CN1244873A - 与层粘连蛋白的巢蛋白结合域结合的抗体及其制备和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与层粘连蛋白的巢蛋白结合域特异性结合的单克隆和多克隆抗体及其部分,还涉及所述抗体及其部分的制备方法,以及它们作为药物、作为检测层粘连蛋白同种型的诊断试剂、作为研究和评价影响巢蛋白/层粘连蛋白相互作用之物质的模型物质的用途。本发明的抗体或其部分优选与层粘连蛋白的γ1Ⅲ4区域结合,特别是与a和c环之高度保守区域结合,并能抑制层粘连蛋白和巢蛋白的结合。

Description

与层粘连蛋白的巢蛋白结合域结合的抗体及其制备和用途
本发明涉及与层粘连蛋白的巢蛋白结合域特异性结合的单克隆和多克隆抗体及其部分，还涉及所述抗体及其部分的制备方法，以及它们作为药物、作为检测层粘连蛋白同种型的诊断试剂、作为研究和评价影响巢蛋白/层粘连蛋白相互作用之物质的模型物质的用途。本发明的抗体或其部分优选与层粘连蛋白的γ1 III4区域结合，特别是与环a或环-a和c之高度保守区域中的必不可少的巢蛋白结合位点结合，并且能抑制层粘连蛋白和巢蛋白的结合。
层粘连蛋白(一种800kDa的糖蛋白)和巢蛋白(一种160kDa的糖蛋白)的结合被看成是基底膜合成和稳定化中一种关键性的生物分子机制[Mayer，U.& Timpl，R.(1994)：胞外基质装配和结构(P.D.Yurchenco等人编)p389-416，Academic Press，Orlando，FL]。由于巢蛋白能与基底膜所有主要成分，如含有γ1的层粘连蛋白同种型[有关其命名，见Burgeson，R.E.等(1994)，基质生物学，14：209-211]、胶原蛋白IV、基底膜聚糖和fibulin以及它们的各个结合结构形成三元复合体，因此巢蛋白可行使连接成员功能，互连、空间识别并稳定相互不同的宏观结构(Fox，J.W等(1991)EMBOJ.10：3137-3146；Aumailley，M.等(1993)Kidney Int.43：7-12)。
使用多克隆的抗层粘连蛋白抗体的实验提供了明显的证据表明：层粘连蛋白/巢蛋白之相互作用在功能性基底膜合成中起主要作用。通过用层粘连蛋白P1或重组产生的层粘连蛋白片段γ1 III 3-5免疫兔，得到了这些抗体，并通过在层粘连蛋白P1或层粘连蛋白γ1III 3-5基质上进行亲和层析浓缩了所述抗体。在抑制试验中，所述抗体完全抑制了层粘连蛋白/巢蛋白之结合，然而，这种抑制是以抗体为基础的，抗体的结合区域只是位于层粘连蛋白之巢蛋白结合序列的附近，在空间上阻隔了巢蛋白接近层粘连蛋白(Mayer，U等(1993)EMBO J.12：1879-1885)。在胚胎器官培养中，这些抗体能抑制肾小管发生，也能抑制肺泡形成。这两个过程都是依赖于基底膜不受阻挠的新合成的个体发育程序(Ekblom，P等(1994)发育120：2003-2014；Ekblom，P(1993)：基底膜的分子和细胞领域(Rohrbach，D.H. & Timpl，R.编)p359-383；Academic Press，SanDiego，CA.)。
已清楚地鉴定和表述了层粘连蛋白之巢蛋白结合域的位置和序列及其空间结构(X-射线晶体结构和NMR结构)(Mayer，U等(1993)EMBO J.12：1879-1885；Baumgartner，R等(1996)分子生物学杂志，257：658-668；Stetefeld，J等(1996)分子生物学杂志，257：644-657)。所述结合域位于层粘连蛋白γ1链短臂之γ1 III 4区域中的“LE组件”(层粘连蛋白型，表皮生长因子样)内。“LE组件”是由50-60个氨基酸组成的结构基元，所述基元表现出类似于表皮生长因子的、具有4个二硫键的复合折叠模式(Bairoch，A.(1995)胞外域的命名，SWISS-PROT蛋白质序列数据库，Release 310；Engel，J.(1989)FEBS Letters 251：1-7)。
已经阐明，对于小鼠EHS肿瘤层粘连蛋白P1、人胎盘层粘连蛋白2和层粘连蛋白4以及果蝇层粘连蛋白而言，巢蛋白以高亲合力与互补的层粘连蛋白区域结合。这种种间重叠的结合特异性出现的原因是：在所研究的诸种内层粘连蛋白γ1 III 4区域存在异常高水平的氨基酸序列同一性。当考虑到整个组件时，人和小鼠之间的上述序列同一性达到97％，人和果蝇之间的上述同一性竟然达到61％。如果将比较局限于含有必需的巢蛋白结合位点的a至c环区域，上述值分别增加至100％和75％(Pikkarinen，T等(1987)生物化学杂志，263：6751-6758；Chi，H-C. & Hui，C.F.(1989)生物化学杂志，264：1543-1550)。
除阐明了巢蛋白的结合依赖于完整的三维结构之外，也有可能鉴定出位于层粘连蛋白γ1 III 4区域之S-S稳定化的a和c环内十分确定的序列区域。鉴定出了5个必需的氨基酸：4个位于a环中7个氨基酸的区段内，一个酪氨酸位于c环侧链中(Poschl，E等(1994)EMBO J，13：3741-3747；Mayer，U等(1993)EMBO J.12：1879-1885；Poschl，E等(1996)EMBO J，15：5154-5159)。
在特殊结合试验中，可得自层粘连蛋白γ1 III 4区域之相应区域的合成肽能完全抑制层粘连蛋白/巢蛋白的结合(US5,493,008)。然而，这种合成肽在抑制试验中表现出的活性比完整的层粘连蛋白P1或层粘连蛋白γ1 III 3-5的活性约低400-10,000倍(Poschl，E等(1994)EMBO J，13：3741-3747；US 5,493,008)。层粘连蛋白/巢蛋白间相互作用受强大的构象成分影响(Mayer，U等(1993)EMBO J.12：1879-1885)。在水溶液中，肽能采取无数不同的构象，结果是仅有一部分肽以具有生物活性的构象存在，据此可解释合成肽抑制作用较弱的原因。
