BRPI0720473A2 - Agonistas de trkb para tratamento de distúbios autoimunes - Google Patents

Description

"AGONISTAS DE TRKB PARA TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS AUTOIMUNES" Este pedido de patente reivindica prioridade para pedido de patente provisório U.S. 60/870 918 depositado em 20 de dezembro de 2006, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

Campo da Invenção

A invenção refere-se ao tratamento de doenças autoimunes afetando o sistema nervoso central, incluindo esclerose múltipla. A invenção provê agonistas de cinase B recep- tora de tirosina (TrkB) para redução de invasão de leucócitos de tecidos do sistema nervoso central. Antecedentes

Esclecrose múltipla (MS) é uma doença autoimune desmielinizante do sistema ner- voso central (CNS) caratcerizada por inflamação, desmielinização, e dano axonal. A doença afeta mais que um milhão de pessoas em todo mundo e é duas vezes tão predominante em mulheres que em homens. Os sintomas de MS usualmente aparecem entre a idade de 20 e 40.

A etiologia de MS não é clara, embora características da doença tenham sido estu- dadas. Tais características incluem dano para tecidos de CNS, ativação de microglia, produ- ção de citocina pró-inflamatória, impedimento de migração de célula-T e expansão clonotípi- ca, alterada função efetora de macrófago, produção, regulação ascendente de MHC, e ata- que direto de CNS através de células T infiltrantes.

Encéfalomielite autoimune experimental (EAE) é considerado um modelo padrão para MS. O modelo de doença murina tem sido usada para estudar a etiologia de MS e para avaliar drogas para seu tratamento (Aharoni, R. el,, 2005a). As características clínicas de EAE incluem inflamação e desmielinização do CNS por um grande número de linfócitos e macrófagos infiltrando. Imunização ativa de camundongo com vários componentes proteínas diferentes de mielina, incluindo proteína básica mielina (MBP), proteína proteolípideo (PLP), e glicoproteína oligodendrócito mielina (MOG), induz a produção de anticorpos autoimunes e os sintomas clínicos de paralisia ascendente. A doença pode ser aguda ou crônica depen- dendo da linhagem de camundongos e a proteína mielina usada para imunização. EAE tem sido usada para estudar a etiologia de MA e para avaliar drogas para seu tratamento (Aha- roni, R. et al., 2005a).

MS resulta grandemente de uma resposta de célula-T para mielina, um polipeptídeo abundante em tecidos neuronais. Desmielinização e paralisia clínica resultam da invasão de tecidos de CNS por células-T do fenótipo Th1, com especificidade por antígenos mielina. Células Thlproduzem citocinas inflamatórias incluindo TNF-α e IFN-γ. Dano para CNS é provavelmente também causado por outras repostas imunológicas, incluindo a produção de anticorpos autoimunes e ativação de complemento. Células-B são envolvidas durante está- gios inicial e posterior de MS e EAE com anticorpos específicos de proteína básica mielina (MBP) de vários isotipos encontrados por todos os cursos das doenças. Seções preparadas a partir de tecidos de cérebro e cordão espinhal mostram invasão de leucócitos (particular- mente linfócitos e macrófagos) e destruição dos tecidos subjacentes do sistema nervoso.

Acetato de Glatiramer )GA, COPAXONE) é uma droga imunossupressiva para o

tratamento de MS e outras doenças (Amon, R. et al., 2003). A droga também é efetiva no modelo EAE. GA é um indutor de células Th2/3, que produzem citocinas antiinflamatórias, que cruzam a barreira sangue - cérebro para acumulação no CNS. Estas citocinas produ- zem vários efeitos no CNS1 e conduzem à produção local de outros fatores de crescimento, por exemplo, IL-10, TGF-β, e BDNF (Aharoni, R. et al., 2003). Administração prolongada de GA foi associada com maiores níveis de expressão de NT3, NT4, e BDNF (Aharoni, R. et al., 2005b).

NT3, NT4, e BDNF são membros da família neurotropina (NT) de proteínas homo- diméricas pequenas importantes para desenvolvimento neuronal, processo de crescimento, plasticidade sináptica, proteção e sobrevivência.; NTs incluem fator de crescimento de nervo (NGF), fator neurotrófico derivado de cérebro (BDNF), NT3, NT4 (também chamado NT4/5) NT6, e NT7. NTs afetam células alvos através de interações com uma família de receptores, conhecidos como tirosina cinases receptoras (também chamadas cinases receptoras de tirosina). Estes receptores incluem vários receptores de cinase receptora tirosina (Trk) de alto peso molecular (130-150 kDa), alta afinidade (~10"11M) e um receptor conhecido como receptor de baixo peso molecular (65-80 kDa), baixa afinidade (~10"9M) (LNGFR, p75NTR, ou p75). Ligação de NT a uma específica tirosina cinase receptora causa dimerização de receptor e ativação do domínio tirosina cinase intrínseco. NGF liga-se preferencialmente a cinase receptora tirosina A (TkrA), BDNF e NT4 a cinase receptor tirosina B (TrkB), e NT3 a cinse receptor tirosina C (TrkC). Todas NTs se ligam fracamente a p75.

O relato de BDNF e NT4 nos tecidos de CNS de camundongos EAE (Aharoni, R. et al., 2003, 2005b) sugere um papel para NTs e/ou seus receptores em esclerose múltipla e doenças relacionadas.

Referências

Aharoni, R. et al. (2005a) J. Neurosci. 25:8217-28.

Aharoni, R. etal. (2005b) Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 102:19045-50.

Aharoni, R. et al. (2003) Proc. Nat'l. Acad. Sci USA 100:14157-62.

Aharoni, R. et al. (1997) Proc. NafL Acad. Sei. USA 94:10821-26.

Amon, R. et al. (2003) J. Mol. Recognit. 16:412-21. Davies, A. et al. (1993) Neuron 11565-74.

Karnezis, T. etal. (2004) Nat. Neurosci. &:736-44.

Padlan, E. et al. (1995) FASEB J. 133-39. Steinman and Zamvil (2006) Ann. Neurol. 60:12-21

Adicionais referências, particularmente referências relacionando-se a procedimen- tos e processos padrões, são citados por todo texto. Todas as patentes, pedidos de patente, entradas de GenBank, manuais de referência, e publicações citadas acima e em outros Iu- gares no pedido de patente são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

Breve Resumo da Invenção

Em um aspecto, a invenção provê um processo para redução de invasão de leucó- citos de um tecido do sistema nervoso central compreendendo administração a um sujeito mamífero em necessidade de tal tratamento, de uma composição compreendendo um ago- nista de TrkB em uma quantidade efetiva para ativação de receptor de TrkB, pelo que redu- zindo invasão de leucócitos de um tecido do sistema nervoso central. A presente invenção ainda provê o uso de um agonista de TrkB na fabricação de um medicamento usado para redução de invasão de leucócitos de um tecido do sistema nervoso central em um mamífero.

Em algumas realizações, o mamífero tem um distúrbio autoimune. Em uma realiza- ção, o distúrbio autoimune é encáfalomielite autoimune experimental. Em uma outra realiza- ção, o distúrbio autoimune é esclerose múltipla. Em outras realizações, a doença autoimune está associada com rejeição imune, neuropatias óticas, doença inflamatória de intestino, ou mal de Parkinson. Em realizações preferidas, o mamífero é humano.

Em algumas realizações, o agonista de TkrB é um agonista TrkB ocorrendo natu- ralmente. Em uma realização, o agonista de TrkB ocorrendo naturalmente é NT4. Em reali- zações relacionadas, o agonista de TrkB ocorrendo naturalmente compreende um fragmen- to ou derivado de NT4 ocorrendo naturalmente. Em algumas realizações, o fragmento ou derivado de NT4 liga-se a, e ativa TrkB. Em uma outra realização, o agonista de TrkB ocor- rendo naturalmente é BDNF. Em realizações relacionadas, o agonista de TrkB ocorrendo naturalmente compreende um fragmento ou derivado de BDNF ocorrendo naturalmente. Em algumas realizações, o fragmento ou derivado de BDNF liga-se e ativa TrkB.

Em uma outra realização, o agonista de TrkB é um anticorpo. Em uma realização particular, o anticorpo é 38B8. Em uma outra realização, o anticorpo é produzido pela linha- gem de hibridoma depositado sob ATCC Deposit Number PTA-8766. Em algumas realiza- ções, o agonista de TrkB é um anticorpo humano. Em realizações relacionadas, o agonista de TrkB é um anticorpo humanizado. Em algumas realizações o agonista de TrkB é um fragmento ou derivado de anticorpo. Em particulares realizações, o fragmento de anticorpo é selecionado de um anticorpo Fab, Fab', F(ab')2, Fv1 Fc, ou de cadeia simples (ScFv). Em algumas realizações o fragmento de anticorpo compreende a região de ligação de antígeno de anticorpo agonista 38B8. Em algumas realizações o fragmento de anticorpo compreende a região de ligação de antígeno do anticorpo produzido pela linhagem de hibridoma deposi- tado sob ATCC Deposit Number PTA-8766. Em uma realização relacionada, o fragmento de anticorpo compreende as regiões determinantes de complementaridade (CDR) de anticorpo agonista 38B8. Em uma realização relacionada, o fragmento de anticorpo compreende as regiões de determinação de complementaridade (CDR) do anticorpo produzido pela linha- gem de hibridoma depositada sob ATCC Deposit Number PTA-8766.

Em realizações preferidas, os leucócitos invasores compreendem células-T e ma-

crófagos. Em particulares realizações, os leucócitos invasores compreendem leucócitos ex- pressando CD3 e expressando CD68. Em realizações preferidas, o tecido do sistema nervo- so central é tecido de cérebro ou tecido de cordão espinhal.

Em um aspecto relacionado, a invenção provê um processo para tratamento de um distúrbio autoimune afetando o sistema nervoso central compreendendo administração a um sujeito mamífero em necessidade de tal tratamento, de uma composição compreendendo uma quantidade de um agonista de TrkB suficiente para ativar o receptor de TrkB, pelo que reduzindo invasão de leucócitos de tecidos do sistema nervoso central. A presente invenção ainda provê o uso de um agonista de TrkB na fabricação de um medicamento usado para tratamento de um distúrbio autoimune afetando o sistema nervoso central em um mamífero.

Em uma realização, o distúrbio autoimune é encéfalomielite autoimune experimen- tal. Em uma outra realização, o distúrbio autoimune é esclerose múltipla. Em outras realiza- ções, a doença autoimune está associada com rejeição imune, neuropatias óticas, doença inflamatória de intestino, ou mal de Parkinson. Em realizações preferidas, o mamífero é hu- mano.

Em algumas realizações, o agonista de TrkB é um agonista de TrkB ocorrendo na- turalmente. Em uma realização, o agonista de TrkB ocorrendo naturalmente é NT4. Em rea- lizações relacionadas, o agonista de TrkB ocorrendo naturalmente compreende um fragmen- to ou derivado de NT4 ocorrendo naturalmente. Em algumas realizações, o fragmento ou derivado de NT4 se liga e ativa TrkB. Em uma outra realização, o agonista de TrkB ocorren- do naturalmente é BDNF. Em realizações relacionadas, o agonista TrkB ocorrendo natural- mente é um fragmento ou derivado de BDNF ocorrendo naturalmente. Em algumas realiza- ções, o fragmento ou derivado de BDNF se liga e ativa TrkB.

Em uma outra realização, o agonista de TrkB é um anticorpo. Em uma realização particular, o anticorpo é anticorpo 38B8. Em uma outra realização, o anticorpo é produzido pela linhagem hibridoma depositada sob ATCC Deposit Number PTA-8766. Em algumas realizações, o agonista de TrkB é um anticorpo humano. Em realizações relacionadas, o agonista de TrkB é um anticorpo humanizado. Em algumas realizações o agonista de TrkB é um fragmento ou derivado de anticorpo. Em realizações particulares, o fragmento de anti- corpo é selecionado de um anticorpo Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, ou de cadeia simples (ScFv). Em algumas realizações o fragmento de anticorpo compreende a região de ligação de antígeno de anticorpo agonista 38D8. Em algumas realizações o fragmento de anticorpo compreende a região de ligação de antígeno do anticorpo produzido pela linhagem hibrido- ma depositada sob ATCC Deposit Number PTA-8766. Em uma realização relacionada, o fragmento de anticorpo compreende as regiões determinantes de complementaridade de anticorpo agonista 38B8. Em uma realização relacionada, o fragmento de anticorpo compre- ende as regiões determinantes de complementaridade (CDR) do anticorpo produzido pela linhagem hibridoma depositada sob ATCC Deposit Number PTA-8766.

Em realizações preferidas, os leucócitos invasores compreendem células-T"e ma- crófagos. Em realizações particulares, os leucócitos invasores compreendem leucócitos ex- pressando CD3 e expressando CD68. Em realizações preferidas, o tecido do sistema nervo- so central é tecido de cérebro ou tecido de cordão espinhal.

Ainda em um aspecto, a invenção provê um kit de partes para redução de invasão de leucócitos de um tecido do sistema nervoso central, compreendendo um agonista de TrkB em uma quantidade efetiva para ativação de receptor de TrkB e instruções para uso. Em um aspecto relacionado, a invenção provê um kit de partes para tratamento de um dis- túrbio autoimune afetando o sistema nervoso central, compreendendo um agonista de TrkB em uma quantidade efetiva para ativação de receptor de TrkB e instruções para uso.

Ainda em uma realização, a presente invenção refere-se ao anticorpo agonista de TrkB 38B8, por exemplo, um anticorpo 38B8 monoclonal isolado. Em uma outra realização, a presente invenção refere-se a um anticorpo agonista de TrkB isolado produzido pela Ii- nhagem hibridoma depositada sob ATCC Deposit Number PTA-8766. Em algumas realiza- ções o agonista de TrkB é um fragmento de anticorpo ou derivado de 38B8. Ainda em uma realização, o agonista de TrkB é um fragmento de anticorpo ou derivado do anticorpo produ- zido pela linhagem hibridoma depositada sob ATCC Deposit Number PTA-8766. Em realiza- ções particulares, o fragmento de anticorpo é selecionado de um anticorpo Fab, Fab', F(ab')2, Fv1 Fc, ou (ScFv) de cadeia simples derivado de 38B8. Em particulares realizações, o fragmento de anticorpo é selecionado de um anticorpo Fab, Fab', F(ab')2, Fv1 Fc1 ou (ScFv) de cadeia simples derivado do anticorpo produzido pela linhagem hibridoma deposi- tada sob ATCC Deposit Number PTA-8766. Em algumas realizações o fragmento de anti- corpo compreende a região de ligação de antígeno de anticorpo agonista 38B8. Em algumas realizações o fragmento de anticorpo compreende a região de ligação de antígeno do anti- corpo agonista produzido pela linhagem hibridoma depositada sob ATCC Deposit Number PTA-8766. Em uma realização relacionada, o fragmento de anticorpo compreende as regi- ões determinantes de complementaridade (CDR) de anticorpo agonista 38B8. Em uma reali- zação relacionada, o fragmento de anticorpo compreende as regiões determinantes de complementaridade (CDR) de anticorpo agonista que é produzido pela linhagem hibridoma depositada sob ATCC Deposit Number PTA-8766. Ainda uma realização é uma célula que produz o anticorpo agonista de TkrB 38B8, ou que produz um fragmento derivado de 38B8. Ainda uma realização é a linhagem hibridoma depositada sob ATCC Deposit Number PTA- 8766.

