BRPI0610938A2 - anticorpos monoclonais anti-trkb e usos dos mesmos - Google Patents

Abstract

A presente invenção fornece anticorpos monoclonais para TrkB humano. Em certas modalidades, os anticorpos inventivos ligam e ativam TrkB humano. Em certas modalidades os anticorpos inventivos são seletivos para TrkB humano em que eles não ligam (ou ativam) TrkA humano ou TrkC humano. Em algumas modalidades os anticorpos inventivos monoclonais reagem cruzado com TrkB de murino. Versões humanizadas ou embutidas dos anticorpos inventivos também são abrangidas. Composições farmacêuticas que compreendem anticorpos inventivos são fornecidas como são os métodos para preparar os anticorpos inventivos e métodos de uso dos mesmos para propósitos de tratamento, detecção ou purificação.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-TRKB E USOS DOS MESMOS".

INFORMAÇÃO DE PRIORIDADE

O presente pedido reivindica o benefício do U.S. Série N-60/687.705, depositado em 6 de junho de 2005, os conteúdos inteiros doqual são por meio do mesmo incorporados por referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Receptores de tirosina cinase Trk são receptores de transmem-brana única de domínio múltiplo que desempenham um papel importante emum espectro amplo de respostas neuronais incluindo sobrevivência, diferen-ciação, crescimento e regeneração. Eles são receptores de afinidade eleva-da para neurotrofinas, uma família de fatores de crescimento de proteína,que inclui fator de crescimento nervoso (NGF), fator neurotrófico derivado docérebro (BDNF), neurotrofiná-3 (NT-3) e neurotrofina-4/5 (NT-4/5). As neuro-trofinas compartilham características estruturais altamente conservadas, a-inda suas seqüências de aminoácido únicas permitem que cada membroevoque interações de afinidade elevada com o domínio extracelular de re-ceptores de Trk específicos, isto é, TrkA, B ou C. Assim, NGF é um ligandopreferido para TrkA; BDNF e NT-4/5 são ligandos preferidos para TrkB; eNT-3 mostrou ligar TrkC, embora também pareça ligar TrkA e TrkB com afi-nidades mais baixas.

Entre os receptores de Trk, o papel de TrkB foi bem caracteriza-do no sistema nervoso central (CNS). TrkB são amplamente distribuídas nocérebro, incluindo no neocórtex, hipocampo, estriado, formação olfativa ehaste cerebral. Usando BDNF como um ligando cognato, os papéis indis-pensáveis de TrkB na sobrevivência, diferenciação e neurorregeneraçãoneuronais foram mostrados em vários modelos neurodegenerativos, incluin-do acidente vascular cerebral, lesão na medula espinhal, axotomia e ALS.

Através de várias análises de sinalização e sistemas desprovi-dos de receptor, as respostas de BDNF mostraram depender da ligação eativação de TrkB. Como observado, receptores de Trk são proteínas detransmembrana única de domínio múltiplo. Eles consistem em um domíniode ligação de ligando extracelular, uma região de transmembrana, e um do-mínio de tirosina cinase intracelular. O domínio extracelular é composto deum motivo rico em leucina flanqueado por dois agrupamentos de cisteína edois domínios semelhantes à imunoglobulina (Ig). Os receptores de Trk mos-traram interagir com seus ligandos principalmente através do segundo domí-nio semelhante a Ig, embora a contribuição de outras regiões tais como ummotivo rico em leucina e o primeiro domínio de Ig em acoplamento de ligan-do foi proposto. As estruturas de cristal do domínio de ligação de ligandos dereceptores de Trk assim como complexos de ligando-receptor foram resolvi-dos. A interface ligando-receptor parece consistir em duas porções: uma pa-ra um motivo de ligação conservada compartilhado entre todas as neurotro-finas e a outra específica para cada neurotrofina.

Na ligação de neurotrofinas aos receptores de Trk, a dimeriza-ção do receptor e mudanças conformacionais subseqüentes ocorrem, o queacredita-se levar à ativação do domínio de tirosina cinase intracelular. Exis-tem várias tirosinas conservadas no domínio intracelular de receptores deTrk. A fosforilação da alça autoreguladora do domínio de cinase ativa a ativi-dade de cinase, e a fosforilação de outros resíduos promove a sinalizaçãocriando-se sítios de acoplamento para proteínas adaptadoras que ligam es-tes receptores a cascatas de sinalização intracelular, incluindo via de proteí-na cinase de Ras/cinase regulada por sinal extracelular (ERK), a via dePI3K/Akt cinase e fosfolipase C-gama. Embora um pouco sobrepostas, estasvias individuais estão envolvidas em atividades biológicas distintas:

Ras/MAPK regula a diferenciação e proliferação neuronais, as vias dePI3K/Akt controlam a dinâmica e sobrevivência de atina e PLC gama estáenvolvido na mobilização de cálcio.

Até agora, não existe nenhum exemplo bem-sucedido de rea-gentes que agem como agonistas potentes e seletivos in vivo de TrkB. Em-bora BDNF, como uma proteína recombinante, mostrou aumentar a sobrevi-vencia e neuroregeneração neuronais em vários modelos degenerativos doCNS in vitro e in vivo, os efeitos da terapia de proteína BDNF em clínicasforam negativos, o mais provavelmente porque BDNF tem uma meia-vida invivo curta. Portanto existe uma necessidade na técnica para reagentes far-macêuticos que agem como agonistas potentes e seletivos in vivo de TrkB.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece anticorpos monoclonais para TrkBhumano. Em certas modalidades os anticorpos inventivos ligam e ativamTrkB humano. Em certas modalidades os anticorpos inventivos são seletivospara TrkB humano em que eles ligam-se preferencialmente a TrkB em TrkAhumano ou TrkC humano. Em algumas modalidades os anticorpos monoclo-nais inventivos reagem cruzado com TrkB de murino.

A invenção também fornece composições farmacêuticas quecompreendem um ou mais dos mesmos anticorpos. A invenção fornece ain-da métodos para preparar os anticorpos monoclonais inventivos. Versõeshumanizadas ou embutidas dos anticorpos inventivos também são abrangi-das como são os hibridomas que produzem os anticorpos inventivos.

A invenção fornece ainda métodos de usar estes anticorpos mo-noclonais como agonistas de TrkB. Em certas modalidades os anticorposmonoclonais são usados como agonistas de TrkB humano. De acordo comtais modalidades, os anticorpos podem ser usados para tratar condições querequerem ativação de TrkB, incluindo condições neurológicas.

A invenção fornece ainda outros métodos para detectar TrkB emuma amostra e métodos para purificar TrkB a partir de uma amostra usandoos anticorpos inventivos.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 descreve atividades de anticorpo específico de TrkBem soros imunes de cinco camundongos imunizados (M1 a M5). A ligaçãode soros imunes resulta de um ensaio ELISA com uma proteína recombinan-te que inclui o domínio extracelular de TrkB humano fundido à região Fc delgG1 humana (rhTrkB-EDC-Fc) são mostrados em (A). A ligação de sorosimunes resulta de um ensaio ELISA com uma proteína recombinante queinclui o domínio extracelular de TrkB de murino (rmTrkB-EDC) são mostra-dos em (B). A extensão para que soros imunes podem bloquear a interaçãode rhTrkB-EDC-Fc e BDNF em um ensaio ELISA de competição são mos-trados em (C). A ligação de soros imunes a rhTrkB de superfície em célulasHEK-293 é mostrada em (D).

A Figura 2 descreve resultados de controle que foram obtidoscom neurotrofinas em um ensaio de atividade de luciferase que usa célulasHEK-293 que expressam rhTrkB de superfície. Estes resultados de controlemostram que o ensaio pode representar seletivamente a ativação de TrkB.

A Figura 3 descreve resultados que foram obtidos com sorosimunes no mesmo ensaio de atividade de luciferase como a Fig. 2. Estesresultados mostram que a incubação de células hTrkB com sangrias imunessignificantemente aumentou os sinais de luciferase em uma maneira depen-dente de dose.

A Figura 4 descreve resultados que foram obtidos com certosanticorpos de TrkB no mesmo ensaio de atividade de luciferase como a Fig.2. Todos os anticorpos causaram aumentos dependentes de dose no sinalcom EC50 na faixa de 10"10 (M). A janela de sinal máximo foi ~ 7 vezes maisbasal para a maioria dos anticorpos, que foi comparável à resposta induzidapor BDNF a 200 ng/ml (6,2 vezes mais basal).

A Figura 5 descreve os resultados que foram obtidos com certosanticorpos de TrkB em um ensaio de crescimento de neurito. O ensaio usoucélulas SY5Y de neuroblastoma humano, que mostraram expressar TrkB nadiferenciação neuronal. A adição de BDNF e da maioria dos anticorpos pro-moveu o crescimento de neurito como demonstrado por aumentos no com-primento de neurito (A) e no número de pontos de ramificação (B). Imagensrepresentativas de alguns grupos de tratamento são mostradas em (C). Osresultados de análises de resposta de dose completa obtidas para um sub-conjunto dos mesmos anticorpos são mostrados em (D).

A Figura 6 descreve os resultados que foram obtidos com certosanticorpos de TrkB em um ensaio de neuroproteção. O ensaio mede a so-brevivência de células SY5Y diferenciadas a seguir do dano de retirada desoro. Os resultados mostraram que BDNF e vários anticorpos protegeramcélulas SY5Y diferenciadas, demonstrando aumentos dependentes de dosena viabilidade celular.A Figura 7 descreve alguns dos resultados que foram obtidosquando três anticorpos anti-TrkB, 18C3, 29D7 e 17D11, que mostraram ligar-se a TrkB de murino recombinante (rmTrkB), foram testados em culturas deneurônio de grânulo cerebelar (CGN) de rato quanto à atividade contra oreceptor de TrkB de rato endógeno. Resultados são mostrados para um en-saio de crescimento de neurito e um ensaio de neuroproteção (29D7 apenas).

A Figura 8 descreve os resultados que foram obtidos quandocertos anticorpos anti-TrkB foram avaliados na análise de Western quanto àindução de autofosforilação de TrkB. Todos os anticorpos levaram à fosfóri-lação de TrkB robusta* é estes efeitos foram antagonizados por tratamentocom o inibidor de cinase K252a, indicando que estes anticorpos que ligamTrkB causaram ativação de TrkB.

A Figura 9 descreve os resultados de um ensaio FACS de liga-ção de TrkA (A) e um ensaio de atividade de luciferase de TrkA (B) que fo-ram obtidos com certos anticorpos anti-TrkB. Estes resultados mostram queanticorpos inventivos não ligam ou ativam células de TrkA humano.

A Figura 10 descreve os resultados que foram obtidos quandocertos anticorpos ànti-TrkB foram avaliados em um ensaio de atividade deluciferase de TrkC. Estes resultados mostram que anticorpos inventivos nãoativam célulasdeTrkC humano.

A Figura 11 descreve o modelo de roedor de hipoxia-isquemia(Hl) neonatal que é fundamentado no procedimento de Levine.

A Figura 12 descreve a seqüência de aminoácido de TrkB hu-mano (SEQ ID NO: 1).

A Figura 13 descreve a seqüência de aminoácido de TrkB demurino (SEQ ID NO: 2).

A Figura 14 descreve a seqüência de aminoácido de TrkB derato (SEQ ID NO: 3).

A Figura 15 descreve a seqüência de aminoácido de TrkB degalinha (SEQ ID NO: 4).

A Figura 16 descreve a seqüência de aminoácido de TrkA hu-mano (SEQ ID NO: 5).

A Figura 17 descreve a seqüência de aminoácido de TrkC hu-mano (SEQ ID NO: 6).

A Figura 18 mostra os dados de ELISA de ligação de fago a par-tir de um conjunto representativo de clones de scFv positivos de TrkB (sele-ção de mistura da biblioteca de BMV).

A Figura 19 mostra a especificidade de ligação de anticorpos descFv selecionados de TrkB testados usando o ensaio FACS. Os dados mos-tram que os anticorpos de scFv selecionados de TrkB reagem com TrkB as-sociado à membrana em uma maneira específica (histogramas cheios) semnenhuma reatividade cruzada para controlar células (histogramas abertos).

A Figura 20 mostra resultados de ligação de ELISA para anticor-po de IgG 29D7 e seu fragmento Fab com TrkB humano (A) e de camun-dongo (B). Tanto IgG total quanto Fab de 29D7 mostraram atividades de li-gação dependente de dose a TrkB humano e de camundongo. Entretanto, ovalor de ED50 do Fab foi cerca de 100 vezes mais baixo do que aquele de27D7 intacto. Nem uma lgG1 de controle de isótipo nem seu fragmento Fabligado a TrkB.

A Figura 21 mostra atividade de luciferase em células HEK-293medida 16 horas pós tratamento com IgG de 29D7 ou Fab de 29D7. TantoIgG total quanto Fab de 29D7 induziram atividades de luciferase dependen-tes-de dose! indicando a ativação de TrkB. Entretanto, o valor de EC5o deFab de 29D7 foi cerca de 27 vezes mais alto do que aquele de IgG de 27D7(0,083 nM e 2,28 nM para IgG de 27D7 e Fab de 29D7, respectivamente).

Nem uma lgG1 de controle de isótipo nem seu fragmento Fab tiveram efeitosna ativação de TrkB.

A Figura 22 mostra resultados da análise de mapeamento deepítopo de anticorpos monoclonais anti-TrkB 17D11, 29D7, 7F5, 11E1 e19E12. O anticorpo monoclonal 17D11 reconhece a alça-3 do segmento delgG-2 de TrkB humano (KNEYGKD, SEQ ID NO: 7, aminoácidos 364 a 370da SEQ ID NO: 1); e alça-1 do segmento de lgG-2 de TrkB humano(KGNPKP, SEQ ID NO: 8, aminoácidos 308 a 313 da SEQ ID NO: 1). Todosos anticorpos monoclonais 29D7, 7F5, 11E1 e 19E12 reconhecem a alça-3do segmento de lgG-1 de TrkB humano (ENLVGED, SEQ ID NO: 10, amino-ácidos 269 a 275 da SEQ ID NO: 1); e também podem reconhecer a alça-1do segmento de lgG-1 de TrkB humano (AGDPVP, SEQ ID NO: 11, aminoá-cidos221 a 226 da SEQ ID NO: 1).

A Figura 23 compara as manchas que foram obtidas do estriadoe hipocampo para tratamentos diferentes depois de lesão hipóxica-isquêmica (Hl).

A Figura 24 compara a perda de tecido cerebral total (A) e perdade tecido sub-regional (B) para tratamentos diferentes depois de lesão Hl.

Os dados são mostrados como média e erro padrão da média (S.E.M.).BDNF e anticorpo monoclonal anti-TrkB 29D7 mostraram proteção depen-dente de dose significante do cérebro a partir da lesão Hl. A proteção não foilocalizada a qualquer sub-região específica do cérebro mas proteção máxi-ma foi geralmente observada no córtex.

A Figura 25 mostra os resultados de um ensaio de clivagem deDEVD-AMC que foi usado para determinar atividades de caspase-3 paratratamentos diferentes depois da lesão Hl. Os resultados para regiões dife-rentes do cérebro são mostrados como média ± S.E.M. BDNF e anticorpomonoclonal anti-TrkB 29D7 bloquearam a ativação de caspase-3 causadapor lesão Hl.

A Figura 26 mostra imunomanchas de amostras de proteína to-madas de camundongos fornecidos com tratamentos diferentes depois delesão Hl. As amostras foram separadas por SDS-PAGE e submetidas a imu-noblotting com anticorpos contra certos substratos de caspase-3 (PARP e a-espectrina). Anticorpos contra B-actina foram usados como controles paraverificar a carga igual de proteínas. Os resultados mostram que a clivagemdos mesmos substratos de caspase-3 foi inibida por BDNF e anticorpo mo-noclonal anti-TrkB 29D7 (lados C = contra e I = ipsi da ligação da carótida).

A Figura 27 mostra imunoblots de amostras de proteína tomadasde camundongos normais depois de uma injeção intracerebroventricular deanticorpo anti-TrkB 29D7 (ou veículo como controle). Amostras foram toma-das 1, 2, 6, 12 e 24 horas depois da injeção. Amostras foram separadas porSDS-PAGE e submetidas ao imunoblotting com anticorpos específicos paraproteínas que são fosforiladas como um resultado da ativação de TrkB (fos-fo-ERK1/2 e fosfo-AKT). Anticorpos contra (3-actina foram usados como con-troles para verificar a carga igual de proteínas. Os resultados mostram que oanticorpo monoclonal anti-TrkB 29D7 induziu a fosforilação dependente dotempo de ERK1/2 e AKT (dados de amostras hipocampais e corticais sãomostrados e são representativos de resultados obtidos de quatro outras a-mostras).

A Figura 28 é uma quantificação densitométrica da fosforilaçãode ERK mostrada na Figura 27.

A Figura 29 é uma quantificação densitométrica da fosforilaçãode AKT mostrada na Figura 27.

