙΜΆ6ΕΒ (В). Концентрации образца были недостаточными для осаждения после продолжительной экспозиции при 37°С. Дорожки обозначаются следующим образом: 1, маркер молекулярного веса; 2, нативный α2Μ; 3-5, восстановленный а2М*, инкубированный с меченным по Болтон-Хантеру лизоцимом 0, 5 и 24 ч, соответственно; 6-8, невосстановленный а2М*, инкубированный с меченным по Болтон-Хантеру лизоцимом 0, 5 и 24 ч, соответственно; 9, восстановленный немеченный лизоцим, 16 мкг; 10, восстановленный лизоцим, меченный по Болтону-Хантеру, 4 мкг; 11, восстановленный лизоцим, меченный по БолтонуХантеру, 0.8 мкг; 12, невосстановленный лизоцим, меченный по Болтону-Хантеру, 0.8 мкг.
Фиг. 5 демонстрирует результаты электрофоретического анализа меченного радиоактивным иодом 1251-лизоцима куриного яйца в комплексе с α2Μ* в неденатурирующем ПААГ. а2М* получали как описано в примере 1 и инкубировали с буфером (дорожки 3-5), меченным радиоактивным иодом лизоцимом (дорожки 6-8) при 50°С. В указанные моменты времени отбирали и замораживали аликвоты с тем, чтобы потом подвергнуть их анализу на электрофоретическую подвижность в неденатурирующем 415% ПААГ. Концентрации образца были недостаточными для осаждения после продолжитель13 ной экспозиции при 50°С. Дорожки обозначаются следующим образом: 1, быстро мигрирующий а2М*; 2, медленно мигрирующий а2М*; 3-5, а2М*; инкубированный при 50°С 0, 5 и 24 ч, соответственно; 6-8, а2М*, инкубированный с меченным радиоактивным иодом лизоцимом при 50°С 0, 5 и 24 ч, соответственно.
Фиг. 6 демонстрирует результаты электрофоретического анализа комплекса меченного радиоактивным иодом 1251-лизоцима и а2М*, образованного при 50°С, в неденатурирующем ПААГ. а2М* инкубировали с буфером (дорожки 2-3) или 40-кратным молярным избытком меченного радиоактивным иодом инсулина (дорожки 4-5) при 50°С. Через 5 ч аликвоту инсулинсодержащей смеси подвергали гель-фильтрации, и фракции, содержащие а2М*, объединяли (дорожка 6). В указанные моменты времени отбирали и помещали на лед аликвоты с тем, чтобы потом подвергнуть их анализу на электрофоретическую подвижность в неденатурирующем 4-15% ПААГ. Дорожки обозначаются следующим образом: 1, медленно мигрирующий а2М*; 2-3, а2М*, инкубированный при 50°С 0 и 5 ч, соответственно, с буфером; 4 и 5, с радиоактивно-меченным инсулином при 50°С 0 и 5 ч, соответственно; 6, выделенный а2М*инсулиновый комплекс.
Фиг. 7 демонстрирует результаты электрофоретического анализа в денатурирующем геле меченного радиоактивным иодом 1251-инсулина в комплексе с а2М*. а2М* инкубировали с 40кратным молярным избытком радиоактивномеченного инсулина при 50°С. Через 5 ч отбирали аликвоту, подвергали ее гель-фильтрации и охарактеризовывали в 8Э8-ПААГ (А), затем сканировали РНО8РНОК1МАСЕВ (В). Дорожки обозначали следующим образом: 1, маркеры молекулярного веса; 2-3, восстановленный α2макроглобулин*-инсулиновый комплекс; 4-6, невосстановленный а2-макроглобулин*-инсулиновый комплекс; 7-9, невосстановленный меченный радиоактивным иодом инсулин; 10, восстановленный меченный радиоактивным иодом инсулин.
Фиг. 8 демонстрирует включение 3Нтимидина в периферические мононуклеарные клетки крови из индивидуальных 8\ν через пять дней после экспонирования клеток с различными дозами комплекса стрептокиназы и α2макроглобулина (белые квадраты), полученного в соответствии со способом настоящего изобретения, в сравнении с одной только стрептокиназой (черные ромбы).
Фиг. 9 демонстрирует тот же эксперимент, что и фиг. 8, с клетками из индивидуальных НС.
Фиг. 10 демонстрирует тот же эксперимент, что и фиг. 8, с клетками из индивидуальных Κν.
Фиг. 11 демонстрирует тот же эксперимент, что и фиг. 8, с клетками из индивидуальных 8\ν. спустя шесть дней после экспозиции.
Фиг. 12 демонстрирует тот же эксперимент, что и фиг. 8, с клетками из индивидуальных НС, спустя шесть дней после экспозиции.
Фиг. 13 демонстрирует тот же эксперимент, что и фиг. 8, с клетками из индивидуальных Κν, спустя шесть дней после экспозиции.
Подробное описание изобретения
Следующие термины и сокращения, используемые в настоящем тексте, имеют следующие значения, если это не оговорено особо.
Термин биомолекула относится к любой молекуле биологического происхождения или использования, такой как пептиды, белки, углеводы, цитокины, факторы роста, гормоны, ферменты, токсины, антисмысловые РНК, лекарственные препараты, олигонуклеотиды жиры, ДНК, антигены, иммуногены и аллергены.
Термин иммуноген относится к любой субстанции, такой как молекула, клетка, вирус или фрагмент такой молекулы, клетки или вируса, который может быть введен в организм с целью вызвать иммунный ответ. Термин иммуноген, таким образом, просто относится к таким субстанциям, которые вводят или могут ввести или используют иначе для того, чтобы повысить содержание антител или компонентов клеточной иммунной системы, как при праймировании. При использовании вместе с термином иммуноген, термин молекула относится к молекуле или фрагменту молекулы антигена, если это не оговорено особо.
Подобным образом, когда термин используется применительно к клетке, вирусу или их фрагментам, иммуногеном может быть клетка, вирус или их компоненты, которые могут быть размещены в составе комплекса в соответствии с настоящим изобретением для усиления иммунного ответа к ним. Термин иммуноген поэтому включает антигенные вещества, такие как чужеродные белки, а также вещества, которые не несут существенной антигенности, если не обработаны так, как описано здесь, клетки, вирусы, и клеточные и вирусные компоненты.
Термин антиген, который может быть сокращен до Аг, относится к веществам, то есть молекулам, которые индуцируют иммунный ответ. Он, таким образом, относится к любой молекуле, контактирующей с иммунной системой, и может включать без ограничений белки, нуклеиновые кислоты и подобные вещества, и может даже распространяться на углеводы, способные быть представленными в соответствии с настоящим описанием. Обычно каждый типичный антиген включает один или более эпитопов. Термины антиген и иммуноген иногда используют как взаимозаменяемые.
Определенные антигены, описанные здесь, или эпитопы, расположенные на них, в некоторых случаях могут рассматриваться как слабые антигены и могут не вызывать существенного иммунного ответа или другой иммунологической реакции при инъекции или другом способе экспонирования у нормального, вполне иммунокомпетентного хозяина. Они могут также включать слабые антигены, которые трудно получить или очистить, или антигены, которые требуют адъювантов или назначения в больших количествах для получения эффективного иммунного ответа. В соответствии с вышесказанным, антигенность и иммуногенность используют как взаимозаменяемые термины.
Термин белок относится к синтетическим и природным полипептидам, фрагментам полипептидов и их производным, которые могут провоцировать иммунный ответ либо ίη νίίτο, либо ίη νίνο. Для удобства, но не в качестве ограничения, в последующем описании используется термин белок как применимый также к веществам, которые либо содержат белковые остатки, либо структурно им подобны. Олигонуклеотиды, углеводы, аминсодержащие жиры, а также другие реактивные биомолекулы могут быть упомянуты в качестве неограничивающих примеров. Настоящее толкование термина, таким образом, не ограничивается белками или их фрагментами.
Термины иммунокомпетентный, нормальная иммунная система и подобные термины относятся к иммунному ответу, который может быть получен у нормальных млекопитающих хозяев к интересующему антигену, когда испытуемый антиген вводится без модификаций и подготовки, описанной здесь. Иммуноген просто может быть введен хозяину в немодифицированной форме с целью оценки нормального иммунного ответа. Таким образом, используя известные способы, такой контроль легко организовать, без обращения к уникальному экспериментированию.
Термин антитело относится к иммуноглобулинам, включая целые антитела, а также их фрагменты, такие как Рай-, Р(ай')2- или бЛЬфрагменты, которые узнают или связывают специфические эпитопы. Термин, таким образом, включает, помимо прочего, поликлональные, моноклональные и химерные антитела, причем последние подробно описаны в Патентах США №4816397 и 4816567, включенных в настоящее описание в виде ссылок. Препарат антител, таким образом, содержит такие антитела или их фрагменты, которые реактивны по отношению к антигену, когда по крайней мере часть индивидуальных молекул иммуноглобулина в препарате узнает (то есть, связывает) антиген. Препарат антител поэтому называют нереактивным к антигену, если связывание индивидуальных молекул иммуноглобулина с антигеном не детектируется с помощью обычно используемых способов.
Упомянутые антитела узнают эпитоп, если они связываются с этим эпитопом. Следовательно, узнавание включает реакцию связывания антитела с эпитопом, которая включает обычные механизмы и способы связывания. Связывание используется в традиционном смысле и не требует образования химических связей.
Термин эпитоп используется для идентификации одной или более частей антигена или иммуногена, который узнается или является узнаваемым антителами или другими компонентами иммунной системы. Эпитопная область, как это понимается здесь, относится к эпитопу и окружающей его области, имея в виду трехмерное пространство. Следовательно, принимается во внимание третичная и четвертичная структура антигена.
Процессинг и представление относятся к механизмам, с помощью которых антиген принимается, изменяется и становится доступным для иммунной системы. Представление также включает, в соответствующих случаях, образование комплексов или связывание с ГКГ (см. ниже) и другие молекулярные события, связанные с генерацией эффективного Тклеточного ответа. В определенных случаях процессинг влечет за собой поглощение и частичную протеолитическую деградацию антигена Антиген Чувствительными Клетками (АПК), а также его экспонирование на поверхности АПК в окружении ГКГ.
Термины реакция и комплекс, а также их производные, когда используются в своем общем значении, не следует истолковывать как требующие конкретного механизма реакции или последовательности.
Сокращение ГКГ относится к главному комплексу гистосовместимости, группе веществ, которые в норме присутствуют в большей или меньшей степени на поверхности, помимо прочих, антигенпредставляющих клеток. Функция ГКГ состоит в том, чтобы сигнализировать компонентам клеточной иммунной системы, то есть Т-лимфоцитам, о том, что следует распознать антигенпредставляющую клетку и реагировать с ней и/или антигеном, связанным с упомянутой клеткой и/или с их ГКГ. Термин сигнал используется в общем значении и относится к инициации реакции между Тклетками и АПК, несущими процессированный антиген в окружении ГКГ. По существу, такой сигнал может включать любую реакцию между этими компонентами, что приводит к тому, что антиген начинает узнаваться антителами, препаратом антител или компонентами клеточной иммунной системы.
В рамках настоящего изобретения термин а2-макроглобулин и его сокращение а2М используются как взаимозаменяемые. Более того, использование а2-макроглобулина в соответствии с настоящим изобретением очевидно в более широком смысле применимо к α17 макроглобулинам и к семейству макроглобулинов, и в рамках настоящего изобретения допустимо такое широкое толкование.
Предпочтительно термин а2М относится к а2М человека. Однако этот термин также включает, но не ограничивается ими: а2М мыши (гомотетрамер), α1-ингибитор-3 мыши (мономер), а2М крысы (гомотетрамер), α1Μ крысы (гомотетрамер), α,ι-ингибитор-З крысы (мономер), α1Μ кролика (гомотетрамер), белок зоны беременности человека (гомодимер), а2М коровы (гомотетрамер), а2М собаки (гомотетрамер), овостатин или овомакроглобулин утки (гомотетрамер), овостатин или овомакроглобулин курицы (гомотетрамер), а2М лягушки (гомотетрамер), а также их рецептор-связывающие фрагменты.
Термин рецептор-связывающий относится к способности связываться со специфическим рецептором или АПК. Рецептор может опосредовать эндоцитоз, сигнализацию и активацию клеток или и то и другое. В настоящее время известно два рецептора для α2Μ. Один рецептор опосредует сигнализацию, и, тем самым, активацию клеток и рост. Другой рецептор опосредует эндоцитоз. С-концевой фрагмент а2М индуцирует активацию макрофагов. Когда этот фрагмент лишают реакционного участка, чувствительного к окислению цис-дихлордиаминплатиной (цис-ДДП), он очевидно связывается с сигнальным рецептором, но не с эндоцитозным рецептором. Когда С-концевой фрагмент включает реакционный участок, чувствительный к окислению цис-ДДП, он очевидно связывается с обоими рецепторами.
В соответствии с настоящим изобретением описан структурно-определенный и стабильный комплекс, включающий антиген и а2-макроглобулин, который может быть использован в модуляции иммунного ответа. Настоящее изобретение предлагает простой и воспроизводимый способ получения комплекса между структурно-определенным антигеном и а2-макроглобулином, без ограничения размера антигена.
Как было описано в разделе Уровень техники, выше, предыдущие исследования образования комплекса между антигеном, таким как белок, и а2-макроглобулином, продемонстрировали необходимость протеолитической обработки молекулы нативного а2-макроглобулина для получения как рецептор-узнаваемой формы молекулы, так и для открытия доступа антигену к тиоловому эфиру а2-макроглобулина, включающему глутамильный остаток в позиции 952 (О1и952) и цистеинильный остаток в позиции 949 (Сук949). Расщепление тиолового эфира, сформированного аминогруппой и сульфгидрильной группой соответствующих аминокислотных остатков, дает потенциальный участок для ковалентного присоединения антигена. Когда нуклеофильные аминокислотные остатки в составе антигена, такие как лизин, получают доступ к тиоловому эфиру в результате протеолитического расщепления, они открывают тиоловый эфир и связываются с γ-глутамильным остатком. Тот же или другой антиген может также связаться с цистеиновьм остатком посредством дисульфидной связи. Затем антиген-а2-макроглобулиновый комплекс, через процессинг, осуществляемый иммунной системой, описанный в разделе Уровень техники выше, дает возрастание иммунного ответа на антиген.
Предыдущие исследования на тиоловом эфире и антигене, связанном с а2-макроглобулином, привели исследователей к мысли использовать малые нуклеофильные соединения (чаще всего метиламин) для изучения активации а2-макроглобулина. В отсутствие протеиназ эти нуклеофилы расщепляли тиоловый эфир и активировали а2-макроглобулин, который имел интактный участок-наживку, в рецептор-узнаваемую форму. Однако после добавления нуклеофила к тиоловому эфиру, дальнейшее добавление или замена на другой нуклеофил, такой как лизильный остаток антигена, не рассматривалось.
Авторы настоящего изобретения при изучении тиолового эфира и реактивности α2макроглобулина по отношению к антигену, сделали неожиданное и важное открытие, что нуклеофил-активированнный а2-макроглобулин может в действительности вступать в реакцию нуклеофильной замены с белком или другим антигеном в определенных условиях. Условия, позволяющие реакцию нуклеофильной замены, как выяснилось, представляют собой инкубацию при повышенной температуре в течение соответствующего периода времени. Например, белковый антиген, который стабилен при повышенной температуре, подвергался замене в ходе инкубации при примерно 50°С в течение 15 ч с нуклеофил-активированным а2-макроглобулином, что привело к значительному включению белкового антигена в а2-макроглобулин. При более низких температурах, как, например, 37°С, нуклеофильная замена может быть достигнута за более продолжительный период времени, примерно 24 ч. Способность к ковалентному присоединению антигена к а2-макроглобулину в отсутствие протеиназы позволяет значительно улучшить, по сравнению с предыдущим опытом, в отношении простоты и воспроизводимости, процесс получения структурноопределенных антиген-а2-макроглобулиновых конъюгатов для модуляции иммунного ответа. Одно из основных преимуществ этого открытия состоит в том, что антиген, который не являлся подходящим для связывания с а2-макроглобулином по причине своего размера и/или чувствительности к протеолитической деградации, теперь может быть связан с нуклеофилактивированным а2-макроглобулином в отсут19 ствие протеиназы способом настоящего изобретения. Поскольку условия, в которых происходит конъюгация антигена и а2-макроглобулина определены, может быть достигнуто высокое отношение антигена к а2-макроглобулину. Более того, когда используют протеиназу, происходит включение протеиназы в а2-макроглобулин, что уменьшает емкость а2-макроглобулина в отношении антигена и формирует комплекс с более чем одним антигеном: желаемый антиген и нежелаемая протеиназа. Более того, при использовании протеиназы, могут формироваться антитела к самой протеиназе. Эти нежелательные дополнения устраняются настоящим изобретением. Имея в виду склонность а2-макроглобулина к участию в процессинге антигенов для усиления или подавления иммунного ответа, способность получать структурно-определенные комплексы дает значительное облегчение при получении вакцин.
