KR20080032070A - 항-ＴｒｋＢ 모노클로날 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20080032070A
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샹-양 탄
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Abstract

본 발명은 사람 TrkB에 대한 모노클로날 항체를 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명의 항체는 사람 TrkB에 결합하여 이를 활성화시킨다. 특정 양태에서, 본 발명의 항체는 이들 항체가 사람 TrkA 또는 사람 TrkC에 결합하지 않는다는(또는 활성화시키지 않는다는) 점에서 사람 TrkB에 대해 선택적이다. 일부 양태에서, 본 발명의 모노클로날 항체는 쥐 TrkB와 교차-반응한다. 본 발명의 항체의 사람화 또는 베니어링된(veneered) 버젼도 또한 포함된다. 본 발명의 항체를 포함하는 약제학적 조성물과 함께, 본 발명의 항체의 제조방법 및 치료, 검출 또는 정제 목적으로 이들 항체를 이용하는 방법이 제공된다.
Figure P1020087000331
모노클로날 항체, 사람 TrkB 수용체, TrkA, TrkC, 세포외 도메인, 효능제, 신경계 질환, 하이브리도마

Description

항-ＴｒｋＢ 모노클로날 항체 및 이의 용도{Anti-TrkB monoclonal antibodies and uses thereof}
우선권 정보
본 출원은 2005년 6월 6일자로 출원된 미국 특허원 제 60/687,705호(이의 전문은 본원에서 참조로 인용된다)를 우선권으로 청구한다.
Trk 티로신 키나제 수용체는 생존, 분화, 성장 및 재생을 포함하는 광범위한 스펙트럼의 신경세포 반응에서 중요한 역할을 하는 다중-도메인 단일-트랜스막(transmembrane) 수용체이다. 이들은 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래의 향신경 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3 (NT- 3) 및 뉴로트로핀-4/5 (NT-4/5)을 포함하는 단백질 성장 인자 계열(family)인 뉴로트로핀에 대한 고친화성 수용체이다. 뉴로트로핀은 고도로 보존된 구조직 특징을 공유하고 있으나, 이들의 고유한 아미노산 서열은 각 구성원이 특이적 Trk 수용체, 즉 TrkA, B 또는 C의 세포외 도메인과 고친화성 상호작용을 일으키도록 한다. 따라서, NGF는 TrkA에 대한 바람직한 리간드이고, BDNF 및 NT-4/5는 TrkB에 대한 바람직한 리간드이고, NT-3은 TrkC에 결합하는 것으로 나타났지만, TrkA 및 TrkB에 낮은 친화성으로 결합하는 것으로 보인다.
Trk 수용체 가운데, TrkB의 역할은 중추신경계(CNS)에서 잘 규명되어 있다. TrkB는 신피질, 해마, 선조체, 후각 망울 및 뇌간을 포함하는 뇌에 널리 분포되어 있다. 동족(cognate) 리간드로서 BDNF를 사용할 경우, 신경세포 생존, 분화 및 신경재생에서의 TrkB의 중요한 역할은 졸중, 척수 손상, 신경퇴행성 모델, 축삭절제(axotomy) 및 ALS를 포함하는 수많은 신경퇴행성 모델에서 나타났다.
다양한 신호전달 분석 및 수용체 녹아웃(knockout) 시스템을 통해서, BDNF의 반응은 TrkB의 결합 및 활성화에 의존하는 것으로 나타났다. 주지된 바와 같이, Trk 수용체는 다중-도메인 단일-트랜스막 단백질이다. 이들은 세포외 리간드 결합 도메인, 트랜스막 영역 및 세포내 티로신 키나제 도메인으로 이루어져 있다. 세포외 도메인은 2개의 시스테인 일단(cluster)과 2개의 면역글로불린(Ig)-유사 도메인이 양 측면에 위치하는 류신-풍부 모티프로 이루어져 있다. 리간드-도킹(docking)에서 류신-풍부 모티프 및 제1 Ig 도메인과 같은 다른 영역의 기여도 또한 제안된 바 있으나, Trk 수용체는 주로 제2 Ig-유사 도메인을 통해서 이의 리간드와 상호작용하는 것으로 나타났다. Trk 수용체의 리간드 결합 도메인의 결정 구조 뿐만 아니라 리간드-수용체 복합체도 해명되었다. 리간드-수용체 계면은 2개의 팻치, 즉, 모든 뉴로트로핀 간에 공유된 보존된 결합 모티프에 대한 하나의 팻치 및 각 뉴로트로핀에 특이적인 다른 하나의 팻치로 이루어진 것으로 보인다.
뉴로트로핀이 Trk 수용체에 결합시, 수용체 이량체화 및 후속적 입체형태 변화가 일어나며, 이는 세포내 티로신 키나제 도메인의 활성화를 유도하는 것으로 사료된다. Trk 수용체의 세포내 도메인에는 몇가지 보존된 티로신이 존재한다. 상 기 키나제 도메인의 자가조절성 루프의 인산화는 키나제 활성을 활성화시키고, 다른 잔기의 인산화는 이들 수용체를 Ras/세포외 신호 조절된 키나제 (ERK) 단백질 키나제 경로, PBK/ Akt 키나제 경로 및 포스포리파제 C-감마를 포함하는 세포내 신호 연쇄증폭반응(cascade)에 커플링시키는 어댑터 단백질에 대한 결합 부위를 생성시킴으로써 신호전달을 촉진시킨다. 다소 중복되더라도, 이들 개개 경로는 별개의 생물학적 활성에 관여한다: Ras/MAPK는 신경세포 분화 및 증식을 조절하고, PI3/Akt 경로는 액틴 동력학 및 생존을 제어하고, PLC 감마는 칼슘 고정화에 관여한다.
오늘날까지, TrkB의 강력하고 선택적인 생체내 효능제로서 작용하는 시약의 성공적 예는 없다. 재조합 단백질로서 BDNF가 시험관내 및 생체내에서 수많은 CNS 퇴행성 모델에서 신경세포 생존 및 신경재생을 증가시키는 것으로 나타났지만, 임상에서 BDNF 단백질 요법의 결과는 부정적이었는데, 이는 아마도 BDNF가 생체내 반감기가 짧기 때문일 가능성이 크다. 따라서, 당업계에서는 TrkB의 강력하고 선택적인 생체내 효능제로서 작용하는 약제학적 시약이 요구된다.
발명의 개요
본 발명은 사람 TrkB에 대한 모노클로날 항체를 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명의 항체는 사람 TrkB에 결합하여 이를 활성화시킨다. 특정 양태에서, 본 발명의 항체는 이들 항체가 사람 TrkA 또는 사람 TrkC보다 TrkB에 우선적으로 결합한다는 점에서 사람 TrkB에 대해 선택적이다. 일부 양태에서, 본 발명의 모노클로 날 항체는 쥐 TrkB와 교차반응한다.
본 발명은 또한 이들 항체중 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 추가로 본 발명의 모노클로날 항체의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 항체를 생산하는 하이브리도마와 마찬가지로 본 발명의 항체의 사람화 또는 베니어링된(veneered) 버젼도 또한 포함된다.
본 발명은 추가로 TrkB의 효능제로서 이들 모노클로날 항체를 사용하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 모노클로날 항체는 사람 TrkB의 효능제로서 사용된다. 이러한 양태에 따라서, 당해 항체를 사용하여, 신경계 질환을 포함하는 TrkB 활성화가 요구되는 상태를 치료할 수 있다.
본 발명은 또한 추가로, 본 발명의 항체를 사용하여, 샘플중에서 TrkB를 검출하는 방법 및 샘플로부터 TrkB를 정제하는 방법 제공한다.
도 1은 5마리의 면역화된 마우스(M1 내지 M5)로부터의 면역 혈청 중 TrkB-특이적 항체 활성화를 도시한 것이다. 사람 IgG1의 Fc 영역에 융합된 사람 TrkB의 세포외 도메인을 포함하는 재조합 단백질(rhTrkB-EDC-Fc)을 이용한 ELISA 검정의 면역 혈청 결합 결과는 도 1A에 도시한다. 쥐 TrkB의 세포외 도메인을 포함하는 재조합 단백질(rmTrkB-EDC)을 이용한 ELISA 검정의 면역 혈청 결합 결과는 도 1B에 도시한다. 면역 혈청이 경쟁적 ELISA 검정에서 rhTrkB-EDC-Fc 및 BDNF의 상호작용을 어느 정도까지 차단할 수 있는가는 도 1C에 도시한다. HEK-293 세포상의 표면 rhTrkB에 대한 면역 혈청 결합은 도 1D에 도시한다.
도 2는 표면 rhTrkB를 발현하는 HEK-293 세포를 사용하는 루시페라제 활성 검정에서 뉴로트로핀으로 수득된 제어 결과를 도시한 것이다. 당해 제어 결과는 당해 검정이 TrkB의 활성화를 선택적으로 나타낼 수 있음을 보여준다.
도 3은 도 2와 동일한 루시페라제 활성 검정에서 면역 혈청으로 수득된 결과를 도시한 것이다. 당해 결과는 hTrkB 세포의 면역 혈액과의 항온처리가 용량-의존적 방식으로 루시페라제 신호를 증가시킴을 보여준다.
도 4는 도 2와 동일한 루시페라제 활성 검정에서 특정 TrkB 항체로 수득된 결과를 도시한 것이다. 모든 항체는 10-10 (M) 범위의 EC50으로 용량-의존적 증가를 유발시켰다. 최대 신호 창(window)은 대부분의 항체에 있어 기저치보다 7배 이상이였으며, 이는 200 ng/ml에서 BDNF에 의해 유도된 반응(기저치보다 6.2배)과 필적하였다.
도 5는 신경돌기 증식(neurite outgrowth) 검정에서 특정 TrkB 항체로 수득된 결과를 도시한 것이다. 당해 검정은 신경세포 분화시 TrkB를 발현하는 것으로 공지된 사람 신경모세포종 SY5Y 세포를 사용하였다. BDNF 및 대부분의 항체의 부가는 신경돌기 길이(도 5A) 및 분지점의 수(도 5B)의 증가로 입증된 바와 같이 신경돌기 증식을 촉진하였다. 몇가지 처리군의 대표적 영상을 도 5C에 도시한다. 이들 항체의 서브셋트에 대해 수득된 전체-용량 반응 분석으로부터의 결과는 도 5D에 도시한다.
도 6은 신경보호 검정에서 특정 TrkB 항체로 수득된 결과를 도시한 것이다. 당해 검정은 혈청 회수(serum withdrawal) 손상 후에 분화된 SY5Y 세포의 생존을 측정한다. 결과는 BDNF 및 몇가지 항체가 분화된 SY5Y 세포를 보호하였음을 보여줬는데, 이는 세포 생존성의 용량-의존적 증가를 입증한다.
도 7은 재조합 쥐 TrkB (rmTrkB)에 결합하는 것으로 나타난 3가지 항-TrkB 항체, 18C3, 29D7 및 17D11를, 내인성 랫트 TrkB 수용체에 대한 활성에 대해 랫트 소뇌 과립 뉴론(CGN) 배양물에서 시험한 경우에 수득된 결과중 일부를 도시한 것이다. 신경돌기 증식 검정 및 신경보호 검정(오직 29D7)에 대한 결과를 도시한다.
도 8은 특정 항-TrkB 항체를 TrkB 자가인산화의 유도에 대해 웨스턴 분석으로 평가한 경우에 수득된 결과를 도시한 것이다. 모든 항체는 활발한 TrkB 인산화를 유도하였으며, 이러한 효과는 키나제 억제제 K252a 처리에 의해 길항되었는데, 이는 이들 TrkB-결합 항체가 TrkB의 활성화를 유발하였음을 가리킨다.
도 9는 특정 항-TrkB 항체로 수득된, FACS TrkA 결합 검정(9A) 및 TrkA 루시페라제 활성 검정(9B)의 결과를 도시한 것이다. 당해 결과는 본 발명의 항체가 사람 TrkA에 결합하지 않거나 이를 활성화시키지 않음을 보여준다.
도 10은 항-TrkB 항체를 TrkC 루시페라제 활성 검정에서 평가하였을 때 수득된 결과를 도시한 것이다. 당해 결과는 본 발명의 항체가 사람 TrkC 세포를 활성화시키지 않음을 보여준다.
도 11은 레빈(Levine) 과정에 기초하는 신생아 저산소증-허혈(HI)의 설치류 모델을 도시한 것이다.
도 12는 사람 TrkB의 아미노산 서열(서열번호 1)을 도시한 것이다.
도 13은 쥐 TrkB의 아미노산 서열 (서열번호 2)을 도시한 것이다.
도 14는 랫트 TrkB (서열번호 3)의 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 15는 닭 TrkB의 아미노산 서열(서열번호 4)을 도시한 것이다.
도 16은 사람 TrkA의 아미노산 서열(서열번호 5)도시한 것이다.
도 17은 사람 TrkC의 아미노산 서열(서열번호 6)을 도시한 것이다. .
도 18은 TrkB 양성 scFv 클론의 대표적 셋트로부터의 파아지 결합 ELISA 데이타(BMV 라이브러리 패닝(panning) 선별)를 도시한 것이다.
도 19는 FACS 검정을 사용하여 시험된 TrkB 선택된 scFv 항체의 결합 특이성을 도시한 것이다. 본 데이타는 TrkB 선택된 scFv 항체가 막 결합된 TrkB(검은색 그래프)과 특이적 방식으로 반응하지만, 대조군 세포(흰색 그래프)에 대한 교차-반응성이 없음을 보여준다.
도 20은 29D7 IgG 항체 및 이의 Fab 단편과 사람(A) 및 마우스(B) TrkB에 대한 ELISA 결합 결과를 도시한 것이다. 29D7의 전체 IgG 및 Fab 둘다는 사람 및 마우스 TrkB에 대한 용량-의존적 결합 활성을 나타냈다. 그러나, Fab의 ED50 값은 온전한 27D7의 값보다 약 100배 낮았다. 동종형 대조군 IgG1 또는 이의 Fab 단편 중 어느 것도 TrkB에 결합하지 않았다.
도 21은 29D7 IgG 또는 29D7 Fab로 처리한지 16시간 후에 측정된 HEK-293 세포에서의 루시페라제 활성을 도시한 것이다. 29D7의 전체 IgG 및 Fab 둘다는 TrkB의 활성을 가리키는 루시페라제 활성을 용량-의존적으로 유도하였다. 그러나, 29D7 Fab의 ED50 값은 27D7 IgG의 값보다 약 27배 높았다(각각, 27D7 IgG 및 29D7 Fab의 경우 0.083 nM 및 2.28 nM). 동종형 대조군 IgG1 또는 이의 Fab 단편 중 어느 것도 TrkB 활성화에 효과를 미치지 않았다.
도 22는 항-TrkB 모노클로날 항체 17D11, 29D7, 7F5, HE1 및 19E12의 에피토프 지도화 분석의 결과를 도시한 것이다. 17D11 모노클로날 항체는 사람 TrkB의 IgG-2 절편의 루프-3(KNEYGKD, 서열번호 7, 서열번호 1의 아미노산 364 내지 370); 및 IgG-2 절편의 루프-1(KGNPKP, 서열번호 8, 서열번호 1의 아미노산 308 내지 313)을 인식한다. 29D7, 7F5, 11E1 및 19E12 모노클로날 항체는 모두 사람 TrkB의 IgG-1 절편의 루프-3(ENLVGED, 서열번호 10, 서열번호 1의 아미노산 269 내지 275)을 인식하며 또한 사람 TrkB의 IgG-1 절편의 루프-1(AGDPVP, 서열번호 11, 서열번호 1의 221 내지 226)을 인식할 수 있다.
도 23은 저산소증-허혈성(HI) 손상 후 상이한 처리에 대한 선조체 및 해마로부터 수득된 염색결과를 비교한 것이다.
도 24는 HI 손상 후 상이한 처리에 대한 총 뇌 조직 손실(A) 및 소(小)구역의 조직 손실(B)를 비교한 것이다. 데이타는 평균 및 평균의 표준오차(S.E.M.)로서 제시되어 있다. BDNF 및 항-TrkB 모노클로날 항체 29D7은 HI 손상으로부터 뇌의 유의적 용량-의존적 보호를 나타냈다. 보호는 뇌의 어떠한 특정 소구역에 국한되지 않았고, 가장 큰 보호는 일반적으로 피질에서 관찰되었다.
도 25는 HI 손상 후 상이한 처리에 대한 카스파제-3 활성을 측정하기 위해 사용된 DEVD-AMC 절단 검정의 결과를 도시한 것이다. 뇌의 상이한 영역에 대한 결 과는 평균 ±S.E.M.으로서 제시한다. BDNF 및 항-TrkB 모노클로날 항체 29D7은 HI 손상에 의해 유발된 카스파제-3 활성화를 차단하였다.
도 26은 HI 손상 후 상이한 처리를 받은 마우스로부터 채취된 단백질의 면역블롯을 도시한 것이다. 샘플은 SDS-PAGE로 분리시키고 특정 카스파제-3 기질(PARP및 α-스펙트린)에 대한 항체를 이용하여 면역블롯팅하였다. β-액틴에 대한 항체를 대조군으로서 사용하여 단백질이 동일하게 부하되었는지를 확인하였다. 당해 결과는 이들 카스파제-3 기질의 절단이 BDNF 및 항-TrkB 모노클로날 항체 29D7(C = 경동맥 결찰부의 반대 측면 및 I = 경동맥 결찰부의 동측면)에 의해 억제되었음을 나타낸다.
도 27은 항-TrkB 항체 29D7(또는 대조군으로서 비히클)의 뇌실내 주사 후 정상 마우스로부터 채취된 단백질 샘플의 면역블롯을 도시한 것이다. 샘플은 주사 후 1, 2, 6, 12 및 24시간째에 채취하였다. 샘플은 SDS-PAGE에 의해 분리시키고 TrkB 활성화(포스포-ERK1/2 및 포스포-AKT)의 결과로서 인산화되는 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 면역블롯팅하였다. β-액틴에 대한 항체를 대조군으로서 사용하여 단백질이 동일하게 부하되었는지를 확인하였다. 당해 결과는 항-TrkB 모노클로날 항체 29D7이 ERK1/2 및 AKT의 시간-의존적 인산화를 유도하였음을 보여준다(해마 및 피질 샘플로부터의 데이타를 도시하며 이 데이타는 4개의 나머지 샘플로부터 수득된 결과를 대표하는 것이다).
도 28은 도 27에 도시한 ERK 인산화의 농도계측적 정량이다.
도 29는 도 27에 도시한 AKT 인산화의 농도계측적 정량이다.
도 30은 고정되고 뉴론-특이적 마커 NeuN (좌측) 및 항-포스포-ERK1/2 항체(중앙)에 대한 항체로 면역형광적으로 표지된, 비히클 및 29D7 처리된 뇌 조직을 도시한 것이다. 우측 도면은 이들 2개를 병합한 것이다. ERK 1/2 인산화는 29D7 처리된 샘플에서 유의적으로 강하였다.
도 31은 항-TrkB 모노클로날 항체 29D7의 뇌실내 투여 후 피질 및 해마 조직 중의 ERK1/2 활성화의 시간에 따른 추이를 도시한 것이다.
도 32는 (A) MAG 및 (B) 미엘린에 의해 유발된, 1차 소뇌 과립 뉴론의 신경돌기 증식의 용량-의존적 억제를 도시한 것이다.
도 33은 항-TrkB 모노클로날 항체 29D7에 의해서 (A) MAG- 및 (B) 미엘린-매개된 신경돌기 억제가 역전되었음을 도시한 것이다.
본 발명은 부분적으로는 TrkB 수용체의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체가 TrkB를 이량체화시키고 당해 수용체의 활성화 및 BDNF에 의해 매개되는 것과 유사한 생물학적 반응을 유도하기에 충분할 수 있다는 발견을 기본으로 한다.