A Figura 30 mostra tecidos cerebrais tratados com veículo e29D7 que foram fixados e imunoflourescentemente rotulados com um anti-corpo para o marcador específico de neurônio NeuN (esquerda) e um anti-corpo anti-fosfo-ERK1/2 (centro). As figuras do lado direito mostram estesdois unidos. A fosforilação de ERK1/2 é significantemente mais forte nasamostras tratadas com 29D7.

A Figura 31 mostra o curso de tempo da ativação de ERK1/2 nostecidos corticais e hipocampais a seguir da injeção intracerebroventricular deanticorpo monoclonal anti-TrkB 29D7.

A Figura 32 mostra a inibição dependente de dose de cresci-mento de neurito de neurônios de grânulo cerebelar primários causada por(A) MAG e (B) mielina.

A Figura 33 mostra a reversão de inibição de neurito mediadapor (A) MAG e (B) mielina que é causada por anticorpo monoclonal anti-TrkB 29D7.

DESCRIÇÃO DE CERTAS MODALIDADES

A presente invenção originou-se em parte da compreensão queanticorpos monoclonais que espcificamente ligam-se aos domínios extrace-lulares do receptor de TrkB podem dimerizar TrkB e serem suficientes parainduzir a ativação do receptor e respostas biológicas similares àquelas me-diadas por BDNF.

Anticorpos monoclonais em geral representam uma única classede proteínas que têm utilidades diversas em pesquisa, diagnose médica, eno tratamento clínico de doença. Vantajosamente, anticorpos monoclonaissão considerados terem maior estabilidade farmacocinética do que proteínasrecombinantes tais como BDNF do mesmo modo considerando efeitos far-macológicos sustentáveis que têm um benefício significante para aplicaçõesclínicas. Por exemplo, os usos clinicamente aprovados correntes de medica-ções de anticorpo monoclonal incluem prevenção de rejeição a transplantede órgão, tratamento de cânceres (por exemplo, mama, cólon, linfoma quenão de Hodgkin, leucemia), artrite reumatóide, profilaxia contra doença dovírus sincicial respiratório, doença de Crohn, intervenção coronária percutâ-nea, e asma. Outras aplicações médicas para tratar uma variedade de doen-ças humanas com anticorpos monoclonais também estão correntemente emexperiências clínicas. Os efeitos biológicos dos mesmos anticorpos mono-clonais são geralmente conduzidos bloqueando-se ou neutralizando-se e-ventos moleculares exercidos por ligandos endógenos, assim primariamenteagindo como antagonistas de afinidade alta específicos. Na presente inven-ção, anticorpos monoclonais são usados como agonistas que imitam os efei-tos biológicos de interações de receptor-ligando.

1. Anticorpos monoclonais e hibridomas

Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpos mono-clonais que ligam TrkB humano (SEQ ID NO: 1). Em certas modalidades,estes anticorpos ligam TrkB humano (SEQ ID NO: 1) com um ED50 na faixade cerca de 10 pM a cerca de 500 nM, por exemplo na faixa de cerca de 10pM a cerca de 1 nM, cerca de 10 pM a cerca de 100 pM, ou cerca de 10 pMa cerca de 50 pM. Como usado aqui o termo "cerca de" é definido para a-branger variações de ± 15%.

Em uma modalidade, os anticorpos inventivos também são ago-nistas de TrkB humano. Em certas modalidades, estes anticorpos ativamTrkB humano (SEQ ID NO: 1) com uma EC5o na faixa de cerca de 10 pM acerca de 500 nM, por exemplo, na faixa de cerca de 10 pM a cerca de 1 nM,cerca de 10 pM a cerca de 100 pM, ou cerca de 10 pM a cerca de 50 pM.

Em uma modalidade, anticorpos inventivos são seletivos paraTrkB humano (SEQ ID NO: 1) em que eles ligam-se preferencialmente aTrkB (SEQ ID NO: 1) em TrkA humano (SEQ ID NO: 5) ou TrkC humano(SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, anticorpos inventivos não ligam-se a TrkA humano ou TrkC humano. Como definido aqui, um anticorpo in-ventivo "não liga" TrkA humano (SEQ ID NO: 5) ou TrkC humano (SEQ IDNO: 6) se ele não exibe nenhuma ligação detectável com estes receptoresem concentrações acima de cerca de 1 nM, por exemplo, acima de cerca de10 nM, acima de cerca de 100 nM ou acima de cerca de 1 pM.

Em uma modalidade, anticorpos inventivos são seletivos paraTrkB humano em que eles não ativam TrkA humano (SEQ ID NO: 5) ou TrkChumano (SEQ ID NO: 6). Como definido aqui, um anticorpo inventivo "nãoativa" TrkA humano (SEQ ID NO: 5) ou TrkC humano (SEQ ID NO: 6) se elenão causa nenhuma ativação detectável com estes receptores em concen-trações acima de cerca de 1 nM, por exemplo acima de cerca de 10 nM, a-cima de cerca de 100 nM ou acima de cerca de 1 fiM.

Em uma modalidade, anticorpos inventivos bloqueiam a ligaçãoentre BDNF e TrkB humano (SEQ ID NO: 1) com uma IC5o na faixa de cercade 100 pM a cerca de 500 nM, por exemplo na faixa de cerca de 100 pM acerca de 1 nM, ou cerca de 100 pM a cerca de 500 pM. Em outra modalida-des estes anticorpos não bloqueiam a ligação entre BDNF e TrkB humano(SEQ ID NO: 1). Como definido aqui, um anticorpo inventivo "não bloqueia" aligação entre BDNF e TrkB humano (SEQ ID NO: 1) se ele não exibe ne-nhuma atividade de bloqueio detectável em concentrações acima de cercade 1 nM, por exemplo acima de cerca de 10 nM, acima de cerca de 100 nMou acima de cerca de 1 ^M.

Em certas modalidades os anticorpos da invenção pertencem aum isótipo de IgG, por exemplo, o isótipo de lgG1, lgG2a ou lgG2b.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece anticorposmonoclonais com qualquer uma das propriedades acima que ligam e/ou ati-vam ainda TrkB de camundongo (SEQ ID NO: 2). Em certas modalidades,estes anticorpos ligam e/ou ativam TrkB de camundongo (SEQ ID NO: 2)com um ED50 na faixa de cerca de 10 pM a cerca de 500 nM, por exemplona faixa de cerca de 10 pM a cerca de 1 nM, incluindo na faixa de cerca de10 pM a cerca de 500 pM e na faixa de cerca de 10 pM a cerca de 100 pM.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece anticorposmonoclonais com qualquer uma das propriedades acima que ligam ainda umou mais epítopos específicos de TrkB humano (SEQ ID NO: 1) e opcional-mente um ou mais epítopos específico de TrkB de camundongo (SEQ IDNO: 2). Em certas modalidades, estes anticorpos ligam um ou ambos epíto-pos de TrkB humano com as seqüências KNEYGKD (SEQ ID NO: 7, amino-ácidos 364 a 370 da SEQ ID NO: 1) e KGNPKP (SEQ ID NO: 8, aminoácidos308 a 313 da SEQ ID NO: 1). Em uma modalidade, estes anticorpos tambémligam um ou ambos epítopos de TrkB de camundongo com as seqüênciasKNEYGKD (SEQ ID NO: 7, aminoácidos 364 a 370 da SEQ ID NO: 2) eRGNPKP (SEQ ID NO: 9, aminoácidos 308 a 313 da SEQ ID NO: 2). Emoutras modalidades, a presente invenção fornece anticorpos que ligam umepítopo de TrkB humano com a seqüência ENLVGED (SEQ ID NO: 10, ami-noácidos 269 a 275 da SEQ ID NO: 1) e opcionalmente um epítopo de TrkBhumano com a seqüência AGDPVP (SEQ ID NO: 11, aminoácidos 221 a 226da SEQ ID NO: 1). Em uma modalidade, estes anticorpos também ligam umepítopo de TrkB-de-cafnundongo com a seqüência ENLVGED (SEQ ID NO:10, aminoácidos 269 a 275 da SEQ ID NO: 2).

Ainda em um outro aspecto, a presente invenção fornece hibri-domas que produzem qualquer um dos mesmos anticorpos monoclonais.Por exemplo, hibridomas que foram depositados com a ATCC em 18 de A-gosto de 2005 e foram fornecidos com ATCC designações de depósito depatente PTA-6948 (17D11) e PTA-6949 (29D7) são fornecidas.

Ainda em um outro aspecto, a presente invenção fornece anti-corpos monoclonais que são produzidos pelos hibridomas que foram deposi-tados com a ATCC em 18 de agosto de 2005 e foram fornecidos com desig-nações de depósito de patente de ATCC PTA-6948 (17D11) e PTA-6949(29D7), respectivamente. A presente invenção também fornece anticorposque bloqueiam a ligação dos mesmos anticorpos e portanto compartilham omesmo epítopo de ligação em TrkB humano (SEQ ID NO: 1).

2. Preparação de anticorpos monoclonais e hibridomas

Deve ser entendido que os anticorpos monoclonais da invençãopodem ser preparados por qualquer método mostrado. Por exemplo, elespodem ser preparados usando tecnologia sintética, recombinante ou de hi-bridoma (por exemplo, como descrito em Antibodies: A Laboratory Manual,Ed. por E. Harlow e D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 ouMonoclonal Antibodies: Principies and Practice por J. W. Goding, AcademicPress, 1996). Em particular será avaliado que os anticorpos inventivos po-dem ser preparados inicialmente imunizando-se um animal com TrkB huma-no ou um derivado do mesmo (por exemplo, uma proteína recombinante queinclui o domínio extracelular de TrkB humano) e depois preparando mono-clonais a partir de hibridomas adequadamente preparados.

Em um aspecto, os anticorpos monoclonais da presente inven-ção são preparados por tecnologia de hibridoma padrão usando pelo menosdois imunógenos de proteína que são derivados de proteínas de TrkB deespécies diferentes. Por exemplo, os imunógenos podem incluir um primeiroimunógeno que foi derivado de TrkB humano e um segundo imunógeno quefoi derivado de um TrkB não humano. Preferivelmente, todos os imunógenos-incluem o domínio extracelular de TrkB. Em certas modalidades o pelo me-nos dois imunógenos são combinados como uma mistura para propósitos deimunização.

Em uma modalidade, o primeiro dos mesmos imunógenos é umaproteína recombinante que inclui o domínio extracelular (ECD) de TrkB hu-mano. O ECD de TrkB humano é compreendido de resíduos de aminoácidoC32-H430 da proteína de tamanho natural (que é apresentada como SEQ IDNO: 1 na Fig. 12, Acesso no GenBank N2 NP_006171). Nota-se que todasas seqüências de proteína e ácido nucleico que estão presentes como dadata de arquivamento no GenBank, SwissProt, bases de dados de EMBL ouqualquer outra base de dados publicamente disponível são incorporadosaqui por referência (incluindo sem limitação as seqüências das neurotrofinas,por exemplo, NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5, etc). O segundo imunógeno é umaproteína recombinante que inclui o domínio extracelular (ECD) de TrkB demurino. O ECD de TrkB de murino é compreendido de resíduos de aminoá-cido C32-H429 da proteína de tamanho natural (que é apresentada comoSEQ ID NO: 2 na Fig. 13, Acesso no GenBank N- P15209). Aqueles habili-tados na técnica avaliarão que imunógenos adequados que incluem estesdomínios podem ser preparados usando tecnologia recombinante padrão(por exemplo, ver Protocols in Molecular Biology Ed. por Ausubel et al., JohnWiley & Sons, Nova Iorque, NY, 1989 and Molecular Cloning: A LaboratoryManual Ed. por Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY,1989, os conteúdos dos quais são incorporados aqui por referência).

Em certas modalidades, os primeiro e segundo imunógenos sãoadministrados em uma razão (em peso) que é maior do que cerca de 1. Porexemplo, a razão pode ser de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais. Emuma modalidade a razão é maior do que cerca de 5. Em uma modalidade arazão é cerca de 10. Em uma modalidade os primeiro e segundo imunóge-nos são administrados simultaneamente como uma mistura.

Em uma modalidade, um ou ambos imunógenos incluem ver-sões de seus domínios extracelulares respectivos que diferem um pouco dosdomínios que ocorrem naturalmente: Por exemplo, aminoacidos no términoN ou C do domínio extracelular podem estar-ausentes. Alternativamente al-guns aminoacidos dentro da seqüência que ocorre naturalmente podem sermutados. Preferivelmente estas mutações são substituições conservativas.Deve ser entendido que estas versões que não ocorrem naturalmente de-vem incluir uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95%, preferi-velmente pelo menos 96%, mais preferivelmente pelo menos 97%, aindamais preferivelmente pelo menos 98% e ainda mais preferivelmente pelomenos 99% idêntica aos domínios extracelulares que são encontrados naSEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.

Em certas modalidades, os primeiro e/ou segundo imunógenosnão incluem nenhum dos aminoacidos que são encontrados fora do domínioextracelular de TrkB (por exemplo, eles não incluem os aminoácidos que sãoencontrados em domínios de transmembrana e/ou intracelulares de TrkB).Em certas modalidades, os imunógenos podem incluir um ou mais aminoá-cidos terminais que são ausentes das proteínas de TrkB que ocorrem natu-ralmente. Em particular, aminoácidos terminais podem ser adicionados paraaumentar a expressão da proteína recombinante, como uma conseqüênciado vetor usado para a expressão, etc. Além disso, segmentos de aminoácidoque são ausentes do alérgeno de proteína podem ser adicionados ao térmi-no amino e/ou carboxila da proteína recombinante, por exemplo, caracterespara purificação, rótulos para detecção, caracteres que aumentam a solubili-dade do alérgeno recombinante, caracteres que aumentam a estabilidadedos imunógenos, fusão com uma proteína não relacionada ou proteína veí-culoa adjuvante, etc. Um sítio de clivagem proteolítico pode ser introduzidona junção do segmento de aminoácido adicionado e no término de proteínarecombinante para permitir a remoção do segmento adicionado depois que aproteína recombinante foi purificada, absorvida, etc. Modificações terminaiscomuns usadas na tecnologia recombinante são descritas em Current Proto-cols in Molecular Biology Ed. por Ausubel et ai, John Wiley & Sons, NovaIorque, NY, 1989 e Molecular Cloning: A Laboratory Manual Ed. por Sam-brook et ai, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, 1989.

Em uma modalidade, os primeiro e segundo imunógenos têm amesma composição como os dois imunógenos que são descritos nos Exem-plos e que foram obtidos da R&D systems, Inc. (Cat. N- 397-TR/CF e 1494-TB/CF, respectivamente).

Em certas modalidades, o primeiro imunógeno é como descritoacima, mas o segundo imunógeno inclui o domínio extracelular (ECD) deuma outra espécie de TrkB não humano que não murino (por exemplo, rato,galinha, coelho, etc). O ECD de TrkB de rato é compreendido de resíduosde aminoácido C32-H429 da proteína de tamanho natural (que é apresenta-da como SEQ ID NO: 3 na Fig. 14, Acesso no GenBank N2 NP036863). OECD de TrkB de galinha é compreendido de resíduos de aminoácido C32-T428 da proteína de tamanho natural (que é apresentada como SEQ ID NO:4 na Fig. 15, Acesso no GenBank N2 CAA54468).

Uma vez que imunógenos adequados foram preparados, os i-munógenos são injetados em qualquer um de uma variedade ampla de ani-mais (por exemplo, camundongos, ratos, coelhos, etc). Em uma modalidadeos imunógenos são injetados em camundongos como descrito nos Exem-plos. Por exemplo, os imunógenos são injetados subcutânea e intraperitone-almente com adjuvante de Freund completo. Em certas modalidades, cadaanimal é injetado subcutaneamente em sítios diferentes múltiplos. Nesta e-tapa, as proteínas recombinantes podem servir como imunógenos sem outramodificação. Alternativamente, uma resposta imune superior pode ser evo-cada se as proteínas recombinantes são unidas a uma proteína veículoaadjuvante, tal como albumina sérica bovina ou hemocianina de lapa buracode fechadura (KLH). Os imunógenos são injetados no hospedeiro animal,preferivelmente de acordo com um programa predeterminado incorporandouma ou mais imunizações de reforço e os animais são sangrados periodica-mente. Por exemplo, em certas modalidades, uma ou mais imunizações dereforço são administradas intravenosamente. A ligação entre soros imunes eo primeiro (e opcionalmente o segundo) imunógeno depois é opcionalmenteavaliada para confirmar que um título adequado de anticorpos foi elevado.