а2-Макроглобулин, используемый в настоящем изобретении. Может быть нативным или полученным рекомбинантным путем, используя хорошо известные методики молекулярной биологии. Рекомбинантная форма целого белка может экспрессироваться в гликозилированной форме, например, путем экспрессии в дрожжевых, бакуловирусных экспрессионных системах, или в системах клеток млекопитающих, либо в негликозилированной форме, например, путем экспрессии в бактериальных экспрессионных системах. Альтернативно, α2макроглобулин может быть получен трансгенным путем, например, путем экспрессии в молоко трансгенных животных, таких как корова, коза или овца. В предпочтительном случае экспрессию проводят в бакуловирусной экспрессионной системе, которая обеспечивает высокий выход, при этом избегая проблем загрязнения эндотоксинами, которые сопровождают экспрессию в бактериальных системах, таких как Е.со11. Трансгенная экспрессия в молоко, описанная выше, также не страдает этими проблемами.
Активация а2М до формы а2М* может быть достигнута с помощью соответствующего амина, такого как описываемый формулой Κ.ΝΗ2, где В означает линейную или разветвленную низшую алкильную группу, содержащую от 1 до 6 углеродных атомов, такую как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, трет-бутил и им подобные. Аммиак и метиламин являются предпочтительными.
Как описывалось выше, значительным преимуществом настоящего изобретения является то, что размер антигена для связывания с а2-макроглобулином не ограничен. Прежние способы, которые использовали протеиназы для активации а2-макроглобулина, ограничивали размер связываемого антигена величиной примерно 40 килодальтон, соответствующей разме ру связывающего кармана 5 нм, образующегося в а2-макроглобулине после протеолитического расщепления. Способы настоящего изобретения устраняют необходимость активации а2-макроглобулина протеиназой, и поэтому размер антигена, предназначенного для связывания, не ограничен, и может колебаться в пределах от примерно 0.5 до примерно 100 кДа. Включение антигена или биомолекулы через тиоловый эфир (один или более) молекулы а2-макроглобулина может осуществляться по глутамильному, цистеинильному остатку или по обоим остаткам, формирующимся после расщепления тиолового эфира. Теоретически максимальное количество антигенов, способных связаться с тетрамерным а2-макроглобулином, составляет восемь молекул.
Также было обнаружено, что степень включения антигена в а2-макроглобулин способом настоящего изобретения может быть увеличена. В прежних способах, использующих протеиназную активацию, определенное количество протеиназы могло включаться в а2-макроглобулин, ограничивая количество антигена, который мог бы стать связанным. Кроме того, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что для дальнейшего увеличения количества антигена, который может быть включен в α2макроглобулин, может быть использовано мягкое окисление антигена. Оно может быть достигнуто путем инкубации антигена с окислителем, таким как Ν-хлорбензолсульфонамид или другие реактивы, которые не влияют на структурные или иммуногенные свойства антигена.
В конкретном, но не ограничивающем примере практического применения настоящего изобретения, а2-макроглобулин активируют до его рецептор-узнаваемой формы путем инкубации с 200 мм бикарбоната аммония, рН 8.5, в течение 1 ч. Эта обработка приводит к расщеплению тиолового эфира а2-макроглобулина. Затем, после удаления избытка бикарбоната аммония, а2-макроглобулин с расщепленным тиоловым эфиром инкубировали в 40-кратном молярном избытке антигена, такого как лизоцим, стрептокиназа или инсулин. Инкубация при 37°С обеспечивает оптимальное включение антигена через 24 ч, при 50°С реакция идет быстрее и оптимальное включение наблюдается через 5 ч. Комбинация температуры и времени может быть выбрана, основываясь на температурной чувствительности и стабильности белка и желаемой степени связывания антигена с α2макроглобулином; опытный специалист определит на основе характеристик конкретного антигена оптимальные условия получения желаемого продукта. Примеры, приведенные ниже, демонстрируют конкретные, но не ограничивающие условия.
Предполагалось множество применений антиген-а2-макроглобулиновых комплексов настоящего изобретения. Как будет показано в следующих ниже примерах, полезными преимуществами являются простота и воспроизводимость получения, отсутствие протеолитического расщепления и структурная определенность и стабильность комплекса, полученного способом настоящего изобретения. Эти примеры являются всего лишь иллюстрациями многочисленных применений комплекса настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как ограничивающие. Другие примеры применения антиген-а2-макроглобулиновых комплексов настоящего изобретения можно найти в СТ7И8 93/12479 Университета Дюка, включенной здесь в виде ссылки.
Как было показано ранее, полезность антиген-а2-макроглобулиновых комплексов настоящего изобретения основывалась на улучшенном представлении антигена ίη νίίτο и, что более важно, на значительном усилении иммунной активности, оцениваемой по производству антител в ответ на антигенный стимул ίη νίνο, когда антиген связан с а2-макроглобулином. Такое значительное усиление активности является одной из целей настоящего изобретения, другой целью является способность комплекса настоящего изобретения быть полученным без использования и включения протеиназы. Способность к работе без адъюванта рецептуры, полученной в соответствии с настоящим изобретением, делает систему более эффективной, а также устраняет возможность вредных реакций и задержек в поглощении, которые наблюдаются с адъювантсодержащими рецептурами.
Настоящее изобретение далее охватывает получение антител к антигенам, включая, при необходимости, моноклональные и химерные антитела на основе тех, что были получены к комплексам настоящего изобретения, а также праймированные лимфоциты, специфичные по отношению к конкретным антигенам. Подобным образом, настоящее изобретение может быть использовано как средство стимуляции антигенности и иммунокомпетентности в случаях, когда конкретный антиген ранее не добился иммунологически или терапевтически значимого возбуждения и активности в хозяине.
Применение комплексов настоящего изобретения в первую очередь ориентируется на назначение антигенов, узнаваемых макрофагами, принимая во внимание наличие на макрофагах рецепторов а2-макроглобулина. Однако другие АПК могут также иметь рецепторы а2М и настоящее изобретение вместе с тем предназначено распространить представление антигена на эти другие АПК.
Путем связывания антигена с а2-макроглобулином в соответствии с настоящим изобретением с образованием комплекса настоящего изобретения, и использования этого комплекса в качестве иммуногена, может быть получен модифицированный иммунный ответ. Это означает, что, например, иммуноген может быть использован для генерации антител, которые специфичны либо к слабоузнаваемым, либо к вообще неузнаваемым эпитопам. Кроме того, модифицированный иммунный ответ может включать неантительные компоненты иммунной системы, то есть Т-лимфоциты, которые могут узнавать эпитоп, бывший ранее непредставляемым или неузнаваемым. Таким образом, модифицированный иммунный ответ в значительной степени направлен на ранее плохо или совсем неузнаваемые эпитопы на обработанном антигене или на эпитопы, требующие адъюванта, или требующие использования больших количеств антигена, как и было ранее описано.
Еще один предпочтительный случай применения настоящего изобретения использует комплекс как иммуноген, и подразумевает генерирование антител и реагирование комплекса с антителами, которые узнают тот же или другой эпитоп, находящийся на той же молекуле. В этом случае так называемый модифицированный иммунный ответ включает генерирование антител, которые в ином случае не могут быть эффективно получены или обнаружены ίη νίίτο и ίη νίνο. Это может также включать генерирование антител или стимуляцию лимфоцитов, которые бы в противном случае не проявились бы без применения вредных адъювантов, которые не рекомендуется применять на людях. Предпочтительно и преимущественно, такие антитела могут быть получены для иммунизации в отсутствии адъюванта. Например, иммуноген может быть использован для инокуляции млекопитающего для генерирования антител к новоузнаваемому эпитопу. И для получения антисыворотки или вакцинных препаратов и т.п.
Подобным образом, молекулы антител могут быть расщеплены с образованием фрагментов антител, которые могут быть рекомбинированы ίη νίίτο с образованием химерных антител, которые узнают или связывают новоузнаваемые эпитопы на антигене. Таким образом, модифицированный иммунный ответ не ограничен традиционным иммунным ответом или просто увеличением или уменьшением его специфичности и силы.
Как отмечалось выше, может быть достигнута и позитивная и негативная регуляция антигенности эпитопов. Например, как только эпитоп становится узнанным или узнаваемым, сразу могут быть произведены антитела для узнавания и связывания антигена. Повышенная антигенность и способность вызывать синтез антител к слабым, скудным или неэффективным эпитопамам, обнаруживает практический смысл не только с точки зрения получения вакцин для животных, включая людей, но также при получении антител, которые могут быть использованы в качестве реагентов для, помимо прочего, связывания, идентификации, характеризации и преципитации эпитопов и антигенов, для получения антител к бедным, слабым антигенам для исследовательских целей.
Иммунодоминантность конкретных эпитопов на молекуле может быть модифицирована. Некоторые антигены, содержащие более чем один эпитоп, имеют характерный иммунный ответ, основанный на доминировании одного эпитопа над другим (другими). Настоящее изобретение позволяет улучшить узнавание подчиненных (недоминантных) эпитопов (эпитопа) либо путем получения и введения комплекса настоящего изобретения для усиления и активации подчиненного эпитопа (эпитопов), либо путем получения и введения комплекса, несущего на себе агент, который будет узнаваться доминантным эпитопом, который, в свою очередь тем самым будет подавлять собственную антигенность.
В еще одном случае применения настоящего изобретения можно, например, использовать возможности рецепторных белков АПК, которые узнают и связывают полипептидные молекулы в составе антигена или комплекса настоящего изобретения.
Поглощение антигена антиген-представляющими клетками может осуществляться через неспецифические механизмы, и может привести к экспозиции антигена вместе с ГКГ на клеточной поверхности.
Как только антиген поглощен АПК, осуществляется его частичная протеолитическая деградация в прелизосомальной эндосоме, после чего процессированные пептидные фрагменты антигена ассоциируют с молекулами ГКГ. Однако, хотя частичная протеолитическая деградация антигена может быть весьма глубокой с целью образования соответствующих связей ГКГ и Т-клеток с его пептидными фрагментами, избыточная деградация антигена, как выяснилось, является пагубной для окончательного иммунного ответа. Было показано, что ингибирование не очень глубокого протеолиза в процессинге некоторых специфических антигенов, усиливает процессинг и представление антигенов, что означает, что вмешательство неуместного протеолиза в действительности усиливает представление антигенов. Настоящее изобретение подразумевает способ получения антигена2-макроглобулиновых комплексов, включающих структурно-определенный антиген для доставки его к АПК и дальнейшего процессинга. Протеолитическая деградация антигена в ходе получения комплекса не является желательной для получения ожидаемого иммунного ответа.
Антитела, описанные здесь, обычно являются антителами, которые узнают эпитопы антигенов, которые сделаны узнаваемыми, усиленными или суппрессированными как описано выше. Путем инъецирования таких антигенов в млекопитающего, например, в соответствии с методикой гипериммунизации, может быть получен модулированный иммунный антительный или Т-лимфоцитарный клеточный ответ.
Описанные здесь антитела могут быть поликлональными, моноклональными или химерными антителами, и могут быть получены для распознавания желаемого эпитопа и использованы в различных диагностических, терапевтических и исследовательских целях. Например, антитела могут быть использованы для скрининга экспрессионных библиотек для однозначной идентификации гена, который кодирует белки, несущие интересующий эпитоп. Кроме того, антитела, которые узнают представляемый антиген, могут быть использованы или измерены в интактных животных для выяснения биологической роли, которую играет какой-либо белок, для более эффективной оценки состояния иммунного ответа или иммунной памяти.
Поликлональные, моноклональные и химерные антитела к антигенам могут быть получены с помощью хорошо известных способов после иммунизации комплексом в соответствии с настоящим изобретением, таких как методика гипериммунизации или гибридомная технология, используя, например, лимфоциты селезенки мыши, слитые с клетками миеломы. Бессмертные клеточные линии, продуцирующие антитела, могут быть также получены иными способами, нежели слияние, такими как прямая трансформация лимфоцитов онкогенной ДНК или трансфекция вирусом Эпштейн-Барр. Подобным образом, химерные молекулы антител могут быть получены с использованием соответствующей трансфекции и гибридомной технологии. Аналогично могут быть получены бессмертные эпитопно-специфичные линии Тлимфоцитов.
Настоящее изобретение также включает иммуногены, которые получают и используют как здесь описано. Так, предпочтительный иммуноген представляет собой антиген, полученный в составе комплекса настоящего изобретения, который имеет по крайней мере один эпитоп, такой иммуноген имеет модифицированную антигенность в виду присутствия, реакции с или связи с а2-макроглобулиновой молекулой. Такой иммуноген индуцирует образование или пролиферацию Т-клеток или антител, которые узнают белок в его модифицированной форме или в его немодифицированной форме.
В предпочтительном случае применения, антиген, используемый в иммуногенном комплексе настоящего изобретения, является синтетическим пептидом ВИЧ, например, как описано в (52). Такие синтетические пептиды объединяют нейтрализующие В-клетки участки из третьего вариабельного региона (У3) оболочечного пептида ВИЧ др120, и Т-хелперный эпитоп Т-1 др 120. Некоторые из этих синтетических пептидов, обозначаемые Т1-8Р10, вызывали образование высокого титра нейтрализующих антител и Т-клеточный ответ у мышей, коз и макак-резусов, если их вводили в неполном адъюванте Фрейнда (см. НатЛ с! а1., кирга). Например, пептид Τ1-8Ρ10ΜΝ(Α) (Μν 4771), который имеет следующую аминокислотную последовательность:
ΚρίΙΝΜνρΕνΟΚΑΜΥΑΟΤΚΡΝΥΝΚΚΚΚΙΗΙΟΡΟΚΑΡΥΤΤΚ (8Ε(.) ГО N0:1), может быть скомплексован с а2М путем инкубации пептида с нуклеофил-активированным а2-макроглобулином в соответствии со способом настоящего изобретения.
Другие неограничивающие примеры антигенов, которые могут быть использованы в иммуногенных комплексах настоящего изобретения, включают другой ВИЧ-кодируемый гибридный пептид [Τ1-8Ρ10ΙΙΙΒ(Α): последовательность: ΚρΠΝΜνρΕνΟΚΑΜΥΑΌΤΚΡΝΝΝΤΚΚδ ΙΗΙΟΗΟιΡΟιΗΑΕνΤΙ (8ΕΟ ΙΌ Ν0:2), ссылка (52)], кодирующий Т-клеточный эпитоп (Т1) др 120 ВИЧ (вирус иммунодефицита человека) (76); НВ5Αд, белок, представляющий один из основных поверхностных антигенов вируса гепатита В человека; пептид 08 (аминокислоты 124-147 НВ5Αд, последовательность: ΕΤΤΡΑ0ΟΝ8ΜΕ Ρ8000ΤΚΡΤΌ6Ν0, (8 ЕС) ΙΌ Ν0:3) (80) и химерный пептид (последовательность: ΤΡΙΕΤΙΡΟ 8ΕΌ80ΤΚΡΤΌ6Ν0) (81), представляющий Тклеточный эпитоп (аминокислоты 23-24) НВ8Αд, соединенный с Ν^-концом Вклеточного эпитопа (аминокислоты 139-147) НВ5Αд. Эти примеры только иллюстрируют типы и разнообразие антигенов, которые могут быть использованы для получения полезных иммуногенов настоящего изобретения и в любом случае не должны рассматриваться как ограничивающие в отношении выбора антигена.
В другом случае применения, иммунный ответ к конкретному антигену может быть индуцирован у животных путем экспонирования ίη νίίτο антиген-представляющих клеток, выделенных у животного, с комплексом антигена и а2М, описываемом здесь.
После экспозиции, антиген-представляющие клетки могут быть реинтродуцированы обратно в животное и праймированные таким образом антиген-представляющие клетки будут индуцировать иммунный ответ к этому антигену. Например, чтобы индуцировать иммунный ответ к растущей у пациента опухоли, может быть приготовлен комплекс между выделенными антигенами раковых клеток и а2М. Дендритные клетки могут быть выделены из образца цельной крови пациента и экспонированы с комплексом опухолевый антиген-а2М ίη νίίτο. Затем дендритные клетки реинтродуцируют обратно пациенту. Получаемый иммунный ответ, направленный против опухолевого антигена, таким образом, осуществляет атаку на опухоль.
Используя любые из, или все разнообразные компоненты и способы, описанные здесь, можно представить различные способы терапевтического лечения и диагностики. Например, для диагностики или лечения рака или инфекционного заболевания из опухоли, анормальных клеток или инфекционных организмов может быть получен очищенный белок, который может быть использован в качестве антигена и включен в комплекс с а2-макроглобулином, следуя способу настоящего изобретения. Антитела к этому белку могут быть получены, используя способы усиления представления антигенов, описанные здесь, и используемые для идентификации, характеризации, связывания, ингибирования или инактивации, по мере необходимости, ранее неизвестных или неэффективных эпитопов опухолей, анормальных клеток, бактериальных или вирусных белков. Эта информация, в свою очередь, полезна для разработки лекарственных препаратов против таких недугов, таких как агонисты, антагонисты и им подобные.