모노클로날 항체는 일반적으로 질환의 조사, 의학적 진단 및 임상 치료에서 다양한 유용성을 갖는 고유한 단백질 부류를 대표한다. 유리하게도, 모노클로날 항체는 BDNF와 같은 재조합 단백질보다 큰 약동학적 안정성을 가짐으로써 임상적 적용을 위한 상당한 이점을 갖는 지속될 수 있는 약리학적 효과를 가능케 한다. 예를 들면, 모노클로날 항체 의약의 현재 임상적으로 승인된 사용은 기관 이식 거부의 예방, 암의 치료(예: 유방암, 결장암, 비호지킨 림프종, 백혈병), 류마티스 관절염, 호흡기 합포체 바이러스 질환에 대한 예방, 크론병, 경피 관상동맥 중재술) 및 천식을 포함한다. 다양한 사람 질환을 모노클로날 항체로 치료하기 위한 다른 의학적 적용도 또한 현재 임상 시험중이다. 이들 모노클로날 항체의 생물학적 효과는 일반적으로 내인성 리간드에 의해 야기되는 분자적 사건들을 차단하거나 중화시킴으로써 성취되며, 따라서 주로 특이적 고 친화성 길항제로서 작용한다. 본 발명에서 모노클로날 항체는 수용체-리간드 상호작용의 생물학적 효과를 모사하는 효능제로서 사용된다.
1. 모노클로날 항체 및 하이브리도마
한 측면에서, 본 발명은 사람 TrkB(서열번호 1)에 결합하는 모노클로날 항체를 제공한다. 특정 양태에서, 이들 항체는 약 10 pM 내지 약 500 nM, 예를 들면, 약 10 pM 내지 약 1 nM, 약 10 pM 내지 약 100 pM 또는 약 10 pm 내지 약 50 pM 범위의 ED50으로 사람 TrkB(서열번호 1)에 결합한다. 본원에서 사용되는 "약"이란 용어는 ±15%의 변동을 포괄하여 정의된다.
한 양태에서, 본 발명의 항체는 또한 사람 TrkB의 효능제이다. 특정 양태에서, 이들 항체는 약 10 pM 내지 약 500 nM 범위, 예를 들면, 약 10 pM 내지 약 1 nM, 약 10 pM 내지 약 100 pM 또는 약 10 pM 내지 약 5O pM 범위의 EC50으로 사람 TrkB(서열번호 1)을 활성화시킨다.
한 양태에서, 본 발명의 항체는 이들 항체가 사람 TrkA (서열번호 5) 또는 사람 TrkC (서열번호 6)보다 사람 TrkB(서열번호 1)에 우선적으로 결합한다는 점에서 사람 TrkB(서열번호 1)에 선택적이다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 사람 TrkA 또는 사람 TrkC에 결합하지 않는다. 본원에서 정의한 바와 같이, 본 발명의 항체는 약 1 nM 이상, 예를 들면, 약 10 nM 이상, 약 100 nM 이상 또는 약 1 μM 이상의 농도에서 사람 TrkA (서열번호 5) 또는 사람 TrkC(서열번호 6)과의 검출가능한 결합을 나타내지 않는다면, 이들 수용체에 "결합하지 않는다".
한 양태에서, 본 발명의 항체는 이들 항체가 사람 TrkA (서열번호 5) 또는 사람 TrkC(서열번호 6)를 활성화시키지 않는다는 점에서 사람 TrkB에 대해 선택적이다. 본원에서 정의한 바와 같이, 본 발명의 항체는 약 1 nM 이상, 예를 들면, 약 10 nM 이상, 약 100 nM 이상 또는 약 1 μM 이상의 농도에서 사람 TrkA (서열번호 5) 또는 사람 TrkC(서열번호 6)과의 검출가능한 활성화를 유발하지 않는다면, 이들 수용체를 "활성화시키지 않는다".
한 양태에서, 본 발명의 항체는 약 100 pM 내지 약 500 nM 범위, 예를 들면, 약 100 pM 내지 약 1 nM 또는 약 100 pM 내지 약 500 pM 범위의 IC50으로 BDNF와 사람 TrkB (서열번호 1) 간의 결합을 차단한다. 다른 양태에서, 이들 항체는 BDNF와 사람 TrkB (서열번호 1) 간의 결합을 차단하지 않는다. 본원에서 정의된 바와 같이, 본 발명의 항체는 약 1 nM 이상, 예를 들면, 약 10 nM 이상, 약 100 nM 이상 또는 약 1 μM 이상의 농도에서 검출가능한 차단 활성을 나타내지 않는다면 BDNF와 사람 TrkB(서열번호 1) 간의 결합을 차단하지 않는다.
특정 양태에서, 본 발명의 항체는 IgG 동종형, 예를 들면, IgG1, IgG2a 또는 IgG2b 동종형에 속한다.
다른 측면에서, 본 발명은 추가로 마우스 TrkB(서열번호 2)에 결합하고/하거나 이를 활성화시키는 상기로부터의 특성중 어느 하나를 갖는 모노클로날 항체를 제공한다. 특정 양태에서, 이들 항체는 약 10 pM 내지 약 500 nM의 범위, 예를 들면 약 10 pM 내지 약 1 nM 범위, 약 10 pM 내지 약 500 pM의 범위 및 약 10 pM 내지 약 100 pM 범위의 ED50으로 마우스 TrkB(서열번호 2)에 결합하고/하거나 이를 활성화시킨다.
다른 측면에서, 본 발명은 사람 TrkB (서열번호 1)의 하나 이상의 특이적 에피토프 및 임의로 마우스 TrkB (서열번호 2)의 하나 이상의 특이적 에피토프에 추가로 결합하는 상기 특성중 어느 하나를 갖는 갖는 모노클로날 항체를 제공한다. 특정 양태에서, 이들 항체는 서열 KNEYGKD (서열번호 7, 서열번호 1의 아미노산 364 내지 370)을 갖는 사람 TrkB의 에피토프 및 KGNPKP(서열번호 8, 서열번호 1의 아미노산 308 내지 313)을 갖는 사람 TrkB의 에피토프 중 하나 또는 둘다에 결합한다. 한 양태에서, 이들 항체는 또한 서열 KNEYGKD (서열번호 7, 서열번호 2의 아미노산 364 내지 370)을 갖는 마우스 TrkB 에피토프 및 RGNPKP(서열번호 9, 서열번호 2의 아미노산 308 내지 313)을 갖는 마우스 TrkB 에피토프 중 하나 또는 둘다에 결합한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열 ENLVGED(서열번호 10, 서열번호 1의 아미노산 269 내지 275)을 갖는 사람 TrkB의 에피토프 및 임의로 서열 AGDPVP(서열번호 11, 서열번호 1의 아미노산 221 내지 226)을 갖는 사람 TrkB의 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 한 양태에서, 이들 항체는 또한 서열 ENLVGED (서열번호 10, 서열번호 2의 서열번호 2)를 갖는 마우스 TrkB의 에피토프에 결합한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 이들 모노클로날 항체중 어느 하나를 생산하는 하이브리도마를 제공한다. 예를 들면, 2005년 8월 18일자로 ATCC에 기탁되어 ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6948 (17D11) 및 PTA-6949 (29D7)를 부여받은 하이브리도마가 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 2005년 8월 18일자로 ATCC에 기탁되어 각각 ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6948 (17D11) 및 PTA-6949 (29D7)를 부여받은 하이브리도마에 의해 생산되는 모노클로날 항체를 제공한다. 본 발명은 이들 항체의 결합을 차단하고 따라서 사람 TrkB(서열번호 1)상의 동일한 결합 에피토프를 공유하는 항체를 또한 제공한다.
2. 모노클로날 항체 및 하이브리도마의 제조
본 발명의 모노클로날 항체를 임의의 공지된 방법으로 제조될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들면, 이들 항체는 합성, 재조합 또는 하이브리도마 기술(예를 들면, 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. by E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 or Monoclonal Antibodies: Principles and Practice by J. W. Goding, Academic Press, 1996]에 기술된 바와 같은)을 사용하여 제조할 수 있다. 특히, 본 발명의 항체는 초기에 사람을 사람 TrkB 또는 이의 유도체(예: 사람 TrkB의 세포외 도메인을 포함하는 재조합 단백질)로 면역화시켜 제조할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 모노클로날 항체는 상이한 종의 TrkB 단백질로부터 유래되는 2개 이상의 단백질 면역원을 사용하여 표준 하이브리도마 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 면역원은 사람 TrkB로부터 유래된 제1 면역원과 비-사람 TrkB로부터 유래된 제2 면역원을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 면역원은 각각 TrkB의 세포외 도메인을 포함한다. 특정 양태에서, 면역화 목적상 2가지 이상의 면역원이 혼합물로서 배합된다.
한 양태에서, 이들 면역원중 제1 면역원은 사람 TrkB의 세포외 도메인(ECD)을 포함하는 재조합 단백질이다. 사람 TrkB의 ECD는 전체길이 단백질(도 12에 서열번호 1로서 제시함, GenBank 수탁번호 NP_006171)로부터의 아미노산 잔기 C32-H430로 이루어진다. GenBank, SwissProt, EMBL 데이타베이스 또는 기타 공개적으로 이용가능한 데이타베이스에서 제출 일자로서 제시한 모든 단백질 및 핵산 서열(제한됨이 없이 뉴로트로핀, 예를 들면, NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5 등의 서열을 포함)은 본원에서 참조로 인용됨이 주지된다. 제2 면역원은 쥐 TrkB의 세포외 도메인(ECD)를 포함하는 재조합 단백질이다. 쥐 TrkB의 ECD는 전체길이 단백질(도 13에 서열번호 2로서 제시함, GenBank 수탁번호 P15209)로부터의 아미노산 잔기 C32-H429로 이루어진다. 당업자라면, 이들 도메인을 포함하는 적합한 면역원은 표준 재조합 기술[참조; Protocols in Molecular Biology Ed. by Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, NY, 1989 and Molecular Cloning: A Laboratory Manual Ed. by Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, 1989; 이의 내용은 본원에서 참조로 인용된다]을 사용하여 제조할 수 있음을 인지할 것이다.
특정 양태에서, 제1 및 제2 면역원은 약 1을 초과하는 비율(중량 기준)로 투여된다. 비율은 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상일 수 있다. 한 양태에서, 비율은 약 5를 초과할 수 있다. 한 양태에서, 비율은 약 10이다. 한 양태에서, 제1 및 제2 면역원은 혼합물로서 동시에 투여된다.
한 양태에서, 하나 또는 2개의 면역원은 천연 발생 도메인과 다소 상이한 이의 각각의 세포외 도메인 버젼을 포함한다. 예를 들면, 세포외 도메인의 N- 또는 C-말단은 결실될 수 있다. 또는, 천연발생 서열 내의 몇몇 아미노산이 돌연변이될 수 있다. 바람직하게는, 이들 돌연변이는 보존적 치환이다. 이들 비-천연 발생 버젼은 서열번호 1 또는 서열번호 2에서 발견되는 세포외 도메인과 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 보다 바람직하게는 97% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 98% 이상, 보다 더욱더 바람직하게는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 양태에서, 제1 및/또는 제2 면역원은 TrkB의 세포외 도메인의 외부에서 발견되는 어떠한 아미노산도 포함하지 않는다(예를 들면, 이들 면역원은 TrkB의 트랜스막 및/또는 세포내 도메인에서 발견되는 아미노산을 포함하지 않는다). 특정 양태에서, 면역원은 천연발생 TrkB 단백질에는 존재하지 않는 하나 이상의 말단 아미노산을 포함할 수 있다. 특히, 말단 아미노산은 발현 등을 위해 사용되는 벡터의 결과로서 재조합 단백질의 발현을 증가시키기 위해 부가될 수 있다. 또한, 단백질 알레르겐에 존재하지 않는 아미노산 절편을 재조합 단백질의 아미노 및/또는 카복실 말단에 부가할 수 있으며, 예로는, 정제용 태그, 검출용 표지, 재조합 알레르겐의 용해도를 증가시키는 태그, 면역원의 안정성을 증가시키는 태그, 비관련 단백질 또는 보조제 운반체 단백질과의 융합 등이 있다. 단백질분해성 절단 부위를 부가된 아미노산 절편과 재조합 단백질 말단의 접합부에 도입시켜, 상기 재조합 단백질이 정제, 흡착 등이 된 후에 부가된 절편이 제거되게 할 수 있다. 재조합 기술에서 사용되는 통상의 말단 변형은 문헌[참조: Current Protocols in Molecular Biology Ed. by Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, NY, 1989 and Molecular Cloning: A Laboratory Manual Ed. by Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, 1989]에 기재되어 있다.
한 양태에서, 제1 및 제2 면역원은 본원 실시예에 기술되어 있고 R&D systems, Inc. (각각 카탈로그 번호 397-TR/CF 및 1494-TB/CF)으로부터 입수된 2가지 면역원과 동일한 조성을 갖는다.
특정 양태에서, 제1 면역원은 상기 기술한 바와 같지만, 제2 면역원은 쥐 이외의 비-사람 TrkB(예: 랫트, 닭, 토끼 등)으로부터의 세포외 도메인(ECD)을 포함한다. 랫트 TrkB의 ECD는 전체길이 단백질로부터의 아미노산 잔기 C32-H429(도 14에 서열번호 3으로서 제시되어 있음, GenBank 수탁번호 NP_036863)로 이루어진다. 닭 TrkB의 ECD는 전체길이 단백질로부터의 아미노산 잔기 C32-T428(도 15에 서열번호 4로 제시되어 있음, GenBank 수탁번호 CAA54468)로 이루어진다.
일단 적합한 면역원이 제조되면, 면역원은 임의의 광범위한 동물(예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼 등)에게 주사된다. 한 양태에서 면역원은 본원 실시예에 기술된 바와 같이 마우스에게 주사된다. 예를 들면, 면역원은 완전 프로인트 보조제와 함께 피하 및 복강내 주사된다. 특정 양태에서, 각 동물은 다수의 상이한 부위에 피하 주사된다. 이러한 단계에서, 재조합 단백질은 추가의 변형이 없이 면역원으로서 작용할 수 있다. 또는, 재조합 단백질이 소 혈청 알부민 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)와 같은 보조제 운반체 단백질에 연결되는 경우 보다 우수한 면역반응이 유도될 수 있다. 면역원은 바람직하게는 하나 이상의 부스터(booster) 면역화를 포함하는 예정된 스케쥴에 따라서 동물 숙주에게 주사되고, 동물은 정기적으로 채혈된다. 예를 들면, 특정 양태에서, 하나 이상의 부스터 면역화를 정맥내로 실시한다. 이어서, 임의로 면역 혈청과 제1(및 임의로 제2) 면역원의 결합을 평가하여 적합한 항체 역가가 상승되었는지를 확인한다.
면역원 중 하나 또는 둘다에 특이적인 모노클로날 항체는 임의의 표준 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 문헌[참조: Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511, 1976]의 기술 및 이를 개선시킨 기술을 사용할 수 있다. 간략하게 언급하면, 이들 방법은 일반적으로 목적하는 특이성을 갖는 항체를 생산할 수 있는 불멸 세포주의 제조를 포함한다. 이러한 세포주는, 예를 들면, 상기한 바와 같이 면역화된 하나 이상의 동물로부터 수득된 비장 세포로부터 생성시킬 수 있다. 이어서, 비장 세포를, 예를 들면, 골수종 세포 융합 파트너, 바람직하게는 면역화된 동물과 동계인 파트너와의 융합에 의해 의해 불멸화시킬 수 있다. 특정 양태에서, 적합한 혈청을 갖는 동물을 비장 세포를 제거하기 전에 제1 및/또는 제2 면역원으로 1회 이상 부스트시킨다. 다양한 융합 기술을 사용할 수 있다. 예를 들면, 비장 세포 및 골수종 세포를 수 분 동안 니코틴산 세제와 배합한 다음, 하이브리드 세포의 성장은 지지하지만 골수종 세포의 성장은 지지하지 않는 선별적 배지에 저밀도로 플레이팅할 수 있다. 특정한 선별 기술은 HAT(하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘) 선별을 사용한다. 충분한 시간, 일반적으로 1 내지 2주 후에, 하이브리드의 콜로니가 관찰된다. 단일 콜로니를 선별하여 이의 배양 상청액을 하기 기술하는 바와 같이 제1 (및 임의로 제2) 면역원에 대한 결합 활성에 대해 시험한다.
모노클로날 항체를 성장중인 하이브리도마 콜로니의 상청액으로부터 분리할 수 있다. 또한, 쥐와 같은 적합한 척추 동물의 복강내로 하이브리도마 세포주를 주사하는 것과 같은 다양한 기술을 사용하여 수율을 향상시킬 수 있다. 이어서, 모노클로날 항체를 복수액 또는 혈액으로부터 수거할 수 있다. 크로마토그래피, 겔 여과, 침전 및 추출과 같은 통상의 기술에 의해 항체로부터 오염원을 제거할 수 있다. 항체 동종형은 표준 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 본원 실시예에 논의되고 표 1에 제시한 바와 같이, 본 발명자들은 이들 방법을 사용하여 동종형 IgG1, IgG2a 및 IgG2b에 속하는 특이적 쥐 항체를 제조하였다.
3. 항체 결합의 특성 규명
특정 양태에서, 본 발명의 항체를 사람 TrkB를 활성화시키는 이의 결합 활성에 대해 규명한다(예를 들면, 본원 실시예에 기술된 바와 같은 ELISA 및/또는 FACS를 사용하여). 특정 양태에서, 세포 표면에서 발현되는 사람 TrkB 단백질에 대한 결합을 또한 평가할 수 있다(예를 들면, 본원 실시예에 기술된 바와 같은 HEK293 세포를 사용하여). 바람직하게는, 본 발명의 항체를 (예를 들면, 제2 면역원을 이용하여) 교차-종 결합 활성에 대해 또한 시험한다. 이로써 동정될 두 종 모두로부터의 TrkB에 결합하는 모노클로날 항체가 생산될 수 있다. 이들 항체를 동물 모델에서 시험할 수 있고 사람 임상 시험에서도 적용할 수 있음을 알고 있기 때문에 이들 항체도 관심대상이다.
특정 양태에서 임의의 소정의 모노클로날 항체의 결합 특성을 추가로 규명하는 것이 유리한 것으로 증명될 수 있다. 특히, 항체가 TrkB와 BDNF의 상호작용을 차단하는지를 결정하기 위해 경쟁 검정(예를 들면, ELISA)을 사용할 수 있다. 또한, 항체가 비-사람 TrkB 및/또는 사람 TrkA 또는 TrkC에 결합하는지를 평가할 수 있다. 예를 들면, TrkB에 대한 다른 항체의 결합을 차단하는데 있어서의 각각의 개개 항체의 활성을 조사함으로써 TrkB(사람 또는 기타)상의 관련된 항체 결합 에피토프의 지도화를 수행할 수 있다. 예를 들면, 2개의 항체가 각각 서로의 결합을 차단한다는 관찰결과는 이들 항체가 TrkB상의 동일 에피토프 또는 중복 에피토프에 결합할 수 있음을 시사한다.
4. 항체 기능의 규명
특정 양태에서, 본 발명의 항체를 사람 TrkB를 활성화시키는 이의 기능적 능력에 대해 규명하였다. 임의의 효능제 검정을 사용할 수 있다. 본원 실시예는 TrkB의 활성화를 선택적으로 나타내는 것으로 제시된 예시적 루시페라제 검정을 기술한다. 또한, TrkB 활성화의 척도로서 TrkB 자가인산화(예를 들면, 웨스턴 블롯으로 측정함)을 사용할 수도 있다.
대안적으로 또는 부가적으로, 본 발명의 항체의 사람 TrkB 효능제 활성은 내인성 TrkB(예를 들면, 사람 신경아세포종 SY5Y 세포에서)가 관여하는 검정에서 평가할 수 있다. 실시예에 기술된 바와 같이, 이러한 검정은 신경돌기 증식을 촉진하거나 손상(예를 들면, 혈청 회수 손상) 후 분화된 세포의 생존을 증가시키는 이러한 각 항체의 능력을 시험한다. 특정 양태에서, 신경돌기 증식 및/또는 세포 생존성에 대한 본 발명의 항체의 용량 의존적 효과를 측정한다.