Anticorpos monoclonais que são específicos para um ou ambosos imunógenos podem ser preparados por qualquer método padrão. Por e-xemplo, a técnica de Kohler e Milstein, Eur. J Immunol. 6:511,1976 e melho-ras a esta podem ser usadas. Brevemente, estes métodos geralmente en-volvem a preparação de linhagens de célula imortais capazes de produziranticorpos tendo a especificidade desejada. Tais linhagens de célula podemser produzidas, por exemplo, de células do baço obtidas de um ou mais a-nimais imunizados como descrito acima. As células do baço depois são i-mortalizadas, por exemplo, por fusão com um parceiro de fusão de célula demieloma, preferivelmente um que é isogênico com o animal imunizado. Emcertas modalidades animais com soros adequados são reforçados uma oumais vezes com os primeiro e/ou segundo imunógeno antes que as célulasdo baço sejam removidas. Uma variedade de técnicas de fusão pode serutilizada. Por exemplo, as células do baço e células de mieloma podem sercombinadas com um detergente não iônico durante alguns minutos e depoisplaqueadas em densidade baixa em um meio seletivo que sustenta o cres-cimento de células híbridas, mas não células de mieloma. Uma certa técnicade seleção usa a seleção de HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). De-pois de um tempo suficiente, usualmente cerca de 1 a 2 semanas, colôniasde híbridos são observadas. Colônias únicas são selecionadas e seus so-brenadantes de cultura testados quanto à atividade de ligação contra o pri-meiro (e opcionalmente o segundo) imunógeno como descrito abaixo.

Anticorpos monoclonais podem ser isolados dos sobrenadantesde colônias de hibridoma em crescimento. Além disso, várias técnicas po-dem ser utilizadas para realçar o rendimento, tal como injeção da linhagemde célula de hibridoma na cavidade peritoneal de um hospedeiro vertebradoadequado, tal como um murino. Anticorpos monoclonais depois podem sercolhidos do fluido de ascite ou do sangue. Contaminantes podem ser remo-vidos dos anticorpos por técnicas convencionais, tais como cromatografia,filtração de gel, precipitação e extração. Os isótipos de anticorpo podem serdeterminados usando métodos padrão. Como debatido nos Exemplos emostrado na Tabela 1, preparam-se anticorpos de murino específicos quepertencem aos isótipos lgG1, lgG2a e lgG2b usando estes métodos.

3. Caracterização da ligação de anticorpo

Em certas modalidades, -anticorpos inventivos são caracteriza-dos por suas atividades de ligação a TrkB humano (por exemplo, usandoELISA e/ou FACS como descrito nos Exemplos). Em certas modalidades aligação a proteínas de TrkB humano que são expressadas em uma superfí-cie celular também pode ser avaliada (por exemplo, usando células HEK293como descrito nos Exemplos). Preferivelmente, os anticorpos inventivostambém são testados quanto à sua atividade de ligação de espécie cruzada(por exemplo, com o segundo imunógeno). Isto permite que anticorpos mo-noclonais que ligam TrkB de ambas as espécies sejam identificados. Estesanticorpos são de interesse visto que eles podem ser testados em modelosde animal com o conhecimento de que eles também podem ser aplicadosem experiências clínicas humanas.

Em certas modalidades pode provar ser vantajoso caracterizarainda as propriedades de ligação de qualquer anticorpo monoclonal dado.

Em particular, uma pessoa pode usar um ensaio de competição (por exem-plo, um ELISA) para determinar se os anticorpos bloqueiam a interação deTrkB e BDNF. Uma pessoa também pode avaliar se os anticorpos ligamTrkB não humano e/ou TrkA humano ou TrkC.

O mapeamento dos epítopos de ligação de anticorpo relativosem TrkB (humano ou outros) também pode ser conduzido, por exemplo, e-xaminando-se a atividade de cada anticorpo individual em bloquear a ligaçãode outros anticorpos a TrkB. Por exemplo, a observação de que dois anti-corpos bloqueiam cada outra ligação sugere que estes anticorpos podemligar-se ao mesmo epítopo ou epítopos sobrepostos em TrkB.

4. Caracterização da função de anticorpo

Em certas modalidades, anticorpos inventivos são caracteriza-dos por sua capacidade funcional para ativar TrkB humano. Qualquer ensaioagonista pode ser usado. Os Exemplos descrevem um ensaio de luciferaseexemplar que mostrou representar seletivamente a ativação de TrkB. A auto-fosforilação de TrkB (por exemplo, como medido por Western blot) tambémpode ser usada como uma medida da ativação de TrkB.

Alternativa ou adicionalmente, a atividade de agonista de TrkB-humano dos anticorpos inventivos pode ser avaliada em um ensaio que en-volve TrkB endógeno (por exemplo, em células SY5Y de neuroblastoma hu-mano). Como descrito nos Exemplos, tais ensaios testam quanto à capaci-dade de cada anticorpo para promover o crescimento de neurito ou paraaumentar a sobrevivência de células diferenciadas a seguir da lesão (porexemplo, dano de retirada de soro). Em certas modalidades os efeitos de-pendentes de dose dos anticorpos inventivos no crescimento de neurito e/ouviabilidade de célula são medidos.

Em certas modalidades os anticorpos monoclonais purificadostambém são caracterizados por sua capacidade funcional para ativar TrkBnão humano (por exemplo, murino, rato, galinha, coelho, etc). Os Exemplosdescrevem um ensaio em que os anticorpos foram testados em culturas deneurônio de grânulo cerebelar (CGN) de rato quanto à atividade contra oreceptor de TrkB de rato endógeno. Como com as células humanas um en-saio de crescimento de neurito e um ensaio de neuroproteção pode ser rea-lizado. Outros ensaios úteis são mostrados na técnica e serão reconhecidospor aqueles habilitados no ramo.

Ainda em outra modalidades e como descrito nos Exemplos, osanticorpos monoclonais purificados são caracterizados ainda por sua capa-cidade funcional para ativar TrkA e/ou TrkC humanos.

5. Anticorpos humanizados e embutidos

Quando do uso de um anticorpo inventivo para propósitos tera-pêuticos pode provar ser vantajoso usar uma versão humanizada ou embuti-da do anticorpo de interesse para reduzir qualquer reação imunogênica po-tencial. Em geral, anticorpos humanizados ou embutidos minimizam respos-tas imunológicas indesejadas que limitam a duração e efetividade de aplica-ções terapêuticas de anticorpos não humanos em receptores humanos.

Vários métodos para preparar anticorpos humanizados compre-endendo uma porção de ligação de antígeno derivada de um anticorpo nãohumano foram descritos na técnica. Em particular, anticorpos com regiõesvariáveis de roedor e suas regiões determinantes de complementaridade(CDRs) associadas fundidas aos domínios constantes humanos foram des-critos (por exemplo, ver Winter-efa/.,-Nature 349:293, 1991? Lobuglio et ai,Proc. Nat. Acad. Sei. USA 86:4220, 1989; Shaw et ai, J. Immuna 138:4534,1987; e Brown era/., Câncer Res. 47:3577, 1987). CDRs de roedor enxerta-das em um ser humano que sustenta região de estrutura (FR) antes da fu-são com um domínio constante de anticorpo humano apropriado (por exem-plo, ver Riechmann et ai, Nature 332:323, 1988; Verhoeyen et ai, Science239:1534, 1988; e Jones et al. Nature 321:522, 1986) e CDRs de roedor sus-tentadas por FRs de roedor recombinantemente embutidas também foramdescritas (por exemplo, ver Pub. de Patente EPO N2 519.596).

Anticorpos completamente humanos são particularmente dese-jáveis para tratamento terapêutico de pacientes humanos. Tais anticorpospodem ser produzidos usando camundongos transgênicos que são incapa-zes de expressar genes de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina en-dógena, mas que podem expressar genes de cadeia pesada e leve humanos(por exemplo, ver Lonberg e Huszar Int. Rev. Immunol. 13:65-93, 1995 ePatente U.S. N— 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; e 5.661.016).

Versões embutidas dos anticorpos inventivos também podemser usadas nos métodos da presente invenção. O processo de embutimentoenvolve seletivamente substituir resíduos de FR, por exemplo, de uma regi-ão variável de cadeia pesada ou leve de murino, com resíduos de FR huma-nos de modo a fornecer um anticorpo que compreende uma porção de liga-ção de antígeno que retém substancialmente toda a estrutura de dobradurade proteína FR nativa. As técnicas de embutimento são fundamentadas noentendimento de que as características de ligação de antígeno de uma por-ção de ligação de antígeno são determinadas primariamente pela estrutura edisposição relativa dos conjuntos de CDR de cadeia pesada e leve dentro dasuperfície de associação de antígeno (por exemplo, ver Davies et al., Ann.Rev. Biochem. 59:439, 1990). Assim, a especificidade de associação de an-tígeno pode ser preservada em um anticorpo humanizado apenas em que asestruturas de CDR, sua interação entre si e sua interação com o restantedos domínios de região variável são cuidadosamente mantidas. Usando-setécnicas de embutimento, resíduos de FR exterior (por exemplo, acessível a-solvente)-que-são facilmente encontrados pelo-sistema imune são seletiva-mente substituídos com resíduos humanos para fornecer uma molécula hí-brida que compreende uma superfície embutida fracamente imunogênica, ousubstancialmente não imunogênica.

6. Anticorpos de cadeia única

Anticorpos de cadeia única também podem ser preparados combase nos anticorpos inventivos. Por exemplo, um anticorpo de cadeia única(scFv) pode ser engendrado como descrito, por exemplo, em Colcher et al.,Ann. N Y Acad. Sei. 880:263-80, 1999; e Reiter, Clin. Câncer Res. 2:245-52,1996. Métodos específicos são descritos nos Exemplos. O anticorpo de ca-deia única pode ser dimerizado ou multimerizado para gerar anticorpos mui-tivaleníes tendo especificidades para epítopos diferentes de TrkB humano.

7. Composições farmacêuticas

Anticorpos monoclonais da invenção podem ser administradospuros de modo a ativar TrkB de acordo com a presente invenção. Mais co-mumente, entretanto, eles são administrados no contexto de uma composi-ção farmacêutica, que contém uma quantidade terapeuticamente eficaz deum ou mais anticorpos juntamente com um ou mais outros ingredientes mos-trados àqueles habilitados na técnica para formular composições farmacêuticas.

Como aqui usado, os termos "quantidade farmaceuticamenteeficaz" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" significam a quantidade totalde cada ingrediente ativo da composição farmacêutica ou método que é su-ficiente para mostrar um benefício significativo do paciente, isto é, tratamen-to, prevenção ou melhora de uma condição que requer ativação de TrkB.

Quando aplicado a um ingrediente ativo individual que é administrado sozi-nho, o termo refere-se àquele ingrediente sozinho. Quando aplicado a umacombinação de ingredientes ativos, o termo refere-se a quantidades combi-nadas dos ingredientes ativos que resultam no efeito terapêutico, se admi-nistrados em combinação, serial ou simultaneamente.

Em certas modalidades da invenção, anticorpos inventivos sãoadministrados com uma dose semanal na faixa de cerca de 0,1 a cerca de1000 mg/kg-de peso-corporal, ou cerca de 1 acerca de 500 mg/kg de pesocorporal, em certas modalidades cerca de 10 a cerca de 300 mg/kg de pesocorporal. Doses podem ser administradas como um único regime ou comoum regime contínuo dividido por duas ou mais doses durante o curso de umdia ou semana. A liberação pode ser como um bolo ou em certas modalida-des como uma infusão gradual (por exemplo, por injeção durante 30 min).

Em certas modalidades uma ou mais doses mais altas (por exemplo, 2, 3 ou4 vezes mais altas) podem ser administradas inicialmente seguido por umaou mais doses de manutenção mais baixas. A(s) dose(s) mais alta(s) podemser administradas no início do tratamento apenas ou no começo de cadaciclo de tratamento. Estes níveis de dosagem e outros níveis de dosagemaqui são para administração intravenosa ou intraperitoheal. A pessoa habili-tada facilmente será capaz de determinar os níveis de dosagem necessáriospara uma via diferente de administração. Será avaliado que, em geral, a do-se exata usada será como determinado pelo médico prescrevente e depen-derá não apenas do peso do paciente e da via de administração, mas tam-bém da idade do paciente e da severidade dos sintomas.

Ingredientes adicionais úteis na preparação de composiçõesfarmacêuticas de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo,veículos (por exemplo, na forma líquida ou sólida), agentes flavorizantes,lubrificantes, solubilizantes, agentes de suspensão, enchimentos, deslizan-tes, auxiliares de compressão, aglutinantes, agentes desintegrantes de com-primido, materiais encapsulantes, emulsificadores, tampões, conservantes,adoçantes, agentes espessantes, agentes colorantes, reguladores de visco-sidade, estabilizantes ou osmo-reguladores, ou combinações dos mesmos.

Composições farmacêuticas líquidas preferivelmente contêm umou mais anticorpos monoclonais da invenção e um ou mais veículos líquidospara formar soluções, suspensões, emulsões, xaropes, elixires, ou composi-ções pressurizadas. Veículos líquidos farmaceuticamente aceitáveis incluem,por exemplo água, solventes orgânicos, óleos farmaceuticamente aceitáveisou gordura, ou combinações dos mesmos. O veículo líquido pode conter ou-tros aditivos farmacêuticos adequados tais como solubilizantes, emulsifica-dores, tampões, conservantes, adoçantes, agentes flavorizantes, agentes desuspensão, agentes espessantes, cores, reguladores de viscosidade, estabi-lizantes ou osmo-reguladores, ou combinações dos mesmos. Se a formula-ção líquida é intencionada para o uso pediátrico, é geralmente desejável evi-tar a inclusão de álcool.

Exemplos de veículos líquidos adequados para a administraçãooral ou parenteral incluem água (preferivelmente contendo aditivos tais comoderivados de celulose tais como carboximetil celulose de sódio), álcoois ouseus derivados (incluindo álcoois monoídricos ou álcoois poliídricos tais co-mo glicóis) ou óleos (por exemplo, óleo de coco fracionado e óleo de amen-doim). Para a administração parenteral o veículo também pode ser um ésteroleoso tal como oleato de etila e miristato de isopropila. O veículo líquidopara composições pressurizadas pode ser hidrocarbonetos halogenados ououtro propulsor farmaceuticamente aceitável.

Composições farmacêuticas sólidas preferivelmente contêm umou mais veículos sólidos, e opcionalmente um ou mais outros aditivos taiscomo agentes flavorizantes, lubrificantes, solubilizantes, agentes de suspen-são, enchimentos, deslizantes, auxiliares de compressão, aglutinantes ouagentes desintegrantes de comprimido ou um material encapsulante. Veícu-los sólidos adequados incluem, por exemplo, fosfato de cálcio, estearato demagnésio, talco, açúcares, lactose, dextrina, amido, gelatina, celulose, metilcelulose, carboximetil celulose de sódio, polivinilpirrolidina, ceras de fusãobaixa ou resinas de troca de íon, ou combinações dos mesmos. Em compo-sições farmacêuticas em pó, o veículo é preferivelmente um sólido finamentedividido que está em mistura com o ingrediente ativo finamente dividido. Emcomprimidos, o(s) ingrediente(s) ativo(s) são geralmente misturados com umveículo tendo as propriedades de compressão necessárias em proporçõesadequadas, e opcionalmente, outros aditivos, e compactados na forma etamanho desejados.

Em algumas modalidades da invenção, composições farmacêu-ticas são fornecidas na forma de dosagem unitária, tais como comprimidosou cápsulas. Em tal forma, a composição é subdividida em dose unitáriacontendo-quantidades apropriadas do(s) ingrediente(s) ativo(s). As formasde dosagem unitárias podem ser composições empacotadas, por exemplopós empacotados, frascos, ampolas, seringas pré-cheias ou sachês conten-do líquidos. A forma de dosagem unitária pode ser, por exemplo, uma cápsu-la ou comprimido por si só, ou ela pode ser um número apropriado de qual-quer uma de tais composições na forma de pacote.

Assim, a presente invenção também fornece uma composiçãofarmacêutica na forma de dosagem unitária para ativar TrkB, onde a compo-sição contém uma dosagem unitária terapeuticamente eficaz de pelo menosum anticorpo monoclonal da invenção. Como uma pessoa habilitada na téc-nica reconhecerá, certa dosagem unitária terapeuticamente eficaz depende-rá do método de administração.

A presente invenção também fornece um pacote terapêutico pa-ra dispensar os anticorpos monoclonais da invenção a um indivíduo que étratado para uma condição que requer ativação de TrkB. Em algumas moda-lidades, o pacote terapêutico contém uma ou mais dosagens unitárias depelo menos um anticorpo monoclonal inventivo, um recipiente contendo umaou mais dosagens unitárias, e rotulagem que dirige-se ao uso do pacote pa-ra o tratamento. Em certas modalidades, a dose unitária está na forma decomprimido ou cápsula. Em algumas casos, cada dosagem unitária é umaquantidade terapeuticamente eficaz.

8. Outros agentes farmacêuticos

De acordo com a presente invenção, anticorpos monoclonais dainvenção podem ser administrados sozinhos para modular a atividade deTrkB. Alternativamente os anticorpos podem ser administrados em combina-ção com (se simultânea ou seqüencialmente) um ou mais outros agentesfarmacêuticos úteis no tratamento, prevenção ou melhora de uma ou maisoutras condições (incluindo sintomas, distúrbios, ou doenças) que requerematividade de TrkB.

Por exemplo, outros agentes farmacêuticos que podem modulara atividade de TrkB podem ser usados em combinação com os anticorposmonoclonais da invenção, incluindo outros ativadores de TrkB. As PatentesU.S. 5.770.577; 6.077,829; 6.723.701 e 6,800.607 (todas incorporadasaqui por referência em sua totalidade) descrevem derivados de BDNF ecomposições que podem ser úteis de acordo com a prática da presente invenção.