A presente invenção também refere-se a qualquer um dos agonistas de TrkB aqui descritos para uso no tratamento de qualquer um dos distúrbios autoimunes aqui descritos.

A presente invenção também provê uma composição farmacêutica compreendendo qual- quer um dos agonistas de TrkB como aqui descritos e um carreador farmaceuticamente a- ceitável.

Em uma outra realização, a invenção refere-se a uma molécula de ácido nucléico isolada compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica qualquer um dos ago- nistas de TrkB como aqui descritos. Uma particular realização é uma molécula de ácido nu- cléico isolada compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica o anticorpo a- gonista que é produzido pela linhagem hibridoma depositada sob ATCC Deposit Number PTA-8766. A invenção ainda refere-se a um vetor compreendendo qualquer uma das molé- culas de ácido nucléico aqui descritas, onde o vetor opcionalmente compreende uma se- qüência de controle de expressão operavelmente ligada à molécula de ácido nucléico.

Uma outra realização provê uma célula hospedeira compreendendo qualquer um dos vetores aqui descritos ou compreendendo qualquer uma das moléculas de ácido nucléi- co aqui descritas. A presente invenção também provê uma linha de células isoladas que produz qualquer um dos anticorpos ou porções de ligação de antígeno como aqui descritas ou que produzem a cadeia pesada ou cadeia leve de qualquer um dos ditos anticorpos ou ditas porções de ligação de antígeno.

Em uma outra realização, a presente invenção refere-se a um processo para pro- dução de um anticorpo agonista de TrkB ou uma sua porção de ligação de antígeno, com- preendendo cultura de qualquer uma das células hospedeiras ou linhas de células aqui des- critas sob condições apropriadas e recuperação do dito anticorpo ou porção de ligação de antígeno.

A presente invenção também refere-se a um animal transgênico não-humano ou planta transgênica compreendendo qualquer um dos ácidos nucléicos aqui descritos, onde o animal transgênico não-humano ou planta transgênica expressa o dito ácido nucléico. A presente invenção ainda provê um processo para isolamento de um anticorpo

agonista de TrkB ou sua porção de ligação de antígeno, compreendendo a etapa de isola- mento de anticorpo a partir de animal transgênico não-humano ou planta transgênica como aqui descrito.

Estes e outros aspectos da invenção tornar-se-ão aparentes a partir da descrição da invenção e exemplos que se seguem.

Breve Descrição dos Desenhos

As Figuras 1A e 1B mostram gráficos mostrando a morbidez relativa em animais EAE nas semanas seguindo indução-MOG. MOG foi administrada no dia 0. (A) Iniciando no dia 10 animais receberam administrações de NT4 (10 mg/kg) ou véiculo sozinho como um controle. (B) Animais foram tratados com IgG controle (10 mg/kg; n=9), NT4 (10 mg/kg) a partir de dia 3 para dia 9 (n=8), ou NT4 (10 mg/kg) de dia 9 para dia 15 (n=8).

A Figura 2 mostra uma série de gráficos mostrando a afinidade relativa de quatro

agonistas de tirosina cinase receptora (isto é, NGF1 BDNF1 NT4, e 38B8) para uatro tirosina cinases receptoras (isto é, TrkA1 TrkB1 TrkC1 e p75). O eixo χ mostra tempo (todo na faixa de 300-450 segundos). O eixo y mostra afinidade relativa. FiIeira superior em escala total (es- querda para direita): 90, 20, 50 e 60 unidades; segunda fileira: 32, 60, 60, 140 unidades; terceira fileira: 35, 35, 16, e 20 unidades; fileira de baixo: 90, 80, 100 e 90 unidades. Estes dados são ainda descritos no texto e no Exemplo 4 incluindo Tabela 2).

A Figura 3 mostra um gráfico mostrando morbidez em animais tratados com um a- gonista de TrkB 9 dias após indução com MOG. Animais receberam no dia 9 e 16 tanto 5 mg/kg de anticorpo agonista de TrkB 38B8 como uma IgG não-específica (controle). Ca- mundongos foram avaliados diariamente para sinais clínicos de EAE de acordo com o se- guinte sistema de escore: 0=normal; 1 = cauda claudicante; 2 = moderada fraqueza de membro traseiro; 3 = moderadamente severa fraqueza de membro traseiro (animal ainda pode andar com dificuldade); 4 = severa fraqueza de membro traseiro (animal pode mover seu membros traseiros mas não pode andar); 5 = completa paralisia de membro traseiro; e 6 = morte.

A Figura 4 mostra um gráfico mostrando morbidez em animais tratados com um a- gonista de TrkB 16 dias após indução de MOG. Animais receberam nos dias 16 e 23 tanto 5 mg/kg de anticorpo agonista de TrkB 38B8 como veículo (PBS).

As Figuras 5A e 5B mostram gráficos mostrando morbidez em animais tratados de- pois em progressão de doença. (A) Animais receberam nos dias 18 e 23 tanto 5 mg/kg de anticorpo agonista de TrkB 38B8 como uma IgG não-específica. (B) Animais receberam co- meçando no dia 22 administrações diárias de GA (COPAXONE) ou somente veículo (contro- le).

As Figuras 6A e 6B mostram gráficos mostrando morbidez e peso de corpo em a- nimais seguindo a administração de um agonista de TrkB ou dexametasona. Animais rece- beram 38B8 (5 mg/kg, semanalmente no dia 9 e dia 16), ou dexametasona (4 mg/kg) ou veículo etanol (controle), diariamente nos dias 3-12. (A) Morbidez foi medida como acima. (B) O peso de corpo dos animais foi medido sobre o curso de progressão de doença.

As Figuras 7 A e 7B mostram gráficos mostrando que a eficácia do agonista de TrkB na redução de morbidez de doença é dependente de dosagem. (A) Animais receberam nos dias 9 e 16 1 mg/kg ou 5 mg/kg do agonista de TrkB 38B8. (B). Animais receberam nos dias 9 e 16 5 mg/kg de 38B8 ou 10 mg/kg dde 38B8, ou PBS (controle). A Figura 8 mostra um gráfico mostrando a quantidade relativa de sobrevivência de neurônios na presença de quantidades crescentes de vários anticorpos agonistas de TrkB (38B8, 23B8, 36D1, 37D12, e 19H8) usando um ensaio in vitro. Os procedimentos experi- mentais e resultados são descritos no texto e no Exemplo 1 (por exemplo, Tabela 1). O valor EC50 para cada anticorpo no ensaio de sobrevivência de neurônio é mostrado na 3a coluna de Tabela 1.

A Figura 9 mostra uma série de gráficos mostrando os níveis relativos dos isotipos indicados de anticorpos específicos de MOG em animais não-tratados (controles) e animais tratados com anticorpo agonista de TrkB 38B8. Cada gráfico mostra a quantidade do isotipo de anticorpo indicado (como determinada através de medição de absorção em 450 μΐη) em animais tratados com agonista de TrkB (38B8) ou não-tratados (controles).

A Figura 10 mostra um gráfico mostrando os resultados de um ensaio de estimula- ção de esplenócito. Células de baço de animais não - tratados induzidos com MOG (contro- les) ou animais tratados com anticorpo agonista de TrkB (38B8) induzidos com MOG foram cultivadas in vitro na presença de MOG sozinha ou MOG em combinação com anticorpo agonista de TrkB (38B8; 50 uL/mg), ou dexametasona em uma de duas concentrações dife- rentes (IO-8Me 10"5M).

A Figura 11 mostra os resultados de manchamento imunoquímico de seções de cordão espinhal removidas de animais tratados com agonista de TrkB (B) e controles (A). As seções foram manchadas com Luxol Fast Blue para mielina e violeta Cresila para corpos de célula.

A Figura 12 mostra os resultados do manchamento imunoquímico de seções de cordão espinhal removidas de animais controles (A) e tratados com agonista de TrkB (B). As seções foram manchadas com anticorpo específico para CD3. A Figura 13 mostra os resultados de manchamento imunoquímico de seções de

cordão espinhal removidas de animais EAE controles (A) e tratados com agonista de TrkB. As seções foram manchadas com um anticorpo específico para CD68.

A Figura 14 mostra os resultados de manchamento histológico de seções de cordão espinhal removidas de animais EAE controles e tratados com agonista de TrkB. As seções foram manchadas com uma mancha de mielina, Luxol Fast Blue. A ausência de mancha- mento indica áreas de desmielinização.

Descrição Detalhada

Definições

Como aqui usados, os termos "cinase receptora tirosina" e "tirosina cinase recepto- ra" são usados intercambiavelmente para referirem-se a uma classe de moléculas da qual TrkB é um membro. A ligação de um Iigante (agonista) a uma tirosina cinase receptora dis- para dimerização de receptor induzida por Iigante e autofosforilação de resíduos tirosina no domínio cinase intracelular. Fosforilação de tirosina é seguida pela ativação de diversas cascatas sinalizantes, como os caminhos fosfatidil inositol 3-cinase (PI3K)/Akt, MAPK1 e PLC1 que modulam expressão de gene, tipicamente em uma maneira específica de tipo de célula.

Como aqui usado, "leucócitos invasores" são leucócitos que invadem, infiltram ou

migram em tecidos do sistema nervoso central (CNS), incluindo tecidos de cérebro e cordão espinhal, como um resultado de uma doença autoimune, preferivelmente uma doença auto- imune afetando o CNS. Os leucócitos invasores são primariamente células-T e monócitos, embora outros leucócitos possam estar presentes. Como aqui usado, "redução de leucócitos invasores" refere-se a diminuição de mi-

gração (isto é, invasão ou infiltração) de leucócitos em tecidos do CNS, incluindo tecidos de cérebro e cordão espinhal. Redução de invasão de leucócitos também refere-se a redução de efeitos citotóxicos mediados por invasão de leucócitos, particularmente com relação à células neuronais subjacentes e/ou outras células suportes do tecido de CNS. Invasão de leucócitos inclui invasão por células T e monócitos. Redução de invasão de leucócitos inclui proteção de tecidos de CNS de ataque autoimune. As células do CNS que são destruídas por invasão de leucócitos incluem células expressando mielina e células expressando não- mielina de vizinhança. Destruição de célula pode ser através de apoptose, necrose, ou uma combinação das mesmas. Reduzida invasão de leucócitos é caracterizada por indicações clínicas tais como diminuída progressão de doença, início retardado ou severidade de mor- bidez, sobrevivência prolongada, aperfeiçoada qualidade de vida, sintomas cognitivos, moto- res, ou comportamentais diminuídos ou estabilizados. Redução de invasão de leucócitos também inclui prevenção ou redução de risco de migração de leucócitos em tecidos do sis- tema nervoso central (CNS). A redução em invasão de leucócitos pode ser parcial ou com- pleta, por exemplo, a redução pode ser cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, ou mesmo cerca de 95%, em redução comparativa ou real, como aqui descrito.

Como aqui usado, um "agonista de receptor de TrkB" ou um "agonista de TrkB" é uma molécula que aumenta a quantidade de ativação dos receptores de tRKb, PRODUZINDO EFEITOS SIMILARES ÀQUELES PRODUZIDOS pelos agonistas ocorrendo naturalmente BDNF e NT4. Ativação de TrkB normalmente ocorre através de autofosforila- ção induzida por receptor, que inicia uma cascata característica de eventos sinalizantes in- tracelulares. Agonistas de receptor de TrkB aumentam esta ativação, por exemplo, através de modulação de dimerização de receptor ou fosforilação, através de modulação de ligação de agonistas ocorrendo naturalmente, imitando a ligação de agonistas ocorrendo natural- mente, fazendo com que o receptor de TrkB permaneça em uma condição ativada (por e- xemplo, fosforilada) por um período de tempo maior (incluindo indefinidamente), ou de outro modo modulando ativação de TrkB ou iniciando a cascata de eventos intracelulares que é característica de ativação de receptor de TrkB. Agonistas de TrkB incluem polipeptídeos agonistas ocorrendo naturalmente, seus fragmentos, variantes, e derivados, incluindo mas não limitado aos conhecidos agonistas de TrkB NT4 e BDNF. Agonistas de TrkB incluem anticorpos agonistas, seus fragmentos, variantes, e derivados. Propriedades preferidas de agonista de TrkB são aqui descritas. Agonista de TrkB da invenção pode aumentar ativação de TrkB por pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo me- nos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, ou mais.

Como aqui usado, "um fragmento" de polipeptídeo é uma porção de um maior poli- peptídeo que retem pelo menos algumas das propriedades biológicas do peptídeo maior, tal como a habilidade de ativar receptores de TrkB. Fragmentos preferidos compreendem os resíduos de aminoácidos e/ou estruturas ou o maior polipeptídeo que resultou nas proprie- dades biológicas do maior polipeptídeo. Fragmentos de polipeptídeo podem ser chamados de peptídeo, embora nenhuma distinção seja feita aqui entre polipeptídeos e peptídeo. Fragmentos exemplares são aqui descritos. Fragmentos podem ser derivadeos como aqui descrito.