특정 양태에서, 정제된 모노클로날 항체는 또한 비-사람 TrkB(예를 들면, 쥐, 랫트, 닭, 토끼 등)을 활성화시키는 이의 기능적 활성에 대해 규명된다. 본원 실시예에서는, 항체를 랫트 소뇌 과립 뉴론(CGN) 내에서 내인성 랫트 TrkB 수용체에 대한 활성에 대해 시험한 검정이 기술된다. 사람 세포를 사용했을 때와 마찬가지로 신경돌기 증식 검정 및 신경보호 검정을 수행할 수 있다. 기타 유용한 검정은 당업계에 공지되어 있고 당업자에 의해 인지될 수 있다.
또 다른 양태에서 및 본원 실시예에 기술된 바와 같이, 정제된 모노클로날 항체를 사람 TrkA 및/또는 TrkC를 활성화시키는 이의 능력에 대해 추가로 규명한다.
5. 사람화 및 베니어링된 항체
치료학적 목적으로 본 발명의 항체를 사용한 경우, 임의의 잠재적 면역원성 반응을 감소시키기 위해 관심대상의 항체의 사람화 또는 베니어링된 버젼을 사용하는 것이 유리한 것으로 입증될 수 있다. 일반적으로, 사람화 또는 베니어링된 항체는 사람 수용자에서 비-사람 항체의 치료학적 적용의 지속기간 및 효율성을 제한하는 원치않는 면역반응을 최소화시킨다.
비-사람 항체로부터 유래된 항원 결합 부분을 포함하는 사람화 항체를 제조하기 위한 수많은 방법들이 당업계에서 기술된 바 있다. 특히, 사람 불변 도메인에 융합된 설치류 가변 영역과 이의 관련된 상보성 결정 영역(CDR)이 기술된 바 있다[참조: Winter et al., Nature 349:293, 1991; Lobuglio et al., Proc. Nat. Acad. ScL USA 86:4220, 1989; Shaw et al., J. Immunol. 138:4534, 1987; and Brown et al., Cancer Res. 47:3577, 1987]. 적절한 사람 항체 불변 도메인과 융합되기 전에 사람 지지 골격 영역(framework region; FR)으로 이식된 설치류 CDR[참조: Riechmann et al., Nature 332:323, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534, 1988; and Jones et al. Nature 321:522, 1986] 및 재조합에 의해 베니어링된 설치류 FR에 의해 지지되는 설치류 CDR도 또한 기술되었다[참조: EPO 특허 공보 제519,596호].
완전한 사람 항체가 사람 환자의 치료학적 처치를 위해 특히 바람직하다. 이러한 항체는 내인성 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자를 발현할 수 없는 유전자전이된(transgenic) 마우스를 사용하여 생산할 수 있다[참조: Lonberg and Huszar M Rev. Immunol 13:65-93, 1995 및 미국 특허 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호].
본 발명의 항체의 베니어링된 버젼을 또한 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다. 베니어링 과정은, 실질적으로 모든 천연 FR 단백질 폴딩 구조를 보유하는 항원 결합 부분을 포함하는 항체를 제공하기 위해, 예를 들면, 쥐 중쇄 또는 경쇄 가변 영역으로부터의 FR 잔기를 사람 FR로 선택적으로 치환시킴을 포함한다. 베니어링 기술은 항원 결합 부분의 항원 결합 특징이 주로 항원-연합 표면내 중쇄 및 경쇄 CDR 셋트의 구조 및 상대적 배열에 의치에 의해 결정된다는 이해에 기초한다[참조: Davies et al., Ann. Rev. Biochem. 59:439, 1990]. 따라서, 항원 연합 특이성은 오로지 CDR 구조, CDR 구조 서로 간의 상호작용 및 가변 영역 도메인의 나머지와 CDR 구조의 상호작용이 주의깊게 유지되는 사람화된 항체에서만 보존될 수 있다. 베니어링 기술을 사용함으로써, 면역계와 용이하게 접촉되는 외부(예를 들면, 용매-접근성) FR 잔기가 사람 잔기로 선택적으로 치환되어 약하게 면역원성인 또는 실질적으로 비-면역원성인 베니어링된 표면을 포함하는 하이브리드 분자가 제공된다.
6. 일본쇄 항체
일본쇄 항체를 또한 본 발명의 항체에 기초하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 일본쇄 항체(scFv)는 예를 들면, 문헌[참조: Colcher et al., Ann. N Y Acad. ScL 880:263-80, 1999; and Reiter, Clin. Cancer Res. 2:245-52, 1996]에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다. 구체적 방법은 본원 실시예에 기술되어 있다. 일본쇄 항체를 이량체화 또는 다량체화시켜 사람 TrkB의 상이한 에피토프에 대한 특이성을 갖는 다가 항체를 제조할 수 있다.
7. 약제학적 조성물
본 발명의 모노클로날 항체는 본 발명에 따라서 TrkB를 활성화시키기 위해 순수한 상태로 투여할 수 있다. 그러나, 보다 통상적으로는 항체는 하나 이상의 항체의 치료학적 유효량과 함께 약제학적 조성물의 제형화용으로 당업자에게 공지된 하나 이상의 기타 성분을 함유하는 약제학적 조성물의 범주에서 투여된다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "약제학적 유효량" 또는 "치료학적 유효량"이란 용어들은 의미있는 환자 이익, 즉 TrkB 활성화가 요구되는 상태의 치료, 예방 또는 경감을 나타내기에 충분한 약제학적 조성물 또는 방법의 각 활성 성분의 총량을 의미한다. 단독으로 투여되는 개개의 활성 성분에 적용될 경우, 상기 용어는 그 단독 성분만을 의미한다. 활성 성분의 배합물에 적용되는 경우, 상기 용어는 배합물로서, 연속적으로 또는 동시에 투여되는지에 관계없이 치료학적 효과를 초래하는 활성 성분들의 배합된 양을 의미한다.
본 발명의 특정 양태에서, 본 발명의 항체는 약 0.1 내지 약 1000 mg/체중 kg, 또는 약 1 내지 약 500 mg/체중 kg, 특정 양태에서는 약 10 내지 약 300 mg/체중 kg 범위의 매주 투여량으로 투여된다. 투여량은 단일 용법으로서 또는 수일 또는 수주 간의 과정에 걸쳐 2회 이상의 투여량으로 나뉜 연속적 용법으로서 투여될 수 있다. 전달은 일시적(bolus) 주입 또는 특정 양태에서는 순차적 주입(예를 들면, 30분에 걸쳐서 주사에 의해)에 의한 것일 수 있다. 특정 양태에서, 하나 이상의 높은 투여량(예를 들면, 2, 3 또는 4배 높은)이 초기에 투여된 다음에 하나 이상의 낮은 유지 용량이 투여될 수 있다. 높은 투여량(들)은 오직 치료 착수시에 또는 각 치료 사이클의 시작시에 투여될 수 있다. 이러한 투여량 수준 및 본원의 기타 투여량 수준은 정맥내 또는 복강내 투여를 위한 것이다. 당업자라면 상이한 투여 경로를 위해 요구되는 투여량 수준을 용이하게 결정할 수 있다. 일반적으로, 사용되는 정확한 투여량은 담당 주치의에 의해 결정될 수 있고 피험체의 체중 및 투여 경로 뿐만 아니라 피험체의 연령 및 증상의 중증도에 따라 좌우될 수 있음이 이해될 것이다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물을 제조하는데 있어 유용한 부가적 성분들은, 예를 들면, 담체(예: 액체 또는 고체 형태), 풍미제, 윤활제, 가용화제, 현탁화제, 충전제, 압착 보조제, 결합제, 정제 붕해제, 봉입 물질, 유화제, 완충제, 보존제, 감미제, 증점제, 착색제, 점도 조절제, 안정화제 또는 삼투압조절제 또는 이들의 배합물이 포함된다.
액체 약제학적 조성물은 바람직하게는 본 발명의 모노클로날 항체 항체 이상과 하나 이상의 액체 담체를 함유하여, 용제, 현탁제, 에멀젼, 엘릭서제(elixir) 또는 가압된 조성물을 형성한다. 약제학적으로 허용되는 액체 담체로는 예를 들면, 물, 유기 용매, 약제학적으로 허용되는 오일 또는 지방 또는 이들의 배합물이 포함된다. 액체 담체는 가용화제, 유화제, 완충제, 보존제, 보존제, 감미제, 풍미제, 현탁화제, 증점제, 착색제, 점도 조절제, 안정화제 또는 삼투압조절제 또는 이들의 배합물과 같은 기타 적합한 약제학적 첨가제를 함유할 수 있다. 액체 조성물이 소아용으로 의도되는 경우, 일반적으로 알코올을 포함시키지 않는 것이 바람직하다.
경구 또는 비경구 투여에 적합한 액체 담체의 예로는 물(바람직하게는 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체와 같은 첨가제를 함유함), 알코올 또는 이의 유도체(일가 또는 다가 알코올, 예를 들면, 글리콜) 또는 오일(예를 들면, 분별 코코넛 오일 및 아라키스 오일)이 포함된다. 비경구 투여를 위해, 담체는 또한 에틸 올레이트 및 이소프로필 미리스테이트와 같은 유성 에스테르일 수 있다. 가압된 조성물용 액체 담체는 할로겐화 탄화수소 또는 기타 약제학적으로 적합한 추진제일 수 있다.
고체 약제학적 조성물은 바람직하게는 하나 이상의 고체 담체 및 임의로 하나 이상의 기타 첨가제, 예를 들면, 풍미제, 윤활제, 가용화제, 현탁화제, 충전제, 활주제, 가압 보조제, 결합제 또는 정제-붕해제 또는 봉입 물질을 함유한다. 적합한 고체 담체로는, 예를 들면, 인산칼슘, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 당, 락토오스, 덱스트린, 젤라틴, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 저융점 왁스 또는 이온 교환 수지 또는 이들의 배합물이 포함된다. 산제 약제학적 조성물에서, 담체는 바람직하게는 미분된 활성 서분과 혼합된 미분된 고체이다. 정제에서, 활성 성분(들)은 일반적으로 필수적 압착 특성을 적합한 비율로 갖는 담체 및 임의로 기타 첨가제와 혼합되어 목적하는 모양과 크기고 압착된다.
본 발명의 일부 양태에서, 약제학적 조성물은 정제 또는 캡슐제와 같은 단위 투여량 형태로 제공된다. 이러한 형태에서 조성물은 적당량의 활성 성분(들)을 함유하는 단위 투여량으로 세분된다. 단위 투여량 형태는 패킹된 조성물, 예를 들면, 액체를 함유하는 패킹된 산제, 바이알, 앰풀, 예비충전된 주사기 또는 샤세(sachet)일 수 있다. 단위 투여량 형태는, 예를 들면, 캡슐제 또는 정제 그 자체일 수 있거나, 패키지 형태의, 적당한 수의 임의의 이러한 조성물일 수 있다.
따라서, 본 발명은 TrkB를 활성화시키기 위한 단위 투여량 형태의 약제학적 조성물을 또한 제공하며, 이때 당해 조성물은 본 발명의 하나 이상의 모노클로날 항체의 치료학적으로 유효한 단위 투여량을 함유한다. 당업자가 인지할 수 있는 바와 같이, 특정한 치료학적으로 유효한 단위 투여량은 투여 방법에 따라 좌우될 것이다.
본 발명은 또한 TrkB 활성화가 요구되는 상태가 치료될 개체에게 본 발명의 모노클로날 항체를 분배하기 위한 치료학적 패키지를 제공한다. 일부 양태에서, 치료학적 패키지는 하나 이상의 본 발명의 모노클로날 항체의 단위 투여량 하나 이상, 이러한 단위 투여량 하나 이상을 함유하는 용기 및 당해 패키지의 용도가 치료용임을 지시하는 표지를 함유한다. 특정 양태에서, 단위 투여량은 정제 또는 캡슐제 형태로 존재한다. 일부 경우에, 각각의 단위 투여량은 치료학적 유효량이다.
8. 기타 약제학적 제제
본 발명에 따라서, 본 발명의 모노클로날 항체는 TrkB 활성을 조절하기 위해 단독으로 투여될 수 있다. 대안으로, 당해 항체는 TrkB 활성이 요구되는 하나 이상의 기타 상태(증상, 질병 또는 질환을 포함)의 치료, 예방 또는 경감에서 유용한 하나 이상의 기타 약제학적 제제와 함께(동시에 또는 순차적으로) 투여될 수 있다.
예를 들면, TrkB 활성을 조절할 수 있는 약제학적 제제는 TrkB의 기타 활성화제를 포함하여 본 발명의 모노클로날 항체와 배합하여 사용할 수 있다. 미국 특허 제5,770,577호; 제6,077,829호; 제6,723,701호 및 제6,800,607호(각각 전문이 본원에서 참조로 인용된다)에는 본 발명의 실시에 따라서 유용할 수 있는 BDNF 유도체 및 조성물이 기재되어 있다.
부가적으로 또는 대안으로, 모노클로날 항체는 신경계 장애 및 질환의 치료, 예방 또는 경감에서 유용한 기타 약제학적 제제와 함께 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 모노클로날 항체는 신경계 손상(예를 들면, 외상, 수술, 허혈, 감염, 대사질환, 영양실조, 악성 종양 또는 독성 약물 등에 의한 손상)에 의해 유발된 장애 및 질환의 치료, 예방 또는 경감에서 유용한 제제와 병용된다. 문헌[참조; Physicians' Desk Reference, 55th Edition, 2001, published by Medical Economics Company, Inc. at Monvale, NJ, 이의 관련 부분은 본원에서 참조로 인용된다]에 기재된 것들을 포함하여 당업계에 공지된 어떠한 적합한 제제라도 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
9. 치료학적 용도
한 측면에서, 본 발명의 항체는 TrkB의 활성화가 요구되는 상태(증상, 질병 또는 질환을 포함)를 치료하는데 유용하다. 이러한 방법은 하나 이상의 본 발명의 항체의 치료학적 유효량을 개체에게 투여함을 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명은 신경계 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 제한됨이 없이, 본 발명의 항체를 사용하여, 신경계가 외상, 수술, 허혈, 감염, 대사질환, 영양실조, 악성 종양 또는 독성 약물 등에 의해 손상된 개체를 치료할 수 있다. 구체적 예로는 졸중, 척수 손상, 외상성 뇌 손상, 망막 퇴행 및 축삭절제가 포함된다. 본 발명의 항체는 또한 주의력-결핍 과잉행동장애(ADHD), 우울증, 노화 관련 정신적 손상과 같은 장애를 치료하는데 사용할 수 있다(즉, 인지력 증강을 제공함에 의해). 또한, 본 발명의 항체는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증(ALS) 및 이들과 관련된 질환을 포함하는 선천성 또는 신경퇴행성 상태를 치료하는데 사용될 수도 있다. 또한, 암 및 당뇨병과 같은 비-신경계 상태를 치료하는데 있어서의 TrkB 활성화의 이점은 기술된 바 있으며, 따라서 본 발명의 항체는 이러한 범주에서 유용성을 가질 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,877,016호 및 제6,800,607호에는 각각 암 및 당뇨병을 치료하는데 있어 TrkB 활성화의 이점이 기술되어 있다).
본 발명의 방법은 성인 및 아동에서 본원에 기술된 상태를 치료하는데 유용하다. 본 방법은 또한 특히 개 및 고양이에의 적용을 포함하는 수의학적 적용을 위해 유용할 수 있다. 경우에 따라, 본원의 방법은 또한 양, 개, 돼지 및 말 품종과 같은 농장 동물에서도 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 예를 들면, 비경구, 정맥내, 국소, 비강, 경구(협측(buccal) 또는 설하를 포함), 직장 투여 또는 기타 투여 방식을 포함하는 임의의 적절한 투여 경로를 통한 본 발명의 모노클로날 항체의 전달을 포함한다. 일반적으로, 본 항체는 즉각적, 지연된, 변형된, 지속된, 간헐적 또는 제어-방출 전달용으로 제형화될 수 있다.
특정 양태에서, 항체는 주사로 전달하기 위해 제형화된다. 이러한 양태에서, 투여는, 예를 들면, 해면체내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 경막내, 뇌실내, 요도내, 흉골내, 두개내, 근육내 또는 피하이거나, 주입 또는 무바늘 주사 기술을 통해 수행된다. 이러한 비경구 투여를 위해, 본 발명의 항체는 통상적인 동결건조된 제형으로 제조되거나 유지될 수 있고, 투여 전에 약제학적으로 허용되는 염 용액, 예를 들면, 0.9% 염 용액으로 재구성될 수 있다. 주사가능한 제형의 pH는, 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 약제학적으로 허용되는 산, 예를 들면, 메탄설폰산으로 조절될 수 있다. 사용할 수 있는 다른 허용되는 비히클 및 용매는 링거액 및 U.S.P.를 포함한다. 또한, 멸균 고정유는 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용된다. 이러한 목적을 위해, 임의의 무자극성 고정유를 사용할 수 있고, 이는 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함한다. 또한, 지방산, 예를 들면, 올레산은 주사가능한 제형에 사용된다. 주사가능한 제형은, 예를 들면, 박테리아-함유 필터를 통해 여과하여 또는 사용하기 전에 멸균수 또는 다른 멸균 주사가능한 매질에 용해시키거나 분산시킬 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태로 멸균화제를 혼입하여 멸균시킬 수 있다.
본 발명의 항체의 효과를 연장시키기 위해, 근육내 또는 피하 주사로부터 이의 흡수를 느리게 하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 투여된 항체의 지연된 흡수는 오일 비히클 중에 제제를 용해시키거나 현탁시켜 수행할 수 있다. 주사가능한 데폿(depot) 형태는 생분해성 중합체, 예를 들면, 폴리락타이드-폴리글리콜라이드 중 항체의 미세캡슐 매트릭스를 형성하여 제조한다. 항체 대 중합체의 비 및 사용되는 구체적인 중합체의 성질에 의존하여, 항체 방출 속도가 조절될 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)을 포함한다. 주사가능한 데폿 제형은 또한 항체를 체조직과 상용성인 리포솜 또는 미세에멀젼에 포획하여 제조된다.
피부에 국소적으로 적용하기 위해, 항체를, 예를 들면, 하나 이상의 다음 물질과의 혼합물에 현탁되거나 용해된 활성 성분을 포함하는 적합한 연고로서 제형화할 수 있다: 광유, 액체 바셀린, 화이트 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화용 왁스 및 물. 대안적으로, 이들은 적합한 로션 또는 크림으로 제형화될 수 있고, 예를 들면, 하나 이상의 다음 물질의 혼합물에 현탁되거나 용해될 수 있다: 광유, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 액상 파라핀, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알콜, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알콜 및 물.
본 발명의 항체는 또한 비강내 또는 흡입하여 투여할 수 있고, 가압 용기, 펌프, 스프레이, 분무기 또는 분사기로부터 적합한 추진체, 예를 들면, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 하이드로플루오로알칸, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하거나 사용하지 않고 건조 분말 흡입제 또는 에어로졸 스프레이 제시(presentation) 형태로, 용이하게 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 투여 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 측정될 수 있다. 가압된 용기, 펌프, 스프레이, 분무기 또는 분사기는 항체의 용액 또는 현탁액을 포함할 수 있고, 예를 들면, 에탄올과 추진체의 혼합물을 용매로서 사용하고, 이는 추가로 윤활제, 예를 들면, 소르비탄 트리올레에이트를 포함할 수 있다. 흡입제 또는 취입기에서 사용하기 위한 캡슐 및 카트리지(예를 들면, 젤라틴으로부터 제조됨)는 본 발명의 항체 및 적합한 분말 베이스, 예를 들면, 락토즈 또는 전분의 분말 혼합물을 포함하도록 제형화될 수 있다.
경구 전달을 이용하는 본 발명의 방법을 위해, 이러한 전달은 고체 또는 액체 제형, 예를 들면, 정제, 캡슐, 다중입자, 겔, 필름, 소란형(ovules), 엘릭서제, 용제 또는 현탁제를 사용하여 수행될 수 있다. 특정 양태에서, 모노클로날 항체는 경구 정제 또는 캡슐로서 투여된다. 이러한 제제는 경우에 따라, 예를 들면, 어린이, 정제를 삼키는 능력이 약화된 개체 또는 동물에의 투여를 용이하게 하기 위해혼합된 츄잉성 또는 액체 제형 또는 식품 형태 또는 액제일 수 있다.