Подобным образом, антитела, описанные выше, могут быть получены с целью прямой диагностики или непосредственного терапевтического использования, особенно при лечении онкологических, аутоиммунных и инфекционных заболеваний.
Предпочтительной формой использования антиген-а2-макроглобулинового комплекса, описанного здесь, является форма вакцины, которая может быть использована для иммунизации млекопитающих пациентов, нуждающихся в таком лечении. Назначением таким пациентам эффективного количества иммуногена могут быть получены антитела к конкретному антигену, а иммуноген-специфические лимфоциты могут быть праймированы и активированы, становясь эффективными для лечения заболеваний или их предотвращения или распространения. В специфическом случае применения, настоящее изобретение подразумевает вакцину против ВИЧ.
Предпочитаемые неклеточные компоненты, которые узнают антиген и которые используют для характеризации представляемых эпитопов в соответствии с настоящим изобретением, включают антитела к антигену, которые трудно или невозможно генерировать, не применяя способы, описанные здесь. Также, как отмечалось выше, наиболее предпочтительные антитела получают к антигену в комплексе, но при этом узнают немодифицированную молекулу.
Общие методики и протоколы, упомянутые выше, иллюстрируются следующими неограничивающими примерами.
Материалы и методы
Буферы, 5,5'-дитиобис(2-нитробензоат) (ДТНБ), порошковая лазурь, ΝН4НС03, β-аминопропионитрил, иодацетамид, панкреатическая эластаза свиньи, и бычий инсулин получены от
81дта (Сент-Луис, Миссури). 2,4-динитрофе27 ниловый эфир тиоциановой кислоты (ΌΝΡδΟΝ) получены от ТС1 Атепса (Портленд, Орегон). Бычий сывороточный альбумин, среда ΚΡΜΙ, сбалансированный солевой раствор Еаг1е получены от О1Ьсо ВКЬ (Грэнд Айленд, Нью-Йорк). Лизоцим куриных яиц получен от Воейпидег Маппйеип. Пептид ΤΙ-δΡΙΟΜΝ(Α) был любезно предоставлен доктором Бартоном Ф. Хайнесом из Университета Дюка. ΙΟΌΟ-ΒΕΑΌ8 получены от Р1егсе (Рокфорд, Иллинойс). Νονν ЕпДапб Шс1еаг (Бостон, Массачусеттс) поставил реактив 1251-Болтон-Хантера и Ν;·ιΙ2Ί. Реактивы для электрофореза получены от Βίο-Раб БаЬогаЮг1е5 (Ричмонд, Калифорния), а замороженную, обедненную по тромбоцитам просроченную человеческую плазму получали от Американского Красного Креста (Шарлотт, Северная Каролина). Мыши С57ВБ/6 были получены от Сйаг1е8 Кгуег ЬаЬогаШгкк (Роли, Северная Каролина). Используемые спектрофотометры были либо ЗЫтабхи υν 160 (Коламбия, Мериленд), либо Весктап Όυ® 640 (Арлингтон Хайтс, Иллинойс). Меченные белки считали в счетчике ЬКВ-Аа11ас 1272 СЬЮТОАММА (Пискатавей, Нью-Джерси), а гели с меченными белками анализировали в РНО8РНОШМАОЕК™ 410А от Мо1еси1аг Иупаткк (Саннивэйл, Калифорния).
α2Μ человека очищали как ранее описано (53). Концентрацию интактного тиолового эфира определяли титрованием ДНТБ (53, 54), Концентрация белка основывалась на А280нм (1%/1см)=8.93, молекулярная масса 718 кДа (55). Титрование ДТНБ подтвердило, что более чем 95% тиоловых эфиров в препарате а2М были интактны.
Если не оговорено особо, тиолэфир-расщепленное производное, обозначенное как а2М*, получали инкубацией а2М (2-6 мг/мл) с 0.2 М NН4НСОз (рН доводили до 8.5 с помощью ΝΗ4ΟΗ) в течение 60 мин при комнатной температуре. В результате такой обработки более 95% тиоловых эфиров были расщеплены, что определялось титрованием ДНТБ (53, 54), электрофоретической подвижностью и в тестировании с порошковой лазурью (53, 56, 57). Избыток модифицирующего реагента удаляли гельфильтрацией на колонке ΡΌ-10 8ЕРНАЭЕХ 025 (Рйагтааа. Пискатавей, Нью-Джерси). Состав буфера, если не оговорено особо: 50 мМ Трис, 50 мМ №С1, рН 7.5.
Лизоцим растворяли в воде и разбавляли соответствующим буфером. Инсулин растворяли при кислом рН и разбавляли соответствующим буфером. Чистоту инсулина и лизоцима определяли электрофорезом в восстанавливающем и невосстанавливающем δΌδ-ПААГ. Концентрацию инсулина определяли по формуле: Е280нм=5220 М-1см-1 (58), а лизоцима по формуле: А280нм(1%/1см)=26.5 (59). Инсулин или лизоцим включали в а2М путем инкубации обессоленного а2М* с избытком лиганда при 37°С или при 50°С в течение 5-24 ч. В некоторых случаях комплексы отделяли от свободного лиганда гель-фильтрацией на колонке 8ЕРНАСКУЬ δ300-НК ^1дта, Сент-Луис, Миссури). Коэффициент экстинкции, используемый для комплексов, был тем же, что и для свободного а2М, что позволяло получать оценки в пределах экспериментальной ошибки. Белки концентрировали, используя ячейку ΑΜIСΟN или концентратор СΕNΤΚIСΟN® от Аткоп (Денверс, Массачусеттс).
Лизоцим и инсулин метили реактивом 125ΙБолтона-Хантера, в основном, как описано Болтоном и Хантером в (60). В некоторых случаях лизоцим или инсулин метили радиоактивным иодом, используя IΟ^Ο-ΒΕΑ^δ®, в соответствии со спецификацией производителя. Радиоактивность измеряли, используя ЬКВ 1272 γсчетчик.
Электрофорез в δΌδ-ПААГ проводили в градиентном 4-20% геле (10см х 10см х 1.5мм), используя систему глицин/2-амино-2-метил-1,3пропандиол/НС1, описанную Бьюри (61).
Электрофорез в неденатурирующем пороограничивающем ПААГ проводили для разделения белков в соответствии с их радиусом, как описано ранее (53). Когда а2М обрабатывали Ν^, тиоловый эфир расщеплялся и связанные с этим конформационные изменения можно было наблюдать с помощью электрофореза в неденатурирующем пороограничивающем ПААГ (61-63). Электрофоретическая подвижность нативного а2М традиционно рассматривается как медленная, а нуклеофил-инактивированного (а2М* как быстрая. Во всех представленных здесь исследованиях электрофоретическая подвижность а2М и его производных рассматривалась относительно этих двух стандартов. Пороограничивающие гели, описанные здесь, являлись градиентными 4-15% гелями (10см х 10см х 1.5 мм). В некоторых случаях гель сушили и сканировали по радиоизотопным маркерам в ΡΗΟδΡΗΟΚ.IΜΑ6ΕΚ™.
Исследования по связыванию проводили в основном как описано Имбером и Пиццо в (64). Перитонеальные макрофаги получали из мышей С57ВБ/6, стимулированных тиогликолатом, как описано ранее (65); их размещали в микропланшетах на 24 лунки (2х105 клеток/лунка) и инкубировали при 37°С в увлажняющем СО2инкубаторе. После уравновешивания при 4°С, монослои клеток промывали ледяным сбалансированным солевым раствором Еаг1е с 0.2% бычьего сывороточного альбумина. В каждую лунку добавляли увеличивающиеся концентрации (0.23 нМ-60нМ) 1251-меченного а2М* или а2М* с белковыми лигандом, включенным посредством инкубации в течение 5 ч при 50°С, после чего оставляли на инкубацию при осторожном перемешивании при 4°С на 16 ч. Неспецифическое связывание определяли в парал лельных экспериментах, в которых связывание радиоактивно-меченного лиганда имело место в присутствии 10-100-кратного молярного избытка немеченного лиганда. Раствор радиоактивномеченного лиганда удаляли из лунки, которую затем промывали сбалансированным солевым раствором Еаг1е с 0.2% бычьего сывороточного альбумина. Клетки солюбилизировали 1.0 М ΝαΟΗ, 0.1% 8Ό8 и считали на γ-счетчике. Специфическое связывание оценивали путем вычитания неспецифического связывания из величины общего связывания, а К,| определяли для каждого лиганда решением уравнения связывания для одного участка, используя программу нелинейных данных 81СМАРЬОТ® (1аибе1 8с1епййс, Сан Рафаэль, Калифорния).
Пример 1. а2-Макроглобулин* получали как описано выше и инкубировали с сорокакратным молярным избытком лизоцима из куриных яиц, меченного реактивом 1251-БолтонаХантера при 50°С. Образцы анализировали неденатурирующим пороограничивающим электрофорезом в ПААГ (фиг. 1А). Контрольные образцы, в отсутствии лизоцима, вели себя как ожидалось (18), принимая характеристики медленно мигрирующей конформации нативного а2М (фиг. 1А, дорожки 6-8). Однако в присутствии лизоцима наблюдали как медленно, так и быстро мигрирующие формы даже после 24 ч при 50°С (фиг. 1А, дорожка 5). Гели высушивали и сканировали на радиоактивность на РНО8РНОК1МАСЕВ (фиг. 1Б). Радиоактивность определяли только в образцах, инкубированных с 1251-лизоцимом, и радиоактивный материал мигрировал со скоростью, соответствующей быстрой, рецептор-узнаваемой форме а2М* (фиг. 1Б, дорожки 3-5). Для дальнейшего подтверждения положения радиоактивной полосы, аликвоту комплекса, выделенного через 5 ч инкубации (см. ниже), инкубировали с избытком панкреатической эластазы свиньи. Окрашивание Кумасси голубым подтвердило, что весь белок мигрирует с той же скоростью, что и радиоактивная полоса, то есть быстрый а2М (фиг. 1, дорожки 9 и 10). Была предпринята попытка исследования, используя увеличивающиеся концентрации лизоцима, с целью предотвращения принятия а2М* медленно мигрирующей конформации. Однако, из-за плохой растворимости оказалось невозможным довести реакцию до завершения, и во всех экспериментах некоторое количество а2М* принимало медленно мигрирующую нативную конформацию, без ассоциирования с лизоцимом. Электрофорез в δΌδ-ПААГ подтвердил, что не весь лизоцим, ассоциированный с а2М*, был включен ковалентно (фиг. 2). В образцах, которые хранили на льду или при комнатной температуре, большая часть радиоактивности высвобождалась из а2М* при нагревании образца до 100°С в присутствии 1% 8Ό8 (фиг. 2Б, дорожка 4). Кова лентное включение 1251-лизоцима в а2М* наблюдали только после продолжительной инкубации при 50°С (фиг. 2Б, дорожки 5 и 6, радиоактивная полоса в положении субъединицы а2М 180 кДа). Кинетическое исследование определило оптимальные условия для ковалентного включения лиганда как 5 ч при 50°С.
Пример 2. Для дальнейшей характеризации комплекса, а2М* инкубировали с сорокакратным избытком меченного по 1251-БолтонХантеру лизоцима при 50°С (5 ч) как описано выше. Образовавшийся комплекс отделяли от свободного лиганда гель-фильтрацией на колонке 8-300-НК Как и ожидалось, при электрофоретическом анализе в неденатурирующем, пороограничивающем ПААГ, в образце обнаруживались как быстрая, так и медленная формы а2М (фиг. 1А, дорожка 9). Поскольку разделить две формы макроглобулина с помощью гель-фильтрации было невозможно, представленная стехиометрия основана на смеси этих двух форм. Количество включенного лизоцима определяли из общей концентрации белка (А280нм), включенной радиоактивности и удельной радиоактивности меченного по 1251-БолтонХантеру лизоцима (3000-5000 имп./мин/пМоль). Комплекс содержал примерно 2.3 Моль связанного лизоцима на каждый Моль а2М (см. табл. 1 ниже). Более чем 94% радиоактивности комплекса осаждалось 25% трихлоруксусной кислотой, показывая, что вся она ассоциирована с белком. Для определения стабильности комплекса, аликвоту кипятили 30 мин, затем подвергали центрифужной микрофильтрации в микроконцентраторе СЕNТΚ1СΟN 100 (с порогом 100 кДа) для выделения свободного лизоцима или свободной метки. Фильтрат анализировали на радиоактивность и определили, что высвобождалось менее 15% радиоактивности комплекса. Уровень нековалентного связывания количественно определяли денатурацией комплекса в 1% 8Ό8, 30 мин при 100°С, с последующей центрифужной микрофильтрацией. Примерно 60% радиоактивности, остающейся в а2М* -комплексе, означает, что 1.4 Моль лизоцима ковалентно связывается с 1 Моль а2М* при 50°С (5ч). Анализ комплекса в δΌδ-ПААГ подтвердил такую стехиометрию (фиг. 2, дорожки 2 и 3). Перед электрофорезом образцы кипятили десять минут в присутствии 1% 8Ό8, и, в некоторых случаях 50 мМ ДТТ. После высушивания гели сканировали на РНО8РНОК1МА6ЕВ. Радиоактивные полосы оценивали количественно либо с помощью программного обеспечения к РНО8РНОК1МА6ЕК,, либо вырезая полосы из геля и промеряя их в гаммасчетчике; оба способа дали сходные результаты. В невосстанавливающих, денатурирующих условиях, примерно 1.6 Моль 1251-лизоцима оставалось связанным с 1 Моль комплекса (фиг. 2Б, дорожка 3). В присутствии 50 мМ ДТТ при
808-обработке, примерно 0.6 Моль 1251лизоцима оставалось связанным с α2Μ на 1 Моль комплекса (фиг. 2Б, дорожка 2). Вся радиоактивность мигрировала в позициях, соответствующих либо электрофоретической подвижности свободного лизоцима, либо субъединице 180 кДа а2М.
Таблица 1
Взаимодействие Число Моль меченного лиганда на 1 Моль аМ* Лиганд и условия
Лизоцим 37°С (24 ч) Лизоцим 50°С (5 ч)
Ковалентное и нековалентное 6.6 2.3
Сук949 и О1п952 опосредованное (8Э8-устойчивое) 1.3 1.4
О1п опосредованное (8Э8 и ДТТ устойчивое) 1.0 0.6
Пример 3. Исследовали эффективность реакции при пониженной температуре. а2М инкубировали с сорокакратным избытком 1251лизоцима при 23°С и 37°С с различной продолжительностью. Даже через 24 ч инкубации при 23°С, ковалентного включения лизоцима в а2М* не наблюдалось, как было показано электрофорезом в 8И8-ПААГ с последующей центрифужной микрофильтрацией выделенного комплекса, обработанного 8Ό8. Как наблюдалось при 50°С, при 37°С, зависимость электрофоретической подвижности α2Μ* от времени инкубации изменялась в присутствии лизоцима и меньшая часть макроглобулина превращалась в медленно мигрирующую конформационную форму нативного а2М (фиг. 3А, дорожки 3 и 6). Оптимальное время для ковалентного включения, как было определено с помощью электрофореза в 8И8-ПААГ, составляло 24 ч. Комплекс, который выделяли через 24 ч при 37°С, содержал примерно 6.6 Моль связанного лизоцима на каждый Моль а2М (см. табл. 1 выше). Уровень нековалентного связывания количественно определяли денатурацией комплекса в 1% 8Ό8, 30 мин при 100°С, с последующей центрифужной микрофильтрацией. Примерно 1.3 Моль лизоцима оставалось ковалентно связанным на Моль а2М* -комплекса (см. табл. 1 выше). Анализ комплекса электрофорезом в 8Ό8ПААГ подтверждает эту стехиометрию (фиг. 4А и 4Б). В невосстанавливающих условиях примерно 1.3 Моль лизоцима оставалось связанным с каждым Моль а2М. Когда в ходе обработки 8Ό8 применяли 50 мМ ДТТ, на каждый Моль α2Μ оставалось связанным 1.0 Моль 1251лизоцима. Очевидно, что при 37°С большая часть ковалентного связывания устойчива к восстановлению, чем при 50°С.
