CN114316053B - 一种vce的单克隆抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种结合VCE的单克隆抗体及其制备方法，属于免疫领域。本发明提供的结合VCE的单克隆抗体可用于检测mRNA疫苗生产过程中残留的VCE。

Description

一种VCE的单克隆抗体及其制备方法

技术领域

本发明属于免疫学领域，具体涉及一种VCE的单克隆抗体。本发明还涉及该单克隆抗体的制备方法及其用途。

背景技术

mRNA是“信使核糖核酸”。作为“信使”，mRNA最主要的功能就是传递转录DNA信息，将生产各类蛋白质的模板指令传递出去。当人体细胞内加工蛋白质的“工厂”接收到这一指令，就会启动蛋白质合成过程。1987年底，Robert Malone将mRNA与脂肪滴混在一起，发现人体细胞可以吸收这些加入脂滴的mRNA，并且产生了蛋白质(Malone et al Sci.USA86，6077-6081(1989))。这一发现成为mRNA体内表达首次成功的尝试，也证明了mRNA疫苗的可行性。此后，经过30年的研究发展，重大的技术创新和研究投资使mRNA成为一种在疫苗开发和癌症治疗领域的重要工具。

mRNA疫苗在通过特定的递送系统进入人体后，利用人体的转录以及翻译系统生成具有特定免疫原性的蛋白质，这些蛋白质被抗原呈递细胞(APC)识别后，诱树突状细胞的成熟进而激活B细胞以及T细胞产生强烈的免疫应答，引发体液和细胞双重免疫反应，形成免疫记忆。而传统疫苗鲜少有报道可产生细胞免疫。从生产工艺来讲，mRNA疫苗具有生产工艺简单、开发速度快、不需要细胞培养、成本低等显著的优势。

在实际应用中，一方面，mRNA和细胞膜都带负电荷，所以需要递送系统有效包裹mRNA，使其不被会被存在于血液和组织中的RNA酶降解，另一方面，真核体系中的mRNA都具有帽子结构让mRNA在细胞内稳定表达，疫苗IVT过程中的mRNA需要这样的修饰，所以牛痘病毒加帽酶(Vaccine Capping Enzyme,VCE)可在mRNA疫苗中对外源抗原mRNA进行加帽，使其在细胞内稳定表达。生物体内的帽子结构有cap0，cap1，cap2三种形式，单细胞真核生物mRNA主要是cap0帽子，即第一个甲基出现在所有真核细胞的mRNA中，由鸟苷酸-7甲基转移酶催化；真核细胞中mRNA主要以cap1帽子结构为主，在第二个核苷酸的2’-OH位上加另一个甲基，由2’-O-甲基转移酶完成。牛痘病毒加帽酶由D12和D1两个亚基构成，D1亚基具有RNA三磷酸酶和鸟苷转移酶活性，D12亚基具有鸟嘌呤甲基转移酶活性，所以牛痘病毒加帽酶能够在mRNA的5’端添加cap0帽子，效率达到100％，并且方向正确。

检测VCE的残留也是重要的环节，因此，开发出一个高灵敏性、高特异性的检测抗VCE残留的单克隆抗体迫在眉睫。

发明内容

本发明目的在于提供特异性结合VCE(牛痘病毒加帽酶)的分离的抗体或其抗原结合片段，用于检测VCE的残留。

本发明的第一方面，提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：

(a)重链可变结构域(VH)，所述重链可变结构域包含：

SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的HCDR2，和SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的HCDR3；以及

(b)轻链可变结构域(VL)，所述轻链可变结构域包含：

SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的LCDR2，和SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的LCDR3；

其中所述抗体或其抗原结合片段能够特异性地结合至VCE，优选的所述VCE包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含SEQID NO:7所示氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段是啮齿动物的、嵌合的、人的、部分人源化的、或完全人源化的。

在一些实施方案中，所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段是鼠源的。

在一些实施方案中，所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的重链恒定结构域(CH)和SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的轻链恒定结构域(CL)。