직장 투여용 조성물은 바람직하게는 좌제이고, 이는 본 발명의 항체와 적합한 비자극성 부형제 또는 담체, 예를 들면, 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜 또는, 주위온도에서 고체이고 체온에서 액체여서 직장 원개(rectal vault)에서 용융되고 항체를 방출하는 좌제 왁스와 혼합하여 제조할 수 있다. 체류 관장(retention enemas) 및 직장 카테터는 또한 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지된 것을 사용할 수 있다. 점도-개선 담체, 예를 들면, 하이드록시프로필 셀룰로오스는 또한 본 발명의 직장 투여용 임의의 담체이고, 이는 직장내 약제학적 조성물이 체류할 수 있게 한다. 일반적으로, 약제학적 조성물에 첨가되는 담체의 용적은 조성물의 체류를 최대화하기 위해 선택된다. 특히, 용적은 직장 원개에서 투여되는 조성물의 체류를 위험하게 할 정도로 크지 않아야 한다.
10. 진단학적 용도
다른 측면에서, 본 발명의 항체는 샘플 중에서 TrkB를 검출하기 위해(예를 들면, TrkB의 과발현 또는 저발현을 특징으로 하는 장애를 진단하기 위해) 사용될 수 있다. 이러한 방법에 따라서, 본 발명의 항체를 특이적 결합을 허용하는 조건하에 샘플과 배합한다. 이어서, 특이적 결합을 검출하여 샘플 중의 TrkB의 존재를 나타낸다.
샘플은 체액(예를 들면, 뇌척수액, 혈액, 혈청, 뇨 등)으로부터 유래될 수 있거나 세포 또는 조직의 추출물(예를 들면, 생검 샘플)일 수 있다. 결합의 검출은 당해 항체를 검출가능한 물질(즉, 항체 표지)과 커플링(즉, 물리적 연결)시켜 촉진할 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는 각종 효소, 보결분자단(prosthetic group), 형광성 물질, 발광성 물질, 생물발광성 물질 및 방사성 물질이 포함된다. 적합한 효소의 예로는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제가 포함되며, 적합한 보결분자단의 예로는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴이 포함되고, 적합한 형광성 물질의 예로는 움벨리페론, 플루오로세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 포함되고, 발광성 물질의 예로는 루미놀이 포함되고, 생물발광성 물질의 예로는 루시페라제, 루시페린 및 애쿼린이 포함되며, 적합한 방사성 물질의 예로는 125I, 131I, 35S 또는 3H가 포함된다.
ELISA 및 FACS를 포함하여 항체 결합을 측정하기 위한 각종 프로토콜은 당업계에 공지되어 있으며 변경된 또는 비정상적 TrkB 수준을 진단하기 위한 기초를 제공한다. ELISA 및 FACS는 본원 실시예에 추가로 기술되어 있다. TrkB 발현에 대한 정상 또는 표준 수치는 정상 개체로부터 채취된 샘플을 복합체 형성에 적합한 조건하에 본 발명의 항체와 배합하여 확립된다. 표준 복합체 형성의 양은 검출가능한 기질의 성질에 따라서 각종 방법으로 정량할 수 있다. 바람직하게는, 표준 복합체 형성량은 광도계 수단으로 정량한다. 그 다음, 질환에 걸린 개체로부터의 샘플 중의 TrkB 발현 수준을 표준 수치와 비교한다. 표준 수치와 질환에 걸린 개체의 수치 간의 편차는 질환을 진단하기 위한 파라메터를 확립시킨다.
특정 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여, TrkB의 과발현 또는 저발현을 특징으로 하는 신경계 상태를 진단할 수 있다. 예를 들면, 제한됨이 없이, 본 발명의 방법을 사용하여, 외상, 수술, 허혈, 감염, 대사질환, 영양실조, 악성 종양 또는 독성 약물 등에 의해 손상된 신경계를 동정할 수 있다. 구체적 예로는 졸중, 척수 손상, 외상성 뇌 손상, 망막 퇴행 및 축삭절제가 포함된다. 또한, 본 발명의 방법을 사용하여 주의력-결핍 과잉행동장애(ADHD), 우울증, 노화 관련 정신적 손상과 같은 장애를 진단할 수 있다(즉, 인지 증강을 제공함에 의해). 또한, 본 발명의 방법을 사용하여 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증(ALS) 및 이와 관련된 상태를 포함하는 선천성 또는 신경퇴행성 상태를 진단할 수 있다.
11. 정제 용도
본 발명은 또한 특이적 결합을 허용하는 조건하에 본 발명의 항체를 샘플과 배합하여 항체-TrkB 복합체를 생성시키고, 항체-TrkB 수용체 복합체를 샘플의 나머지 부분으로부터 분리시킨 다음, 항체를 TrkB 수용체로부터 분리하여 정제된 TrkB 수용체를 수득함을 포함하는, 항체를 사용하여 샘플로부터 사람 TrkB를 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항체를 사용하여 어떠한 표준 기술, 예를 들면, 친화성 크로마토그래피 또는 면역침전법에 의해서도 TrkB를 분리할 수 있음이 인지될 것이다.
본 발명은 다음 실시에 의해 추가로 설명되고 뒷받침된다. 그러나, 이들 실시에는 결코 본 발명의 범주를 보다 한정하는 것으로 고려되지 않아야 한다. 반대로, 당업자라면 본 발명의 취지 및/또는 첨부된 청구의 범위에서 벗어남이 없이 본 발명의 기타 양태, 변형 및 등가물이 있음을 용이하게 이해할 수 있다.
실시예 1
당해 실시예는 다수의 TrkB 항체의 제조, 및 시험관내 특성 규명 및 시험을 기술한다.
재료 및 방법
면역원
쥐 항-TrkB 항체를 2가지 단백질 면역원의 혼합물을 사용하여 제조하였다: 사람 TrkB의 세포외 도메인(ECD)을 포함하는 제1 재조합 단백질(rhTrkB-ECD)(R&D systems, Inc., Cat. No. 397-TR/CF) 및 쥐 TrkB의 세포외 도메인을 포함하는 제2 재조합 단백질(rmTrkB-ECD)(R&D system, Inc., Cat. No. 1494-TB/CF).
사람 TrkB의 세포외 도메인은 전체길이 단백질(도 12에 서열번호 1로서 제시함, GenBank 수탁번호 NP_006171)로부터의 아미노산 잔기 C32-H430로 이루어진다. rhTrkB-ECD를 쥐 골수종 세포주 NSO에서 발현시켰다. 단량체 rhTrkB-ECD의 계산된 분자량은 44 kDa이였으나, 글리코실화된 경우 이는 환원 조건하에 SDS-PAGE에서 80 내지 100 kDa의 밴드로서 이동한다.
쥐 TrkB의 세포외 도메인은 전체길이 단백질(도 13에 서열번호 2로서 제시함, GenBank 수탁번호 P15209)로부터의 아미노산 잔기 C32-H429로 이루어진다. 당해 실시예를 위해 사용된 mhTrkB-ECD에서, 이 서열은, 발현 도중에 절단되는 N-말단 사람 CD33 시그날 펩타이드와 C-말단 His 태그가 양 측면에 위치한다. rhTrkB-ECD를 또한 쥐 골수종 세포주 NSO에서 발현시켰다. 단량체 mhTrkB-ECD의 계산된 분자량은 45.9 kDa이였으나, 글리코실화된 경우 이는 환원 조건하에 SDS-PAGE에서 75-100 kDa의 밴드로서 이동한다.
면역화 스케쥴
5마리의 8주령 암컷 BALB/c 마우스를 완전 프로인트 보조제(CFA)와 사전 혼합된 10㎍의 rhTrkB-ECD로 면역화시켰다. 혼합물을 분획으로 나누고, 이를 격주로 4회(즉, 0주, 2주, 4주 및 6주째에) 피하 및 복강내 주사하였다. 또한, 마우스를 7주째에 완전 프로인트 보조제(CFA)와 사전 혼합된 1㎍의 rmTrkB-ECD를 피하 및 복 강내 주사하여 면역화시켰다. 5주째 및 7주째에 마우스 혈액을 수거하고 혈청 중의 항체 반응을 평가하였다.
쥐 항-TrkB 모노클로날 항체(mAb)의 제조
5마리의 마우스중 3마리를 세포 융합 3일 전에 10㎍ rhTrkB 및 1㎍ rmTrkB로 추가 부스트시켰다. 이들 3마리 마우스로부터의 비장세포를 50% 폴리에틸렌 글리콜(MW 1500)(Roche Diagnostics Corp., Cat. No. 783641)을 사용하여 4:1 비율로 쥐 골수종 세포 P3X63Ag8.653 (ATCC, Cat. No. CRL-1580)와 융합시켰다. 융합 후, 세포를 선별 배지(20% FBS 및 5% Origen(IGEN International, Inc., Cat. No. 210001), 2mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신, 1×HEPES 및 1×HAT (하이포크산틴-아미노프테린-티미딘)(Sigma, Cat. No. H0262)을 함유하는 RPMIl 640) 중에서 96웰 플레이트에 1×105개 세포/웰로 접종하여 배양하였다. 하이브리도마 상청액을 ELISA에 의해 rhTrkB와의 결합에 대해 스크리닝하고, FACS 분석(하기 참조)에 의해 rhTrkB-발현 HEK293 안정한 세포상의 염색에 대해 스크리닝하였다. 이어서, 양성인 것으로 선별된 하이브리도마 상청액을 루시페라제 검정(하기 참조)을 사용하여 rhTrkB에 대한 효능제 활성에 대해 시험하였다. 선별된 하이브리도마를 연속적 희석에 의해 4회 서브클로닝하고 FACS 분류법(하기 참조)에 의해 1회 서브클로닝하였다. 조건화 배지(conditional medium)를 안정한 하이브리도마 배양물로부터 수거하였다. Prosep-A (Montage Antibody Purification Spin 컬럼, Millipore, Cat. No. P36486)을 사용하여 하이브리도마 조건화 배지로부터 IgG를 정제하였다. 각 mAb의 Ig 부류를 쥐 mAb 동종형결정 키트(IsoStrip, Boehringer Mannheim Corp., Cat. No. 1493027)를 사용하여 결정하였다.
ELISA
TrkB-특이적 항체의 존재를 결정하기 위해, 96웰 플레이트(Maxisorp, Nunc)를 1㎍/ml rhTrkB-EDC-Fc (R&D system, Cat. No. 688-TK) 또는 rmTrkB-Fc (R&D system)로 피복하고 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 1% BSA 및 0.05% Tween-20을 함유하는 PBS(10 mM 인산나트륨, 150 mM NaCl5 pH 7.2)로 플레이트를 세척하고 웰을 차단한 후, 희석된 면역 헐청 또는 하이브리도마 상청액 100㎕를 부가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 세척하고, 결합된 항-TrkB 항체를 퍼옥시다제 접합된 염소 항-쥐 IgG (H+L)(PIERCE, Cat. No. 31434)를 사용하여 검출한 다음, 기질 TMB (BioFX Laboratories, Cat. No. TMBW_1000-01)과 함께 항온처리하였다. 흡광도 값을 450 nm에서 분광 광도계로 측정하였다.
하이브리도마 상청액 중의 mAb 농도를 측정하기 위해, 96웰 플레이트를 PBS 중의 1㎍/ml 염소 항-쥐 IgG(Fcγ)(PIERCE5 Cat. No.31123)로 피복하고 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 1% BSA 및 0.05% Tween-20을 함유하는 PBS로 웰을 세척하고 차단한 후, 희석된 하이브리도마 상청액 100㎕를 실온에서 1시간 동안 부가하였다. 정제된 동종형-일치(matching) 쥐 IgG를 항-TrkB IgG 농도의 정량을 위한 표준으로서 사용하였다. 플레이트를 세척하고, HRP 표지된 염소 항-쥐 IgG-Fc를 부가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 웰을 세척한 후, 기질 TMB를 부가하였다. 흡광도를 450 nm에서 측정하였다.
경쟁 결합을 사용한 관련된 항체 결합 에피토프의 특성 규명
TrkB 단백질에 대한 항-TrkB IgG의 결합이 BDNF과 TrkB의 상호작용에 어떻게 영향을 주는지를 측정하기 위해, 96웰 플레이트를 PBS 중의 0.3㎍/ml의 BDNF (R&D system, Cat. No. 248-BD/CF)로 피복하고 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 웰을 1% BSA 및 0.05% Tween-20을 함유하는 PBS로 세척하고 차단한 후, 사전항온처리된 하이브리도마 상청액(또는 희석된 면역 혈청)과 rhTrkB-EDC-Fc과의 혼합물 100㎕를 플레이트에 부가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 세척한 후, 퍼옥시다제 접합된 염소 항-사람 IgG(Fcγ)(PIERCE, Cat. No. 31416)를 부가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 웰을 세척하고 기질 TMB를 부가하였다. 흡광도를 450 nm에서 측정하였다.
rhTrkB 상의 관련된 항체 결합 에피토프를 지도화하기 위해, 96웰 플레이트를 PBS 중의 1㎍/ml의 각 개별적 TrkB-특이적 mAb로 피복하고 4℃에서 밤새 피복하였다. 웰을 1% BSA 및 0.05% Tween-20을 함유하는 PBS로 세척하고 차단한 후, 각각의 개별적 사전항온처리된 TrkB mAb (20㎍/ml)와 rhTrkB-EDC-Fc (0.1㎍/ml)의 혼합물 100㎕를 웰에 부가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 세척하고 퍼옥시다제 접합된 염소 ant-사람 IgG(Fcγ)와 함께 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 세척한 후, 기질 TMB를 부가하였다. 흡광도를 450 nm에서 측정하였다.
루시페라제 검정
HEK-293 세포를 pcDNA-hTrkB (전체길이, GenBank 수탁번호 NM_006180 참조)로 형질감염시켜 rhTrkB를 발현하는 안정한 HEK-293 세포주를 생성시켰다. 형질감염된 세포를 제한 희석법으로 2주 동안 하이그로마이신의 존재하에 선별하였다. 초기 평가 후, 연구를 위해 세포의 단일 클론을 선택하였다. 루시페라제 검정을 위해, 세포를 96웰 플레이트내 100㎕ 배양 배지에 1.5×104개 세포/웰로 플레이팅하였다. 다음날, 세포를 10x 최종 농도의 BDNF 또는 시험 항체 10㎕로 처리하였다. 처리한지 16시간 후에 Promega Steady-Glo 검정 키트를 제조업자의 프로토콜에 따라서 사용하여 루시페라제 활성을 측정하였다. 간략하게 언급하면, 배지를 100㎕의 PBS로 교체하고 100㎕의 Steady-Glo 시약을 부가하였다. 플레이트를 TopSeal로 밀봉한 후, 플레이트를 Titer Plate Shaker에서 속도 약 5로 5분 동안 진탕한 다음, 발광을 TopCount NXT v2.13 장치(Packard)를 사용하여 측정하였다.
FACS 분석
rhTrkB를 발현하는 HEK-293 세포를 5 mM EDTA를 함유하는 PBS를 사용하여 플레이트로부터 떼어내고, 튜브당 2×1O5개의 세포씩 5 ml Falcon 튜브(Becton Dickinson, Cat. No. 352063)로 옮겼다. 세포를 4℃에서 3분 동안 800 rpm으로 원심분리하여 PBS로 1회 세척하고, 1% FBS를 함유한 PBS에 희석된 100㎕의 하이브리도마 배양 상청액, 정제된 항체 또는 면역 혈청과 함께 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 세포를 1% FBS를 함유하는 1ml PBS로 3회 세척하고 암실에서 4℃에서 30분 동안 1% FBS를 함유하는 PBS 중의 PE 표지된 염소 항-쥐 IgG, F(ab')2 단편(DAKO Corporation, Cat. No. R0480)과 함께 항온처리하였다. 세포를 다시 3회 세척하고 1% FBS를 함유하는 250㎕ PBS에 재현탁시켰다. 요오드화프로피듐을 사멸된 세포의 검출을 위해 사용하였고, 이를 분석으로부터 제외시켰다. 5000개 세포/튜브의 형광을 FACScan 유세포분석기(Becton Dickinson)를 사용하여 계수하였다.
TrkB 자가인산화 검정
rhTrkB를 발현하는 HEK-293 세포를 DMEM 성장 배지 중에서 2×105 개 세포/웰로 24 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음날, 세포를 혈청 비함유 DMEM 중에서 90분 동안 항온처리한 다음, 37℃에서 30분 동안 상이한 농도의 BDNF 또는 시험 항체로 자극시켰다. PBS로 1회 세척한 후, 세포를 95℃에서 사전가열된 Laemmli 샘플 완충액(Bio-Rad) 중에서 용해시켰다. 용해물을 QIAshredder 컬럼(Qiagen)을 통해 통류시키고 20㎕의 샘플을 4-12% Bis-Tris 겔(Invitrogen)에서 분해시켰다. 니트로셀룰로오스 막으로 전이시킨 후, 인산화된 TrkB 밴드를 PY490 포스포-Trk-특이적 항체 (1:100, Cell Signaling, Cat. No. 9141)를 사용하여 검출한 다음, HRP-접합된 항-토끼 2차 항체(Molecular Probes)와 함께 항온처리하였다. 신호를 ECL 플러스 키트(Amersham)를 사용하여 발생시켰다.
신경돌기 증식 검정
사람 신경아세포종 SH-SY5Y 세포를 2 mM L-글루타민, 15 % FBS and pen/strep이 보충된 DMEM:F12(1:1)에서 성장시켰다. 신경돌기 증식 검정을 위해, 세포를 96웰 조직 배양 플레이트에 4×103개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고 10μM 올-트랜스-레티노산(all-trans-retinoic acid; RA)과 함께 항온처리하여 신경세포 분화를 유도하였다. 셋째날, 배지를 당해 결과에 지시된 바와 같이 BDNF 또는 시험 항체를 함유하거나 함유하지 않는 새로운 성장 배지로 교체하였다. 배지에서 추가로 3일 후에, 세포를 실온에서 30분 동안 IC-Fix로 고정시키고 베타-튜불린 III의 면역염색을 위해 추가로 가공하였다. 먼저, 세포를 포스페이트-완충된 용액(TPBS) 중의 0.2% Triton 중에서 짧게 항온처리하여 투과성이 되도록 만들었다. 샘플을 TPBS 중의 1.5% 표준 염소 혈청(NGS) 중에서 30분 동안 항온처리하여 비-특이적 결합을 차단한 다음, 1.5% NGS/TPBS 중의 항-베타-튜불린 III mAb(Tujl, 1 :1000, Covance)과 함께 항온처리하였다. Tuj1 신호를 Alexa 488 쥐 항-염소 항체(1:500, Molecular Probes)를 사용하여 검출하고, 신경돌기 증식을 Cellomics 어레이스캔을 사용하여 분석하였다.
1차 뉴론내에서 신경돌기 촉진 효과를 측정하기 위해, 랫트 또는 쥐 소뇌 과립 뉴론(CGN) 배양물을 제조하였다. 간략하게 언급하면, 소뇌를 생후 7일의 동물로부터 절제하고 작은 조각으로 절단하였다. 조직을 37℃에서 30분 동안 파라핀(Worthington Biochemical Corp.)으로 처리하고 가볍게 분쇄시켜 분산시켰다. 300g에서 5분 동안 원심분리한 후, 해리된 세포를 B27 보충제, 0.5 mM l-글루타민 및 25 mM 염화칼륨을 함유하는 Neurobasal 배지 중에 재구성하고 폴리-d-라이신(BD bioscience)이 1.2×104 개 세포/웰의 밀도로 사전피복된 96웰 Biocoat 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 BDNF 또는 시험 항체로 24시간 동안 처리하고 실온에서 30분 동안 IC-Fix로 고정시키고 상기한 바와 같이 Tuj1 면역염색을 위해 가공하였다.