Пример 4. Непротеолитическое ковалентное включение белка в а2-макроглобулин* не ограничивается лизоцимом. Небольшой белок инсулин ведет себя очень похоже. а2-Макроглобулин инкубировали с сорокакратным избытком меченным по 1251-Болтон-Хантеру инсулином при 37°С или 50°С 5 или 24 ч. При каждом наборе условий образовавшийся комплекс анализировали электрофорезом в неденатурирующем пороограничивающем ПААГ, и обе, быстрая и медленная, миграционные формы а2-макроглобулина были обнаружены, как описано выше. Количество ковалентно включаемого инсулина определяли электрофорезом в 8Ό8ПААГ в кинетических исследованиях. Оптимальные условия для включения составляли (как и для лизоцима) 5 ч при 50°С и 24 ч при 37°С. Комплекс, образованный в 5-часовой инкубации при 50°С содержал 3 Моль инсулина, ковалентно связанного с каждым Моль а2макроглобулина*. В восстанавливающих условиях только 0.3 Моль инсулина оставалось связанным на 1 Моль а2-макроглобулина*. Так же как и с лизоцимом, комплекс был более устойчив к восстановлению, когда был образован при 37°С, чем при 50°С. В отсутствие восстанавливающего агента, 2.5 Моль инсулина ковалентно связывались с 1 Моль комплекса, образованного при 37°С (24 ч). В восстанавливающих условиях примерно 1.6 Моль 1251-инсулина оставалось связанным с каждым Моль а2-макроглобулина*. Эти данные суммированы ниже:
Таблица 2
Взаимодействие Число молей меченного лиганда, связавшегося с 1 Моль «2Μ*. Лиганды и условия
Инсулин 37°С (24 ч) Инсулин 50°С (5 ч)
Сук949 и О1п952 опосредованное (8Э8-устойчивое) 2.5 3.0
О1п952 опосредованное (8Ώ8 и ДТТ устойчивое) 1.6 0.3
Пример 5. Дальнейшая характеризация ковалентной связи между лизоцимом и быстро мигрирующим а2М в комплексе. Нативный, медленно мигрирующий а2М инкубировали с 1251-лизоцимом при 37°С (24 ч) или 50°С (5 ч). Образцы анализировали электрофорезом в 8Ό8ПААГ, как описано выше (гели не показаны). При 37°С ковалентное включение в нативный а2М было менее чем 7% от включения в расщепленный по тиоловому эфиру, быстро мигрирующий а2М*. При 50°С ковалентное включение в нативный а2М составляло примерно 10% от включения в а2М*. Единственное химическое различие между нативным а2М и расщепленным по тиоловому эфиру α2Μ* состоит в свободном Сук949 и модифицированном -ΝΗ2 О1п952 в а2М*. Ограниченное включение лиганда в нативный а2М говорит о том, что большая часть ковалентного включения лизоцима в α2Μ* опосредована компонентами тиолового эфира, либо через нуклеофильную замену по О1п952, либо через тиол-дисульфидную замену по Сук949. Глубже это было изучено путем оценки включения белкового лиганда в присутствии конкурентного нуклеофила или тиолспецифических реагентов. В некоторых экспериментах инкубацию а2М* и 125Ι-лизоцима проводили в присутствии 150 мМ β-амино пропионитрила, реагента, который конкурирует за включение по глутамильному остатку тиолового эфира (20). Некоторые инкубации проводили в присутствии 0.65 мМ ΟΝΡ8Γ’Ν или 0.1 мМ иодацетамида, реагентов, которые модифицируют Сук949 в а2М* (66-71) (при более высоких концентрациях реагентов белок выпадает в осадок в ходе инкубации при высокой температуре). В параллельных экспериментах а2М* инкубировали либо с 125Ι-лизоцимом, либо только с модифицирующими реагентами. Образцы анализировали на включение радиоактивного белка в α2Μ* с помощью электрофореза в 8Э8ПААГ.
% меченного лизоцима, связанного с «2М* в присутствии конкурентного реагента, по отношению к условиям, когда тиолэфир-специфические реагенты отсутствуют
Аминокислотные остатки, специфичные для конкурентного реагента 37°С, 24 ч 50°С, 5 ч
Ο1η952 40% 40%
Сук949 55% 30%
После 5 ч при 50°С образцы с β-аминопропионитрилом включили примерно 40% лизоцима, включенного в отсутствии β-аминопропионитрила. В присутствии ΟΝΡ8ί.'Ν или иодацеетамида, включение приближалось 30%. После 24 ч при 37°С образцы с β-аминопропионитрилом включили примерно 40% лизоцима, включенного в отсутствии β-аминопропионитрила. В присутствии ΟΝΡ8ί.'Ν или иодацетамида включение составляло 50-60%. Таким образом, модификация либо 01η952, либо Сук949 в а2М* значительно уменьшает включение белкового лиганда.
Пример 6. а2М* и а2М*-лизоцимовый комплекс, образуемый в ходе инкубации при 50°С (5 ч), метили радиоактивным иодом с помощью Να125Ι и исследовали связывание с макрофагами. Два образца связывали макрофаги со сходным сродством: Кд2М*)=5+/-2 нМ и КДкомплекс)=8+/-2 нМ. В образце комплекса присутствовали и медленно мигрирующая и рецептор-узнаваемая формы α2Μ*. Мы не разделяли эти две формы макроглобулина, поэтому стехиометрия базируется на смеси этих двух форм, без учета того факта, что только рецептор-узнаваемая форма связывается с макрофагами. Это может объяснить почему Кд комплекса немного выше, чем для самого а2М*. Однако наблюдаемые величины лежат в пределах экспериментальной ошибки для такого рода исследований, и согласуются с нашей величиной Кд для связывания α2Μ* с ЬКР-рецептором (72).
Пример 7. В одной серии экспериментов лизоцим куриных яиц был мечен радиоактивным иодом с помощью ΝαΙ2Ί способом химического окисления Ν-хлорбензолсульфонамидом, иммобилизованном на полистирольных гранулах (ΙΟΟΟΒΕΑΩ8®). Реакция между меченным радиоактивным иодом лизоцимом (1251-лизоцим) и а2М* представляется более эффективной, чем с лизоцимом куриного яйца, меченным по 125ΙБолтон-Хантеру. а2М* инкубировали с сорокакратным избытком 1251-лизоцима при 50°С. В параллельных экспериментах а2М* инкубировали при 50°С в отсутствие лизоцима, пробы отбирали через 0, 5 и 24 ч и анализировали электрофорезом в неденатурирующем, пороограничивающем ПААГ. Как описано выше, контрольные образцы, без лизоцима, почти полностью принимали медленно мигрирующую конформацию нативного а2М (фиг. 5, дорожки 3-5). Однако в присутствии 1251-лизоцима весь белок и вся радиоактивность мигрировали как быстрая, рецептор-узнаваемая форма а2М*, даже через 24 ч при 50°С (фиг. 5, дорожки 6-8). Свободный 1251-лизоцим отделяли от комплекса (через 5 ч при 50°С) гель-фильтрацией на колонке 8-300-НЮ Количество лизоцима, связавшегося с а2М в комплекс а2М*-1251-лизоцим определяли по включенной радиоактивности и удельной радиоактивности лизоцима, участвующего в образовании комплекса (18500 имп/мин/пМоль). Примерно 2.7 Моль 125Ιлизоцима связываются с одним Моль α2Μ*. Уровень ковалентного связывания количественно определяли путем денатурации а2М*содержащих фракций в 1% 8Э8, 30 мин при 100°С с последующей центрифужной микрофильтрацией на микроконцентраторе СЕКГК!СО^ 100, для выделения всего свободного лизоцима. примерно 75% радиоактивности оставалось в составе комплекса а2М*-1251-лизоцим, демонстрируя тем самым, что 2 Моль лизоцима куриного яйца ковалентно связывает один Моль а2М*. При электрофоретическом анализе в неденатурирующем пороограничивающем ПААГ, комплекс а2М*-1251-лизоцим мигрирует исключительно как быстрый рецептор-узнаваемый α2Μ*, означая, тем самым, что равновесие сдвинуто в сторону образования комплекса.
Комплекс был затем охарактеризован электрофорезом в ТО8-ПААГ (гели не показаны). Перед электрофорезом образцы кипятили десять минут в присутствии 1% 8Э8 и, в некоторых случаях, 50 мМ ДТТ, после чего гели сканировали на ΡΗΟ8ΡΗΟΚ1ΜΑ6ΕΚ™. В невосстанавливающих условиях 8Э8 высвобождает примерно 0.3 Моль свободного 1251-лизоцима на один Моль комплекса а2М*-1251-лизоцим, тогда как 1.6 Моль 1251-лизоцима остаются связанными с одним Моль комплекса. В присутствии и 50 мМ ДТТ, и 1% 8^8, 0.8 Моль свободного 125Ι-лизоцима высвобождается на 1 Моль комплекса α2Μ*-125Ι-лизоцим, тогда как 1.2 Моль 1251-лизоцима на 1 Моль α2Μ* остаются в комплексе. Видно, что степень ковалентного взаимодействия, полученная с меченным радиоактивным иодом лизоцимом выше, чем с лизоцимом, меченным по 1251-Болтон-Хантеру, и более высокая фракция ковалентного связывания устойчива к восстановлению. Поскольку реагент Болтон-Хантера реагирует с лизильными остатками, то возможно, что более низкая степень ковалентного включения, наблюдаемая с лизоцимом куриного яйца, меченным по Болтон-Хантеру, объясняется наличием нескольких групп, доступных для нуклеофильной замены, в районе тиолового эфира. Однако а2М*, инкубированный с необработанным лизоцимом при 50°С, имел профиль миграции в пороограничивающем ПААГ, идентичный профилю а2М*, инкубированного с лизоцимом, меченным по 1251-Болтон-Хантеру (гели не показаны), и распределение между медленной и быстрой миграцией а2М*-комплексов было таким же. Когда эксперименты были повторены с лизоцимом, который был экспонировал для окисления на ΙΟΌΟΒΕΑΌ8, в отсутствии Ыа1251, нативный электрофорез в ПААГ подтвердил, что реакция с а2М* была полной, и что все а2М*-комплексы сохранили быстро мигрирующую конформацию даже после 24 ч при 50°С. Поэтому мы считаем, что мягкое окисление праймирует аминокислотные остатки лиганда, что ведет к более охотному реагированию с а2М* и к замене на -ΝΗ2 по О1и952 тиололового эфира а2М*. Этот механизм не был описан ранее и мы допускаем, что усиленная реактивность также может быть обусловлена окислением боковых цепей аминокислот у лизоцима.
Пример 8. Упомянутые выше эксперименты были повторены с инсулином. Интересно, что меньший по размерам инсулин вел себя также как лизоцим куриного яйца. Когда инсулин метили радиоактивным иодом с помощью ΝαΙ25Ι способом химического окисления, используя ΙΟΌΟΒΕΑΌ8, лиганд был полностью включен в а2М* после инкубации 5 ч при 50°С. Электрофорез в неденатурирующем пороограничивающем ПААГ показал, что весь белок и вся радиоактивность мигрировали одной полосой в позиции, соответствующей быстро, рецептор-узнаваемому а2М* (фиг. 6, дорожки 46). После выделения комплекса а2М*-инсулин, 7.5 Моль 1251-инсулина обнаружили в связанном состоянии на один Моль а2М*. Ковалентное связывание составляло примерно 57% инсулина в комплексе а2М*-1251-инсулин (4.3 Моль инсулина на Моль а2М*), как было определено центрифужной микрофильтрацией. Комплекс анализировали электрофорезом в 8Э8-ПААГ фиг. 7А и 6Б, дорожки 2-6). В не-восстанавливающих условиях 8Ό8 высвобождает 2.8 Моль свободного 1251-инсулина на Моль комплекса а2М*1251-инсулин, тогда как 3.3 Моль 1251-инсулина остается в комплексе на каждый Моль а2М* (Фиг. 7Б, дорожки 4-6). Когда в ходе 808обработки добавляли 50 мМ ДТТ, высвобождалось 7 Моль 1251-инсулина на Моль а2М и очень мало радиоактивности оставалось ассоциированной с макроглобулином (фиг. 6Б, дорожки 2 и 3). В параллельных экспериментах α2Μ* инкубировали при 50°С в присутствии необработанного нативного инсулина и образцы, взятые в 0, 5 и 24 ч, анализировали электрофорезом в неденатурирующем поро-ограничивающем
ПААГ. Как было описано для лизоцима, некоторые а2М* обратились в медленно мигрирующую конформацию без включенного инсулина и реакция не была настолько полной, как в тех случаях, когда инсулин праймировали окислением, используя ΙΟΌΟΒΕΑΌ8.
Данные, представленные в приведенных выше примерах, показывают, что лизоцим и инсулин могут ковалентно включаться в нуклеофил-обработанный α2Μ*, когда они инкубируются совместно при 37°С (24 ч) или при 50°С (5 ч). Приблизительно 6.6 (37°С) или 2.3 (50°С) Моль лизоцима связываются с 1 Моль а2М*. Кипячение комплекса а2М*-лизоцим высвобождает 15-25% включенной радиоактивности. Кипячение в присутствии 1% 8Ό8 высвобождает значительно больше, показывая тем самым, что при 50°С (5 ч) или 37°С (24 ч) примерно 1.4 Моль лизоцима на 1 Моль а2М включается ковалентно. Это превышает величины, полученные протеолитическим включением, когда всего 1 моль лизоцима ковалентно связывался с 1 Моль а2М (27). В ходе протеолитической реакции протеиназа захватывается совместно с лигандом во внутреннюю полость а2М и размер лиганда и протеиназы ограничивает число молекул, которые могут быть включены. Более того, активированная протеиназа конкурирует с лизоцимом за реакцию с тиоловым эфиром. Интересно, что когда включение осуществлялось через протеолитического посредника, связь между лизоцимом и а2М была устойчивой к восстановлению (27), тогда как мы обнаружили, что часть лизоцима, включенного путем нуклеофильной активации, освобождается из комплекса а2М*-лизоцим восстановлением. В ходе протеолитической активации, нуклеофилы на поверхности белка могут реагировать с βглутамиловой группой тиолового эфира (О1и952), но в а2М* эта группа модифицирована -ΝΗ2. Тиоловая группа тиолового эфира (Сук949), однако, доступна для тиол-дисульфидной замены (73). Показано, что температура влияет на распределение между включениями по О1и952 и Сук949. Комплексы, образованные при 37°С, были более устойчивы к восстановлению, чем комплексы, образованные при 50°С, показывающие большее предпочтение к реакции с Сук949 в противоположность к замене нуклеофи лов на участке 01η952 при повышенной температуре.
Мягкое окисление лизоцима и инсулина приводит к увеличению включения в α2Μ*. Улучшенное включение, индуцируемое мягким окислением, не было ранее описано, и мы полагаем, что оно обусловлено окислением аминокислотных остатков в белковом лиганде до более реакционно-способного нуклеофильного состояния.
Инсулин является небольшой, подобной фактору роста, молекулой, имеющей такой размер (6 кДа), который позволяет ей диффундировать в ловушку а2М* и из нее, тогда как лизоцим (14 кДа) слишком велик для такой диффузии (35). Инкубация при 50°С позволяет ковалентно включить 3 Моль инсулина на 1 Моль а2М*, что сравнимо с протеолитическим включением 3-4 Моль инсулина на Моль а2М*(21).
С точки зрения структуры, способность нуклеофил-инактивированого а2М* захватывать различные непротеолитические белки и образовывать с ними 8Ό 8-стабильные комплексы, расширяет ранее известные знания о механизме связывания а2М и а2М* (обзор в (74) и (75)).
Пример 9. В этом примере оценивали способность комплексов, сформированных из стрептокиназы и амин-активированного α2макроглобулина индуцировать иммунный ответ в иммунных клетках человека. Стрептокиназу очищали из препарата ΚΑΒΙΚΙΝΑ8Ε (Рйагтааа Абла), поставленного аптекой Медицинского Центра Университета Дюка, в соответствии со способами СайеШпо с1 а1. (Мс11юб5 ίη Εηζίιηοΐоду ХЬУ:244-257). Исходный материал следовало переочистить с целью освободить стрептокиназу от сывороточного альбумина человека, который используют в препарате ΚΑΒΙΚΙΝΑ8Ε в качестве носителя. а2-Макроглобулин получали очисткой из просроченной плазмы человека (Американский Красный Крест, Дурхэм, Северная Каролина) по процедуре, описанной в (64). Набор для тестирования эндотоксинов ЬАЬ, был получен от А55ое1а1с5 о£ Саре Соб, а колонка для удаления эндотоксинов - от Рюгсе Сйсшюа1 Сотрапу (Рокфорд, Иллинойс).