由于这些肽构型的灵活性，以及在蛋白酶存在下的不稳定性和弱的生物利用率和药效，使其作为药物的用途受到很大的限制(Milner-White，E.J.(1989)Trends Pharmacol.Sci.10：70-74；Hruby，V.J.(1994)：Peptides，Proc.Thirteenth AmericanPeptide Symposium；(Hodges，R.S. & Smith，J.A编)p 3-17；ESCOM：Leiden，Netherlands)。
与层粘连蛋白之巢蛋白结合域特异性结合、且在低浓度下能竞争性抑制层粘连蛋白和巢蛋白之间的结合的抗体更适于用作治疗疾病的治疗剂，因为它们具有较高的亲和力，较高程度的稳定性和令人满意的药物动力学。另外，它们也可用作诊断试剂，或用作研究和评价影响层粘连蛋白/巢蛋白间相互作用之物质的生物学和药学模型中的辅助物。
尽管以前生产的一些抗层粘连蛋白P1或抗层粘连蛋白γ1 III3-5抗体能抑制巢蛋白/层粘连蛋白结合，但它们不是直接识别层粘连蛋白γ1链的巢蛋白结合位点；反倒是空间相互作用的结果抑制了巢蛋白/层粘连蛋白结合(Mayer，U等(1993)EMBO J.12：1879-1885)。层粘连蛋白γ1链的巢蛋白结合域以种间重叠的方式超乎寻常地高度保守。除此之外，层粘连蛋白是一种胞外蛋白，它既可作为基底膜的整合组分，也可以循环血清组分的形式，持续地与免疫系统接触(EP 0696 597 A2)。由于免疫系统能区分“我”与“非我”，可以断定，每个经免疫的种均将高度保守的免疫抗原识别为其自体组分，为此不会产生任何针对此组分的抗体，因此，预期不能产生特异性的抗体滴度。迄今为止，通过用层粘连蛋白P1和层粘连蛋白γ1 III 3-5免疫兔，均未能产生任何针对层粘连蛋白巢蛋白结合域的抗体，这一事实进一步证实了上述被普遍认可的学说(Mayer，U等(1993)EMBO J.12：1879-1885)。然而，与层粘连蛋白之巢蛋白结合域外部非确切限定的表位结合的上述多克隆抗体不太适于或完全不适于用作治疗剂、诊断试剂，或用作研究和评价影响层粘连蛋白/巢蛋白相互作用之物质的模型物质：因为空间抑制作用取决于抑制剂的空间范围，因此将这些抗体的部分用作治疗剂(在药物学上以此为佳)几乎是不太可能的。另外，与并不打算检测的分析物之间可能的交叉反应限制了这些抗体在诊断试验中的应用。
本发明的目的是产生这样一类抗体，它们能与层粘连蛋白的巢蛋白结合域特异性结合，即能直接识别层粘连蛋白γ1链的巢蛋白结合域，并适于用作药物、用作检测层粘连蛋白同种型的诊断试剂，以及用作开发和评价影响层粘连蛋白/巢蛋白间相互作用之物质的模型物质。
通过下文描述的抗体以及制备和使用这些抗体的方法，可达到本发明的目的。
本发明的抗体或其部分特征性地与层粘连蛋白的巢蛋白结合域(即层粘连蛋白γ1 III 4区域)结合，优选与层粘连蛋白γ1 III 4区域的a环或a和c环之高度保守的区域结合。特别优选地，本发明的抗体以与表位有关的依赖于构象的方式(即识别层粘连蛋白之巢蛋白结合位点的天然构象；参见实施例6)，直接或以重叠的方式与a环或a环和c环之高度保守的区域结合。具体地说，本发明包括至少与表1所示的一种肽结合的抗体或其部分。本发明提供了多克隆和单克隆抗体。优选本发明的抗体是嵌合的、人源化的、双特异性或寡特异性抗体。特别优选本发明的抗体竞争性地或部分竞争性地抑制层粘连蛋白/巢蛋白间的结合(参见实施例7)。表1：用于免疫的肽的氨基酸序列(1)：          DNIDPNAVGNL
Figure A9718141200101
通过用层粘连蛋白、层粘连蛋白P1、层粘连蛋白γ1 III 3-5或层粘连蛋白γ1 III 4，特别是用含有层粘连蛋白γ1 III 4区域的必需的巢蛋白结合位点但非其整个氨基酸序列的肽，特别优选用表1所示的一种或两种肽作为免疫抗原，免疫具有免疫活性的脊椎动物，如兔、小鼠、绵羊、山羊、豚鼠、大鼠和鸡，可得到本发明的抗体。
当用层粘连蛋白或层粘连蛋白P1进行免疫时，使用层粘连蛋白γ1 III-3-5和/或层粘连蛋白γ1 III-4鉴定抗体，并最终检测其竞争性或部分竞争性地抑制层粘连蛋白/巢蛋白结合的能力。
当用层粘连蛋白γ1 III 3-5进行免疫时，使用层粘连蛋白和/或层粘连蛋白P1鉴定抗体，并最终检测其竞争性或部分竞争性地抑制层粘连蛋白/巢蛋白结合的能力。
特别优选使用层粘连蛋白γ1 III 4或表1所示的一种或多种肽作为免疫抗原。用这些免疫抗原免疫可得到的抗体优选使用层粘连蛋白和/或层粘连蛋白P1进行鉴定。检测鉴定出的抗体竞争性或部分竞争性地抑制层粘连蛋白结合位点的能力是有利的。
除了多克隆抗体之外，在下文的实例中，用起先产生的可生产单克隆抗体Mab的杂交瘤细胞也可得到单克隆抗体(Mab)。也可使用亲和层析，优选使用以层粘连蛋白和/或层粘连蛋白P1作为亲和基质的亲和层析，从含有抗体的材料(如经免疫动物的抗血清、杂交瘤细胞培养物上清液、腹水或细胞)中纯化本发明的抗体，得到纯化形式的抗体。
本发明的抗体或其部分能抑制层粘连蛋白/巢蛋白相互作用，作为一个总称说来，它们也包含相应的嵌合的、人源化的、双特异性或寡特异性抗体，和抗体类似物，在别处详细描述了这些抗体和抗体类似物。
本发明也包括产生本发明抗体和抗体部分的动物、植物和原核生物的细胞以及细胞系，优选杂交瘤DSMACC2327，根据布达佩斯条约的规定，于1997年10月27日将该杂交瘤保藏于DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德国微生物和细胞培养物保藏中心)(DSMZ，Marscheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，德国)。本发明也涉及由保藏号为DSMACC2327的杂交瘤产生的单克隆抗体。
本发明另外还包括上述抗体的制备方法，其中，使用具有免疫活性的脊椎动物，如兔、小鼠、绵羊、山羊、豚鼠、大鼠和鸡，用层粘连蛋白、层粘连蛋白P1、层粘连蛋白γ1 III 3-5和层粘连蛋白γ1 III 4，特别优选用不含有层粘连蛋白γ1 III 4区域完整的氨基酸序列的肽，更特别优选用表1所示的一种或两种肽来制备上述抗体。应理解术语“肽”包括寡肽、多肽，也包括蛋白质和蛋白质片段。当用作免疫抗原时，优选使用与载体偶联的肽，所述载体如蛋白质(如卵白蛋白、白蛋白或血蓝蛋白)，或聚合物(如聚乙二醇，聚丙烯酰胺或聚-d-谷氨酰胺-d-赖氨酸)。
当用层粘连蛋白或层粘连蛋白P1进行免疫时，使用层粘连蛋白γ1 III 3-5和/或层粘连蛋白γ1 III 4鉴定抗体，并检测其竞争性或部分竞争性地抑制层粘连蛋白/巢蛋白结合的能力。
当用层粘连蛋白γ1 III 3-5进行免疫时，使用层粘连蛋白和/或层粘连蛋白P1鉴定抗体，并检测其竞争性或部分竞争性地抑制层粘连蛋白/巢蛋白结合的能力。
优选地，在本发明方法中使用层粘连蛋白γ1 III 4，或必要时使用表1所示的一种或两种肽，优选使用与载体偶联的上述物质。
优选使用层粘连蛋白和/或层粘连蛋白P1，对用层粘连蛋白γ1III 4或用表1所示的一种或两种肽免疫产生的抗体进行鉴定，检测所述抗体竞争性或部分竞争性地抑制层粘连蛋白/巢蛋白结合的能力是有利的。
该方法也任选地包括产生可生产MAb的杂交瘤细胞。业已证实，借助于例如亲和层析，优选使用以层粘连蛋白和/或层粘连蛋白P1作为亲和基质的亲和层析，从含有抗体的材料(如经免疫动物的抗血清、杂交瘤细胞培养物上清液、腹水或细胞)中纯化本发明的抗体或其部分是有利的。
可以多种不同的方式使用本发明的抗体或其部分，例如作为药物，作为诊断试剂，作为开发和评价能影响巢蛋白/层粘连蛋白相互作用之物质的生物学和药学模型中的辅助物，例如作为模型物质，用于评估与层粘连蛋白之巢蛋白结合位点互补的接触区带的空间结构，及此接触区带潜在的结合效价，和用于研究基底膜的生物合成和在不同生理学进程(如器官发育、血管发生或胚胎发生)中基底膜的影响。本发明也包括含有本发明的一种或多种抗体或抗体部分的药物和诊断试剂。
本发明也包括本发明的一种或多种抗体或抗体部分用于下述的用途：*用于制备药物以治疗一些疾病，这些疾病有，基底膜、具体为纤维膜过量或不必要合成的疾病，尤其是酒精肝纤维变性和肺纤维变性，以及伴随着基底膜增厚(尤其是在肾脏，眼和血管系统中)的所有形式的糖尿病晚期并发症，还有动脉硬化以及因血管发生而使临床症状恶化的所有疾病，如癌症、糖尿病性视网膜病，和具有强炎性因子的疾病，如类风湿性关节炎、骨关节炎、血管炎、血管瘤和银屑病；*用于制备诊断试剂以检测生物样品、例如体液(如血液、血清、血浆、尿液、唾液或脑脊髓液)和组织中含有γ1的层粘连蛋白同种型。术语诊断试剂包括例如异种和同种免疫测定、免疫组化检测系统和如免疫闪烁扫描术的体内检测方法中所用试剂的不同实施方案。含有本发明抗体或抗体部分的制品也可以诊断试剂盒的形式或单独或与其它辅助试剂(如缓冲液、洗涤溶液、发射信号检测溶液)和/或其它辅助物(如小池)一起联合使用。
下文中，将借助于多个实施例更详细地描述和阐明本发明：
令人惊奇的是：使用表1所列的、不能形成如LE组件中所见的任何折叠模式的肽可以产生针对层粘连蛋白之巢蛋白结合域高度保守的氨基酸序列的抗体。为此，使用碳二亚胺，将表1所示的肽与卵白蛋白偶联，然后使用这些偶联物免疫兔。借助于酶免疫测定法分析针对层粘连蛋白P1和层粘连蛋白γ1 III 3-5的特异性抗体滴度的产生情况。
通过使具有所需特异性的多克隆抗体穿过结合有人胎盘层粘连蛋白P1的基质以进行亲和层析，然后再进行分子筛层析，浓缩所述抗体。EP 0696 597 A2中描述了纯化和鉴定人胎盘层粘连蛋白的方法，以及人胎盘层粘连蛋白用于免疫小鼠和分离能合成抗层粘连蛋白P1之抗体的杂交瘤的用途。
对抗血清进行层粘连蛋白P1亲和层析后得以浓缩的抗体显示出对人胎盘层粘连蛋白P1/小鼠层粘连蛋白P1(EHS肿瘤)和大鼠层粘连蛋白(卵黄囊)的结合特异性。除了能识别该特异性序列外，抗体也能识别层粘连蛋白之巢蛋白结合域的生物活性构象。它们能完全抑制层粘连蛋白/巢蛋白结合。
然而，优选地，用层粘连蛋白γ1 III 4，特别是用含有层粘连蛋白γ1 III 4区域的重要的巢蛋白结合位点但并不含有其完整的氨基酸序列的肽，特别优选用表1所示的肽免疫具有免疫活性的其它脊椎动物，如小鼠、绵羊、山羊、豚鼠、大鼠和鸡，也可得到本发明的抗体。可从经免疫动物的抗血清中纯化本发明的多克隆抗体。为了产生相应的单克隆抗体，可使用众所周知的方法(例见Harlow，E. & Lane，D.(1988)抗体：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港)，将经免疫动物(如小鼠)的免疫细胞与骨髓瘤细胞融合，以产生可生产Mab的杂交瘤细胞，然后分离适当的克隆。使用特异的筛选方法选择所需的可生产Mab的克隆。本文优选使用酶免疫测定法或放射性免疫测定法，以及Western印迹，来检查释放至培养物上清液中的抗体结合例如免疫抗原、免疫抗原载体以及天然和重组层粘连蛋白和/或其片段的特异性。另一个可能的选择标准是抗体阻止巢蛋白/层粘连蛋白结合的能力。使用例如实施例中详细描述的抑制试验可评价这种能力。已克隆出了能产生特异性地结合层粘连蛋白之巢蛋白结合域的Mab的杂交瘤，然后可将所述杂交瘤长期用于产生Mab。根据所需的目的，仅使用抗体的一部分，如F(ab)2、Fab’或Fab片段可能更为有利的。使用例如本领域技术人员已知的酶裂解法可产生这些片段(例见Harlow，E. & Lane，D.(1988)抗体：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港)。
抗体的抗原结合位点位于所谓的可变区，该可变区由相应的V基因编码。假如通过氨基酸测序的结果仍不知道该序列，也可使用已知的基因操作方法(例见Sambrook，J等(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，第2版；McCafferty，J等(1990)自然，348：552-554)测定与层粘连蛋白之巢蛋白结合域结合的抗体的相应核酸序列，从而推定其相应的氨基酸序列。杂交瘤细胞或经免疫哺乳动物之产生抗体的免疫细胞被用作分析的起始材料。
当已知核酸和氨基酸序列时，即可使用常规的基因操作和分子生物学方法(也参见Johnson，K.S. & Chiswell，D.J.(1993)结构生物学最新见解，3：564-571)制备与层粘连蛋白之巢蛋白结合域特异性结合的人源化的或嵌合的、双特异性的或寡特异性的抗体和抗体类似物，如得自互补决定区的肽(“最小识别单位”)、单链片段和功能性融合产物，具体如重组制备的抗体/酶或抗体/补体构建体。得自本发明抗体或抗体基因的这些分子包括在本文所用的总术语“抗体或其部分”中。这些分子可作如下应用：例如，当将它们作为药物施用时，可用来达到免疫原性降低和/或效力增加的目的，和/或当将它们用作诊断试剂或作为研究和评价影响层粘连蛋白/巢蛋白相互作用之物质的辅助物时，也可带来好处。可在植物(如酵母)、动物和原核细胞中制备诸抗体或其部分。
当用于体内诊断时，可通过例如用放射性同位素或顺磁化合物标记来修饰本发明的抗体及其部分，或者，可通过将药学活性物质与之结合来修饰本发明的抗体及其部分以产生甚至更有效的药物。
下文所述实施例通过举例方式阐明本发明的各个方面。实施例：
根据标准方法或生产商说明进行SDS凝胶电泳，Western印迹和BCA蛋白质测定。除非特别说明，所用化合物得自Merck(Darmstadt)，Sigma(Munich)或Riedel de Haen(Seelze)。实施例1：肽的合成
使用148mg(0.1mmol)FMOC-酰胺锚-PAM树脂以固相合成(ABI433肽合成仪)肽。完成合成之后，观察到树脂重量增加到513mg。室温下，用由10ml三氟乙酸和365μl三乙基硅烷组成的溶液将树脂处理2小时。树脂被滤去之后，通过在真空中旋转蒸发以浓缩溶液，将残留物溶解于50ml 10％乙酸(AcOH)中，然后将此溶液冻干，得到145mg(得率为54％)粗肽。然后将粗肽溶解于3ml 80％AcOH中，将此溶液滴加至快速搅拌的溶液(0.006mmol碘和0.006mmol乙酸钠于55ml 80％AcOH)中。5分钟后，加入0.1N抗坏血酸溶液以终止反应。将溶液浓缩至体积为2ml，并上样于SephadexG25柱中，用0.1MAcOH展开。然后使用反相HPLC层析得到高度纯化形式的分离肽。得率：36mg DNIDPNAVGNLKCIYNTAGFYCDR-NH2(理论值的13.5％)
通过质谱分析法(分子量：2673Da)和氨基酸分析证实结构。
按类似的方式制备肽DNIDPNAVGNL-NH2。得率：268mg(理论值的67％)；分子量：1140Da实施例2：将肽与卵白蛋白偶联
将30mg卵白蛋白(Sigma A 2512)溶解于1ml磷酸钠缓冲液，pH7.4中，然后向此卵白蛋白溶液中加入200μl含7mg N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐(Fluka 56485)的水溶液和300μl含100mg 1-乙基-3-(3-diaminaminopropyl)碳二亚胺，HCl(Sigma E 6383)的水溶液。5分钟后，加入肽溶液(30mg适当的肽溶于1ml 10mM磷酸钠缓冲液，pH7.4中)。室温下，在黑暗中进行偶联反应16小时。反应期结束时，离心溶液以除去可能已出现的任何浊物。然后通过NAP 25柱(Pharmacia)层析除去未反应的化合物和盐。这样即将卵白蛋白/肽偶联物转移至PBS+0.04％吐温20中，得率为50-55mg偶联物。偶联物1：卵白蛋白-DNIDPNAVGNL偶联物2：
Figure A9718141200161
实施例3：免疫兔
用卵白蛋白/肽偶联物免疫体重约为3kg的杂种兔。为此，将1mg各种适当的偶联物溶解于0.5ml磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，然后将此溶液与相同体积的完全弗氏佐剂混合，小心乳化全部混合物。将1ml所得乳剂皮内注射给兔；在此操作过程中，每次将1/5体积施用于局部淋巴结附近5个不同位点中的1处。21天和53天后，用半浓缩的抗原乳剂进行加强免疫注射(为此，用不完全弗氏佐剂乳化抗原)。实施例4：4只经免疫兔体内滴度的发展
通过使用经层粘连蛋白P1包被或经层粘连蛋白γ1 III 3-5包被的塑料托盘进行酶免疫测定，以详细研究4只动物体内特异性抗体滴度的发展情况。以R2，R3，R4和R905表示相应的动物血清。用偶联物1免疫得到血清R3和R4，而用偶联物2免疫得到血清R2和R905。在所有兔中，均非常快地激发了免疫反应，此免疫反应在21天后(第一次加强免疫)保持恒定，或缓慢但连续地降低。未观察到第二次加强免疫注射可重新刺激免疫应答。形成的抗体既可与层粘连蛋白P1反应，也可与层粘连蛋白γ1 III 3-5区域反应。然而，抗体与层粘连蛋白P1的结合在某种程度上不如与层粘连蛋白γ1 III3-5的结合那么显著，且在免疫反应的过程中似乎较不稳定。这可能表明在多克隆的血清中存在几个以不同亲合力与层粘连蛋白P1和层粘连蛋白γ1 III 3-5中的巢蛋白结合基元或其构象结合的抗体群。实施例5：抗体的亲和纯化
为了进一步鉴定抗体，将特异性的抗体与动物血清中剩余的免疫球蛋白、其它血清组分和针对卵白蛋白的抗体分开。为此，在层粘连蛋白P1亲和基质上进行亲和层析，将FractogelEMDazlactone 650(S)(Merck，Darmstadt)用作支持物(凝胶基质)。偶联之前，于6ml PBS、1M Na2SO3，pH7.4中将0.3g材料保温15分钟，然后倒掉液体上清液。保温过程中，材料的体积溶胀至1ml，可直接使用基质以与所需配体共价偶联。
将3.4mg人层粘连蛋白P1溶解于2ml 0.2M碳酸氢铵，pH8.0中，于4℃，将此溶液与1ml被激活(见上文)的支持材料一起保温过夜(＞16小时)。然后用0.2M碳酸氢铵，pH8.0洗涤凝胶材料。通过在4℃，于5ml 0.2M甘氨酸，pH8.0中保温24小时，以封闭支持材料上的残留活性基团。通过在PBS、1M Na2SO3(pH7.4)，0.1M乙酸钠(pH4.0)和0.2M甘氨酸(pH8.0)中轮换保温，进行3次洗涤循环，最终制得亲和结合所用的凝胶基质。用基质填充PharmaciaHR5/5柱，然后用PBS/0.04％吐温20平衡柱。
为了从动物血清中纯化与层粘连蛋白P1结合的抗体，用PBS/0.04％吐温20按1∶2稀释相关血清，并以2ml/min的流速使稀释后的血清流过柱。随后，用缓冲液洗涤柱，直至流过监测仪的UV信号(220nm)再次达到基线。通过将过柱缓冲液变换为0.1M甘氨酸/HCl，pH2.7，最终洗脱结合的抗体。
使用固定化的层粘连蛋白γ1 III 3-5进行酶免疫测定，分析柱流过液和柱洗脱液。
上述亲和纯化被成功地用于从4种动物血清中纯化抗体，平均得率是每50ml血清0.3mg(血清R2的得率仅为0.1mg)。然而，所有血清中的大多数抗体(＞80％)均不与层粘连蛋白P1结合，推测这或者是由于结合动力学太低，或者是由于只对用于免疫的肽的序列具有亲合力。
在层粘连蛋白P1柱上进行亲和层析使得可以从血清中选择性地富集快速而稳定结合的抗体变体(寻找抗体)。实施例6：经亲和纯化的抗体的结合特异性
Western印迹结果证实，经亲和纯化的抗体保持了对层粘连蛋白P1的结合特异性，相对于与通过还原二硫键可分离的线性层粘连蛋白P1部分(Gerl，M.等(1991)欧洲生物化学杂志，202：167-174)的反应而言，不同制品与未经还原的层粘连蛋白P1的反应更加强烈。这是抗体的结合特异性中依赖于构象的组分的间接证据。另外还发现，4种抗体制品的结合偏向性不同。用偶联物1免疫得到的两种抗体制品R3和R4识别相同的层粘连蛋白P1带，所述带是通过对未经还原的样品进行SDS(十二烷基硫酸钠)凝胶电泳之后得到的。而两种抗体制品R2和R905(抗偶联物2)也表现出彼此相同的反应模式，与抗偶联物1的两种抗体制品相比，它们识别较少的层粘连蛋白P1带。
在免疫化学检测通过还原和SDS凝胶电泳分离的层粘连蛋白P1带时，我们惊奇地发现所有4种抗体制品对含有层粘连蛋白γ1 III 4的部分具有不同的结合偏向性。实施例7：抑制试验-用经亲和纯化的抗体抑制层粘连蛋白/巢蛋白的结合
利用包被管试验可以鉴定经亲和纯化的抗体的抑制活性，所述包被管试验是在抗体存在下测定经放射性标记的巢蛋白与被(人胎盘)层粘连蛋白P1包被的管的结合情况。用125I放射性标记巢蛋白
将重组产生的人巢蛋白(35μg，有关克隆的描述和培养及纯化条件可参见Mayer，U等(1995)，欧洲生物化学杂志，227：681-686)溶解于250μl PBS中，向溶液中加入0.405mCi(＝15Mbq)碘化钠(125I)溶液(＝1.55μl，Nordion Europe)，10μl 0.5M磷酸钠(pH7.4)和溶于100μl 0.05M磷酸钠(pH7.4)中的40μg氯胺T(N-氯-4-甲苯磺酰胺钠盐，Merck)。室温下将反应进行60秒，加入溶于100μl 0.05M磷酸钠(pH7.4)中的40μg偏亚硫酸氢钠(Riedel-de-Haen)溶液以终止反应。此加入过程至多持续30秒，然后向混合物中加入900μl溶于PBS中的1％BSA(Sigma)。通过使用PD 10柱(Pharmacia)的分子筛层析，分离出游离的放射性和过量的盐。收集洗脱至PBS中的被碘标记的巢蛋白，用1％BSA/0.05M磷酸钠/0.01％叠氮化钠，pH7.4进行稀释，使其浓度为50ng/ml。包被反应管
于4℃，用4μg/ml溶于碳酸盐缓冲液(0.159g碳酸钠；0.293g碳酸氢钠；0.02g NaN3于1升蒸馏水中)、20μg/ml BSA(牛血清白蛋白，Serva)，pH9.2中的层粘连蛋白P1溶液将反应管(Greiner，75×12，No.115061)包被过夜。通过与0.5ml溶于PBS/0.04％吐温20中的0.5％BSA一起保温2小时以封闭游离的结合位点。使用“层粘连蛋白模拟”结构的抑制试验(有顺序的抑制)
室温下，在反应容器中摇晃200μl经碘标记的巢蛋白(约10ng，约40,000cpm)和200μl抑制剂(如可得自层粘连蛋白γ1 III 4区域的肽)或标准品(层粘连蛋白γ1 III 3-5)。抑制剂和标准品皆溶于PBS/0.04％吐温20中。保温3小时之后，将150μl此混合物转移至经包被的管中，室温下再保温2小时。最后，移出溶液，用1mlPBS/0.04％吐温20将管洗涤2次，然后在γ计数仪上测定结合的放射性(巢蛋白)。含有抑制剂的溶液中结合的巢蛋白的量与未加入抑制剂时巢蛋白的量相关。使用“巢蛋白模拟”结构的抑制试验(有顺序的抑制)
在经层粘连蛋白P1包被的反应容器中，将150μl抑制剂(如可与层粘连蛋白γ1 III 4区域结合的抗体或可得自巢蛋白序列的肽)或标准品(重组的巢蛋白)摇晃3小时。抑制剂和标准品皆溶于PBS/0.04％吐温20中。样品被吸收之后，加入150μl经碘标记的巢蛋白(约10ng，约40,000cpm)，维持2小时，以置换已结合的抑制剂。最后，移出溶液，用1ml PBS/0.04％吐温20将容器洗涤2次，然后在γ计数仪上测定结合的放射性(巢蛋白)。结合的放射性巢蛋白的量与抑制剂浓度或标准品的浓度有关。抑制试验(同时抑制)
在此试验变型中，未预先进行保温，而是将75μl经碘标记的巢蛋白(10ng)与75μl抑制剂或标准品一起直接移入经包被的管中，然后于室温下保温2小时；除此不同之外，本方案类似于有顺序的抑制试验变型。结果
从10次独立的试验中得出层粘连蛋白γ1 III 3-5标准品的IC50％为0.22nM，标准偏差为+/-15％。IC50％的定义为将巢蛋白与层粘连蛋白P1的结合抑制50％所需物质的浓度。为了进行比较，使用US5,493,008中所述的(平衡)抑制试验得到IC50％为0.05nM，标准偏差为+/-52％。
表2显示出抗体制品R3，R905，R1.2，R2.2和R3.2及不同的游离肽的IC50％值。抗体制品R1.2，R2.2和R3.2是用新的偶联物II进行第二轮兔免疫并经过类似的纯化步骤得到的。这些结果表明该方法具有再现性。表2：本发明抗体对层粘连蛋白/巢蛋白结合的抑制作用
抑制剂 R3 R905 R1.2 R2.2 R3.2 肽(1)* 肽(2)*
IC50％nM IC50％nM IC50％nM IC50％nM IC50％NM IC50％nM IC50％nM
有顺序的抑制** 72 150 500 80 350 60000 20000
同时抑制** 110 - 600 80 500 60000 20000
*：氨基酸序列见表1**：试验类型
US 5,493,008中指出可得自巢蛋白结合域的抑制肽的IC50％值为22nM至1000nM。由于保温时间显著缩短，用选定的试验不可能得到这些值；例如，在本文所述试验中，肽DNIDPNAVGNL的IC50％值仅为60000nM。实施例8：使用BIAcore系统鉴定结合动力学
可使用Pharmacia Biosensor的BIAcore系统联机监测生物特异性的相互作用。检测原理是基于一种光学现象(表面胞质基因组共振)，这种现象受结合于金胶片上的物质的影响。简单地说，该系统是金传感器表面的小型化亲和层析。可以共振信号的形式肉眼观察特异性结合的配体的量(Chaiken，I等(1992)分析生物化学，201：197-201；Karlsson，R等(1992)抗原结构；(van Regenmortel编).p127-148；CRC出版社，Boca Raton，FI.)。
根据使用手册中的指示，将溶于10mM乙酸钠(pH4.0)中浓度为200μg/ml的层粘连蛋白P1固定于传感器片上，得到含有4000RU结合的层粘连蛋白P1的基质。进行双脉冲，每次均用4μl 100mMHCl，以再生亲和基质。
在HBS缓冲液(10mM HEPES，3.4mM EDTA，150mM NaCl，0.005％BIAsurfactant P20；pH＝7.4)中，流速为2μl/min时，巢蛋白(20μg/ml)以抛物线式饱和动力学与层粘连蛋白P1结合，经亲和纯化的抗体制品R905和R3以线性依赖于抗原的方式与层粘连蛋白P1结合。1400秒后仍未能观察到任何向平衡态转换的迹象，这一事实可能是负责结合巢蛋白的层粘连蛋白P1特异性肽序列易于被抗体所用的反映。不论此序列是生物活性构象还是不同的构象，诸抗体都与此序列结合。这一观点的证据在于以下观察结果，即仅结合600RU后，巢蛋白就明显转换至饱和相。因此，很显然，不是所有固定化的层粘连蛋白P1分子都以巢蛋白可识别的结构存在，因为未达到层理论最大饱和值2500RU。然而，长时间接触后，两种抗体即可达到这种饱和。令人惊奇的是，不得不以高10倍的浓度(320μg/ml)使用R905样品，以达到和R3(33μg/ml)差不多的结合速率。另一方面，与R3相比，R905与层粘连蛋白P1的结合更加稳定，因为R905解离的速率(由变化至HBS缓冲液的时间：1500秒即可看出)比R3制品解离的速率明显慢一些。
这些发现解释了在抑制试验中观察到的R3和R905之间的差异：●抗体制品R3抑制层粘连蛋白/巢蛋白结合的效果比R905更好，因为R3结合的特征在于具有更快速的结合动力学。●当在经层粘连蛋白P1包被的管中与巢蛋白同时保温时，抗体制品R3也能抑制层粘连蛋白/巢蛋白的结合，因为当其浓度与巢蛋白差不多时，R3具有良好的结合动力学。●抗体制品R905仅能在“有顺序的抑制”试验变型中抑制层粘连蛋白/巢蛋白结合，因为其特征在于解离速率较慢，因此后来加入的巢蛋白不再能轻易地从抗原上取代R905。当R905和巢蛋白同时竞争结合位点时，R905因其很慢的结合动力学而逊于巢蛋白。实施例9：通过Western印迹检测亲和纯化的抗体制品R3和R905的结合特异性
在Western印迹分析中研究抗体制品R3和R905与偶联物2和卵白蛋白的相互作用。为此，根据NOVEXTM说明书，使用4-12％NuPAGETM凝胶(NOVEXTM，San Diego，CA)和MOPS缓冲液分级分离抗原，然后使用NuPAGETM转移缓冲液(NOVEXTM)将抗原转移至硝酸纤维素膜上。用1μg/ml聚乙烯醇封闭膜上的游离结合位点(1min)之后，将抗原与检测抗体一起保温。然后用共价键合了碱性磷酸酶的抗兔IgG抗体检测已结合的抗体。
我们发现，亲和纯化的抗体只与肽结合，因为未能检测到其与载体蛋白卵白蛋白的任何相互作用。也未能观察到其与蓝色的“SeeBlue”标准标记物(NOVEXTM)有任何反应。
还已证明，R3和R905都能与层粘连蛋白和得自不同种的层粘连蛋白衍生物(人胎盘层粘连蛋白和大鼠卵黄囊层粘连蛋白(Calbiochem)，人胎盘层粘连蛋白P1和小鼠EHS肿瘤层粘连蛋白P1，以及重组制备的小鼠层粘连蛋白γ1 III 3-5)反应。这为抗体与巢蛋白结合域内保守序列的结合提供了支持证据。两种抗体制品均未表现出与人巢蛋白或人IV型胶原蛋白具有任何交叉反应性。这是明确使用上述抗体作为巢蛋白拮抗剂的先决条件。实施例10：制备单克隆抗体
为了得到单克隆抗体，使用标准方法，用例如层粘连蛋白、层粘连蛋白P1、层粘连蛋白γ1 III 3-5或层粘连蛋白γ1 III 4，或用实施例2中提及的偶联物免疫适当的脊椎动物，优选为小鼠或大鼠。当抗血清表现出特异性的免疫反应时，使用标准方法分离可产生Mab的杂交瘤。
使用结合试验(如应用层粘连蛋白γ1 III 3-5和/或层粘连蛋白γ1 III 4的点印迹或Western印迹)，特别是实施例7描述的抑制试验，以及其它方法，筛选出所需的抗体或相应的杂交瘤克隆。选定的克隆构成了合成大量本发明抗体的来源。
可使用常规方法，如与G蛋白或A蛋白的结合来纯化所需抗体。然而，优选使用在层粘连蛋白P1柱上进行的亲和层析。至于上述多克隆抗体，此纯化步骤使得有可能挑选出并选择性地浓缩具有最佳结合常数的单克隆抗体。
本发明抗体的例子是单克隆细胞克隆A6/2/4产生的单克隆抗体(MAb)，该细胞克隆已根据布达佩斯条约的规定，于1997年10月27  日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(德国微生物和细胞培养物保藏中心)(DSMZ，Marscheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德国)，保藏号为DSMACC2327。
用分离自人胎盘的层粘连蛋白P1免疫小鼠得到杂交瘤。EP 0696 597 A2中描述了抗原的纯化和杂交瘤的产生方法。依据其与层粘连蛋白γ1 III 3-5和层粘连蛋白γ1 III 4的结合特征，鉴定出了抗体A6/2/4。该抗体是IgM亚型的单克隆抗体，它可以通过分子筛层析纯化。部分由于该抗体是多价的，它与层粘连蛋白P1的结合特别强。由于此原因，且由于IgM抗体的大小，因而不能从层粘连蛋白P1亲和柱上洗脱下该抗体(见上文)。(“同时抑制试验变型”，见上文)抑制试验已反映出该抗体与层粘连蛋白P1强烈结合。MabA6/2/4能抑制层粘连蛋白/巢蛋白的结合，IC50为30nM。
由于其结合明显地依赖于构象，因此层粘连蛋白γ1 III 4区域内的结合表位(层粘连蛋白的巢蛋白结合域)不能明确定义。然而，可得自层粘连蛋白之巢蛋白结合序列的肽能部分(75-80％)抑制抗体与层粘连蛋白P1的相互作用，这一事实表明Mab A6/2/4的结合表位与巢蛋白的结合表位有重叠。
下文将描述类似于本发明的多克隆抗体、可使用肽/卵白蛋白偶联物产生的抑制性单克隆抗体的制备。
在完全弗氏佐剂存在下，使用50μg肽2/卵白蛋白偶联物(偶联物2，见上文)皮下免疫SJL/J品系的小鼠。4和8周后，在不完全弗氏佐剂存在下，各用25μg偶联物2皮下注射以加强免疫反应，再过7周。融合前3天，通过腹膜内注射25μg偶联物2来加强免疫应答。
为了进行融合，处死动物并分离脾细胞。在聚乙二醇存在下，将脾细胞与骨髓瘤细胞系P3X63AG8.653融合。通过在次黄嘌呤/氨基喋呤/胸苷培养基中将融合混合物培养3周来选择脾细胞×P3X63AG8.653杂合体。为了得到稳定的细胞系，将所得细胞克隆亚克隆几次。在多种免疫学结合试验中检测所得细胞集落的抗体生产情况。依据下文的筛选策略，筛选  得到细胞系E79/1/6和E82/1/10。表征和鉴定特异性单克隆抗体的实验
用偶联物2免疫SJL/J小鼠可得到很多能产生抗体的杂交瘤克隆。培养物上清液中的抗体显示出与层粘连蛋白γ1 III 3-5、层粘连蛋白P1和卵白蛋白具有强烈免疫反应。
现在，为了找到能产生针对具有天然结构的层粘连蛋白之巢蛋白结合域的单克隆抗体的克隆，必需运用适当的筛选方法。
在此筛选方法中，注意力主要集中于抗体与层粘连蛋白P1和层粘连蛋白γ1 III 3-5的结合。同时，在亚克隆过程中，也要注意抗体与载体蛋白卵白蛋白的反应应是可以忽略不计的，并选择出专门识别卵白蛋白的抗体。
表3和4给出了以此方法鉴定出的两个克隆(E79和E82)得到的结果。表3：在ELISA中测定E79的结合
   层粘连蛋白γ1III 3-5包被：2.5μg/ml   层粘连蛋白P1包被：2.0μg/ml   卵白蛋白包被：20μg/ml
杂交瘤E79未稀释的培养物上清液 1.33 0.68 1.63
E79/1/6，第一次克隆，未稀释的培养物上清液 2.03 0.16 0.27
E79/1/6，纯化的抗体2.5μg/ml        0.56        0.33       0.05
表4：在ELISA中测定E82的结合
  层粘连蛋白γ1III 3-5包被：2.5μg/ml   层粘连蛋白P1包被：2.0μg/ml   卵白蛋白包被：20μg/ml
杂交瘤E82未稀释的培养物上清液 1.77 1.48 2.33
E82/1/10，第一次克隆，未稀释的培养物上清液 1.32 0.26 0.05
E82/1/10，纯化的抗体6.4μg/ml       1.55        0.5       0.18
显然可通过克隆分离出与卵白蛋白具有免疫反应的细胞。同时，在每种情况下都可以分离出产生能与层粘连蛋白γ1 III 3-5和层粘连蛋白P1结合之抗体的细胞克隆。这一事实和用得自层粘连蛋白之巢蛋白结合域的肽引起了免疫的事实表明，抗体与具有天然结构的层粘连蛋白之巢蛋白结合基元能够结合。
抑制试验的“同时结合”变型(见上文)提供了结合特异性的直接证据，其中抗体直接与被碘标记的巢蛋白竞争结合完整层粘连蛋白(得自小鼠EHS肿瘤的层粘连蛋白，Chemicon，No.CC095)的巢蛋白结合基元。
由细胞克隆E79/1/6产生的抗体(IgG2a亚型)以IC50为19nM的水平抑制层粘连蛋白-巢蛋白的结合，由细胞克隆E82/1/10产生的抗体(IgG1亚型)以IC50为190nM的水平抑制层粘连蛋白-巢蛋白的结合。

Claims (42)

1.一种与可结合巢蛋白的层粘连蛋白γ1 III-4区域能结合的抗体或其部分。
2.权利要求1所要求的抗体或其部分，其与可结合巢蛋白的层粘连蛋白γ1 III4区域的a环或a和c环、或这些环紧邻部分的高度保守区域能结合。
3.权利要求2所要求的抗体或其部分，其可直接地以与表位有关的构象依赖性方式，或以重叠的方式与a环或a和c环之高度保守区域结合。
4.权利要求1至3中一项或多项所要求的抗体或其部分，其至少可与表1所示的一种肽结合。
5.权利要求1至4中一项或多项所要求的抗体，它是多克隆抗体。
6.权利要求1至4中一项或多项所要求的抗体，它是单克隆抗体。
7.权利要求6所要求的抗体，它是嵌合的、人源化的、双特异性的或寡特异性的抗体。
8.权利要求1至7中一项或多项所要求的抗体，它可竞争性地或部分竞争性地抑制层粘连蛋白/巢蛋白的结合。
9.一种抗体，所述抗体可通过用层粘连蛋白或层粘连蛋白P1作为免疫抗原，免疫具有免疫活性的脊椎动物，随后使用层粘连蛋白γ1 III 3-5和/或层粘连蛋白γ1 III 4鉴定抗体，并检测所得抗体竞争性或部分竞争性地抑制层粘连蛋白/巢蛋白之结合的能力而得到。
10.一种抗体，所述抗体可通过用层粘连蛋白γ1 III 3-5作为免疫抗原免疫具有免疫活性的脊椎动物，随后使用层粘连蛋白和/或层粘连蛋白P1鉴定抗体，并检测所得抗体竞争性或部分竞争性地抑制层粘连蛋白/巢蛋白之结合的能力而得到。
11.一种抗体，所述抗体可通过用层粘连蛋白γ1 III 4和/或用不含有层粘连蛋白γ1 III 4区域完整的氨基酸序列但含有其巢蛋白结合位点的重要组分的肽作为免疫抗原，免疫具有免疫活性的脊椎动物而得到。
12.权利要求11所要求的抗体，其中层粘连蛋白γ1 III 4被用作免疫抗原。
13.权利要求11所要求的抗体，其中表1所示的一种或两种肽被用作免疫抗原。
14.权利要求11至13中的一项或多项所要求的抗体，所述抗体是使用层粘连蛋白和/或层粘连蛋白P1鉴定出的。
15.权利要求11至14中的一项或多项所要求的抗体，其中检测了所述抗体竞争性或部分竞争性地抑制层粘连蛋白/巢蛋白之结合的能力。
16.权利要求9至15中任一项所要求的抗体，其中得到了可生产单克隆抗体的杂交瘤细胞。
17.权利要求9至16中任一项所要求的抗体，它是通过亲和层析从含有抗体的材料中纯化得到的。
18.权利要求18所要求的抗体，其中以层粘连蛋白和/或层粘连蛋白P1作为亲和基质进行该亲和层析。
19.产生权利要求1至8中一项或多项所要求的抗体或其部分的细胞或细胞系。
20.杂交瘤DSMACC2327。
21.由杂交瘤DSMACC2327产生的抗体。
22.制备权利要求1至8中任一项所要求的抗体的方法，所述方法包括用层粘连蛋白或层粘连蛋白P1免疫具有免疫活性的脊椎动物，使用层粘连蛋白γ1 III 3-5和/或层粘连蛋白γ1 III 4鉴定抗体，和检测此抗体竞争性或部分竞争性地抑制层粘连蛋白/巢蛋白之结合的能力。
23.制备权利要求1至8中任一项所要求的抗体的方法，所述方法包括用层粘连蛋白γ1 III 3-5免疫具有免疫活性的脊椎动物，使用层粘连蛋白和/或层粘连蛋白P1鉴定抗体，和检测此抗体竞争性或部分竞争性地抑制层粘连蛋白/巢蛋白之结合的能力。
24.制备权利要求1至8中任一项所要求的抗体的方法，所述方法包括用层粘连蛋白γ1 III 4和/或用不含有层粘连蛋白γ1 III 4区域完整的氨基酸序列但含有其巢蛋白结合位点的重要组分的肽免疫具有免疫活性的脊椎动物。
25.权利要求24所要求的方法，其中层粘连蛋白γ1 III 4被用作免疫抗原。
26.权利要求24所要求的方法，其中表1所示的一种或两种肽被用作免疫抗原。
27.权利要求26所要求的方法，其中免疫抗原偶联在载体上。
28.权利要求24至27中一项或多项所要求的方法，其中使用层粘连蛋白和/或层粘连蛋白P1鉴定抗体。
29.权利要求24至28中一项或多项所要求的方法，其中对所述抗体竞争性或部分竞争性地抑制层粘连蛋白/巢蛋白之结合的能力进行了检测。
30.权利要求22至29中一项或多项所要求的方法，其中产生了可生产单克隆抗体的杂交瘤细胞。
31.权利要求22至30中一项或多项所要求的方法，其中通过亲和层析从含有抗体的材料中纯化所述抗体。
32.权利要求31所要求的方法，其中以层粘连蛋白和/或层粘连蛋白P1作为亲和基质进行该亲和层析。
33.权利要求1至18或21中任一项所要求的抗体或其部分，其可用作药物。
34.含有权利要求1至18和21中至少一项所要求的一种或多种抗体或抗体部分的药物。
35.权利要求1至18和21中至少一项所要求的一种或多种抗体或抗体部分用于制备治疗特征为基底膜合成过量或不必要之疾病的药物的用途。
36.权利要求35所要求的用途，其中所述疾病为伴随着基底膜增厚的糖尿病晚期并发症形式，动脉硬化形式，纤维变性，或因血管发生而使临床症状恶化的疾病。
37.权利要求35或36所要求的用途，所述用途是制备治疗糖尿病性视网膜病、酒精肝性纤维变性、肺纤维变性、癌症、糖尿病性肾病或具有强炎性因子的疾病，如类风湿性关节炎、骨关节炎、血管炎、血管瘤和银屑病的药物。
38.权利要求1至18或21中任一项所要求的抗体或其部分用作诊断试剂。
39.含有权利要求1至18和21中至少一项所要求的一种或多种抗体或抗体部分的诊断试剂。
40.权利要求1至18和21中至少一项所要求的一种或多种抗体或抗体部分用于制备检测生物样品、体液或组织中含有γ1之层粘连蛋白同种型的诊断试剂的用途。
41.权利要求1至18或21中任一项所要求的抗体或其部分用作研究和评价影响层粘连蛋白/巢蛋白间相互作用之物质的生物学和药学模型中的辅助物的用途。
42.权利要求41所要求的用途，所述用途是在研究和评价影响层粘连蛋白/巢蛋白间相互作用之物质的生物学和药学模型中的用途。
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