Adicional ou alternativamente, os anticorpos monoclonais podemser usados em combinação com outros agentes farmacêuticos que são úteisno tratamento, prevenção ou melhora de distúrbios e doenças neurológicos.

Em certas modalidades, os anticorpos monoclonais são combinados comagentes que são úteis no tratamento, prevenção ou melhora de distúrbios edoenças causados por lesões ao sistema nervoso (por exemplo, por ferimen-to, cirurgia, isquemia, infecção, doenças metabolicas, subnutrição, tumormaligno, medicamentos tóxicos, etc.)- Deve ser entendido que qualquer a-gente adequado mostrado na técnica pode ser usado, incluindo aqueles lis-tados na Physicians' Desk Reference, 55â Edição, 2001, publicado por Medi-cai Economics Company, Inc. at Monvale, NJ, as porções relevantes do qualsão incorporadas aqui por referência.

9. Usos terapêuticos

Em um aspecto, anticorpos inventivos são úteis para tratar con-dições (incluindo sintomas, distúrbios, ou doenças) que requerem ativaçãode TrkB. Tais métodos envolvem administrar uma quantidade terapeutica-mente eficaz de um ou mais anticorpos inventivos ao indivíduo. Em certasmodalidades, a invenção fornece métodos para tratar condições neurológi-cas. Por exemplo, e sem limitação, anticorpos inventivos podem ser usadospara tratar indivíduos com um sistema nervoso que foi lesionado por feri-mento, cirurgia, isquemia, infecção, doenças metabólicas, subnutrição, tumormaligno, medicamento tóxico, etc. Exemplos específicos incluem acidentevascular cerebral, lesão na medula espinhal, lesão cerebral traumática, de-generação retiniana e axotomia. Os anticorpos inventivos também podemser usados para tratar distúrbios tais como distúrbio de hiperatividade comdéficit de atenção (ADHD), depressão e dano mental associado à idade (istoé, fornecendo-se aumento cognitivo). Os anticorpos inventivos também po-dem ser usados para tratar condições congênitas ou neurodegenerativasincluindo doença de Alzheimer, doença de Parkinson, coréia de Huntington,esclerose lateral amiotrófica (ALS) e condições relacionadas a estas. Os be-nefícios de ativação de TrkB no tratamento de doenças não neurológicas taiscomo câncer e diabete também foi descrito e os anticorpos inventivos por-tanto podem encontrar utilidade em tais contextos (por exemplo, PatentesU.S. N-s 5.877.016 e 6.800.607 descrevem os benefícios de ativação deTrkB para tratar câncer e diabete, respectivamente).

Os métodos desta invenção são úteis para tratar as condiçõesdescritas aqui em adultos e crianças. Eles também podem ser utilizados pa-ra aplicações veterinárias, particularmente incluindo aplicações em caninos efelinos. Se desejado, os métodos aqui também podem ser usados com ani-mais de criação, tais como criações de ovino, bovino, porcino e eqüino.

Métodos inventivos envolvem a liberação de anticorpos mono-clonais inventivos por intermédio de qualquer via apropriada dé administra-ção incluindo, por exemplo, modos parenteral, intravenoso, tópico, nasal,oral (incluindo bucal ou sublingual), retal ou outros modos. Em geral, os anti-corpos podem ser formulados para a liberação imediata, retardada, modifi-cada, prolongada, pulsada, ou controlada.

Em certas modalidades, os anticorpos são formulados para aliberação por injeção. Em tais modalidades, a administração pode ser, porexemplo, intracavernosa, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intrate-cal, intraventricular, intra-uretral, intra-esternal, intracranial, intramuscular ousubcutânea, ou por intermédio de técnicas de infusão ou injeção sem agu-lha. Para tal administração parenteral, os anticorpos da invenção podem serpreparados e mantidos em formulações liofilizadas convencionais e reconsti-tuídos antes da administração com uma solução salina farmaceuticamenteaceitável, tal como uma solução salina a 0,9%. O pH da formulação injetávelpode ser ajustado, como é mostrado na técnica, com um ácido farmaceuti-camente aceitável, tal como ácido metanossulfônico. Outros veículos e sol-ventes aceitáveis que podem ser utilizados incluem solução de Ringer eU.S.P. Além disso, óleos fixos, estéreis são convencionalmente utilizadoscomo um solvente ou meio de suspensão. Para este propósito qualquer óleofixo brando pode ser utilizado incluindo mono- ou diglieerídeos sintéticos.

Além disso, ácidos graxos tais como ácido oléico são usados na preparaçãode injetáveis. As formulações injetáveis podem ser esterelizadas, por exem-plo, por filtração através de um filtro de retenção bacteriana, ou incorporan-do-se agentes esterilizantes na forma de composições sólidas estéreis quepodem ser dissolvidas ou dispersas em água estéril ou outro meio injetávelestéril antes do uso.

De modo a prolongar o efeito do anticorpo inventivo, pode serdesejável reduzir sua absorção a partir de uma injeção intramuscular ousubcutânea. A absorção retardada de um tal anticorpo administrado podeser realizada dissolvendo-se ou colocando-se em suspensão o agente emum veículo oleoso. Formas de depósito injetáveis são fabricadas formando-se matrizes de microcápsula do anticorpo em polímeros biodegradáveis taiscomo polilactídeo-poliglicolídeo. Dependendo da razão de anticorpo parapolímero e da natureza do polímero particular utilizado, a taxa de liberaçãode anticorpo pode ser controlada. Exemplos de outros polímeros biodegra-dáveis incluem poli(ortoésteres) e poli(anidridos). Formulações de depósitoinjetáveis também são preparadas capturando-se os anticorpos em liposso-mos ou microemulsões que são compatíveis com tecidos corporais.

Para a aplicação topicamente à pele, os anticorpos podem serformulados como um ungüento adequado contendo o ingrediente ativo colo-cado em suspensão ou dissolvido em, por exemplo, uma mistura com um oumais dos seguintes: óleo mineral, petrolato líquido, petrolato branco, propile-no glicol, composto de polioxietileno polioxipropileno, cera emulsificante eágua. Alternativamente, eles podem ser formulados como uma loção oucreme adequados, colocados em suspensão ou dissolvidos em, por exem-plo, uma mistura de um ou mais dos seguintes: óleo mineral, monoestearatode sorbitano, um polietileno glicol, parafina líquida, polisorbato 60, cera deésteres cetílicos, álcool cetearílico, 2-octildodecanol, álcool benzílico e água.

Os anticorpos inventivos também podem ser administrados in-tranasal ou por inalação e são convenientemente liberados na forma de uminalador de pó seco ou uma apresentação de pulverização por aerossol apartir de um recipiente-pressurizado, bombar pulverizador, atomizador ounebulizador, com ou sem o uso de um propulsor adequado, por exemplo,diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, um hidro-fluoroalcano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de umaerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada forne-cendo-se uma válvula para liberar uma quantidade medida. O recipientepressurizado, bomba, pulverizador, atomizador ou nebulizador podem conteruma solução ou suspensão do anticorpo, por exemplo, usando uma misturade etanol e o propulsor como o solvente, que adicionalmente pode conter umlubrificante, por exemplo, trioleato de sorbitano. Cápsulas e cartuchos (fabri-cados, por exemplo, de gelatina) para o uso em um inalador ou insufladorpodem ser formulados para conter uma mistura em pó dos anticorpos dainvenção e uma base de pó adequada tal como lactose ou amido.

Para métodos inventivos utilizando liberação oral, tal liberaçãopode ser realizada usando formulações sólidas ou líquidas, por exemplo naforma de comprimidos, cápsulas, multiparticulados, géis, películas, óvulos,elixires, soluções ou suspensões. Em certas modalidades, os anticorposmonoclonais são administrados como comprimidos ou cápsulas orais. Taispreparações podem ser formulações mastigáveis ou líquidas mistas ou ma-teriais alimentícios ou líquidos se desejável, por exemplo para facilitar a ad-ministração a crianças, a indivíduos cuja capacidade para engolir comprimi-dos é comprometida, ou a animais.

Composições para a administração retal são preferivelmentesupositórios que podem ser preparados misturando-se os anticorpos inventi-vos com adequados excipientes ou veículos não irritantes tais como mantei-ga de cacau, polietileno glicol ou uma cera de supositório que são sólidos natemperatura ambiente, mas líquidos na temperatura corporal e portanto fun-dem na abóbada retal e liberam os anticorpos. Enemas de retenção e cate-teres retais também podem ser usados como é mostrado na técnica. Veícu-los que realçam a viscosidade tais como hidroxipropil celulose também sãoalguns veículos da invenção para a administração retal visto que eles facili-tam a retenção da composição farmacêutica dentro do reto. Geralmente, o-volume de veículo-que-é adicionado à composição farmacêutica é selecio-nado de modo a maximizar a retenção da composição. Em particular, o vo-lume não deve ser tão grande como para expor a retenção da composiçãoadministrada na abóbada retal.

10. Usos de diagnóstico

Em um outro aspecto, anticorpos inventivos podem ser usadospara detectar TrkB em uma amostra (por exemplo, de modo a diagnosticarum distúrbio caracterizado por super ou sub expressão de TrkB). De acordocom tais métodos um anticorpo inventivo é combinado com uma amostrasob condições para permitir a ligação específica. A ligação específica depoisé detectada indicando do mesmo modo a presença de TrkB na amostra.A amostra pode ser derivada de um fluido corporal (por exemplo,do fluido cerebroespinhal, sangue, soro, urina, etc.) ou um extrato de célulasou tecido (por exemplo, uma amostra de biópsia). A detecção da ligação po-de ser facilitada ligando-se (isto é, fisicamente ligando) o anticorpo a umasubstância detectável (isto é, rotulagem de anticorpo). Exemplos de subs-tâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiaisfluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, e mate-riais radioativos. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase derábano silvestre, fosfatase alcalina, (3-galactosidase, ou acetilcolinesterase;

exemplos de complexos de grupo prostético adequados incluem estreptavi-dina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequa-dos incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, roda-mina, diclorotriazinilamina fluoresceína, dansil cloreto ou ficoeritrina; um e-xemplo de um material luminescente inclui luminol; exemplos de materiaisbioluminescentes incluem luciferase, luciferina, e aequorina; e exemplos dematerial radioativo adequado incluem 125l,1311,35S ou 3H.

Uma variedade de protocolos para medir a ligação de anticorpo,incluindo ELISA e FACS, são mostrados na técnica e fornecem uma basepara diagnosticar níveis alterados ou anormais de expressão de TrkB. ELISAe FACS são descritos ainda nos Exemplos. Valores normais ou padrão paraa expressão de TrkB são estabelecidos combinando-se amostras tomadas-de indivíduosnormais com-um anticorpo inventivo sobcondições adequadaspara a formação de complexo. A quantidade de formação de complexo pa-drão pode ser quantificada por vários métodos dependendo da natureza dasubstância detectável. Preferivelmente a quantidade de formação de com-plexo padrão é quantificada por meios fotométricos. Níveis de expressão deTrkB em amostras de indivíduos doentes depois são comparados com osvalores padrão. O desvio entre valores padrão e de doente estabelece osparâmetros para diagnosticar a doença.

Em certas modalidades, os métodos inventivos podem ser usa-dos para diagnosticar condições neurológicas que são caracterizadas porsuper ou subexpressão de TrkB. Por exemplo, e sem limitação, métodosinventivos podem ser usados para identificar sistemas nervosos que foramlesionados por ferimento, cirurgia, isquemia, infecção, doenças metabólicas,subnutrição, tumor maligno, medicamento tóxico, etc. Exemplos específicosincluem acidente vascular cerebral, lesão na medula espinhal, lesão cerebraltraumática, degeneração retiniana e axotomia. Os métodos inventivos tam-bém podem ser usados para diagnosticar distúrbios tais como distúrbio dehiperatividade com déficit de atenção (ADHD), depressão e dano mental as-sociado à idade (isto é, fornecendo-se aumento cognitivo). Os métodos in-ventivos também podem ser usados para diagnosticar condições congênitasou neurodegenerativas incluindo doença de Alzheimer, doença de Parkin-son, coréia de Huntington, esclerose lateral amiotrófica (ALS) e condiçõesrelacionada a estes.

11. Usos de purificação

A invenção também fornece um método de usar um anticorpopara purificar TrkB de uma amostra compreendendo combinar um anticorpoinventivo com uma amostra sob condições para permitir a ligação específica,do mesmo modo produzindo um complexo de anticorpo-receptor de TrkB,separar o complexo de anticorpo-receptor de TrkB do restante da amostra edepois separar o anticorpo do receptor de TrkB, obtendo do mesmo modoum receptor de TrkB purificado. Será avaliado que os anticorpos inventivospodem ser usados para isolar TrkB por qualquer técnica padrão, tal como

G-romatografia por afinidade ou imunoprecipitação.

EXEMPLOS

A presente invenção é ilustrada e sustentada ainda pelos exem-plos seguintes. Entretanto, estes exemplos não devem ser de nenhum modoconsiderados para limitar mais o escopo da invenção. Ao contrário, umapessoa tendo habilidade comum na técnica facilmente entenderia que exis-tem outras modalidades, modificações, e equivalentes da presente invençãosem divergir do espírito da presente invenção e/ou do escopo das reivindica-ções anexas.

EXEMPLO 1

Este exemplo descreve a preparação e caracterização e teste invitro de uma pluralidade de anticorpos de TrkB.

Materiais e Métodos

Imunógenos

Anticorpos de murino anti-TrkB foram preparados usando umamistura de dois imunógenos de proteína: uma primeira proteína recombinan-te que inclui o domínio extracelular (ECD) de TrkB humano (rhTrkB-ECD)(R&D systems, Inc., Cat. N2 397-TR/CF) e uma segunda proteína recombi-nante que inclui o domínio extracelular de TrkB de murino (rmTrkB-ECD)(R&D system, Inc., Cat. N2 1494-TB/CF).

O domínio extracelular de TrkB humano é compreendido de re-síduos de aminoácido C32-H430 da proteína de tamanho natural (que é a-presentada como a SEQ ID NO: 1 na Fig. 12, Acesso no GenBank N2 NP006171). rhTrkB-ECD foi expressado em linhagem de célula de mieloma demurino NSO. A massa molecular calculada de rhTrkB-ECD monomérico é 44kDa; entretanto, quando glicosilado ele migra como uma faixa ampla de 80 a100 kDa em SDS-PAGE sob condições de redução.

O domínio extracelular de TrkB de murino é compreendido deresíduos de aminoácido C32-H429 da proteína de tamanho natural (que éapresentada como a SEQ ID NO: 2 na Fig. 13, Acesso no GenBank N2P15209). No rhTrkB-ECD usado para este exemplo, esta seqüência é flan-queada por um peptídeo de sinal humano CD33 de terminal N que é clivadodurante a expressão e um Rótulo His de terminal C. rhTrkB-ECD também foiexpressado em linhagem de célula de mieloma de murino NSO. A massamolecular calculada do rhTrkB-ECD monomérico é de 45,9 kDa; entretanto,quando glicosilado ele migra como uma faixa ampla de 75 a 100 kDa emSDS-PAGE sob condições de redução.

Programas de imunização

Cinco camundongos BALB/c fêmeas de 8 semanas de idadeforam imunizados com 10 ug de rhTrkB-ECD que foi pré-misturado com ad-juvante de Freund completo (CFA). A mistura foi separada em porções queforam injetadas subcutânea e intraperitonealmente 4 vezes quinzenalmente(isto é, nas semanas 0, 2, 4, e 6). Os camundongos também foram imuniza-dos na semana 7 por injeção subcutânea e intraperitoheal com 1 ug de rm-TrkB-ECD que foi pré-misturado com adjuvante de Freund completo (CFA).

As sangrias dos camundongos foram coletadas nas semanas 5 e 7 e respos-tas de anticorpo nos soros foram avaliadas.

Geração de anticorpos monoclonais anti-TrkB de murino (mAbs)

Três dos cinco camundongos foram adicionalmente reforçadosintravenosamente com 10 ug de rhTrkB e 1 ug de rmTrkB 3 dias antes dafusão celular (que ocorreu na semana 12). Esplenócitos dos mesmos trêscamundongos foram fundidos com células de mieloma de murino

P3X63Ag8.653 (ATCC, Cat. N2 CRL-1580) na razão de 4:1 usando 50% depolietileno glicol (MW 1500) (Roche Diagnostics Corp., Cat. N- 783641). De-pois da fusão, as células foram semeadas e cultivadas em placas de 96 ca-vidades a 1 x 105 células/cavidade em meio de seleção (RPM 11640 conten-do 20% de FBS e 5% de Origen) (IGEN International, Inc., Cat. N2. 210001),2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 ug/ml de estreptomicina, 1x HEPES e 1 x HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina) (Sigma, Cat. N2H0262). Sobrenadantes de hibridoma foram triados quanto à ligação comrhTrkB por ELISA e manchamento em células estáveis HEK293 que expres-sam rhTrkB por análise FACS (ver abaixo). Os sobrenadantes de hibridomaselecionados para ser positivos foram subseqüentemente testados quandoas atividades agonistas èm rhTrkB usando um ensaio de luciferase (ver a-baixG-)v-Os -hibridomas- selecionados -foram subclonados quatro vezes pordiluições seriais e uma vez por classificação FACS (ver abaixo). O meiocondicional foi colhido da cultura de hibridoma estável. Prosep-A (MontageAntibody Purification Spin columns, Millipore, Cat. N2. P36486) foi usado pa-ra purificar IgG do meio condicional de hibridoma. A classe de Ig de cadamAb foi determinada com um kit de isotipagem de mAb de murino (IsoStrip,Boehringer Mannheim Corp., Cat. N2 1493027).