本发明第二方面，提供制备第一方面所述的分离的抗体或其抗原结合片段的方法。

在一些实施方案中，所述通过使用VCE作为抗原对小鼠进行免疫获得小鼠脾细胞之后进行杂交瘤融合，获得杂交瘤细胞，筛选能够分泌表达结合VCE的抗体的杂交瘤细胞；对杂交瘤细胞进行测序，获得抗体的可变结构域及恒定结构域氨基酸序列和核酸序列，根据上述序列信息重组表达所需抗体。

在一些实施方案中，所述VCE的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。

本发明第三方面，提供一种试剂盒，其包含本发明第一方面所述分离的抗体或其抗原结合片段，并且包含能够结合所述VCE的第二分离的抗体或其抗原结合片段；其中，所述第二分离的抗体或其抗原结合片段与所述分离的抗体或其抗原结合片段结合在所述VCE的不同表位。

在一些实施方案中，所述的分离的抗体或其抗原结合片段包含：(a)重链可变结构域(VH)，所述重链可变结构域包含：SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的HCDR2，和SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的HCDR3；以及(b)轻链可变结构域(VL)，所述轻链可变结构域包含：SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的LCDR2，和SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗体或其抗原结合片段能够特异性地结合至VCE，优选的所述VCE包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的VCE。

在一些实施方案中，所述VH包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述的分离的抗体或其抗原结合片段，还包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的重链恒定结构域(CH)和SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的轻链恒定结构域(CL)。

本发明的第四方面，提供另一种试剂盒，其包含第一方面所述分离的抗体或其抗原结合片段，并且包含能够结合所述VCE的第二分离的抗体或其抗原结合片段；其中，所述第二分离的抗体或其抗原结合片段与所述分离的抗体或其抗原结合片段非竞争性地结合所述VCE。

在一些实施方案中，所述的分离的抗体或其抗原结合片段包含：(a)重链可变结构域(VH)，所述重链可变结构域包含：SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的HCDR2，和SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的HCDR3；以及(b)轻链可变结构域(VL)，所述轻链可变结构域包含：SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的LCDR2，和SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗体或其抗原结合片段能够特异性地结合至VCE，优选的所述VCE包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的VCE。

在一些实施方案中，所述VH包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述的分离的抗体或其抗原结合片段，还包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的重链恒定结构域(CH)和SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的轻链恒定结构域(CL)。

本发明的第五方面，提供一种检测mRNA疫苗制备过程中VCE残留的方法，其采用上述分离的抗体或抗原结合蛋白、上述试剂盒对VCE残留进行检测。

本发明的第六方面，提供上述抗体或抗原结合蛋白、含上述抗体或抗原结合片段的试剂盒在mRNA疫苗生产中的应用。本发明所述的mRNA疫苗生产中的应用，指的是疫苗生产的各个环节中的应用，包括但不限于生产过程中、生产结束，任何生产环节涉及VCE残留的情况都可以应用本发明的抗体或抗原结合片段及其试剂盒对残留VCE进行去除。

本发明的第七方面，提供前述试剂盒在酶联免疫反应中的用途。

本发明还提供编码所述的分离的抗体或其抗原结合片段的核酸；本发明还提供包含所述核酸的载体，其能够表达所述的分离的抗体或其抗原结合片段的核酸；本发明还提供包含所述载体的宿主细胞。

本发明的氨基酸序列信息如表1所示：

表1氨基酸序列

术语

应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。

术语“表位”意指能够特异性地结合至抗体的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团(诸如氨基酸或糖侧链)组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象性表位和非构象性表位的区别在于，在变性溶剂的存在下，与前者而非后者的结合丧失。

术语“抗体”、“抗体部分”、“抗原结合片段”或“抗体构建体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、全长抗体及其抗原结合片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性即可。