세포 생존 검정
SH-SY5Y 세포를 96웰 플레이트에 1×104개 세포/웰로 플레이팅하고 RA(10μM)와 함께 항온처리하여 신경세포 분화를 유도하였다. 3일 후, 배지를 혈청을 함유하지 않는 배지(혈청 비함유 배지)로 교체하고, 세포를 BDNF, 시험 항체 또는 비히클로 처리하였다. 배양물 중에서 추가로 2일 후에, 세포 생존성을 CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit (Promega)를 제조업자의 프로토콜에 따라서 사용하여 MTT 검정으로 측정하였다.
신경보호 검정
랫트 또는 쥐 CGN 배양물을 상기한 바와 같이 7일령 새끼 동물로부터 제조하고, 폴리-d-라이신(BD bioscience)이 7.3×104개 세포/웰의 밀도로 사전피복된 96웰 Biocoat 플레이트에 플레팅하였다. 플레이팅한지 24시간 후, 세포를 소뇌 과립 뉴론의 현저한 사멸을 초래하는 것으로 공지된 칼륨 혈청 결핍(potassium serum deprivation; KSD) 손상에 적용시켰다. 자매(sister) 배양물을 BDNF 또는 시험 항체와 함께 공배양하였다. 24시간 동안 항온처리한 후, 세포 생존성을 CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit(Promega)를 사용하여 측정하였다.
결과
TrkB 면역화된 마우스로부터의 항체 반응의 평가
TrkB에 대한 특이적 반응을 평가하기 위해, 5마리의 면역화된 마우스(M1-M5)를 제3 및 제4 면역한지 1주 후에 출혈시켰다. 제3 및 제4 출혈 둘다에서 ELISA 및 FACS에 의해 혈청중의 높은 항-TrkB 항체 역가가 측정되었다. 도 1은 제4 면역화 후의 출혈로부터의 결과를 도시한 것이다. 모든 5마리의 마우스는 ELISA에서rhTrkB-ECD 및 rmTrkB-ECD 둘다를 인식하는 높은 항체 역가를 발생시켰다(도 1A 및 1B).
BDNF 결합 부위와 관련된 hTrkB 상의 항체 결합 에피토프를 또한 평가하였다. 경쟁 ELISA로부터의 결과는 면역 혈액이 M2 = M5 > M3 > M4 = M1의 순서로 rhTrkB-EDC-Fc 및 BDNF 상호작용을 차단할 수 있음을 보여주었다(도 1C). 흥미롭게도, rhTrkB-BDNF 상호작용을 차단하는데 있어서의 항체의 효능은 항체 결합 역가와 상관관계가 있었다(도 1A 및 1C를 비교함). 모든 면역 혈액은 또한, FACS 분석으로 입증된 바에 따르면 HEK-293 세포 상의 세포 표면 발현된 rhTrkB에 결합하는 것으로 나타났다(도 1D).
hTrkB에 대한 면역 혈청의 높은 역가 특이적 결합이 관찰된 후에, 이러한 면역 혈액들을 루시페라제 리포터 검정으로 평가하여, 이들의 효능제 활성을 시험하였다. rhTrkB를 발현하는 HEK-293 세포에서의 루시페라제 활성은 TrkB의 활성화 를 선택적으로 나타내는 것으로 보여졌다(도 2). 이들 세포와 면역 혈액을 함께 항온처리하면 루시페라제 신호가 용량-의존적 방식으로 증가되었다(도 3). 다시, 효능제 활성의 효능은 M2 = M5 > M3 > M4 = M1의 순서였다. 가장 높은 항체 역가와 강건한 효능제 활성을 갖는 3마리 마우스(M2, M3 및 M5)를 후속적 하이브리도마 생산을 위해 선택하였다.
모노클로날 항체의 생산
이미 기술한 바와 같이, 3마리의 선택된 마우스(M2, M3 및 M5)를 융합 3일 전에 10㎍의 rhTrkB-ECD 및 1㎍의 rmTrkB-ECD를 이용하여 정맥내 부스트시켰다. 1회의 하이브리도마 스크리닝으로부터, ELISA 검정에서 rhTrkB-EDC-Fc에 강하게 결합한 94개의 클론이 선택되었다. 이들 클론중 20개가 ELISA 검정에서 rmTrkB-ECD와 교차-반응하였다. FACS 분석은 54개의 클론이 HEK-293 세포의 표면에서 발현된 rhTrkB에 결합하였음을 확인시켜주었다.
각 클론의 TrkB 효능제 활성을 루시페라제 검정을 사용하여 시험하고, 가장 높은 활성을 갖는 17개의 하이브리도마 클론을 추가 특성 규명을 위해 선택하였다. 이들 클론을 안정화시키고, 연속적 희석을 이용하여 3회 서브클로닝하고, FACS 분류법을 이용하여 1회 서브클로닝한 후, 각 배양 조건화 배지로부터의 모노클로날 항체를 수거하고 ProSep-A(Montage Antibody Purification Kit)를 사용하여 정제하였다. 각 항체의 IgG 동종형을 쥐 동종형 결정 시험 키트에 의해 결정하였다(표 1). 항체 농도를 쥐 IgG 정량 ELISA로 측정한 결과, 모든 17개의 클론은 배양물 상청액 중에서 우수한 수준의 Ig를 생산하였다.
Figure 112008000901282-PCT00001
모노클로날 항체의 특성 규명
정제된 TrkB-특이적 모노클로날 항체를 ELISA에 의해 hTrkB에 대한 이의 결합 활성에 대해 규명하였다. 정제후에 ED50이 10-11(M)으로부터 10-10(M)으로 저하된 클론 29D7(데이타는 제시하지 않음)을 제외한 대부분의 항체는 높은 결합 친화성 (ED50 = 10-11(M))으로 rhTrkB에 결합하였다. 2개의 클론 12F4 및 18C8은 정제 후에 이들의 결합 활성을 상실하였고, 따라서 상위 목록에서 제외시켰다(따라서, 표 1에는 포함시키지 않음). FACS 분석 후, 나머지 15개의 TrkB 결합 mAb 모두는 또한 HEK293 세포의 표면에 발현된 hTrkB에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다. 항체를 또한 ELISA에 의해 rmTrkB에 대한 교차-종 결합 활성에 대해 시험하였다. 대부분의 항체가 rmTrkB에 약하게 결합하는 것으로 확인된 반면에, 클론 17D11, 18C3 및 29D7은 ED50=10-10 내지 11(M)으로 rmTrkB에 결합하는 것으로 확인되었다(표 2).
경쟁 ELISA 검정을 사용하여 항체가 rhTrkB와 BDNF의 상호작용을 차단하는지를 결정하였다. 클론 29D7은 차단 활성을 나타내지 않은 반면, 클론 17D11, 18C3 및 19E12는 rhTrkB-BDNF 상호작용을 부분적으로 차단하였다. 다른 모든 클론은 IC50 = 3 내지 5×10-10 (M)으로 rhTrkB-BDNF 상호작용을 차단하였다(표 2).
Figure 112008000901282-PCT00002
rhTrkB에 대한 다른 항체의 결합을 차단하는데 있어서의 각 개개 항체의 활성을 조사함으로써 rhTrkB 상의 관련된 항체 결합 에피토프의 지도화를 실시하였다. 예를 들면, 2개의 항체가 rhTrkB와의 결합을 서로 차단한다는 관찰결과는 이들 항체가 rhTrkB상의 동일 에피토프 또는 중복 에피토프에 결합할 수 있음을 시시한다(표 3). 표 3에서, 사전결합된 항체는 각 행에 제시되어 있고 경쟁(즉, 피복) 항체는 각 열에 제시되어 있다. 결과는 클론 11E1, 19E12 및 29D7이 특유의 에피토프를 인식할 수 있음을 보여주었다. 클론 17D11 및 18C3은 동일한 결합 부위에 대해 경쟁하는 것으로 보인다. 모든 나머지 클론은 서로 경쟁하였으며 동일한 결합 에피토프를 공유할 수 있다.
Figure 112008000901282-PCT00003
루시페라제 활성
정제된 TrkB-특이적 항체를 루시페라제 검정을 사용하여 조사하여, 효능제 활성을 입증하였다. 모든 항체는 10-10 (M) 범위의 EC50으로 신호를 용량-의존적으로 증가시켰다(도 4). 최대 신호 창은 대부분의 항체에 있어 기준치보다 7배 이상이였으며, 이는 200 ng/ml에서 BDNF에 의해 유도된 반응(기저치보다 6.2배)과 필적하였다.
mAb의 기능적 활성
TrkB-결합 항체가 내인성 TrkB 수용체 활성화, 신경돌기 촉진 효과를 이들 항체로 처리한 후에 평가하였다. 항체의 종 특이적 결합에 기반하여, 본 발명자들은 먼저 신경세포 분화시 TrkB를 발현하는 것으로 공지된 사람 신경아세포종 SY5Y 세포를 사용하였다. 이전의 보고와 일치하여, 본 발명자들은 신경돌기 길이와 분지점의 수의 증가로 입증되는 BDNF 촉진된 신경돌기 증식을 관찰하였다(도 5A 및 5B). 중요하게도, 대부분의 항체는 또한 BDNF와 필적하거나 보다 우수한 효율로 신경돌기 증식을 유의적으로 증가시켰다(도 5A 및 5B). 몇몇 처리군의 대표적 영상의 예는 도 5C에 도시한다.
가장 높은 활성을 갖는 7개의 TrkB 항체(6E2, 7F5, 11E1, 16E11, 17D11, 19E12 및 29D7)를 전체 용량-반응 분석을 위해 선택하였다. 이들 항체는 10-10 (M) 범위의 EC50으로 신경돌기 증식을 용량-의존적으로 증가시켰다(도 5D, 데이타는 6E2의 경우에는 수득되지 않았다). 이들 항체를 또한 혈청 회수(serum withdrawal) 손상 후에 분화된 SY5Y 세포의 생존성을 증가시키는 능력에 대해 시험하였다. 결과는 BDNF 및 몇가지 항체가 분화된 SY5Y 세포를 보호하였음을 보여주었고, 이는 세포 생존성의 용량-의존적 증가를 입증한다(도 6).
rmTrkB에 결합하는 것으로 나타난 2개의 TrkB 항체, 17D11, 18C3 및 29D7를 또한 랫트 소뇌 과립 뉴론(CGN) 배양물 중에서 내인성 랫트 TrkB 수용체에 대한 활성에 대해 시험하였다. 신경돌기 증식 검정 및 신경보호 검정 둘다에서, 오직 29D7만이 BDNF과 필적하는 활성을 나타냈으며, 17D11 및 18C3는 불활성이었다(도 7, 데이타는 제시하지 않음). 17D11 및 18C3은 랫트 TrkB 내의 상이한 아미노산을 함유하는 쥐 TrkB 상의 에피토프를 인식한다고 시사될 수 있다.
TrkB 인산화 분석
상기한 모든 활성을 기초로 하여 선별된 7개의 TrkB 항체 (6E2, 7F5, 11E1, 16E11, 17D11, 19E12 및 29D7)를 TrkB 자가인산화에 대해 웨스턴 블롯으로 평가하였다. 모든 항체는 활발한 TrkB 인산화를 유도하였고, 이러한 효과는 키나제 억제제 K252a 처리에 의해 길항되었는데, 이는 이들 TrkB-결합 항체가 TrkB를 활성화시켰음을 나타낸다(도 8).
rmTrkB에 결합하는 것으로 나타난 2개의 TrkB 항체, 17D11, 18C3 및 29D7를 또한 랫트 소뇌 과립 뉴론(CGN) 배양물 중에서 내인성 랫트 TrkB 수용체에 대한 활성에 대해 시험하였다. 신경돌기 증식 검정 및 신경보호 검정 둘다에서, 오직 29D7만이 BDNF과 필적하는 활성을 나타냈으며, 17D11 및 18C3는 불활성이었다(도 7, 데이타는 제시하지 않음). 17D11 및 18C3은 랫트 TrkB 내의 상이한 아미노산을 함유하는 쥐 TrkB 상의 에피토프를 인식한다고 시사될 수 있다.
TrkB 인산화 분석
상기한 모든 활성을 기초로 하여 선별된 7개의 TrkB 항체 (6E2, 7F5, 11E1, 16E11, 17D11, 19E12 및 29D7)를 TrkB 자가인산화에 대해 웨스턴 블롯으로 평가하였다. 모든 항체는 활발한 TrkB 인산화를 유도하였고, 이러한 효과는 키나제 억제제 K252a 처리에 의해 길항되었는데, 이는 이들 TrkB-결합 항체가 TrkB를 활성화시켰음을 나타낸다(도 8).
ATCC 기탁
17D11 및 29D7 TrkB 항체를 생산한 하이브리도마는 2005년 8월 18일자로 ATCC에 기탁되었고 각각 ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6948 및 PTA-6949를 부여받았다.
실시예 2
본 실시에는 다수의 TrkB 항체의 시험관내 특성 규명 및 시험을 추가로 기술한다. 특히, 당해 실시예는 실시예 1의 항체중 몇가지의, TrkB과 대비한 TrkA 및 TrkC 특이성을 평가하기 위해 수행한 실험을 기술한다.
재료 및 방법
FACS 분석
사람 TrkA를 발현하는 HEK-293 세포를 5 mM EDTA를 함유하는 PBS를 사용하여 플레이트로부터 떼어내고, 튜브당 2×1O5개의 세포씩 5 ml Falcon 튜브(Becton Dickinson, Cat. No. 352063)로 옮겼다. 세포를 4℃에서 3분 동안 800 rpm으로 원심분리하여 PBS로 1회 세척하고, 1% FBS를 함유한 PBS에 희석된 100㎕의 하이브리도마 배양 상청액, 정제된 항체 또는 면역 혈청과 함께 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 세포를 1% FBS를 함유하는 1ml PBS로 3회 세척하고 암실에서 4℃에서 30분 동안 1% FBS를 함유하는 PBS 중의 PE 표지된 염소 항-쥐 IgG, F(ab')2 단편(DAKO Corporation, Cat. No. R0480)과 함께 항온처리하였다. 세포를 다시 3회 세척하고 1% FBS를 함유하는 250㎕ PBS에 재현탁시켰다. 요오드화프로피듐을 사멸된 세포의 검출을 위해 사용하였고, 이 세포를 분석으로부터 제외시켰다. 5000개 세포/튜브의 형광을 FACScan 유세포분석기(Becton Dickinson)를 사용하여 계수하였다.
루시페라제 검정
TrkA(또는 사람 TrkC)를 발현하는 안정한 HEK-293 세포주를 생성시켰다. 형질감염된 세포를 제한 희석법으로 2주 동안 하이그로마이신의 존재하에 선별하였다. 초기 평가 후, 세포의 단일 클론을 연구를 위해 선택하였다. 루시페라제 검정을 위해, 세포를 96웰 플레이트내 100㎕ 배양 배지에 1.5×104개 세포/웰로 플레이팅하였다. 다음날, 세포를 10x 최종 농도의 NGF(또는 NT-3) 또는 시험 항체 10㎕로 처리하였다. 처리한지 16시간 후에 Promega Steady-Glo 검정 키트를 제조업자의 프로토콜에 따라서 사용하여 루시페라제 활성을 측정하였다. 간략하게 언급하면, 배지를 100㎕의 PBS로 교체하고 100㎕의 Steady-Glo 시약을 부가하였다. 플레이트를 TopSeal로 밀봉한 후, 플레이트를 Titer Plate Shaker에서 속도 약 5로 5분 동안 진탕한 다음, 발광을 TopCount NXT v2.13 장치(Packard)를 사용하여 측정하였다.
결과
모노클로날 항체의 FACS 분석
표 1의 각 TrkB-특이적 모노클로날 항체에 대한 순수한 조건화 배지를, FACS를 사용하여 사람 TrkA에 대한 결합 활성에 대해 규명하였다. 모든 시험된 항체는 사람 TrkA에 결합하지 못하였다. 구체적으로는, 항체를 약 5 내지 약 60㎍/ml(표 1의 각 항체의 구체적 농도를 참조, 이는 약 30 내지 약 500 nM 범위의 농도에 상응한다) 범위의 농도에서 시험한 결과, 각 항체는 어떠한 검출가능한 결합도 나타내지 못하였다. FACS 데이타는 도 9A에 도시한다.
루시페라제 활성
표 2의 정제된 TrkB-특이적 항체의 서브셋트를 또한 TrkA 또는 TrkC 루시페라제 검정을 사용하여 조사하여 효능제 활성을 평가하였다. 시험된 항체중 어떠한 것도 TrkA 또는 TrkC를 활성화시키지 않았다. 구체적으로는, 항체를 약 3㎍/ml(약 20 nM) 이하의 농도에서 시험하였고, 각 경우에 항체는 기저치 이상의 검출가능한 증가를 유발하지 못하였다(참조: TrkA에 대해서는 도 9B 및 TrkC에 대해서는 도 10). 반대로, NGF는 300 ng/ml에서 TrkA에 대한 기처치보다 약 6배의 증가를 유도하였고(도 9A), NT-3은 300 ng/ml에서 TrkC에 대한 기처치보다 약 6배의 신호 증가를 유도하였다(도 10).
실시예 3
당해 실시예는 신생아 저산소증-허혈(HI)의 설치류 모델에서 다수의 TrkB 항체의 생체내 시험을 기술한다.
재료 및 방법
동물 및 수술 과정
신생아 저산소증-허혈(HI)의 설치류 모델은 도 11에 도시된 레빈(Levine) 과정[참조: Levine, Am. J. Pathol. 36:1-17, 1960; Rice et al., Ann. Neurol, 9:131-141, 1981 and Gidday et al., Neurosci. Lett. 168:221- 224, 1994; 각각 본원에서 참조로 인용된다)에 기초하였다. 간략하게, 생후 7일째(P7)의 새끼 동물을 2.5% 할로탄으로 마취시키고, 좌측 총경동맥을 영구적으로 결찰시켰다. 절개부를 봉합하고, 새끼 동물을 회복 및 먹이 공급을 위해 홈 케이지로 복귀시켰다. 2시간 후, 새끼 동물을 개별적 컨테이너에 넣고, 이 컨테이너를 통해 가습된 8% 산소가 유동하게 하였다. 2.5시간의 저산소증 허혈 상태 후, 새끼 동물을 이의 홈 케이지로 복귀시켰다. 처리를 위해, 저산소성 상해(hypoxic insult) 직전에 동물에게 0.1 또는 0.3 nmole의 BDNF, 항-TrkB 모노클로날 항체 29D7, 대조 IgG1 또는 비히클 중 하나를 뇌실내 주사로 5㎕ 투여하였다.
뇌 조직 손실의 평가
P14에, 뇌 절편을 몇마리 마우스로부터 제조하여 HI 손상에 의해 유발된 손상을 측정하였다. 선조체, 피질 및 해마의 관상 절편을 크레실 바이올렛으로 염색시키고, 병변이 생긴 반구에서의 손실된 면적%를 온전한 면적과 비교하였다. 도 23은 상이한 처리에 대한 선조체 및 해마로부터 수득된 염색 결과를 비교한 것이다. 도 24A 및 24B는 상이한 처리에 대한 총 뇌 조직 손실 및 소구역 조직 손실을 비교한 것이다. 데이타는 평균 및 평균의 표준오차(S.E.M.)로서 나타낸다. BDNF 및 항-TrkB 모노클로날 항체 29D7는 HI 손상으로부터 유의적인 용량-의존적 뇌 보호를 나타냈다. 이러한 보호는 뇌의 임의의 특정 소구역에 국한되지 않았지만, 가장 큰 보호는 피질에서 일반적으로 관찰되었다.
생화학적 분석
HI 손상 24시간 후에, 생화학적 분석을 위해 마우스의 서브셋트로부터 뇌 절편을 제조하였다. 해마 및 피질 뇌 조직을 절제하고 용해시키고 몇가지 생화학적 검정에 적용시켰다.
DEVD-AMC 절단 검정을 사용하여 카스파제-3 활성을 측정하였다[참조: Nagase et al., Immunol Lett. 84:23, 2002; 이는 본원에서 참조로 인용된다]. 마우스에게 0.1 nmole의 상이한 시험 시약(평균±S.E.M)을 투여한 마우스에서 뇌의 여러 영역들에 대한 결과는 도 25에 도시한다.