ELISAs

Para medir a presença de anticorpos de TrkB específicos, placasde 96 cavidades (Maxisorp, Nunc) foram revestidas com 1 ug/ml de rhTrkB-EDC-Fc (R&D system, Cat. N2 688-TK) ou rmTrkB-Fc (R&D system) e incu-badas durante a noite a 4o C. Depois de lavar as placas e bloquear os cavi-dades com PBS (10 mM de fosfato de sódio, 150 mM de NaCI, pH 7,2) con-tendo 1% de BSA e 0,05% de Tween-20, 100 ul de soro imune diluído ousobrenadantes de hibridoma foram adicionados e incubados durante 1 h natemperatura ambiente. As placas foram lavadas, e os anticorpos anti-TrkBligados foram detectados usando IgG anti-murino de cabra conjugado a pe-roxidase (H+L) (PIERCE, Cat. N-. 31434) seguido por incubação com osubstrato TMB (BioFX Laboratories, Cat. N- TMBW_1000-01). Os valores deabsorbância foram determinados a 450 nm em um espectrofotômetro.

Para determinar a concentração de mAb no sobrenadante dehibridoma, placas de 96 cavidades foram revestidas com 1 ug/ml de IgG an-timurino de cabra (Fcy) (PIERCE, Cat. N2 31123) em PBS e incubadas du-rante a noite a 4o C. Depois de lavar e bloquear as cavidades com PBS con-tendo 1% de BSA e 0,05% de Tween-20, 100 ul de sobrenadantes de hibri-doma diluídos foram adicionados durante 1 h na temperatura ambiente. IgGde murino de emparelhamento de isótipo purificado foi usado como um pa-drão para a quantificação de concentrações de IgG anti-TrkB. As placas fo-ram lavadas, e IgG-Fc anti-murino de cabra rotulado com HRP foram adicio-nadas e incubadas durante 1 h na temperatura ambiente. Depois de lavar oscavidades, o substrato TMB foi adicionado. A absorbância foi determinada a450 nm.

Caracterização-de epítopos de ligação de-anticorpo relativos usando ligaçãopor competição

Para determinar como a ligação de IgG anti-TrkB à proteínaTrkB afeta a interação de BDNF com TrkB, uma placa de 96 cavidades foirevestida com 0,3 ug/ml de BDNF (R&D system, Cat. N2 248-BD/CF) emPBS e incubada durante a noite a 4o C. Depois de lavar e bloquear os cavi-dades com PBS contendo 1% de BSA e 0,05% de Tween-20, 100 pi de mis-tura de sobrenadante de hibridoma pré-incubado (ou soro imune diluído)com rhTrkB-EDC-Fc foi adicionado à placa e incubado durante 1 h na tem-peratura ambiente. Depois de lavar a placa, IgG anti-humano de cabra con-jugado à peroxidase, (Fcy) (PIERCE, Cat. N2 31416) foi adicionado e incu-bado durante 1 h na temperatura ambiente. As cavidades foram lavadas e osubstrato TMB foi adicionado. A absorbância foi determinada a 450 nm.

Para mapear os epítopos de ligação de anticorpo relativos emrhTrkB, uma placa de 96 cavidades foi revestida com 1 ug/ml de cada mAbespecífico de TrkB individual em PBS e incubada durante a noite a 4o C. De-pois de lavar e bloquear os cavidades com PBS contendo 1% de BSA e0,05% de Tween-20, 100 ul de mistura de cada mAb de TrkB pré incubadoindividual (20 ug/ml) e rhTrkB-EDC-Fc (0,1 ug/ml) foi adicionado as cavida-des e incubado durante 1 h na temperatura ambiente. A placa foi lavada eincubada durante 1 h com IgG anti-humano de cabra conjugado à peroxida-se (Fcy). Depois de lavar a placa, o substrato TMB foi adicionado. A absor-bância foi determinada a 450 nm.

Ensaio de luciferase

Uma linhagem estável de células HEK-293 que expressam rh-TrkB foi gerada transfectando-se as células HEK-293 com pcDNA-hTrkB(tamanho natural, ver Acesso no GenBank N2 NM_006180). Células trans-fectadas foram selecionadas na presença de higromicina durante 2 semanascom diluições limitadas. A seguir da avaliação inicial, um único clone de cé-plaqueadas a 1,5 x 104 células/cavidade em 100 ul de meio de crescimentoem placas de 96 cavidades. No dia seguinte, as células foram tratadas com-1-0 ul de~1 Ox-Goncentração final-de BDNF ou -anticorpos de teste. Atividadesde luciferase foram medidas 16 h depois dos tratamentos usando o kit deensaio Steady-GIo da Promega de acordo com o protocolo do fabricante. Empoucas palavras, o meio foi substituído com 100 ul de PBS e 100 ul de rea-gente Steady-GIo foram adicionados. Depois de vedar as placas com Top-Seal, as placas foram agitadas em Agitador de Placa Tituladora em veloci-dade ~ 5 durante 5 minutos e depois a luminescência foi medida usando uminstrumento TopCount NXT v2.13 (Packard).

Análise FACS

Células HEK-293 que expressam rhTrkB foram destacadas dasplacas com PBS contendo 5 mM de EDTA e transferidas para tubos Falconde 5 ml (Becton Dickinson, Cat. No. 352063) com 2 x 105 células por tubo.As células foram lavadas uma vez com PBS centrifugando-se a 800 rpm a 4oC durante 3 min, e incubadas durante 30 min a 4o C com 100 ul de sobrena-dante de cultura de hibridoma, anticorpos purificados ou soro imune diluídoem PBS com 1% de FBS. As células foram lavadas 3 vezes com 1 ml dePBS contendo 1 % de FBS e incubadas durante 30 min a 4o C no escuro comIgG anti-murino de cabra rotulado com PE, fragmento F(ab')2 (DAKO Corpo-ration, Cat. No. R0480) em PBS contendo 1% de FBS. As células foram la-vadas três vezes novamente e re-colocadas em suspensão em 250 ul dePBS contendo 1% de FBS. lodeto de propídio foi usado para a detecção decélulas mortas, que foram excluídas da análise. A fluorescência de 5000 cé-lulas/tubo foi contada por um citofluorômetro de fluxo FACScan (Becton Dic-kinson).

Ensaio de autofosforilacão de TrkB

Células HEK-293 que expressam rhTrkB foram plaqueadas emplacas de 24 cavidades a 2 x 105 células/cavidade em um meio de cresci-mento DMEM. No dia seguinte, as células foram incubadas em DMEM isentode soro durante 90 min, depois estimuladas com BDNF ou anticorpos deteste em concentrações diferentes durante 30 min a 37° C. Depois de lavarcom PBS uma vez, as células foram lisadas em Tampão de Amostra Laem-mli (Bio-Rad) pré aquecido a 95° C. Os lisatos foram conduzidos através de

GQluna-QJAshredder^Ofâ^ em 4 a12% de gel Bis-Tris (Invitrogen). A seguir da transferência às membranas denitrocelulose, faixas de TrkB fosforilado foram detectadas usando anticorpoespecífico de PY490 fosfo-Trk (1:100, Cell Signaling, Cat. No. 9141) seguidopor incubação com anticorpo secundário anti-coelho conjugado a HRP (Mo-lecular Probes). Os sinais foram desenvolvidos usando o kit ECL plus (A-mersham).

Ensaio de crescimento de neurito

Células SH-SY5Y de neuroblastoma humanas foram cultivadasem DMEM:F12(1:1) suplementado com 2 mM de L-glutamina, 15 FBS epen/estrep. Para o ensaio de crescimento de neurito, as células foram pia-queadas em placas de cultura de tecido de 96 cavidades na densidade de 4x 103 células/cavidade e incubadas com 10 uM de ácido all-trans-retinóico(RA) para induzir a diferenciação neuronal. No terceiro dia, o meio foi substi-tuído com meio de crescimento fresco com ou sem BDNF ou anticorpos deteste, como indicado nos resultados. Depois de três dias adicionais em cultu-ra, as células foram fixadas por IC-Fix durante 30 min na temperatura ambi-ente e processadas ainda para o imunomanchamento de beta-Tubulina III.

Primeiro, as células foram permeabilizadas por incubação breve em 0,2% deTriton em solução tamponada com fosfato (TPBS). Depois as amostras fo-ram incubadas em 1,5% de soro de cabra normal (NGS) em TPBS durante30 min para bloquear a ligação não específica, seguido por incubação commAb anti-beta-Tubulina III (Tuj1, 1:1000, Covance) em. 1,5% de NGS/TPBS.

Os sinais de Tuj1 foram detectados usando anticorpo anti-cabra de murinoAlexa 488 (1:500, Molecular Probes) e crescimento de neurito foi analisadousando Cellomics varredura de arranjo.

Para a medição de efeitos promotores de neurito nos neurôniosprimários, culturas de neurônio granular cerebelar de rato ou murino (CGN)foram preparadas. Brevemente, o cerebelo foi dissecado dos animais pósnatal no dia 7 e cortado em pedaços pequenos. O tecido foi tratado com pa-paína (Worthington Biochemical Corp.) durante 30 min a 37° G e dispersa-dos por trituração suave. A seguir da centrifugação a 300 g durante 5 min,células-dissociadas-foram reconstituídas em -meio-Neurobasal contendo su-plemento B27, 0,5 mM de 1-glutamina, e 25 mM de cloreto de potássio eplaqueadas em placas Biocoat de 96 cavidades pré-revestidas com poli-d-lisina (BD bioscience) em uma densidade de 1,2 x 104 células/cavidade. Ascélulas foram tratadas com BDNF ou anticorpos de teste durante 24 h, fixa-das com IC-Fix durante 30 min na temperatura ambiente e processadas paraimunomanchamento com Tuj1 como descrito acima.

Ensaio de sobrevivência celular

As células SH-SY5Y foram plaqueadas em placas de 96 cavida-des a 1 x 104 células/cavidade e incubadas com RA (10 uM) para induzir adiferenciação neuronal. Depois de 3 dias, o meio de cultura foi mudado parao meio de crescimento sem soro (meio isento de soro) e as células foramtratadas com BDNF, anticorpos de teste ou veículo. A seguir de dois diasadicionais em cultura, a viabilidade de célula foi medida por ensaio de MTTusando o Kit de Ensaio de Proliferação de Célula Não Radioativa CelITiter96 (Promega) de acordo com o protocolo do fabricante.

Ensaio de neuroproteção

Culturas de CGN de rato ou murino foram preparadas de filhotesde 7 dias de idade como descrito acima e plaqueadas em placas Biocoat de96 cavidades pré revestidas com poli-d-lisina (BD bioscience) em uma den-sidade de 7,3 x 104 células/cavidade. 24 h depois do plaqueamento, as célu-las foram submetidas a lesão de privação de soro de potássio (KSD), que émostrada resultar em morte significante de neurônios granulares cerebela-res. Culturas irmãs foram co-tratadas com BDNF ou anticorpos de teste. Aseguir de 24 h de incubação, viabilidade de célula foi medida usando um Kitde Ensaio de Proliferação de Célula Não Radioativa CelITiter 96 (Promega).

Resultados

Avaliação de respostas de anticorpo a partir de camundongosimunizados com TrkB

Para avaliar as respostas imunes específicas para TrkB, os cin-co camundongos imunizados (M1 a M5) foram sangrados uma semana aseguir da terceira e quarta imunizações. Títulos de anticorpo anti-TrkB ele--vados-no-soro-foram-determinados por- ELISA-e análise FACS tanto na ter-ceira quanto na quarta sangria. A Fig. 1 representa resultados das sangriasdepois da quarta imunização. Todos os cinco camundongos geraram títuloselevados reconhecendo tanto rhTrkB-ECD quanto rmTrkB-ECD em ELISA(Figuras 1A e 1B).

O local dos epítopos de ligação de anticorpo no hTrkB em rela-ção ao sítio de ligação de BDNF também foi avaliado. Resultados de ELISAde competição mostraram que as sangrias imunes podem bloquear intera-ções de rhTrkB-EDC-Fc e BDNF em uma ordem de M2 = M5 > M3 > M4 =M1 (Figura 1 C). Interessantemente, as eficácias de anticorpos em bloqueara interação de rhTrkB-BDNF correlacionada com os títulos de ligação de an-ticorpo (comparar as Figuras 1A e 1 C). Todas as sangrias imunes tambémmostraram ligar-se a rhTrkB expressado na superfície celular em célulasHEK-293 como demonstrado por análise FACS (Fig. 1 D).

A seguir da observação de ligação de título elevada específicade soros imunes a hTrkB, estas sangrias imunes foram avaliadas em umensaio repórter de luciferase para testar suas atividades agonísticas. A ativi-dade de luciferase em células HEK-293 que expressam rhTrkB mostrou se-letivamente representar a ativação de TrkB (Fig. 2). A incubação destas cé-lulas com sangrias imunes significantemente aumentou os sinais de lucifera-se em uma maneira dependente de dose (Fig. 3). Novamente, a eficácia deatividades agonísticas foi em uma ordem de M2 = M5 > M3 > M4 = M1. Ostrês camundongòs com os títulos de anticorpo mais elevados e atividadesagonistas robustas (M2, M3 e M5) foram escolhidos para a geração de hibri-doma subseqüente.

Produção de anticorpos monoclonais

Como descrito previamente, os três camundongòs selecionados(M2, M3 e M5) foram reforçados intravenosamente com 10 ug de rhTrkB-ECD e 1 ug de rmTrkB-ECD três dias antes da fusão. A partir da primeirarodada de triagem de hibridoma, noventa e quatro clones foram adquiridosque ligaram-se fortemente a rhTrkB-EDC-Fc em um ensaio ELISA. Vinte dosmesmos clones reagiram cruzado com rmTrkB-ECD em um ensaio ELISA. Aanálise FACS-confirmou que cinqüenta e quatro clones ligaram-se a rhTrkBexpressado na superfície de células HEK-293.

A atividade agonista de TrkB de cada clone foi testada usandoum ensaio de luciferase e dezessete clones de hibridoma com atividadesmais elevadas foram selecionados quanto à outra caracterização. A seguirda estabilização dos mesmos clones, três rodadas de subclonagem com di-luição serial, e uma rodada de subclonagem com classificação FACS, osanticorpos monoclonais de cada meio de cultura condicional foram coletadose purificados usando-se ProSep-A (Montage Antibody Purification Kits). Osisótipos de IgG de cada anticorpo foram determinados por kit de teste deIsotipagem de Murino (Tabela 1). As concentrações de anticorpo foram de-terminadas por quantificação de IgG de Murino ELISA e todos os dezesseteclones produziram bons níveis de Ig nos sobrenadantes de cultura.

TABELA 1

<table>table see original document page 39</column></row><table>

Caracterização de anticorpos monoclonais

Os anticorpos monoclonais específicos de TrkB purificados fo-ram caracterizados por suas atividades de ligação a hTrkB por ELISA. Amaioria dos anticorpos ligados a rhTrkB com afinidades de ligação elevadas(ED50 = 10"11 (M)), exceto para um clone 29D7, para o qual ED50 caiu de 10"11 (M) a 10"10 (M) depois da purificação (dados não mostrados). Dois clones12F4 e 18C8 perderam suas atividades de ligação depois da purificação eportanto foram excluídos da lista de prioridade (e assim não foram incluídosna Tabela 1). Usando análises FACS, todos os quinze mAbs que iigam TrkBremanescentes também foram mostrados espcificamente ligar-se a hTrkBexpressado na superfície de células HEK293. Anticorpos também foram tes-tados quando as suas atividades de ligação de espécie cruzada a rmTrkBpor ELISA. Embora a maioria dos anticorpos foram descobertos ligar rmTrkBfracamente, clones 17D11, 18C3 e 29D7 foram descobertos ligar rmTrkBcom ED50 = 10-10~11(M) {Tabela 2).Um ensaio de competição ELISA foi usado para determinar seos anticorpos bloqueiam a interação de rhTrkB e BDNF. O clone 29D7 nãomostrou nenhuma atividade de bloqueio, enquanto os clones 17D11, 18C3 e19E12 parcialmente bloquearam a interação de rhTrkB-BDNF. Todos os ou-tros clones bloquearam a interação de rhTrkB-BDNF coma IC5o = 3-5 x 10"10(M) (Tabela 2).