基本的4链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本异四聚体单元以及称为J链的另外多肽组成，并且含有10个抗原结合位点，而IgA抗体包含2-5个基本4链单元，所述基本4链单元可以聚合形成与J链组合的多价聚集物。在IgG的情况下，4链单元通常为约150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两条H链根据H链同种型通过一个或多个二硫键彼此连接。每条H和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条H链在N末端具有一个可变结构域(VH)，随后是每条α和γ链的三个恒定结构域(CH)以及μ和ε同种型的四个CH结构域。每条L链在N末端具有一个可变结构域(VL)，随后是在其另一末端的一个恒定结构域。VL与VH对齐，并且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐。据信特定的氨基酸残基在轻链可变结构域与重链可变结构域之间形成界面。VH和VL一起配对形成单个抗原结合位点。对于不同类别抗体的结构和特性，参见例如，Basic and Clinical Immunology,第8版,Daniel P.Sties,Abba I.Terr和TristramG.Parsolw(编辑),Appleton&Lang e,Norwalk,Conn.,1994,第71页和第6章。根据其恒定结构域的氨基酸序列，可以将来自任何脊椎动物物种的L链分配为两种明显不同的类型(称为κ和λ)中的一种。取决于其重链恒定结构域(CH)的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分配为不同类别或同种型。免疫球蛋白有五个类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，它们分别具有命名为α、δ、ε、γ和μ的重链。根据CH序列和功能的相对小的差异，将γ和α类别进一步分成亚类。

“分离的”抗体是已经从其生产环境的组分(例如，天然或重组)中鉴定、分离和/或回收的一种抗体。优选地，分离的多肽不与来自其生产环境中的所有其他组分缔合。其生产环境的污染组分(诸如由重组转染细胞产生的污染组分)是通常干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素以及其他蛋白质或非蛋白质溶质。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，将不存在抗体天然环境的至少一种组分。然而，通常，分离的多肽、抗体或构建体将通过至少一个纯化步骤来制备。

抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别被称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体的变化最大的部分(相对于相同类别的其他抗体)，并且含有抗原结合位点。

术语“可变的”是指可变结构域的某些区段在抗体之间序列差异很大的事实。V结构域介导抗原结合并且限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在可变结构域的整个范围内不是均匀分布。相反，它集中在轻链可变结构域和重链可变结构域中的三个称为互补决定区(CDR)或高变区(HVR)的区段中。可变结构域的更高度保守的部分被称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含由三个CDR连接的、主要采用β-折叠构型的四个FR区，所述三个CDR形成环，所述环连接β-折叠结构并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区紧密结合在一起，并且与另一条链中的CDR一起有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人,Sequences of Immunologi cal Interest,第五版,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但是展现出多种效应子功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除可以少量存在的可能的天然发生的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、脱酰胺)以外构成群体的单独抗体是相同的。单克隆抗体具有高度特异性，针对单个抗原位点。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优势在于它们是由杂交瘤培养物合成的，不受其他免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表示从基本均质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，可通过多种技术来制备根据本申请使用的单克隆抗体，所述技术包括例如杂交瘤方法(例如,Kohler和Milstei n.,Nature,256:495-97(1975)；Hongo等,Hybridoma,14(3):253-260(1995)；Harlow等,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1988)；Hammerling等,Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))；重组DNA方法(参见例如，美国专利号4,816,567)；噬菌体展示技术(参见例如，Clackson等,Nature,352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004))。

术语“恒定结构域”是指免疫球蛋白分子的一部分，所述部分相对于所述免疫球蛋白的另一部分(即可变结构域)具有更保守的氨基酸序列，其含有抗原结合位点。恒定结构域含有重链的CH1、CH2和CH3结构域(统称为CH)以及轻链的CHL(或CL)结构域。

术语“互补决定区”或“CDR”用于指由Kabat系统所定义的高变区。参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)。

