KR20090091181A - 자가면역 장애의 치료를 위한 티로신 수용체 키나아제 ｂ 작용제 - Google Patents

Abstract

티로신 수용체 키나아제(TrkB) 작용제는 다발경화증과 같은 자가면역 질환에서 중추 신경계의 백혈구 침입을 감소시키기 위해 제공된다. TrkB 작용제는 천연 작용제, 예컨대 NT4 및 BDNF뿐만 아니라 작용제 항체와 같은 작용제를 포함한다.

Description

자가면역 장애의 치료를 위한 티로신 수용체 키나아제 Ｂ 작용제{TRKB AGONISTS FOR TREATING AUTOIMMUNE DISORDERS}

본 발명은 다발경화증(MS)을 비롯한, 중추 신경계(CNS)에 영향을 미치는 자가면역 질환의 치료에 관한 것이다. 본 발명은 중추 신경계 조직의 백혈구 침입을 감소시키는 티로신 수용체 키나아제 B(TrkB) 작용제를 제공한다.

본 발명은 2006년 12월 20일자로 출원된 미국 특허 출원 제 60/870,918 호를 우선권 주장하며, 그 전체는 본원에서 참고로서 인용된다.

다발경화증은 염증, 미엘린탈락 및 축삭 손상을 특징으로 하는 중추 신경계의 미엘린탈락화 자가면역 질환이다. 이 질환은 전 세계적으로 수백만명 이상의 사람들에게 영향을 미치며 남성보다 여성에게서 2배 정도 우세하다. MS 증상은 보통 20 내지 40살의 연령에서 나타난다.

MS 병인은 비록 상기 질환의 특징이 연구되어 왔지만 불분명하다. 그러한 특징은 CNS 조직에 대한 손상, 미세아교세포의 활성화, 친-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 생성, T-세포 이동 및 클론형 증식의 저지, 변경된 대식 세포 효과기 작용, 생성, MHC의 상향조절, 및 T-세포 침윤에 의한 직접적인 CNS 공격을 포함한다.

실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE)은 MS에 대한 표준 모델로서 간주된다. 뮤린 질환 모델은 MS의 병인을 연구하고 그의 치료를 위한 약물을 평가하는데 사용되어 왔다(2005a 아하로니(Aharoni, R.) 등). EAE의 임상적 특징은 다수의 림프구 및 대식세포 침윤에 의한 CNS의 염증 및 미엘린탈락화를 포함한다. 미엘린 염기성 단백질(MBP), 단백질지질 단백질(PLP) 및 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)을 비롯한 몇몇 상이한 미엘린 단백질 성분에 의한 마우스의 활성 면역화는 자가면역 항체의 생성 및 상행성 마비의 임상 증상을 유도한다. 상기 질환은 면역화에 사용되는 마우스 균주 및 미엘린 단백질에 따라 급성 또는 만성일 수 있다. EAE는 MS의 병인을 연구하고 그의 치료를 위한 약물을 평가하는데 사용되어 왔다(2005a 아하로니 등).

MS는 주로 뉴런 조직에 풍부한 폴리펩타이드인 미엘린에 대한 T-세포 반응으로부터 발생한다. 미엘린탈락화 및 임상 마비는 미엘린 항원에 대해 특이성을 갖는 Th1 표현형의 T-세포에 의한 CNS 조직의 침입으로부터 발생한다. Th1 세포는 TNF-α 및 IFN-γ를 포함한 염증성 사이토카인을 생성시킨다. CNS에 대한 손상은 또한 자가면역 항체의 생성 및 보체 활성화를 비롯한, 다른 면역 반응에 의해 아마도 유발될 것이다. B-세포는 MS 및 EAE의 초기 및 말기 단계 도중에 상기 질환의 과정을 통해 발견된 다양한 동형의 미엘린 염기성 단백질(MBP)-특이적 항체와 관계된다. 뇌 및 척수 조직으로부터 제조된 절편은 백혈구 침입(특히, 림프구 및 대식 세포) 및 신경계의 기본 조직의 파괴를 보인다.

글라티라머 아세테이트(GA, 코팍손(COPAXONE))는 MS 및 다른 질환의 치료를 위해 승인된 면역억제성 약물이다(2003년 아르론(Arnon, R.) 등). 또한, 상기 약물은 EAE 모델에 효과적이다. GA는 Th2/3 세포의 유발인자이며, 이는 항염증성 사이토카인을 생성하고, 혈액-뇌 장벽을 가로질러 CNS에 축적된다. 이러한 사이토카인은 CNS 조직에서 다양한 효과를 낳으며, 다른 성장 인자, 예컨대 IL-10, TGF-β 및 BDNF의 국지적 생성을 이끈다(2003년 아하로니 등). 장기간의 GA 투여는 높은 수준의 NT3, NT4 및 BDNF 발현과 관련된다(2005b 아하로니 등).

NT3, NT4 및 BDNF는 뉴런 발달, 돌기 성장, 시냅스 가소성, 보호 및 생존에 있어 중요한 작은 동종이량체 단백질의 뉴로트로핀(NT) 계열의 일원이다. NT는 신경 성장 인자(NGF), 뇌-유래된 향신경 인자(BDNF), NT3, NT4(또한 NT4/5로도 불림), NT6 및 NT7을 포함한다. NT는 수용체 티로신 키나아제(또한 티로신 수용체 키나아제로도 불림)로서 공지된 수용체 계열과의 상호작용을 통해 표적 세포에 영향을 미친다. 이러한 수용체는 몇몇 고 분자량(130 내지 150 kDa), 고 친화도(약 10^-11 M) 티로신 수용체 키나아제(Trk) 수용체 및 저 분자량(65 내지 80 kDa), 저 친화도(약 10^-9 M) 수용체(LNGFR, p75NTR 또는 p75)로서 공지된 수용체를 포함한다. 특이적 수용체 티로신 키나아제에 결합하는 NT는 내재성 티로신 키나아제 도메인의 수용체 이량체화 및 활성화를 유발한다. NGF는 우선적으로 티로신 수용체 키나아제 A(TrkA)에 결합하며, BDNF 및 NT4는 티로신 수용체 키나아제 B(TrkB)에 결합하 고, NT3은 티로신 수용체 키나아제 C(TrkC)에 결합한다. 모든 NT는 p75에 약하게 결합한다.

EAE 마우스의 CNS 조직에서의 BDNF 및 NT4에 대한 보고서(2003, 2005b 아하로니 등)는 다발경화증 및 관련된 질환에서 NT 및/또는 이들의 수용체에 대한 역할을 제시하였다.

참고 문헌

문헌[Aharoni, R. et al. (2005a) J. Neurosci. 25:8217-28]

문헌[Aharoni, R. et al. (2005b) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 102:19045-50]

문헌[Aharoni, R. et al. (2003) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 100:14157-62]

문헌[Aharoni, R. et al. (1997) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 94:10821-26]

문헌[Arnon, R. et al. (2003) J. Mol. Recognit. 16:412-21]

문헌[Davies, A. et al. (1993) Neuron 11565-74]

문헌[Karnezis, T. et al. (2004) Nat. Neurosci. 7:736-44]

문헌[Padlan, E. et al. (1995) FASEB J. 133-39]

문헌[Steinman and Zamvil (2006) Ann. Neurol. 60:12-21]

추가의 참조 문헌, 특히 표준 절차 및 방법과 관련된 참조 문헌은 본원에서 인용된다. 상기 및 본원의 다른 곳에서 인용된 모든 특허, 특허 출원, 진벵크(Genbank) 등록사항, 참조 안내서 및 문헌은 그 전체가 본원에서 참고로서 인용 된다.

발명의 개요

하나의 양태에서, 본 발명은 TrkB 수용체를 활성화시키는데 효과적인 양의 TrkB 작용제를 포함하는 조성물을 치료가 필요한 포유류 대상에게 투여함으로써 중추 신경계 조직의 백혈구 침입을 감소시킴을 포함하는, 중추 신경계 조직의 백혈구 침입을 감소시키는 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 포유류의 중추 신경계 조직의 백혈구 침입을 감소시키는데 사용되는 약제의 제조에 있어서 TrkB 작용제의 용도를 제공한다.

일부 실시양태에서, 포유류는 자가면역 장애를 갖는다. 하나의 실시양태에서, 자가면역 장애는 실험적 자가면역성 뇌척수염이다. 다른 실시양태에서, 자가면역 장애는 다발경화증이다. 다른 실시양태에서, 자가면역 질환은 면역 거부 반응, 시각 신경병증, 염증성 창자 질환 또는 파킨슨병과 관련된다. 바람직한 실시양태에서, 포유류는 인간이다.

일부 실시양태에서, TrkB 작용제는 천연 TrkB 작용제이다. 하나의 실시양태에서, 천연 TrkB 작용제는 NT4이다. 관련 실시양태에서, 천연 TrkB 작용제는 NT4의 천연 단편 또는 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, NT4의 단편 또는 유도체는 TrkB에 결합하여 활성화시킨다. 다른 실시양태에서, 천연 TrkB 작용제는 BDNF이다. 관련 실시양태에서, 천연 TrkB 작용제는 BDNF의 천연 단편 또는 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, BDNF의 단편 또는 유도체는 TrkB에 결합하여 활 성화시킨다.

다른 실시양태에서, TrkB 작용제는 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 항체 38B8이다. 다른 실시양태에서, 항체는 ATCC 기탁 번호 PTA-8766으로 기탁된 하이브리도마 균주에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, TrkB 작용제는 인간 항체이다. 관련 실시양태에서, TrkB 작용제는 인간화된 항체이다. 일부 실시양태에서, TrkB 작용제는 항체 단편 또는 유도체이다. 특정 실시양태에서, 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 또는 단일쇄(ScFv) 항체로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항체 단편은 작용제 항체 38B8의 항원-결합 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 단편은 ATCC 기탁 번호 PTA-8766으로 기탁된 하이브리도마 균주에 의해 생성된 항체의 항원-결합 영역을 포함한다. 관련 실시양태에서, 항체 단편은 작용제 항체 38B8의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 관련 실시양태에서, 항체 단편은 ATCC 기탁 번호 PTA-8766으로 기탁된 하이브리도마 균주에 의해 생성된 항체의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 침입 백혈구는 T-세포 및 대식세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 침입 백혈구는 CD3-발현 및 CD68-발현 백혈구를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 중추 신경계 조직은 뇌 조직 또는 척수 조직이다.