0.3 nmole의 상이한 시험 시약으로 처리된 마우스로부터의 단백질 샘플(30㎍/레인)을 SDS-PAGE로 분리시키고 특정 카스파제-3 기질(PARP 및 α-스펙트린)에 대한 항체를 이용한 면역블롯팅에 적용시켰다. 단백질이 동일하게 부하되었는지를 확인하기 위해 β-액틴에 대한 항체를 사용하였다. 도 26에 도시된 당해 결과는 이들 카스파제-3 기질의 절단이 BDNF 및 항-TrkB 모노클로날 항체 29D7(C = 경동맥 결찰부의 반대 측면 및 I = 경동맥 결찰부의 동측면)에 의해 억제되었음을 입증한다.
추적 실험
다음은 본 연구의 마우스에 대해 수행될 수 있는 예지적 추적 조사이다. 공간 학습 및 기억력 시험에서 나머지 마우스의 수행능을 평가할 수 있다(예를 들면, 제한됨이 없이, 문헌[참조: Almli et al., Exp. Neurology 166:99-114, 2000; 이는 본원에서 참조로 인용된다]에 기술된 시험). 예를 들면, 마우스를 P20 내지 P30에서 시험할 수 있다. 임의로, 수행능은 해당 기간 동안에 수일에 걸쳐서 또는 심지어 이후의 시점에서도 평가할 수 있다.
양성 결과(뇌 조직 손실의 감소, 공간 학습 및 기억력의 향상 등으로 측정됨)를 산출하는 처리 프로토콜을 보다 큰 범위의 투여량에 걸쳐서 반복할 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, 처리 프로토콜은 상이한 투여 방식으로(예를 들면, 복강내 투여, 정맥내 투여 등); 상이한 출발 시점에서(예를 들면, 결찰 전, 저산소증 직후, 저산소증 후 가변적 지연으로); 및/또는 상이한 지속 기간 또는 빈도로(예를 들면, 손상 후 2주 동안 매일 처리 등) 반복할 수 있다.
실시예 4
당해 실시예는 사람 TrkB에 대한 사람 일본쇄 Fv (scFv) 항체의 제조 및 시험을 기술한다. 일본쇄 Fv 단편을 함유하는 사람 항체 파아지 디스플레이 라이브러리(CS, BMV and DP-47; Cambridge Antibody Technology)를 다음 방법을 사용하여 TrkB 결합에 대해 선별하였다.
재료 및 방법
패닝에 의한 항체의 선별
10㎍의 hTrkB-EDC-Fc를 100㎕ 중의 Nunc Maxisorp 플레이트에 피복시키고 4℃에서 밤새 정치시켰다. 파아지 라이브러리를 사전 차단시키고(50㎕ 파아지 분취액을 2×PBS 중의 50㎕의 6% 탈지유에 부가하였다), 실온에서 1시간 동안 PSGL-Fc(Wyeth, Lot. No. 00H25M004)에 대해 음성적으로 선별하여 Fc에 대해 반응성인 파아지를 결실시켰다. 제외된 파아지를 표적 단백질-피복된 플레이트(hTrkB -EDC-Fc)로 옮기고 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. 웰을 PBS/0.1% Tween 20로 10회 세척하고 PBS로 5회 세척하였다. 결합된 파아지를 50㎕/웰의 갓 제조된 100 mM TEA(10 ml의 초순수 중의 140㎕ TEA)로 용출시켰다. 용출된 파아지를 25㎕의 멸균된 1M Tris-HCl(pH 7.5)를 사용하여 중화시켰다. 파아지를 10 ml의 중간-대수증식기(600nm에서 O.D = 0.5)의 이. 콜라이(E. coli) TGl 세포에 감염시켰다. 형질전환된 세포를 2×TYAG 아가 Bioassay 플레이트에 도말하고 30℃에서 밤새 항온처리하였다.
가용성 파아지 선별(바이오틴 선별)
파아지 항체를 다음을 제외하고는 상기 기술한 프로토콜에 따라서 바이오티닐화된 hTrkB-EDC-Fc를 사용하여 선별하였다. 사전차단된 파아지를 먼저 100 nM 바이오티닐화된 PSGL-Fc에 대해 결실시킨 다음, 100 nM 바이오티닐화된 hTrkB-EDC-Fc상에서 양성 선별하였다. 사람 TrkB 특이적 파아지를 사전차단된 마그네틱 스트렙타비딘 비이드(Dynabeads M-280 스트렙타비딘, Cat. No. 112.06)를 사용하여 포획하였다. 비이드를 PBS/0.1% Tween 20으로 10회 세척하고 PBS로 3회 세척하였다. 결합된 파아지를 200㎕의 갓 제조된 100 mM TEA (10 ml 초순수 중의 140㎕의 TEA)로 용출시키고 100㎕의 멸균된 1M Tris-HCl(pH 7.5)를 사용하여 용출된 파아지로 중화시켜 TEA를 중화시켰다. 파아지를 이. 콜라이에 감염시키고 이전 단계에 기술한 바와 같이 증식시켰다.
파아지 구제(phage rescue)
파아지로 감염된 이. 콜라이를 Bioassay 아가 플레이트로부터 스크랩하고 Bioassay 플레이트당 10ml 2×TYAG(2×TY와 1OOμg/ml Amp 및 2% 글루코오스)와 혼합하였다. 20 ml 2×TYAG에 100㎕의 세포 상청액을 접종시키고 37℃(300 rpm)에서 600nm에서의 OD가 0.3 내지 0.5가 될 때까지 성장시켰다. 이. 콜라이를 3.3㎕의 MK13KO7 헬퍼 파아지로 중감염시키고(superinfect) 37℃(150rpm)에서 1시간 동안 항온처리하였다. 중감염된 세포를 20ml 2×TYAK 배지(2×TY/100㎍/ml Amp/50㎍/ml 카나마이신)에 재현탁시키고 25℃ 280rpm으로 밤새 성장시켰다. 이. 콜라이를 3500rpm으로 15분 동안 회전시키고, 이 파아지를 함유하는 상청액을 다음의 선별을 위해 사용하였다.
ELISA를 위한 파아지 항체 제제
감염된 이. 콜라이의 단일 콜로니를 웰당 150 ml의 2×TYAG 배지(2% 글루코오스)를 함유하는 미세역가 웰(Costat Cell)로 선택해 옮겼다. 클론을 37℃(100-120 rpm)에서 5 내지 6시간 동안(600 nm에서의 OD = 0.5) 성장시켰다. M13K07 헬퍼 파아지 스톡(1013 pfu/ml)을 2×TYAG 배지를 사용하여 1:1000로 희석시키고, 20㎕를 각 웰에 부가하였다. 웰을 37℃(100 rpm)에서 1시간 동안 항온처리하였다. 프레이트를 10분 동안 3200 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 150㎕ 의 2×TYAK 배지에 재현탁시켰다. 배양물을 25℃(120 rpm)에서 밤새 성장시켰다. 다음날, 플레이트를 15분 동안 3200 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 파아지 ELISA 검정을 위해 신선한 플레이트로 옮겼다.
파아지 ELISA
ELISA 플레이트를 4℃에서 웰당 50㎕의 PBS 중 1㎍/ml의 hTrkB-EDC-Fc(대조군으로서 BSA)으로 밤새 피복시켰다. 웰을 PBS로 3회 세정하고 실온에서 1시간 동안 웰당 300㎕의 PBS/3% 탈지유로 차단시켰다. 파아지를 동일 용적의 PBS/6% 탈지유로 차단시키고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 50㎕의 차단된 파아지를 ELISA 웰에 부가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 PBS/0.1% Tween으로 3회 세척한 다음, PBS로 3회 세척하였다. PBS/3% 탈지유(1:5000, Amersham Pharmacia biotech, Cat. No. 27-9421- 01) 중의 50㎕의 HRP-마우스 항-M13 항체를 각 웰에 부가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 이전과 같이 세척하고, 50㎕ TMB 기질을 각 웰에 부가하고 2 내지 5분 동안 전개시켰다. 50㎕의 0.5M 황산을 부가하여 반응을 중단시키고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다.
FACS를 위한 일본쇄 Fv 제제
단일 콜로니를 선택하여 37℃에서 0.9 ml 2×TYAG 배지를 함유하는딥웰(deepwell) 미세역가 플레이트에서 5 내지 6시간 동안 성장시켰다. IPTG를 2×TY 배지 중의 최종 농도 0.02 mM까지 부가하여 scFv 발현을 유도하고 30℃에서 밤새 성장시켰다. 이. 콜라이를 밤새 성장시킨 후 수거하고 물에 1:5로 희석된 150㎕ TES 완충액을 사용하여 삼투압적 충격을 가하고 빙상에서 30분 동안 항온처리하였다. 세포를 원심분리하고, 상청액을 FACS 검정을 위해 새로운 플레이트로 옮겼다. TrkB로 안정하게 형질감염된 293 세포를 상기한 바와 같이 제조한 scFv로 염색하였다. 세포를 빙상에서 30분 동안 항온처리한 다음, PBS 완충액으로 세척하였다. 일본쇄 Fv를 1:1000로 희석된 9E10 항-myc 항체를 함유하는 용액을 사용하여 검출한 다음, 1:500로 희석된 PE 접합된 항-마우스 IgG-Fc 항체를 부가하였다. 염색된 세포를 Bectin-Dickinson 유세포분석기에서 분석하였다.
결과
파아지 ELISA
표 4는 상이한 파아지 라이브러리 선별(패닝 및 가용성 선별) 파아지 ELISA 검정의 결과를 나타낸 것이다. 도 18은 TrkB 양성 클론의 대표적 세트로부터의 파아지 결합 ELISA 데이타(BMV 라이브러리 패닝 선별)를 도시한 것이다. 대다수의 TrkB 선별된 클론은 TrkB-EDC-Fc에 대한 강력하고 특이적인 반응성을 나타냈지만, 대조군 단백질 PSGL-Fc에 대해서는 반응성을 나타내지 않았다.
Figure 112008000901282-PCT00004
2회의 패닝 선별 후, CS 라이브러리로부터 무작위적으로 선택된 클론의 78%가 TrkB-EDC-Fc 결합에 대해 양성이였지만, PSGL-Fc 결합에 대해서는 그렇지 않았다. 마찬가지로, 클론의 3%가 2회의 가용성 선별 후에 양성이였다. BMV 및 DP-47 라이브러리에 대한 양성 클론의 수는 패닝 선별로부터는 58% 및 45%였고, 가용성 선별로부터는 6% 및 10%였다. DNA 서열분석을 사용하여, 본 발명자들은 CS 패닝 클론의 53%가 특유한 것인 반면에, CD 가용성 선별 클론의 100%가 특유한 것임을 확인하였다. BMV 및 DP-47 라이브러리에 대한 특유한 클론의 수는 패닝 선별로부터는 23% 및 39%였고, 가용성 선별로부터는 50% 및 50%였다.
FACS 분석
도 19는 FACS 검정을 사용하여 시험된 TrkB 선별된 scFv 항체의 결합 특이성을 도시한 것이다. 당해 데이타는 상기 TrkB 선별된 scFv 항체가 막 결합된 TrkB(검은색 그래프)와 특이적 방식으로 반응하지만, 대조군 세포(흰색 그래프)에 대한 교차-반응성이 없음을 보여준다.
실시예 5
당해 실시예는 사람 및 마우스 TrkB에 대한 29D7 TrkB 항체 및 29D7 Fab 단편의 결합 활성을 비교한다. 마우스(rhTrkB-EDC-Fc) 및 사람(rmTrkB-EDC) TrkB를 ELISA 플레이트에 실시예 1에 기재된 바와 같이 피복시켰다.
도 2OA 및 2OB는 각각 사람 및 마우스 TrkB에 대한 ELISA 결합 결과를 도시한 것이다. 29D7 IgG 항체 및 이의 Fab 단편 둘다는 사람 및 마우스 TrkB의 용량-의존적 결합 활성을 갖는다. 그러나, Fab의 ED50 값은 온전한 27D7보다 약 100배 낮았다. 동종형 대조군 IgG1 및 이의 Fab 단편은 둘다 TrkB에 결합하지 않았다.
실시예 6
당해 실시예는 사람 TrkB에 대한 실시예 5의 29D7 TrkB 항체 및 Fab 단편의 효능제 활성을 비교한다. 효능제 활성은 루시페라제 검정 및, 실시예 1에 기재된 표면 rhTrkB를 발현하는 HEK-293 세포를 사용하여 검정하였다.
HEK-293 세포를 지시된 농도의 29D7 IgG 또는 29D7 Fab로 처리하고, 축적 루시페라제 활성을 처리후 16시간째에 측정하였다. 도 21에 도시된 바와 같이, 총 IgG 및 29D7의 Fab 둘다는 TrkB의 활성화를 나타내는 용량-의존적 루시페라제 활성을 유도하였다. 그러나, 29D7 Fab의 EC50 값은 27D7 IgG 보다 약 27배 높았다(27D7 IgG 및 29D7 Fab에 대해 각각 0.083nM 및 2.28nM). 동종형 대조군 IgG1 또는 이의 Fab 단편중 어느 것도 TrkB 활성화에 효과를 미치지 않았다.
실시예 7
당해 실시예는 특정한 본 발명의 TrkB 모노클로날 항체의 에피토프 지도화 분석을 기술한다. 지도화를 사람 TrkB 세포외 도메인내 서열로부터 유추된 선형의, 단일 루프 및 이중 루프 펩타이드에 대해 수행하였다.
도 22에 도시한 바와 같이, 17D11 모노클로날 항체는 사람 TrkB의 IgG-2 절편의 루프-3(KNEYGKD, 서열번호 7, 서열번호 1의 아미노산 364 내지 370); 및 사람 TrkB의 IgG-2 절편의 루프-1(KGNPKP, 서열번호 8, 서열번호 1의 아미노산 308 내지 313)을 인식한다. 전자 에피토프의 마우스 서열(KNEYGKD, 서열번호 7, 서열번호 2의 아미노산 364 내지 370)은 사람 서열과 동일하다. 후자 에피토프의 마우스 서열(RGNPKP, 서열번호9, 서열번호 2의 아미노산 308 내지 313)은 1개의 아미노산이 상이하다.
도 22에 나타낸 바와 같이, 29D7, 7F5, 11IE1 및 19E12 모노클로날 항체는 모두 사람 TrkB의 IgG-I 절편의 루프-3(ENLVGED, 서열번호 10, 서열번호 1의 아미노산 269 내지 275)을 인식하고; 또한 사람 TrkB의 IgG-1 절편의 루프-1(AGDPVP, 서열번호 11, 서열번호 1의 아미노산 221 내지 226)을 인식한다. 전자 에피토프의 마우스 서열(ENLVGED, 서열번호 10, 서열번호 2의 아미노산 269 내지 275)은 사람 서열과 동일하다. 후자 에피토프의 마우스 서열(GGDPLP, 서열번호 12, 서열번호 2의 아미노산 221 내지 226)은 2개의 아미노산이 상이하다.
실시예 8
당해 실시예는 항-TrkB 항체 29D7로 수행된 생체내 TrkB 활성화 시험을 기술한다. 간략히 언급하면, 새끼 동물에게 P7에서 0.3nmol의 항-TrkB 모노클로날 항체 29D7 또는 비히클을 뇌실내 주사로 5㎕ 투여하였다. 이어서, 뇌 조직을 주사한지 1, 2, 6, 12 및 24시간 후 절제하였다. 조직을 분리하고, 동일한 양의 단백질 샘플(30㎍/레인)을 SDS-PAGE로 분리하고, TrkB 활성화의 결과로서 인산화된 단백질에 특이성 항체로 면역블롯팅하였다(포스포-ERKl/2 및 포스포-AKT). β-액틴에 대한 항체를 대조군으로서 사용하여 단백질이 동일하게 부하되었는지를 확인하였다. 도 27의 결과는 항-TrkB 모노클로날 항체 29D7이 ERKl/2 및 AKT의 시간-의존적 인산화를 유도함을 보여준다(해마 및 피질 샘플로부터의 데이타를 도시하며 이 데이타는 4개의 나머지 샘플로부터 수득된 결과를 대표하는 것이다).
도 28은 도 27에 도시한 ERK 인산화의 농도계측적 정량이다. 도 29는 도 27에 도시한 AKT 인산화의 농도계측적 정량이다. 도 30은 고정되고 뉴론-특이적 마커 NeuN (좌측) 및 항-포스포-ERK1/2 항체(중앙)에 대한 항체로 면역형광적으로 표지된, 비히클 및 29D7 처리된 뇌 조직을 도시한 것이다. 우측 도면은 이들 2개를 병합한 것이다. ERK 1/2 인산화는 29D7 처리된 샘플에서 유의적으로 강하였다. 도 31은 항-TrkB 모노클로날 항체 29D7의 뇌실내 투여 후 피질 및 해마 조직 중의 ERK1/2 활성화의 시간에 따른 추이를 도시한 것이다.
실시예 9
당해 실시예는 항-TrkB 항체 29D7를 사용하여 수행한 MAG/미엘린-유도된 신경돌기 억제 검정을 기술한다. 간략히 언급하면, 50㎕ 재조합 랫트 MAG(I -5) 또는 정제된 랫트 미엘린의 분취량을 96웰 평저 조직 배양 플레이트에 부가하고 실온에서 밤새 공기-건조시켰다. MAG(l-5) 또는 미엘린의 총량은 달리 언급하지 않는 한, 웰당 0.25 내지 0.5㎍이었다. 다음날, MAG- 또는 미엘린-피복된 플레이트를 50㎕의 폴리-D-라이신(17㎍/ml)으로 1.5시간 동안 처리한 다음, 10% FBS를 함유하는 배지와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 배지를 흡인한 후, 랫트 CGN 세포를 200 mM L-글루타민, 2 M KCl 및 100 U/ml 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 B27-보충된 Neurobasal 성장 배지에 8,000개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 지시되는 경우, 처리 시약을 세포 플레이팅시에 부가하였다. 뉴론을 5% CO2과 평형화된 37℃ 항온처리기에서 성장시켰다. 플레이팅한지 약 20시간 후에, 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 Tuj1 염색을 위해 가공하였다. 세포를 실온에서 5분 동안 0.2% Triton X/PBS (TPBS)를 사용하여 투과성이 되도록 만든 다음, TPBS(S-TPBS) 중의 1.5% 표준 염소 혈청과 함께 항온처리하여 비-특이적 결합을 차단하였다. 항-신경세포 부류 III b-튜불린 모노클로날 항체(Tuj1, 1:1000, Covance Covance # MMS-435P)의 분취량을 세포에 부가하였다. 실온에서 1시간 동안 항온처리한 후, 미결합된 항체를 PBS로 3회 세척하고 Alexa Fluor 488 마우스 항-염소 IgG 항체(1:500, Molecular Probe # A-11001)의 붙위량을 부가하여 신호를 가시화시켰다. 훽스트 33342(Molecular Probe # H-3570, 2㎍/ml)을 포함시켜 핵을 표지하였다. 세척 후, 플레이트를 밀봉하고 Cellomics 어레이 스캔을 사용하여 신경돌기 증식에 대해 분석하였다. 전형적으로, 약 9개 영역으로부터 약 300개의 세포를 웰마다 분석하였고, 각 처리는 4회 반복 수행하였다.
MAG 및 미엘린은 배양물 중에서 1차 소뇌 과립 뉴론의 신경돌기 증식을 억제한다. 재조합 랫트 MAG(I-5) 또는 정제된 랫트 미엘린의 농도를 증가시키면서 96웰 조직 배양 플레이트를 피복하고, 1차 뉴론의 신경돌기 신장을 상기한 바와 같이 20시간째에 측정하였다. 도 32에 도시한 바와 같이, (A) MAG 및 (B) 미엘린은 신경돌기 증식을 용량-의존적으로 억제하였다.