如本文所用，术语“特异性地结合”、“特异性地识别”或“对……特异”是指可测量和可再现的相互作用诸如靶标与抗原结合蛋白(诸如mAb)之间的结合，所述结合决定了在包括生物分子的异质分子群体的存在下所述靶标的存在。例如，特异性地结合靶标(其可以是表位)的抗原结合蛋白(诸如mAb)是以更大的亲和力、亲合力、更容易地和/或以比其结合其他靶标更长的持续时间结合此靶标的抗原结合蛋白(诸如mAb)。在一些实施方案中，如例如通过放射免疫测定(RIA)所测量，抗原结合蛋白(诸如mAb)与不相关靶标的结合程度为所述抗原结合蛋白(诸如mAb)与所述靶标的结合的小于约10％。在一些实施方案中，特异性地结合靶标的抗原结合蛋白(诸如mAb)具有以下解离常数(KD)：≤10-5M、≤10-6M、≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、≤10-11M、或≤10-12M。在一些实施方案中，抗原结合蛋白特异性地结合蛋白质上的表位，所述表位在来自不同物种的蛋白质中是保守的。在一些实施方案中，特异性结合可以包括但不要求排他结合。

附图简述

图1显示了全长抗VCE单克隆抗体SDS-PAGE电泳结果。

图2显示了功能最佳的VCE单克隆抗体与VCE结合结果。

具体实施方式

实施例1VCE抗体的制备

用VCE免疫小鼠，首免100ug，二免50ug，三免50ug，四免50ug，再制备杂交瘤细胞，筛选得到编号为E7-2、E7-3、E7-6、E7-7的杂交瘤，之后进行杂交瘤细胞的克隆化，详细参见(Proetzel,Gabriele；Ebersbach,Hilmar(2012).[Methods in Molecular Biology]Antibody Methods and Protocols Volume 901||Hybridoma Technology for theGeneration of Monoclonal Antibodies.,10.1007/978-1-61779-931-0(Chapter 7),117–135)。

VCE氨基酸序列：

MDANVVSSSTIATYIDALAKNASELEQRSTAYEINNELELVFIKPPLITLTNVVNISTIQESFIRFTVTNKEGVKIRTKIPLSKVHGLDVKNVQLVDAIDNIVWEKKSLVTENRLHKECLLRLSTEERHIFLDYKKYGSSIRLELVNLIQAKTKNFTIDFKLKYFLGSGAQSKSSLLHAINHPKSRPNTSLEIEFTPRDNETVPYDELIKELTTLSRHIFMASPENVILSPPINAPIKTFMLPKQDIVGLDLENLYAVTKTDGIPITIRVTSNGLYCYFTHLGYIIRYPVKRIIDSEVVVFGEAVKDKNWTVYLIKLIEPVNAINDRLEESKYVESKLVDICDRIVFKSKKYEGPFTTTSEVVDMLSTYLPKQPEGVILFYSKGPKSNIDFKIKKENTIDQTANVVFRYMSSEPIIFGESSIFVEYKKFSNDKGFPKEYGSGKIVLYNGVNYLNNIYCLEYINTHNEVGIKSVVVPIKFIAEFLVNGEILKPRIDKTMKYINSEDYYGNQHNIIVEHLRDQSIKIGDIFNEDKLSDVGHQYANNDKFRLNPEVSYFTNKRTRGPLGILSNYVKTLLISMYCSKTFLDDSNKRKVLAIDFGNGADLEKYFYGEIALLVATDPDADAIARGNERYNKLNSGIKTKYYKFDYIQETIRSDTFVSSVREVFYFGKFNIIDWQFAIHYSFHPRHYATVMNNLSELTASGGKVLITTMDGDKLSKLTDKKTFIIHKNLPSSENYMSVEKIADDRIVVYNPSTMSTPMTEYIIKKNDIVRVFNEYGFVLVDNVDFATIIERSKKFINGASTMEDRPSTRNFFELNRGAIKCEGLDVEDLLSYYVVYVFSKR