Мононуклеарные клетки нормальной периферической крови (МКПК) были получены в стерильных условиях из венозной крови с добавлением 10% цитрата (кислый цитрат декстрозы, 81дта, Сент-Луис, Миссури), полученной от здоровых информированных добровольцев по их согласию. Кровь разбавляли 1:1 в 50 мл конической полипропиленовой центрифужной пробирке стерильным солевым раствором с фосфатным буфером (РВ8, 01ВС0 ВКЬ, Гайтерсбург, Мерилэнд), на подслойке из равного объема среды для разделения лимфоцитов (Ъ8М, Огдагюг! Тектка Согр., Дурхэм, Северная Каролина), после чего пробирки центрифугировали 40 мин при 400д, 20°С. Полосу мононукле арных клеток отбирали в другую пробирку, клетки дважды промывали РВ8 и ресуспендировали в концентрации 2х106/мл в полной среде ΡΡΜΙ (ΚΡΜΙ 1640, дополненная 25 мМ ΗΕΡΕ8, 5% инактивированной нагревом [56°С, 30 мин.] объединенной АВ-сыворотки человека, 1% ΝϋΤΚΙΌ0ΜΑ НИ [Воейгтдег Μηηη1κίιη|. 100мкМ ΜΕΜ не-необходимых аминокислот, 2мМ Ьглутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 1мМ пирувата натрия.
а2-Макроглобулин (2.5 мл, 9.6 мкМ) добавляли к 408 мкл 1% М NН4НСОз рН 8.0 и инкубировали 60 мин при комнатной температуре. Затем а2-макроглобулин пропускали через колонку ΡΌ-10 (Р1егсе, Рокфорд, Иллинойс), уравновешенную РВ8 (10 мМ №ьНРО+ 50мМ №С1, рН 7.4), для замены буфера. Такой а2-макроглобулин в так называемой быстрой форме обозначается здесь как а2-макроглобулин* и имеет А280=2.227 в кювете 1 см. Стрептокиназа (СК), ранее очищенная из ΚΑΒΙΚΙΝΑ8Ε, имела А280=2.088, что соответствует концентрации 46.4 мкМ. Для получения а2-макроглобулин */ СК-комплексов, 6.0 мл СК (280 нМоль) смешивали с 2.0 мл α2Μ* (7 нМ), стерилизовали фильтрацией через 0.45 мкм фильтр с низким уровнем сорбции белка, и инкубировали 24 ч при 37°С. Затем смесь наносили на колонку 8ΕΡΗΑΟΡΥΕ 8-300-НР (1.5х96 см, с объемом слоя 170 мл, Рйагтааа), уравновешенную РВ8, для отделения комплексов от свободной СК. Колонку элюировали на скорости потока 40 мл/ч по 6 мин на фракцию. Фракции анализировали электрофорезом в 8Э8-ПААГ, используя 5-15% градиентные гели в восстанавливающих условиях. Фракции (№21-23), представляющие апекс пика (определено по значению Α280 каждой фракции), соответствующие а2М*/СКкомплексам, объединяли с конечным выходом 12 мл материала с А280=0.219. Этот объединенный препарат а2М*/СК комплексов затем тестировали на эндотоксины и обнаружили их содержание на уровне < 0.1 нг/мл при концентрации СК 1.0 мкг/мл.
Стимуляцию МКПК ίη νίΙΐΌ проводили следующим образом: клетки от трех здоровых доноров (обозначенных как 8\ν, НО и Κν) получали как описано выше. Сто мкл клеток (2х106/мл в полном ΡΡΜΙ) вносили в каждую лунку 96-луночного полистирольного планшета для тканевых культур (Со§1аг). На каждом планшете верхний и нижний ряды не использовали, но заполняли 200 мкл стерильного РВ8. К каждой четверке лунок добавляли 100 мкл СК (0.02-20 мкг/мл среды, четырехкратные разведения) или а2М*/СК (0.002-2.0 мкг/мл среды, четырехкратные разведения). Дополнительные контроли включали а2М* сам по себе (0.075-75 мкг/мл среды, четырехкратные разведения) или РВ8 (0.04-31% в среде, четырехкратные разведения). Сдублированные планшеты инкубиро39 вали 5 и 6 дней, соответственно, при 37°С в увлажненной атмосфере с 5% СО2. Когда до окончания инкубации оставалось 6 ч, в каждую лунку добавляли по 50 мкл среды, содержащей 0.5 мк Ки 3Н-тимидина (6.7 Ки/мМоль в стерильной Н2О, Νο\ν Епд1апб Ыис1еаг). Содержимое каждой лунки собирали на стекло-волоконные фильтры и промывали, используя автоматический собиратель клеток 8ка1гоп, фильтры помещали в сцинтилляционные флаконы, содержащие 3 мл сцинтиллятора, и определяли включенную радиоактивность (выраженную в импульсах в минуту, имп./мин) жидкостно-сцинтилляционной спектрофотометрией. Определяли среднее от четырех повторов и строили график против концентрации СК или а2-макроглобулин*/СК.
Значительного включения 3Н-тимидина клетками, экспонированными только с а2М* или с ΡΒ8 не было, в сравнении с литературными данными о клетках, экспонированных только со средой (данные не показаны). Сходные результаты были получены в других экспериментах, использующих тех же трех доноров. Как показано на фиг. 8-10, пик пролиферативного ответа на 5-й день после введения только СК, с клетками, полученными от 8 XV. НО и КУ, наблюдался при концентрации вводимой СК 10 мкг/мл, хотя ответ клеток КУ был очень низкий и пик был довольно плоским, из чего можно заключить, что данный донор является относительным анергиком по отношению к СК.
Однако, для каждого из трех доноров клеток, максимальный пролиферативный ответ на 5-6-й день был в 2-3 раза выше, чем ответ, полученный на введение только СК (фиг. 8-10). Кроме того, для каждого из трех доноров максимальный ответ, наблюдаемый в варианте только СК, мог быть получен с концентрацией а2-макроглобулин*/СК комплекса, содержащем в 300 раз меньшее количество СК. Результаты шестого дня близки к результатам пятого дня (фиг. 11-13); хотя пиковое значение ответа, полученного для комплекса, все еще значительно выше наблюдаемого для только СК, это превышение не настолько выражено, как на 5-й день. Однако концентрации, требуемые для достижения пикового пролиферативного ответа, были настолько значительно низки (в 35 раз для 8 У, 200 раз для НО) с комплексом а2-макроглобулин/СК, что даже клетки довольно анергичного донора (КУ) показали ответ с отчетливой дозовой зависимостью на комплексы, хотя на только СК такого ответа не было. Таким образом, включение СК в а2-макроглобулин* вызывает очень значительное усиление иммунного ответа у уже сенсибилизированных клеток и усиление ответов у клеток либо плохо сенсибилизированных, либо анергичных.
Пример 10. Непротеолитическое ковалентное включение белка в а2-макроглобулин* (а2М*) никак не ограничено для полноразмерного интактного белка. Гибридный синтетический пептид [Τ1-8Ρ10ΜΝ(Α); аминокислотная последовательность = ΚΟΙΙΝΜΧνΟΕΥΟΚΑΜΥ ΑСΤΚΡNΥNIКЯКШНЮΡ6ΚΑΡΥΤΤК, см. (52)] кодирующий Т-клеточный (Т1) эпитоп др 120 (76), от Ν-концевого до гидрофильного Вклеточные эпитопы др 120 из района петли У3 (последовательность 8Ρ10) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) (77-79), был синтезирован твердо-фазным методом и очищен обратнофазовой ВЭЖХ. Этот синтетический пептид метили реактивом 1251-Болтона-Хантера (№\ν Епд1апб М1с1еаг) в соответствии с рекомендациями производителя с получением удельной радиоактивности примерно 132000 имп./мин/мг пептида. а2М* человека получали как описано выше. К 470 мкл а2М* (1072 пМоль) добавляли 1000 мкл меченый реактивом 1251-БолтонХантера пептид Τ1-8Ρ10ΜΝ(Α) (43130 пМоль; 26х106 имп./мин). Сто пятьдесят мкл смеси отбирали для параллельного эксперимента с целью получения образцов для анализа. Основную часть смеси инкубировали 5 ч при 50°С. В параллельном эксперименте 150 мкл смеси, отобранные ранее, а также 150 мкл а2М* в отсутствие Τ1-8Ρ10ΜΝ(Α), инкубировали при 50°С, отбирая образцы для анализа через 0, 5 ч и 24 ч. После инкубации в течение 5 ч при 50°С свободный пептид отделяли от пептида, связанного с а2М* пропусканием смеси через колонку (объем слоя 22,5 мл) 8ЕР11ЛСЮ’1. 8300 НВ (81дта, Сент-Луис, Миссури), уравновешенную 50мМ Трис-НС1, 50мМ №С1, рН7.5. Поток элюента в колонке составлял 5.4 мл/ч, размер собираемых фракций 1.8 мл. В каждой фракции определяли поглощение при 280 нм и радиоактивность. Количество 125Ι-Τ1-8Ρ10ΜΝ(Α), связавшегося с α2Μ* в комплекс α2Μ*-125Ι-Τ18Ρ10ΜΝ(Α) определяли исходя из включенной радиоактивности и удельной радиоактивности 125Ι-Τ1-8Ρ10ΜΝ(Α), используемого для образования комплекса. Фракции с колонки анализировали электрофорезом в 4-15% пороограничивающем геле и в 4-20% 8Э8-ПААГ в присутствии или отсутствии восстанавливающего агента дитиотреитола (ДТТ). Уровень ковалентного связывания количественно определяли путем денатурации а2М*-содержащих фракций в буфере образца для электрофореза в 8Э8-ПААГ в течение 5 мин при 100°С перед электрофорезом. Примерно 6.4 Моль 125Ι-Τ1-8Ρ10ΜΝ(Α) на 1 Моль а2М* связывалось в отсутствие ДТТ, тогда как в присутствии ДТТ с одним Моль а2М* связывалось примерно 1.4 Моль 125Ι-Τ18Ρ10ΜΝ(Α).
Таким образом, комплекс содержит 5 Моль пептида, связанного ковалентно с 1 Моль а2М*.
В восстановительных условиях примерно 1 моль пептида остается связанным с 1 Моль а2М*. Стехиометрия включения пептида слегка выше, чем для белков, упомянутых выше - ли41 зоцима и инсулина, возможно в силу димерной структуры пептида. Пептид имеет только один цистеинильный остаток и анализ электрофорезом в невосстанавливающем 8Э8-ПААГ подтверждает, что существует фракция пептида, в форме димера, связанного через дисульфидный мостик.
Пример 11. Непротеолитическое ковалентное включение синтетического пептида в α2макроглобулин* (а2М*) подтверждалось с помощью другого ВИЧ-кодируемого пептида. Гибридный синтетический пептид [Т18Р10ШВ(А); аминокислотная последовательность = ΚρίΙΝΜνρΕνϋΚΑΜΥΑΟΤΒΡΝΝΝΤ КК81К1рКСРСКАГУТ1; см. (52); 8ЕО ΙΌ N0:2] кодирующий Т-клеточный (Т1) эпитоп др 120 (76), от Ν-концевого до гидрофильного Вклеточные эпитопы др120 из района петли ν3 (последовательность 8Р10) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) (77-79), был синтезирован твердо-фазным методом и очищен обратнофазовой ВЭЖХ. Этот синтетический пептид метили реактивом 1251-Болтона-Хантера (№те Еид1аиб М1с1саг) в соответствии с рекомендациями производителя с получением удельной радиоактивности примерно 2х107 имп./мин/мг пептида и разбавляли немеченньм пептидом перед включением в а2М*. а2М* человека получали как описано выше. К 470 мкл а2М* (69 пМоль) добавляли 1000 мкл меченый реактивом 1251-Болтон-Хантера пептид Т1-8Р10ШВ(А) (2778 пМоль; примерно 3.4х106 имп./мин). Сто пятьдесят мкл смеси отбирали для параллельного эксперимента с целью получения образцов для анализа. Основную часть смеси инкубировали 5 ч при 50°С. После инкубации в течение 5 ч при 50°С свободный пептид отделяли от пептида, связанного с а2М* пропусканием смеси через колонку (объем слоя 22,5 мл) 8ЕРНАСВУЪ 8300 НВ (81дта, Сент-Луис, Миссури), уравновешенную 50 мМ Трис-НС1, 50мМ №С1, рН7.5. Поток элюента в колонке составлял 5.4 мл/ч, размер собираемых фракций 1.8 мл. В каждой фракции определяли поглощение при 280 нм и радиоактивность. Количество 125Ι-Τ18Р10111В(А), связавшегося с а2М* в комплекс а2М*-1251-Т1-8Р10111В(А) определяли исходя из включенной радиоактивности и удельной радиоактивности 1251-Т1-8Р10111В(А), используемого для образования комплекса. Фракции с колонки анализировали электрофорезом в 415% пороограничивающем геле и в 4-20% 8Ό8ПААГ в присутствии или отсутствии восстанавливающего агента дитиотреитола (ДТТ). Уровень ковалентного связывания количественно определяли путем денатурации α2Μ*содержащих фракций в буфере образца для электрофореза в 8Э8-ПААГ в течение 5 мин при 100°С перед электрофорезом. Примерно 6.5 Моль 1251-Т1-8Р10111В(А) на 1 Моль а2М* связывалось в отсутствие ДТТ, тогда как в присутствии ДТТ с одним Моль а2М* связывалось примерно 1.1 Моль 1251-Т1-8Р10111В(А).
Пример 12. В дополнение к приведенным выше примерам, другие белки или синтетические пептиды, которые непротеолитически и ковалентно включаются в α-макроглобулин* с образованием иммуногена настоящего изобретения, следуя процедурам, подобным описанным выше, включают НВкАд, белок, представляющий один из главных поверхностных антигенов гепатита В человека, пептид О8 (аминокислоты 124-147 НВкАд; последовательность = СТТ1САОС,\'8\11Т8СССТКРТ1)С1\'С; 8 ЕС) ΙΌ Ν0:3) (80) и химерный пептид (последовательность = ΤВI^ΤIΡ^8^^8СΤΚΡΤ^СNС; 8 ЕС) ΙΌ Ν0:4) (81), представляющий Т-клеточный эпитоп (аминокислоты 23-34) НВкАд, соединенный с Ν^-концом В-клеточного эпитопа (аминокислоты 139-147) НВкАд.
В примере НВ 5Ад, рекомбинантного белка, продуцируемого в дрожжах (Абуаисеб Вю1сс11по1од1с5 Шс., Коламбия, Мерилэнд) анализировали, используя электрофорез в ПААГ (полиакриламидном геле) и в 8Э8-ПААГ в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Было показано, что белок агрегирует и что эта агрегация зависит от дисульфидных связей. С целью восстановления белка до его мономерного состояния (25 кДа), белок восстанавливали и алкилировали следующим образом. НВкАд сначала обессоливали, используя РЭ-10 (Рйагтааа Вю1ес11) или подобную колонку, уравновешенную 50 мМ Трис-НС1, 100 мМ №С1, рН8. Следующий этап проводили в темноте, заворачивая пробирку в алюминиевую фольгу. Белок восстанавливали добавлением 1 мМ ДТТ на 30 мин при 37°С. Восстановленный белок затем алкилировали добавлением 5 мМ иодацетамида с последующей 30-минутной инкубацией при 37°С. В завершение восстановленный/ алкилированный НВкАд обессоливал, используя РЭ-10 или подобную колонку, уравновешенную 50 мМ Трис-НС1, 100 мМ №С1, рН7.4. НВкАд включался как в а2М* человека, так и в а2М* мыши, приготовленные как описано выше, в ходе инкубации восстановленного/алкилированного НВкАд с препаратом а2М* (молярное отношение НВкАд к а2М* 40:1) в течение 5 ч при 50°С. Инкубационную смесь затем разделяли электрофорезом либо в ПААГ, либо в 8Э8-ПААГ в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях и переносили на ΡV^Ε-мембраны с помощью Вестерн-блоттинга. Мембраны затем блокировали для подавления неспецифического связывания и инкубировали с поликлональными антителами кролика к НВ 5Ад для определения наличия и размера НВ 5Ад. Этот анализ подтвердил, что часть НВ5Ад была ассоциирована с а2М*.
Настоящее изобретение может быть выполнено в других формах или проведено други43 ми способами без отступления от его духа или существенных признаков. Настоящее описание, поэтому, следует рассматривать как во всех отношениях иллюстративное и не ограничивающее, пределы настоящего изобретения установлены прилагаемой формулой изобретения, и все изменения, которые происходят в пределах эквивалентных указанным в формуле значений и диапазона следует рассматривать как включенные в настоящее описание.
Далее следует перечень публикаций, относящихся к использованным выше ссылкам с номерами, соответствующими указанным в описании. Каждая из следующих ссылок, а также ссылки, цитированные по ходу описания, настоящим включены в данное описание как его неотъемлемая часть.
1. Εαηζανοοοίιία. А. 1990. ВсссрЮг-тсб1а1сб апкдсп ир1акс апб кк ейей οη апкдсп ртсксййюп ΐο с1акк 11-гс51г1с1сб Т 1утр1юсу1с5 Аппи. Всу. Iттиηο1. 8:773.
2. Рοκκит, 8., 8. Р. Всгд, апб 8. М)аа1апб. 1992. Тагдскпд апкдспк ΐο апкдсп ргскспкпд сс11к. 8стш ίη Iттиηο1. 4:275.