TABELA 2

<table>table see original document page 40</column></row><table>

NB**: Nenhuma ligação

O mapeamento dos epítopos de ligação de anticorpo relativosem rhTrkB foi conduzido examinando-se a atividade de cada anticorpo indi-vidual em bloquear a ligação de outros anticorpos a rhTrkB. Por exemplo, aobservação de que dois anticorpos bloquearam cada ligação diferente comrhTrkB sugere que estes anticorpos podem ligar-se ao mesmo epítopo ouepítopos sobrepostos em rhTrkB (Tabela 3). Na Tabela 3, os anticorpos pré-ligados são apresentados em cada linha enquanto os anticorpos de competi-ção (isto é, revestimento) são apresentados em cada coluna. Os resultadosmostraram que os clones 11E1, 19E12 e 29D7 podem reconhecer epítoposúnicos. Os clones 17D11 e 18C3 parecem competir pelo mesmo sítio de li-gação. Todos os clones remanescentes competiram entre si e podem com-partilhar o mesmo epítopo de ligação.TABELA 3

<table>table see original document page 42</column></row><table>Atividades de luciferase

Os anticorpos específicos de TrkB purificados foram examinadosusando um ensaio de luciferase para demonstrar atividades agonistas. To-dos os anticorpos causaram aumentos dependentes de dose no sinal comEC50 na faixa de 10"10 (M) (Fig. 4). A janela de sinal máximo foi ~ 7 vezesmais basal para a maioria dos anticorpos, que foi comparável a resposta in-duzida por BDNF a 200 ng/ml (6,2 vezes mais basal).

Atividades funcionais de mAbs

Para testar se os anticorpos que ligam TrkB têm atividades ago-nistas funcionais mediadas por ativação de receptor de TrkB endógeno, efei-tos de promoção de neurito foram avaliados a seguir de tratamentos comestes anticorpos. Com base na ligação específica das espécies característi-ca dos anticorpos, primeiro utilizaram-se células SY5Y de neuroblastomahumano, que mostraram expressar TrkB na diferenciação neuronal. Coeren-te com relatos anteriores, observou-se que a adição de BDNF promoveu ocrescimento de neurito como demonstrado por aumentos no comprimento deneurito e no número de pontos de ramificação (Figs. 5A e 5B). Considera-velmente, a maioria dos anticorpos também aumentem significantemente ocrescimento de neurito com eficácias comparáveis ou ainda superiores aBDNF (Figs. 5A e 5B). Exemplos de imagens representativas de alguns gru-pos de tratamento são mostrados na Fig. 5C.

Sete anticorpos de TrkB com atividades mais altas (6E2, 7F5,11E1, 16É11, 17D11, 19E12 e 29D7) foram selecionados quanto à análisede resposta de dose total. Eles induziram aumentos dependentes de doseno crescimento de neurito com EC50 de cerca de 10"10 (M) (Fig. 5D, dadosnão foram obtidos para 6E2). Estes anticorpos também foram testados quan-to a sua capacidade para aumentar a sobrevivência de células SY5Y dife-renciadas a seguir do dano de retirada de soro. Os resultados mostraramque BDNF e vários anticorpos protegeram células SY5Y diferenciadas, de-monstrando aumentos dependentes de dose em viabilidade de célula (Fig. 6).

Dois anticorpos de TrkB, 17D11, 18C3 e 29D7, que mostraramligar-se a rmTrkB, também foram testados em culturas de neurônio de grâ-nulo cerebelar (CGN) de rato quanto à atividade contra o receptor de TrkBde rato endógeno. Tanto no ensaio de crescimento de neurito quanto no en-saio de neuroproteção, apenas 29D7 mostrou atividades comparáveis àque-las de BDNF, enquanto 17D11 e 18C3 foram inativos (Fig. 7 e dados nãomostrados). Pode-se sugerir que 17D11 e 18C3 reconhecem um epítopo emTrkB de murino que contém aminoácidos diferentes em TrkB de rato.

Análise de fosforilação de TrkB

Sete anticorpos de TrkB (6E2, 7F5, 11E1, 16E11, 17D11, 19E12e 29D7) selecionados com base em todas as atividades descritas acima fo-ram avaliados na análise de Western quanto à indução de autofosforilaçãode TrkB. Todos os anticorpos levaram à fosforilação de TrkB robusta, e es-tes efeitos foram antagonizados por tratamento com o inibidor de cinaseK252a, indicando que estes anticorpos que ligam TrkB causaram ativaçãode TrkB (Fig. 8).

Dois anticorpos de TrkB, 17D11, 18C3 e 29D7, que mostraramligar-se a rmTrkB, também foram testados em culturas de neurônio de grâ-nulo cerebelar (CGN) de rato quanto à atividade contra o receptor de TrkBde rato endógeno. Tanto no ensaio de crescimento de neurito quanto no en-saio de neuroproteção, apenas 29D7 mostrou atividades comparáveis àque-las de BDNF, enquanto 17D11 e 18C3 foram inativos (Fig. 7 e dados nãomostrados). Pode-se sugerir que 17D11 e 18C3 reconhecem um epítopo emTrkB de murino que contém aminoácidos diferentes em TrkB de rato.

Análise de fosforilação de TrkB

Sete anticorpos de TrkB (6E2, 7F5, 11E1, 16E11, 17D11,19E12e 29D7) selecionados com base em todas as atividades descritas acima fo-ram avaliados em análise de Western quanto à indução de autofosforilaçãode TrkB. Todos os anticorpos levaram à fosforilação de TrkB robusta, e es-tes efeitos foram antagonizados por tratamento com o inibidor de cinaseK252a, indicando que estes anticorpos que ligam TrkB causaram a ativaçãode TrkB (Fig. 8).Depósitos de ATCC

Os hibridomas que produziram os anticorpos de TrkB 17D11 e29D7 foram depositados com a ATCC em 18 de Agosto de 2005 e foramdadas designações de depósito de patente ATCC PTA-6948 e PTA-6949,respectivamente.

EXEMPLO 2

Este exemplo descreve outra caracterização e teste in vitro deuma pluralidade de anticorpos de TrkB. Em particular, este exemplo descre-ve experimentos que foram realizados para avaliar a especificidade de TrkBvs. TrkA e TrkC de alguns dos anticorpos do Exemplo 1.

Materiais e Métodos

Análise FACS

Células HEK-293 que expressam TrkA humano foram destaca-das das placas com PBS contendo 5 mM de EDTA e transferidas em tubosFalcon de 5 ml (Becton Dickinson, Cat. Ns 352063) com 2 x 105 células portubo. As células foram lavadas uma vez que com PBS centrifugando-se a800 rpm a 4o C durante 3 min, e incubadas durante 30 min a 4o C com 100ul de sobrenadante de cultura de hibridoma ou soro imune diluído em PBScom 1% de FBS. As células foram lavadas 3 vezes com 1 ml de PBS con-tendo 1% de FBS e incubadas durante 30 min a 4o C no escuro com IgGantimurino de cabra rotulado com PE, fragmento F(ab')2 (DAKO Corporation,Cat. N- R0480) em PBS contendo 1% de FBS. As células foram lavadas trêsvezes novamente e recolocadas em suspensão em 250 ul de PBS contendo1% de FBS. lodeto de propídio foi usado para a detecção de células mortas,que foram excluídas da análise. A fluorescência de 5000 células/tubo foicontada por um citofluorômetro de fluxo FACScan (Becton Dickinson).

Ensaio de luciferase

Linhagens estáveis de células HEK-293 que expressam TrkAhumano (ou TrkC humano) foram preparadas. As células transfectadas fo-ram selecionadas na presença de higromicina durante 2 semanas com dilui-ções limitadas. A seguir da avaliação inicial, um único clone de células foiescolhido para o estudo. Para o ensaio de luciferase, as células foram pia-queadas a 1,5 x 104 células/cavidade em meio de crescimento de 100 ul emplacas de 96 cavidades. No dia seguinte, as células foram tratadas com 10ul de 10x concentração final de NGF (ou NT-3) ou anticorpos de teste. Ativi-dades de luciferase foram medidas 16 h depois dos tratamentos usando o kitde ensaio Steady-GIo da Promega de acordo com o protocolo do fabricante.

Em poucas palavras, o meio foi substituído com 10 ul de PBS e 100 m' dereagente Steady-GIo foram adicionados. Depois de vedar as placas comTopSeal, as placas foram agitadas em Agitador de Placa Tituladora em velo-cidade ~ 5 durante 5 minutos e depois a luminescência foi medida usandoum instrumento TopCount NXT v2.13 (Packard).

Resultados

Análise FACS de anticorpos monoclonais

Os meios condicionados puros para cada um dos anticorposmonoclonais específicos de TrkB da Tabela 1 foram caracterizados por suasatividades de ligação a TrkA humano por FACS. Todos os anticorpos testadofalharam para ligar-se a TrkA humano. Espcificamente, os anticorpos foramtestados em concentrações variando de cerca de 5 a cerca de 60 ug/ml (verconcentrações específicas para cada anticorpo na Tabela 1, estas corres-pondem a concentrações na faixa de cerca de 30 a cerca de 500 nM) e cadaanticorpo falhou para mostrar qualquer ligação detectavel. Os dados deFACS são mostrados na Fig. 9A.

Atividades de luciferase

Um subconjunto dos anticorpos específicos de TrkB purificadosda Tabela 2 também foram examinados usando um ensaio de luciferase deTrkA ou TrkC para avaliar as atividades agonistas. Nenhum dos anticorpostestados ativou TrkA ou TrkC. Espcificamente, os anticorpos foram testadosem concentrações de até cerca de 3 ug/ml (cerca de 20 nM) e em cada casoos anticorpos falharam para causar aumento detectavel acima do basal (verFig. 9B para TrkA e Fig. 10 para TrkC). Ao contrário, NGF induziu um au- mento de ~ 6 vezes mais basal para TrkA a 300 ng/ml (Fig. 9A) e NT-3 indu-ziu um aumento de sinal de ~ 6 vezes mais basal para TrkC a 300 ng/ml(Fig. 10).EXEMPLO 3

Este exemplo descreve o teste in vivo de uma pluralidade deanticorpos de TrkB em um modelo de roedor de hipoxia-isquemia (Hl) neo-natal.

Materiais e Métodos

Animais e procedimentos cirúrgicos

O modelo de roedor de hipoxia-isquemia (Hl) neonataí foi fun-damentado no procedimento de Levine que é apresentado na Fig. 11 (porexemplo, ver Levine, Am. J. Pathol. 36:1-17, 1960; Rice et ai, Ann. Neurol.,9:131-141, 1981 e Gidday et ai, Neurosci. Lett. 168:221224, 1994 cada umdos quais é incorporado aqui por referência). Brevemente, filhotes em P7foram anestesiados com 2,5% de halotano e a artéria carótida comum es-querda foi permanentemente ligada. Depois que as incisões foram sutura-das, filhotes foram devolvidos à gaiola para recuperação e alimentação. Du-as horas mais tarde, os filhotes foram colocados em recipientes individuais,através dos quais oxigênio a 8% umidificado foi fluído. Depois de 2,5 h deum período hipóxico isquêmico, os filhotes foram devolvidos a suas gaiolas.

Para o tratamento, os animais receberam uma injeção intracerebroventricu-lar de 5 pi de 0,1 ou 0,3 nmol de BDNF, anticorpo monoclonal anti-TrkB29D7, controle lgG1 ou veículo exatamente antes do prejuízo hipóxico.

Avaliação da perda de tecido cerebral

Em P14, seções do cérebro foram preparadas de alguns doscamundongos para determinar o dano causado pela lesão Hl. As seçõescoronais do estriado, córtex e hipocampo foram manchadas com violeta decresila e a perda de área percentual no hemisfério lesionado foi comparadacom a área intacta. A Fig. 23 compara as manchas que foram obtidas doestriado e hipocampo para tratamentos diferentes. As Figs. 24A e 24B com-param a perda de tecido cerebral total e perda de tecido sub-regional, res-pectivamente, para tratamentos diferentes. Os dados são mostrados comomédia e erro padrão da média (S.E.M.). BDNF e anticorpo monoclonal anti-TrkB 29D7 mostrou proteção dependente de dose significante do cérebro dodano Hl. A proteção não foi localizada a qualquer sub-região específica docérebro mas a proteção máxima foi geralmente observada no córtex.

Análise bioquímica

24 horas depois da lesão Hl, seções do cérebro foram prepara-das a partir de um subconjunto dos camundongos para a análise bioquímica.Tecidos cerebrais hipocampais e corticais foram dissecados, lisados e sub-metidos a vários ensaios bioquímicos.

Um ensaio de clivagem de DEVD-AMC foi usado para determi-nar atividades de caspase-3 (por exemplo, ver Nagase era/., Immunol Lett.84:23, 2002 incorporado aqui por referência). Os resultados para as regiõesdiferentes do cérebro são mostrados na Fig. 25 para camundongos que fo-ram fornecidos com 0,1 nmol de reagentes de teste diferentes (média ±S.E.M.). BDNF e anticorpo monoclonal anti-TrkB 29D7 bloquearam a ativa-ção de caspase-3 causada por lesão Hl.

Amostras de proteína (30 ug/linha) de camundongos tratadoscom 0,3 nmol de reagentes de teste diferentes foram separadas por SDS-PAGE e submetidas ao imunoblotting com anticorpos contra certos substra-tos de caspase-3 (PARP e a-espectrina). Anticorpos contra B-actina foramusados como controles para verificar a carga igual de proteínas. Os resulta-dos mostrados na Fig. 26 demonstram inibição da clivagem dos mesmossubstratos de caspase-3 por BDNF e anticorpo monoclonal anti-TrkB 29D7(lados C = contra e I = ipsi de ligação da carótida).

Experimentos de seguimento

Os seguintes são experimentos de seguimento proféticos quepodem ser realizados nos camundongos do mesmo estudo. O desempenhodos camundongos remanescentes em testes de aprendizagem e memóriaespaciais pode ser avaliado (por exemplo, sem limitação os testes descritosem Almli et ai, Exp. Neurology 166:99-114, 2000 incorporado aqui por refe-rência). Por exemplo, os camundongos podem ser testados entre P20-P30.Opcionalmente, o desempenho pode ser avaliado durante vários dias duran-te este período ou mesmo em pontos no tempo mais tardios.

Protocolos de tratamento que produzem um efeito positivo (co-mo medido por uma redução na perda de tecido cerebral, uma melhora naaprendizagem e memória espaciais ou diferente) podem ser repetidos emuma faixa ainda maior de dosagens. Alternativa ou adicionalmente, protoco-los de tratamento podem ser repetidos com modos diferentes de administra-ção (por exemplo, administração intraperitoneal, administração intravenosa,etc); com pontos de partida diferentes (por exemplo, antes da ligação, ime-diatamente depois da hipoxia, com um retardo variável depois de hipoxia,etc); e/ou com duração ou freqüência diferentes (por exemplo, tratamentodiário durante 2 semanas pós lesão, etc).

EXEMPLO 4

Este exemplo descreve a preparação e teste de anticorpos Fv decadeia única humanos (scFv) contra TrkB humano. Bibliotecas de exibiçãode fago de anticorpo humano (CS, BMV e DP-47; Cambridge Antibody Te-chnology) contendo fragmentos Fv de cadeia única foram selecionadosquanto à ligação de TrkB usando os métodos seguintes.

Materiais e Métodos

Seleção de anticorpos por movimentação

10 ug de hTrkB-EDC-Fc foram revestidos em placa Nunc Maxi-sorp em 100 ml e deixados durante a noite a 4° C. Uma biblioteca de fago foipré-bloqueada (alíquota de 50 fagos adicionada a 50 ul de 6% de leite des-natado em 2 x PBS) e negativamente selecionada contra PSGL-Fc (Wyeth,Lot. N2 O0H25MO04) durante 1 h na temperatura ambiente para suprimir fagoreativo contra Fc O fago excluído foi transferido à-placa revestida com prote-ína alvo (hTrkB-EDC-Fc) e incubado na temperatura ambiente durante 2 h.

Cavidades foram lavados 10 vezes com PBS/0,1% de Tween 20 e 5 vezescom PBS. O fago ligado foi eluído com 50 ul/cavidade de TEA 100 mM re-centemente fabricado (140 pi de TEA em 10 ml de água ultra pura). O fagoeluído foi neutralizado usando 25 u1 de Tris-HCI 1 M estéril pH 7,5 . O fagofoi infectado em 10 ml de um semi-log (O.D a 600 nm = 0,5) de células TG1de E. coli. As células transformadas foram difundidas em uma placa de Bio-ensaio em ágar 2xTYAG e incubadas durante a noite a 30° C.Seleção de fase solúvel (Seleção de biotina)

Anticorpos de fago foram selecionados usando hTrkB-EDC-Fcbiotinilado de acordo com o protocolo descrito acima com as exceções se-guintes. O fago pré-bloqueado foi excluído primeiro contra 100 nM de PSGL-Fc biotinilado seguido por seleção positiva em 100 nM de hTrkB-EDC-Fcbiotinilado. Fago específico de TrkB humano foi capturado usando pérolasde estreptavidina magnéticas pré-bloqueadas (Dynabeads M-280 streptavi-din, Cat. N2 112.06). As pérolas foram lavadas 10 vezes com PBS/0,1% deTween 20 e 3 vezes com PBS. O fago ligado foi eluído com 200 ul de TEA100 mM recentemente fabricado (140 ul de TEA em 10 ml de água ultra pu-ra) e neutralizado usando 100 pi de Tris-HCI 1 M estéril pH 7,5 ao fago eluí-do para neutralizar o TEA. O fago foi infectado em E. coli e propagado comodescrito na etapa anterior.