实施例2单克隆抗体的表达以及纯化

将实施例1筛选到的杂交瘤细胞裂解后提取mRNA，再将mRNA逆转录之后形成cDNA，cDNA进行一轮扩增之后，调取IgG重、轻链基因片段，之后将调取的IgG重、轻链基因片段拼接入表达载体中来构建质粒。质粒采用ExpiCHO^TM Reagent共转染HEK293悬浮培养细胞进行瞬时表达。转染时，细胞密度维持在6×10⁶细胞/mL，ExpiCHO^TM Reagent:DNA(质粒)比例为4:1。细胞在37℃，8％CO₂培养箱中120转/分钟震荡培养。转染转染16-18h后，加入180μLExpiFectamine^TMCHO Enhance和4.8mL ExpiCHO^TMFeed，随后转移至32℃，5％，120rpm摇床培养。转染11天后收集细胞上清。0.22μm滤膜过滤后进行纯化。纯化之前，将管道和蛋白A柱用0.2M NaOH去热原。将柱用含有0.05M Tris和1.5M NaCl(pH8.0)的缓冲液重新平衡。随后将收获的细胞培养物上清液使用2×上述缓冲液1:1稀释并过滤除菌。将过滤的上清液和蛋白A柱室温孵育2小时，用并1×上述缓冲液洗涤柱后，使用无菌0.1M柠檬酸钠(pH3.5)洗脱IgG，收集了洗脱液并用九分之一体积的无菌1M Tris-HCl(pH9)中和。在无菌条件下，将所述产品缓冲液交换为PBS(pH7.4)以除去任何的洗脱缓冲液并浓缩所述样品。浓缩之后，使用1.43的消光系数Ec(0.1％)通过OD280nm对抗体进行定量。

沿用杂交瘤的编号对抗体进行编号，纯化的E7-2、E7-3、E7-6、E7-7抗体通过BioRad电泳系统用10％预制胶(GenScript)在50mM二硫苏糖醇还原条件下通过SDS-PAGE来分析。将所述凝胶用Estain2.0(GenScript)染色并通过比较染色带与Protein Ladder(GenScript)来估计分子大小。图1结果显示E7-2、E7-3、E7-6、E7-7抗体均呈现分子量为50kDa和25KDa的两条带，分别为抗体的重链和轻链。泳道1：E7-2；泳道2：7-3；泳道3：E7-6；泳道4：7-7；泳道5：蛋白maker。

实施例3VCE单克隆抗体的结合活性验证

3.1包被抗原：使用包被液(1.59g无水碳酸钠，2.93g无水碳酸氢钠溶于1000ml蒸馏水中，购自国药)将2ug/ml的VCE加到反应板酶标孔中，每孔100μL，将反应板加盖放于4℃过夜包被，上层为液体，包被后的VCE吸附在反应板上。

3.2封闭：用洗涤液每孔350μL冲洗反应板一次以洗去包被液，在吸水纸上将反应板中洗涤液(氯化钠8g、磷酸二氢钾0.5g、磷酸氢二钠2.9g、Tween20 0.5ml溶于1000ml蒸馏水中，购自国药)拍干，每孔迅速加入100-200μL封闭液置于37℃培养箱，孵育2h；倒去封闭液(牛血清白蛋白5克溶于100ml洗涤缓冲液中，购自国药)，甩板机甩干或在吸水纸上拍干封闭液，即可使用反应板，如不立即使用，反应板应放于密封袋中并加入干燥包置于2-8℃保存，干燥包需位于反应板板底，不能接触反应板孔。

3.3加待测样品：反应板平衡至室温后从密封袋中拿出，每孔加入100ul E7-2、E7-3、E7-6、E7-7，起始浓度为5000ng/ml，2倍倍比梯度稀释至0.3ng/ml，在微型振荡器上振荡60秒使孔内液体混合均匀，置于37℃培养箱，孵育1小时。

34加酶标结合物：使用样本稀释液按1：20000稀释二抗-HRP，小心揭下板贴，每孔加入100μL稀释好的二抗-HRP(Jackson Immuno Research，115-005-008自产)，更换板贴并贴好，在微型振荡器上振荡60秒使孔内液体混合均匀，置于37℃培养箱，孵育1h小时。

3.5洗板：小心揭下板贴，用1x洗涤液冲洗反应板六次(推荐使用洗板机，每孔加液量350μL)，最后在吸水纸上拍干或甩板机甩干。

3.6显色：将显色A液(醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30％双氧水0.3ml，蒸馏水加至500ml，购自国药。)和B液(乙二胺四乙酸二钠0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50ml，TMB 0.15g，蒸馏水加至500ml，购自国药。)按体积比1:1混匀成显色工作液，每孔加入显色工作液100μL，更换板贴并贴好，置于37℃避光反应10分钟。