그 다음, CGN 뉴론을 대조군 또는 일정 농도 범위의 TrkB 항체 29D7을 함유한, MAG 또는 미엘린-피복된 플레이트에 플레이팅하였다. 신경돌기 신장을 처리 후 20시간째에 측정하였다. 도 33에서 도시한 바와 같이, 29D7은 (A) MAG- 및 (B) 미엘린-매개된 신경돌기 억제의 역전을 초래하였다.
기타 양태
본원에 개시된 본 발명의 명세서 또는 실시를 고려하여 본 발명의 기타 양태는 당업자에게 자명할 것이다. 본원 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로 고려되며, 본 발명의 진정한 범주는 하기 청구의 범위로 나타낸 바와 같다.
<110> WYETH <120> Anti-TrkB monoclonal antibodies and uses thereof <130> 2004658-0338 <150> US 60/687,705 <151> 2005-06-06 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 838 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human - (homo sapiens) TrkB <400> 1 Met Ser Ser Trp Ile Arg Trp His Gly Pro Ala Met Ala Arg Leu Trp 1 5 10 15 Gly Phe Cys Trp Leu Val Val Gly Phe Trp Arg Ala Ala Phe Ala Cys 20 25 30 Pro Thr Ser Cys Lys Cys Ser Ala Ser Arg Ile Trp Cys Ser Asp Pro 35 40 45 Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Val Asp 50 55 60 Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Phe Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu Glu 65 70 75 80 Ile Ile Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Arg Asn Leu 85 90 95 Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala His Lys Ala Phe Leu 100 105 110 Lys Asn Ser Asn Leu Gln His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu Thr 115 120 125 Ser Leu Ser Arg Lys His Phe Arg His Leu Asp Leu Ser Glu Leu Ile 130 135 140 Leu Val Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Ile Lys 145 150 155 160 Thr Leu Gln Glu Ala Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr Cys 165 170 175 Leu Asn Glu Ser Ser Lys Asn Ile Pro Leu Ala Asn Leu Gln Ile Pro 180 185 190 Asn Cys Gly Leu Pro Ser Ala Asn Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr Val 195 200 205 Glu Glu Gly Lys Ser Ile Thr Leu Ser Cys Ser Val Ala Gly Asp Pro 210 215 220 Val Pro Asn Met Tyr Trp Asp Val Gly Asn Leu Val Ser Lys His Met 225 230 235 240 Asn Glu Thr Ser His Thr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile Ser 245 250 255 Ser Asp Asp Ser Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu Val 260 265 270 Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Asn Leu Thr Val His Phe Ala Pro Thr 275 280 285 Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile Pro 290 295 300 Phe Thr Val Lys Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe Tyr Asn 305 310 315 320 Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His Val 325 330 335 Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn Pro Thr 340 345 350 His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Glu Tyr Gly 355 360 365 Lys Asp Glu Lys Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Trp Pro Gly Ile 370 375 380 Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val Ile Tyr Glu Asp Tyr 385 390 395 400 Gly Thr Ala Ala Asn Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Arg Ser Asn Glu 405 410 415 Ile Pro Ser Thr Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Arg Glu His Leu Ser 420 425 430 Val Tyr Ala Val Val Val Ile Ala Ser Val Val Gly Phe Cys Leu Leu 435 440 445 Val Met Leu Phe Leu Leu Lys Leu Ala Arg His Ser Lys Phe Gly Met 450 455 460 Lys Asp Phe Ser Trp Phe Gly Phe Gly Lys Val Lys Ser Arg Gln Gly 465 470 475 480 Val Gly Pro Ala Ser Val Ile Ser Asn Asp Asp Asp Ser Ala Ser Pro 485 490 495 Leu His His Ile Ser Asn Gly Ser Asn Thr Pro Ser Ser Ser Glu Gly 500 505 510 Gly Pro Asp Ala Val Ile Ile Gly Met Thr Lys Ile Pro Val Ile Glu 515 520 525 Asn Pro Gln Tyr Phe Gly Ile Thr Asn Ser Gln Leu Lys Pro Asp Thr 530 535 540 Phe Val Gln His Ile Lys Arg His Asn Ile Val Leu Lys Arg Glu Leu 545 550 555 560 Gly Glu Gly Ala Phe Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu Cys Tyr Asn Leu 565 570 575 Cys Pro Glu Gln Asp Lys Ile Leu Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Asp 580 585 590 Ala Ser Asp Asn Ala Arg Lys Asp Phe His Arg Glu Ala Glu Leu Leu 595 600 605 Thr Asn Leu Gln His Glu His Ile Val Lys Phe Tyr Gly Val Cys Val 610 615 620 Glu Gly Asp Pro Leu Ile Met Val Phe Glu Tyr Met Lys His Gly Asp 625 630 635 640 Leu Asn Lys Phe Leu Arg Ala His Gly Pro Asp Ala Val Leu Met Ala 645 650 655 Glu Gly Asn Pro Pro Thr Glu Leu Thr Gln Ser Gln Met Leu His Ile 660 665 670 Ala Gln Gln Ile Ala Ala Gly Met Val Tyr Leu Ala Ser Gln His Phe 675 680 685 Val His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn Leu 690 695 700 Leu Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Ser Arg Asp Val Tyr Ser Thr 705 710 715 720 Asp Tyr Tyr Arg Val Gly Gly His Thr Met Leu Pro Ile Arg Trp Met 725 730 735 Pro Pro Glu Ser Ile Met Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu Ser Asp Val 740 745 750 Trp Ser Leu Gly Val Val Leu Trp Glu Ile Phe Thr Tyr Gly Lys Gln 755 760 765 Pro Trp Tyr Gln Leu Ser Asn Asn Glu Val Ile Glu Cys Ile Thr Gln 770 775 780 Gly Arg Val Leu Gln Arg Pro Arg Thr Cys Pro Gln Glu Val Tyr Glu 785 790 795 800 Leu Met Leu Gly Cys Trp Gln Arg Glu Pro His Met Arg Lys Asn Ile 805 810 815 Lys Gly Ile His Thr Leu Leu Gln Asn Leu Ala Lys Ala Ser Pro Val 820 825 830 Tyr Leu Asp Ile Leu Gly 835 <210> 2 <211> 821 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> murine (Mus musculus) TrkB <400> 2 Met Ser Pro Trp Leu Lys Trp His Gly Pro Ala Met Ala Arg Leu Trp 1 5 10 15 Gly Leu Cys Leu Leu Val Leu Gly Phe Trp Arg Ala Ser Leu Ala Cys 20 25 30 Pro Thr Ser Cys Lys Cys Ser Ser Ala Arg Ile Trp Cys Thr Glu Pro 35 40 45 Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Val Asp 50 55 60 Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Leu Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu Glu 65 70 75 80 Ile Ile Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Arg Asn Leu 85 90 95 Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala Tyr Lys Ala Phe Leu 100 105 110 Lys Asn Ser Asn Leu Arg His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu Thr 115 120 125 Ser Leu Ser Arg Arg His Phe Arg His Leu Asp Leu Ser Asp Leu Ile 130 135 140 Leu Thr Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Leu Lys 145 150 155 160 Thr Leu Gln Glu Thr Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr Cys 165 170 175 Leu Asn Glu Ser Ser Lys Asn Met Pro Leu Ala Asn Leu Gln Ile Pro 180 185 190 Asn Cys Gly Leu Pro Ser Ala Arg Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr Val 195 200 205 Glu Glu Gly Lys Ser Val Thr Leu Ser Cys Ser Val Gly Gly Asp Pro 210 215 220 Leu Pro Thr Leu Tyr Trp Asp Val Gly Asn Leu Val Ser Lys His Met 225 230 235 240 Asn Glu Thr Ser His Thr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile Ser 245 250 255 Ser Asp Asp Ser Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu Val 260 265 270 Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Asn Leu Thr Val His Phe Ala Pro Thr 275 280 285 Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile Pro 290 295 300 Phe Thr Val Arg Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe Tyr Asn 305 310 315 320 Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His Val 325 330 335 Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn Pro Thr 340 345 350 His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Met Ala Lys Asn Glu Tyr Gly 355 360 365 Lys Asp Glu Arg Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Arg Pro Gly Val 370 375 380 Asp Tyr Glu Thr Asn Pro Asn Tyr Pro Glu Val Leu Tyr Glu Asp Trp 385 390 395 400 Thr Thr Pro Thr Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Lys Ser Asn Glu Ile 405 410 415 Pro Ser Thr Asp Val Ala Asp Gln Ser Asn Arg Glu His Leu Ser Val 420 425 430 Tyr Ala Val Val Val Ile Ala Ser Val Val Gly Phe Cys Leu Leu Val 435 440 445 Met Leu Leu Leu Leu Lys Leu Ala Arg His Ser Lys Phe Gly Met Lys 450 455 460 Gly Pro Ala Ser Val Ile Ser Asn Asp Asp Asp Ser Ala Ser Pro Leu 465 470 475 480 His His Ile Ser Asn Gly Ser Asn Thr Pro Ser Ser Ser Glu Gly Gly 485 490 495 Pro Asp Ala Val Ile Ile Gly Met Thr Lys Ile Pro Val Ile Glu Asn 500 505 510 Pro Gln Tyr Phe Gly Ile Thr Asn Ser Gln Leu Lys Pro Asp Thr Phe 515 520 525 Val Gln His Ile Lys Arg His Asn Ile Val Leu Lys Arg Glu Leu Gly 530 535 540 Glu Gly Ala Phe Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu Cys Tyr Asn Leu Cys 545 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760 765 Arg Val Leu Gln Arg Pro Arg Thr Cys Pro Gln Glu Val Tyr Glu Leu 770 775 780 Met Leu Gly Cys Trp Gln Arg Glu Pro His Thr Arg Lys Asn Ile Lys 785 790 795 800 Ser Ile His Thr Leu Leu Gln Asn Leu Ala Lys Ala Ser Pro Val Tyr 805 810 815 Leu Asp Ile Leu Gly 820 <210> 3 <211> 821 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rat - (Rattus norvegicus) TrkB <400> 3 Met Ser Pro Trp Pro Arg Trp His Gly Pro Ala Met Ala Arg Leu Trp 1 5 10 15 Gly Leu Cys Leu Leu Val Leu Gly Phe Trp Arg Ala Ser Leu Ala Cys 20 25 30 Pro Met Ser Cys Lys Cys Ser Thr Thr Arg Ile Trp Cys Thr Glu Pro 35 40 45 Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Ile Asp 50 55 60 Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Leu Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu Glu 65 70 75 80 Ile Ile Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Lys Asn Leu 85 90 95 Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala Tyr Lys Ala Phe Leu 100 105 110 Lys Asn Gly Asn Leu Arg His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu Thr 115 120 125 Ser Leu Ser Arg Arg His Phe Arg His Leu Asp Leu Ser Asp Leu Ile 130 135 140 Leu Thr Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Leu Lys 145 150 155 160 Thr Leu Gln Glu Thr Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr Cys 165 170 175 Leu Asn Glu Ser Ser Lys Asn Thr Pro Leu Ala Asn Leu Gln Ile Pro 180 185 190 Asn Cys Gly Leu Pro Ser Ala Arg Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr Val 195 200 205 Glu Glu Gly Lys Ser Val Thr Ile Ser Cys Ser Val Gly Gly Asp Pro 210 215 220 Leu Pro Thr Leu Tyr Trp Asp Val Gly Asn Leu Val Ser Lys His Met 225 230 235 240 Asn Glu Thr Ser His Thr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile Ser 245 250 255 Ser Asp Asp Ser Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu Val 260 265 270 Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Asn Leu Thr Val His Phe Ala Pro Thr 275 280 285 Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile Pro 290 295 300 Phe Thr Val Arg Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe Tyr Asn 305 310 315 320 Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His Val 325 330 335 Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln 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Ile Thr Gln Gly 755 760 765 Arg Val Leu Gln Arg Pro Arg Thr Cys Pro Gln Glu Val Tyr Glu Leu 770 775 780 Met Leu Gly Cys Trp Gln Arg Glu Pro His Thr Arg Lys Asn Ile Lys 785 790 795 800 Asn Ile His Thr Leu Leu Gln Asn Leu Ala Lys Ala Ser Pro Val Tyr 805 810 815 Leu Asp Ile Leu Gly 820 <210> 4 <211> 818 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> chicken - (Gallus gallus) TrkB <400> 4 Met Val Ser Trp Arg Arg Arg Pro Gly Pro Gly Leu Ala Arg Leu Trp 1 5 10 15 Gly Leu Cys Cys Leu Val Leu Gly Cys Trp Arg Gly Ala Leu Gly Cys 20 25 30 Pro Ala Ser Cys Arg Cys Ser Ser Trp Arg Ile Trp Cys Ser Glu Pro 35 40 45 Val Pro Gly Ile Thr Ser Phe Pro Val Pro Gln Arg Ser Thr Glu Asp 50 55 60 Asp Asn Val Thr Glu Ile Tyr Ile Ala Asn Gln Arg Lys Leu Glu Ser 65 70 75 80 Ile Asn Asp Asn Glu Val Gly Phe Tyr Val Gly Leu Lys Asn Leu Thr 85 90 95 Val Val Asp Ser Gly Leu Arg Phe Val Ser Arg Gln Ala Phe Val Lys 100 105 110 Asn Ile Asn Leu Gln Tyr Ile Asn Leu Ser Arg Asn Lys Leu Ser Ser 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Pro Phe 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Glu Cys Tyr Asn Leu Cys Pro Glu Gln 545 550 555 560 Asp Lys Ile Leu Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Asp Ala Ser Asp Asn 565 570 575 Ala Arg Lys Asp Phe His Arg Glu Ala Glu Leu Leu Thr Asn Leu Gln 580 585 590 His Glu His Ile Val Lys Phe Tyr Gly Val Cys Val Glu Gly Asp Pro 595 600 605 Leu Ile Met Val Phe Glu Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Asn Lys Phe 610 615 620 Leu Arg Ala His Gly Pro Asp Ala Val Leu Met Ala Glu Gly Asn Arg 625 630 635 640 Pro Ala Glu Leu Thr Gln Ser Gln Met Leu His Ile Ala Gln Gln Ile 645 650 655 Ala Ala Gly Met Val Tyr Leu Ala Ser Gln His Phe Val His Arg Asp 660 665 670 Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn Leu Leu Val Lys Ile 675 680 685 Gly Asp Phe Gly Met Ser Arg Asp Val Tyr Ser Thr Asp Tyr Tyr Arg 690 695 700 Val Gly Gly His Thr Met Leu Pro Ile Arg Trp Met Pro Pro Glu Ser 705 710 715 720 Ile Met Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu Ser Asp Val Trp Ser Leu Gly 725 730 735 Val Val Leu Trp Glu Ile Phe Thr Tyr Gly Lys Gln Pro Trp Tyr Gln 740 745 750 Leu Ser Asn Asn Glu Val Ile Glu Cys Ile Thr Gln Gly Arg Val Leu 755 760 765 Gln Arg Pro Arg Thr Cys Pro Lys Glu Val Tyr Asp Leu Met Leu Gly 770 775 780 Cys Trp Gln Arg Glu Pro His Met Arg Leu Asn Ile Lys Glu Ile His 785 790 795 800 Ser Leu Leu Gln Asn Leu Ala Lys Ala Ser Pro Val Tyr Leu Asp Ile 805 810 815 Leu Gly <210> 5 <211> 796 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> human - (Homo sapiens) TrkA <400> 5 Met Leu Arg Gly Gly Arg Arg Gly Gln Leu Gly Trp His Ser Trp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Pro Gly Ser Leu Leu Ala Trp Leu Ile Leu Ala Ser Ala Gly 20 25 30 Ala Ala Pro Cys Pro Asp Ala Cys Cys Pro His Gly Ser Ser Gly Leu 35 40 45 Arg Cys Thr Arg Asp Gly Ala Leu Asp Ser Leu His His Leu Pro Gly 50 55 60 Ala Glu Asn Leu Thr Glu Leu Tyr Ile Glu Asn Gln Gln His Leu Gln 65 70 75 80 His Leu Glu Leu Arg Asp Leu Arg Gly Leu Gly Glu Leu Arg Asn Leu 85 90 95 Thr Ile Val Lys Ser Gly Leu Arg Phe Val Ala Pro Asp Ala Phe His 100 105 110 Phe Thr Pro Arg Leu Ser Arg Leu Asn Leu Ser Phe Asn Ala Leu Glu 115 120 125 Ser Leu Ser Trp Lys Thr Val Gln Gly Leu Ser Leu Gln Glu Leu Val 130 135 140 Leu Ser Gly Asn Pro Leu His Cys Ser Cys Ala Leu Arg Trp Leu Gln 145 150 155 160 Arg Trp Glu Glu Glu Gly Leu Gly Gly Val Pro Glu Gln Lys Leu Gln 165 170 175 Cys His Gly Gln Gly Pro Leu Ala His Met Pro Asn Ala Ser Cys Gly 180 185 190 Val Pro Thr Leu Lys Val Gln Val Pro Asn Ala Ser Val Asp Val Gly 195 200 205 Asp Asp Val Leu Leu Arg Cys Gln Val Glu Gly Arg Gly Leu Glu Gln 210 215 220 Ala Gly Trp Ile Leu Thr Glu Leu Glu Gln Ser Ala Thr Val Met Lys 225 230 235 240 Ser Gly Gly Leu Pro Ser Leu Gly Leu Thr Leu Ala Asn Val Thr Ser 245 250 255 Asp Leu Asn Arg Lys Asn Val Thr Cys Trp Ala Glu Asn Asp Val Gly 260 265 270 Arg Ala Glu Val Ser Val Gln Val Asn Val Ser Phe Pro Ala Ser Val 275 280 285 Gln Leu His Thr Ala Val Glu Met His His Trp Cys Ile Pro Phe Ser 290 295 300 Val Asp Gly Gln Pro Ala Pro Ser Leu Arg Trp Leu Phe Asn Gly Ser 305 310 315 320 Val Leu Asn Glu Thr Ser Phe Ile Phe Thr Glu Phe Leu Glu Pro Ala 325 330 335 Ala Asn Glu Thr Val Arg His Gly Cys Leu Arg Leu Asn Gln Pro Thr 340 345 350 His Val Asn Asn Gly Asn Tyr Thr Leu Leu Ala Ala Asn Pro Phe Gly 355 360 365 Gln Ala Ser Ala Ser Ile Met Ala Ala Phe Met Asp Asn Pro Phe Glu 370 375 380 Phe Asn Pro Glu Asp Pro Ile Pro Val Ser Phe Ser Pro Val Asp Thr 385 390 395 400 Asn Ser Thr Ser Gly Asp Pro Val Glu Lys Lys Asp Glu Thr Pro Phe 405 410 415 Gly Val Ser Val Ala Val Gly Leu Ala Val Phe Ala Cys Leu Phe Leu 420 425 430 Ser Thr Leu Leu Leu Val Leu Asn Lys Cys Gly Arg Arg Asn Lys Phe 435 440 445 Gly Ile Asn Arg Pro Ala Val Leu Ala Pro Glu Asp Gly Leu Ala Met 450 455 460 Ser Leu His Phe Met Thr Leu Gly Gly Ser Ser Leu Ser Pro Thr Glu 465 470 475 480 Gly Lys Gly Ser Gly Leu Gln Gly His Ile Ile Glu Asn Pro Gln Tyr 485 490 495 Phe Ser Asp Ala Cys Val His His Ile Lys Arg Arg Asp Ile Val Leu 500 505 510 Lys Trp Glu Leu Gly Glu Gly Ala Phe Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu 515 520 525 Cys His Asn Leu Leu Pro Glu Gln Asp Lys Met Leu Val Ala Val Lys 530 535 540 Ala Leu Lys Glu Ala Ser Glu Ser Ala Arg Gln Asp Phe Gln Arg Glu 545 550 555 560 Ala Glu Leu Leu Thr Met Leu Gln His Gln His Ile Val Arg Phe Phe 565 570 575 Gly Val Cys Thr Glu Gly Arg Pro Leu Leu Met Val Phe Glu Tyr Met 580 585 590 Arg His Gly Asp Leu Asn Arg Phe Leu Arg Ser His Gly Pro Asp Ala 595 600 605 Lys Leu Leu Ala Gly Gly Glu Asp Val Ala Pro Gly Pro Leu Gly Leu 610 615 620 Gly Gln Leu Leu Ala Val Ala Ser Gln Val Ala Ala Gly Met Val Tyr 625 630 635 640 Leu Ala Gly Leu His Phe Val His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys 645 650 655 Leu Val Gly Gln Gly Leu Val Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Ser 660 665 670 Arg Asp Ile Tyr Ser Thr Asp Tyr Tyr Arg Val Gly Gly Arg Thr Met 675 680 685 Leu Pro Ile Arg Trp Met Pro Pro Glu Ser Ile Leu Tyr Arg Lys Phe 690 695 700 Thr Thr Glu Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp Glu Ile 705 710 715 720 Phe Thr Tyr Gly Lys Gln Pro Trp Tyr Gln Leu Ser Asn Thr Glu Ala 725 730 735 Ile Asp Cys Ile Thr Gln Gly Arg Glu Leu Glu Arg Pro Arg Ala Cys 740 745 750 Pro Pro Glu Val Tyr Ala Ile Met Arg Gly Cys Trp Gln Arg Glu Pro 755 760 765 Gln Gln Arg His Ser Ile Lys Asp Val His Ala Arg Leu Gln Ala Leu 770 775 780 Ala Gln Ala Pro Pro Val Tyr Leu Asp Val Leu Gly 785 790 795 <210> 6 <211> 839 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> human (Homo sapiens) TrkC <400> 6 Met Asp Val Ser Leu Cys Pro Ala Lys Cys Ser Phe Trp Arg Ile Phe 1 5 10 15 Leu Leu Gly Ser Val Trp Leu Asp Tyr Val Gly Ser Val Leu Ala Cys 20 25 30 Pro Ala Asn Cys Val Cys Ser Lys Thr Glu Ile Asn Cys Arg Arg Pro 35 40 45 Asp Asp Gly Asn Leu Phe Pro Leu Leu Glu Gly Gln Asp Ser Gly Asn 50 55 60 Ser Asn Gly Asn Ala Asn Ile Asn Ile Thr Asp Ile Ser Arg Asn Ile 65 70 75 80 Thr Ser Ile His Ile Glu Asn Trp Arg Ser Leu His Thr Leu Asn Ala 85 90 95 Val Asp Met Glu Leu Tyr Thr Gly Leu Gln Lys Leu Thr Ile Lys Asn 100 105 110 Ser Gly Leu Arg Ser Ile Gln Pro Arg Ala Phe Ala Lys Asn Pro His 115 120 125 Leu Arg Tyr Ile Asn Leu Ser Ser Asn Arg Leu Thr Thr Leu Ser Trp 130 135 140 Gln Leu Phe Gln Thr Leu Ser Leu Arg Glu Leu Gln Leu Glu Gln Asn 145 150 155 160 Phe Phe Asn Cys Ser Cys Asp Ile Arg Trp Met Gln Leu Trp Gln Glu 165 170 175 Gln Gly Glu Ala Lys Leu Asn Ser Gln Asn Leu Tyr Cys Ile Asn Ala 180 185 190 Asp Gly Ser Gln Leu Pro Leu Phe Arg Met Asn Ile Ser Gln Cys Asp 195 200 205 Leu Pro Glu Ile Ser Val Ser His Val Asn Leu Thr Val Arg Glu Gly 210 215 220 Asp Asn Ala Val Ile Thr Cys Asn Gly Ser Gly Ser Pro Leu Pro Asp 225 230 235 240 Val Asp Trp Ile Val Thr Gly Leu Gln Ser Ile Asn Thr His Gln Thr 245 250 255 Asn Leu Asn Trp Thr Asn Val His Ala Ile Asn Leu Thr Leu Val Asn 260 265 270 Val Thr Ser Glu Asp Asn Gly Phe Thr Leu Thr Cys Ile Ala Glu Asn 275 280 285 Val Val Gly Met Ser Asn Ala Ser Val Ala Leu Thr Val Tyr Tyr Pro 290 295 300 Pro Arg Val Val Ser Leu Glu Glu Pro Glu Leu Arg Leu Glu His Cys 305 310 315 320 Ile Glu Phe Val Val Arg Gly Asn Pro Pro Pro Thr Leu His Trp Leu 325 330 335 His Asn Gly Gln Pro Leu Arg Glu Ser Lys Ile Ile His Val Glu Tyr 340 345 350 Tyr Gln Glu Gly Glu Ile Ser Glu Gly Cys Leu Leu Phe Asn Lys Pro 355 360 365 Thr His Tyr Asn Asn Gly Asn Tyr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Pro Leu 370 375 380 Gly Thr Ala Asn Gln Thr Ile Asn Gly His Phe Leu Lys Glu Pro Phe 385 390 395 400 Pro Glu Ser Thr Asp Asn Phe Ile Leu Phe Asp Glu Val Ser Pro Thr 405 410 415 Pro Pro Ile Thr Val Thr His Lys Pro Glu Glu Asp Thr Phe Gly Val 420 425 430 Ser Ile Ala Val Gly Leu Ala Ala Phe Ala Cys Val Leu Leu Val Val 435 440 445 Leu Phe Val Met Ile Asn Lys Tyr Gly Arg Arg Ser Lys Phe Gly Met 450 455 460 Lys Gly Pro Val Ala Val Ile Ser Gly Glu Glu Asp Ser Ala Ser Pro 465 470 475 480 Leu His His Ile Asn His Gly Ile Thr Thr Pro Ser Ser Leu Asp Ala 485 490 495 Gly Pro Asp Thr Val Val Ile Gly Met Thr Arg Ile Pro Val Ile Glu 500 505 510 Asn Pro Gln Tyr Phe Arg Gln Gly His Asn Cys His Lys Pro Asp Thr 515 520 525 Tyr Val Gln His Ile Lys Arg Arg Asp Ile Val Leu Lys Arg Glu Leu 530 535 540 Gly Glu Gly Ala Phe Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu Cys Tyr Asn Leu 545 550 555 560 Ser Pro Thr Lys Asp Lys Met Leu Val Ala Val Lys Ala Leu Lys Asp 565 570 575 Pro Thr Leu Ala Ala Arg Lys Asp Phe Gln Arg Glu Ala Glu Leu Leu 580 585 590 Thr Asn Leu Gln His Glu His Ile Val Lys Phe Tyr Gly Val Cys Gly 595 600 605 Asp Gly Asp Pro Leu Ile Met Val Phe Glu Tyr Met Lys His Gly Asp 610 615 620 Leu Asn Lys Phe Leu Arg Ala His Gly Pro Asp Ala Met Ile Leu Val 625 630 635 640 Asp Gly Gln Pro Arg Gln Ala Lys Gly Glu Leu Gly Leu Ser Gln Met 645 650 655 Leu His Ile Ala Ser Gln Ile Ala Ser Gly Met Val Tyr Leu Ala Ser 660 665 670 Gln His Phe Val His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly 675 680 685 Ala Asn Leu Leu Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Ser Arg Asp Val 690 695 700 Tyr Ser Thr Asp Tyr Tyr Arg Leu Phe Asn Pro Ser Gly Asn Asp Phe 705 710 715 720 Cys Ile Trp Cys Glu Val Gly Gly His Thr Met Leu Pro Ile Arg Trp 725 730 735 Met Pro Pro Glu Ser Ile Met Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu Ser Asp 740 745 750 Val Trp Ser Phe Gly Val Ile Leu Trp Glu Ile Phe Thr Tyr Gly Lys 755 760 765 Gln Pro Trp Phe Gln Leu Ser Asn Thr Glu Val Ile Glu Cys Ile Thr 770 775 780 Gln Gly Arg Val Leu Glu Arg Pro Arg Val Cys Pro Lys Glu Val Tyr 785 790 795 800 Asp Val Met Leu Gly Cys Trp Gln Arg Glu Pro Gln Gln Arg Leu Asn 805 810 815 Ile Lys Glu Ile Tyr Lys Ile Leu His Ala Leu Gly Lys Ala Thr Pro 820 825 830 Ile Tyr Leu Asp Ile Leu Gly 835 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> human (Homo sapiens) <400> 7 Lys Asn Glu Tyr Gly Lys Asp 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human (Homo sapiens) <400> 8 Lys Gly Asn Pro Lys Pro 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> murine (Mus musculus) <400> 9 Arg Gly Asn Pro Lys Pro 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> human (Homo sapiens) <400> 10 Glu Asn Leu Val Gly Glu Asp 1 5 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> human (Homo sapiens) <400> 11 Ala Gly Asp Pro Val Pro 1 5

Claims (70)

  1. 사람 TrkB에 결합하는 모노클로날 항체.
  2. 제1항에 있어서, 사람 TrkB와의 결합이 약 10 pM 내지 약 500 nM 범위의 ED50을 갖는 모노클로날 항체.
  3. 제1항에 있어서, 사람 TrkB와의 결합이 약 10 pM 내지 약 1 nM 범위의 ED50을 갖는 모노클로날 항체.
  4. 제1항에 있어서, 사람 TrkB와의 결합이 약 10 pM 내지 약 100 pM 범위의 ED50을 갖는 모노클로날 항체.
  5. 제1항에 있어서, 사람 TrkB와의 결합이 약 10 pM 내지 약 50 pM 범위의 ED50을 갖는 모노클로날 항체.
  6. 제1항에 있어서, 약 10 pM 내지 약 500 nM 범위의 EC50으로 사람 TrkB를 활성화시키는 모노클로날 항체.
  7. 제1항에 있어서, 약 10 pM 내지 약 1 nM 범위의 EC50으로 사람 TrkB를 활성화시키는 모노클로날 항체.
  8. 제1항에 있어서, 약 10 pM 내지 약 100 pM 범위의 EC50으로 사람 TrkB를 활성화시키는 모노클로날 항체.
  9. 제1항에 있어서, 약 10 pM 내지 약 50 pM 범위의 EC50으로 사람 TrkB를 활성화시키는 모노클로날 항체.
  10. 제1항에 있어서, 사람 TrkA에 결합하지 않고/않거나 이를 활성화시키지 않는 모노클로날 항체.
  11. 제10항에 있어서, 약 1nM 이상의 항체 농도에서 사람 TrkA와의 검출가능한 결합을 나타내지 않고/않거나 사람 TrkA의 임의의 검출가능한 활성화를 유발하지 않는 모노클로날 항체.
  12. 제10항에 있어서, 약 10nM 이상의 항체 농도에서 사람 TrkA와의 검출가능한 결합을 나타내지 않고/않거나 사람 TrkA의 임의의 검출가능한 활성화를 유발하지 않는 모노클로날 항체.
  13. 제10항에 있어서, 약 100nM 이상의 항체 농도에서 사람 TrkA와의 검출가능한 결합을 나타내지 않고/않거나 사람 TrkA의 임의의 검출가능한 활성화를 유발하지 않는 모노클로날 항체.
  14. 제10항에 있어서, 약 1 μM 이상의 항체 농도에서 사람 TrkA와의 검출가능한 결합을 나타내지 않고/않거나 사람 TrkA의 임의의 검출가능한 활성화를 유발하지 않는 모노클로날 항체.
  15. 제1항에 있어서, 사람 TrkC에 결합하지 않고/않거나 이를 활성화시키지 않는 모노클로날 항체.
  16. 제15항에 있어서, 약 1nM 이상의 항체 농도에서 사람 TrkC와의 검출가능한 결합을 나타내지 않고/않거나 사람 TrkC의 임의의 검출가능한 활성화를 유발하지 않는 모노클로날 항체.
  17. 제15항에 있어서, 약 10nM 이상의 항체 농도에서 사람 TrkC와의 검출가능한 결합을 나타내지 않고/않거나 사람 TrkC의 임의의 검출가능한 활성화를 유발하지 않는 모노클로날 항체.
  18. 제15항에 있어서, 약 100 nM 이상의 항체 농도에서 사람 TrkC와의 검출가능한 결합을 나타내지 않고/않거나 사람 TrkC의 임의의 검출가능한 활성화를 유발하지 않는 모노클로날 항체.
  19. 제15항에 있어서, 약 1 μM 이상의 항체 농도에서 사람 TrkC와의 검출가능한 결합을 나타내지 않고/않거나 사람 TrkC의 임의의 검출가능한 활성화를 유발하지 않는 모노클로날 항체.
  20. 제10항에 있어서, 사람 TrkC에 결합하지 않고/않거나 이를 활성화시키지 않는 모노클로날 항체.
  21. 제1항에 있어서, 뇌 유래의 향신경 인자(BDNF)와 사람 TrkB 간의 결합을 차단하는 모노클로날 항체.
  22. 제21항에 있어서, 약 100 pM 내지 약 500 nM의 범위의 IC50으로 BDNF와 사람 TrkB 간의 결합을 차단하는 모노클로날 항체.
  23. 제21항에 있어서, 약 100 pM 내지 약 1 nM의 범위의 IC50으로 BDNF와 사람 TrkB 간의 결합을 차단하는 모노클로날 항체.
  24. 제21항에 있어서, 약 100 pM 내지 약 500 pM의 범위의 IC50으로 BDNF와 사람 TrkB 간의 결합을 차단하는 모노클로날 항체.
  25. 제1항에 있어서, BDNF와 사람 TrkB 간의 결합을 차단하지 않는 모노클로날 항체.
  26. 제25항에 있어서, 약 1 nM 이상의 항체 농도에서 검출가능한 차단 활성을 나타내지 않는 모노클로날 항체.
  27. 제25항에 있어서, 약 10 nM 이상의 항체 농도에서 검출가능한 차단 활성을 나타내지 않는 모노클로날 항체.
  28. 제25항에 있어서, 약 100 nM 이상의 항체 농도에서 검출가능한 차단 활성을 나타내지 않는 모노클로날 항체.
  29. 제25항에 있어서, 약 1 μM 이상의 항체 농도에서 검출가능한 차단 활성을 나타내지 않는 모노클로날 항체.
  30. 제1항에 있어서, IgG1 동종형(isotype)을 갖는 모노클로날 항체.
  31. 제1항에 있어서, IgG2a 동종형을 갖는 모노클로날 항체.
  32. 제1항에 있어서, IgG2b 동종형을 갖는 모노클로날 항체.
  33. 제1항 내지 제32항 중의 어느 한 항에 있어서, 쥐 TrkB에 결합하고/하거나 이를 활성화시키는 모노클로날 항체.
  34. 제33항에 있어서, 쥐 TrkB와의 결합이 약 10 pM 내지 약 500 nM 범위의 ED50을 갖는 모노클로날 항체.
  35. 제33항에 있어서, 쥐 TrkB와의 결합이 약 10 pM 내지 약 1 nM 범위의 ED50을 갖는 모노클로날 항체.
  36. 제33항에 있어서, 쥐 TrkB와의 결합이 약 10 pM 내지 약 500 pM 범위의 ED50을 갖는 모노클로날 항체.
  37. 제33항에 있어서, 쥐 TrkB와의 결합이 약 10 pM 내지 약 100 pM 범위의 ED50을 갖는 모노클로날 항체.
  38. 제1항에 있어서, 서열 KNEYGKD (서열번호 7)을 갖는 사람 TrkB의 에피토프 및 KGNPKP(서열번호 8)을 갖는 사람 TrkB의 에피토프 중 하나 또는 둘다에 결합하는 모노클로날 항체.
  39. 제38항에 있어서, 서열 KNEYGKD (서열번호 7)을 갖는 마우스 TrkB의 에피토프 및 RGNPKP (서열번호 9)을 갖는 마우스 TrkB의 에피토프 중 하나 또는 둘다에 추가 결합하는 모노클로날 항체.
  40. 제1항에 있어서, 서열 ENLVGED (서열번호 10)을 갖는 사람 TrkB의 에피토프 및 임의로 서열 AGDPVP (서열번호 11)을 갖는 사람 TrkB의 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체.
  41. 제40항에 있어서, 서열 ENLVGED (서열번호 10)을 갖는 마우스 TrkB의 에피토프에 추가 결합하는 모노클로날 항체.
  42. 2005년 8월 18일자로 ATCC에 기탁되어 ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6948을 부여받은 하이브리도마 또는 이의 전구세포(progenitor cell)로부터 생산되는 모노클로날 항체.
  43. 2005년 8월 18일자로 ATCC에 기탁되어 ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6949를 부여받은 하이브리도마 또는 이의 전구세포로부터 생산되는 모노클로날 항체.
  44. 제1항에 있어서, 제42항의 모노클로날 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체.
  45. 제1항에 있어서, 제43항의 모노클로날 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체.
  46. 제1항 내지 제41항 중의 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마.
  47. 2005년 8월 18일자로 ATCC에 기탁되어 ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6948을 부여받은 하이브리도마 또는 이의 전구세포.
  48. 2005년 8월 18일자로 ATCC에 기탁되어 ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6949를 부여받은 하이브리도마 또는 이의 전구세포.
  49. 동물을 상이한 종의 TrkB 단백질로부터 유래된 2가지 이상의 단백질 면역원으로 면역화시키는 단계; 및
    상기 면역화된 동물로부터의 비장 세포를 골수종 세포와 융합시키는 단계를 포함하는, 하이브리도마를 생산하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 2가지 이상의 단백질 면역원이 사람 TrkB로부터 유래된 제1 면역원 및 비-사람 TrkB로부터 유래된 제2 면역원을 포함하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 제1 면역원이 사람 TrkB의 세포외 도메인을 포함하고, 제2 면역원이 비-사람 TrkB의 세포외 도메인을 포함하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 제2 면역원이 쥐 TrkB, 랫트 TrkB 및 닭 TrkB로 이루어진 그룹으로부터 선택된 비-사람 TrkB의 세포외 도메인을 포함하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 제2 면역원이 쥐 TrkB의 세포외 도메인을 포함하는 방법.
  54. 제50항에 있어서, 제1 면역원 및 제2 면역원이 면역화 단계에서 약 1을 초과하는 비율(중량 기준)을 갖는 양으로 투여되는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 비율이 약 5를 초과하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 비율이 약 10인 방법.
  57. 제51항에 있어서, 제1 및 제2 면역원이 TrkB의 세포외 도메인의 외부에서 발견되는 어떠한 아미노산도 포함하지 않는 방법.
  58. 제49항 내지 제57항 중의 어느 한 항의 방법에 따라서 생산된 하이브리도마.
  59. 제49항 내지 제57항 중의 어느 한 항에 있어서, 하이브리도마로부터 모노클로날 항체를 생성시킴을 추가로 포함하는 방법.
  60. 제59항의 방법에 따라서 생산된 모노클로날 항체.
  61. 개체에게 제1항 내지 제41항 중의 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하는, 개체에서 사람 TrkB를 활성화시키는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 개체가 TrkB의 활성화가 요구되는 신경계 질환을 앓고 있는 방법.
  63. 제61항에 있어서, 개체의 신경계가 외상, 수술, 허혈, 감염, 대사질환, 영양실조, 악성 종양 또는 독성 약물에 의해 손상된 방법.
  64. 제61항에 있어서, 개체가 졸중, 척수 손상 또는 축삭절제(axotomy)를 앓는 방법.
  65. 제61항에 있어서, 개체가 선천성 또는 신경퇴행성 상태를 앓는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상태가 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 및 근위축성 측삭 경화증(ALS)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  67. 제61항에 있어서, 모노클로날 항체가 개체에게 비경구 투여되는 방법.
  68. 제61항에 있어서, 모노클로날 항체가 개체에게 정맥내 또는 복강내 투여되는 방법.
  69. 제1항 내지 제41항 중의 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체를, 당해 모노클로날 항체와 사람 TrkB 간의 특이적 결합을 허용하는 조건하에 일정양의 사람 TrkB와 배합하는 단계; 및
    특이적 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 샘플 중의 사람 TrkB의 존재를 나타내는 방법.
  70. 제1항 내지 제41항 중의 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체를, 당해 모노클 로날 항체와 사람 TrkB 간의 특이적 결합을 허용하는 조건하에 일정양의 사람 TrkB와 배합하여 항체-TrkB 복합체를 생성시키는 단계;
    상기 항체-사람 TrkB 복합체를 샘플의 나머지 부분으로부터 분리시키는 단계; 및
    항체를 사람 TrkB로부터 분리하는 단계를 포함하는, 정제된 사람 TrkB를 수득하는 방법.
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