관련 양태에서, 본 발명은 TrkB 수용체를 활성화시키는데 충분한 양의 TrkB 작용제를 포함하는 조성물을 치료가 필요한 포유류 대상에게 투여함으로써 중추 신경계 조직의 백혈구 침입을 감소시킴을 포함하는, 중추 신경계에 영향을 미치는 자가면역 장애의 치료 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 포유류의 중추 신경계에 영향을 미치는 자가면역 장애의 치료에 사용되는 약제의 제조에 있어서 TrkB 작용제의 용도를 제공한다.

하나의 실시양태에서, 자가면역 장애는 실험적 자가면역성 뇌척수염이다. 다른 실시양태에서, 자가면역 장애는 다발경화증이다. 다른 실시양태에서, 자가면역 질환은 면역 거부 반응, 시각 신경병증, 염증성 창자 질환 또는 파킨슨병과 관련된다. 바람직한 실시양태에서, 포유류는 인간이다.

일부 실시양태에서, TrkB 작용제는 천연 TrkB 작용제이다. 하나의 실시양태에서, 천연 TrkB 작용제는 NT4이다. 관련 실시양태에서, 천연 TrkB 작용제는 NT4의 천연 단편 또는 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, NT4의 단편 또는 유도체는 TrkB에 결합하여 활성화시킨다. 다른 실시양태에서, 천연 TrkB 작용제는 BDNF이다. 관련 실시양태에서, 천연 TrkB 작용제는 BDNF의 천연 단편 또는 유도체이다. 일부 실시양태에서, BDNF의 단편 또는 유도체는 TrkB에 결합하여 활성화시킨다.

다른 실시양태에서, TrkB 작용제는 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 항체 38B8이다. 다른 실시양태에서, 항체는 ATCC 기탁 번호 PTA-8766으로 기탁된 하이브리도마 균주에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, TrkB 작용제는 인간 항체이다. 관련 실시양태에서, TrkB 작용제는 인간화된 항체이다. 일부 실시양태에서, TrkB 작용제는 항체 단편 또는 유도체이다. 특정 실시양태에서, 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 또는 단일쇄(ScFv) 항체로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항체 단편은 작용제 항체 38B8의 항원-결합 영역을 포함한다. 일부 실 시양태에서, 항체 단편은 ATCC 기탁 번호 PTA-8766으로 기탁된 하이브리도마 균주에 의해 생성된 항체의 항원-결합 영역을 포함한다. 관련 실시양태에서, 항체 단편은 작용제 항체 38B8의 상보성 결정 영역을 포함한다. 관련 실시양태에서, 항체 단편은 ATCC 기탁 번호 PTA-8766으로 기탁된 하이브리도마 균주에 의해 생성된 항체의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 침입 백혈구는 T-세포 및 대식세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 침입 백혈구는 CD3-발현 및 CD68-발현 백혈구를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 중추 신경계 조직은 뇌 조직 또는 척수 조직이다.

추가의 양태에서, 본 발명은 TrkB 수용체를 활성화시키는데 효과적인 양의 TrkB 작용제 및 사용 설명서를 포함하는, 중추 신경계의 조직의 백혈구 침입을 감소시키기 위한 부품을 갖는 키트를 제공한다. 관련 양태에서, 본 발명은 TrkB 수용체를 활성화시키는데 효과적인 양의 TrkB 작용제 및 사용 설명서를 포함하는, 중추 신경계에 영향을 미치는 자가면역 장애를 치료하기 위한 부품을 갖는 키트를 제공한다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 TrkB 작용제 항체 38B8, 예를 들면 단리된 단클론 38B8 항체에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 ATCC 기탁 번호 PTA-8766으로 기탁된 하이브리도마 균주에 의해 생성된 단리된 TrkB 작용제 항체에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, TrkB 작용제는 38B8의 항체 단편 또는 유도체이다. 추가의 실시양태에서, TrkB 작용제는 ATCC 기탁 번호 PTA-8766으로 기탁된 하이브리도마 균주에 의해 생성된 항체의 항체 단편 또는 유도체이다. 특정 실시양 태에서, 항체 단편은 38B8로부터 유도된 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 또는 단일쇄(ScFv) 항체로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 항체 단편은 ATCC 기탁 번호 PTA-8766으로 기탁된 하이브리도마 균주에 의해 생성된 항체로부터 유도된 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 또는 단일쇄(ScFv) 항체로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항체 단편은 작용제 항체 38B8의 항원-결합 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 단편은 ATCC 기탁 번호 PTA-8766으로 기탁된 하이브리도마 균주에 의해 생성된 작용제 항체의 항원-결합 영역을 포함한다. 관련 실시양태에서, 항체 단편은 작용제 항체 38B8의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 관련 실시양태에서, 항체 단편은 ATCC 기탁 번호 PTA-8766으로 기탁된 하이브리도마 균주에 의해 생성된 작용제 항체의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 추가의 실시양태는, TrkB 작용제 항체 38B8을 생성하거나, 38B8로부터 유래된 단편을 생성하는 세포이다. 추가의 실시양태는 ATCC 기탁 번호 PTA-8766으로 기탁된 하이브리도마 균주이다.

또한, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 자가면역 장애를 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 임의의 TrkB 작용제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 TrkB 작용제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 TrkB 작용제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 하나의 특정 실시양태는, ATCC 기탁 번호 PTA-8766으로 기탁된 하이브리도마 균주에 의해 생성된 작용제 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분 자이다. 추가로, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것으로서, 상기 벡터는 선택적으로 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함한다.

다른 실시양태는 본원에 기재된 임의의 벡터 또는 본원에 기재된 임의의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 항체 또는 항원-결합 부분를 생성하거나, 임의의 상기 항체 또는 상기 항원-결합 부분의 중쇄 또는 경쇄를 생성하는 단리된 세포주를 제공한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 적합한 조건하에 본원에 기재된 임의의 숙주 세포 또는 세포주를 배양하고, 항체 또는 항원-결합 부분을 회수함을 포함하는, TrkB 작용제 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 제조 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 핵산을 포함하는 비-인간 유전자삽입 동물 또는 유전자삽입 식물에 관한 것으로서, 상기 비-인간 유전자삽입 동물 또는 유전자삽입 식물은 상기 핵산을 발현한다.

추가로, 본 발명은 본원에 기재된 비-인간 유전자삽입 동물 또는 유전자삽입 식물로부터 항체를 단리하는 단계를 포함하는, TrkB 작용제 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 단리하는 방법을 제공한다.

본 발명의 이러한 양태 및 다른 양태는 하기 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 명백해질 것이다.

도 1A 및 1B는 MOG-유도 후 1주에 EAE 동물의 상대적 이환률을 나타내는 그래프를 도시하고 있다. MOG는 0일째에 투여하였다. (A) 열흘 째 되는 날 동물에게 NT4(10 mg/kg) 또는 대조군으로서 비히클 단독을 매일 투여하였다. (B) 대조군 IgG(10 mg/kg; n = 9), 3일부터 9일까지(n = 8) NT4(10 mg/kg), 또는 9일부터 15일까지(n = 8) NT4(10 mg/kg)로 동물을 처리하였다.

도 2는 4가지 수용체 티로신 키나아제(즉, TrkA, TrkB, TrkC 및 p75)에 대한 4가지 수용체 티로신 키나아제 작용제(즉, NGF, BDNF, NT4 및 38B8)의 상대적 친화도를 나타내는 일련의 그래프를 도시하고 있다. x-축은 시간(모두 300 내지 450 초 범위에 있다)을 나타낸다. y-축은 상대적 친화도를 나타낸다. 최대 눈금 - 맨 윗줄(왼쪽부터 오른쪽으로): 90, 20, 50 및 60 단위; 두 번째 줄: 32, 60, 60, 140 단위; 세 번째 줄: 35, 35, 16 및 20 단위; 맨 아랫 줄: 90, 80, 100 및 90 단위. 이들 데이터는 추가로 본원 및 실시예 4(표 2 포함)에 기재되어 있다.

도 3은 MOG-유도 후 9일째에 TrkB 작용제로 처리된 동물의 이환률을 나타내는 그래프를 도시하고 있다. 동물은 9일 및 16일째에 5 mg/kg TrkB 작용제 항체 38B8 또는 비-특이적 IgG(대조군)를 수용하였다. 다음과 같은 점수 시스템에 따라 EAE의 임상 신호에 대해 마우스를 매일 평가하였다: 0 = 정상; 1 = 절뚝거리는 꼬리; 2 = 중등도 뒷 다리 쇠약; 3 = 중등 고도 뒷 다리 쇠약(동물은 여전히 어렵게 걸을 수 있다); 4 = 고도 뒷 다리 쇠약(동물은 그들의 뒷 다리를 움직일 수 있지만 걸을 수는 없다); 5 = 완전한 뒷 다리 마비; 6 = 폐사.

도 4는 MOG-유도 후 16일째에 TrkB 작용제로 처리된 동물의 이환률을 나타내 는 그래프를 도시하고 있다. 동물은 16일 및 23일째에 5 mg/kg TrkB 작용제 항체 38B8 또는 비히클(PBS)을 수용하였다.

도 5A 및 5B는 동물을 처리한 후 질병 진행의 이환률을 나타내는 그래프를 도시하고 있다. (A) 동물은 18일 및 23일째에 5 mg/kg TrkB 작용제 항체 38B8 또는 비-특이적 IgG를 수용하였다. (B) 22일째 되는 날 GA(코팍손) 또는 비히클 단독(대조군)을 동물에게 매일 투여하였다.