3. 8и, Ό., апб ναη Βοο^π. Ткс го1с οί тасгаркадск ίη Шс ^ттиποаб^иνаηΐ ас!юп οί Ιίροδοιικδ: ЕТТсс!к οί с1^т^ηаΐ^οη οί кр1сшс тасгоркадск οη 1кс пптипс тс^пкс адатй ^п1^аνспοиκ1у т)сс1сб кροκοтс-аκκοκ^аΐсб а1Ьитт апкдсп. Iттиπο1οду 66:466.
4. Усгта 1., Μ. Κηο, 8. Аткс1ст, и. Ккуск, С. В. А1у|пд, 8. 1. 6гссп, алб N. Μ. ^акксГ. 1992. Абрп'агИ сГГсс1к οί Ηροκοιικκ сοπΐа^π^πд 1ίρί6 А: Елкалс^^ οί 1ίροκοιηη1 апкдсп ргсксп1а1юп апб гсспШтсп! οί тасгоркадск. 1пГсс!юп апб 1ттипку 60:2438.
5. Ка^атига, Н., апб 1. А. ВсггюуБку. 1986. Епкапсстсп! οί апкдсшс ροΐспсу ίπ νίΐτο пб 1тιηιιηοβα'ΐίάΐν ίη νίνο Ьу отиркпд 1кс апкдсп ΐο аηΐ^^ттипοд1οЬ^п. 1. ^тишк 136:58.
6. Са^ауапηο^ΐ^κ, 6., апб В. Н. ВагЬсг. 1987. Аб^ай-Ртес 1д6 ^скροηкск шбиссб \\'Ш1 апбдсп отиркб ΐο аШ^б^к адатк! с1акк II МНС. №11игс 327: 59.
7. Сак1сп, Ь. А., апб 8. К. Р1сгсс. 1988. ВсссрЮг- тсб!а1сб В сс11 апбдсп ргосскктд: 1псгсаксб апОдсшску οί а дЮЬШаг рго1ст сονа1сπ11у отиркб ΐο аη1^Ьοб^ск крскШс ίοτ В сс11к ктРасс к1гис1игск. I. Iттиπο1. 140:404.
8. 8п1бсг, Ό. Р., А. КаиЫкск, апб Ό. М. 8сда1. 1990. Епкапссб апкдсп ^ттипοдсп^с^1у шбиссб Ьу Ыкрск|Пс ай^бик. 1. Ехр. Мсб. 171:1957.
9. М]аа1апб, 8., апб 8. Рοккит. 1991. Апбдсп (агдскпд \\йк тοпοс1οпа1 ай^бик ак уссЮгк II/ РшИксг су|бспсс Ша1 сοп^ида1^οп οί апкдсп ΐο крссШс тοпοс1οпа1 ай^бик спкапсск ир1акс Ьу апкдсп ргскспкпд сс11к. ШЕ ^тишк 3:1315.
10. Мапса, Р., Ό. РатодЮ, 6. ЫРка, А. Кипк1, апб Р. Сс1аба. 1991. ЕГГсс! οί айЕ дсη/ай^Ьοбу Γηίίο οη тасгоркадс иρΐакс, ргасскк1пд, апб ρ^сксп1а1^οп ΐο Т сс11к οί апбдсп оттр1схсб \\'Ш1 ρο1ус1οпа1 ап1^Ьοб^ск. 1. Ехр. Мсб.
173:37.
11. 6οπΐί)ο, С. М., апб 6. Μο11с^. 1991. ΜстЬ^аηс-^псο^ρο^аΐсб ^ттипοд1οЬи1^п гсссрЮгк тсгсакс 1кс апкдсп-ртскспкпд аЬ11йу οί В-сс11к. 8сапб. 1. Iттипο1. 34:577.
12. 8^Η^^, В. 1992. Сараску οί апбдсп ир1акс Ьу В сс11к, ДЬгоЫайк οτ тасгоркадск бс(сгттск сШсгспсу οί ргсксйа!юп οί а гоШНс кс1Г апбдсп (С5) ΐο Т ^тр^су^к. Еиг. I. Iттипο1. 22:1271.
13. Вοск. К. Ь., В. ВспассггаР, апб А. К. АЬЬак. 1984. Апбдсп ргсксп1а1юп Ьу Нар1сп-крсс|Пс В ^тр^суйк I. ΒοΒ οί кшТасс ίιηιηιιηο§1οΕιι1ίη гсссрЮгк. 1. Ехр. Мсб. 160: 1102.
14. Еаг^ауссаа, А. 1985. Апидсп-крссШс т1сгас1юп ЬсЕуссп Т апб В сс11к. №11игс 314:537.
15. Ипапис (1981), Αбν. Iттипο1. 31:11136.
16. Εοιτηζ, В. 6., 1. 8. В1ит, апб Р. М. А11сп. 1990. ^π^ίΐώ^ сοтρс1^ΐ^οп Ьу кс1Г рго1стк ίοτ апбдсп ргсксп1а1юп сап Ьс ο\όιόοιικ Ьу гсссрЮг-спкапссб ир1акс. I. Iттипο1. 144:1600.
17. Агу1сих, 1., Н. Уккс1, апб М. 6. СсЮтЬ.
1988. Αпΐ^дсп-Ьοипб С3Ь апб С4Ь спкапсс апбдсп-ргсксйтд сс11 Типйюп ίπ асГО'йюп οί китап Т-сс11 сЮпск. Iттипο1. 65:229.
18. 6гоп, Н., Т^дс^сй, I. В., Епдкбб, 1. 1. апб 8. V. (1996) Вюскст. I: 318, 539-545.
19. 8аВсксп, 6. 8., апб А. I. Ватгск. 1980. Сονа1спΐ Ьшбшд οί ргоЮтакск ίπ 1кси геайюп \\Ш1 о^-тасгодЮЬикп. Вюскст. 1. 187:695.
20. 8аксксп, 6. 8., апб С. А. 8аусгк, апб А.
1. Ваггсй. 1981. РитШст ска^асΐс^^ζаΐ^οп οί 1кс отνа1спΐ 1шкшд гсас!юп οί а^-тасгодЮЬиНп. Вюскст. 1. 195:4453.
21. Ски, С. Т., Ό. 8. ВиЬспйст, I. I. Епдкбб, апб 8. V. Γίζζο. 1991. Мсскаткт οί ίπки11п ^псο^ρο^аΐ^οп ίπΐο о^-тасгодЮЬЫт: кирНса1юпк ίοτ Шс кШбу οί рсрббс апб дго\\Ш ГзсЮг Ьтбтд. ВюскстМгу 30:1551.
22. Βονί, Т., Ό. Μοκкс^, апб Vакс^^. 1977. Сикигсб китап тοпοсуΐсκ куйксжс апб кссгс!с о^-тасгодЮЬикпс. 1. Ехр. Мсб. 145:1580.
23. Сокп, Ζ. А. 1978. Ткс асΐ^νа1^οп οί тοпοпис1са^ ρкадοсуΐсκ: ίасΐ, ίаηсу, апб ГиШгс. I. Iттиπο1. 121:813.
24. 8ск1сктдсг, С., 1. МсЕпктс, 1. \Уа11тап,
1. Ь. 8^ксу, С. Нап1су, апб М. Ήο6οτ^π.
1989. СотаЮт Ьтбтд ΐο α-тас^οд1οЬи1^пк ίί а рго1ст \\Ш1 Ггсс 8Н дгоирк ргабиссб Ьу асГОШсб В сс11к: ЬЮсШ^ Ьу О-рсшсШаттс апб дο1б сοтροипбк. Μο1. Iттипο1. 26:255.
25. ΡοΠΗ, В. 8скссг, А. ИгЬапкку, Т. А.
Ьидсг, апб Ь. 8οΐ1^иρ,-^спκсп. 1990. Втбтд οί !Е1β ΐο а-тасгодЮЬЫтк апб гс1сакс Ьу ΐк^ο^сбοx^п. I. Iттипο1. 145: 3747.
26. Тсοбο^скси М., М. МсАТТсс, 1. Ь. 8^ксу, 1. \Уа11тап, А. 8ка\\·, апб С. Нап1су. 1991. Сονа1спΐ бйикабс Ьтбтд οί китап [Ь-1Ь ΐο аЗ-тасгодкЬлНп: Ιηΐιίόίΐίοη Ьу Ό-репкШатше. Μο1. ТютишЬ 28:323.
27. СЬи, С. Т., аиб 8. V. Ρίζζο. 1993. Кесеркг-теб1акб аибдеи бе1кегу ίηΐο тасгорЬадек: С.бтр1ехН1д апбдеи ΐο α2-тас^οд1οЬи1^и епНапсек ]:>ΐΌ^ηΐαΐίοη ΐο Т-се11к. 1. Iттилο1. 150:48.
28. Ιΐο, Р., 8. Ιΐο, апб N. 81ιίιηίζιι. 1984. ТгапктетЬгапе бе1кегу οΓ ρο1уρеρί^бе Ηο тюлек Ьуракчпд (Не Ηιΐπηκχ се11 кийасе гесеркгк: А сοи^идаΐе οΓ ίηκπ1ίη \νίΐΗ α2-тас^οд1οЬи1^и (α2Μ) ι^ο^ηίζίη^ 6οΐ6 ίηκυ1ίη апб α2Μ гесеркгк апб ίΐκ Ьюкдка1 асбубу ίη гекИюп ΐο еибοсуΐ^с ра(Н\уаук. Μο1. Се11. Εибοс^^и. 36:165.
29. Окаба, Т., Υ. Кигоба, аиб А. Пхай 1987. Εибοсуΐοί^с ^иΐе^иаί^ζаΐ^οи οΓ α2-тас^οд1οЬи1^и: αда1асЮк1баке сοи^идаΐе Ьу сиНигеб йЬгоЫаЧк бепгеб Ггот РаЬгу Ьет^ζудοΐе. ВюсНет. Вюркк. Кек. Сеттла 142:100.
30. Кар1ап, 1., аиб Μ. й. №е1кеп. 1979. Ληη1νκίκ οΓ тасгорЬаде кигГасе гесеркгк. Вшбшд οΓ α2-тас^οβ1οЬи1^п-ρ^οιе^паке сοтρ1еxеκ ΐο гаЬЬб ^ίο· тасгарНадек. ΐ. Βίο1. СЬет. 254:7323.
31. 8οΐΐ^иρ.-^еηκеη Й., Т. Е. Ρеΐе^κеη. апб 8. Μадпи88οп. 1981. Тгуркш-шбисеб асΐ^νаί^οи οΓ (Не ίΗΐο1 еЧегк ίη (у-тасгодкЬиНп делегакк а κΗογϊ-Η\ό6 шкгтеб1ак (паксегИ а2М) (На( сои геас( гар1б1у ΐο ^исο^ρο^аΐе ηοΐ οпίу теШуНтше ογ ркгексше Ьш η1κο ргокшк 1аскшд ргокшаке псРуНу. РЕВ8 Ьеб. 128:123.
32. 8οΐΐ^иρ.-^еηκеη Й., 1987. α2Μас^οд1οЬи1^и аиб гекИеб ΐΗίο1 еЧег р1акта ргаΐе^иκ. 1и ТНе Р1акта Ρτο^ίπκ: 8биЧиге, Ριηκΐίοη, аиб Сеиебс Ссибок νο1. V. Р. А. РиШатк, еб. Асабетк Ргекк, 1ис., Ογ1ππ6ο Ей., р. 191.
33. ΒηΓΓίκοη, К. А. 1984. ТЬе Гатйу οΓ ргоΐе^иκ Нахтд ^иΐе^иаί ίЬ^ο1еκΐе^ 6οπ6κ. Весел! Абνаисек ш Iттииο1οду 17:87.
34. Ре1бтаи, 8. К., 8. Ь. 6οηίηκ, аиб 8. V. Ρίζζο. 1985. Μοбе1 οΓ (у-тасгодкЬиНп ЧгисШге апб Γιηκΐίοη. Ргос. Νηΐ1. Асаб. 8ск И8А 82:5700.
35. Ваггеб, А. 1., аиб Ρ. Μ. 8ΐа^кеу. 1973. ТНе ^иΐе^асί^οи οΓ (у-тасгодкЬЫш \\йН ргокшакек: СЬагаскйкбск аиб крес|ПсНу οΓ !Не ιτα^ίοη, апб а НуροΐНек^к μι^γπιι^ 1(к пю1еси1аг тесНап1кт. ВксЬет. 1. 133:709.
36. Ρίζζο 8. V. апб 8. Ь. 6οηίηκ. 1984. КесерГОг теб1а!еб ρ^οΐеаκе ^еди1аί^οи. 1и ТНе КесерГОгк ^1. I. Ρ. Μ. боппк, еб. Асабетк Ργο88, Ογ1οπ6ο, Р1, р. 177.
37. 8οΐΐ^иρ.-^еηκеη й., 1989. α2Μас^οд1οЬи1^ηκ: ЧгисШге, кНаре апб тесЬашкт οΓ ргокшаке оттркх Γοηηηΐίοη. 1. Βίο1. СНет. 263: 11539.
38. Неге, 1., и. Наттап, 8. ^дие, О. ΜукΕΗο4, НН. Οαπ^οΗ, апб К. К. 8ίапίеу. 1988. 8игб1се ^ηΐίοη апб Н1дЬ аΓΓίπίΐν Γογ са1сшт οΓ а 500-кЭа Нхег тетЬгаие ргокшк скке1у ге1акб ΐο Ше ййй-гесерЮг клддеЧ а ρЬуκ^ο1οд^са1 га1е ак ^юргеНеи! гесеркг. ΕΜΒΟ 1. 7:4119.
39. 8бкк1апб, Ό. К., 1. Ό. АкН^т, 8. А11батк, А. Н. Вигдекк, Μ. Μ^д1^ο^^п^, апб А. 8.
Агдтахек. 1990. 8ес.|лепсе 1бепШу Ьейгееп Ше α2тасгодШЬиби гесерГОг апб 1ο\ν беикбу 1^ρορ^οΐе^и гесеркг-ге1акб ргокш киддеЧк ΐΗηΐ ΐΐιίκ тο1еси1е 1к а ιηιι1ΐίΓιιη4ίοηη1 гесерГОг. 1. Вю1. СЬет. 265: 17401.
40. Ρίζζο 8. V. 1988. КесерШг ^есοдп^ΐ^οп οΓ ΐΐκ р1акта ргокшаке ^пд^Ь^ΐο^ (у-тасгодкЬиПп. Ι8Ι Абак οΓ 8скисе: ВксЬеткбу 1:242.
41. ЕидЬбб, 1. 1., I. В. ТЬсдегкеп, Ρ. А. КссЬе, апб 8. V. Ρίζζο. 1989. А μι·ι^γ\ό6 гедюп ίη а-тасгодкЬибик ρа^ΐ^с^ρаΐек ίπ Ьшбшд ΐο 1Ье таттаНап а-тасгодкЬиби гесеркг. ВюсНеппкбу 28: 1406.
42. ΕαΜαπΐ, 1., Μ. А. Науек, С. К. Αο1ΕηЬегд, I. Никкшш, 8. А. На11, аиб 8. й. 6οηίηκ. 1991. Аи а^тасгодШЬиби гесерЮг-берепбеШ тесНашкт Γογ Ше р1акта с1еагаисе οΓ ΐηηκΓοηη1ид дго\\1Н ΓκΐοΓ-β1 ίπ тке. 1. Сби. 1п¥еЧ. 87:39.
43. Окаба еΐ а1. (1987), ВксЬет. ВкрЬук. Кек. Сют. 146(1):26-31.
44. Окаба еΐ а1. (1988), ВксЬет. ВкрЬук. Кек. Сют. 150(2):883-889.
45. Ιΐο еΐ а1. (1983), РЕВ8 йебегк,
152(1):131-135.
46. Окаба еΐ а1. (1987), ВксЬет. ВкрЬук. Кек. Сют. 142(1):100-106.
47. Окаба еΐ а1. (1987), ВксЬет. ВкрЬук. Кек. Сют. 143(3):954-958.
48. 1атек, К. 1980. А1рЬа2 тасгодйЬлНп апб ίΐκ [ΐο^^Ε ^тρο^ΐаисе ίπ 1ттиие куЧетк. Тгеибк ВксЬет. 8ск 5:43.
49. 8акекеи еΐ а1. 1981, ВксЬет 1. 195:45361.
50. Vап йелтем еΐ а1. 1982, ВксЬет 1. 201:119-28.
51. Vап Кοтρаеу еΐ ак, 1995, ВксЬет. 1. 312:183-90.
52. Наб й а1. (1991), Ρ^Ο тТЙ. АСАЭ. 8СЙ и.8.А. 88:9448-52.
53. 8акекеи, С., апб 1. 1. ЕидНбб. αΜас^οд1οЬи1^иκ: ^еΐесΐ^οη апб сЬа^асΐе^^ζаί^οи. ΜеΐЬοбκ Ен/ш-юН 223:121.