3.7读数：

小心揭下板贴，每孔加入终止液50μL终止反应，用酶标仪450nm单波长检测，测定各孔的吸光值。各组反应数据如表2：

表2各抗体在450nm单波长下的吸光值

抗体浓度ng/ml	E7-2	E7-3	E7-6	E7-7
					5000	2.6623	2.567	2.8826	2.9077
2500	2.6645	2.5752	2.8877	2.7799
					1250	2.5022	2.1877	2.8241	2.6012
625	2.7006	2.2257	2.9298	2.8753
					312.5	2.5366	2.0259	2.8005	2.5302
156.25	2.4027	1.7638	2.673	2.3204
					78.125	1.8704	0.8398	2.1693	1.728
39.0625	1.3715	0.5012	1.692	1.2285
					19.53125	0.6919	0.4341	0.8616	0.6503
9.765625	0.3526	0.2306	0.4557	0.3005
					4.8828125	0.2269	0.1322	0.2442	0.2087
2.44140625	0.1405	0.0917	0.1713	0.1448
					1.220703125	0.0861	0.0662	0.1069	0.0977
0.610351563	0.063	0.0546	0.0715	0.065
					0.305175781	0.0529	0.0561	0.0619	0.0583
0	0.052	0.0715	0.0542	0.0542
					EC50	40.78	110.7	34.79	53.09
R2	0.9977	0.9886	0.9987	0.9961

以VCE抗原包被Elisa板，以不同浓度的E7-2抗体与包被于板子上的抗原分子结合，并以HRP标记的羊抗鼠IgG Fc抗体测定结合的抗体。图2结果显示E7-2抗体可结合于VCE，并呈现浓度依赖性和可饱和性。

序列表

<110> 南京诺唯赞生物科技股份有限公司

<120> 一种VCE的单克隆抗体及其制备方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asn Phe Ser Ile Thr Asn Tyr Gly

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Trp Ser Gly Gly His Thr

1 5

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Ser Asp Tyr Asp Val Ser Ile Tyr Tyr Val Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Thr Phe

1 5 10

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Arg Ser Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Gln Thr Asn Asp Asp Pro Pro Thr

1 5

<210> 7

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Asn Phe Ser Ile Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly His Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ser Asp Tyr Asp Val Ser Ile Tyr Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Met Ser Cys Ser Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr

20 25 30

Gly Asn Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Asn Pro Gln Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn

85 90 95

Asp Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 9

<211> 324

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

100 105 110

Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

115 120 125

Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

130 135 140

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

145 150 155 160

Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

165 170 175

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn

180 185 190

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro

195 200 205

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln

210 215 220

Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val

225 230 235 240

Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val

245 250 255

Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln

260 265 270

Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

275 280 285

Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

290 295 300

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His

305 310 315 320

Ser Pro Gly Lys

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

35 40 45

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

65 70 75 80

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

<210> 11

<211> 844

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Asp Ala Asn Val Val Ser Ser Ser Thr Ile Ala Thr Tyr Ile Asp

1 5 10 15

Ala Leu Ala Lys Asn Ala Ser Glu Leu Glu Gln Arg Ser Thr Ala Tyr

20 25 30

Glu Ile Asn Asn Glu Leu Glu Leu Val Phe Ile Lys Pro Pro Leu Ile

35 40 45

Thr Leu Thr Asn Val Val Asn Ile Ser Thr Ile Gln Glu Ser Phe Ile

50 55 60

Arg Phe Thr Val Thr Asn Lys Glu Gly Val Lys Ile Arg Thr Lys Ile

65 70 75 80

Pro Leu Ser Lys Val His Gly Leu Asp Val Lys Asn Val Gln Leu Val

85 90 95

Asp Ala Ile Asp Asn Ile Val Trp Glu Lys Lys Ser Leu Val Thr Glu

100 105 110

Asn Arg Leu His Lys Glu Cys Leu Leu Arg Leu Ser Thr Glu Glu Arg

115 120 125

His Ile Phe Leu Asp Tyr Lys Lys Tyr Gly Ser Ser Ile Arg Leu Glu

130 135 140

Leu Val Asn Leu Ile Gln Ala Lys Thr Lys Asn Phe Thr Ile Asp Phe

145 150 155 160

Lys Leu Lys Tyr Phe Leu Gly Ser Gly Ala Gln Ser Lys Ser Ser Leu

165 170 175

Leu His Ala Ile Asn His Pro Lys Ser Arg Pro Asn Thr Ser Leu Glu

180 185 190

Ile Glu Phe Thr Pro Arg Asp Asn Glu Thr Val Pro Tyr Asp Glu Leu

195 200 205

Ile Lys Glu Leu Thr Thr Leu Ser Arg His Ile Phe Met Ala Ser Pro

210 215 220

Glu Asn Val Ile Leu Ser Pro Pro Ile Asn Ala Pro Ile Lys Thr Phe

225 230 235 240

Met Leu Pro Lys Gln Asp Ile Val Gly Leu Asp Leu Glu Asn Leu Tyr

245 250 255

Ala Val Thr Lys Thr Asp Gly Ile Pro Ile Thr Ile Arg Val Thr Ser

260 265 270

Asn Gly Leu Tyr Cys Tyr Phe Thr His Leu Gly Tyr Ile Ile Arg Tyr

275 280 285

Pro Val Lys Arg Ile Ile Asp Ser Glu Val Val Val Phe Gly Glu Ala

290 295 300

Val Lys Asp Lys Asn Trp Thr Val Tyr Leu Ile Lys Leu Ile Glu Pro

305 310 315 320

Val Asn Ala Ile Asn Asp Arg Leu Glu Glu Ser Lys Tyr Val Glu Ser

325 330 335

Lys Leu Val Asp Ile Cys Asp Arg Ile Val Phe Lys Ser Lys Lys Tyr

340 345 350

Glu Gly Pro Phe Thr Thr Thr Ser Glu Val Val Asp Met Leu Ser Thr

355 360 365

Tyr Leu Pro Lys Gln Pro Glu Gly Val Ile Leu Phe Tyr Ser Lys Gly

370 375 380

Pro Lys Ser Asn Ile Asp Phe Lys Ile Lys Lys Glu Asn Thr Ile Asp

385 390 395 400

Gln Thr Ala Asn Val Val Phe Arg Tyr Met Ser Ser Glu Pro Ile Ile

405 410 415

Phe Gly Glu Ser Ser Ile Phe Val Glu Tyr Lys Lys Phe Ser Asn Asp

420 425 430

Lys Gly Phe Pro Lys Glu Tyr Gly Ser Gly Lys Ile Val Leu Tyr Asn

435 440 445

Gly Val Asn Tyr Leu Asn Asn Ile Tyr Cys Leu Glu Tyr Ile Asn Thr

450 455 460

His Asn Glu Val Gly Ile Lys Ser Val Val Val Pro Ile Lys Phe Ile

465 470 475 480

Ala Glu Phe Leu Val Asn Gly Glu Ile Leu Lys Pro Arg Ile Asp Lys

485 490 495

Thr Met Lys Tyr Ile Asn Ser Glu Asp Tyr Tyr Gly Asn Gln His Asn

500 505 510

Ile Ile Val Glu His Leu Arg Asp Gln Ser Ile Lys Ile Gly Asp Ile

515 520 525

Phe Asn Glu Asp Lys Leu Ser Asp Val Gly His Gln Tyr Ala Asn Asn

530 535 540

Asp Lys Phe Arg Leu Asn Pro Glu Val Ser Tyr Phe Thr Asn Lys Arg

545 550 555 560

Thr Arg Gly Pro Leu Gly Ile Leu Ser Asn Tyr Val Lys Thr Leu Leu

565 570 575