도 6A 및 6B는 TrkB 작용제 또는 덱사메타손의 투여 후 동물의 이환률 및 체중을 나타내는 그래프를 도시하고 있다. 동물은 38B8(5 mg/kg, 9일째 및 16일째에 주 1회씩) 또는 3 내지 12일째에 매일 덱사메타손(4 mg/kg) 또는 메탄올 비히클(대조군)을 수용하였다. (A) 상기와 같이 이환률을 측정하였다. (B) 동물의 체중을 질병 진행 과정에 대해 측정하였다.

도 7A 및 7B는 질병 이환률 감소시 TrkB 작용제의 효과가 투여량-의존적임을 나타내는 그래프를 도시하고 있다. (A) 동물은 9일 및 16일째에 TrkB 작용제 38B8 1 mg/kg 또는 5 mg/kg을 수용하였다. (B) 동물은 9일 및 16일째에 38B8 5 mg/kg 또는 38B8 10 mg/kg, 또는 PBS(대조군)를 수용하였다.

도 8은 시험관내 분석법을 사용하여 증가량의 몇몇 TrkB 작용제 항체(38B8, 23B8, 36D1, 37D12 및 19H8)의 존재하에 뉴런 생존의 상대적인 양을 나타내는 그래프를 도시하고 있다. 실험 절차 및 결과는 본원 및 실시예 1(예, 표 1)에 기재되어 있다. 뉴런 생존 분석에서 각각의 항체에 대한 EC₅₀ 값은 표 1의 3번째 칸에 나 타나 있다.

도 9는 비처리된 동물(대조군) 및 TrkB 작용제 항체 38B8로 처리된 동물에서 MOG-특이적 항체를 갖는 지적된 동형의 상대적 수준을 나타내는 일련의 그래프를 도시하고 있다. 각각의 그래프는 TrkB 작용제 (38B8)-처리된 또는 비처리된 동물(대조군)에서 지적된 항체 동형의 양(450 ㎛에서 흡광도를 측정함으로써 결정됨)을 나타낸다.

도 10은 비장단핵세포 자극 분석의 결과를 나타내는 그래프를 도시하고 있다. MOG-유도된 비처리된 동물(대조군) 또는 MOG-유도된 TrkB 작용제 항체(38B8)-처리된 동물로부터의 비장 세포를 MOG 단독, 또는 TrkB 작용제 항체(38B8; 50 ㎕/mg)와 MOG, 또는 두 가지 농도(10^-8 M 및 10^-5 M) 중 하나의 농도에서의 덱사메타손의 존재하에 시험관내에서 배양하였다.

도 11은 대조군(A) 및 TrkB 작용제-처리된 동물(B)로부터 제거된 척수 절편의 면역화학적 염색 결과를 도시하고 있다. 절편들을 미엘린에 대해서는 루솔 패스트 블루(Luxol Fast Blue)로 염색하고 세포체에 대해서는 크레실 바이올렛(Cresyl violet)으로 염색하였다.

도 12는 대조군(A) 및 TrkB 작용제-처리된 동물(B)로부터 제거된 척수 절편의 면역화학적 염색 결과를 도시하고 있다. 절편들을 CD3에 대해 특이적인 항체로 염색하였다.

도 13은 대조군(A) 및 TrkB 작용제-처리된 EAE 동물(B)로부터 제거된 척수 절편의 면역화학적 염색 결과를 도시하고 있다. 절편들을 CD68에 대해 특이적인 항체로 염색하였다.

도 14는 대조군 및 TrkB 작용제-처리된 EAE 동물로부터 제거된 척수 절편의 조직학적 염색 결과를 도시하고 있다. 절편들을 미엘린 염색, 루솔 패스트 블루로 염색하였다. 염색이 안된 것은 미엘린탈락된 구역을 가리킨다.

정의

본원에서 사용되는 용어 "티로신 수용체 키나아제" 및 "수용체 티로신 키나아제"는 TrkB가 구성원인 분자의 종류를 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 리간드(작용제)의 수용체 티로신 키나아제로의 결합은 세포내 키나아제 도메인에서 리간드-유도된 수용체 이량체화 및 티로신 잔기의 자가인산화를 일으킨다. 티로신 인산화에 이어 다양한 신호 연쇄반응, 예컨대 포스파티딜리노시톨 3-키나아제(PI3K)/Akt, MAPK 및 PLC-경로의 활성화가 뒤따르며 이는 전형적으로 세포 유형-특이적 방식으로 유전자 발현을 조정한다.

본원에서 사용되는 용어 "침입 백혈구"는 자가면역 질환, 바람직하게는 CNS에 영향을 미치는 자가면역 질환의 결과로서 뇌 및 척수 조직을 포함한 중추 신경계(CNS) 조직으로 침입, 침윤 또는 이동하는 백혈구이다. 침입 백혈구는 주로 T-세포 및 단핵구이지만, 다른 백혈구가 존재할 수도 있다.

본원에서 사용되는 용어 "백혈구 침입의 감소"는 뇌 및 척수 조직을 포함한 CNS 조직으로의 백혈구 이동(즉, 침입 또는 침윤)을 감소시키는 것을 지칭한다. 또한, 백혈구 침입의 감소는, 특히 CNS 조직의 기본 뉴런 세포 및/또는 다른 지지 세포에 대해서 백혈구 침입에 의해 매개된 세포독성 영향을 감소시키는 것을 지칭한다. 백혈구 침입은 T-세포 및 단핵구에 의한 침입을 포함한다. 백혈구 침입의 감소는 자가면역 공격으로부터 CNS 조직을 보호하는 것을 포함한다. 백혈구 침입에 의해 파괴되는 CNS 세포는 미엘린-발현 세포 및 이웃하는 비-미엘린 발현 세포를 포함한다. 세포 파괴는 세포자멸사, 괴사 또는 이의 조합에 의한 것일 수 있다. 감소된 백혈구 침입은 느려진 질병 진행, 지연된 발병 또는 이환률의 고도성, 연장된 생존, 개선된 삶의 품질, 감소되거나 안정화된 인지력, 운동성 또는 행동 증상과 같은 임상적 징후를 특징으로 한다. 백혈구 침입의 감소는 또한 중추 신경계(CNS) 조직으로의 백혈구의 이동 위험성을 예방하거나 감소시킴을 포함한다. 백혈구 침입의 감소는 부분적이거나 전체적일 수 있으며, 예컨대 감소는 본원에서 기재한 바와 같이, 비교 또는 실제 감소시 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 심지어 약 95%일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "TrkB 수용체 작용제" 또는 "TrkB 작용제"는 TrkB 수용체의 활성화 양을 증가시켜 천연 작용제 BDNF 및 NT4에 의해 생성된 것과 유사한 효과를 산출하는 분자이다. TrkB 활성화는 일반적으로 수용체-유도된 자가인산화에 의해 발생하며, 이는 세포내 신호 사건의 특징적인 연쇄반응을 일으킨다. TrkB 수용체 작용제는 이러한 활성화를, 예컨대 수용체 이량체화 또는 인산화를 조정하거나, 천연 작용제의 결합을 조정하거나, 천연 작용제의 결합을 모방하거나, TrkB 수용체로 하여금 오랜 시간(무기한의 시간 포함) 동안 활성화된(예컨대, 인산화된) 조건에 남아있도록 야기시키거나, 또는 다르게는 TrkB 활성화를 조정하거나 TrkB 수용체 활성화의 특징인 세포내 사건의 연쇄반응을 일으킴으로써 증가시킨다. TrkB 작용제는 비제한적으로 공지된 TrkB 작용제 NT4 및 BDNF를 포함한, 천연 작용제 폴리펩타이드, 이의 단편, 변이체 및 유도체를 포함한다. TrkB 작용제는 작용제 항체, 이의 단편, 변이체 및 유도체를 포함한다. TrkB 작용제의 바람직한 특성은 본원에 기재되어 있다. 본 발명의 TrkB 작용제는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 50% 이상, 100% 이상, 200% 이상, 또는 그 이상 만큼 TrkB의 활성화를 증가시킬 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "단편" 폴리펩타이드는 보다 큰 폴리펩타이드의 생물학적 특성 중 적어도 일부, 예컨대 TrkB 수용체를 활성화시키는 능력을 보유하는 보다 큰 폴리펩타이드의 일부이다. 바람직한 단편은 보다 큰 폴리펩타이드의 생물학적 특성을 초래하는 보다 큰 폴리펩타이드의 아미노산 잔기 및/또는 구조를 포함한다. 폴리펩타이드 단편은 펩타이드로 불릴 수 있지만, 본원에서 폴리펩타이드와 펩타이드간에 구별은 없다. 예시적인 단편이 본원에 기재되어 있다. 단편은 본원에 기재된 바와 같이 유도체화될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "유도체" 폴리펩타이드는 작용기 또는 잔기의 첨가 또는 제거와 같은 하나 이상의 공유 또는 비공유 변형을 갖는다. 유도체의 예가 본원에 제공되어 있다.

본원에서 사용되는 용어 특정 폴리펩타이드 서열의 "변이체"는 클루스탈(Clustal) V 또는 블라스트(BLAST), 예컨대 디폴트 매개변수로 설정된 "블라스트 2 시퀀스" 툴 버전 2.0.9(1999년 5월 7일)와 같은 알고니즘을 사용하여 폴리펩타이드 서열 중 하나의 특정 길이에 대해 특정 폴리펩타이드 서열과 40% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열로서 정의된다. 상기 한 쌍의 폴리펩타이드는, 예를 들면 폴리펩타이드 중 하나의 특정한 소정 길이에 대해 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 보다 큰 서열 동일성을 나타낼 수 있다.