54. НаЬееЬ, А.Р.8.А. (1972) ΜеίЬοб Епатей 457-464.
55. На11, Р. К., апб К. С. ^Ьейк. 1978. Ρ^κκα1 апб сНетюа1 ргорегбек οΓ Ьитаи р1акта (у-тасгодкНиПп. ВюсНет. 1. 171:27.
56. 8акекеи, С., апб №1даке, Н. (1989) ίπ Ργο^οΉκ Εпζутеκ: А Ρ^асΐ^са1 АрргоасН (Веуΐοπ. К. 1. апб Βοиб, 1. 8., ебк.) рр. 83-104, Шй Ριόκκ αΐ Ох&гб ипкегкйу Ριόκκ, №\у ΥογΕ
57. ЕидНбб, 1. 1., Ι. В. ТЬсдегкеп, С. 8акекеи, С.Н. Реу, N. й. Р1д1ег, 8. й. 6οηίακ, аиб 8. V. Ρίζζο. 11990. α-Μас^οд1οЬи1^и Γγοηι Й1ти1ик ρο1уρЬетиκ еxΗ^Ь^ΐκ ргсИешаке 1пЬ1Ь1кгу асбгбу аиб ρа^ΐ^с^ρаΐеκ ίπ а Ьетο1уΐ^с куЧет. ВюсНеликбу 29:10070.
58. ΡΓαίκ^απ, Μ. аиб Кир1еу, 1. А. (1968) ВксЬет1Чгу 7,2431-2445.
59. СапГ1е1б, К. Е. 1963. Рерйбек бепуеб Ггот йурйс бфекбоп оГ едд теййе 1укохуте. I. Вю1. СЬет. 238:2691.
60. ВоИоп, А. Е. апб НиШег, V. Μ. (1973) ВюсЬет1кйу боигпа1 133, 529-539
61. Вигу, А. Е. 1981. Апа1ук1к оГ рго!еш апб рерббе т1х!игек: Еуа1иабоп оГ !Ьгее кобшт бобесу1 ки1рЬа1е-ро1уасгу1ат1бе де1 е1ес1горЬогек1к ЬиГГег кук1етк. I. СЬготаЮдг. 213:491.
61Ь. 8теепкоп, К. Р. апб Нотеагб I. В. (1979) Ргос. №аГ. Асаб. δοΐ. И8А 76: 4313-4316.
62. Нотеагб, I. В., Уегтеи1еп, Μ., апб 8теепкоп, К. Р. (1980) I. Вю1. СЬет. 255: 3820-3823.
63. Уап Ьеиуеп, Е., Саккппап. Ι-Е апб Уап беп ВегдЬе, Н. (1981) I. Вю1. СЬет. 256, 90169022.
64. 1тЬег, Μ.6., апб 8.У. Р|ххо. 1981. С1еагапсее апб Ьтбтд оГ 1тео е1есйорЬогейс Гак( Гогтк оГ Питан а2-тасгод1оЬи1т. I. Вю1. СЬет. 256:8134.
65. Μίκιη, и.К., С.Т. СЬи, Ό.8. КиЬепк1ет, 6. 6атеаб1, апб 8.У. Р|ххо. 1993. КесерЮггесодшхеб а2-тасгод1оЬи11п-теШу1ат1пе е1еуа1ек тйасе11и1аг са1стт, токйо1 рЬокрЬа!ек апб сусЬс АΜР т типпе регйопеа1 тасгорЬадек. ВюсЬет. I. 290: 885.
66. бепкеп, Р.Е.Н., 8ЬапЬЬад, У.Р. апб 8йдЬгапб, Т. (1995) Еиг. I. ВюсЬет 227,612-616.
67. бепкеп, Р.Е.Н. апб 8йдЬгапб, Т. (1992) Еиг. I. ВюсЬет 210,1071-1077.
68. В_)огк, I. (1985) ВюсЬет. I. 231,451-457
69. СиптпдЬат, Ь. V., Сгетек, В. С. апб 6ейтк, Р. (1990) ВюсЬетИйу 29,1638-1643.
70. Уап Ьеиуеп, Е., Μа^упеп, Р., Сакытап, б-б. апб Уап беп ВегдЬе, Н. (1982) ВюсЬет. б. 203, 405-411.
71. 6ей1пк, Р.6.\\;. (1995) ВюсЬетИйу 34, 12233-12240.
72. Нотеагб, 6. С., ΜΐδΐΗ, и.К., ИеСатр, И.Ь. апб Р1ххо, 8.У. (1995) б. С1т. 1пуек1. 97, 1193-1203.
73. 6ейтк, Р.С.'М. апб Сгетек, В.С. (1994) Апп. Ν.Υ. Асаб. 8ск 737, 383-398.
74. СЬи, С.Т. апб Р1ххо, 8.У. (1994) ЬаЬ. 1пуекК 71, 792-812.
75. Тгау1к, б., апб 6.8. 8а1уекеп. 1983. Нитап р1акта рго1етаке шЫЬйогк. Апп. Кете. ВюсЬет. 52:655.
76. Сеаке, К.В., Μа^да1й, Н., Сотейе, б.Ь., РиШеу, 8.Ό., ЭеКкЕ С., апб ВегхоГкку, б.А. (1987) Ргос. №аЬ Асаб. 8ск, И8А 84:4249-44253.
77. Ра1кег, Т.6., С1агк, ΜΈ., Ьапд1о1к, А.б., ΜайЬетек, Т.6., ХУетЬоИ, К.6., Капба11, К.К., Во1одпекК И.Р., апб Наупек, В.Е. (1988) Ргос. №а11. Асаб. 8ск, И8А 85:1932-1936.
78. Ра1кег, Т.6., ΜайЬетек, Т.6., ЬапдЫк,
А.б., Таппег, ΜΈ., 1631161, ΜΈ., 8сеагсе, Β.Μ., К1т, 6.Е., ВегхоГкку, б.А., Во1одпекК И.Р., апб Наупек, В.Е. (1989) б. 1ттипо1. 142:3612-3619.
79. Най, МК., Ра1кег, Т.6., ΜайЬетек, Т.6., Ьапд1о1к, А.6., ЬегсЬе, Ν.ν., ΜηΠίπ, ΜΈ.,
8сеагсе, Β.Μ., 1^031131, С., Во1одпекф И.Р., апб
Наупек, В.Е. (1990) б. 1ттипо1. 145:2677-2685.
80. Μί^ιη, А., Као. К.У.8., Пигдара1, Н., Μап^νе1, У., апб Рапба, 8.К. (1993) 1ттипо1. 79:362-367.
81. 81етеагб, Μ.ν., Рагйбок, С.И., И^еНо, Е. апб Нотеагб, С.К. (1993) Уассте 11:1405-1414.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Ρίζζο, ЗаК’абоге
Огоп, Наппе <120> МОДУЛЯТОР ИММУННОГО ОТВЕТА «2-МАКРОГЛОБУЛИНОВЫЙ
КОМПЛЕКС <130> 2295-1-001С1Р <140>
<141>
<150> 09/053, 301 <151> 1998-04-01 <160>4 <170> Патентование. Версия 2.0 <210>1 <211>40 <212>РК.Т <213>ВИЧ <400>1
ТЬг Аг£ Пе Ьеи ТЬг Пе Рго С1п Зег Ьеи Азр Зег Сук ТЬг Ьук Рго ТЬг Акр С1у
5 1015
Акп Сук <210>2 <211>41 <212>РКТ <213>ВИЧ <400>2
ТЬг Аг§ Пе Ьеи ТЬг Пе Рго 61п 8ег Ьеи Акр Зег Сук ТЬг Ьук Рго ТЬг
1015
Акр О1у Акп Сук <210>3 <211>24 <212>ΡΚΤ <213>НВзАд <400>3
ТЬг Агд Пе Ьеи ТЬг Пе Рго <Э1п Зег Ьеи Акр Зег Сук ТЬг Ьук Рго ТЬг Акр О1у
5 1015
Акп Сук <210>4 <211>21 <212> РКТ <213>НВкАё <400>4
ТЬг Агд Пе Ьеи ТЬг Пе Рго С1п Зег Ьеи Акр Зег Сук ТЬг Ьук Рго ТЬг Акр 61у
1015
Акп Сук

Claims (63)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Стабильный комплекс, включающий как минимум одну интактную биомолекулу с нуклеофильной группой и активированный α249 макроглобулин, несущий интактный участок наживки, причем каждая из упомянутых интактных биомолекул с нуклеофильной группой связана с упомянутым активированным α2макроглобулином через связь, состоящую из упомянутой нуклеофильной группы, ковалентно связанной с γ-глутамиловой группой упомянутого расщепленного сложного тиолового эфира упомянутого а2-макроглобулина.
  2. 2. Стабильный комплекс по п.1, где упомянутая биомолекула выбрана из группы, состоящей из пептидов, белков, углеводов, цитокинов, факторов роста, гормонов, ферментов, токсинов, антисмысловой РНК, лекарственных препаратов, олигонуклеотидов, жиров, ДНК, антигенов, иммуногенов, аллергенов и их комбинаций.
  3. 3. Стабильный комплекс по п.2, где упомянутая биомолекула выбрана из группы, состоящей из ΚρίΙΝΜψρΕνΟΚΑΜΥΑΟΤΒΡΝΥΝΚΚΚΒΙΗΙΟ ΡΟΚΑΡΥΤΤΚ (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:1);
    ΚΟΙΙΝΜΑΟΕναΚΑΜΥΑΕΊΉΡΝΝΝΊΉΚδΙΗΙΟ ΚΟΡΟΚΑΡνΤΙ (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:2);
    ΟΤΤΡΑρΟΝδΜΡΡδΟΟΟΤΚΡΤΏΟΝΟ (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:3) и
    ΤΚΙΕΤΙΡρδΕΌδΟΤΚΡΤΌΟΝΟ (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:4).
  4. 4. Стабильный комплекс по п.1, где упомянутая биомолекула имеет молекулярный вес от примерно 0,5 до примерно 100 кДа.
  5. 5. Иммуноген, включающий стабильный комплекс по п.1, причем упомянутая по меньшей мере одна интактная биомолекула с нуклеофильной группой представляет собой антигенную молекулу, несущую как минимум один эпитоп.
  6. 6. Стабильный комплекс по п.2, причем упомянутый антиген выбран из группы, состоящей из ВИЧ-антигенов, антигенов вирусного гепатита, их пептидов, их фрагментов, их гибридных пептидов, их химерных пептидов и их гибридных синтетически пептидов.
  7. 7. Стабильный комплекс по п.6, причем упомянутые антигены или фрагменты вируса ВИЧ содержат др120, др160 или их фрагмент.
  8. 8. Стабильный комплекс по п.6, причем упомянутые антигены вирусного гепатита или их фрагменты содержат НШЛд или его фрагмент.
  9. 9. Стабильный комплекс, включающий как минимум одну интактную биомолекулу с нуклеофильной группой и активированный α2макроглобулин, несущий интактный участок наживки, причем каждая из упомянутых интактных биомолекул с нуклеофильной группой связана с упомянутым активированным α2макроглобулином через связь, состоящую из упомянутой нуклеофильной группы, ковалентно связанной с γ-глутамиловой группой упомянутого расщепленного сложного тиолового эфира упомянутого а2-макроглобулина, причем упо мянутый стабильный комплекс получен последовательностью стадий активации а2-макроглобулина путем инкубации с нуклеофильным веществом до образования нуклеофил-активированного а2-макроглобулина, удаления избытка упомянутого нуклеофильного вещества и инкубации упомянутого нуклеофил-активированного а2-макроглобулина с упомянутой биомолекулой, вследствие чего образуется упомянутый стабильный комплекс.
  10. 10. Стабильный комплекс по п.9, причем упомянутая биомолекула выбрана из группы, состоящей из пептидов, белков, углеводов, цитокинов, факторов роста, гормонов, ферментов, токсинов, антисмысловой РНК, лекарственных препаратов, олигонуклеотидов, жиров, ДНК, антигенов, иммуногенов, аллергенов и их комбинаций.
  11. 11. Стабильный комплекс по п.10, причем упомянутый антиген выбран из группы, состоящей из ВИЧ-антигенов, антигенов вирусного гепатита, их пептидов, их фрагментов, их гибридных пептидов, их химерных пептидов и их гибридных синтетически пептидов.
  12. 12. Стабильный комплекс по п.11, причем упомянутые антигены или фрагменты вируса ВИЧ содержат др120, др160 или их фрагмент.
  13. 13. Стабильный комплекс по п.11, причем упомянутые антигены вирусного гепатита или их фрагменты содержат ΗϋδΑ§ или его фрагмент.
  14. 14. Стабильный комплекс по п.9, причем упомянутая биомолекула выбрана из группы, состоящей из
    ΚρΙΙΝΜ^ρΕνΟΚΑΜΥΑΟΤΚΡΝΥΝΚΚΚΚΙΗΙΟ ΡΟΚΑΡΥΤΤΚ ОНО ΙΌ ΝΟ:1);
    ΚρΙΙΝΜ^ρΕνΟΚΑΜΥΑΟΤΚΡΝΝΝΤΒΚδΙΒΙρ ΚΟΡΟΚΑΡνΤΙ ОНО ΙΌ ΝΟ:2);
    ΟΤΤΡΑρΟΝδΜΡΡδΟΟΟΤΚΡΤΌΟΝΟ ΟΕΟ ΙΌ ΝΟ:3) и
    ΤΚΙΕΤΙΡρδΕΌδΟΤΚΡΤΌΟΝΟ (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:4).
  15. 15. Стабильный комплекс по п.9, причем упомянутая биомолекула имеет молекулярный вес от примерно 0,5 до примерно 100 кДа.
  16. 16. Иммуноген, включающий стабильный комплекс по п.9, причем упомянутая по меньшей мере одна интактная биомолекула с нуклеофильной группой представляет собой антигенную молекулу, несущую как минимум один эпитоп.
  17. 17. Стабильный комплекс по п.9, причем упомянутое нуклеофильное вещество имеет формулу ΚΝΗ2, где Κ выбран из группы, состоящей из водорода и алкильной группы с числом углеродных атомов от 1 до 6.
  18. 18. Стабильный комплекс по п.17, причем упомянутое нуклеофильное вещество выбрано из группы, состоящей из аммиака, метиламина, этиламина и их комбинаций.
  19. 19. Стабильный комплекс по п.9, причем упомянутую инкубацию упомянутого нуклео фил-активированного а2-макроглобулина с упомянутой биомолекулой проводят в температурном диапазоне от примерно 35 до примерно 55°С.
  20. 20. Стабильный комплекс по п.9, причем упомянутую стадию инкубации проводят в температурном диапазоне от примерно 37 до примерно 50°С и в период времени в диапазоне от примерно 1 до примерно 24 ч.
  21. 21. Стабильный комплекс по п.20, причем диапазоны температуры и времени упомянутой инкубации выбраны из температуры примерно 37°С для примерно 24 ч и температуры примерно 50°С для диапазона от примерно 1 до примерно 5 ч.
  22. 22. Способ получения ковалентного комплекса между как минимум одной интактной биомолекулой с нуклеофильной группой и активированным а2-макроглобулином, несущим интактный участок наживки, причем упомянутая интактная биомолекула с нуклеофильной группой связана с упомянутым активированным а2-макроглобулином через связь, состоящую из упомянутой нуклеофильной группы, ковалентно связанной с γ-глутамиловой группой упомянутого расщепленного сложного тиолового эфира упомянутого а2-макроглобулина, включающий стадии
    ί) активации упомянутого а2-макроглобулина путем инкубации с нуклеофильным веществом с образованием нуклеофил-активированного а2-макроглобулина;
    ίί) удаления избытка упомянутого нуклеофильного вещества и ϊϊΐ) инкубации упомянутого нуклеофилактивированного а2-макроглобулина с упомянутой биомолекулой в течение периода времени, достаточного для образования упомянутого комплекса.
  23. 23. Способ по п.22, причем упомянутое нуклеофильное вещество имеет формулу ΚΝΗ2, где К выбран из группы, состоящей из водорода и алкильной группы с числом углеродных атомов от 1 до 6.
  24. 24. Способ по п.23, причем упомянутое нуклеофильное вещество выбрано из группы, состоящей из аммиака, метиламина, этиламина и их комбинаций.
  25. 25. Способ по п.22, причем упомянутую инкубацию упомянутого нуклеофил-активированного а2-макроглобулина с упомянутой биомолекулой проводят в температурном диапазоне от примерно 35 до примерно 55°С.
  26. 26. Способ по п.22, причем упомянутую стадию инкубации проводят в температурном диапазоне от примерно 37 до примерно50°С и в период времени в диапазоне от примерно 1 до примерно 24 ч.
  27. 27. Способ по п.26, причем диапазоны температуры и времени упомянутой инкубации выбраны из температуры примерно 37°С для примерно 24 ч и температуры примерно 50°С для диапазона от примерно 1 до примерно 5 ч.