Como aqui usado, "um derivado" polipeptídeo tem uma ou mais modificações cova- Ientes ou não-covalentes, tal como a adição ou remoção de um grupo ou metade funcional. Exemplos de derivados são aqui providos. Como aqui usado, uma "variante" de uma particular seqüência de polipeptídeos é

definida como uma seqüência de polipeptídeo tendo pelo menos 40% de identidade de se- qüência para a particular seqüência de polipeptídeo sobre um certo comprimento de uma das seqüências de polipeptídeo usando um algoritmo tal como Clustal V ou BLAST, por e- xemplo, o "BLAST 2 Sequences" tool Version 2.0.9 (7 de maio de 1999) fixados como parâ- metros default. Um tal par de polipeptídeos pode mostrar, por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% ou maior identidade de seqüência sobre um certo comprimento definido de um dos polipeptídeos. Como aqui usado, "identidade de seqüência", como aplicada a seqüências de poli-

peptídeos, refere-se à porcentagem de emparelhamentos de resíduos entre pelo menos duas seqüências de polipeptídeos alinhadas usando um algoritmo padronizado, tal como Clustal V, MEGALIGN, ou BLAST. Processos de alinhamento de seqüência de polipeptídeos são bem conhecidos. Alguns processos de alinhamento levam em conta substituições con- servativas de aminoácidos. Tais substituições conservativas como aqui descritas, generica- mente preservam a carga e hidrofobicidade no sítio de substituição, assim preservando a estrutura (e por isso função) do polipeptídeo. Como aqui usado, "uma quantidade efetiva para ativação de receptor de TrkB", ou expressões similares com relação a um agonista de TrkB, refere-se a uma quantidade sufi- ciente para aumento em ativação de receptor de TrkB (como aqui definido e conhecido na técnica) comparado a um nível de linha base de ativação antes da administração do agonis- ta de receptor de TrkB. O aumento em ativação pode ser de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, ou mais. Esta quantidade levara em conta considerações tais como a rota de admi- nistração, a meia - vida do agonista de TrkB no corpo, a solubilidade, biodisponibilidade, taxa de depuração, e outras características fármaco - cinéticas do agonista de TrIB, o peso de corpo e metabolismo do animal ou paciente, etc. Ver também agonistas de TrkB.

Como aqui usada, "um animal em necessidade de tratamento" ou expressões simi- lares, significa um animal, preferivelmente um mamífero incluindo um humano, tendo ou em risco de desenvolver uma doença autoimune envolvendo o CNS. Exemplos de doenças au- toimunes (ou distúrbios, sem distinção) afetando o CNS são encéfalomielite autoimune ex- perimental (EAE) em camundongos, esclerose múltipla (MS) em humanos, e doenças auto- imunes similares encontradas em outros mamíferos. Ataque autoimune do CNS é também observado em, por exemplo, rejeição imune, neuropatias óticas, doença inflamatória de in- testino, e mal de Parkinson.

Como aqui usado, "agonistas de TrkB ocorrendo naturalmente" são moléculas que existem na natureza e funcionam como ativadores de receptores de TrkB. Os agonistas o- correndo naturalmente conhecidos de receptores de TrkB são as neurotrofinas NT4 e BDNF. Agonistas de TrkB ocorrendo naturalmente incluem moléculas variantes ocorrendo natural- mente, como um polipeptídeo neurotrofina expresso em um animal com um alelo TrkB que sofreu mutação.

Um "anticorpo isolado", como aqui usado, é pretendido referir-se a um anticorpo

que é substancialmente livre de outros anticorpos tendo diferentes especificidades antigêni- cas (por exemplo,um anticorpo isolado que liga especificamente TrkB é substancialmente livre de anticorpos que ligam especificamente antígenos outros que não TrkB). Um anticorpo isolado que liga especificamente TrkB pode, entretanto, ter reatividade - cruzada para ou- tros antígenos, tais como moléculas de TrkB de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou compostos químicos.

Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal" como aqui usados referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpos de composição mo- lecular simples. Uma composição de anticorpo monoclonal mostra uma especificidade de ligação simples e afinidade para um particular epítopo.

Técnicas Genéricas

A presente invenção emprega técnicas convencionais usadas nos campos de bio- Iogia molecular, biologia de célula, bioquímica e imunologia. Tais técnicas são descritas em referências, como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, ET AL., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, Ed., 1984); Me- thods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, Ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Matherand P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; ell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a Iaboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).

Agonistas de TrkB

A invenção provê processos de uso de agonistas de TrkB para o tratamento de es-

clerose múltipla e outros distúrbios autoimunes afetando o sistema nervoso central (CNS). De acordo com uma característica da invenção, agonistas de TrkB são efetivos na redução de invasão de leucócitos em tecidos do CNS e redução de destruição dos tecidos neuronais subjacentes do CNS1 e assim melhorando as manifestações clínicas desta doença, tal como paralisia de membro. Em particular, agonistas de TrkB reduzem a migração de monócitos e células T, que são ativos em apresentação de antígenos mielina e administração de efeitos citotóxicos sobre as células produzindo os mesmos.

As observações conduzindo à invenção foram feitas usando um modelo animal bem aceito para MS, o camundongo com encéfalomielite autoimune experimental (EAE). EAE é um estado de doença experimental que compartilha muitas características clínicas e patoló- gicas com MS em humanos. Muitas terapias de MS aprovadas por FDA foram primeiro des- cobertas e desenvolvidas baseado nos modelos EAE em camundongos e ratos (revisto por Steinman and Zamvil, 2006). EAE pode ser induzida em camundongos C57BL/6 seguindo imunização com peptídeo 35-55 de glicoproteína oligodendrócito mielina (MOG) (Aharoni, R., et al., 2005a). Imunização com MOG induz reações autoimunes específicas de mielina, que causam desmielinização e morbidez similares àquelas de MS.

Experimentos animais usando agonistas de TrkB Em experimentos realizados em suporte da presente invenção, administração direta de um agonista de TrkB foi mostrada reduzir morbidez e dano de tecido de CNS em animais com uma doença autoimune específica de CNS (Figuras 1A e 1B). Uma forma recombinante da NT4 agonista de TrkB ocorrendo naturalmente foi administrada a animais EAE seguindo indução com MOG (Exemplo 5). Os animais tratados com NT4 mostraram morbidez signifi- cantemente reduzida comparados a animais controles. Este resultado demonstrou que ad- ministração de um agonista de TrkB foi efetiva na diminuição de progressão de EAE crônica. Ainda experimentos indicaram que a proteção oferecida por NT4 quando administrada du- rante um período de tempo inicial é pelo menos tão boa (se não melhor) que quando admi- nistrada durante um período de tempo posterior, com relação ao início de sintomas, e que tratamento com o agonista de TrkB não tem de continuar para o momento de início de sin- tomas de modo que o tratamento seja efetivo (Figura 1B). Ativação de TrkB podem ser eta- pas alvejantes relativamente à montante na indução de EAE.

Exemplos 1-4 e 6 descrevem anticorpos TrkB, alguns dos quais funcionaram como agonistas de TrkB, baseado em suas habilidades para estimular as atividades biológicas de TrkB, isto é, ativação de TrkB (por exemplo, Exemplo 6 e Tabelas 1 e 2). Vários anticorpos, incluindo anticorpo 38B8, foram específicos para TrkB e não mostraram ligação significante para as outras tirosina cinase receptoras ensaiadas. Anticorpo 38B8 foi mesmo mais seleti- vo para o receptor de TrkB que os agonistas ocorrendo naturalmente BDNF e NT4, que mostraram alguma reatividade cruzada. Uma análise cinética destas interações de Iigante - receptor é provida no exemplo 4 e Tabela 2.

Experimentos animais mostraram que um anticorpo agonista de TrkB proporcionou significante proteção contra morbidez de EAE comparado a uma imunoglobulina controle (Figura 3, Exemplo 7). O anticorpo agonista de TrkB foi efetivo quando administrado tão tar- de quanto 16 dias seguindo indução com MOG, e após o início de sintomas clínicos (Figura 4). Comparação com acetato de glatiramer (GA) sugeriu que o mecanismo de ação do ago- nista de TrkB é diferente daquele de GA, e outras drogas MS correntes (Figura 5). Outros resultados demonstram que os efeitos benéficos do agonista de TrkB foram similares àque- les da dexametasona imunossupressora (Figuras 6A e 6B). Os efeitos benéficos do anticor- po agonista de TrkB foram dependentes de dose (Figuras 7A e 7B).

Um ensaio de sobrevivência de célula neurônio foi usado para demonstrar que anti- corpos agonistas de TrkB afetam células neuronais em uma maneira consistente com com agonistas de TrkB ocorrendo naturalmente (Exemplo 8). Adição de quantidades crescentes dos anticorpos agonistas de TrkB resultou em aumentada sobrevivência de neurônio (Figura 8). Os valores EC50 para anticorpos agonistas de TrkB 38B8, 23B8, 36D1, e 37D12 nos en- saios de sobrevivência de neurônio e em ensaios KIRA humanos são descritos no Exemplo 1 e resumidos na Tabela 1. Drogas correntes para o tratamento de MS (incluindo GA e dexametasona) são i- munomoduladoras. Um anticorpo agonista de TrkB não parece funcionar através de supres- são de produção de anticorpos anti-MOG e, por isso, não parecem funcionar como imunos- supressores convencionais (Figura 9, Exemplo 9). Além disso, a presença do anticorpo ago- nista de TrkB não teve efeito aparente sobre estimulação de esplenócitos, como teve a de- xametasona imunossupressora (Figura 10). Animais tratados com o agonista de TrkB ret~em a habilidade de produzir respostas normais de célula B e/ou célula T anti-MOG. Es- tas observações sugerem que mecanismos de ação da dexametasona imunossupressora e agonistas de TrkB são diferentes, e que o mecanismo de ação de agonistas de TrkB não está primariamente no nível de proliferação de leucócitos.

Análises histológicas mostraram reduzida invasão de leucócitos em seções prepa- radas a partir de animais tratados com um agonista de TrkB. Alguns animais tratados com agonista de TrkB virtualmente não mostraram evidência de invasão de leucócitos do CNS (Figura 11). Identificação das células invasoras foi realizada por manchamento para células T expressando CD3 e macrófagos expressando CD68. Tecidos de cordão espinhal de ani- mais tratados com agonista de TrkB mostram invasão de monócitos e células T substanci- almente reduzida comparados a animais controles (Figuras 12 e 13). Regiões de severa desmielinização foram aparentes em camundongos controles mas não camundongos trata- dos com o agonista de TrkB (Figura 14). Os resultados do manchamento histoquímico de seções de tecido de CNS demonstraram que tratamento com agonista de TrkB reduz inva- são de linfócitos e monócitos do CNS.

Os resultados descritos acima demonstram que agonistas de TrkB são efetivos na redução de invasão de leucócitos do CNS e diminuição de progressão de EAE1 um modelo animal amplamente aceito para MS. O agonista de TrkB ocorrendo naturalmente NT4 e um anticorpo agonista de TrkB foram ambos efetivos na diminuição de progressão de doença. O anticorpo agonista demonstrou a mais alta seletividade para TrkB e foi usado para ainda estudos. Os efeitos benéficos dos agonistas de TrkB foram dependentes de dosagem, com reduzida morbidez sendo associada com crescentes doses de agonistas de TrkB. Diferente de drogas MS correntes, agonistas de TrkB não funcionam principalmente através de imu- nossupressão. Experimentos histoquímicos mostraram que agonistas de TrkB reduzem in- vasão de tecidos de CNS por células T e monócitos.

Agonistas de TrkB para distúrbios autoimunes de CNS

Sem ser limitado por teoria, é acreditado que agonistas de TrkB funcionam primari- amente através de modulação de migração de leucócitos. Imunidade celular pode predomi- nar em MS1 tornando agonista de TrkB um tipo mais efetivo de droga que correntes imunos- supressores, que afetam imunidade humoral. Além disso, os presentes processos podem ser combinados com correntes tratamentos imunossupressores para produção de adicionais efeitos terapêuticos.

Os agonistas de TrkB da invenção podem ser usados para reduzirem invasão de leucócitos de tecidos de CNS em um número de doenças autoimunes ou relacionadas. Em adição a serem o modelo para MS, os camundongos EAE são também usados para estudo de neurite ótica. Agonistas de TrkB são esperados aliviarem invasão imune de CNS em to- das estas doenças e outros distúrbios autoimunes mediados por, inter alia, invasão de leu- cócitos. Notar que os termos doença e distúrbio são usados sem distinção.

Uma característica da invenção é a direta administração de um agonista de TrkB a um animal sofrendo de uma doença autoimune. Embora as realizações preferidas da inven- ção sejam descritas em termos de polipeptídeos, a invenção abrange a administração de polinucleotídeos codificando tais polipeptídeos agonistas de TrkB na medida em que dire- cionarão a expressão dos agonistas de TrkB codificados no corpo. Processos de injeção direta de ADN e liberação de terapia de gene são conhecidos na técnica. Polipeptídeos a- gonistas de TrkB1 ou polinucleotídeos codificando os mesmos, são administrados diretamen- te a um animal, como oposto a serem induzidos através das administrações de uma droga, tal como GA. A invenção também abrange moléculas peptidomiméticas que se ligam e ati- vam TrkB em uma maneira consistente com agonistas de TrkB ocorrendo naturalmente e/ou anticorpos agonistas.

Particulares agonistas de TrkB para uso de acordo com os processos aqui descritos são descritos ainda em detalhyes abaixo. Adicionais agonistas de TrkB serão aparentes pa- ra aqueles versados na técnica sem se fugir do escopo da invenção.

Agonistas de TrkB ocorrendo naturalmente e seus derivados

Agonistas de TrkB incluem polipeptídeos agonistas ocorrendo naturalmente, inclu- indo mas não limitado aos agonistas de TrkB conhecidos NT4 e BDNF. Seqüências de poli- peptídeos de NT4 e/ou BDNF podem ser das mesmas espécies como o correspondente receptor de TrkB ou de espécies diferentes, contanto que o resultante polipeptídeo se ligue a TrkB e funcione como um agonista.

Agonistas de TrkB incluem NT4 ocorrendo naturalmente e variante (isto é, NT-4/5 e nomes similares). Polipeptídeos NT4 são descritos na publicação de pedido de patente US Nos 2005/020914, 2003/0203383, e 2002/0045576, e em PCT WO 2005/08240. Polipeptí- deos NT4 (isto é, NT4/5) foram identificados em um número de mamíferos. Substituições de aminoácidos de interesse incluem G77 para Κ, H, Q ou R; e R84 para E1 F, Ρ, Y ou W. Sítios de clivagem de protease podem ser removidos para estender a meia - vida ou polipeptídeos NT4 e BDNF, ou adicionados para permitir a regulação de sua atividade. Agonistas de TrkB podem ser conjugados ou fundidos para a metades de extensão de meia - vida, tais como um PEG, a região Fc de IgG, albumina, ou um peptídeo ou epítopos tais como Myc, HÁ (hemaglutinina), His-6, ou FLAG. Polipeptideos BDNF também foram identificados em um número de mamíferos (ver, por exemplo, patente US 5 180 820 e pedido de patente US 2003/0203383).

Polipeptídeos BDNF e NT4 variantes e ocorrendo naturalmente da invenção inclu- em quimeras, variantes, fragmentos (incluindo peptídeos), e/ou seus derivados. Fragmentos preferidos incluem a porção de ligação de TrkB de polipeptídeos ocorrendo naturalmente, ou uma porção Iigante equivalente mutada, ou consenso, quimérica. Fragmentos incluem pep- tídeos sintéticos. Variantes incluem variantes de seqüências de aminoácidos ocorrendo na- turalmente tendo substituições de aminoácidos conservativas e não-conservativas.