폴리펩타이드 서열에 적용되는 본원에서 사용되는 용어 "서열 동일성"은 표준화된 알고리즘, 예컨대 클루스탈 V, 메갈린(MEGALIGN) 또는 블라스트를 사용하여 정렬된 둘 이상의 폴리펩타이드 서열간의 잔기 조화 비율을 지칭한다. 폴리펩타이드 서열 정렬 방법은 널리 알려져 있다. 몇몇 정렬 방법은 보존적 아미노산 치환을 고려한다. 본원에 기재된 상기 보존적 치환은 일반적으로 치환 부위에서 전하 및 소수성을 보전하여, 이에 따라 폴리펩타이드의 구조( 및 그에 따른 작용)를 보전한다.

본원에서 사용되는 용어 "TrkB 수용체를 활성화시키는데 효과적인 양" 또는 TrkB 작용제와 관련한 유사한 표현은 TrkB 수용체 작용제의 투여 전 활성화의 기준 수준과 비교하여 TrkB 수용체 활성화(본원에 정의되고 당해 분야에 공지된 것)를 증가시키기에 충분한 양을 지칭한다. 활성화 증가는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 50% 이상, 100% 이상, 200% 이상 또는 그 이상일 수 있다. 이 양은 투여 경로, TrkB 작용제의 체내 반감기, 용해도, 생체이용률, 제거율, 및 TrkB 작용제의 다른 약동학적 특징들, 동물 또는 환자 등의 체중 및 대사와 같은 고려 사항을 고려한다. 또한, TrkB 작용제를 참고한다.

본원에서 사용되는 용어 "치료가 필요한 동물" 또는 유사한 표현은 CNS와 관계된 자가면역 질환을 갖거나 발병 위험성을 갖는, 동물, 바람직하게는 인간을 포함한 포유류를 의미한다. CNS에 영향을 미치는 자가면역 질환(또는 장애, 구별없음)의 예는 마우스의 실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE), 인간의 다발경화증(MS), 및 다른 포유류에서 발견된 유사한 자가면역 질환이 있다. 또한, CNS의 자가면역 공격은, 예컨대 면역 거부 반응, 시각 신경병증, 염증성 창자 질환 및 파킨슨병에서 관찰된다.

본원에서 사용되는 용어 "천연 TrkB 작용제"는 천연 상태로 존재하고 TrkB 수용체의 활성화제로서 작용하는 분자이다. 공지된 TrkB 수용체의 천연 작용제는 뉴로트로핀 NT4 및 BDNF이다. 천연 TrkB 작용제는 천연 변이체 분자, 예컨대 돌연변이된 TrkB 대립유전자를 갖는 동물에서 발현되는 뉴로트로핀 폴리펩타이드를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다(예컨대, 특이적으로 TrkB에 결합하는 단리된 항체는 TrkB 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나, TrkB에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예컨대 다른 종으로부터의 TrkB 분자에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다. 게다가, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "단클론 항체" 또는 "단클론 항체 조성물"은 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 단클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 보인다.

일반적인 기법

본 발명은 분자 생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학 분야에 사용되는 통상적인 기법을 사용한다. 상기 기법은, 예컨대 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]에 기재되어 있다.

TrkB 작용제

본 발명은 다발경화증 및 중추 신경계(CNS)에 영향을 미치는 다른 자가면역 장애의 치료를 위해 TrkB 작용제를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 특징에 따르면, TrkB 작용제는 CNS 조직으로의 백혈구 침입을 감소시키고 CNS의 기본 뉴런 조직의 파괴를 감소시킴으로써 사지 마비와 같은 상기 질환의 임상적 조짐을 개선키는데 효과적이다. 특히, TrkB 작용제는 미엘린 항원을 나타내고 그들을 생성하는 세포에 대해 세포독성 효과를 부여하는데 있어 활성인, 단핵구 및 T-세포의 이동을 감소시킨다.

MS에 대해 잘 순응된 동물 모델, 즉 실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE) 마우스를 사용하여 본 발명을 유도하는 관찰을 실시하였다. EAE는 인간의 MS와 여러 임상적 및 병리학적 특징을 공유하는 실험적 질병 상태이다. 다양한 FDA-승인된 MS 치료가 먼저 마우스 및 래트의 EAE 모델을 기반으로 발견되어 개발되었다(2006년 스테인만(Steinman) 및 잠빌(Zamvil)에 의해 개괄됨). EAE는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)의 펩타이드 35-55에 의한 면역화 후 C57BL/6 마우스에서 유도될 수 있다(2005a 아하로니 등). MOG에 의한 면역화는 미엘린-특이적 자가면역 반응을 유도하고, 이는 MS와 유사한 미엘린탈락 및 이환률을 유발한다.

TrkB 작용제를 사용한 동물 실험

본 발명을 지지하여 수행되는 실험에서, TrkB 작용제의 직접적인 투여는 CNS-특이적 자가면역 질환을 갖는 동물에게서 이환률 및 CNS 조직 손상을 감소시키는 것으로 나타났다(도 1A 및 1B). 천연 TrkB 작용제 NT4의 재조합 제형을 MOG-유도 후 EAE 동물에게 투여하였다(실시예 5). NT4로 처리된 동물은 대조군 동물과 비교하여 상당히 감소된 이환률을 보였다. 이 결과로 TrkB 작용제의 투여가 만성 EAE의 진행을 늦추는데 효과적임이 증명되었다. 추가의 실험은 NT4에 의해 제공된 보호성이 초기에 투여될 경우 말기에 투여되는 것보다 증상의 발병에 대해 (낫지는 않더라도) 적어도 우수하다는 것과, 효과적인 치료를 위해 TrkB 작용제로의 처리를 증상 발병시까지 계속할 필요가 없음을 보여주었다(도 1B). TrkB 활성화는 EAE 유도에서 상대적으로 상류인 단계를 표적으로 할 수 있다.

실시예 1 내지 4 및 6은 TrkB 항체를 기재하며, 이들 중 일부는 TrkB의 생물학적 활성을 자극하는, 즉 TrkB를 활성화시키는 그들의 능력을 기준으로 TrkB 작용제로서 작용한다(예컨대, 실시예 6 및 표 1 및 2). 항체 38B8을 포함한 몇몇 항체는 TrkB에 대해 특이적이며 분석된 다른 수용체 티로신 키나아제에 현저히 결합하지 않는 것으로 나타났다. 항체 38B8은 천연 작용제 BDNF 및 NT4보다 TrkB 수용체에 대해 훨씬 더 선택적이며, 이는 일부 교차-반응성을 나타내었다. 이들 리간드-수용체 상호작용의 동역학적 분석은 실시예 4 및 표 2에 제공되어 있다.

동물 실험은 TrkB 작용제 항체가 대조군 면역글로불린과 비교하여 EAE 이환률로부터 현저히 보호한다는 것을 보여주었다(도 3, 실시예 7). TrkB 작용제 항체는 MOG-유도 후 16일만큼 늦게 그리고 임상 증상 발병 후 투여될 경우 효과적이다(도 4). 글라티라머 아세테이트(GA)와의 비교는 TrkB 작용제의 작용 메커니즘이 GA 및 다른 현행 MS 약물의 메커니즘과 상이하다는 것을 시사하였다(도 5). 다른 결과는 TrkB 작용제의 유리한 효과가 면역억제성 덱사메타손의 효과와 유사하다는 것을 증명하였다(도 6A 및 6B). TrkB 작용제 항체의 유리한 효과는 투여량-의존적이었다(도 7A 및 7B).

뉴런 세포 생존 분석을 사용하여 TrkB 작용제 항체가 천연 TrkB 작용제와 동일한 방식으로 뉴런 세포에 영향을 미침을 증명하였다(실시예 8). 증가량의 TrkB 작용제 항체의 첨가는 뉴런 생존을 증가시켰다(도 8). 뉴런 생존 분석 및 인간 KIRA 분석에서 TrkB 작용제 항체 38B8, 23B8, 36D1 및 37D12의 EC₅₀ 값은 실시예 1에 기재되어 있으며, 표 1에 요약되어 있다.

MS의 치료를 위한 현행 약물(GA 및 덱사메타손 포함)은 면역조절제이다. TrkB 작용제 항체는 항-MOG 항체의 생성을 억제함으로써 작용하는 것으로 보이지 않으므로, 통상적인 면역억제제로서 작용하는 것으로 보이지 않는다(도 9, 실시예 9). 더구나, TrkB 작용제 항체의 존재는 면역억제제 덱사메타손처럼 비장단핵세포 자극에 대해 뚜렷한 영향을 미치지 않았다(도 10). TrkB 작용제로 처리된 동물은 정상적인 항-MOG T-세포 및/또는 B-세포 반응을 생성하는 능력을 보유한다. 이러한 관찰은 면역억제제 덱사메타손과 TrkB 작용제의 작용 메커니즘이 상이하고, TrkB 작용제의 작용 메커니즘이 주로 백혈구 증식 수준에서가 아님을 시사한다.

조직학적 분석은 TrkB 작용제로 처리된 동물로부터 제조된 절편에서 감소된 백혈구 침입을 보여주었다. 일부 TrkB 작용제-처리된 동물은 CNS 백혈구 침입의 증거가 실질적으로 나타나지 않았다(도 11). CD3-발현 T-세포 및 CD68-발현 대식세포에 대해 염색함으로써 침입 세포를 확인하였다. TrkB 작용제-처리된 동물로부터의 척수 조직은 대조군 동물과 비교할 경우 실질적으로 감소된 T-세포 및 단핵구 침입을 보인다(도 12 및 도 13). 고도 미엘린탈락 영역은 대조군 마우스에서 뚜렷하였지만 TrkB 작용제로 처리된 마우스에서는 그렇지 않았다(도 14). CNS 조직 절편의 조직 화학적 염색 결과는 TrkB 작용제 처리가 CNS의 림프구 및 단핵구 침입을 감소시킨다는 것을 증명하였다.

상기 기재된 결과는 TrkB 작용제가 CNS의 백혈구 침입을 감소시키고 EAE, 즉 MS에 대해 폭넓게 순응된 동물 모델의 진행을 늦추는데 효과적임을 증명한다. 천연 TrkB 작용제 NT4 및 TrkB 작용제 항체는 둘 다 질병의 진행을 늦추는데 효과적이었다. 작용제 항체는 TrkB에 대한 가장 높은 선택성을 입증하였고 추가의 연구에 사용하였다. TrkB 작용제의 유리한 효과는 투여량-의존적이며, 이때 감소된 이환률은 TrkB 작용제의 투여량 증가와 관련된다. 현행 MS 약물과 달리, TrkB 작용제는 주로 면역억제를 통해 작용하지 않는다. 조직 화학적 실험은 TrkB 작용제가 T-세포 및 단핵구에 의한 CNS 조직의 침입을 감소시킨다는 것을 보여주었다.

CNS 자가면역 장애에 대한 TrkB 작용제

임의의 이론으로 제한되지 않으면서, TrkB 작용제는 주로 백혈구의 이동을 조정함으로써 작용하는 것으로 생각된다. 세포성 면역은 MS에서 탁월할 수 있으며, TrkB 작용제를 현행 면역억제제보다 보다 효과적인 유형의 약물로 만들어, 체액성 면역에 영향을 미친다. 게다가, 본 발명의 방법은 추가적인 치료 효과를 낳기 위해 현행 면역억제제 치료제와 병용될 수 있다.

본 발명의 TrkB 작용제는 다수의 자가면역 또는 관련 질환의 CNS 조직의 백혈구 침입을 감소시키는데 사용될 수 있다. MS에 대한 모델 외에도, EAE 마우스가 또한 시각 신경염을 연구하는데 사용된다. TrkB 작용제는 모든 이러한 질환 및 특히 백혈구 침입에 의해 매개된 다른 자가면역 장애에서 CNS 면역 침입을 완화시키는 것으로 예상된다. 용어 "질환" 및 "장애"가 구별없이 사용됨을 주목한다.

본 발명의 특징은 자가면역 질환을 앓는 동물에게 TrkB 작용제를 직접 투여하는 것이다. 본 발명의 바람직한 실시양태가 폴리펩타이드에 관하여 기재되었지만, 본 발명은 체내에서 암호화된-TrkB 작용제의 발현을 지시할 TrkB 작용제 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 투여를 포함한다. 직접적 DNA 주입 및 유전자 치료 전달 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. TrkB 작용제 폴리펩타이드 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 GA와 같은 약물의 투여에 의해 유도되는 것과 상반되게 동물에게 직접적으로 투여된다. 또한, 본 발명은 천연 TrkB 작용제 및/또는 작용제 항체와 동일한 방식으로 TrkB에 결합하고 활성화시키는 펩타이드유사 분자를 포함한다.

본원에 기재된 방법에 따라 사용하기 위한 특정 TrkB 작용제는 하기에 더욱 상세하게 기재되어 있다. 추가의 TrkB 작용제는 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 당해 분야의 숙련자에게 명백할 것이다.

천연 TrkB 작용제 및 이의 유도체

TrkB 작용제는 비제한적으로 공지된 TrkB 작용제 NT4 및 BDNF를 포함한, 천연 작용제 폴리펩타이드를 포함한다. NT4 및/또는 BDNF 폴리펩타이드 서열은 상응하는 TrkB 수용체와 동일한 종 또는 상이한 종으로부터의 것일 수 있으나, 단 생성된 폴리펩타이드는 TrkB에 결합하고 작용제로서 작용해야 한다.

TrkB 작용제는 천연 및 변이형 NT4(즉, NT-4/5 및 유사한 이름)를 포함한다. NT4 폴리펩타이드는 미국 특허 출원 공개 제 2005/0209148 호, 제 2003/0203383 호 및 제 2002/0045576 호, 및 국제 특허 출원 공개 제 WO 2005/08240 호에 기재되어 있다. NT4(즉, NT4/5) 폴리펩타이드는 여러 포유류에서 확인되어 왔다. 관심있는 아미노산 치환은 G77 내지 K, H, Q 또는 R; 및 R84 내지 E, F, P, Y 또는 W를 포함한다. 프로테아제 절단 부위는 반감기 또는 NT4 및 BDNF 폴리펩타이드를 연장시키기 위해 제거되거나 그의 활성을 조절하기 위해 첨가될 수 있다. TrkB 작용제는 반감기 연장 잔기, 예컨대 PEG, IgG Fc 영역, 알부민, 또는 펩타이드 또는 에피토프, 예컨대 Myc, HA(적혈구응집소), His-6 또는 FLAG에 접합되거나 융합될 수 있다.

BDNF 폴리펩타이드 또한 여러 포유류에서 확인되어 왔다(예컨대, 미국 특허 제 5,180,820 호 및 미국 특허 출원 공개 제 2003/0203383 호를 참고한다).

본 발명의 천연 및 변이형 NT4 및 BDNF 폴리펩타이드는 그들의 키메라, 변이체, 단편(펩타이드 포함) 및/또는 유도체를 포함한다. 바람직한 단편은 천연 폴리펩타이드, 또는 키메라, 공통 또는 돌연변이된 등가의 결합 부분의 TrkB-결합 부분을 포함한다. 변이체는 보존적 및 비-보존적 아미노산 치환을 갖는 천연 아미노산 서열 변이체를 포함한다.

보존적 치환은 유사한 크기, 전하 또는 소수성을 갖는 아미노산 잔기를 포함한다. 예를 들면, Ala는 Val, Leu 또는 Ile에 의해 치환될 수 있다. Arg는 Lys, Gln 또는 Asn에 의해 치환될 수 있다. Asn은 Gln, His, Lys 또는 Arg에 의해 치환될 수 있다. Asp는 Glu에 의해 치환될 수 있다. Cys는 Ser에 의해 치환될 수 있다. Gln은 Asn에 의해 치환될 수 있다. Glu는 Asp에 의해 치환될 수 있다. Gly는 Pro에 의해 치환될 수 있다. His는 Asn, Gln, Lys 또는 Arg에 의해 치환될 수 있다. Ile는 Leu, Val, Met, Ala, Phe 또는 노르류신에 의해 치환될 수 있다. Leu는 노르류신, Ile, Val, Met, Ala 또는 Phe에 의해 치환될 수 있다. Lys는 Arg, Gln 또는 Asn에 의해 치환될 수 있다. Met는 Leu, Phe 또는 Ile에 의해 치환될 수 있다. Phe는 Leu, Val, Ile 또는 Ala에 의해 치환될 수 있다. Pro는 Gly에 의해 치환될 수 있다. Ser은 Thr에 의해 치환될 수 있다. Thr은 Ser에 의해 치환될 수 있다. Trp는 Tyr에 의해 치환될 수 있다. Tyr은 Trp, Phe, Thr 또는 Ser에 의해 치환될 수 있다. Val은 Ile, Leu, Met, Phe, Ala 또는 노르류신에 의해 치환될 수 있다.

작용시 실질적 변형은 (a) 치환 구역에서 폴리펩타이드 골격의 구조를, 예컨대, 시트 또는 나선 형태로 유지하거나, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성을 유지하거나, 또는 (c) 측쇄의 크기를 유지하는데 있어서 그의 효과가 상당히 다른 치환을 선택함으로써 달성될 수 있다. 천연 잔기는 공통적인 측쇄 특성을 기준으로 하기 군으로 분류된다(이들 중 일부는 몇몇 작용기에 속할 수 있다):

(1) 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile, 노르류신;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

(5) 방향족: Trp, Tyr, Phe; 및

(6) 벤딩(bending)을 유도하는 잔기: Gly 및 Pro.

비-보존적 치환은 한 종류의 구성원을 다른 종류의 구성원으로 교환하거나, 상기에서 보존적이라 간주하지 않은 치환을 포함한다.

변이체는 천연 아미노산 서열 변이체 및 유전공학 처리된 변이체를 포함하지만, 단 생성된 폴리펩타이드 또는 유도체는 TrkB에 결합하고 작용제로서 작용해야 한다. TrkB 활성화를 측정하는 분석은 본원 및 인용된 참고 문헌에 기재되어 있다.

추가의 변이체는 NT3 및 NGF를 포함한 티로신 수용체 키나아제의 Trk 계열의 다른 관련 리간드로부터의 부분 아미노산 서열을 갖는 TrkB 작용제 폴리펩타이드를 포함한다. 추가로, 변이체는 공통 Trk 또는 공통 수용체 티로신 키나아제 결합 및/또는 활성화 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.

다른 유도체는 공유 및 비-공유적으로 변형된 펩타이드 및 폴리펩타이드(예컨대, 아실화된 폴리펩타이드, PEG화된 폴리펩타이드, 파네실화된 폴리펩타이드, 당화 폴리펩타이드 또는 인산화된 폴리펩타이드)를 포함한다. NT4의 특정 PEG화된 형태 및 다른 변형된 형태는 미국 특허 출원 공개 제 2005/0209148 호에 기재되어 있다. 폴리펩타이드는 결합 및/또는 활성을 조절하거나, 체내의 이미지 형성을 허용하거나, 반감기를 조절하거나, 혈액-뇌 장벽을 가로지른 수송을 조절하거나, 특정 세포 또는 조직으로의 폴리펩타이드의 표적화를 돕는 추가의 작용기를 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 변형(예컨대, PEG화, 당화 또는 다른 부위의 첨가)을 촉진하는 아미노산 치환을 포함할 수 있지만, 단 치환은 폴리펩타이드의 TrkB로의 결합 또는 작용제 활성에 실질적으로 영향을 주지 않아야 한다.