  28. 28. Способ по п.22, причем упомянутая биомолекула выбрана из группы, состоящей из пептидов, белков, углеводов, цитокинов, факторов роста, гормонов, ферментов, токсинов, антисмысловой РНК, лекарственных препаратов, олигонуклеотидов, жиров, ДНК, антигенов, иммуногенов, аллергенов и их комбинаций.
  29. 29. Способ по п.28, причем упомянутый антиген выбран из группы, состоящей из ВИЧантигенов, антигенов вирусного гепатита, их пептидов, их фрагментов, их гибридных пептидов, их химерных пептидов и их гибридных синтетически пептидов.
  30. 30. Способ по п.29, причем упомянутые антигены или фрагменты вируса ВИЧ содержат др120, др160 или их фрагмент.
  31. 31. Способ по п.29, причем упомянутые антигены вирусного гепатита или их фрагменты содержат ИЬ^Лд или его фрагмент.
  32. 32. Способ по п.28, причем упомянутая биомолекула выбрана из группы, состоящей из ΚρίΙΝΜνρΕνΟΚΑΜΥΑΟΤΚΡΝΥΝΚΚΚΚΙΗΙΟ ΡΟΚΑΡΥΤΤΚ (8Εφ ΙΌ N0:1);
    ΚφΙΙΝΜνρΕνΟΚΑΜΥΑΟΤΗΡΝΝΝΤΚΚδΙΚΙρ ΚΟΡΟΚΑΡνΤΙ (8Εφ ΙΌ Ν0:2);
    ΟΤΤΡΑφΟΝδΜΡΡδΟΟΟΤΚΡΤΌΟΝΟ (8Εφ ΙΌ Ν0:3) и
    ΤΚΙΕΤΙΡφδΕΌδΟΤΚΡΤΌΟΝΟ (8Εφ ΙΌ Ν0:4).
  33. 33. Способ по п.22, причем молекулярный вес упомянутой биомолекулы составляет от примерно 0,5 до примерно 100 кДа.
  34. 34. Способ по п.22, причем упомянутый способ осуществляют в отсутствии протеолитического фермента, способного к расщеплению упомянутой биомолекулы и упомянутого участка наживки.
  35. 35. Иммуноген, включающий биомолекулу с нуклеофильной группой в комплексе с α2макроглобулином, имеющим интактный участок наживки, причем упомянутая биомолекула имеет как минимум один эпитоп, причем упомянутый а2-макроглобулин способен связываться с а2-макроглобулиновым рецептором, упомянутый комплекс включает как минимум одну интактную биомолекулу и активированный а2-макроглобулин с интактным участком наживки, где каждая из упомянутых интактных биомолекул с нуклеофильной группой связана с упомянутым активированным а2-макроглобулином через связь, состоящую из упомянутой нуклеофильной группы, ковалентно связанной с γ-глутамиловой группой упомянутого расщепленного сложного тиолового эфира упомянутого а2-макроглобулина.
  36. 36. Иммуноген по п.35, причем упомянутая биомолекула выбрана из группы, состоящей из пептидов, белков, углеводов, цитокинов, факторов роста, гормонов, ферментов, токсинов, антисмысловой РНК, лекарственных препара тов, олигонуклеотидов, жиров, ДНК, антигенов, иммуногенов, аллергенов и их комбинаций.
  37. 37. Иммуноген по п.36, причем упомянутый антиген выбран из группы, состоящей из ВИЧ-антигенов, антигенов вирусного гепатита, их пептидов, их фрагментов, их гибридных пептидов, их химерных пептидов и их гибридных синтетически пептидов.
  38. 38. Иммуноген по п.37, причем упомянутые антигены или фрагменты вируса ВИЧ содержат др120, др160 или их фрагмент.
  39. 39. Иммуноген по п.37, причем упомянутые антигены вирусного гепатита или их фрагменты содержат НЬкЛд или его фрагмент.
  40. 40. Иммуноген по п.35, причем упомянутая биомолекула выбрана из группы, состоящей из ΚρίΙΝΜΑρΕνΟΚΑΜΥΑΟΤΒΡΝΥΝΚΚΚΒΙΗΙΟ ΡΟΒΑΕΥΤΤΚ (8ΕΟ ΙΌ N0:1); ΚρίΙΝΜψρΕνΟΚΑΜΥΑΟΤΒΡΝΝΝΤΒΚδΙΒίρ ΒΟΡΟΒΑΕνΤΙ (8ΕΟ ΙΌ Ν0:2);
    ΟΤΤΡΑρΟΝδΜΕΡδΟΟΟΤΚΡΤΌΟΝΟ (8ΕΟ ΙΌ Ν0:3) и
    ΤΒΙΕΤΙΡρδΌΌδΟΤΚΡΤΌΟΝΟ (8ΕΟ ΙΌ Ν0:4).
  41. 41. Иммуноген по п.35, причем молекулярный вес упомянутой биомолекулы составляет от примерно 0,5 до примерно 100 кДа.
  42. 42. Вакцина, включающая стабильный комплекс, включающий как минимум одну интактную биомолекулу с нуклеофильной группой и активированный а2-макроглобулин, несущий интактный участок наживки, причем каждая из упомянутых интактных биомолекул с нуклеофильной группой связана с упомянутым активированным а2-макроглобулином через связь, состоящую из упомянутой нуклеофильной группы, ковалентно связанной с γ-глутамиловой группой упомянутого расщепленного сложного тиолового эфира упомянутого а2-макроглобулина, способного к связыванию рецептора а2-макроглобулина.
  43. 43. Вакцина по п.42, причем упомянутая биомолекула выбрана из группы, состоящей из пептидов, белков, углеводов, цитокинов, факторов роста, гормонов, ферментов, токсинов, антисмысловой РНК, лекарственных препаратов, олигонуклеотидов, жиров, ДНК, антигенов, иммуногенов, аллергенов и их комбинаций.
  44. 44. Вакцина по п.43, причем упомянутый антиген выбран из группы, состоящей из ВИЧантигенов, антигенов вирусного гепатита, их пептидов, их фрагментов, их гибридных пептидов, их химерных пептидов и их гибридных синтетически пептидов.
  45. 45. Вакцина по п.44, причем упомянутые антигены или фрагменты вируса ВИЧ содержат др120, др160 или их фрагмент.
  46. 46. Вакцина по п.44, причем упомянутые антигены вирусного гепатита или их фрагменты содержат НЬ^д или его фрагмент.
  47. 47. Вакцина по п.42, причем упомянутая биомолекула выбрана из группы, состоящей из ΚρΙΙΝΜΑΡΕνΟΚΑΜΥΑΟΤΡΡΝΥΝΚΒΚΒΙΗΙΟ ΡΟΒΑΕΥΤΤΚ (8ΕΟ ΙΌ Ν0:1); ΚρΙΙΝΜΑΡΕνΟΚΑΜΥΑΟΤΡΡΝΝΝΤΒΚδΙΚίρ ΒΟΡΟΒΑΕνΤΙ (8ΕΟ ΙΌ Ν0:2);
    ΟΤΤΡΑρΟΝδΜΕΡδΟΟΟΤΚΡΤΌΟΝΟ (8ΕΟ ΙΌ Ν0:3) и
    ΤΒΙΕΤΙΡρδΌΌδΟΤΚΡΤΌΟΝΟ (8ΕΟ ΙΌ Ν0:4).
  48. 48. Вакцина по п.42, причем упомянутая биомолекула имеет молекулярный вес от примерно 0,5 до примерно 100 кДа.
  49. 49. Способ увеличения степени ковалентного связывания биомолекулы с а2-макроглобулином для образования биомолекула-а2макроглобулинового комплекса, полученного по п.22, причем перед реакцией упомянутой биомолекулы с упомянутым нуклеофилактивированным а2-макроглобулином, упомянутую биомолекулу обрабатывают мягким окислителем.
  50. 50. Способ по п.49, причем упомянутым окислителем является Ν-хлорбензолсульфонамид.
  51. 51. Стабильный комплекс, включающий как минимум одну интактную биомолекулу с нуклеофильной группой и активированный α2макроглобулин, несущий интактный участок наживки, причем каждая из упомянутых интактных биомолекул с нуклеофильной группой связана с упомянутым активированным α2макроглобулином через связь, состоящую из упомянутой нуклеофильной группы, ковалентно связанной с γ-глутамиловой группой упомянутого расщепленного сложного тиолового эфира упомянутого а2-макроглобулина, причем упомянутый комплекс получают способом, включающим стадии
    ί) активации упомянутого а2-макроглобулина в форму нуклеофил-активированного а2-макроглобулина путем инкубации упомянутого а2-макроглобулина с нуклеофильным веществом в отсутствие протеиназы, способной расщепить участок наживки;
    ίί) удаления остатка упомянутого нуклеофильного вещества и
    ш) инкубации упомянутого нуклеофилактивированного а2-макроглобулина с упомянутой биомолекулой в течение периода времени, достаточного для образования упомянутого комплекса.
  52. 52. Стабильный комплекс по п.51, причем упомянутая биомолекула выбрана из группы, состоящей из пептидов, белков, углеводов, цитокинов, факторов роста, гормонов, ферментов, токсинов, антисмысловой РНК, лекарственных препаратов, олигонуклеотидов, жиров, ДНК, антигенов, иммуногенов, аллергенов и их комбинаций.
  53. 53. Стабильный комплекс по п.52, причем упомянутый антиген выбран из группы, со55 стоящей из ВИЧ-антигенов, антигенов вирусного гепатита, их пептидов, их фрагментов, их гибридных пептидов, их химерных пептидов и их гибридных синтетически пептидов.
  54. 54. Стабильный комплекс по п.53, причем упомянутые антигены или фрагменты вируса ВИЧ содержат др120, др160 или их фрагмент.
  55. 55. Стабильный комплекс по п.53, причем упомянутые антигены вирусного гепатита или их фрагменты содержат НЬ5Αд или его фрагмент.
  56. 56. Стабильный комплекс по п.52, причем упомянутая биомолекула выбрана из группы, состоящей из
    Κ^IINΜV^ΕV6ΚΑΜΥΑСΤΚΡNΥNΚВΚВIНЮ ΡΟΒΑΕΥΤΤΚ (8ΕΟ ΙΌ Ν0:1);
    ΚρΙΙΝΜνρΕν6ΚΑΜΥΑσΓΒΡΝΝΝΤΚΚ8ΙΚΐρ ΚΟΡΟΚΑΕνΤΙ (8ΕΟ ΙΌ Ν0:2);
    СΤΤΡΑ^6N8ΜΕΡ8СССΤΚΡΤ^6NС (8ΕΟ ΙΌ Ν0:3) и
    ΤΒΙΕΤΙΡρ8ΌΌ8ΟΤΚΡΤΌ6^ (8ΕΟ ΙΌ Ν0:4).
  57. 57. Стабильный комплекс по п.51, причем упомянутая биомолекула имеет молекулярный вес от примерно 0,5 до примерно 100 кДа.
  58. 58. Стабильный комплекс по п.51, причем упомянутое нуклеофильное вещество имеет формулу ΒΝΉ2, где В выбран из группы, со стоящей из водорода и алкильной группы с числом углеродных атомов от 1 до 6.
  59. 59. Стабильный комплекс по п.58, причем упомянутое нуклеофильное вещество выбрано из группы, состоящей из аммиака, метиламина, этиламина и их комбинаций.
  60. 60. Стабильный комплекс по п.51, причем упомянутую инкубацию упомянутого нуклеофил-активированного а2-макроглобулина с упомянутой биомолекулой проводят в температурном диапазоне от примерно 35 до примерно 55°С.
  61. 61. Стабильный комплекс по п.60, причем упомянутую стадию инкубации проводят в температурном диапазоне от примерно 37 до примерно 50°С и в период времени от примерно 1 до примерно 24 ч.
  62. 62. Стабильный комплекс по п.61, причем диапазоны температуры и времени упомянутой инкубации выбраны из температуры примерно 37°С для примерно 24 ч и температуры примерно 50°С для диапазона от примерно 1 до примерно 5 ч.
  63. 63. Стабильный комплекс по п.51, причем упомянутый стабильный комплекс является им муногеном, антиген-представляющим комплексом или вакциной.
EA200000974A 1998-04-01 1999-04-01 МОДУЛЯТОР ИММУННОГО ОТВЕТА α- МАКРОГЛОБУЛИНОВЫЙ КОМПЛЕКС EA004228B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5330198A 1998-04-01 1998-04-01
US09/282,826 US6403092B1 (en) 1998-04-01 1999-03-31 Immune response modulator alpha-2 macroglobulin complex
PCT/US1999/007236 WO1999050303A2 (en) 1998-04-01 1999-04-01 Immune response modulator alpha-2 macroglobulin complex

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200000974A1 EA200000974A1 (ru) 2001-06-25
EA004228B1 true EA004228B1 (ru) 2004-02-26

Family

ID=26731680

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200000974A EA004228B1 (ru) 1998-04-01 1999-04-01 МОДУЛЯТОР ИММУННОГО ОТВЕТА α- МАКРОГЛОБУЛИНОВЫЙ КОМПЛЕКС

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20020127232A1 (ru)
JP (1) JP2003528025A (ru)
AP (1) AP2000001938A0 (ru)
AU (1) AU754988B2 (ru)
CA (1) CA2324864A1 (ru)
EA (1) EA004228B1 (ru)
OA (1) OA11536A (ru)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2023211165A1 (en) * 2022-01-31 2024-07-25 Aarhus Universitet A biopharmaceutical prodrug platform based on protein conformational change

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5873994A (en) * 1992-12-18 1994-07-19 Duke University Immune response modulator complex, and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
OA11536A (en) 2004-05-17
CA2324864A1 (en) 1999-10-07
US20020127232A1 (en) 2002-09-12
AU3463999A (en) 1999-10-18
JP2003528025A (ja) 2003-09-24
AU754988B2 (en) 2002-11-28
AP2000001938A0 (en) 2000-12-31
EA200000974A1 (ru) 2001-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6403092B1 (en) Immune response modulator alpha-2 macroglobulin complex
US5969109A (en) Chimeric antibodies comprising antigen binding sites and B and T cell epitopes
KR100263359B1 (ko) IgE 관련 알레르기 반응의 치료용 IgE의 입실론 사슬의 정상부로 구성된 백신
US5807552A (en) Compositions for conferring immunogenicity to a substance and uses thereof
US5166050A (en) Monoclonal antibodies and peptides useful in treating and diagnosing HIV infections
EP0157643A2 (en) Antibodies to human interleukin-2 induced by synthetic polypeptides
BE1000811A4 (fr) Anticorps monoclonaux, peptides et compositions les contenant, destinees au diagnostic et au traitement des infections par le virus hiv.
NZ222031A (en) Luteinising hormone-releasing hormone (lhrh) analogues, dna coding for the analogues, and vaccines.
JPS60155133A (ja) アンチ−イデイオタイプのモノクロナル抗体を採用したアンチ−イデイオタイプワクチン
WO1991008220A1 (en) A method for the stepwise, controlled synthesis of chemical species, particularly peptides, coupled products obtained by the method and the use of these coupled products, e.g. as vaccines
JPH08510240A (ja) C型肝炎ウイルスe2/ns1領域の保存モチーフ
CA1270099A (en) Immunogenic hav peptides
EA004228B1 (ru) МОДУЛЯТОР ИММУННОГО ОТВЕТА α- МАКРОГЛОБУЛИНОВЫЙ КОМПЛЕКС
Hillman et al. A polymer containing a repeating peptide sequence can stimulate T-cell-independent IgG antibody production in vivo
CN114316053B (zh) 一种vce的单克隆抗体及其制备方法
AU4250393A (en) Methods and agents for modulating immune response, and uses thereof
US11801292B2 (en) Polypeptide epitopes of S. aureus and respective monoclonal antibodies for the treatment of infections and immune-diagnosis
JP3780421B2 (ja) ヒト免疫不全ウイルスに対するワクチンおよびその製造方法
ES2350901T3 (es) Polipéptidos aislados basados en el epítopo neutralizante de la proteína p17 del vih útiles como vacunas, y anticuerpos anti-p17 neutralizantes que reconocen específicamente dicho epítopo neutralizante.
CN114262378A (zh) 一种omt的单克隆抗体及其制备方法
MXPA00009626A (en) Immune response modulator alpha-2 macroglobulin complex
JP2002543090A (ja) インターフェロンα2に由来するペプチドホモダイマーおよびペプチドヘテロダイマー
Michaelides Chemical and enzymatic fragmentation of tetanus toxin and immunological studies on anti-tetanus toxin and toxoid sera.
WO1996008516A1 (en) PORCINE ANTIBODIES TO TNF-α(ALPHA)
JP2004041084A (ja) ヘリコバクター・ピロリ菌に対するワクチン用ペプチド、それをコードする遺伝子、その遺伝子が導入された形質転換体、及びそれらの利用方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU