JP2000221191A - ヒト障害についての診断マ―カ― - Google Patents

ヒト障害についての診断マ―カ―

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、代謝および栄養障害、胃腸障害、中枢神経系
障害、並びに自己免疫障害または免疫低下障害をはじめ
とするヒト障害に関する。本発明はより詳しくは、ヒト
の組織や体液中に生来見つかる単離されたペプチドおよ
びその誘導体を含んで成る診断マーカーに関する。それ
らのペプチドは、一貫してアヘン剤様活性を示しそして
／またはアヘン剤様活性を示すペプチドの誘導体である
ことが発見された。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、広範囲には、代謝
および栄養障害、胃腸障害、中枢神経系障害並びに自己
免疫障害または免疫低下障害をはじめとするヒトの障害
に関する。
【０００２】本発明は、より詳しくは、ヒトの組織およ
び体液中に元来見つかる単離されたペプチドおよびその
誘導体を含んで成る、診断マーカーに関する。それらの
ペプチドは、一貫してアヘン剤様活性を示すかまたはア
ヘン剤様活性を示すペプチドの誘導体である。
【０００３】本発明は、それらのペプチドの同定による
前記障害の診断方法並びにそれらのペプチドの検出方法
にも関する。これらの方法としてはイムノアッセイ試験
法および質量分析法が挙げられるがそれらに限定されな
い。
【０００４】特に、本発明は、該ペプチドの検出または
定量によるヒト障害、例えば自閉症の食事関連形態の診
断方法に関する。本発明は、高プロリンペプチドの代謝
に関与する酵素にも関する。そのような酵素の一例はジ
ペプチジルペプチダーゼIVである。
【０００５】本発明はまた、ヒト障害の治療用の医薬組
成物に関する。本発明は「ヒト障害」に向けられる。本
願発明の目的上、「ヒト障害」は「代謝および栄養障
害」、「胃腸障害」、「中枢神経系障害」、「自己免疫
障害または免疫低下障害」および癌を含むものとして定
義される。
【０００６】本願発明の目的上、「代謝および栄養障
害」は、食料品、ビタミン、ミネラルまたは元素、補因
子または塩類、健康に不可欠な元素の「吸収過度」また
は「吸収不足」を伴うか、あるいは消化の中断、栄養不
足または毒性に関係する、いずれかの状態または徴候と
して定義される。更に代謝障害は組織の破壊も含むこと
がある。一般的な障害としては、フェニルケトン尿症
(1) 、腎不全(2) 、てんかん(3) 、骨粗しょう症(4) 、
高ペプチド尿症(5) などが挙げられるがそれらに限定さ
れない。
【０００７】本願発明の目的上、「胃腸障害」は、腸に
関係する任意の状態または徴候、並びに大腸、小腸、胆
嚢および肝臓をはじめとする体内のそしゃく器官に関係
する任意の状態または徴候として定義される。一般的な
障害としては、非限定的に、潰瘍(7) 、ポリープ(8) 、
悪性貧血(9) 、クローン症候群(10)、下痢(11)、急性腸
疾患（ＡＢＤ）(12)などが挙げられる。
【０００８】本願発明の目的上、「中枢神経系障害」
は、脳、脊柱、神経もしくは神経組織または神経被覆
物、および体内の情報伝達もしくは情報処理または行動
の変化に関係する任意の状態または徴候として定義され
る。一般的な例は、非限定的に、精神分裂病(13)、痴呆
(14)、パーキンソン病(15)、多発性硬化症(16)などであ
る。中枢神経系障害、特に自閉症スペクトル障害（ＡＳ
Ｄ）は、会話、学習および社交術を冒す終生的状態であ
る。自閉症スペクトル障害としては、注意欠陥障害（Ａ
ＤＥＤ）、注意欠陥過活動障害（ＡＤＨＤ）、アスペル
ガー症候群、広汎発達障害（ＰＤＤ）および自閉症など
が挙げられるが、それらに限定されない。
【０００９】本願発明の目的上、「自己免疫障害または
免疫低下障害」は、自己免疫系の変化、具体的には自己
に対する応答を増強する変化を伴う任意の状態または徴
候として定義される。免疫応答は内在性のまたは外来の
任意物質により生成され、そしてその後で予防接種また
は感染が行われ得る。一般的な障害としては、非限定的
に、セリアック病(18)、糖尿病(19)およびＨＩＶ関連障
害(20)などが挙げられる。ほとんどの場合ＡＳＤの犠牲
者は精神遅滞を伴わないけれども、この犠牲者は重い発
育障害を患う。
【００１０】本発明の目的上、癌(21)は、全てのヒトお
よび動物集団において発生し、そして潜在的に分裂可能
な細胞から成る全ての組織において生じる、未知で且つ
恐らく多くの原因の病気の大集団である悪性新生物に対
して用いられる通俗的な一般用語として定義される。癌
の基本的特徴は、侵略性増殖と代謝を通して宿主に重大
な悪影響を及ぼす、無制御な過剰増殖と過剰機能により
現れる転移性の細胞異常である。
【００１１】
【従来の技術】歴史的には、自閉症スペクトル障害は、
主としてそれらの症候群を構成する重複する障害数のた
めに、治療と診断の両方に関して科学的謎であった。
【００１２】臨床上自閉症スペクトル障害と診断される
個体の顕著な特徴としては、反復身体運動、保続、過激
な自己吸収、急性感覚異常、並びにしばしばカゼインお
よびグルテン含有製品を含むような重い偏食が挙げられ
る。
【００１３】初期の研究は、異常行動（精神分裂病、自
閉症）と或る種の食物、特に小麦や牛乳の摂取との関係
を示唆した。それらや他の研究では、患者の食事からそ
れらの食物を除去することにより、多くの患者が改善す
るように思われた。ＡＳＤにかかった小児から採取した
尿のクロマトグラフィーは、共通のピークの存在を明ら
かにした。この研究者らは、それ以上同定することな
く、これらの共通のピークが小さな食物由来ペプチドの
存在から生じるものであると提唱した。提唱されたペプ
チドは既知のアヘン剤様活性を有することから、それら
を患者の機能障害行動の原因であると理論づけた。
【００１４】歴史上、自閉症スペクトル障害を含むそれ
らの障害は、大部分はそれらの症候群を構成している重
複する障害数のせいで、治療と診断の両方に関して科学
的ななぞであった。例えば、自閉症は行動にだけ基づい
た診断である。それらの行動は、便宜上、自閉症または
自閉症スペクトル障害と分類されている多数の症候群の
最終的な神経学的経路を構成する。
【００１５】最近、ＡＳＤの中からＰＫＵ、ランドー−
クレッフナー症候群、ぜい弱Ｘ症候群、レット症候群お
よびプリン自閉症のような特定の症候群が抜粋された。
様々な方法で治療可能であるものもある。更に、多くの
形態の自閉症は、風疹自閉症、ＣＭＶ関連自閉症および
ＨＩＶ関連自閉症の出現により示されるように、免疫系
の機能不全に関連するという証拠がある。
【００１６】ＡＳＤは複雑な病因を有するので、特異的
な診断手段を開発することが困難であった。潜在的に自
閉症患者の高比率を占めるＡＳＤの一形態は、グルテン
／カゼイン不耐性に関連している。グルテン／カゼイン
不含有の食事を取らせると、この形態のＡＳＤに明らか
に苦しんでいる小児は穏和なものから劇的なものまでに
渡る改善を示した。グルテン／カゼイン不含有の食事を
取らせた小児（一般に２人以下）が完全に回復したこと
を証明する散発的な報告がある。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】ＡＳＤの特定形態を含
むそういった多数のヒト障害を診断するための生化学的
方法は今まで入手できていない。特に、多発性硬化症、
パーキンソン病、アルツハイマー痴呆、およびグルテン
／カゼイン不耐性に関連するＡＳＤのようなヒト障害の
特異的生化学的診断方法を提供することが有用である。
できるだけ早期に有効な治療を開始できるように食事関
連型自閉症にかかっているかもしれない小児を見分ける
ことが重要である。
【００１８】
【課題を解決するための手段】本発明は、広範囲には、
代謝および栄養障害、胃腸障害、中枢神経系障害並びに
自己免疫低下免疫障害または癌をはじめとするがそれら
に限定されないヒト障害に関する。
【００１９】本発明はより詳しくは、ヒトの組織や体液
中に元来見つかる単離されたポリペプチドおよびその誘
導体を含んで成る診断マーカーに関する。それらのペプ
チドは、一貫してアヘン剤様活性を示しそして／または
アヘン剤様活性を示すペプチドの誘導体である。
【００２０】本発明は、それらのペプチドの同定による
ヒト障害の診断方法並びにそれらのペプチドの検出方法
にも関する。このような方法としてはイムノアッセイ方
法および質量分析方法が挙げられるがそれらに限定され
ない。
【００２１】特に、本発明は、関連ペプチドの検出また
は定量によるヒト障害、例えば自閉症の食事関連形態の
診断方法に関する。本発明は、ヒト障害の治療用の医薬
組成物にも関する。
【００２２】
【発明の実施の形態】具体的には、中枢神経系障害、例
えば自閉症スペクトル障害の診断は、一般に行動分析に
基づいて行われる。そのような障害を有する患者から得
られた生物学的試料中に存在する、ヒト障害の特定タイ
プに特異的な物質の検出および／または定量によってそ
れらのヒト障害を診断する必要がある。上述したよう
に、グルテン／カゼイン不耐性に関連する自閉症スペク
トル障害の診断および／または治療を可能にする生物学
的方法を提供することが特に有用である。この要望は本
発明によって満たされる。本発明者らは、自閉症と診断
されたかまたは自閉症スペクトル障害を有すると分類さ
れた患者の部分集合からの体組織や体液、特に尿試料
が、様々なアヘン剤様および／またはアヘン剤由来ペプ
チドを含有することを発見した。
【００２３】本願発明の目的上、「自閉症スペクトル障
害」は、自閉症、広汎発達障害、アスペルガー症候群、
注意欠陥障害（ＡＤＤ）および注意欠陥過活動障害（Ａ
ＤＨＤ）に関する群より選ばれる任意の障害として定義
される。
【００２４】本願発明の目的上、「診断マーカー」は、
次の特徴を示すマーカーとして定義される： a) 与えられた集団に特異的である； b) 測定可能であり且つ測定が再現可能である； c) 生物学的試料中で検出するのに必要な時間に渡り存
続する。
【００２５】本願発明の目的上、「受容体」は、非限定
的に皮膚、深部組織、内蔵または特定の感覚器における
様々な感覚神経末端のいずれかとして定義される。本発
明の目的上、「アヘン剤様ペプチド」は、アヘン剤受容
体または「アヘン剤様」受容体に結合するアミノ末端お
よびカルボキシ末端を含んで成る、タンパク様か非タン
パク様のいずれかの任意分子として定義される。「アヘ
ン剤様」ペプチドは作用剤であっても拮抗剤であっても
よい。アヘン剤様ペプチドの例としては、非限定的に、
モルヒネ、カゾモルフィン、デルモフィン、ナロキソ
ン、プロエンケファリン、エンケファリンおよびエンド
ルフィンが挙げられる。
【００２６】本願発明の目的上、「アヘン剤由来ペプチ
ド」は、アヘン剤様ペプチドの誘導体であるがアヘン剤
活性および／またはアヘン剤様活性を必ずしも示さなく
てもよい任意のペプチドとして定義される。
【００２７】本願発明の目的上、「アヘン剤様」受容体
は、「アヘン剤様」ペプチドおよび／またはアヘン剤由
来ペプチドを結合し、次いでしばしば体内で局所的にま
たは遠隔的に応答を触発する、細胞表面または細胞内に
存在する任意のタンパク様または非タンパク様物質とし
て定義される。「アヘン剤様受容体」は、定義上、アヘ
ン剤受容体を包含する。「アヘン剤様受容体」の例とし
ては、非限定的に、ミュー（μ）、カッパ（κ）および
デルタ（δ）オピオイド受容体が挙げられる。それらは
Ｇタンパク質に結合し、そしてホモであってもキメラで
あってもよい。更に、各受容体型にはサブタイプがあ
る。μ，δおよびκオピオイド受容体の配列間には〜60
％のアミノ酸相同性がある。推定膜貫通セグメントおよ
びそれらのセグメントを連結する３つの細胞内ループの
配列は、高度に保存されている。一方で、細胞外NH2 末
端セグメント、第二および第三ループ並びに細胞内COOH
末端の配列は多様である。それらの多様性細胞外領域
が、μ，δおよびκオピオイド受容体の異なるリガンド
結合性質の原因であろうというのは筋が通っている。
【００２８】μ受容体はモルヒネと拮抗剤ナロキソンに
対し高い親和性を有する。δ受容体は内因性神経伝達物
質、エンケファリンおよび拮抗剤ナルトリンドールの生
物学的作用を媒介する。κ受容体は内因性伝達物質、ダ
イノルフィンおよび拮抗剤nor-BNI の生理学的作用を媒
介する。異なるタイプのアヘン剤受容体はＣＮＳの異な
る領域で発現され、そして作用証拠はそれらがアヘン剤
および「アヘン剤様」ペプチドの選択的薬理作用を媒介
するのかもしれないことを示す。
【００２９】本願発明の目的上、「作用剤」は、受容体
と結合すると薬剤作用を開始させることができる薬剤ま
たは結合剤として定義される。それは親和性と固有の活
性を有する。
【００３０】本願発明の目的上、「拮抗剤」は別の物質
の作用を妨害することができる薬剤または結合剤として
定義される。それは作用剤の作用または効果を中和また
は妨害する。
【００３１】本発明者らは後述のようにペプチドを同定
した。そのうちの幾つかは神経学的に活性であると知ら
れている。本発明者らは、それらのペプチドのアミノ酸
配列も決定した。
【００３２】第一の態様では、本発明は、非限定的に次
に挙げるものを含む多種多様な潜在的障害のための診断
マーカーを臨床医に提供する：尿のような体液中の或る
種のペプチドの存否により特徴づけられる、代謝および
栄養障害、胃腸障害、中枢神経系障害、自己免疫障害ま
たは免疫低下障害並びに癌。
【００３３】第二の態様では、本発明は、非限定的に次
に挙げるものを含む多種多様なヒト障害の診断方法に関
する：尿のような体液中の或る種のペプチドの存否によ
り特徴づけられる、代謝および栄養障害、胃腸障害、中
枢神経系障害、自己免疫障害または免疫低下障害並びに
癌。
【００３４】第三の態様では、本発明は、アヘン剤様ペ
プチドを含んで成る診断マーカーの検出方法に関する。
その方法としては非限定的に、生物学的試料中のアヘン
剤様ペプチドの存在および／または量を検出するための
イムノアッセイ法、ＥＬＩＳＡアッセイ法、キットおよ
び試験装置が挙げられる。
【００３５】本願発明の目的上、「生物学的試料」は、
非限定的に、上皮液、組織、血清、全血、糞便、涙、脊
髄液および尿として定義される。より具体的には、本発
明は、患者の尿試料中の、グルテン／カゼイン不耐性に
関連した自閉症の食事関連形態に関連するペプチドの存
在を決定するための高圧液体クロマトグラフィー（HPL
C）法に関する。
【００３６】本発明は、それらのアヘン剤様ペプチドを
曖昧なく同定しそして生物学的代表試料を特徴づけるた
めの質量分析を使った方法にも関する。生物学的指示薬
（インジケーター）質、特にアヘン剤様活性を示すペプ
チドを検出することができる。それらのペプチドの幾つ
かは神経学的に活性であることが知られており、自閉症
のような特定のヒト障害に関連して観察される幾つかの
行動の原因かもしれない。自閉的として特徴づけられた
患者から得られた尿試料のサブセットにおいて同定さ
れ、そして神経学的に活性であると知られているペプチ
ドとしては、β−カゾモルフィン(13)、α−グリアジン
(14)、デルモルフィン(15)、デルトルフィンＩ、デルト
ルフィンII (16) およびモルフィネ調節神経ペプチド(1
7)が挙げられる。
【００３７】第四の態様では、本発明は例えば自閉症の
ようなヒト障害を治療する方法に関する。第五の態様で
は、本発明はそれらの障害の治療用の医薬組成物に関す
る。本発明の第六の態様では、本発明は「アヘン剤様」
受容体の拮抗剤および作用剤、並びに拮抗剤および作用
剤のスクリーニング方法に関する。
【００３８】「アヘン剤様」ペプチドおよび／または
「アヘン剤由来」ペプチドの下記一覧表は、自閉的とし
て診断された患者より得られた尿試料のサブセットにお
いて同定された。それらは親タンパク質または親ペプチ
ドの下に列挙され、それは後述のようにして決定した。
この一覧表は、「アヘン剤様ペプチド」および「アヘン
剤由来ペプチド」の代表であり、決して限定ではない。
【００３９】親タンパク質または親ペプチドの下に列挙
されたペプチド、並びにその中に列挙された他のもの
は、親タンパク質または親ペプチドの細菌および／また
は酵素分解から生じる場合がある。新鮮な尿試料だけが
親ペプチド（またはタンパク質）を提供するかもしれな
い。あるいは、ペプチドは内因性代謝から生じるのかも
しれない。今のところ、これらのペプチドの起源は未知
である。ヒドロキシプロリン〔ＨＹＰ〕（３−ヒドロキ
シプロリンおよび４−ヒドロキシプロリン）は配列表
（ＣＲＦ）中Ｘａａで表されることに注意されたい。
【００４０】本願発明の目的上、「誘導体」は、内因性
のものおよび試料分解からのものを包含する、親ペプチ
ドの天然に存在する分解生成物を示すものである。ある
いは、誘導体は変異体を生じるように親ペプチドのＤＮ
Ａ配列コード領域を適当に修飾することにより、親ペプ
チドから誘導されたポリペプチドを意味する。誘導体は
生来のアミノ酸配列のＣ末端およびＮ末端のいずれか一
方もしくは両方での１個もしくは複数個のアミノ酸の付
加、生来のアミノ酸配列中の１もしくは複数の部位での
１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、生来の配列の一
端もしくは両端または生来の配列内の１もしくは複数の
部位での１個もしくは複数個のアミノ酸の削除、あるい
は生来の配列中への１個もしくは複数個のアミノ酸の挿
入により得られてもよく、それには全ての側鎖の削除ま
たはコンホメーション変化が包含される。よって、誘導
体は、「アヘン剤様ペプチド」または「アヘン剤由来ペ
プチド」であることができる。
【００４１】 カゼイン（親タンパク質） β−カゾモルフィン（親ペプチド） （NH4-TyrProPheProGlyProIle-COOH) （配列番号１） （NH4-TyrProPheProGlyPro-COOH) （配列番号２） （NH4-TyrProPheProGly-COOH) （配列番号３） （NH4-TyrProPhePro-COOH) （配列番号４） （NH4-TyrProPhe-COOH) （配列番号５） （NH4-ProPheProGlyProIle-COOH) （配列番号６） およびそれらの誘導体。
【００４２】 グルテン（親タンパク質） α−グリアジン（親ペプチド） （NH4-TyrProGlnProGlnProPhePro-COOH) （配列番号７） （NH4-TyrProGlnProGlnPro-COOH) （配列番号８） （NH4-TyrProGlnProGln-COOH) （配列番号９） （NH4-TyrProGlnPro-COOH) （配列番号10） （NH4-TyrProGln-COOH) （配列番号11） （NH4-ProGlnProGlnProPhe-COOH) （配列番号12） およびそれらの誘導体。
【００４３】 デルモフィン（親ペプチド） （NH4-TyrAlaPheGlyTyrProSer-COOH) （配列番号13） （NH4-TyrAlaPheGlyTyrPro-COOH) （配列番号14） （NH4-TyrAlaPheGlyTyr-COOH) （配列番号15） （NH4-TyrAlaPheGly-COOH) （配列番号16） （NH4-TyrAlaPhe-COOH) （配列番号17） （NH4-AlaPheGlyTyrProAer-COOH) （配列番号18） およびそれらの誘導体。
【００４４】 デルトルフィンII（親ペプチド） （NH4-TyrAlaPheGluValValGly-COOH) （配列番号19） （NH4-TyrAlaPheGluValVal-COOH) （配列番号20） （NH4-TyrAlaPheGluVal-COOH) （配列番号21） （NH4-TyrAlaPheGlu-COOH) （配列番号22） （NH4-AlaPheGluValValGly-COOH) （配列番号23） およびそれらの誘導体。
【００４５】 モルフィネ調節神経ペプチド（親ペプチド） （NH4-PheLeuPheGlnProGlnArgPhe-COOH) （配列番号24） （NH4-PheLeuPheGlnProGlnArg-COOH) （配列番号25） （NH4-PheLeuPheGlnProGln-COOH) （配列番号26） （NH4-PheLeuPheGlnPro-COOH) （配列番号27） （NH4-PheLeuPheGln-COOH) （配列番号28） （NH4-PheLeuPhe-COOH) （配列番号29） およびそれらの誘導体。
【００４６】 デルトルフィンＩ（親ペプチド） （NH4-TyrAlaPheAspValValGly-COOH) （配列番号30）
【００４７】 新規自閉症ペプチドＩ （NH4-TyrAlaPheAspValVal-COOH) （配列番号31） （NH4-TyrAlaPheAspVal-COOH) （配列番号32） （NH4-TyrAlaPheAsp-COOH) （配列番号33） （NH4-AlaPheAspValValGly-COOH) （配列番号34） （NH4-AlaProPheHypGlyHypIle-COOH) （配列番号35） （NH4-AlaProPheHypGlyHyp-COOH) （配列番号36） （NH4-AlaProPheHypGly-COOH) （配列番号37） （NH4-AlaProPheHyp-COOH) （配列番号38） （NH4-AlaProPhe-COOH) （配列番号39） （NH4-AlaPro-COOH) （配列番号40） （NH4-ProPheHypGlyHypIle-COOH) （配列番号41）
【００４８】 新規自閉症化合物II （NH4-TyrProPheProProIle-COOH) （配列番号42） （NH4-TyrGlyGlyTyr-COOH) （配列番号43）
【００４９】下記の一覧表は上記ペプチド配列とそれら
の実際の分析に関する。この表に記載されるのはＭ＋１
質量値であることに注意。
【００５０】
【表１】
【００５１】
【表２】
【００５２】次の分子量（分子イオン±１）はこの研究
の間に発見された化合物に関する。分子スペクトル断片
化パターンが確立され、多数の自閉症患者試料において
一致することがわかっている。しかしながら、それらの
化合物の素性はまだ決定されていない。 733 MW 755 MW 511 MW 488 MW 463 MW 458 MW 441 MW 479 MW
【００５３】上述した質量は対応するペプチドの質量を
有するけれども、他の化合物もこの質量値を共有しうる
ことを理解しておかなければならない。本発明のこの態
様にはキラル形の一方または両方が含まれることは当業
者の理解するところであろう。D-Ala 形とL-Ala 形の両
方が等量でまたは事実上等量で含まれてもよく、あるい
はＤ異性体形とＬ異性体形の一方のみが混合物中に存在
するかまたは優勢であってもよい。しかしながら、この
点はキラル異性に基づいて識別するのではない方法を使
ったこの検出では重要でない。
【００５４】自閉症児の尿中にそれらのアヘン剤様およ
び／またはアヘン剤由来ペプチドが豊富であることは、