Substituições conservativas envolvem resíduos de aminoácidos de similar tamanho, carga ou hidrofobicidade. Por exemplo, Ala pode ser substituído por Vai, Leu, ou Ne. Arg pode ser substituído por Lys, Gln, ou Asn. Asn pode ser substituído por Gln, His, Lys, ou Arg. Asp pode ser substituído por Glu. Cys pode ser substituído por Ser. Gln pode ser subs- tituído por Asn. Glu pode ser substituído por Asp. Gly pode ser substituído por Pro. His pode ser substituído por Asn, Gln, Lys, ou Arg. Ile pode ser substituído por Leu, Vai, Met, Ala, Phe, ou Norleucina. Leu pode ser substituído por Norleucina, lie, Vai, Met, Ala, ou Phe. Lys pode ser substituído por Arg, Gln, ou Asn. Met pode ser substituído por Leu, Phe, ou Ne. Phe pode ser substituído por Leu, Vai, lie, ou ala. Pro pode ser substituído por Gly. Ser pode ser substituído por Thr. Thr pode ser substituído por Ser. Trp pode ser substituído por Tyr. Tyr pode ser substituído por Trp1 Phe, Thr, ou Ser. Val pode ser substituído por lie, Leu, Met, Phe, ala, ou Norleucina.

Substanciais modificações em função podem ser realizadas através de seleção de substituições que diferem significantemente em seu efeito sobre manutenção de (a) a estru- tura da cadeia principal de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conformação de folha ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. Resíduos ocorrendo naturalmente são divididos em gru- pos baseados nas propriedades de cadeia lateral comum (alguns destes podem cair em vários grupos funcionais):

(1) hidrofóbico: Met, Ala, Vai, Leu, lie, Norleucina;

(2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr; (3) ácido: Asp1 Glu;

(4) básico: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

(5) aromático: Trp, Tyr, Phe; e

(6) resíduo que induz curvatura: Gly e Pro

Substituições não-conservativas trocam um membro de uma classe por um membro de uma outra classe, ou envolvem uma substituição não identificada como conservativa nos parágrafos anteriores.

Variantes incluem variantes de seqüências de aminoácidos ocorrendo naturalmente e variantes engenheiradas, contanto que os resultantes polipeptídeos ou derivados se li- guem a TrkB e funcionem como agonistas. Ensaios para medição de ativação de TrkB são aqui descritos e nas referências citadas.

Ainda variantes incluem polipeptídeos agonistas de TrkB tendo seqüências de ami- noácidos parciais de outros Iigantes relacionados da família Trkde cinases receptoras de tirosina, incluindo NT3 e NGF. Variantes ainda incluem polipeptídeos tendo seqüências de ativação e/ou ligação de tirosina cinase receptora consensos ou Trk consenso.

Outros derivados incluem peptídeos e polipeptídeos modificados covalentemente ou não-covalentemente (por exemplo, polipeptídeos acilados, pegilados, farnesilados, glico- silados ou fosforilados). Particulares formas pegiladas e outras modificadas de NT4 são descritas na publicação de pedido de patente US 2005/0209148. Os polipeptídeos podem incluir adicionais grupos funcionais para modulação de ligação e/ou atividade, permitem formação de imagem no corpo, modulam meia-vida, modulam transporte através de barreira de sangue - cérebro, ou auxiliam no alvejamento do polipeptídeo para um particular tipo de célula ou tecido. Os polipeptídeos podem compreender substituições de aminoácidos para facilitar modificação (por exemplo, a adição de sítios de pegilação, glicosilação, ou outros), contanto que as substituições não afetem substancialmente a ligação do polipeptídeo as TrkB ou atividade agonista.

Uma modificação comum é pegilação para reduzir depuração sistêmica com míni- ma perda de atividade biológica. Polímeros de polietileno glicol (PEG) podem ser ligados a vários grupos funcionais dos polipeptídeos NT4 e BDNF (assim como anticorpos agonistas de trkB usando processos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Robert set al. (2002), Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476; Sakane et al. (1997) Pharm. Res. 14:1085- 91). PEG pode ser ligado a, por exemplo, grupos amino, grupos carboxila, termini-N naturais ou modificados, e grupos tiol. Em algumas realizações, um ou mais resíduos de aminoáci- dos de superfície são modificados com moléculas PEG. Moléculas PEG podem ser de vá- rios tamanhos (por exemplo, variando de cerca de 2 a 40 kDa). Moléculas PEG ligadas a NT4, BDNF, ou outros polipeptídeos podem ter um peso molecular de cerca de qualquer um de 2000, 10 000, 15 000, 20 000, 25 000, 30 000, 35 000, 40 000 Da. Molécula de PEG po- de ser uma cadeia simples ou ramificada. Para ligar PEG a polipeptídeos agonistas de TrkB, um derivado do PEG tendo um grupo funcional em um ou ambos termini pode ser usado. O grupo funcional é escolhido baseado no tipo de grupo reativo disponível sobre o polipeptí- deo. Processos de ligação de derivados a polipeptídeos são conhecidos na técnica.

NT4 pegilado foi gerada e mostrada funcionar como NT4 em animais (ver, por e- xemplo, Exemplos 6 e 7 de publicação de pedido de patente US 2005/0209148 e PCT WO 2005/082401). O resíduo serina na posição 50 da NT4 madura humana pode ser trocado para cisteína para gerar NT4-S50C que é então pegilada, onde o PEG é ligado à cisteína na posição 50. Um exemplo de uma ligação específica terminal-N para PEG é obter mutação na posição 1 para uma serina ou treonina para facilitar pegilação. Processos similares apli- cam-se a BDNF e outros polipeptídeos para uso na invenção.

Polipeptídeos ou seus derivados podem ser ligados a outras moléculas diretamente ou via Iigadores sintéticos. Preferidos polipeptídeos agonistas de TrkB1 seus fragmentos, ou derivados, exibem afinidade de ligação, seletividade e ativação similares ou melhores com- parados a agonistas de TrkB ocorrendo naturalmente para os quais valores foram reporta- dos. Pequenas porções dos polipeptídeos agonistas podem ser referidas como "peptídeos", embora esta terminologia não deva ser construída como limitante. Agonistas de TrkB preferidos exibem similares propriedades biológicas comparados

a BDNF e NT4 nos numerosos experimentos e ensaios aqui descritos, incluindo os ensaios cinéticos, o modelo animal EAE, o ensaio KIRA, e o ensaio de sobrevivência de neurônio.

Agonistas anticorpos TrkB e seus derivados

Agonistas de TrkB incluem anticorpos agonistas,seus fragmentos, variantes e deri- vados. Apropriados anticorpos agonistas são seletivos para TrkB e se ligam com afinidades similares a ou maiores que polipeptídeos BDNF e NT4 ocorrendo naturalmente. Entretanto, as longas meias-vidas circulantes de anticorpos comparadas a agonistas de TrkB ocorrendo naturalmente, tornam a afinidade de ligação menos crítica. A afinidade de ligação de anti- corpo 38B8 foi determinada ser 46+/-10 nM (ver acima e Exemplo 4). Anticorpos agonistas de TrkB preferidos têm uma Kd de menos que 100 nM, menos que 10 nM, menos que 1 nM, menos que 100 pM, ou mesmo menos que 10 pM, usando as particulares condições de en- saio descritas no exemplo 4.

Agonistas de TrkB preferidos também exibem similares propriedades biológicas comparados a anticorpo 38B8 (e agonistas ocorrendo naturalmente) nos numerosos expe- rimentos e ensaios aqui descritos, incluindo os ensaios de ligação, o modelo animal EAE, o ensaio KIRA, e o ensaio de sobrevivência de neurônio. Por exemplo, preferidos agonistas de TrkB exibem um valor EC50 no ensaio de sobrevivência de neurônio descrito no Exemplo 1 (incluindo Tabela 1) de menos que 11 pM. Preferidos agonistas de TrkB têm um valor de EC50 de cerca de 1 pM a cerca de 10 pM, de cerca de 0,1 pM a cerca de 1 pM, de cerca de 0,01 pM a cerca de 0,1 pM, ou mesmo menor que 0,01 pM. Valores de EC50 exemplares são

0.2 pM para 38B8 e 5 pM para 36D1. Preferidos agonistas de TrkB também exibem simila- res propriedades biológicas comparados a anticorpo 38B8 usando o ensaio KIRA (Exemplo

1, incluindo Tabela 1). Preferidos agonistas de TrkB têm um valor EC50 no ensaio KIRA de menos que 50 nM, preferivelmente de cerca de 5 nM a menos que 50 nM, de cerca de 0,5

nM a cerca de 5 nM, ou mesmo menor que 0,5 nM. Um valor de EC50 exemplar é cerca de 5 nM, sob as condições de ensaio providas.

Anticorpos agonistas de TrkB incluem anticorpos policlonais, anticorpos monoclo- nais, anticorpos recombinantes, anticorpos híbridos, consenso, quiméricos, biespecíficos ou conjugados. Os anticorpos podem ser de qualquer isotipo (isto é, IgA, IgD, IgE1 IgG, ou IgM), se aplicável. Anticorpos incluem fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fe, e anticorpos (ScFv) de cadeia simples. Um apropriado anticorpo agonista de TrkB, ou um seu fragmento ou derivado funcional, se liga a, e ativa TrkB na maneira aqui descrita, por exemplo, com referência ao agonista anticorpo monoclonal 38B8. Anticorpos agonistas de TrkB incluem fragmentos de anticorpos, que abrangem polipeptídeos compreendendo seqüências de aminoácidos que foram derivadas de anticorpos. De particular importância são seqüências de aminoácidos envolvidas em reconhecimento de antígeno, tais como a- quelas na região CDR.

Anticorpo monoclonal e processos de hibridoma de camundongo são bem conheci- dos na técnica. O uso de anticorpos não-humanos para o tratamento de humanos pode ser tolerado em combinação com drogas imunossupressoras. Tais drogas são rotineiramente administradas para tratar ou reduzir os sintomas de MS e outras doenças autoimunes e in- flamatórias. Drogas imunorreguladoras são conhecidas na técnica e incluem glicocorticói- des, agentes citostáticos (por exemplo, agentes alquilantes, antimetabólitos, metotrexato, azatioprina e mercapto purina), anticorpos citotóxicos (por exemplo, receptor de célula T e anticorpos específicos de IL-2), drogas que atuam sobre imunofilinas (por exemplo, ciclospo- rina, tacrolimus, sirolimus, rapamicina, RAPAMUNE, PROGRAF, e FK506), interferons (por exemplo, IFN-β, opióides, proteínas de ligação de TNF (por exemplo, receptores circulan- tes), micofenolato, e outros agentes biológicos usados para supressão de respostas imunes de animal para anticorpos estranhos ou antígenos terapêuticos.

Processos para humanização de anticorpos monoclonais derivados de uma espécie diferente, por exemplo, camundongo, são bem conhecidos na técnica. Para o tratamento de humanos, anticorpos humanos ou humanizados são preferidos. Anticorpos humanizados compreendem um número mínimo de seqüências de aminoácidos não-humanas de modo que eles são minimamente imunogênicos, ou não-imunogênicos em humanos. Anticorpos humanizados preferidos não são reconhecidos como estranhos pelo sistema imune humano. Tais anticorpos podem ser imunoglobulinas quiméricas, fragmentos de imunoglobulinas (por exemplo, Fv1 Fab, Fab', F(ab')2 ou outras porções de cadeias de imunoglobulinas compre- endendo os resíduos de aminoácidos necessários para ligação de antígeno, com a maioria das seqüências de aminoácidos fora de sítio de ligação de antígeno sendo derivadas de imunoglobulinas humanas. Resíduos de aminoácidos dentro de de região de determinação de complementaridade (CDR) também podem ser substituídos com resíduos específicos humanos, tanto quanto ligação de antígeno não seja adversamente afetada.

Um anticorpo humano é um anticorpo exclusivamente ou substancialmente com- preendendo seqüências de aminoácidos de anticorpos humanos. Anticorpos humanos tam- bém incluem anticorpos compreendendo pelo menos um polipeptídeo de cadeia pesada humano ou pelo menos um polipeptídeo de cadeia leve humano, ou seu substancial frag- mento, opcionalmente em combinação com cadeias pesadas ou leves de um outro animal. Um tal exemplo é um anticorpo compreendendo polipeptídeos cadeia leve murina e cadeia pesada humana.

Apropriados anticorpos, seus fragmentos ou derivados, agonistas de TrkB podem ser expressos ou secretados em animais transgênicos, células mamíferas (incluindo células B), células de aves, células de insetos, levedura ou bactérias. Por exemplo, apropriados anticorpos humanos podem ser gerados através de imunização de animais transgênicos (por exemplo, camundongos) capazes de produzirem imunoglobulinas inteiramente huma- nas ou substancialmente humanas. Anticorpos também podem ser produzidos por meio de embaralhamento de genes, mostra de fago, mostra de E.coli, mostra em ribossoma, mostra em ARNm, complementação de fragmento de proteína, ou separação de peptídeo - ARN. Processos para projeto e produção de anticorpos humanos e humanizados e seus derivados são descritos em, por exemplo, patentes US 7 005 504, 6 800 738, 6 407 213, 6 054 297, 6 331 415 e 5 750 373 (Genentech); patentes US 6 833 268, 6 207 418, 6 114 598, e 6 075 181 (Abgenix); patente US 6 498 285 (Alexion); patente US 7 074 557, 5 885 793, 5 837 242, 5 733 743, 5 565 332 (Cambridge Antibody Technology); patentes US 7 118 879, 6 979 538, 6 326 155, 5 994 125, 5 837 500 (Dyax); patentes US 6 753 136, 6 667 150, 6 300 064, 5 514 548 (MorphoGen/Protein Design Labs); e 6 461 824, 6 204 023, 5 821 123, 5 595 898, 576 184, 4 698 420 (Xoma); patentes US 7 041 870,, 6 680 209, 6 500 931, 6 111 166, 6 096 311, 6 071 517, 6 063 116 (Medarex); e patente US 4 816 397 (Celltech). Processos para produção de anticorpos humanos ou humanizados também são descritos em Vaughan et al. (1996) Nature Biotechnology 14:309-14; Sheets ewt al. (1998) Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter (1991) J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222:581; Cole et al. (1985) em Monoclonal Antibodies and câncer Ther- apy (Alan R. Liss) p. 77; e Boerneretal., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95.

Anticorpos agonistas de TrkB podem ser modificados covalentemente e não- covalentemente (por exemplo, acilados, pegilados (ver, por exemplo, Exemplo 5), farnesila- dos, glicosilados, fosforilados, etc.) e podem incluir adicionais grupos funcionais para modu- lar ligação, modular atividade agonista, permitir formação de imagem do polipeptídeo no corpo, modular a meia-vida do polipeptídeo, ou modular transporte através da barreira de sangue - cérebro. Os polipeptídeos podem compreender substituições de aminoácidos para facilitação de modificação (por exemplo, a os adicionais sítios de pegilação, glicosilação ou outros), contanto que as substituições não afetem substancialmente a ligação do polipeptí- deo(as TrkB ou atividade agonista. Polipeptídeos ou seus derivados podem ser ligados a outras moléculas diretamente ou via Iigadores sintéticos. Apropriados fragmentos de anticorpos ou derivados compreendem resíduos de a- minoácidos que mediam ligação e ativação de TrkB1 como aqui descrito e nas referências citadas. Especificidade de anticorpo é primariamente determinada por resíduos em seis pe- quenas regiões de laço, conhecidas com regiões de determinação de complementaridade (CDRs) ou laços hiper-variáveis, localizadas próximas de terminus-N de cadeias leves e pesadas. As CDRs em cadeias leves estão genericamente entre resíduos de aminoácidos 24 e 34 (CDR1-L), 50-56 (CDR2-L), e 89-97 (CDR3-L). As CDRs em cadeias pesadas estão genericamente entre resíduos de aminoácidos 31 e 35b (CDR1-H), 50-65 (CDR2-H), e 95- 102(CDR3-H). O comprimento de algumas CDRs é mais variável que outras. CDR1-L varia em comprimento de cerca de 10-17 resíduos, enquanto CDR3-H varia em comprimento de cerca de 4-26 resíduos. Outras CDRs são de comprimentos bastante padrões. Padlan, E.A., et al. (1995) FASEB. J. 133-39. Fragmentos de anticorpo agonista de TrkB preferidos para uso na invenção compreendem resíduos de aminoácidos da CDR ou dos domínios de ca- deia pesada e/ou leve dentro de CDR.

Anticorpos para uso com a invenção incluem variantes de seqüências de aminoáci- dos ocorrendo naturalmente tendo substituições de aminoácidos conservativas e não- conservativas, como descrito acima e conhecido na técnica.

Preferidos anticorpos, seus fragmentos ou derivados, agonistas de TrkB exibem a- finidade de ligação, seletividade, e habilidade de ativação similares ou melhores, compara- dos a agonistas de TrkB ocorrendo naturalmente. Pequenas porções dos polipeptídeos ago- nistas podem ser referidas como "peptídeos" embora esta terminologia não deva ser cons- truída como limitante.

Formulações agonistas de TrkB

Agonistas de TrkB podem ser usados na fabricação de um medicamento para o tra- tamento de uma doença autoimune afetando o sistema nervoso central, tal como esclerose múltipla. Desta maneira, composições compreendendo agonistas de TrkB podem ser usa- das para tratar uma doença em um mamífero (incluindo um paciente humano), como aqui definido. Composições agonistas de TrkB ainda podem compreender apropriados excipien- tes farmaceuticamente aceitáveis, que são conhecidos na técnica. Genericamente, compo- sições agonistas de TrkB são formuladas para administração através de injeção (por exem- plo, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intramuscular, etc.), embora outras formas de administração possam ser usadas. Agonistas de TrkB podem ser formulados em prepara- ções para injeção através de dissolução, suspensão ou emulsificação dos mesmos em um solvente aquoso ou não-aquoso, como óleos vegetais ou outros similares, glicerídeos ácidos alifáticos sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores ou propileno glicol; e se deseja- do, com aditivos convencionais como solubilizantes, agentes isotônicos, agentes de suspen- são, agentes emulsificantes, estabilizadores e preservativos. Apropriados carreadores, diluentes e excipientes são bem conhecidos na técnica e incluem materiais como carboidratos, ceras polímeros intumescíveis e/ou solúveis em água, materiais hidrofílicos ou hidrofóbicos, gelatina, óleos, solventes, água, e semelhantes. O particular carreador, diluente ou excipiente usado dependerá dos meios e propósito para o qual o composto da presente invenção está sendo aplicado. Em geral, solventes seguros são solventes aquoso não-tóxicos como água e outros solventes não-tóxicos que são solú- veis ou miscíveis em água. Apropriados solventes aquosos incluem água, etanol, propileno glicol, polietileno glicol (por exmeplo, PEG400, PEG300), etc. e suas misturas. As formula- ções também podem incluir um ou mais tampões, agentes estabilizantes, tensoativos, agen- tes umectantes, agentes lubrificantes, emulsificantes, agentes de suspensão, preservativos, antioxidantes, agentes opacificantes, glidantes, auxiliares de processamento, corantes, ado- çantes, agentes perfumantes, agentes aromatizantes e outrõos aditivos conhecidos para provimento de uma apresentação elegante da droga (isto é, um composto da presente in- venção ou sua composição farmacêutica) ou auxílio na fabricação do produto farmacêutico (isto é, medicamento). Algumas formulações podem incluir carreadores tais como Iiposso- mas. Prpearações Iipossomais incluem, mas não são limitadas a, citofectinas, vesículas mul- tilamelares e vesículas unilamelares. Excipientes e formulações para liberação de droga parenteral e não-parenteral são mostradas em Remington, The Science and Practice of Pharmacy (2000).

Administração e Dosagem

Os esquemas de administração e dosagens terapêuticas aqui exemplificadas foram baseadas em fatores tais como massa de corpo de animal, a meia-vida de agonista de TrkB no sangue, e a afinidade dos agonistas de TrkB. Esquemas e dosagens de administração preferidas mantêm uma quantidade terapêutica de agonistas de TrkB no corpo entre admi- nistrações. Faixas de dosagens efetivas para NTs (incluindo agonistas de TrkB ocorrendo naturalmente) são aqui exemplificadas, em Davies et al. (1993) e em outras referências. Faixas de dosagens efetivas para anticorpos agonistas são aqui exemplificadas (por exem- plo, 1-10 mg/kg em animais EAE), e proverão um ponto de partida para determinação de dosagem ótima para anticorpos agonistas similares.

Como demonstrado por experimentos realizados em suporte da invenção (ver, por exemplo, Figuras 1B, 3, e 4), um "tratamento de pulso" inicial no curso da doença parece ser suficiente para reduzir morbidez em animais. Administração continuada do agonista de TrkB pode não ser requerida para a eficácia do tratamento.

O particular regime de dosagem, isto é, dose, cronometragem, e repetição, depen- derá da idade, condição, e peso de corpo do humano ou animal a ser tratado. Regimes de dosagem inicial podem ser extrapolados de experimentos animais. A cronometragem / fre- qüência de administrações de agonista de TrkB deve ser baseada na meia-vida circulante (ou a meia-vida em tecido neuronal) de um particular agonista de TrkB1 a quantidade de a - gonista que passa a barreira de sangue - cérebro, a meia-vida do agonista em células, toxi- dez, e efeitos colaterais, quando se aplicam.

Nos presentes estudos, administração de agonistas de TrkB foi realizada através de injeção intraperitoneal (i.p.); entretanto, outras rotas de administração são esperadas serem efetivas (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intramuscular). Administração intracranial ou intraespinhal (ou administração para outros tecidos do CNS) é provável de ser efetiva. Outras rotas de administração podem ser apropriadas, dependendo do particular agonista de TrkB, seu revestimento, conjugação, ou particulares propriedades biológicas (por exem- pio, oral, sublingual, intrasinovial, mucosal, transdérmica, intraarticular, vaginal, anal, intrau- retral.m nasal, aural, via inalação, insuflação, via cateter, como uma quantidade relativamen- te grande, sobre uma sonda ou outro dispositivo implantável, em uma composição embólica, em uma gota intravenosa, sobre um emplastro ou filme de dissolução, etc.).

O agonista de TrkB é preferivelmente administrado via uma rota periférica apropria- da. Não obstante, é entendido que uma pequena porcentagem do agonista pode atravessar a barreira de sangue - cérebro e ser liberada para células do sistema nervoso central. Em alguns casos, a quantidade de agonista de TrkB administrada perifericamente que ganha acesso ao CNS é pequena (mesmo menos que 1%).

Uma característica da invenção é a administração direta de um agonista de TrkB a um sujeito mamífero sofrendo de uma doença autoimune. "Direta" significa que polipeptí- deos agonistas de TrkB, ou polinucleotídeos capazes de direcionar a expressão de tais poli- peptídeos, são liberados para um animal através de uma rota padrão de inoculação. Agonis- tas de TrkB podem ser liberados para animais em combinação com outros agentes farmaco- lógicos, incluindo imunossupressores tais como glicocorticóides, agentes citostáticos (por exemplo, agentes alquilantes, antimetabólitos, metotrexato, azatioprina e mercapto purina), anticorpos citotóxicos (por exemplo, anticorpos específicos de IL-2 e receptores de célula T), drogas que atuam sobre imunofilinas (por exemplo, ciclosporina, tacrolimus, sirolimus, ra- pamicina), interferons (por exemplo, IFN-β), opióides, proteínas de ligação de TNF (por e- xemplo, receptores circulantes), micofenolato, e outros agentes biológicos usados para su- pressão de respostas imunes de animal para anticorpos estranhos ou antígenos terapêuti- cos.

Uma vantagem do anticorpo agonista de TrkB sobre agonistas de TrkB ocorrendo naturalmente é que anticorpos tendem a ter meias-vidas circulantes relativamente longas comparadas a Iigantes - proteína circulante. Por exemplo, enquanto agonistas ocorrendo naturalmente podem requerer administração diária, anticorpos podem requerer administra- ção semanal. Uma outra vantagem é que anticorpos tendem a ter maiores afinidades de ligação e são mais seletivos para seus antígenos que receptores de células para seus Iigan- tes proteínas.

Tratamento com agonistas de TrkB pode ser combinado com tratamentos conven- cionais para esclerose múltiplae distúrbios relacionados. Drogas convencionais para o tra- tamento e gerenciamento de esclerose múltipla incluem mas não são limitadas: tratamentos ABC (isto é, Avonex-Betaseron/Betaferon-Copaxone) (por exemplo, interferon beta 1a (AVONEX, REBIF), interferon beta 1b (BETASERON, BETAFERON), e acetato de glatira- mer (COPAXONE); agentes quimioterapêuticos (por exemplo, mitoxantrona (NOVANTRONE), azatioprina (IMURAN), ciclofosfamida (CYTOXAN, NEOSAR), ciclospori- na (SANDIMMUNE), metotrexato, e cladribina (LEUSTATIN); corticosteróides e hormônio adreno - corticotrófico (ACTH) (por exemplo, metil prednisolona (DEPO-MEDROL, SOLU- MEDROL), prednisona (DELTASONE), prednisolona (DELTA_CORTEF), dexametasona (MEDROL, DECADRON), hormônio adreno-corticotrófico (ACTH), e corticotrofina (ACTHAR); mediação de dor (disaestesia) (por exemplo, carbamazepina (TEGRETOL, EPITOL, ATRETOL, CARBATROL), gabapentina (NEURONTIN), topiramato (TOPAMAX), zonisamida (ZONEGRAN), fenitiína (DILANTIN), desipramina (NORPRAMIN), amitriptilina (ELAVIL), imipramina (TOFRANIL, IMAVATE, JANIMINE), doxepina (SINEQUAN, ADAPIN, TRIADAPIN, ZONALON), protriptilina (VIVACTIL), cannabis e canabinóides sintéticos (MARINOL), pentoxifilina (TRENTAL), ibuprofeno (NEUROFEN), aspirina, acetaminofeno, e hidroxizina (ATARAX); e outros tratamentos (por exemplo, natalizumabe (ANTEGREN), a- Iemtuzumabe (CAMPATH-1H), 4-amino piridina (FAMPRIDINE), 3,4-diamino piridina, elipro- dil, imunoglobulina IV (GAMMAGARD, GAMMAR-IV, GAMIMUNE N, IVEEGAM, PANGLOBULIN, SANDOGLOBULIN, VENOGLOBULIN), pregabalin e ziconotide).

Kits de partes

A invenção também provê kits de partes (kits) para prática de processos da inven- ção. Kits incluem um agonista de TrkB apropriadamente isolado e esterilizado e instruções para uso de acordo com qualquer um dos processos da invenção aqui descrita. Generica- mente, estas instruções compreendem uma descrição de como administrar o agonista de TrkB. O kit ainda pode compreender instruções para identificação de animais em necessida- de de tratamento e para monitoração ou medição de eficácia de tratamento. As instruções genericamente incluem informação com relação a dosagem, esquema de dosagem (fre- qüência de administração), e rota de administração. As instruções fornecidas nos kits podem ser escritas ou legíveis em máquina / computador como na forma de um arquivo de dados ou planilha.

Os kits podem compreender também uma aparelhagem para administração de a- gonistas de TrkB, incluindo seringas, agulhas, cateteres, inaladores, bombas, esfregaços de álcool, gaze, aparelhagem de biópsia de CNS, anticorpos histológicos e manchas, etc. Os componentes do kit são esterilizados quando requerido. Kits também podem prover adicio- nais agentes farmacêuticos, incluindo mas não limitado a imunossupressores, como GA e dexcametasona. Kits podem incluir estampas de dados, embalagem à prova de violação, e etiquetas de identificação de freqüência de rádio (RFID)ou outras características de controle de inventário.

Exemplos

Os seguintes exemplos são providos para ainda ilustrarem a invenção. Adicionais aspectos da invenção serão aparentes para aqueles versadeos na técnica sem se fugir do escopo da invenção.

Exemplo 1 :Geração e separação de anticorpos agonistas de TrkB

Imunização para geração de anticorpos agonistas de anti-TrkB monoclonais

Um camundongo Balb/C foi injetado 5 vezes em um esquema regular com 8 μg de domínio extracelular TrkB humano como antígeno. Domínio extracelular de TrkB humana marcado com His (resíduos 31-430) foi expresso usando vetor pTriEx-2 Hygro (Novagen, Madison, Wl) em células 293. Domínio extracelular TrkB foi purificado usando resina Ni-NTA via instruções de fabricante (Qiagen, Valencia, CA). Para as primeira 4 injeções, antígeno foi preparado através de mistura de TrkB com sistema adjuvante RIBI e alúmen. Um total de 8 μg de antígeno foi dado via injeção para o cangote , as almofadas de patas e IP, aproxima- damente cada 3 dias no curso de 11 dias. No Dia 13, o camundongo sofreu eutanásia e o baço foi removido. Linfócitos foram fundidos com células 8653 para obtenção de clones hi- bridoma. Clones foram deixados crescer e então selecionados como positivos anti-TrkB a- través de seleção ELISA com ambos ELISA TrkB humano e rato.

Seleção ELISA de anticorpos anti-TrkB

Sobrenadantes de clones hibridoma crescendo foram selecionados para sua habili- dade de ligação de ambas TrkB humana e de rato. Os ensaios foram realizados com placas de 96 cavidades revestidas por toda noite com 100 μί. de proteína de fusão TrkB-Fc de rato ou humana 0,5 μg/mL. Excessos de reagentes foram lavados das cavidades entre cada eta- pa com PBS contendo TWeen-20 0,05%. Placas foram então bloqueadas com solução sali- na tamponada com fosfato (PBS) contendo BSA 0,5%. Sobrenadante foi adicionado às pla- cas e incubado em temperatura ambiente por 2 horas. Fc cabra anti-camundongo conjugado com peroxidase de raiz forte (HRP) foi adicionada para ligar-se aos anticorpos de camun- dongo ligados a TrkB. Tetrametil benzidina foi então adicionada como substrato para HRP para detectar quantidade de anticorpo de camundongo presente no sobrenadante. A reação foi interrompida e a quantidade relativa de anticorpo foi quantificada através de leitura de absorbância em 450 nm. Cinqüenta anticorpos foram mostrados positivos no ensaio ELISA. Entre estes anticorpos, cinco foram ainda testados e mostrados terem atividade agonista. Ver Tabela 2 abaixo.

Ensaio KIRA Este ensaio foi usado para selecionar anticorpos verificados positivos no ELISA pa- ra a habilidade de induzir ativação de tirosina cinase receptora para TrkB humana. Sadick et al., (1997) Experimental Cell Research 234:354-61. Utilizando uma linha de células estável transfectada com TrkB humana marcada com gD, anticorpos murinos purificados dos clones hibridoma foram testados para suas habilidades de ativação de receptor sobre a superfície das células similar à ativação vista com os Iigantes naturais, BDNF e NT-4/5. Ligante natural induziu auto fosforilação do domínio cinase do receptor de TrkB. Após as células serem ex- postas a várias concentrações dos anticorpos, elas foram Iisadas e um ELISA foi realizado para detectar fosforilação do receptor de TrkB. EC50 mostrada na Tabela 2abaixo e Figura 10) foi determinada para cada agonista de TrkB putativo e foi comparada àquela do Iigante natural NT-4/5.

Ensaio de sobrevivência de neurônio nodoso E15

Os neurônios de gânglio nodoso obtidos de embriões E15 foram suportados por BDNF, de modo que em concentrações saturantes do fator neurotróficoa sobrevivência foi próxima de 100% por 48 horas em cultura. Na ausência de BDNF, menos que 5%dos neu- rônios sobreviveram por 48 horas. Por isso a sobrevivência de neurônios nodosos E15 é um ensaio sensível para avaliar a atividade agonista de anticorpos anti-TrkB, isto é, anticorpos agonistas promoverão sobrevivência de neurônios nodosos E15.

Camundongos fêmeas Swiss Webster grávidas emparelhadas - tempo sofreram eutanásia por inalação de CO2. Os chifres uterinos foram removidos e os embriões em está- gio embriônico E15 foram extraídos. Os gânglios nodosos foram dissecados, então tripsini- zados, mecanicamente dissociados e revestidos em uma densidade de 200-300 células por cavidade em meio livre de soro, definido em placas de 96 cavidades revestidas com poli-L- ornitina e laminina. A atividade agonista dos anticorpos anti-TrkB foi avaliada em uma ma- neira dose - resposta em triplicatas com referência a BDNF humana. Após 48 horas em cultura as células foram submetidas a um protocolo imunocitoquímica automatizado realiza- do em uma estação de trabalho de manuseio de líquido Biomek FX (Beckman Coulter). O protocolo incluiu fixação (4% formaldeído, 5% sucrose, PBS), permeabilização (0,3% Triton X-100 em PBS), bloqueio de sítios de ligação não-específica (5% soro de cabra normal, 0,1% BSA, PBS) e incubação seqüencial com um anticorpo primário e secundário para de- tectar neurônios. Um anticorpo policlonal de coelho contra o produto gene proteína 9.5 (PGP9.5, Chemicon), que foi um marcador fenotípico neuronal estabelecido, foi usado como anticorpo primário. Alexa Flúor 488 cabra anti-coelho (Molecular Probes) foi usado como reagente secundário junto com o corante nuclear Hoechst 33342 (Molecular Probes) para marcar os núcleos de todas as células presente sna cultura. Aquisição de imagem e análi- ses de imagem foram realizadas sobre um Discovery-1/Genll Imager (Universal Imaging Croporation). Imagens foram automaticamente adquiridas em dois comprimentos de onda para Alexa Flúor 488 e Hoechst 33342, com o manchamento nuclear sendo usado como ponto de referência, uma vez que eis está presente em todas as cavidades, para o sistema de auto-foco baseado em imagem do Imager. Apropriados objetivos e número de sítios fei- tos imagem por cavidade foram selecionados para cobrir a inteira superfície de cada cavida- de. Análise de imagem automatizada foi fixada para contar o número de neurônios presen- tes em cada cavidade após 48 horas em cultura baseado em seu específico manchamento com o anticorpo anti-PGP9.5. Limitação cuidadosa da imagem e aplicação de filtros de sele- tividade baseada em intensidade de fluorescência e morfologia resultaram em uma conta- gem acurada de neurônios por cavidade. EC50s (mostradas na Tabela 1 abaixo e Figura 8) foram determinadas para cada anticorpo agonista de TrkB putativo e foram comparadas àquelas dos Iigantes naturais.

A tabela que se segue mostra os cinco anticorpos anti-TrkB identificados e suas ati- vidades sobre sobrevivência de neurônios e atividade de fosforilação sobre TrkB humana.

Tabela 1.Efeitos de cinco anticorpos anti-TrkB sobre sobrevivência de neurônios e fosforilação

Clone ELISA TrkB humana ELISA TrkB Rato Ensaio de sobrevivên- cia de neurônios de camundongo (EC50 estimada) Ensaio KIRA humano (EC50) Efeito sobre peso de camundon- go 18H6 + + 0,01 pM 0,5 nM Não testado 38B8 + + 0,2 pM 5 nM Reduz 36D1 + + 5 pM 5 nM Reduz 37D12 + + 50 pM 56 nM Sem altera- ção 23B8 + + 11 pM 50 nM Sem altera- ção

Injeções intracraniais de anticorpos agonistas de anti-TrkB para camundongos: Camundongos de criação retirada C57B6 machos (idade de 8-12 meses) foram ob- tidos de Charles River Laboratories (instalações Hollister) e deixados aclimatarem em um ambiente de temperatura / umidade controlados, com um ciclo de 12 horras de luz / escuro, com acesso ad Iibitum a alimento e água por pelo menos 5 dias antes de injeção. Cada ca- mundongo foi anestesiado com isoflurane, para grampear uma seção de pêlo acima do crâ- nio. O camundongo foi fixado sobre o instrumento de cirurgia estereotáxica (Kopf model 900), anestesiado, e mantido aquecido com uma almofada de aquecimento elétrico fixada para médio. Uma pequena incisão longitudinal - mediana de cerca de 1 cm de comprimento foi feita acima do crânio iniciando justo atrás de orelhas na direção dos olhos. O crânio foi revelado, e um espaço circular de cerca de 1 cm de diâmetro da superfície de crânio foi lim- po com um esfregaço de algodão para remoção de qualquer tecido conjuntivo. A superfície foi limpa com um esfregaço de algodão imerso em peróxido de hidrogênio 30%, para revelar a Bregma. Usando a ponta de broca como uma sonda para medir profundidade de crânio, o crânio foi ajustado horizontalmente e verticalmente para assegurar que ele estava nivelado antes de perfuração. Desvio de profundidade (zerado na Bregma), a partir de 0,5 mm mediai comparado a 0,5 mm lateral, assim como 0,5 mm anterior comparado a 0,5 mm posterior, foi minimizado para dentro de uma diferença de +/-0,05 mm. De acordo com o atlas de cérebro de camundongo (Franklin, K.B. J. & Paxinos, G., The Mouse Brain in Stereotaxic Coordina- tes. Academic Press, San Diego, 1997), coordenadas para uma injeção intrahipotalâmica lateral, simples, foram como se segue: 1,30 mm posterior a partir de Bregma; -0,5 mm a partir de linha média; profundidade 5,70 mm a partir da superfície do crânio (na Bregma). Um pequeno orifício foi perfurado através do crânio, evitando contato com o cérebro. A bro- ca foi substituída com uma agulha medida 26 chanfrada ligada a uma seringa Hamilton (mo- dei 84851) e retornada para as mesmas coordenadas. 2 μΙ_ de composto foram injetados no hipotálamo lateral incrementalmente no curso de 2 minutos. A agulha foi mantida nesta po- sição por 30 segundos após injeção, então elevada 1 mm. Após outros 30 segundos, a agu- lha foi elevada 1 mm adicional. 30 segundos depois, a agulha foi completamente removida. A incisão foi então fechada e mantida junta com grampos de ferimento de 2-9 mm (Autoclip, Braintree Scientific, Inc.). A injeção foi realizada no dia 0. Peso de corpo e tomada de ali- mentoforam monitoradas até dia 15.

Como mostrado na Tabela 1 (acima,), injeções intracraniais de anticorpo 38B8 e 36D1 na dose especificada reduziram significantemente peso de corpo e tomada de alimen- to em camundongos. O anticorpo IgG controle e 23B8, dados na dose especificada, não afetam significantemente tanto a tomada de alimento como o peso de corpo. A linhagem hibridoma murino que produz anticorpo 38B8 foi depositada no American Type Culture Col- lection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, em 21 de novembro de 2007, e recebeu o ATCC Deposit Number PTA-8766.

Exemplo 2: Identificação de agonistas TrkB Agonistas de TrkB (tais como anticorpos) podem ser identificados usando proces-

sos reconhecidos na técnica, incluindo um ou mais dos seguintes processos. Por exemplo, o ensaio de ativação de receptor cinase (KIRA) descrito nas patentes US 5 766 863 e 5 891 650 pode ser usado. Este ensaio tipo ELISA é apropriado para medição qualitativa ou quan- titativa de ativação de cinase através de medição de autofosforilação do domínio cinase de uma tirosina cinase proteína receptora (rPTK, por exmeplo, receptor de Trk), assim como para identificação e caracterização de potencial agonista ou antagonistas de uma rPTK se- lecionada. O primeiro estágio do ensaio envolve fosforilação do domínio cinase de um re- ceptor de cinase, no presente caso um receptor de TrkB1 onde o receptor está presente na membrana de célula de uma célula eucariótica. O receptor pode ser um receptor endógeno ou ácido nucléico codificando o receptor, ou uma construção receptora, pode ser transfor- mada na célula. Tipicamente, uma primeira fase sólida (por exemplo, uma cavidade de uma primeira placa de ensaio) é revestida com uma população substancialmente homogênea DE TAIS CÉLULAS (USUALMENTE UMA LINHA DE CÉLULAS mamíferas) de modo que as células aderem à fase sólida. Freqüentemente, as células são aderentes e pelo que aderem naturalmente à primeira fase sólida. Se uma "construção receptora" é usada, ela usualmente compreende uma fusão de um receptor de cinase e um polipeptídeo bandeira. O polipeptí- deo bandeira é reconhecido pelo agente de captura, freqüentemente um anticorpo de captu- ra, na parte ELISA do ensaio. Um analito, tal como um agonista candidato, é então adicio- nado às cavidades tendo as células aderentes, de modo que o receptor de tirosina cinase (por exemplo, receptor de TrkB) é exposto a (ou contactado com) o analito. Este ensaio permite identificação de Iigantes agonistas par ao receptor de tirosina cinase de interesse (por exemplo, TrkB). Seguindo exposição ao analito, as células aderentes são solubilizadas usando um tampão de Iise (que tem ali um detergente solubilizante) e agitação suave, pelo que liberando Iisado de célula que pode ser submetido à parte ELISA do ensaio diretamente, sem a necessidade de concentração ou clarificação do Iisado de células.

O Iisado de células assim preparado então está pronto para ser submetido ao está- gio ELISA do ensaio. Como uma primeira etapa no estágio ELISA, uma segunda fase sólida (usualmente uma cavidade de uma placa de microtitulação ELISA) é revestida com um a- gente de captura (freqüentemente um anticorpo de captura) que se liga especificamente ao receptor tirosina cinase, ou, no caso de uma construção receptora, ao polipeptídeo bandeira. Revestimento da segunda fase sólida é realizado de modo que o agente de captura adere à segunda fase sólida. O agente de captura é genericamente um anticorpo monoclonal, mas, como é descrito nos presentes exemplos, anticorpos policlonais ou outros agentes também podem ser usados. O Iisado de células obtido é então exposto a, ou contactado com, o a- gente de captura aderente de modo que o receptor ou construção receptora adere a (ou é capturada em) segunda fase sólida. Uma etapa de lavagem é então realizada, de modo a remover Iisado de célula não-ligado, deixando o receptor capturado ou construção recepto- ra. O receptor capturado ou aderindo ou construção receptora é então exposto a, ou conta- tado com, um anticorpo anti-fosfotirosina que identifica resíduos tirosina fosforilados no re- ceptor de tirosina cinase. Em uma realização preferida, o anticorpo anti-fosfotirosina é con- jugado (direta ou indiretamente) a uma enzima que catalisa uma mudança de cor de um reagente de cor não-radioativo. Da mesma maneira, fosforilação do receptor pode ser medi- da por uma subseqüente mudança de cor do reagente. A enzima pode ser diretamente liga- da ao anticorpo anti-fosfotirosina, ou uma molécula de conjugação (por exemplo, biotina) pode ser conjugada ao anticorpo anti-fosfotirosina e a enzima pode ser subseqüentemente ligada ao anticorpo anti-fosfotirosina via a molécula de conjugação. Finalmente, ligação ao anticorpo anti-fosfotirosina ao receptor capturado ou construção receptora é medida, por exemplo, por uma mudança de cor no reagente de cor.

Seguindo identificação inicial, a atividade agonista de um candidato (por exmeplo,

um anticorpo monoclonal anti-TrkB) pode ser ainda confirmada e refinada através de bioen- saios, conhecidos para teste de atividades biológicas alvejadas. Por exmeplo, a habilidade de um candidato agonizar TrkB pode ser testada no ensaio de crescimento de neurito PC12 usando células PC12 transfectada com TrkB de inteiro comprimento (Jian et al., Cell Signal. 8:365-70, 1996). Este ensaio mede o crescimento de processos de neurito por células feoci- tocroma (PC12) de rato em resposta a estimulação através de apropriados ligantes. Estas células expressam TrkA endógena e por isso são responsivas a NGF. Entretanto, elas não expressam TrkB endógena e por isso são transfectadas com construção de expressão de TrkB de modo a elicitarem resposta para agonistas de TrkB. Após incubação de células transfectadas com o candidato, crescimento de neurito é medido, e por exemplo, células com neuritos excedendo 2 vezes o diâmetro da célula são contadas. Candidatos (tais como anticorpos anti-TrkB) que estimulam crescimento de neurito em células PC12 transfectadas demonstram atividade agonista de TrkB.

A ativação de TrkB também pode ser determinada através do uso de vários neurô- nios em específicos estágios de desenvolvimento embriônico. Neurônios apropriadamente selecionados podem ser dependentes de ativação de TrkB para sobrevivência, e assim é possível determinar a ativação de TrkB seguindo a sobrevivência destes neurônios in vitro. Adição de candidatos a culturas primárias de apropriados neurônios conduzirá a sobrevi- vência destes neurônios por um período de pelo menos vários dias se os candidatos ativam TrkB. Isto permite a determinação da habilidade do candidato (tal como um anticorpo anti- TrkB) para ativar TrkB. Em um exemplo deste tipo de ensaio, o gânglio nodoso de embrião de camundongo E15 é dissecado, dissociado e os resultantes neurônios são revestidos em uma placa de cultura de tecido em baixa densidade. Os anticorpos candidatos são então adicionados aos meios e as placas incubadas por 24-48 horas. Após este tempo, a sobrevi- vência dos neurônios é avaliada através de qualquer um de uma variedade de processos. Amostras que receberam um agonista tipicamente mostrarão uma aumentada taxa de so- brevivência sobre amostras que recebem um anticorpo controle, e isto permite a determina- ção da presença de um agonista. Ver, por exemplo, Buchman et al. (1993) Development 118(3):989-1001.

Agonista de TrkB pode ser identificado por sua habilidade para ativar sinalização à

jusante em uma variedade de tipos de células que expressam TrkB1 tanto naturalmente co- mo após transfecção de DNA codificando TrkB. Esta TrkB pode ser humana ou outra TrkB de mamífero (tal como um roedor ou primata). A cascata de sinalização à jusante pode ser detectada por mudanças para uma variedade de parâmetros bioquímicos ou fisiológicos da célula expressando TrkB, tal como o nível de expressão de proteína ou de fosforilação de proteína de proteínas ou mudanças para o estado de crescimento ou metabólico da célula (incluindo sobrevivência neuronal e/ou crescimento de neurito, como aqui descrito). Proces- sos de detecção de relevantes parâmetros bioquímicos ou fisiológicos são conhecidos na técnica.

Exemplo 3:Determinação de afinidade de ligação de anticorpo

Determinação de afinidade de ligação de anticorpos a TrkB pode ser realizada atra- vés de medição de afinidade de ligação de fragmentos Fab monofuncionais do anticorpo. Para obter fragmentos Fab monofuncionais, um anticorpo (por exemplo, IgG) pode ser cliva- do com papaína ou expresso recombinantemente. A afinidade de um fragmento Fab anti- TrkB de um anticorpo pode ser determinada por ressonância plasmon de superfície (BIAco- re3000 surface plasmon resonance (SPR) system, BIAcore, INC, Piscaway, NJ). Chips CM5 podem ser ativados com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetil amino propil) carbodiimida (EDC) e N-hidroxi succinimida (NHS) de acordo com instruções do fornecedor. Proteína de fusão TrkB-Fc humana ("hTrkB") (ou qualquer outra TrkB, tal como TrkB de rato) pode ser diluída em acetato de sódio 10 mM pH 5,0 e inejtada sobre o chip ativado em uma concentração de 0,0005mg/mL. Usando tempo de escoamento variável através de canais de chip individuais, duas faixas de densidade de antígeno podem ser obtidas: 200-400 unidades de resposta (RU) para detalhados estudos cinéticos e 500-1000 RU para ensaios de seleção. O chip pode ser bloqueado com etanolamina. Estudos de regeneração mostraram que uma mistura de tampão de eluição de Pierce (Produto N0 21004, Pierce Biotechnology, Rockford, IL) e NaCI 4 M (2:1) remove efetivamente o Fab ligado enquanto mantendo a atividade de hTrkB sobre o chip por acima de 200 injeções. Tampão HBS-EP (HEPES 0,01 M, pH 7,4, 0,15(?) NaCI, 3 mM EDTA, 0,005% Tensoativo P29) é usado como tampão de corrida para os en- saios BIAcore. Diluições seriais (0,1-1 Ox K0 estimada) de amostras Fab purificadas são inje- tadas por 1 minuto em 100 μί/ιηίηυίο e tempos de dissociação de até 2 horas são permiti- dos. As concentrações das proteínas Fab são determinadas por ELISA e/ou eletroforese SDS-PAGE usando um Fab de concentração conhecida (como determinada por análise de aminoácido) como um padrão. Taxas de associação cinética (Kon) e taxas de dissociação (Koff) (genericamente medidas a 25°C) são obtidas simultaneamente através de adaptação de dados para um modelo de ligação Langmuir 1:1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6:99-110) usando o programa BIAevaIuation. Valores de constante de dissociação de equilíbrio (K0) são calculados como KoffZKon.

Exemplo 4:Análises cinéticas de interações de Iigante / receptor, como medidas por

Biacore Processo Genérico:

Análise de interação foi realizada a 25°C usando um instrumento Biacore 3000 e- quipado com um chip sensor CM5 (Biacore AB1 Uppsala, Sweden). Tampão de corrida HBS- EP (usado para receptores imobilizantes) foi adquirido de Biacore, junto com reagentes de acoplamento de amina (NHS, EDC, acetato, pH 4,5, e etanolamina). Receptores humanos recombinantes fundidos - Fc (TrkA, TrkB, TrkC, e P75) e Iigantes nativos (NGF, BDNF, NT4/5, e NT3) foram adquiridos de R&D Systems ou preparados.

!mobilização de receptores:

Receptores (3 por chip) foram imobilizados sobre chips sensores CM5 em níveis baixos (tipicamente 500 RU1 ou 4 fmol/mm2), deixando uma célula de fluxo não-modificada (por chip) para servir como uma superfície de referência. Um protocolo de acoplamento de amina padrão foi usado em tampão de corrida HBS-EP em 5 μΙ_/ιτιίηυίο e envolveu três eta- pas. Em resumo, isto envolveu três etapas. Primeiro, células de fluxo foram ativadas com uma injeção de 7 minutos de uma mistura preparada recentemente de EDC 200 mM em NHS 50 mM; esta etapa converteu os grupos ácido carboxílico do chip a ésteres reativos. A seguir, receptores foram diluídos para -10 μg/mL em tampão acetato de sódio 10 mM em pH 4,5 e acoplados ao chip até o desejado nível ter sido atingido. Finalmente, excesso de ésteres reativos foi bloqueado com uma injeção de 7 minutos de HCI-sódio etanolamina 1 M(pH 8,5). Análise de ligantes:

Ligantes (NGF, BDNF, NT4/5, e NT3) foram diluídos serialmente em tampão de cor- rida (Hepes 10 mM (pH 7,4), (NH4)2SO4 150 mM, CaCI2 1,5 mM, EGTA 1 mM, e Tween-20 0,005% (v/v) para concentrações de 0,08-250 nM em incrementos de 5 vezes. O fragmento Fab de anticorpo 200.38B8 (38B8) foi diluído a partir de 0,7-480 nM em incrementos de 3- vezes. Amostras foram injetadas por 30 segundos em 100 μΙ_/ minuto permitindo tempos de dissociação de até 10 minutos. Após cada ciclo de ligação, superfícies de receptor foram regeneradas com um coquetel levemente ácido (glicina-HCI 10 mM (pH 4,0), NaCI 500 mM, e EDTA 20 mM). Injeções em duplicata confirmaram que este teste foi reproduzível. Cons- tantes de taxa cinética (Kon e Koff) foram determinadas através de adaptação de dados de ligação globalmente a um modelo de transporte de massa e afinidades de ligação foram calculadas de sua razão, KD=KoffZKon.

Resultados:

Maioria de interações Iigante / receptor no painel foi caracterizada por limitada difu- são, rápida sobre taxas, que foram além de resolução de Biacore (kon~1x107 1/Ms). Uma exceção notável foi ProNGF, que tipicamente mostrou lentas taxas on. Taxas off foram mais variáveis, por exemplo, interações de ProNGF ou NGF maduro com TrkA tiveram taxas off muito lentas (T1/2>1 hora), enquanto a interação NT3/TrkA decaiu dentro de segundos (T1/2=9 s). A interação 38B8-Fab/TrkB teve uma taxa off bifásica, assim somente a fase inicial de decaimento foi adaptada ao modelo. Receptores foram revestidos em baixos níveis sobre o chip de modo a espaçar os mesmos bastante distanciados (em média) de modo que Iigantes diméricos não possam ponte-cis inter-molecularmente entre moléculas receptoras adjacentes. É improvável que um Iigante dimérico possa ter ponte intra-molecularmente en- tre dois braços de uma molécula de receptor fundida-Fc, devido a restrições estéreas. Atra- vés de promoção de condições onde Iigantes foram forçados a ligarem-se via somente um de seus sítios de ligação disponíveis, nós minimizamos questões de avidez e sentimos justi- ficados na adaptação de nossos dados a um modelo de ligação 1:1 simples.

Tabela 2:Análise cinética global (interações são classificadas de afinidade alta para

baixa)

Ligante / Receptor Kon (1/Ms) Koff (1/s) KD (nM) NGF/TrkA >1 e 7 (1,88+ 0,02)e -4 <0,018+0,009 ProNG F/TrkA 7,16 e 5 1,41 e-5 0,02 BDNF/TrkB >1 e 7 1,3 e-3 <0,034 NT45/TrkB >1 e 7 (2,0 + 0,2)e 3 <0,20+ 0,02 NT3/TrkC >1 e 7 0,0151 <0,09 NGF/P75 >1 e 7 (4,9+ 0,5)e-2 <1,7+0,2 NT3/P75 >1 e 7 0,164 <1,7 BDNF/P75 8,38 e 6 0,0174 <2,1 NT3/TrkB >1 e 7 (4,4+ 0,8)e-2 <4,4+ 0,8 NT45/TrkA (2,1+ 0,6) e 6 (4 + 2)e-2 17 + 11 NT3/TrkA (4,4+ 1,0) e 6 (8 + 2) e-2 18 + 6 38B8-Fab/TrkB (1,4+0,9) e 5 (6+3)e-3 46 + 10 NT45/P75 3,45 e 6 0,305 88 ProNGF/P75 6,58 e 5 0,0858 130 ProNGF/TrkB - - NB ProNGF/TrkC - - NB NGF/TrkB - - NB NGF/TrkC - - NB DBN F/TrkA - - NB BDNF/TrkC - - NB NT45/TrkC - - NB 38B8-Fab/TrkA - - NB 38B8-Fab/TrkC - - NB 38B8-Fab/P75 - - NB Notas:

1."média +/- StDev" (isto é, desvio padrão) são dadas para aquelas interações que foram analisadas em dois experimentos independentes.

2.Taxas on em itálico mostram taxas off muito rápidas que estão na resolução do

Biacore (>1e7 1/Ms) porque elas abordam o limite de difusão. Nós usamos esta como um valor de corte, que significa que a KD total somente pode ser cotada como um limite.

3.NB = nenhuma ligação foi detectada para certos emparelhamentos de Iigante / receptor (consistente com a especificidade conhecida a partir da literatura). Exemplo 5:Administração direta de um agonista de TrkB reduz morbidez em ani-

mais

Em experimentos realizados em suporte da presente invenção, administração direta de um agonista de TrkB foi mostrada reduzir morbidez e dano de tecido de CNS em animais com uma doença autoimune específica de CNS (Figuras 1A e 1B). Uma forma recombinante do agonista de TrkB ocorrendo naturalmente NT4 foi produzida como descrito na publicação de pedido de patente US 2005/0209148 e administrada a camundongos fêmeas C57BL/6 seguindo indução com MOG (dia 0).

Animais foram administrados com NT4 (10 mg/kg, η = 8), diariamente, começando dias após indução com MOG (Figura 1A). Veículo foi administrado a animais controles (n = 8). Animais foram classificados para morbidez como se segue: 0 = normal; 1 = cauda mo- le; 2 = moderada fraqueza de membro posterior; 3 = fraqueza de membro posterior modera- damente severa (animal ainda pode andar com dificuldade); 4 = severa fraqueza de membro posterior (animal pode mover seus membros posteriores mas não pode andar); 5 = completa paralisia de membros posteriores; e 6 = morte. Os animais tratados com NT4 mostraram morbidez significantemente reduzida comparados a animais controles. Este resultado de- monstrou que um agonista de TrkB foi efetivo na diminuição de progressão de EAE crônica.

A Figura 1B mostra a morbidez de animais tratados diariamente com NT4 durante diferentes períodos de tempo seguindo indução com MOG. Animais foram tratados com IgG controle (n = 9), NT4 a partir de dia 3 a dia 9 (n = 8), ou NT4 a partir de dia 9 ao dia 15 (n = 8). Ambos esquemas de administração foram efetivos na redução de morbidez de animais. A proteção proporcionada por NT4 quando administrada durante o período de tempo inicial (isto é, o "tratamento de pulso" inicial) é pelo menos tão boa (se não melhor) quanto quando administrada durante o período de tempo posterior. Estes resultados indicam que tratamento com o agonista de TrkBnão tem de continuar para o momento de início de sintomas de mo- do que o tratamento seja efetivo. Ativação de TrkB pode estar alvejando etapas relativamen- te à montante na indução de EAE.

Exemplo 6:Identificação de anticorpos agonistas de TrkB altamente seletivos Os experimentos e observações conduzindo à identificação de anticorpos agonistas de TrkB são descritos em Exemplos 1-4. Ainda caracterização de um dos anticorpos, anti- corpo 38B8, revelou que o anticorpo foi altamente seletivo para TrkB1 enquanto mostrando ligação nominal para TrkA1 TrkC1 ou p75 (Figura 2). As afinidades relativas do fragmento Fab de 38B8 para TrkA1 TrkB1 TrkC1 e p75 foram comparadas àquelas dos agonistas ocor- rendo naturalmente NGF1 BDNF1 e NT4. Cada painel na Figura 2 é um gráfico mostrando ligação relativa versus tempo. Anticorpo 38B8 foi específico para TrkB e não mostrou signifi- cante ligação para as outras tirosina cinases receptoras ensaiadas. 38B8 foi mesmo mais seletivo para TrkB que os agonistas ocorrendo naturalmente BDNF e NT4, que mostraram alguma reatividade cruzada. Como esperado, NGF demonstrou pequena ligação a TrkB e ligou-se preferencialmente a TrkA e o receptor de neurotrofina p75. A afinidade de ligação de 38B8 foi determinada ser 46+/-10 nM. Uma análise cinética destas interações de Iigante - receptor (incluindo dados de Kon, Koff e Kd) é provida no exemplo 4, particularmente na Ta- bela 2.

BDNF e NT4 parecem ter maiores afinidades para TrkB que o agonista de anticorpo

38B8. Entretanto, os experimentos de ligação foram realizados com as formas diméricas dos Iigantes ocorrendo naturalmente e uma forma monomérica de Fab 38B8. Em adição, anti- corpos genericamente têm meias-vidas circulantes muito mais longas que fatores de cres- cimento permitindo os mesmos serem efetivos mesmo enquanto tendo menores afinidades de ligação para seu receptor alvo. O anticorpo agonista de TrkB foi usado para ainda estu- dos.

Exemplo 7:Um anticorpo agonista de TrIB é efetivo em redução de morbidez em doença autoimune

Experimentos animais mostraram que o anticorpo agonista de TrkB proporcionou significante proteção contra morbidez de EAE comparado a uma imunoglobulina controle (Figura 3). Seguindo indução com MOG, os camundongos foram tratados com 5 mg/kg de anticorpo agonista (38B8, n=9) ou uma IgG controle (n=9), administrada nos dias 9 e 16. O anticorpo agonista de TrkB também foi efetivo quando administrado tão tarde quanto 16 dias seguindo indução com MOG, e após o início de sintomas clínicos (Figura 4). Administração posterior, por exemplo, 18 dias seguindo indução, foi menos efetiva na redução de morbidez (Figura 5A). A diferença em sintomas clínicos seguindo tratamento posterior não foi signifi- cante baseado em análise ANOVA de duas vias.

Em outros animais, a administração de acetato de glatiramer (GA, COPAXONE, TYSABRI) 22 dias seguindo indução com MOG foi efetiva na redução de morbidez (Figura 5B). Estes resultados sugerem que o mecanismo de ação do agonista de TrkB é diferente daquele de GA, e outras drogas MS correntes.

O anticorpo agonista de TrkB foi comparado a uma outra droga corrente para o tra- tamento de MS, dexametasona. A Figura 6A mostra um gráfico mostrando morbidez em animais seguindo a administração de um anticorpo agonista de TrkB 38B8 (5 mg/kg, sema- nalmente no dia 9 e dia 16) ou dexametasona (4 mg/kg) ou veículo etanol (controle), diaria- mente nos dias 3-12. Os resultados demonstram que os efeitos benéficos do agonista de TrkB foram similares àqueles do imunossupressor dexametasona. Animais tratados com agonista de TrkB tenderam a perder peso comparados a animais controles (Figura 6B).

Os efeitos benéficos do anticorpo agonista de TrkB foram dependentes de dose. As Figuras 7A e 7B mostram a diferença em morbidez de animal seguindo a administração de 1 (n=8) ou 5 mg/kg (n=9) de 38B8 ou 5 (n=10) e 10 mg/kg (n=9) de 38B8. Os resultados de- monstraram que 5 mg/kg de anticorpo agonista proporcionam mais proteção de morbidez (isto é, menos morbidez) que 1 mg/kg, enquanto 10 mg/kg ainda reduziu morbidez compa- rado a 5 mg/kg. O aumento em proteção foi menos pronunciado nas maiores dosagens, su- gerindo que adicional administração de agonista de TrkB pode ser de valor terapêutico mar- ginal.

Exemplo 8:Anticorpos agonistas de TrkB e NTs protegem células neuronais em cul-

tura

NTs foram mostradas promoverem sobrevivência neuronal usando um ensaio de sobrevivência de célula neurônio in vitro (Davies, A., et al., (1993) Neuron 11565-74). Um ensaio similar foi usado para demonstrar que anticorpos agonistas de TrkB afetam células neuronais em uma maneira consistente com agonistas de TrkB ocorrendo naturalmente (ver exemplo 1). Virtualmente todos os neurônios em uma cultura controle (isto é, sem fatores neurotróficos) morrem dentro de 48 horas. Entretanto, 60-80% de neurônios cultivados na presença de BDNF1 NT3, NT4 ou NGF sobrevivem por 48 horas (Id.).

Em experimentos realizados em suporte da invenção, crescentes quantidades dos anticorpos agonistas de TrkB 38B8, 23B8, 36D1, 37D12 e 19H8 (ver, por exemplo, Exemplo 1, incluindo Tabela 1), foram adicionadas a culturas de neurônios como descrito anterior- mente (Figura 8). Com alguma variação, adição de crescentes quantidades dos anticorpos agonistas de TrkB resultou em aumentada sobrevivência de neurônios (até acima de 75% na faixa de 10-100 pM para 38B8 e até acima de 100% na faixa de 0,1-10 pM para 19H8). O valor EC50 de anticorpo 38B8 no ensaio de sobrevivência de neurônio foi 0,2 pM. Os valores de EC50 para 38B8, 23B8, 36D1, e 37D12 η o ensaio de sobrevivência de neurônio, assim como os valores EC50 para estes anticorpos no ensaio KIRA humano e seu efeito sobre pe- so de corpo de animal (uma resposta reconhecida para agonistas de TrkB) são discutidos no exemplo 1 e resumidos na Tabela 1. Notar que anticorpo 23B8, com um maior valor de EC50 de 11 pM, falhou para produzir um efeito sobre peso de corpo de animal, sugerindo que um valor de EC50 abaixo de 11 pM é requerido para atividade biológica de agonista de TrkB. Anticorpo 36D1, com um valor de EC50 de 5 pM, produziu um efeito sobre peso de corpo de animal. Estes dados são consistentes com resultados reportados para NTs1 demonstrando que o anticorpo agonista de TrkB affeta células neuronais em uma maneira consistente com agonistas de TrkB ocorrendo naturalmente.

Exemplo 9:Agonistas de TrkB não funcionam primariamente através de imunossu-

pressão

Drogas correntes para o tratamento de MS (incluindo GA e dexametasona) são i- munomoduladoras, que exibem efeitos imunossupressivos e outros com relação a resposta imune. Para determinar se o efeito terapêutico dos agonistas de TrkB também estava no nível de supressão imune, animais foram tratados com o anticorpo agonista de TrkB (38B8) ou veículo somente (controle), e os níveis de anticorpos específicos - MOG (mielina) de diferentes isotipos (isto é, IgGI, lgG2a, lgG2b, lgG3, e IgM) foram medidos (Figura 9). Em- bora alguma variação em níveis de anticorpos específicos - MOG fosse observada seguindo tratamento com agonista de TrkB1 ela não parece ser suficiente para explicar a acentuada redução em morbidez de animal. Embora não atribuindo um particular mecanismo para a presente invenção, os resultados sugerem que agonistas de TrkB não funcionam através de supressão de produção de anticorpos anti-MOG e, por isso, não parecem funcionar como imunossupressores convencionais.

Para determinar se agonistas de TrkB inibem a habilidade de células-T e células-B serem estimuladas por mielina, um ensaio de proliferação de esplenócitos foi usado para medir a habilidade de MOG para estimular células de baço isoladas na presença de um a- gonista de TrkB. Para comparação, esplenócitos foram estimulados com MOG na presença do imunossupressor dexametasona.

Células de baço de animais não-tratados (controles) induzidos com MOG (n=9) ou animais tratados com anticorpo (38B8) agonista de TrkB induzidos com MOG foram cultiva- das in vitro na presença de MOG sozinha (0), MOG em combinação com o anticorpo agonis- ta de TrkB (38B8; 50 μΙ./mg), ou dexametasona em uma de duas diferentes concentrações (10"8 M e 10"5M). Referindo-se à Figura 10, as várias quantidades de estimulação de esple- nócitos em relação a esplenócitos que não foram estimulados in vitro com MOG são indica- das no eixo y.

A presença do anticorpo agonista de TrkB não teve efeito aparente sobre estimula-

ção de esplenócitos, como também foi o caso com a menor concentração do imunossupres- sor dexametasona. Dexametasona interferiu com estimulação de MOG na maior concentra- ção de 10"5M.

No total, esplenócidos obtidos de animais tratados com agonista de TrkB respon- dem a estimulação com MOG em uma maneira consistente com animais tratados com con- trole, indicando que animais tratados com o agonista de TrkB ret~em a habilidade para pro- duzir respostas de célula-B e/ou célula-T anti-MOG normais. Adicionalmente, esplenócitos obtidos de animais tratados com agonista de TrkB e animais controles respondem similar- mente à presença do agonista de TrkB no meio de cultura. Estas observações ainda suge- rem que mecanismos de ação do imunossupressor dexametasona e agonistas de TrkB são diferentes, e que o mecanismo de ação de agonistas de TrkB não está primariamente no nível de proliferação de leucócitos.

Exemplo 10:Agonistas de TrkB bloqueiam invasão de célula inflamatória do CNS e reduzem desmielinização

Análise histológica foi realizada para entender melhor o mecanismo através do qual agonistas de TrkB mediam proteção em animais. Seções de cordão espinhal foram prepara- das a partir de animais controles e tratados com anticorpo (38B8) agonista de TrkB1 e então manchadas com Luxol fast blue para manchar mielina, e violeta cresila para manchar corpos de célula (Figura 11). Em animais controles, o manchamento mostrou uma região de inva- são de leucócitos e destruição de células contra um fundo de células neuronais expressando mielina. Reduzida invasão de leucócitos foi observada em seções preparadas de animais tratados com o agonista de TrkB. Alguns animais tratados com agonista de TrkB virtualmen- te não mostraram evidência de invasão de leucócitos do CNS.

Identificação das células invasoras foi realizada usando anticorpos específicos para dois marcadores de leucócitos, CD3 presente sobre células-T e CD68 presente sobre ma- crófagos. A Figura 12 mostra os resultados de manchamento com o anticorpo CD3. Nume- rosas regiões pontuais manchadas brilhantes são aparentes, particularmente nas mesmas áreas que mancharam de modo escuro com violeta cresila. A seção de cordão espinhal ob- tida de camundongos tratados com agonista de TrkB mostraram significantemente menos manchamento, indicando que invasão de células-T foi substancialmente reduzida em ani- mais tratados. Seções de cordão espinhal também foram manchadas com o anticorpo espe- cífico para o marcador CD68 associado com monócitos (Figura 13). As seções preparadas a partir de camundongos controles mancharam mais fortemente que as seções de camundon- gos tratados com agonistas de TrkB, particularmente nas mesmas regiões que mancharam fortemente com violeta cresila e o anticorpo e o anticorpo específico de CD3. Tais observa- ções indicaram que tecidos de cordão espinhal de animais tratados com agonista de TrkB mostram invasão de monócitos e células-T substancialmente reduzida quando comparados com animais controles.

As seções de cordão espinhal foram manchadas com Luxol Fast Blue para medir desmielinização. Os cérebros de camundongos controles mostraram regiões de severa desmielinização (isto é, a ausência de manchamento, como indicado pelas setas pretas na Figura 14) correspondendo a áreas com pesada invasão de linfócitos, que não foram apa- rentes em camundongos tratados com o agonista de TrkB. Regiões de severa desmieliniza- ção e/ou morte de neurônios não foram observadas em seções de animais tratados com agonistas de TrkB. Tomados juntos, os resultados do manchamento histoquímico de seções de tecido de CNS demonstraram que tratamento com agonista de TrkB reduz invasão de linfócitos e monócitos do CNS.

Ambos agonistas de TrkB ocorrendo naturalmente e artificiais são efetivos na dimi- nuição de progressão de EAE. O agonista ocorrendo naturalmente NT4 e um anticorpo ago- nista foram ambos efetivos ns diminuição de progressão de doença. O anticorpo agonista demonstrou a maior seletividade para TrkB e foi usado para ainda investigar o mecanismo através do qual agonistas de TrkB afetam progressão de EAE. Agonistas de TrkB foram efe- tivos quando administrados antes e após vários dias do início de sintoma de EAE (usual- mente dia 12 ou 13 para estes animais particulares). Administração até 16 dias seguindo indução com MOG (ou cerca de 4 dias seguindo o início de sintomas) foi efetiva na redução de morbidez. Os efeitos benéficos de agonistas de TrkB são dependentes de dosagem, com reduzida morbidez sendo associada com crescentes dosagens de agonistas de TrkB. Expe- rimentos histoquímicos mostram que agonistas de TrkB reduzem invasão de tecidos de CNS por células-T e monócitos. Manchamento para mielina mostrou reduzido dano para células de nervo em animais tratados com agonista de TrkB.

Diferente de outras drogas testadas nos ensaios, agonistas de TrkB não funcionam principalmente através de imunossupressão. Isto foi evidenciado na observação de que a- gonistas de TrkB não afetam a produção de anticorpos autoimunes específicos de MOG. Em adição, esplenócitos isolados de animais induzidos com MOG que foram tratados com ago- nistas de TrkB retiveram a habilidade para serem estimulados por MOG in vitro. Assim, ago- nistas de TrkB funcionam em uma maneira diferente daquela de outros compostos, como GA e dexametasona.

É entendido que os exemplos e realizações aqui descritos são somente para pro- pósitos ilustrativos e que várias modificações ou mudanças À luz das mesmas serão sugeri- das para aqueles versados na técnica e são para serem incluídas dentro do espírito e esco- po deste pedido de patente. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui cita- dos são pelo que incorporados por referência em sua totalidade para todos os propósitos na mesma extensão como se cada individual publicação, patente ou pedido de patente fosse específica e individualmente indicado para ser assim incorporado por referência.

Claims (10)

1. Uso de um agonista de TrkB1 CARACTERIZADO pelo fato de ser na fabricação de um medicamento usado para tratamento de um distúrbio autoimune afetando o sistema nervoso central em um mamífero.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dis- túrbio autoimune é encéfalomielite autoimune experimental.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dis- túrbio autoimune é esclerose múltipla.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o a - gonista de TrkB é um agonista de TrkB ocorrendo naturalmente.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o a- gonista de TrkB ocorrendo naturalmente é NT4.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo ffato de que o agonista de TrkB ocorrendo naturalmente é BDNF.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o a - gonista de TrkB é um anticorpo.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o a- gonista de TrkB é um fragmento de anticorpo ou seu derivado.

9. Anticorpo agonista de TrkB monoclonal isolado, CARACTERIZADO pelo fato de ser produzido pela linhagem hibridoma depositada sob ATCC Deposit Number PTA-8766.

10. Linhagem hibridoma, CARACTERIZADA pelo fato de ser depositada sob ATCC Deposit Number PTA-8766.