공통 변형은 생물학적 활성을 최소로 손실시키면서 전신적 청소를 감소시키는 PEG화이다. 폴리에틸렌 글라이콜 중합체(PEG)는 당해 분야에 공지된 방법(예컨대, 문헌[Roberts et al. (2002), Advanced Drug Delivery Reviews 54: 459-476] 및 [Sakane et al., (1997) Pharm. Res. 14: 1085-91]을 참고한다)을 사용하여 NT4 및 BDNF 폴리펩타이드(뿐만 아니라 TrkB 작용제 항체)의 다양한 작용기에 연결될 수 있다. PEG는, 예컨대 아미노 기, 카복실 기, 변형된 또는 천연 N-말단, 아민 기 및 티올 기에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표면 아미노산 잔기는 PEG 분자에 의해 변형된다. PEG 분자는 다양한 크기를 가질 수 있다(예컨대, 약 2 내지 40 kDa). NT4, BDNF 또는 다른 폴리펩타이드에 연결된 PEG 분자는 약 2000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000 Da 중 임의의 분자량을 가질 수 있다. PEG 분자는 단일 또는 분지쇄일 수 있다. PEG를 TrkB 작용제 폴리펩타이드에 연결하기 위해, 하나 또는 두 개의 말단에서 작용기를 갖는 PEG 유도체를 사용할 수 있다. 작용기는 폴리펩타이드 상의 이용가능한 반응성 기의 유형을 기준으로 선택된다. 폴리펩타이드에 유도체를 연결하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.

PEG화된 NT4는 동물에서 생성되고 NT4로서 작용하는 것으로 입증되었다(예컨대, 미국 특허 출원 공개 제 2005/0209148 호 및 국제 특허 출원 공개 제 WO 2005/082401 호의 실시예 6 및 7 참고). 성숙한 인간 NT4의 위치 50에서의 세린 잔기는 시스테인으로 변하여 NT4-S50C를 생성시킬 수 있으며, 이 NT4-S50C는 이어서 PEG화되고, 이때 PEG는 위치 50에서 시스테인에 연결된다. PEG에 대한 N-말단 특이적 부착의 한 예는 위치 1에서의 잔기를 세린 또는 트레오닌으로 돌연변이시켜 PEG화를 촉진시킨다. 유사한 방법이 BDNF 및 본 발명에 사용되는 다른 폴리펩타이드에 적용된다.

폴리펩타이드 또는 이들의 유도체는 직접적으로 또는 합성 연결기를 통해 다른 분자에 연결될 수 있다. 바람직한 TrkB 작용제 폴리펩타이드, 이의 단편 또는 유도체는 그 값이 기록되어 있는 천연 TrkB 작용제와 비교하여 유사하거나 더 우수한 결합 친화도, 선택성 및 활성화를 나타낸다. 작용제 폴리펩타이드의 작은 부분을 "펩타이드"로서 지칭할 수 있지만, 이러한 용어가 제한되는 것으로 간주되서는 안된다.

바람직한 TrkB 작용제는 동역학적 분석, EAE 동물 모델, KIRA 분석 및 뉴런 생존 분석을 포함한, 본원에 기재된 다양한 실험 및 분석에서 BDNF 및 NT4와 비교하여 유사한 생물학적 특성을 나타낸다.

TrkB 항체 작용제 및 이들의 유도체

TrkB 작용제는 이들의 작용제 항체, 단편, 변이체 및 유도체를 포함한다. 적합한 작용제 항체는 TrkB에 선택적이고, 천연 NT4 및 BDNF 폴리펩타이드와 유사하거나 더 큰 친화도로 결합한다. 그러나, 천연 TrkB 작용제와 비교하여 긴 순환 반감기를 갖는 항체는 결합 친화도를 덜 중요하게 만든다. 항체 38B8의 결합 친화도는 46 ± 10 nM인 것으로 결정되었다(상기 및 실시예 4 참고). 바람직한 TrkB 작용제 항체는 실시예 4에 기재된 특정 분석 조건을 사용하는 경우 100 nM 미만, 10 nM 미만, 1 nM 미만, 100 pM 미만, 또는 심지어 10 pM 미만의 Kd를 갖는다.

또한, 바람직한 TrkB 작용제는 결합 분석, EAE 동물 모델, KIRA 분석 및 뉴런 생존 분석을 포함한, 본원에 기재된 다양한 실험 및 분석에서 항체 38B8 (및 천연 작용제)과 비교하여 유사한 생물학적 특성을 나타낸다. 예를 들면, 바람직한 TrkB 작용제는 실시예 1(표 1 포함)에 기재된 뉴런 생존 분석에서 11 pM 미만의 EC₅₀ 값을 나타낸다. 바람직한 TrkB 작용제는 약 1 pM 내지 약 10 pM, 약 0.1 pM 내지 약 1 pM, 약 0.01 pM 내지 약 0.1 pM, 또는 심지어 0.01 pM 미만의 EC₅₀ 값을 갖는다. 예시적인 EC₅₀ 값은 38B8에 대해서는 0.2 pM이고, 36D1에 대해서는 5 pM이다. 또한, 바람직한 TrkB 작용제는 KIRA 분석(실시예 1, 표 1 포함)을 사용하여 항체 38B8과 비교하여 유사한 생물학적 특성을 나타낸다. 바람직한 TrkB 작용제는 KIRA 분석에서 50 nM 미만, 바람직하게는 약 5 nM 내지 50 nM 미만, 약 0.5 nM 내지 약 5 nM, 또는 심지어 0.5 nM 미만의 EC₅₀ 값을 갖는다. 예시적인 EC₅₀ 값은 제공된 분석 조건하에 약 5 nM이다.

TrkB 작용제 항체는 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체, 하이브리드, 공통, 키메라, 이중특이성 또는 접합된 항체를 포함한다. 항체는 적용가능한 경우 임의의 동형(즉, IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)일 수 있다. 항체는 항체 단편(예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 및 단일 쇄(ScFv) 항체)을 포함한다. 적합한 TrkB 작용제 항체 또는 이의 작용성 단편 및 유도체는, 예컨대 단클론 항체 작용제 38B8에 대하여 본원에 기재된 방식으로 TrkB에 결합하여 활성화시킨다. TrkB 작용제 항체는 항체 단편을 포함하며, 이는 항체로부터 유도된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. CDR 영역에서와 같이 항원 인지에 관계된 아미노산 서열이 특히 중요하다.

단클론 항체 및 마우스 하이브리도마 방법은 당해 분야에 널리 알려져 있다. 인간의 치료에 있어서 비인간 항체의 사용은 면역억제성 약물과 병용시 내성이 있을 수 있다. 상기 약물은 MS 증상 및 다른 자가면역 및 염증성 질환을 치료하거나 감소시키기 위해 일상적으로 투여된다. 면역조절성 약물은 당해 분야에 공지되어 있으며 글루코코르티코이드, 세포증식 억제제(예컨대, 알킬화제, 항대사물질, 메토트렉세이트, 아자티오프린 및 메르캅토푸린), 세포독성 항체(예컨대, T-세포 수용체 및 IL-2-특이적 항체), 이뮤노필린에 작용하는 약물(예컨대, 사이클로스포린, 타크롤리머스, 시롤리머스, 라파미신, RAPAMUNE, PROGRAF 및 FK506), 인터페론(예컨대, IFN-β), 아편유사제, TNF-결합 단백질(예컨대, 순환 수용체), 미코페놀레이트 및 외래 항체 또는 치료 항원에 대한 동물의 면역 반응을 억제하는데 사용되는 다른 생물학적 제제를 포함한다.

상이한 종, 예컨대 마우스로부터 유도된 단클론 항체를 인간화하는 방법은 당해 분야에 널리 알려져 있다. 인간의 치료를 위해, 인간 또는 인간화된 항체가 바람직하다. 인간화된 항체는 이들이 인간에게서 최소로 면역원성 또는 비-면역원성이도록 최소의 비-인간 아미노산을 포함한다. 바람직한 인간화된 항체는 인간 면역계에 의해 외래종인 것으로 인식되지 않는다. 상기 항체는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 항원-결합에 필요한 아미노산 잔기를 포함하는 면역글로불린 쇄의 다른 부분)일 수 있으며, 이때 항원 결합 부위 바깥의 대부분의 아미노산 서열은 인간 면역글로불린으로부터 유래된다. 상보성 결정 영역(CDR) 내의 아미노산 잔기는 또한 항원 결합이 부정적으로 영향을 미치지 않는 한 인간-특이적 잔기로 치환될 수 있다.

인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 배타적으로 또는 실질적으로 포함하는 항체이다. 또한, 인간 항체는, 선택적으로 다른 동물로부터의 중쇄 또는 경쇄와 함께, 하나 이상의 인간 중쇄 폴리펩타이드 또는 하나 이상의 인간 경쇄 폴리펩타이드, 또는 이의 실질적 단편을 포함하는 항체를 포함한다. 한가지 예는 뮤린 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체이다.

적합한 TrkB 작용제 항체, 이의 단편 또는 유도체는 유전자삽입 동물, 포유류 세포(B-세포 포함), 조류 세포, 곤충 세포, 효모 또는 박테리아에서 발현되거나 분비될 수 있다. 예를 들면, 적합한 인간 항체는 완전히 인간 또는 실질적으로 인간 면역글로불린을 생성시킬 수 있는 유전사삽입 동물(예컨대, 마우스)을 면역화시킴으로써 생성될 수 있다. 또한, 항체는 유전자 뒤섞기, 파지 디스플레이, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 디스플레이, 리보솜 디스플레이, mRNA 디스플레이, 단백질 단편 상보성 또는 RNA-펩타이드 스크리닝에 의해 생성될 수 있다. 인간화된 항체 및 인간 항체 및 이들의 유도체를 설계하고 생성하는 방법은, 예컨대 미국 특허 제 7,005,504 호, 제 6,800,738 호, 제 6,407,213 호, 제 6,054,297 호, 제 6,331,415 호 및 제 5,750,373 호(제넨테크(Genentech)); 미국 특허 제 6,833,268 호, 제 6,207,418 호, 제 6,114,598 호 및 제 6,075,181 호(압제닉스(Abgenix)); 미국 특허 제 6,498,285 호(알렉시온(Alexion)); 미국 특허 제 7,074,557 호, 제 5,885,793 호, 제 5,837,242 호, 제 5,733,743 호, 제 5,565,332 호(캠브리지 안티바디 테크놀로지(Cambridge Antibody Technology)); 미국 특허 제 7,118,879 호, 제 6,979,538 호, 제 6,326,155 호, 제 5,994,125 호, 제 5,837,500 호(다이악스(Dyax)); 미국 특허 제 6,753,136 호, 제 6,667,150 호, 제 6,300,064 호, 제 5,514,548 호(모르포젠/프로테인 디자인 랩스(MorphoGen/Protein Design Labs)); 및 미국 특허 제 6,461,824 호, 제 6,204,023 호, 제 5,821,123 호, 제 5,595,898 호, 제 5,576,184 호, 제 4,698,420 호(소마(Xoma)); 미국 특허 제 7,041,870 호, 제 6,680,209 호, 제 6,500,931 호, 제 6,111,166 호, 제 6,096,311 호, 제 6,071,517 호, 제 6,063,116 호(메르다렉스(Medarex)); 및 미국 특허 제 4,816,397 호(셀테크(Celltech))에 기재되어 있다. 인간 또는 인간화된 항체를 생성하는 방법은 또한 문헌[Vaughan et al. (1996) Nature Biotechnology 14:309-14], [Sheets et al. (1998) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 95:6157-6162], [Hoogenboom and Winter (1991) J. Mol. Biol., 227:381], [Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222:581], [Cole et al. (1985) in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Alan R. Liss) p. 77] 및 [Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95]에 기재되어 있다.

TrkB 작용제 항체는 공유적으로 및 비-공유적으로 변형(예컨대, 아실화, PEG화(예컨대, 실시예 5 참고), 파네실화, 당화, 인산화 등)될 수 있고, 결합을 조절하거나, 작용제 활성을 조절하거나, 체내에 폴리펩타이드의 이미지 형성을 허용하거나, 폴리펩타이드의 반감기를 조절하거나, 혈액-뇌 장벽을 가로지른 수송을 조절하는 추가의 작용기를 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 변형(예컨대, 추가의 PEG화, 당화 또는 다른 부위)을 촉진하는 아미노산 치환을 포함할 수 있지만, 단 치환은 폴리펩타이드의 TrkB로의 결합 또는 작용제 활성에 실질적으로 영향을 주지 않아야 한다. 폴리펩타이드 또는 이들의 유도체는 직접적으로 또는 합성 연결기를 통해 다른 분자에 연결될 수 있다.

적합한 항체 단편 또는 유도체는 본원 및 인용된 참고문헌에 기재된 TrkB-결합 및 활성화를 매개하는 아미노산 잔기를 포함한다. 항체 특이성은 상보성 결정 영역(CDR)으로서 공지된 6개의 작은 루프 영역 또는 경쇄 및 중쇄의 N-말단 근처에 위치한 과가변 루프 내의 잔기에 의해 주로 결정된다. 경쇄 내의 CDR은 일반적으로 아미노산 잔기 24 내지 34(CDR1-L), 50 내지 56(CDR2-L) 및 89 내지 97(CDR3-L)이다. 중쇄 내의 CDR은 일반적으로 아미노산 잔기 31 내지 35b(CDR1-H), 50 내지 65(CDR2-H) 및 95 내지 102(CDR3-H)이다. 몇몇 CDR의 길이는 다른 것보다 더 가변적이다. CDR1-L의 길이는 약 10 내지 17 잔기이지만, CDR3-H의 길이는 약 4 내지 26 잔기이다. 다른 CDR은 적절한 표준 길이를 갖는다. 문헌[Padlan, E.A., et al. (1995) FASEB. J. 133-39]. 본 발명에 사용하기 위한 바람직한 TrkB 작용제 항체 단편은 CDR 또는 CDR 내의 중쇄 및/또는 경쇄 도메인으로부터의 아미노산 잔기를 포함한다.

본 발명에 사용하기 위한 항체는 상기에 기재되고 당해 분야에 공지된 보존적 및 비-보존적 아미노산 치환을 갖는 천연 아미노산 서열 변이체를 포함한다.

바람직한 TrkB 작용제 항체, 이의 단편 또는 유도체는 천연 TrkB 작용제와 비교하여 유사하거나 더 우수한 결합 친화도, 선택성 및 활성화 능력을 나타낸다. 작용제 폴리펩타이드의 작은 부분을 "펩타이드"로서 지칭할 수 있지만, 이러한 용어가 제한되는 것으로 간주되서는 안된다.

TrkB 작용제 제형

TrkB 작용제는 중추 신경계에 영향을 미치는 자가면역 질환, 예컨대 다발경화증의 치료를 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, TrkB 작용제를 포함하는 조성물을 사용하여 본원에 정의된 포유류(인간 환자를 포함함)의 질병을 치료할 수 있다. TrkB 작용제 조성물은 당해 분야에 공지된 적합한 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 일반적으로, TrkB 작용제 조성물은, 비록 다른 투여 형태가 사용될 수 있을지라도, 주사(예컨대, 복강내, 정맥내, 피하, 근육내 등)로 투여하기 위해 제형화될 수 있다. TrkB 작용제는 이들을 수성 또는 비수성 용매, 예컨대 식물성 또는 다른 유사한 오일, 합성 지방족 산 글리세라이드, 고급 지방족 산 또는 프로필렌 글라이콜의 에스터 중에서, 바람직한 경우 가용화제, 등장제, 현탁제, 유화제, 안정화제 및 보존제와 같은 통상적인 첨가제와 함께 용해시키거나, 현탁시키거나, 유화시킴으로써 주사용 제제로 제형화시킬 수 있다.

적합한 담체, 희석제 및 부형제는 당해 분야에 널리 알려져 있으며, 탄수화물, 왁스, 수용성 및/또는 팽윤성 중합체, 친수성 또는 소수성 물질, 젤라틴, 오일, 용매, 물 등과 같은 물질을 포함한다. 사용되는 특정 담체, 희석제 또는 부형제는 본 발명의 화합물이 적용되는 수단 및 목적에 따라 좌우된다. 일반적으로, 안전한 용매는 물, 및 물에서 용해되거나 혼화될 수 있는 다른 비독성 용매와 같은 비독성 수성 용매이다. 적합한 수성 용매는 물, 에탄올, 프로필렌 글라이콜, 폴리에틸렌 글라이콜(예컨대, PEG400, PEG300) 등 및 이의 혼합물을 포함한다. 제형은 또한 하나 이상의 완충제, 안정화제, 계면활성제, 습윤제, 윤활제, 유화제, 현탁제, 보존제, 항산화제, 불투명화제, 유동화제, 가공 보조제, 착색제, 감미제, 향료, 향미제 및 약물(즉, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학 조성물)을 우아하게 표현하게 하거나 약학 제품(즉, 약제)의 제조에 도움이 되는 다른 공지된 첨가제를 포함할 수 있다. 몇몇 제형은 리포솜과 같은 담체를 포함할 수 있다. 리포솜 제제는, 사이토펙틴, 다층 소포 및 단층 소포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 경구 및 비경구 약물 전달을 위한 부형제 및 제형은 문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy (2000)]에 기재되어 있다.

투여 및 투약

본원에 예시된 투여 계획 및 치료 투여량은 동물의 무게, 혈중 TrkB 작용제의 반감기 및 TrkB 작용제의 친화도와 같은 인자를 기준으로 한다. 바람직한 투여 계획 및 투여량은 투여마다 치료량의 체내 TrkB 작용제를 유지한다. NT(천연 TrkB 작용제 포함)에 대한 효과적인 투여량 범위는 본원, 다비스(Davies) 등의 1993년 문헌 및 다른 참고 문헌에 예시되어 있다. 작용제 항체에 대한 효과적인 투여량 범위는 본원에 예시되어 있고(예컨대, EAE 동물에서 1 내지 10 mg/kg), 유사한 작용제 항체에 대한 최적 투여량을 결정하는 출발점을 제공할 것이다.

본 발명을 지지하여 수행되는 실험에 의해 증명되는 바와 같이(예컨대, 도 1B, 3 및 4 참고), 질병 과정 중 초기의 "펄스 치료"는 동물의 이환률을 감소시키기에 충분한 것으로 보인다. TrkB 작용제의 연속 투여는 치료 효능을 위해 요구되지 않을 수 있다.

특정 투약 섭생, 즉, 투여량, 시간 및 반복은 치료될 인간 또는 동물의 연령, 상태 및 체중에 따라 좌우된다. 초기 투약 섭생은 동물 실험으로부터 외삽 추정될 수 있다. TrkB 작용제 투여의 시간/빈도수는 그들이 적용되는 경우 특정 TrkB 작용제의 순환 반감기(또는 뉴런 조직의 반감기), 혈액-뇌 장벽을 통과하는 작용제의 양, 세포 내의 작용제 반감기, 독성 및 부작용을 기준으로 해야 한다.

본 발명의 연구에서, TrkB 작용제의 투여는 복강내(i.p.) 주사에 의해 수행될 수 있지만, 다른 투여 경로(예컨대, 정맥내, 피하, 근육내)가 효과적일 것으로 예상된다. 두개내 또는 수강내 투여(또는 CNS의 다른 조직으로의 투여)가 효과적일 것 같다. 투여의 다른 경로(예컨대, 구강, 설하, 윤활막내, 점막, 경피, 관절내, 질, 항문, 요도내, 비강, 귀, 흡입을 통해, 통기, 카테터를 통해, 볼러스로서, 스텐트 또는 다른 삽입가능한 장치로, 색전 조성물에서, 정맥내 점적에서, 패치 또는 용해 필름으로, 등)는 특정 TrkB 작용제, 그의 코팅, 접합 또는 특정한 생물학적 특성에 따라 적합할 수 있다.

TrkB 작용제는 바람직하게는 적합한 말초 경로를 통해 투여될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 적은 비율의 작용제는 혈액-뇌 장벽을 횡단할 수 있고, 중추 신경계의 세포로 전달될 수 있는 것으로 이해된다. 몇몇 경우, CNS로의 접근을 늘리는 말초로 투여된 TrkB 작용제의 양은 적다(심지어 1% 미만).