それらの小児が共通して正確には小さなペプチドの代謝
に関与する酵素を欠損していることを示唆する。このデ
ータを詳細に検討すると、欠損酵素はユニークな活性を
示し（同様のまたは重複する基質特異性を有する酵素は
他に１つもない）、単一遺伝子の生成物であり（複数の
イソ酵素は存在しない）そして主として正常条件下では
生存力に必須ではない代謝現象に関与するのかもしれな
い。
【００５５】一例として、上述したペプチドは幾つかの
特徴を示す。具体的には、ほとんどが６〜８アミノ酸の
長さであり、多数がＮ末端にチロシンと２番目にプロリ
ンを有し、そしてある物は複数の１つ置きのプロリンを
有する。プロリンの目立った存在は、ＡＳＤ児には小さ
な高プロリンペプチドの消化に関与する酵素が欠損して
いるかもしれないことを示唆する。
【００５６】ジペプチジルペプチダーゼIV／(DPPIV) CD
26はそれらの推定特徴の全てを有し、更にそれが主要な
欠損かもしれないことを示す幾つかの他の特徴も有す
る。DPPIV/CD26は一般に、腸の刷縁、肝臓の毛細胆管膜
領域および腎臓の皮質をはじめとする小ペプチドの取込
みに関与する組織で発現される必須の細胞表面酵素であ
る。それは末端から２番目にプロリンを含む多数のペプ
チドからＮ末端ジペプチドを特異的に開裂させる（Yaro
n & Naider, 1993）。事実、それの特徴的基質の１つは
β−カゾモルフィンである（Kreil 他, 1983；Heymann
& Mentlein, 1986）。
【００５７】DPPIV/CD26の他の幾つかの特徴は、自閉症
児におけるそれの潜在的に重大な役割と一致する。それ
は細胞表面型である酵素の中でユニークな活性を有し、
それは染色体２に位置する単一遺伝子によりコードされ
（Mathew他, 1994）、そしてDPPIV/CD26に同型接合の遺
伝的欠損を有するラットは明白な病理学を全く示さない
（Erickson他, 1992；Tirrupathi他, 1993）。DPPIV/CD
26の別の顕著な特性は、ＨＩＶにより標的される細胞集
団であるCD4 陽性Ｔヘルパー細胞を含むＴリンパ球上で
の発現である。ＨＩＶ感染患者は顕著なＨＩＶ関連の自
閉症を発病することがある（Moss他, 1994；Brouwers
他, 1995）。更に、DPPIV/CD26は、自閉症に関連する別
の酵素であるアデノシンデアミナーゼの細胞表面結合タ
ンパク質でもある（De Meester他, 1994；Kameoka 他,
1993）。
【００５８】DPPIV/CD26の欠損は様々なメカニズムによ
って起こり得る。第一はコードされる酵素が何らかの理
由により発現されないかまたは機能不全である原発性遺
伝的欠損である。第二は、欠損でなければ正常である酵
素の機能を阻害する抗体を自己免疫応答が生み出すこと
である。最後に、腸内微生物叢の１つでもあり得る感染
性物質がDPPIV/CD26の活性を阻害する化合物を生成し得
ることが考えられる。それらのメカニズムのいずれかが
自閉症児に作用していたら、乳糖不耐性を有する人にラ
クターゼを投与するのとほとんど同じやり方で、哺乳類
または非哺乳類DPPIV の経口補給により、恐らく原因と
なる腸欠陥の影響から児童を救えるというのは完全に理
にかなったことである。よって、本発明は、DPPIV/CD26
を含んで成る医薬組成物に向けられる。
【００５９】本発明を下記の実施例により更に例証する
が、この実施例は決して本発明の範囲を限定するつもり
はない。
【００６０】
【実施例】実施例１ 「アヘン剤様」ペプチドおよび「アヘン剤由来」ペプチ
ドの単離生物学的試料の収集 尿により代表される生物学的試料は、注意欠陥障害（Ａ
ＤＥＤ）、注意欠陥過活動障害（ＡＤＨＤ）、アスペル
ガー症候群、広汎発達障害（ＰＤＤ）または自閉症と臨
床診断された小児、並びにＡＳＤに特異的に関連する尿
組成の差異を決定する時に比較参考試料として使用する
ために「正常」1 小児から採取した。 （1 小児は様々な速度で発育するので、まったく発育上
のまたは社会的な遅れがなく且つ異常な食養生がないグ
ループから無作為に典型的な小児を選んだ。） 無菌ポリプロピレン検体容器に、保存剤として0.5 g の
チモール（Sigma T-0501）を添加し、そして各患者から
採取した約40 mL の尿を添加した。試料を凍結するかま
たは即座に処理した。
【００６１】固相抽出法 凍結した試料を冷蔵庫中でまたは室温で解凍した。しか
し、解凍の時に試料分解を引き起こすことがわかった37
℃の湯浴中では決してしなかった。解凍したまたは新鮮
な各々の試料を卓上遠心機中で1000 rpmで５分間遠心
し、次いで0.22μm シリンジフィルターと10 mL シリン
ジを使って、10 mL より大きい試料容量で濾過した。
【００６２】多数回の溶媒洗浄によりSep-Pak カートリ
ッジを調製した。最初に滴下方式で２×10 mL アリコー
トのメタノールを適用して、溶媒によりカートリッジ中
を平衡化して、カートリッジを清浄する時間を与えた。
次いで同じく滴下方式でメタノールを２×10 mL 洗浄水
により洗い流した。１×10 mL アリコートの0.1 ％水性
ＴＦＡをゆっくりと適用して、試料負荷中のペプチド結
合を増強するのに必要な条件へとカラムを平衡化した。
連続した各洗浄間の（0.1 ％ＴＦＡでの最終洗浄を除
く）余分な液体を除去するため、カートリッジ上に空気
を吹き込み、その後空気がカラムに達しないように数滴
の溶媒をシリンジ中に残した。カートリッジ母材とペプ
チドとの相互作用を最大にするために前の0.1 ％ＴＦＡ
洗浄からカートリッジを湿ったままにして、試料を即座
にカートリッジに適用した。
【００６３】濾過した尿試料 10 mLを調製済カートリッ
ジ上に滴下添加し、流出液を廃棄するつもりで封じ込
め、そして生物危害廃棄物として捨てた。２×５mLアリ
コートの0.1 ％ＴＦＡ水溶液を適用して未結合物質を含
むカートリッジを洗浄し、その各々の溶媒洗浄の間に空
気洗浄を行って母材を乾燥させた。約８mLの0.15％CH3C
N ＋0.1 ％ＴＦＡ水溶液をゆっくりカートリッジに通し
てドリップさせ、それによりCH3CN が母材と相互作用し
そしてゆるく結合した物質を除去する時間を与えた。８
mL容量を適用した後でカートリッジ溶出液がまだ色を呈
していたら、溶出された全てのペプチドがその疎水性レ
ベルで解離しただろうことを示す溶出液が透明になるま
で、１mLの増分で更に溶媒を加えた。次いで空気により
泡が生じなくなるまで、空気をカートリッジに吹き込ん
で完全に乾燥させた。最終ペプチド溶出は100 ％CH3CN
中 0.1％ＴＦＡの２×５mL洗浄で起こり、そして溶出液
を収集した。この洗浄を非常にゆっくりに行って、溶媒
が平衡状態になってペプチドを完全に解離できるように
した（カートリッジを洗浄せずに数分間溶媒中に保持し
た）。最終洗浄の終わりにカートリッジを風乾して、全
てのペプチドが確実に除去されるようにした。
【００６４】最終溶出液を窒素ガス下で40℃の湯浴中に
置き、そして蒸発乾固せしめた。処理した試料を500 μ
L の15％CH3CN ＋0.1 ％ＴＦＡ水溶液により再構成し、
そして渦動攪拌器（ボルテックスミキサー）により激し
く攪拌してペプチド試料を完全に溶解せしめた。100 μ
L アリコートを逆相ＨＰＬＣ分析用に取った。
【００６５】高圧液体クロマトグラフィー実験条件 Waters Symmetry C18 カラム上での逆相クロマトグラフ
ィーを使って、尿試料をＡＳＤ症候群についての生化学
マーカーとして使用することができるペプチドについて
分析した。溶媒Ａは0.1 ％ＴＦＡ水溶液(V/V) から成
り、そして溶媒Ｂは95％アセトニトリル／５％水中の0.
1 ％ＴＦＡであった。溶出勾配は次の通りであった：
【００６６】
【表３】
【００６７】この勾配に使用する流速は1.4 mL／分であ
り、試料注入量は20μL であり、そしてＵＶ検出は215
nmに設定した。
【００６８】ＨＰＬＣ実験結果 次の５つの生物活性ペプチドを標準として使用し、それ
らの保持時間を測定した：β−カゾモルフィン（Sigma
C-5900）、オキシトシン（Sigma O-4375）、グルカゴン
（Sigma G-3157）、ロイシンエンケファリン（Sigma L-
9133）およびソマトスタチン（Sigma S-9129）。それら
のペプチドについて再現性のある保持時間が確立された
ら、尿試料を分析し、そして標準ペプチドと同じ時間に
溶出するピークを更なる分析に使用した。上記ＨＰＬＣ
法はペプチドの検出用に特別にデザインしたので、標準
物質と同様な保持時間を有する尿試料中の物質は当然ペ
プチドであると推測した。
【００６９】ＨＰＬＣは同一性の確定的証拠を提供しな
い。しかしながら、電子衝撃質量分析法（ＥＳ−ＭＳ）
は化学的同一性を確定する。標準ペプチドの領域で溶出
する、ペプチドであると推測された物質は、後述するよ
うにＥＳ−ＭＳを使ってペプチドであると確定されそし
てそれらのアミノ酸配列が決定された。それらのペプヂ
ドのアミノ酸配列が決定されたら、後述するようにそれ
らの起源、即ち、明らかにそれらのペプチドが得られる
１または複数の親分子を決定した。
【００７０】正常者および自閉症と診断された全患者か
らの試料中には幾つかの特徴的プロフィールを示す一連
のピーク（以後正常参考ピークまたはプロフィールと称
する）が現れた。最大の参考プロフィールは、16〜19分
の保持時間を有する四重線のピークであった（図１
Ａ）。この分類のピークは、ピークの相対的高さにわず
かな変動を有するが全ての試料に観察された。23±１分
の溶出時間を有する第二の一重線の参考ピークが観察さ
れ（図１Ｂ）、その高さも試料間で異なっていた。25±
１分の溶出時間を有する第三のピークも観察され、その
高さも四重線領域に比較して異なっていた（図１Ｃ）。
それらの全ピークの組合せが参考プロフィールを構成し
た。
【００７１】尿試料はそれらの入手源とクロマトグラフ
ィー上での性質に基づいて、３つのグループに分類され
た。観察された第一グループは参考ピークプロフィール
を含む正常試料であった。観察された第二グループは、
ＡＳＤと診断された患者からの試料の部分集合であっ
た。このグループからのクロマトグラムは正常者のもの
から識別可能であった。ＡＳＤと診断された患者からの
試料から構成される第三グループは、正常参考ピークに
加えて、15〜30分に溶出する生物マーカーピークを示し
た。この生物マーカーピークは、上述した標準ペプチド
と同じ領域に溶出した（図２および３）。
【００７２】自閉症と診断され次いでグルテン食および
無乳製品食を行った１人の小児からの尿試料は、生物マ
ーカーピークの欠失を示した。この試料は、正常の尿に
おいて観察された参考ピークプロフィールを含まなかっ
た（図４）。この試料中に生物マーカーピークが無いこ
とは、それがＡＳＤ徴候学の存否と相関するとすれば、
その患者がもはやＡＳＤと関連する行動学的徴候を示さ
ないだろうという結論に導くだろう。実際、この小児は
臨床的にＡＳＤから解かれ、そして自閉症が治癒したと
考えられる。
【００７３】第三グループの尿試料中の生物マーカーピ
ークに関連したペプチドはいずれも生物活性に結び付け
られなかった。しかしながら、ＡＳＤと診断された患者
の尿中のそれらの存在および正常試料中のそれらの不在
により、どれが表面上グルテン／カゼイン不耐性に関連
したＡＳＤの食事関連形態であるかについての生物マー
カーとしてそれらのペプチドを同定するための手段とし
て、上述のＨＰＬＣ法を使用することが可能である。Ｈ
ＰＬＣ／ＥＳ−ＭＳ組合せ法（後述する）は、この形態
の自閉症と生化学的に相関しているので、それらのペプ
チドおよびそれのファミリーを詳細に同定する手段を提
供する（それらの直鎖状アミノ酸配列に基づいて）。デ
ルトルフィン II 、デルモルフィンおよびモルフィネ調
節神経ペプチド（並びにそれらの誘導体）の存在が食事
に関連するかどうかは分からないが、それらは常にカゼ
インおよびグルテン関連種と提携して見つかった。よっ
て、尿中のそれらの存在は、自閉症のグルテン／カゼイ
ン不耐性の診断に役立つ。
【００７４】患者の試料中にデルモフィン、デルトルフ
ィン II およびモルフィネ調節神経ペプチド（並びにそ
れらの誘導体）が見つかったことは非常に驚くべきこと
であった。上述したように、それらのペプチドはカゼイ
ン／グルテンファミリーと共に存在し、そしてグルテン
／カゼイン不耐性の診断薬であった。しかしながら、そ
れらの存在は多発性硬化症（ＭＳ）のような他の神経学
的障害にも関連するかもしれない。それらはＨＩＶ感染
および／または腸ストレスにも関連するのかもしれな
い。それらのペプチドがグルテン／カゼイン関連ペプチ
ドよりも尿中で安定であることが観察された（これにつ
いては研究しなかったが、系統的挙動であった）。従っ
て、これらのペプチドはＡＳＤのカゼイン／グルテン不
耐性を診断するのに特に有用な生物マーカーであると考
えられる。
【００７５】電子衝撃質量分析の実験結果 ＨＰＬＣを使って観察された生物マーカーピークにより
表される種のペプチド性質を確認しそしてアミノ酸配列
を決定するのにＥＳ−ＭＳを使用した。
【００７６】ＥＳ−ＭＳは、ペプチドの正確な分子質量
とそれらのアミノ酸配列の両方を提供した。調製用逆相
クロマトグラフィー（上述したＨＰＬＣ条件のもとで）
を使って、生物マーカー領域内に保持時間を有する特定
画分を得、次いでそれをＥＳ−ＭＳを使って分析した
（図５〜８）。ペプチドの化学的素性が確定したら、そ
のペプチドのアミノ酸配列をタンパク質データーベース
中に入手可能なタンパク質のアミノ酸配列と比較して潜
在的な親タンパク質を決定し、かくして該ペプチドの潜
在的起源を決定した。the European Molecular Biologi
cal Labs (EMBL)Non-Redundant Database (NRDB) を使
って、Perkin Elmer/Sciexにより提供された「ペプチド
スキャン（Peptide Scan）」と称する検索エンジンを比
較分析に使用した。生物活性領域中で溶出するペプチド
断片の組合せは試料中に同時に存在するので、この方法
で容易に同定される（図９）。
【００７７】ＥＳ−ＭＳを使って、我々は正常な尿試料
（第一グループ）と第二グループの尿試料が生物マーカ
ー溶出領域にいずれのペプチドも含まないのに対して、
第三グループの尿試料はその領域に複数のペプチドを含
むことを確定した。食物タンパク質グルテンとカゼイン
（それぞれ小麦タンパク質と乳タンパク質）のペプチド
断片、並びにデルトルフィン II 、デルモルフィンおよ
びモルフィネ調節神経ペプチドのような未知の起源のペ
プチドが、第三グループからの試料に存在していた。食
物タンパク質のペプチド断片は豊富であったが、上述し
たように、全ての第三グループ試料中のデルモルフィ
ン、デルトルフィン II およびモルフィネ調節神経ペプ
チドの存在は驚くべきであった。正常試料または第二グ
ループの試料は食物タンパク質断片をいずれも含まなか
ったし、それらは本願明細書中に開示するような意外な
ペプチドをいずれも含まなかった。
【００７８】要約すれば、ＨＰＬＣと電子衝撃質量分析
法を使って、我々は25人のＡＳＤ患者の尿から多数の高
濃度ペプチドを分離しそして同定した。ＡＳＤ試料の高
い割合（25人中13人）において、我々は高濃度の低分子
量のアヘン剤様ペプチド、すなわち小麦グルテンからの
α−グリアジン（NH4-TyrProGlnProGlnProPhe-COOH）と
ウシカゼインからのカゾモルフィン（NH4-TyrProPhePro
GlyProIle-COOH）を見つけた。その上、Ｎ末端の４およ
び５マー並びに脱Tyr 形を含む、α−グリアジンとβ−
カゾモルフィンの分解生成物も著しく豊富であった。我
々はまた、明らかに食物源に由来しない他のアヘン剤様
ペプチド、例えばモルフィネのアヘン剤活性の1000倍を
有するデルモルフィン（NH4-TyrAlaPheGlyTyrProSer-CO
OH）、デルトルフィン II （NH4-TyrAlaPheGluValValGl
y-COOH）およびモルフィネ調節神経ペプチド（NH4-PheL
euPheGlnProGlnArgPhe-COOH ）を発見した。
【００７９】ＡＳＤ患者の尿中の上記ペプチドの発見
は、グルテン／カゼイン不耐性に表面上関連するＡＳＤ
の食事関連形態の診断を確認する生化学的手段を提供す
る。我々の発見は、臨床医が任意の適当な生化学的方法
を使ってこの特定の食事関連ＡＳＤを容易に診断できる
ようにする。今までに同定されたペプチドは既知のアヘ
ン剤様活性を有しており、モルフィネや他のアヘン剤作
用剤により誘導されるものと同様な行動を刺激し得る。
モルフィネ受容体の刺激はＡＳＤに関連した異常行動を
引き起こし得る。
【００８０】患者の尿中の生物マーカーペプチドの同定
により、たぶん行動に対する食事の影響を推測すること
が可能だろう。或る種の食物を排除することが、患者が
発達障害から回復するのを助けるだろう。不特定のまた
は未限定の起源を有する他のペプチドの存在は、追加の
発達障害並びに可能な治療法を示すことができる。
【００８１】実施例２ マーカーペプチドについてのイムノアッセイの開発ペプチドの合成 β−カゾモルフィンとＤ−デルモルフィンは、常法によ
り自動ペプチド合成装置上で合成した。各々を２形態で
調製した：１）モデル抗原およびキャリブレーターとし
ての生来のペプチド（以後、DasoおよびDermと称す
る）、および２）カルボキシ末端に追加のシステイン残
基を有する生来のペプチド（以後、Caso-CysおよびDerm
-Cysと称する）。各々の合成ペプチドの純度および配列
は、電子衝撃質量分析法（ＥＳ−ＭＳ）により決定し
た。
【００８２】タンパク質担体へのペプチドの結合 免疫処置、スクリーニングおよびイムノアッセイ開発の
ために、Caso-CysおよびDerm-Cysペプチドをそれぞれ、
アオガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）に結合した。簡単に言えば、各タンパク質を、一端
にマレイミド基を有しそして他方にＮ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル基を有する異種二価性架橋剤と反応
せしめた（50倍モル過剰、0.1 M KPO4, pH 7.5, ２時
間，ＲＴ）。5 mM EDTA を含む0.1 MKPO4, pH 7.0に対
して徹底的に透析した後、活性化タンパク質を50倍モル
過剰のCaso-CysまたはDerm-Cysと反応させた（0.1 M KP
O4, pH 7.0, 5 mM EDTA,ＲＴ,20時間）。過剰の遊離ペ
プチドをセファデックスＧ-25 上でのサイズ排除クロマ
トグラフィーにより除去した。結合度をSDS-PAGEによる
分子量シフトにより評価した。
【００８３】マウスの免疫処置 Ribiアジュバント中のCaso-Cys-KLHまたはDerm-Cys-KLH
のいずれか 100μg を、６〜12週齢の雌CAF1マウスに三
週間間隔で腹腔内注射により投与した。三回の注射後、
リン酸塩緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中の100 μg の免疫原
の最終腹腔内注射を、ハイブリドーマ作製のために犠牲
にする３日〜５日前に投与した。各々の抗原投与の一週
間後、各マウスを出血させ、その血清を後述のＥＬＩＳ
Ａ試験により抗ペプチド抗体についてスクリーニングし
た。
【００８４】ハイブリドーマの作製およびスクリーニン
グ 選択した動物を犠牲にし、そしてそれらの脾臓を無菌で
取り出した。脾細胞を分散させ、低張での溶解により赤
血球を除去し、そして得られた白血球をダルベッコ改良
イーグル培地で十分に洗浄した後、Laneの方法（Lane R
D 1985, J. Immunol. Meth. 81, 223-228 ）に本質的に
従ってSP2/0-Ag14細胞と融合せしめた。得られたハイブ
リドーマを96ウエルの微量培養プレート中に分配し、Ｈ
ＡＴ培地中で10〜14日間増殖させた後、生じた培養物を
スクリーニングした。
【００８５】モノクローナル抗体の選択 各微量培養プレートウエルを、常用のエンザイムリンク
ドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、抗
Casoまたは抗Derm抗体の存在についてスクリーニングし
た。まず、96ウエルの微量アッセイプレートのウエルを
Caso-Cys-BSAまたはDerm-Cys-BSAのいずれか（2 μg/m
L）を含有するＰＢＳ 100μL でコーティングし、次い
でＰＢＳ中１％オボアルブミン（ＯＡ）でブロックし
た。洗浄緩衝液（0.05％ Tween 20 を含むＰＢＳ）で洗
浄した後、各プレートを−20℃で凍結保存するかまたは
すぐにスクリーニングに使用した。各微量培養物からの
50μLを、コーティングした微量アッセイプレート中の
対応するウエルに移し、そして連続振盪しながら室温
（ＲＴ）で45〜60分間インキュベートしておいた。次い
でプレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、そして各ウエル
にＨＲＰ結合ヤギ抗マウス重鎖および軽鎖抗体（ＨＲＰ
−ＧＡＭ）を含む50μL を添加した。45〜60分間インキ
ュベーション後、プレートを５回洗浄し、そして各ウエ
ルに50μL のＡＢＴＳ基質を加えた。ミクロプレートリ
ーダー上で414 nmでの吸光度をモニタリングすることに
より、抗Casoまたは抗Derm抗体の存在を表すＨＲＰ活性
を検出した。バックグラウンドの２倍より大きい吸光度
を有するウエルを更なる実験のために選択した。
【００８６】可溶性遊離ペプチドとの反応性 遊離ペプチド並びにそれの結合形と反応する各抗体の能
力を上述のＥＬＩＳＡ法における単純な競合アッセイに
より評価した。選択したハイブリドーマ培養上清を次の
３つの希釈度で調製した：未希釈、0.1 ％オボアルブミ
ン含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−ＯＡ）での１：５希釈および
１：50希釈。次いで各試料を2 mM, 2 μMまたは2 nMのC
asoペプチドまたはDermペプチドを含有する同容量のＰ
ＢＳ−ＯＡと混合した。上述したのと全く同様にして、
得られた混合物をCaso-BSAまたはDerm-BSAをコーティン
グしたＥＬＩＳＡプレート上でアッセイした。最大希釈
度において高い吸光度を有しそして可溶性ペプチドと完
全に競合した上清を、次の特徴づけに向けて選択した。
【００８７】選択したDermおよびCaso抗体のイソタイプ
分析 各試料を８個の別々のウエル中でインキュベートし、次
いで各ウエルをＨＲＰ−ＧＡＭ、抗マウスμ，γ1 ，γ
2a，γ2b，γ3 およびα重鎖並びにκおよびλ軽鎖を含
む様々なＨＲＰ結合体を使って発色させたこと以外は、
上述したのと同じＥＬＩＳＡ法を使って、各抗体の重鎖
および軽鎖イソタイプを決定した。γ重鎖のいずれかを
有するそれらのウエルを次の分析のために選択した。
【００８８】抗ペプチド抗体のアフィニティー分析 上記の同族ペプチドに対する各Ｍａｂ（モノクローナル
抗体）のおよその親和力を決定するために、各々の選択
した培養上清をまず上述のＥＬＩＳＡ法において滴定し
て、飽和作用が固定化ペプチド結合体と遊離型可溶性ペ
プチドとの間の競合を隠蔽しないような十分に希薄な濃
度で各Ｍａｂが試験されることを保証した。上述したよ
うに、適当に希釈された選択した培養上清を、2 mM〜2
nMの濃度のＰＢＳ−ＯＡ中のペプチド同容量と混合し
た。414 nmでの吸光度の50％減少を引き起こした遊離ペ
プチドの濃度を、遊離ペプチドに対する見かけ親和力
（ｋob s ）と見なした。ｋobs ＜１μＭを有する抗体を
次の分析のために選択した。
【００８９】交差反応性分析 各ｍＡｂの特異性を調べるために、CasoまたはDermの代
わりに様々な他のペプチドを用いて上述のアフィニティ
ー試験を繰り返した。カゾモルフィンイムノアッセイの
場合、Derm、α−グリアジンまたはデルトルフィン II
との交差反応性（ｋobs ＜0.1 mM）は受け入れられなか
った。デルトルフィンイムノアッセイの場合、Casoおよ
びα−グリアジンとの交差反応性（ｋobs ＜0.1 mM）は
受け入れられなかったが、２つの分子が類似構造を有す
るために、デルトルフィン II との有意な交差反応性は
容認できると考えられた。
【００９０】選択したハイブリドーマ細胞系のクローニ
ングおよび安定化 抗Derm分泌性ハイブリドーマを含む４つのウエルと抗Ca
so分泌性ハイブリドーマを含む３つのウエルからの細胞
を軟寒天中でクローニングした。個々のコロニーを96ウ
エルの微量培養プレートに移し、２〜５日間増殖させ、
次いで抗Dermまたは抗Caso抗体の分泌についてＥＬＩＳ
Ａにより再スクリーニングした。各細胞系からの３つの
クローンを液体窒素中で長期保存用に凍結させた。
【００９１】イムノアッセイのデザイン 生物学的液体中のDermおよびCasoの定量のために２種類
のイムノアッセイを構築した。第一の抗原ダウンフォー
マット（Antigen Down Format ）と称するイムノアッセ
イは、上述したＥＬＩＳＡと同一である。96ウエルのマ
イクロタイタープレートのウエル上にペプチド−ＢＳＡ
結合体を吸着させた。プレートをＰＢＳ−１％ＯＡでブ
ロックし、洗浄しそして凍結保存した。未処理の培養上
清中の不純なものかまたはプロテインＡ−セファロース
上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製し
た抗ペプチド抗体を上述の通り滴定し、飽和作用が試料
中の固定化ペプチド−ＢＳＡと遊離ペプチドとの競合を
弱めないであろうことを保証した。2 mMから2 nMまでの
範囲の濃度のＰＢＳ−ＯＡ中のペプチドの希釈液を作製
することにより、標準試料を調製した。適当に希釈した
抗ペプチドの同容量をそのペプチド標準と混合し、そし
て各混合物の50μL を調製済のペプチド−ＢＳＡでコー
ティングされたプレートの一枚に移した。45〜60分間イ
ンキュベーション（振盪器上でＲＴ）後、プレートを洗
浄緩衝液で５回洗浄した。各ウエルに50μL のＨＲＰ−
ＧＡＭを添加し、更に45〜60分間インキュベーション
し、洗浄し、次いで各ウエルに50μL のＡＢＴＳ基質を
加えそして標準的マイクロプレートリーダー上で414 nm
で発色をモニタリングすることによりプレートを発色さ
せた。得られた標準曲線は、10 nM 未満の濃度が容易に
検出できそして１μM より高い濃度がプレート上に吸着
されたたペプチド−ＢＳＡ結合体に抗ペプチド抗体が結
合するのを完全に防いだ。抗原ダウンフォーマットは単
純であり、１nM〜１μM の濃度でCasoまたはDermのいず
れかを検出できる強力なフォーマットである。
【００９２】第二のフォーマットはRaMFc フォーマット
と称する。マイクロタイタープレートをウサギ抗マウス
IgＧ Fc ポリクローナル抗体(RaMFc) でコーティング
し、次いでプレートをＰＢＳ−１％ＯＡでブロックし、
洗浄し、そして凍結保存した。解凍したプレートを洗浄
した後、各ウエルを50μL の抗ペプチドｍＡｂ（未処理
の培養上清中の不純なものかまたはプロテインＡ−セフ
ァロース上でのアフィニティークロマトグラフィーによ
り精製したもの）と共にインキュベートした。抗ペプチ
ドｍＡｂが固定化RaMFc と結合する間の約30〜60分後、
プレートを洗浄した。試料をペプチド−ＨＲＰ（１nM）
と混合し、混合物を調製済のマイクロタイタープレート
のウエルに移した。30〜60分間インキュベーション（振
盪器上でＲＴにて）後、プレートを洗浄した。50μL の
ＡＢＴＳ基質の添加によりアッセイを顕化し、そして標
準マイクロプレートリーダー上での414 nmでの吸光度を
モニタリングすることにより定量した。RaMFc フォーマ
ットは、約１nMでペプチドを検出しそして0.1 〜１μM
で完全に阻害されるイムノアッセイを提供した。
【００９３】本願明細書中で引用した参考文献 本願明細書中で引用した下記の一覧表に示す全ての参考
文献は参考として組み込まれる。
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、正常尿試料の高圧液体クロマトグラム
を示す。Ａ，ＢおよびＣにより示されるピークは、正常
尿試料についての参考プロフィールを含んで成る。
【図２】図２は、自閉症尿試料の高圧液体クロマトグラ
ムを示す。「アヘン剤様」および／または「アヘン剤由
来」の診断マーカーピークの存在は15〜30分の領域に示
され、そして図１に比較した時の参考プロフィールピー
クの変化は患者が自閉症であると特徴づける。
【図３】図３は、自閉症尿試料の高圧液体クロマトグラ
ムを示す。診断マーカーピークは15〜30分の領域に存在
する。
【図４】図４は、臨床的に「回復した」と確認された自
閉症患者の高圧液体クロマトグラムを示す。参考プロフ
ィールピークが描かれ、その上診断マーカーピークが欠
失している。
【図５】図５は、逆相ＨＰＬＣから得られた患者の尿試
料画分の電子衝撃質量分析を示す。各スパイクは指摘さ
れた分子量の単一ペプチドを表し、そして図中には同定
された神経ペプチドが表示されている。
【図６】図６は、逆相ＨＰＬＣから得られた患者の尿試
料画分の電子衝撃質量分析を示す。各スパイクは指摘さ
れた分子量の単一ペプチドを表し、そして図中には同定
された神経ペプチドが表示されている。
【図７】図７は、逆相ＨＰＬＣから得られた患者の尿試
料画分の電子衝撃質量分析を示す。各スパイクは指摘さ
れた分子量の単一ペプチドを表し、そして図中には同定
された神経ペプチドが表示されている。
【図８】図８は、逆相ＨＰＬＣから得られた患者の尿試
料画分の電子衝撃質量分析を示す。各スパイクは指摘さ
れた分子量の単一ペプチドを表し、そして図中には同定
された神経ペプチドが表示されている。
【図９】図９は、逆相ＨＰＬＣ分画と各画分のＥＳ−Ｍ
Ｓ分析の組合せを使った、生物マーカー領域に溶出する
ペプチドの同定を示す。
【図１０】図１０は、モノクローナル抗体についてのＥ
ＬＩＳＡデータを示す。
【図１１】図１１は、モノクローナル抗体についてのＥ
ＬＩＳＡデータを示す。
【図１２】図１２は、モノクローナル抗体についてのＥ
ＬＩＳＡデータを示す。
【図１３】図１２は、モノクローナル抗体についてのＥ
ＬＩＳＡデータを示す。
【図１４】図１４は、Ｄ−デルモルフィンについてのイ
ムノアッセイを示す。明細書中に記載された抗原ダウン
イムノアッセイを使ってＤ−デルモルフィン（■）およ
びＬ−デルモルフィン（▲）の用量応答曲線を作成し
た。Ｂ／Ｂ0 は、各ペプチド濃度で測定されたＡ414 を
ペプチド濃度が０である時に測定されたＡ414 によって
割った比率である。
【図１５】図１５は、β−カゾモルフィンについてのイ
ムノアッセイを示す。明細書中に記載された抗原ダウン
イムノアッセイを使ってβ−カゾモルフィン（■）およ
び初めの２個のアミノ酸が逆になったβ−カゾモルフィ
ンであるTyr2caso（▲）の用量応答曲線を作成した。Ｂ
／Ｂ0 は、各ペプチド濃度で測定されたＡ414 をペプチ
ド濃度が０である時に測定されたＡ414 によって割った
比率である。
【図１６】図１６はDerm 1.1.1の交差反応性を示す。明
細書中に記載の抗原ダウンイムノアッセイを行うことに
より、様々なペプチドのそれぞれについてのＫobs を求
めた。Ｋobs は、測定されたＡ414 値を阻害ペプチドの
濃度が０であるときに測定されたＡ414 値の50％に減少
させるのに必要なペプチドの濃度である。Derm 1.1.1は
Ｄ−デルモルフィン（２番目の位置のＤ−アラニン以外
は全てＬ−アミノ酸）のアミノ末端の４アミノ酸に高度
に特異的であり、デルトルフィン II と高度に交差反応
性であり、Ｌ−デルモルフィン（全てＬ−アミノ酸）と
はほとんど交差反応性がなく、そしてβ−カゾモルフィ
ンまたはα−グリアジンとは本質的に全く反応性がな
い。
【図１７】図１７はCaso 4.2.2の交差反応性を示す。明
細書中に記載の抗原ダウンイムノアッセイを行うことに
より、様々なペプチドのそれぞれについてのＫobs を求
めた。Ｋobs は、測定されたＡ414 値を阻害ペプチドの
濃度が０であるときに測定されたＡ414 値の50％に減少
させるのに必要なペプチドの濃度である。Caso 4.2.2は
ウシβ−カゾモルフィンのアミノ末端の４アミノ酸に高
度に特異的であり、そしてα−グリアジン、デルモルフ
ィンまたはヒトカゾモルフィンとはほとんど交差反応性
がない。
【配列表】SEQUENCE LISTING <110> Freidman, Alan Shanahan, Michelle Venturini, Al Daiss, Jack <120> DIAGNOSTIC MARKERS FOR HUMAN DISORDERS <130> A996017 <141> 1999-06-15 <150> US 60/089,238; 60/089,237; newly-filed non-p
rovisional <151> 1998-06-15 <160> 43 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Protein <400> 1 Tyr Pro Phe Pro Gly Pro Ile 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Protein <400> 2 Tyr Pro Phe Pro Gly Pro 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Protein <400> 3 Tyr Pro Phe Pro Gly 1 5 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Protein <400> 4 Tyr Pro Phe Pro 1 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Protein <400> 5 Tyr Pro Phe 1 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Protein <400> 6 Pro Phe Pro Gly Pro Ile 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Protein <400> 7 Tyr Pro Gln Pro Gln Pro Phe Pro 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Protein <400> 8 Tyr Pro Gln Pro Gln Pro 1 5 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Protein <400> 9 Tyr Pro Gln Pro Gln 1 5 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Protein <400> 10 Tyr Pro Gln Pro 1 <210> 11 <211> 3 <212> PRT <213> Protein <400> 11 Tyr Pro Gln 1 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Protein <400> 12 Pro Gln Pro Gln Pro Phe 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Protein <400> 13 Tyr Ala Phe Gly Tyr Pro Ser 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Protein <400> 14 Tyr Ala Phe Gly Tyr Pro 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Protein <400> 15 Tyr Ala Phe Gly Tyr 1 5 <210> 16 <211> 4 <212> PRT <213> Protein <400> 16 Tyr Ala Phe Gly 1 <210> 17 <211> 3 <212> PRT <213> Protein <400> 17 Tyr Ala Phe 1 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Protein <400> 18 Ala Phe Gly Tyr Pro Ser 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Protein <400> 19 Tyr Ala Phe Glu Val Val Gly 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Protein <400> 20 Tyr Ala Phe Glu Val Val 1 5 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Protein <400> 21 Tyr Ala Phe Glu Val 1 5 <210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Protein <400> 22 Tyr Ala Phe Glu 1 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Protein <400> 23 Ala Phe Glu Val Val Gly 1 5 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Protein <400> 24 Phe Leu Phe Gln Pro Gln Arg Phe 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Protein <400> 25 Phe Leu Phe Gln Pro Gln Arg 1 5 <210> 26 <211> 6 <212> PRT <213> Protein <400> 26 Phe Leu Phe Gln Pro Gln 1 5 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Protein <400> 27 Phe Leu Phe Gln Pro 1 5 <210> 28 <211> 4 <212> PRT <213> Protein <400> 28 Phe Leu Phe Gln 1 <210> 29 <211> 3 <212> PRT <213> Protein <400> 29 Phe Leu Phe 1 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Protein <400> 30 Tyr Ala Phe Asp Val Val Gly 1 5 <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Protein <400> 31 Tyr Ala Phe Asp Val Val 1 5 <210> 32 <211> 5 <212> PRT <213> Protein <400> 32 Tyr Ala Phe Asp Val 1 5 <210> 33 <211> 4 <212> PRT <213> Protein <400> 33 Tyr Ala Phe Asp 1 <210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Protein <400> 34 Ala Phe Asp Val Val Gly 1 5 <210> 35 <211> 6 <212> PRT <213> Protein <400> 35 Ala Pro Phe Xaa Gly Xaa 1 5 <210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> Protein <400> 36 Ala Pro Phe Xaa Gly Xaa 1 5 <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Protein <400> 37 Ala Pro Phe Xaa Gly 1 5 <210> 38 <211> 4 <212> PRT <213> Protein <400> 38 Ala Pro Phe Xaa 1 <210> 39 <211> 3 <212> PRT <213> Protein <400> 39 Ala Pro Phe 1 <210> 40 <211> 2 <212> PRT <213> Protein <400> 40 Ala Pro 1 <210> 41 <211> 5 <212> PRT <213> Protein <400> 41 Pro Phe Xaa Gly Xaa 1 5 <210> 42 <211> 5 <212> PRT <213> Protein <400> 42 Tyr Pro Phe Pro Pro 1 5 <210> 43 <211> 4 <212> PRT <213> Protein <400> 43 Tyr Gly Gly Tyr 1
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１１年９月１日（１９９９．９．１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正内容】
【請求項４】 配列番号１；配列番号２；配列番号３；
配列番号４；配列番号５および配列番号６から成る群よ
り選ばれた少なくとも１つのペプチド配列を含んで成る
診断マーカー。 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１１年１０月２１日（１９９９．１０．
２１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１３】
【図１】
【図２】
【図１５】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１４】
【図１１】
【図１２】
【図１６】
【図１７】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アルバート ジェイ．ベントゥリニ アメリカ合衆国，ペンシルバニア 18301, イースト ストローズバーグ，ラッセル リッジ ロード 37 (72)発明者 ジョン エル．ダイス アメリカ合衆国，ニューヨーク 14613, ロチェスター，レイクビュー パークウェ イ 30 (72)発明者 アラン イー．フリードマン アメリカ合衆国，ニューヨーク 14617, ロチェスター，サマーシャー ドライブ 120

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒト障害についての診断マーカーであっ
    て、(a) アヘン剤様ペプチド；および(b) アヘン剤由来
    ペプチドから成る群より選ばれたペプチドを含んで成る
    診断マーカー。
  2. 【請求項２】 前記ヒト障害が自閉症スペクトル障害で
    ある、請求項１に記載の診断マーカー。
  3. 【請求項３】 前記自閉症スペクトル障害が、自閉症、
    広汎発達障害、アスペルガー症候群、注意欠陥障害（Ａ
    ＤＤ）および注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）から成る群
    より選ばれる、請求項１に記載の診断マーカー。
  4. 【請求項４】 前記自閉症スペクトル障害が、自閉症、
    広汎発達障害、アスペルガー症候群、注意欠陥障害（Ａ
    ＤＤ）および注意欠陥過活動障害（ＡＤＨＤ）から成る
    群より選ばれる、請求項１に記載の診断マーカー。
  5. 【請求項５】 配列番号７；配列番号８；配列番号９；
    配列番号10；配列番号11；および配列番号12から成る群
    より選ばれた少なくとも１つのペプチド配列を含んで成
    る診断マーカー。
  6. 【請求項６】 配列番号13；配列番号14；配列番号15；
    配列番号16；配列番号17および配列番号18から成る群よ
    り選ばれた少なくとも１つのペプチド配列を含んで成る
    診断マーカー。
  7. 【請求項７】 配列番号19；配列番号20；配列番号21；
    配列番号22および配列番号23から成る群より選ばれた少
    なくとも１つのペプチド配列を含んで成る診断マーカ
    ー。
  8. 【請求項８】 配列番号24；配列番号25；配列番号26；
    配列番号27；配列番号28および配列番号29から成る群よ
    り選ばれた少なくとも１つのペプチド配列を含んで成る
    診断マーカー。
  9. 【請求項９】 配列番号31；配列番号32；配列番号33；
    配列番号34；配列番号35；配列番号36；配列番号37；配
    列番号38；配列番号39；配列番号40；配列番号41；配列
    番号42および配列番号43のアミノ酸配列を有する少なく
    とも１つのペプチド配列を含んで成る診断マーカー。
  10. 【請求項１０】 ヒト障害の診断方法であって、体組織
    または体液においてアヘン剤様活性を有するペプチドを
    同定することを含んで成る方法。
JP11168555A 1998-06-15 1999-06-15 ヒト障害についての診断マ―カ― Pending JP2000221191A (ja)

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