Resgate de fago

E. coli infectada com fago foram fragmentadas nas placas emágar de Bioensaio e misturada com 10 ml de 2xTYAG por placa de Bioen-saio (2xTY com 100 ug/ml Ampe 2% de glicose). 20 ml de 2xTYAG foraminoculados com 100 ml de suspensão celular e cultivados a 37° C (300 rpm)a OD em 600 nm = 0,3 a 0,5. E. coli foram superinfectadas com 3,3 de fagoauxiliar MK13K07 e incubadas a 37° C (150 rpm) durante 1 h. As célulassuperinfectadas foram re-colocadas em suspensão em 20 ml de meio2xT-YAK-(2xTY/100 ug/ml de Amp/50 ug/ml de Canamicina) e cultivadas du-rante a noite a 25° C a 280 rpm. E. coli foram giradas a 3500 rpm durante 15min e o sobrenadante contendo o fago foi usado para a rodada seguinte deseleção.

Preparação de anticorpo de fago para ELISA

Colônias únicas de E. coli infectadas foram escolhidas em cavi-dades de microtítulo (Costat Cellwells) contendo 150 ml de meio 2xTYAGmedia (2% de glicose) por cavidade. Os clones foram deixados crescer a 37°C (100 a 120 rpm) durante 5 a 6 h (OD a 600 nm = 0,5). Estoque de fagoauxiliar M13K07 (1013 pfu/ml) foi diluído 1:1000 com meio 2xTYAG e 20 ulforam adicionado a cada cavidade. Os cavidades foram incubados a 37° C(100 rpm) durante 1 h. As placas foram centrifugadas a 3200 rpm durante 10min, o sobrenadante foi removido e as células foram recolocadas em sus-pensão em 150 ul de meio 2xTYAK. Culturas foram cultivadas durante a noi-te a 25° C (120 rpm). No dia seguinte, as placas foram centrifugadas a 3200rpm durante 15 min e o sobrenadante foi transferido para uma placa novapara o ensaio ELISA de fago.

ELISA de faqo

Placas de ELISA foram revestidas com 50 ul por cavidade de 1ug/ml de hTrkB-EDC-Fc (BSA como um controle) em PBS a 4° C durante anoite. Cavidades foram enxaguados 3 vezes com PBS e bloqueados com300 ul por cavidade de PBS/3% de leite desnatado na temperatura ambientedurante 1 h. O fago foi bloqueado com volume igual de PBS/6% de leitedesnatado e incubado na temperatura ambiente durante 1 h. 50 ul de fagobloqueado foram adicionados aos cavidades de ELISA e incubados na tem-peratura ambiente durante 1 h. As placas foram lavadas 3 vezes comPBS/0,1% de Tween seguido por 3 vezes com PBS. 50 ul de anticorpo anti-M13 de HRP-Camundongo em PBS/3% de leite desnatado (1:5000, Amer-sham Pharmacia biotech, Cat. N- 27-942101) foram adicionados a cada ca-vidade e incubados na temperatura ambiente durante 1 h. As placas foramlavadas como antes e 50 ul de substrato TMB foram adicionados a cada ca-vidade e desenvolvidos durante 2 a 5 min. A reação foi parada adicionando-se 50 ul de ácido sulfúrico 0,5 M e a absorbância foi lida a 450 nm.

Preparação de Fv de cadeia única para FACS

Colônias únicas foram escolhidas e cultivadas em placas de mi-crotitulação de cavidade profundo contendo 0,9 ml de meio 2xTYAG a 37° Cdurante 5 a 6 h. A expressão de scFv foi induzida adicionando-se IPTG auma concentração final de 0,02 mM em meio 2xTY e crescimento a 30° Cdurante a noite. E. coli foram colhidas depois do crescimento durante a noitee osmoticamente chocadas com 150 pi de tampão de TES diluído 1:5 emágua e incubadas em gelo durante 30 min. As células foram centrifugadas eo sobrenadante transferido a uma placa nova para o ensaio FACS. 293 célu-las estavelmente transfectadas com TrkB foram manchadas com scFv pre-parado como descrito. As células foram incubadas em gelo durante 30 min edepois lavadas com tampão de PBS. Fv de cadeia única foi detectado usan-do uma solução contendo anticorpo anti-myc 9E10 diluído 1:1000 seguidopor adição de anticorpo de IgG-Fc anticamundongo conjugado a PE diluído1:500. As células manchadas foram analisadas em um Citômetro de Fluxoda Bectin-Dickinson.

Resultados

ELISA de faqo

A Tabela 4 mostra os resultados de ensaios ELISA de fago dasseleções de biblioteca de fago diferentes (seleções de movimentação e so-lúveis). A Fig. 18 mostra os dados de ELISA de ligação de fago de um con-junto representativo de clones positivos de TrkB (seleção de mistura da bi-blioteca de BMV). A maioria de clones selecionados de TrkB mostrou reativi-dade forte e específica contra TrkB-EDC-Fc e não para a proteína de contro-lePSGL-Fc.

TABELA 4

TABELA 3

<table>table see original document page 52</column></row><table>

Depois de duas rodadas de seleção de movimentação, 78% declones aleatoriamente escolhidos da biblioteca de CS foram positivos para aligação de TrkB-EDC-Fc, mas não para a ligação de PSGL-Fc. Do mesmomodo, 3% de clones foram positivos depois de duas rodadas das seleçõessolúveis. Os números para as bibliotecas BMV e DP-47 foram 58% e 45% declones positivos de seleção de movimentação e 6% e 10% de seleção solú-vel. Usando seqüenciamento de DNA, confirmou-se que 53% dos clones demovimentação CS foram únicos ao passo que 100% dos clones de seleçãosolúvel CS foram únicos. Os números para as bibliotecas BMV e DP-47 fo-ram 23% e 39% únicos de seleções de movimentação e 50% e 50% únicosde seleções solúveis.

Análise FACS

A Fig. 19 mostra a especificidade de ligação de anticorpos descFv selecionados de TrkB testados usando o ensaio FACS. Os dados mos-tram que os anticorpos de scFv selecionados de TrkB reagem com TrkB as-sociado à membrana em uma maneira específica (histogramas azuis cheios)sem nenhuma reatividade cruzada para controlar células (histogramas ver-des abertos).

EXEMPLO 5

Este exemplo compara as atividades de ligação do anticorpo deTrkB 29D7 e um fragmento Fab 29D7 contra TrkB humano e de camundon-go. TrkB de camundongo (rhTrkB-EDC-Fc) e humano (rmTrkB-EDC) foramrevestidos em placas de ELISA como descrito acima no Exemplo 1.

As Figuras 20A e 20B mostram os resultados de ligação de ELI-SA para TrkB humano e de camundongo, respectivamente. Tanto o anticor-po de IgG 29D7 quanto seu fragmento Fab têm atividades de ligação depen-dente de dose para TrkB humano e de camundongo. Entretanto, o valor deED5o do Fab foi cerca de 100 vezes mais baixo do que aquele de 27D7 in-tacto. Nenhum lgG1 de controle de isótipo nem seu fragmento Fab ligaram-se a TrkB.

EXEMPLO 6

Este exemplo compara as atividades agonísticas do anticorpo deTrkB 29D7 e do fragmento Fab do Exemplo 5 contra TrkB humano. Ativida-des agonísticas foram examinadas usando um ensaio de luciferase e célulasHEK-293 que expressam rhTrkB de superfície como descrito no Exemplo 1.

As células HEK-293 foram tratadas com IgG de 29D7 ou Fab de29D7 em concentrações indicadas e atividades de luciferase de acúmuloforam medidas 16 horas pós-tratamento. Como mostrado na Fig. 21, tantoIgG total quanto Fab de 29D7 induziram atividades de luciferase dependen-tes de dose, indicando a ativação de TrkB. Entretanto, o valor de EC50 deFab de 29D7 foi cerca de 27 vezes mais alto do que aquele de IgG de 27D7(0,083 nM e 2,28 nM para IgG de 27D7 e Fab de 29D7, respectivamente).Nenhum lgG1 de controle de isótipo nem seu fragmento Fab tiveram efeitosna ativação de TrkB.

EXEMPLO 7

Este exemplo descreve a análise de mapeamento de epítopo decertos anticorpos inventivos de TrkB monoclonais. O mapeamento foi reali-zado contra peptídeos lineares, de alça única e de alça dupla que foram de-duzidos de seqüências dentro do domínio extracelular de TrkB humano.

Como mostrado na Fig. 22, o anticorpo monoclonal 17D11 reco-nhece a alça-3 do segmento de lgG-2 de TrkB humano (KNEYGKD, SEQ IDNO: 7, aminoácidos 364 a 370 da SEQ ID NO: 1); e alça-1 do segmento delgG-2 de TrkB humano (KGNPKP, SEQ ID NO: 8, aminoácidos 308 a 313 daSEQ ID NO: 1). A seqüência de camundongo para o primeiro epítopo(KNEYGKD, SEQ ID NO: 7, aminoácidos 364 a 370 da SEQ ID NO: 2) é i-dêntica à seqüência humana. A seqüência de camundongo para o últimoepítopo (RGNPKP, SEQ ID NO: 9, aminoácidos 308 a 313 da SEQ ID NO: 2)difere em um aminoácido.

Como mostrado na Fig. 22, os anticorpos monoclonais 29D7,7F5, 11E1 e 19E12 todos reconhecem a alça-3 do segmento de lgG-1 deTrkB humano (ENLVGED, SEQ ID NO: 10, aminoácidos 269 a 275 da SEQID NO: 1); e também podem reconhecer a alça-1 do segmento de lgG-1 deTrkB humano (AGDPVP, SEQ ID NO: 11, aminoácidos 221 a 226 da SEQ IDNO: 1). A seqüência de camundongo para o primeiro epítopo (ENLVGED,SEQ ID NO: 10, aminoácidos 269 a 275 da SEQ ID NO: 2) é idêntica à se-qüência humana. A seqüência de camundongo para o último epítopo (GGD-PLP, SEQ ID NO: 12, aminoácidos 221 a 226 da SEQ ID NO: 2) difere emdois aminoácidos.

EXEMPLO 8

Este exemplo descreve experimentos de ativação de TrkB in vi-vo que foram realizados com o anticorpo anti-TrkB 29D7. Brevemente, filho-tes em P7 receberam uma injeção intracerebroventricular de 5 ul de 0,3nmol de anticorpo monoclonal anti-TrkB 29D7 ou veículo. Tecidos cerebraisdepois foram dissecados 1, 2, 6, 12 e 24 horas depois da injeção. Tecidosforam lisados e quantidades iguais de amostras de proteína (30 ug/linha)foram separadas por SDS-PAGE e submetidas ao imunoblotting com anti-corpos específicos para proteínas que são fosforiladas como um resultadoda ativação de TrkB (fosfo-ERK1/2 e fosfo-AKT). Anticorpos contra (3-actinaforam usados como controles para verificar a carga igual de proteínas. Osresultados da Fig. 27 mostram que o anticorpo monoclonal anti-TrkB 29D7induziu a fosforilação dependente do tempo de ERK1/2 e AKT (dados deamostras hipocampais e corticais são mostrados e são representativos dosresultados obtidos de quatro amostras diferentes).

A Fig. 28 é uma quantificação densitométrica da fosforilação deERK mostrada na Fig. 27. A Fig. 29 é uma quantificação densitométrica dafosforilação de AKT mostrada na Fig. 27. A Fig. 30 mostra tecidos cerebraistratados com veículo e 29D7 que foram fixados e imunoflourescentementerotulados com um anticorpo para o marcador específico de neurônio NeuN(esquerdo) e um anticorpo anti-fosfo-ERK1/2 (central). As figuras do ladodireito mostram estes dois unidos. A fosforilação de ERK1/2 é significante-mente mais forte nas amostras tratadas com 29D7. A Fig. 31 mostra o cursode tempo de ativação de ERK1/2 nos tecidos corticais e hipocampais a se-guir da injeção intracerebroventricular de anticorpo monoclonal anti-TrkB29D7.

EXEMPLO 9

Este exemplo descreve um ensaio de inibição de neurito induzi-do por MAG/mielina que foi realizado com o anticorpo anti-TrkB 29D7. Bre-vemente, alíquotas de 50 ul de MAG(1-5) de rato recombinante ou mielinade rato purificada foram adicionadas a placas de cultura de tecido de fundoplano de 96 cavidades e secas ao ar durante a noite na temperatura ambien-te. As quantidades totais de MAG(1-5) ou mielina foram de 0,25 a 0,5 ug porcavidade, a menos que indicado de outro modo. No dia seguinte, as placasrevestidas com MAG ou mielina foram tratadas com 50 ul de poli-D-lisina (17ug/ml) durante 1,5 hora, seguido por incubação com um meio contendo 10%de FBS durante 1 hora a 37° C. Depois da aspiração do meio, células CGNde rato foram plaqueadas em uma densidade de 8.000 células/cavidade emmeio de crescimento Neurobasal suplementado com B27 contendo 200 mMde L-Glutamina, 2 M de KCI, e 100 U/ml de penicilina e estreptomicina.Quando indicado, reagentes de tratamento foram adicionados no tempo doplaqueamento celular. Neurônios foram cultivados em uma incubadora a 37°C equilibrada com 5% de CO2. Aproximadamente 20 horas pós plaqueamen-to, as células foram fixadas com 4% de paraformaldeído e prosseguiram oblotting com Tuj1. As células foram permeabilizadas com 0,2% de TritonX/PBS (TPBS) durante 5 minutos na temperatura ambiente seguido por in-cubação com 1,5% de soro de cabra normal em TPBS (S-TPBS) durante 30minutos para bloquear a ligação não específica. Uma alíquota de anti- anti-corpo monoclonal b-Tubulina Classe III Neuronal (Tuj1, 1:1000; Covance #MMS-435P) foi adicionada às células. Depois de 1 horas de incubação natemperatura ambiente, anticorpos não ligados foram lavados com PBS trêsvezes e uma alíquota de anticorpo anticabra de IgG de camundongo AlexaFluor 488 (1:500, Molecular Probe # A-11001) foi adicionada para visualizaros sinais. Hoechst 33342 (Molecular Probe # H-3570, 2 ug/ml) foi incluídopara rotular o núcleo. Depois da lavagem, as placas foram seladas e anali-sadas quanto ao crescimento de neurito usando uma varredura de arranjoCellomics. Tipicamente em torno de 300 células de 9 campos foram analisa-das por cavidade e cada tratamento foi conduzido em grupos de quatro.

MAG e mielina inibem o crescimento de neurito de neurônios degrânulo cerebelar primários em culturas. Concentrações crescentes deMAG(1-5) de rato recombinante ou mielina de rato purificada foram revesti-das em placas de cultura de tecido de 96 cavidades e a extensão de neuritode neurônios primários foi medida a 20 horas como descrito acima. Comomostrado na Figura 32, (A) MAG e (B) mielina resultaram na inibição depen-dente de dose de crescimento de neurito.

Neurônios CGN depois foram plaqueados em placas revestidascom MAG ou mielina com controle ou com uma faixa de concentrações doanticorpo de TrkB 29D7. A extensão de neurito foi medida 20 horas pós tra-tamento. Como mostrado na Figura 33, 29D7 levou à reversão de inibição deneurito mediada por (A) MAG e (B) mielina.

OUTRAS MODALIDADES

Outras modalidades da invenção estarão evidentes àqueles ha-bilitados na técnica a partir de uma consideração do relatório descritivo ouprática da invenção divulgados aqui. É intencionado que o relatório descritivoe exemplos sejam considerados como exemplares apenas, com o escopoverdadeiro da invenção sendo indicado pelas reivindicações seguintes.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> wyeth

<120> Anticorpos monoclonais anti-TRKB e usos dos mesmos

<130> 2004658-0338

<140> PCT/US2006/021878

<141> 2005-05-06

<150> 60/687,705

<151> 2005-06-06

<160> 11

<170> Patentln versão 3.2

<210> 1

<211> 838

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Humano - (homo sapiens) TrkB

<400> 1

Met ser Ser Trp ile Arg Trp His Gly Pro Ala Met Ala Arg Leu Trp1 5 10 15

Gly Phe cys Trp Leu Vai vai Gly Phe Trp Arg Ala Ala phe Ala Cys20 25 30

Pro Thr ser Cys Lys Cys Ser Ala Ser Arg ile Trp cys Ser Asp Pro35 40 45

Ser Pro Gly lie vai Ala Phe pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser vai Asp50 55 60

Pro Glu Asn Ile Thr Glu ile Phe ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu Glu65 ___________ 70 75 80

ile ile Asn Glu Asp Asp vai Glu Ala Tyr vai Gly Leu Arg Asn Leu85 90 95

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<220>

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Vai Asp Trp ile vai Thr Gly Leu Gln Ser lie Asn Thr His Gln Thr245 250 255

Asn Leu Asn Trp Thr Asn vai His Ala Ile Asn Leu Thr Leu Vai Asn260 265 270

Vai Thr ser Glu Asp Asn Gly Phe Thr Leu Thr cys lie Ala Glu Asn275 280 285

vai vai Gly Met ser Asn Ala Ser vai Ala Leu Thr Vai Tyr Tyr Pro290 295 300

Pro Arg vai Vai ser Leu Glu Glu Pro Glu Leu Arg Leu Glu His cys305 310 315 320

lie Glu Phe vai vai Arg Gly Asn Pro Pro Pro Thr Leu His Trp Leu325 330 335His Asn Gly Gln Pro Leu Arg Glu Ser Lys lie lie His vai Glu Tyr340 345 350

Tyr Gln Glu Gly Glu lie ser Glu Gly Cys Leu Leu Phe Asn Lys Pro355 360 365

Thr His Tyr Asn Asn Gly Asn Tyr Thr Leu lie Ala Lys Asn Pro Leu370 375 380

Gly Thr Ala Asn Gln Thr lie Asn Gly His Phe Leu Lys Glu Pro Phe385 390 395 400

Pro Glu Ser Thr Asp Asn phe He Leu Phe Asp Glu vai Ser pro Thr405 410 415

pro Pro lie Thr vai Thr His Lys Pro Glu Glu Asp Thr Phe Gly vai420 425 430

ser ile Ala vai Gly Leu Ala Ala Phe Ala cys vai Leu Leu vai vai.435 440 445

Leu Phe Vai Met lie Asn Lys Tyr Gly Arg Arg Ser Lys Phe Gly Met450 455 460

Lys Gly Pro Vai Ala vai lie ser Gly Glu Glu Asp Ser Ala Ser Pro465 470 475 480

Leu His His lie Asn His Gly lie Thr Thr Pro Ser Ser Leu Asp Ala485 .490 495

Gly Pro Asp Thr vai vai lie Gly Met Thr Arg lie Pro vai lie Glu500 505 510

i Asn Pro Gln Tyr Phe Arg Gln Gly His Asn Cys His Lys Pro Asp Thr515 520 525

Tyr Vai Gln His lie Lys Arg Arg Asp lie vai Leu Lys Arg Glu Leu530 535 540

Gly Glu Gly Ala Phe Gly Lys vai Phe Leu Ala Glu cys Tyr Asn Leu545 550 555 560

Ser Pro Thr Lys Asp Lys Met Leu vai Ala vai Lys Ala Leu Lys Asp565 570 575

Pro Thr Leu Ala Ala Arg Lys Asp Phe Gln Arg Glu Ala Glu Leu Leu580 585 590Thr Asn Leu Gln His Glu His lie vai Lys Phe Tyr Gly vai Cys Gly595 600 605

Asp Gly Asp Pro Leu lie Met Vai Phe Glu Tyr Met Lys His Gly Asp610 615 620

Leu Asn Lys Phe Leu Arg Ala His Gly Pro Asp Ala Met Ilè Leu vai625 630 535 640

Asp Gly Gln Pro Arg Gln Ala Lys Gly Glu Leu Gly Leu ser Gln Met645 650 655

Leu His lie Ala ser Gln lie Ala ser Gly Met vai Tyr Leu Ala Ser660 665 670

Gln His Phe vai His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu Vai Gly675 680 685

Ala Asn Leu Leu vai Lys lie Gly Asp Phe Gly Met Ser Arg Asp Vai690 695 700

Tyr ser Thr Asp Tyr Tyr Arg Leu Phe Asn Pro ser Gly Asn Asp Phe705 710 715 720

cys lie Trp cys Glu vai Gly Gly His Thr Met Leu Pro lie Arg Trp725 730 735

Met Pro Pro Glu Ser lie Met Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu Ser Asp740 745 750

vai Trp Ser Phe Gly Vai lie Leu Trp Glu lie Phe Thr Tyr Gly Lys755 760 765

Gln Pro Trp Phe Gln Leu ser Asn Thr Glu Vai lie Glu cys lie Thr770 775 780

Gln Gly Arg vai Leu Glu Arg Pro Arg Vai Cys Pro Lys Glu Vai Tyr785 790 795 800

Asp Vai Met Leu Gly Cys Trp Gln Arg Glu Pro Gln Gln Arg Leu Asn805 810 815

lie Lys Glu lie Tyr Lys lie Leu His Ala Leu Gly Lys Ala Thr Pro820 825 830

lie Tyr Leu Asp lie Leu Gly<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Ser humano (Homo sapiens)

<400> 7

Lys Asn Glu Tyr Gly Lys Asp1 5

<210> 8

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<2 2 3> Ser humano (Homo sapiens)

<400> 8

Lys Gly Asn Pro Lys Pro1 5

<210> 9

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> murine (Mus musculus)

<400> 9

Arg Gly Asn Pro Lys Pro1 5

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<2 2 3> Ser humano (Homo sapiens)

<400> 10

Glu Asn Leu vai Gly Glu Asp1 5

<210> 11

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial<223> Ser humano (Homo sapiens)<400> 11

Ala Gly Asp Pro Vai Pro1 5

Claims (70)

1. Anticorpo monoclonal que liga TrkB humano.

2. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, emque a ligação com TrkB humano tem uma ED5o na faixa de cerca de 10 pM acerca de 500 nM.

3. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, emque a ligação com TrkB humano tem uma ED50 na faixa de cerca de 10 pM acerca de 1 nM.

4. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, emque a ligação com TrkB humano tem uma ED5o na faixa de cerca de 10 pM acerca de 100 pM.

5. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, emque a ligação com TrkB humano tem uma ED5o na faixa de cerca de 10 pM acerca de 50 pM.

6. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, emque o anticorpo monoclonal ativa TrkB humano com um EC50 na faixa decerca de 10 pM a cerca de 500 nM.

7. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, emque o anticorpo monoclonal ativa TrkB humano com um EC50 na faixa decerca de 10 pM a cerca de 1 nM.

8. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, emque o anticorpo monoclonal ativa TrkB humano com um EC50 na faixa decerca de 10 pM a cerca de 100 pM.

9. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, emque o anticorpo monoclonal ativa TrkB humano com um EC50 na faixa decerca de 10 pM a cerca de 50 pM.

10. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, emque o anticorpo monoclonal não liga e/ou não ativa TrkA humano.

11. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 10, emque o anticorpo monoclonal não exibe nenhuma ligação detectavel com TrkAhumano e/ou não causa nenhuma ativação detectavel de TrkA humano emconcentrações de anticorpo acima de cerca de 1 nM.

12. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 10, emque o anticorpo monoclonal não exibe nenhuma ligação detectavel com TrkAhumano e/ou não causa nenhuma ativação detectavel de TrkA humano emconcentrações de anticorpo acima de cerca de 10 nM.

13. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 10, emque o anticorpo monoclonal não exibe nenhuma ligação detectavel com TrkAhumano e/ou não causa nenhuma ativação detectavel de TrkA humano emconcentrações de anticorpo acima de cerca de 100 nM.

14. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 10, emque o anticorpo monoclonal não exibe nenhuma ligação detectavel com TrkAhumano e/ou não causa nenhuma ativação detectavel de TrkA humano emconcentrações de anticorpo acima de cerca de 1 uM.

15. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, emque o anticorpo monoclonal não liga e/ou não ativa TrkC humano.

16. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 15, emque o anticorpo monoclonal não exibe nenhuma ligação detectavel com TrkChumano e/ou não causa nenhuma ativação detectavel de TrkC humano emconcentrações de anticorpo acima de cerca de 1 nM.

17. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 15, emque o anticorpo monoclonal não exibe nenhuma ligação detectavel com TrkChumano e/ou não causa nenhuma ativação detectavel de TrkC humano emconcentrações de anticorpo acima de cerca de 10 nM.

18. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 15, emque o anticorpo monoclonal não exibe nenhuma ligação detectavel com TrkChumano e/ou não causa nenhuma ativação detectavel de TrkC humano emconcentrações de anticorpo acima de cerca de 100 nM.

19. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 15, emque o anticorpo monoclonal não exibe nenhuma ligação detectavel com TrkChumano e/ou não .causa nenhuma ativação detectavel de TrkC humano emconcentrações de anticorpo acima de cerca de 1 uM.

20. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 10, emque o anticorpo monoclonal não liga e/ou não ativa TrkC humano.

21. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, emque o anticorpo monoclonal bloqueia a ligação entre BDNF e TrkB humano.

22. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 21, emque o anticorpo monoclonal bloqueia a ligação entre BDNF e TrkB humanocom uma IC50 na faixa de cerca de 100 pM a cerca de 500 nM.

23. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 21, emque o anticorpo monoclonal bloqueia a ligação entre BDNF e TrkB humanocom uma IC50 na faixa de cerca de 100 pM a cerca de 1 nM.

24. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 21, emque o anticorpo monoclonal bloqueia a ligação entre BDNF e TrkB humanocom uma IC50 na faixa de cerca de 100 pM a cerca de 500 pM.

25. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, emque o anticorpo monoclonal não bloqueia a ligação entre BDNF e TrkB humano.

26. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 25, emque o anticorpo monoclonal não exibe nenhuma atividade de bloqueio detec-tável em concentrações de anticorpo acima de cerca de 1 nM.

27. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 25, emque o anticorpo monoclonal não exibe nenhuma atividade de bloqueio detec-tável em concentrações de anticorpo acima de cerca de 10 nM.

28. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 25, emque o anticorpo monoclonal não exibe nenhuma atividade de bloqueio detec-tável em concentrações de anticorpo acima de cerca de 100 nM.

29. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 25, emque o anticorpo monoclonal não exibe nenhuma atividade de bloqueio detec-tável em concentrações de anticorpo acima de cerca de 1 uM.

30. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, emque o anticorpo monoclonal tem um isótipo de lgG1.

31. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, emque o anticorpo monoclonal tem um isótipo de lgG2a.

32. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, emque o anticorpo monoclonal tem um isótipo de lgG2b.

33. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das rei-vindicações de 1 a 32, em que o anticorpo monoclonal liga e/ou ativa TrkBde murino.

34. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 33, emque a ligação com TrkB de murino tem uma ED5o na faixa de cerca de 10 pMa cerca de 500 nM.

35. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 33, emque a ligação com TrkB de murino tem uma ED50 na faixa de cerca de 10 pMa cerca de 1 nM.

36. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 33, emque a ligação com TrkB de murino tem uma ED50 na faixa de cerca de 10 pMa cerca de 500 pM.

37. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 33, emque a ligação com TrkB de murino tem uma ED5o na faixa de cerca de 10 pMa cerca de 100 pM.

38. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, emque o anticorpo monoclonal liga um ou ambos dos epítopos de TrkB humanocom seqüências KNEYGKD (SEQ ID NO: 7) e KGNPKP (SEQ ID NO: 8).

39. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 38, emque o anticorpo monoclonal liga ainda um ou ambos dos epítopos de TrkBde camundongo com seqüências KNEYGKD (SEQ ID NO: 7) e RGNPKP(SEQ ID NO: 9).

40. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, emque o anticorpo monoclonal liga um epítopo de TrkB humano com a seqüên-cia ENLVGED (SEQ ID NO: 10) e opcionalmente um epítopo de TrkB huma-no com a seqüência AGDPVP (SEQ ID NO: 11).

41. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 40, emque o anticorpo monoclonal liga ainda um epítopo de TrkB de camundongocom a seqüência ENLVGED (SEQ ID NO: 10).

42. Anticorpo monoclonal que é produzido a partir do hibridomadepositado com a ATCC em 18 de Agosto de 2005 e tendo designação dedepósito de patente de ATCC PTA-6948 ou a partir de uma célula progenito-ra do mesmo.

43. Anticorpo monoclonal que é produzido a partir do hibridomadepositado com a ATCC em 18 de Agosto de 2005 e tendo a designação dedepósito de patente de ATCC PTA-6949 ou a partir de uma célula progenito-ra do mesmo.

44. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, emque o anticorpo monoclonal liga ao mesmo epítopo como o anticorpo mono-clonal de acordo com a reivindicação 42.

45. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, emque o anticorpo monoclonal liga ao mesmo epítopo como o anticorpo mono-clonal de acordo com a reivindicação 43.

46. Hibridoma que produz um anticorpo monoclonal como defini-do em qualquer uma das reivindicações de 1 a 41.

47. Hibridoma depositado com a ATCC em 18 de agosto de 2005 e tendo a designação de depósito de patente de ATCC PTA-6948 ouuma célula progenitora do mesmo.

48. Hibridoma depositado com a ATCC em 18 de agosto de 2005 e tendo a designação de depósito de patente de ATCC PTA-6949 ouuma célula progenitora do mesmo.

49. Método compreendendo:imunizar um animal com pelo menos dois imunógenos de proteí-na que foram derivados de proteínas de TrkB de espécies diferentes; efundir células do baço do animal imunizado com células de mie-loma para produzir um hibridoma.

50. Método de acordo com a reivindicação 49, em que pelo me-nos dois imunógenos de proteína incluem um primeiro imunogeno que foiderivado de TrkB humano e um segundo imunogeno que foi derivado de umTrkB não humano.

51. Método de acordo com a reivindicação 50, em que o primeiroimunogeno inclui o domínio extracelular de TrkB humano e o segundo imu-nogeno inclui o domínio extracelular de um TrkB não humano.

52. Método de acordo com a reivindicação 51, em que o segun-do imunógeno inclui o domínio extracelular de um TrkB não humano selecio-nado do grupo consistindo em TrkB de murino, TrkB de rato e TrkB de galinha.

53. Método de acordo com a reivindicação 52, em que o segun-do imunógeno inclui o domínio extracelular de TrkB de murino.

54. Método de acordo com a reivindicação 50, em que o primeiroimunógeno e o segundo imunógeno são administrados na etapa de imuniza-ção em quantidades (em peso) que têm uma razão que é maior do que cerca de 1.

55. Método de acordo com a reivindicação 54, em que a razão émaior do que cerca de 5.

56. Método de acordo com a reivindicação 55, em que a razão éde cerca de 10.

57. Método de acordo com a reivindicação 51, em que o primeiroe segundo imunógenos não incluem nenhum dos aminoácidos que são en-contrados fora do domínio extracelular de TrkB.

58. Hibridoma que foi fabricado de acordo com o método comodefinido em qualquer uma das reivindicações de 49 a 57.

59. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-49 a 57, compreendendo ainda: gerar um anticorpo monoclonal a partir dohibridoma.

60. Anticorpo monoclonal que foi fabricado de acordo com o mé-todo como definido na reivindicação 59.

61. Método de ativar TrkB humano em um indivíduo, compreen-dendo: administrar a um indivíduo, uma quantidade terapeuticamente eficazde um anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindica-ções de 1 a 41.

62. Método de acordo com a reivindicação 61, em que o dito in-divíduo está sofrendo de uma condição neurológica que requer a ativação de TrkB.

63. Método de acordo com a reivindicação 61, em que o sistemanervoso do dito indivíduo foi lesionado por um ferimento, cirurgia, isquemia,infecção, uma doença metabólica, subnutrição, um tumor maligno ou ummedicamento tóxico.

64. Método de acordo com a reivindicação 61, em que o dito in-divíduo sofreu um acidente vascular cerebral, uma lesão na medula espi-nhal, ou uma axotomia.

65. Método de acordo com a reivindicação 61, em que o dito in-divíduo está sofrendo de uma condição congênita ou neurodegenerativa.

66. Método de acordo com a reivindicação 65, em que a dita con-dição é selecionada do grupo consistindo em doença de Alzheimer, doença deParkinson, coréia de Huntington, e esclerose lateral amiotrófica (ALS).

67. Método de acordo com a reivindicação 61, em que o dito an-ticorpo monoclonal é administrado ao dito indivíduo parenteralmente.

68. Método de acordo com a reivindicação 61, em que o dito an-ticorpo monoclonal é administrado ao dito indivíduo intravenosa ou interperi-tonealmente.

69. Método compreendendo:combinar um anticorpo monoclonal como definido em qualqueruma das reivindicações de 1 a 41 com uma amostra que inclui uma quanti-dade de TrkB humano sob condições que permitem ligação específica entreo anticorpo monoclonal e TrkB humano; edetectar a ligação específica, indicando do mesmo modo a pre-sença de TrkB humano na amostra.

70. Método compreendendo:combinar um anticorpo monoclonal como definido em qualqueruma das reivindicações de 1 a 41, com uma amostra que inclui uma quanti-dade de TrkB humano sob condições que permitem a ligação específica en-tre o anticorpo monoclonal e TrkB humano, produzindo do mesmo modo umcomplexo de anticorpo-TrkB;separar o complexo de anticorpo-TrkB humano do restante daamostra; eseparar o anticorpo de TrkB humano, obtendo do mesmo modoTrkB humano purificado.