Ile Ser Met Tyr Cys Ser Lys Thr Phe Leu Asp Asp Ser Asn Lys Arg

580 585 590

Lys Val Leu Ala Ile Asp Phe Gly Asn Gly Ala Asp Leu Glu Lys Tyr

595 600 605

Phe Tyr Gly Glu Ile Ala Leu Leu Val Ala Thr Asp Pro Asp Ala Asp

610 615 620

Ala Ile Ala Arg Gly Asn Glu Arg Tyr Asn Lys Leu Asn Ser Gly Ile

625 630 635 640

Lys Thr Lys Tyr Tyr Lys Phe Asp Tyr Ile Gln Glu Thr Ile Arg Ser

645 650 655

Asp Thr Phe Val Ser Ser Val Arg Glu Val Phe Tyr Phe Gly Lys Phe

660 665 670

Asn Ile Ile Asp Trp Gln Phe Ala Ile His Tyr Ser Phe His Pro Arg

675 680 685

His Tyr Ala Thr Val Met Asn Asn Leu Ser Glu Leu Thr Ala Ser Gly

690 695 700

Gly Lys Val Leu Ile Thr Thr Met Asp Gly Asp Lys Leu Ser Lys Leu

705 710 715 720

Thr Asp Lys Lys Thr Phe Ile Ile His Lys Asn Leu Pro Ser Ser Glu

725 730 735

Asn Tyr Met Ser Val Glu Lys Ile Ala Asp Asp Arg Ile Val Val Tyr

740 745 750

Asn Pro Ser Thr Met Ser Thr Pro Met Thr Glu Tyr Ile Ile Lys Lys

755 760 765

Asn Asp Ile Val Arg Val Phe Asn Glu Tyr Gly Phe Val Leu Val Asp

770 775 780

Asn Val Asp Phe Ala Thr Ile Ile Glu Arg Ser Lys Lys Phe Ile Asn

785 790 795 800

Gly Ala Ser Thr Met Glu Asp Arg Pro Ser Thr Arg Asn Phe Phe Glu

805 810 815

Leu Asn Arg Gly Ala Ile Lys Cys Glu Gly Leu Asp Val Glu Asp Leu

820 825 830

Leu Ser Tyr Tyr Val Val Tyr Val Phe Ser Lys Arg

835 840

Claims (14)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：

(a)重链可变结构域(VH)，所述重链可变结构域包含：

SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的HCDR2，和SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的HCDR3；以及

(b)轻链可变结构域(VL)，所述轻链可变结构域包含：

SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的LCDR2，和SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的LCDR3；

其中所述抗体或其抗原结合片段能够特异性地结合至VCE。

2.权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述VCE包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列。

3.权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列。

4.权利要求1-3任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其还包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的重链恒定结构域(CH)和SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的轻链恒定结构域(CL)。

5.权利要求1-4中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段是啮齿动物的、嵌合的或部分人源化的。

6.权利要求5所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段是鼠源的。

7.编码权利要求1-6任一项所述分离的抗体或其抗原结合片段的核酸。

8.包含权利要求7所述核酸的载体。

9.包含权利要求8所述载体的宿主细胞。

10.一种试剂盒，其包含权利要求1-6任一项所述分离的抗体或其抗原结合片段，并且包含能够结合权利要求1-6任一项所述VCE的第二分离的抗体或其抗原结合片段；其中，所述第二分离的抗体或其抗原结合片段与所述分离的抗体或其抗原结合片段结合在所述VCE的不同表位。

11.一种试剂盒，其包含权利要求1-6任一项所述分离的抗体或其抗原结合片段，并且包含能够结合权利要求1-6任一项所述VCE的第二分离的抗体或其抗原结合片段；其中，所述第二分离的抗体或其抗原结合片段与所述分离的抗体或其抗原结合片段非竞争性地结合所述VCE。

12.检测mRNA疫苗制备过程中VCE残留的方法，所述方法包括使用权利要求1-6任一项所述分离的抗体或其抗原结合片段、权利要求10或11所述的试剂盒对VCE残留进行检测。

13.权利要求1-6任一项所述分离的抗体或其抗原结合片段、权利要求10或11所述的试剂盒在mRNA疫苗生产中的应用。

14.权利要求10或11所述的试剂盒在检测VCE的酶联免疫反应中的非诊断用途。