본 발명의 특징은 자가면역 질환을 앓는 포유류 대상에게 TrkB 작용제를 직접 투여하는 것이다. "직접"은 TrkB 작용제 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드의 발현을 지시할 수 있는 폴리뉴클레오타이드가 표준 경로의 접종에 의해 동물에게 전달되는 것을 의미한다. TrkB 작용제는 면역억제제, 예컨대 글루코코르티코이드, 세포증식 억제제(예컨대, 알킬화제, 항대사물질, 메토트렉세이트, 아자티오프린 및 메르캅토푸린), 세포독성 항체(예컨대, T-세포 수용체 및 IL-2-특이적 항체), 이뮤노필린에 작용하는 약물(예컨대, 사이클로스포린, 타크롤리머스, 시롤리머스, 라파미신), 인터페론(예컨대, IFN-β), 아편유사제, TNF-결합 단백질(예컨대, 순환 수용체), 미코페놀레이트 및 외래 항체 또는 치료 항원에 대한 동물의 면역 반응을 억제하는데 사용되는 다른 생물학적 제제를 포함한, 다른 약학적 제제와 병용하여 동물에게 전달될 수 있다.

천연 TrkB 작용제에 비해 TrkB 작용제 항체의 장점은 순환 단백질-리간드와 비교하여 항체가 비교적 긴 순환 반감기를 갖는 경향이 있다는 점이다. 예를 들면, 천연 작용제는 매일 투여를 필요로 하지만, 항체는 단지 주 1회 투여를 필요로 한다. 다른 장점은 항체가 보다 높은 결합 친화도를 갖는 경향이 있고, 그의 단백질 리간드에 대한 세포 수용체보다 그의 항원에 대해 더 선택적이라는 것이다.

TrkB 작용제에 의한 치료는 다발경화증 및 관련 장애를 위한 통상적인 치료제와 병용될 수 있다. 다발경화증의 치료 및 관리를 위한 통상적인 약물은 ABC(즉, 아보넥스-베타세론/베타페론-코팍손(Avonex-Betaseron/Betaferon-Copaxone)) 치료제(예컨대, 인터페론 베타 1a(아보넥스, 레비프(REBIF)), 인터페론 베타 1b(베타세론, 베타페론), 및 글라티라머 아세테이트(코팍손)); 화학요법제(예컨대, 미톡산트론(노반트론(NOVANTRONE)), 아자티오프린(이뮤란(IMURAN)), 사이클로포스파미드(사이톡산(CYTOXAN), 네오사르(NEOSAR)), 사이클로스포린(산드이뮨(SANDIMMUNE)), 메토트렉세이트, 및 클라드리빈(레우스타틴(LEUSTATIN)); 코르티코스테로이드 및 부신피질자극 호르몬(ACTH)(예컨대, 메틸프레드니솔론(데포-메드롤(DEPO-MEDROL), 소루-메드롤(SOLU-MEDROL)), 프레드니손(델타손(DELTASONE)), 프레드니솔론(델타-코르테프(DELTA-CORTEF)), 덱사메타손(메드롤(MEDROL), 데카드론(DECADRON)), 부신피질자극 호르몬(ACTH), 및 코르티코트로핀(ACTHAR)); 통증 중재(이상감각)(예컨대, 카바마제핀(테그레톨(TEGRETOL), 에피톨(EPITOL), 아트레톨(ATRETOL), 카르바트롤(CARBATROL)), 가바펜틴(뉴론틴(NEURONTIN)), 토피라메이트(토파막스(TOPAMAX)), 조니사미드(조네그란(ZONEGRAN)), 페니토인(디란틴(DILANTIN)), 데시프라민(노르프라민(NORPRAMIN)), 아미트립틸린(에라빌(ELAVIL)), 이미프라민(토프라닐(TOFRANIL), 이마바테(IMAVATE), 자니민(JANIMINE)), 독세핀(시네쿠안(SINEQUAN), 아다핀(ADAPIN), 트라이아다핀(TRIADAPIN), 조날론(ZONALON)), 프로트립틸린(비박틸(VIVACTIL)), 대마초 및 합성 카나비노이드(마리놀(MARINOL)), 펜톡시필린(트렌탈(TRENTAL)), 이부프로펜(뉴로펜(NEUROFEN)), 아스피린, 아세트아미노펜, 및 하이드록시진(아타락스(ATARAX)); 및 다른 치료제(예컨대, 나탈리주맙(안테그렌(ANTEGREN)), 알렘투주맙(캅패스-1H(CAMPATH-1H)), 4-아미노피리딘(팜프리딘(FAMPRIDINE)), 3,4 다이아미노피리딘, 엘리프로딜, IV 면역글로빈(감마가드(GAMMAGARD), 감마르-IV(GAMMAR-IV), 감이뮨 N(GAMIMUNE N), 이베감(IVEEGAM), 판글로불린(PANGLOBULIN), 산도글로불린(SANDOGLOBULIN), 베노글로불린(VENOGLOBULIN)), 프레가발린 및 지코노타이드)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

부품을 갖는 키트

본 발명은 본 발명의 방법을 실시하기 위한 부품을 갖는 키트(키트)를 제공한다. 키트는 본원에 기재된 본 발명의 임의의 방법에 따라 사용하기 위한 적합하게 단리되고 안정화된 TrkB 작용제 및 설명서를 포함한다. 일반적으로, 이러한 설명서는 TrkB 작용제를 투여하는 방법의 설명을 포함한다. 키트는 치료가 필요한 동물을 확인하고 치료 효과를 모니터하고 측정하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 설명서는 일반적으로 투여량, 투여 계획(투여 빈도수) 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 키트에 제공된 설명서는 서면으로 되거나, 데이터 파일 또는 스프레드시트의 형태로 기계/컴퓨터 판독가능할 수 있다.

키트는 또한 주사기, 바늘, 카테터, 흡입기, 펌프, 알콜 스왑(swap), 거즈, CNS 생검 장치, 조직학적 항체 및 염색 등을 포함한, TrkB 작용제를 투여하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 키트의 성분은 필요에 따라 멸균된다. 키트는 또한 비제한적으로 면역억제제, 예컨대 GA 및 덱사메타손을 포함한 추가의 약학 제제를 제공할 수 있다. 키트는 소인, 조작 방지 포장 및 무선 주파수 식별(RFID) 태그 또는 다른 재고 관리 특징부를 포함할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 추가로 설명하기 위해 제공된다. 본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 당해 분야의 숙련자에게 명백해질 것이다.

실시예 1: TrkB 작용제 항체의 생성 및 스크리닝

단클론 항-TrkB 작용제 항체를 생성하기 위한 면역화

Balb/C 마우스에게 항원으로서 인간 TrkB 세포외 도메인 8 ㎍을 규칙적인 계획으로 5회 주사하였다. His-태그된 인간 TrkB 세포외 도메인(잔기 31 내지 430)을 293 세포에서 벡터 pTriEx-2-Hygro(미국 위스콘신주 마디손 소재의 노바겐(Novagen))을 사용하여 발현시켰다. TrkB 세포외 도메인을 제조자의 지시에 의해 Ni-NTA 수지를 사용하여 정화시켰다(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아겐(Qiagen)). 처음 4회 주입 동안, 인간 TrkB를 RIBI 보조제 시스템 및 백반과 혼합하여 제조하였다. 총 8 ㎍의 항원을 11일 과정 동안 대략 매 3일 마다 목덜미, 발바닥 및 복강내로 주사하여 제공하였다. 13일째에, 마우스를 안락사시키고 비장을 제거하였다. 림프구를 8653 세포와 융합하여 하이브리도마 클론을 만들었다. 클론을 성장시킨 후 인간 및 래트 TrkB ELISA로 ELISA 스크리닝하여 항-TrkB 양성으로서 선택하였다.

ELISA 스크리닝 항-TrkB 항체:

성장한 하이브리도마 클론으로부터의 상청액을 인간 및 래트 TrkB 둘 다에 결합하는 능력에 대해 스크리닝하였다. 0.5 ㎍/ml 래트 또는 인간 TrkB-Fc 융합 단백질 중 100 ㎕으로 밤새 코팅된 96-웰 판을 사용하여 분석하였다. 0.05% 트윈(Tween)-20을 함유하는 PBS로 과량의 시약을 각 단계마다 웰로부터 세척하였다. 그 후, 판을 0.5% BSA를 함유하는 인산 완충된 염수(PBS)로 차단하였다. 판에 상청액을 첨가하고 2시간 동안 실온에서 배양하였다. 양고추냉이 과산화효소(HRP) 접합된 염소-항 마우스 Fc를 TrkB에 결합된 마우스 항체에 결합하도록 첨가하였다. 그 후, HRP를 위한 기질로서 테트라메틸 벤지딘을 첨가하여 상청액에 존재하는 마우스 항체의 양을 검출하였다. 반응을 멈추고, 항체의 상대적인 양을 450nm에서의 흡광도를 판독함으로써 정량화하였다. 50개의 항체가 ELISA 분석에서 양성인 것으로 나타났다. 이들 항체 중에서, 5개를 추가로 시험하였고 작용제 활성을 갖는 것으로 나타났다. 하기 표 2를 참고한다.

KIRA 분석:

이 분석은 인간 TrkB에 대한 수용체 티로신 키나아제 활성화를 유도하는 능력에 대해 ELISA에서 양성인 것으로 밝혀진 항체를 스크리닝하기 위해 사용하였다. 문헌[Sadick, et. al. (1997) Experimental Cell Research 234:354-61]. gD 태그된 인간 TrkB로 형질감염된 안정한 세포주를 사용하여, 천연 리간드인 BDNF 및 NT-4/5에서 보여진 활성화와 유사한 세포 표면 상의 수용체를 활성화시키는 능력에 대해 하이브리도마 클론으로부터 정제된 뮤린 항체를 시험하였다. 천연 리간드는 TrkB 수용체의 키나아제 도메인의 자가 인산화를 유도하였다. 세포를 다양한 농도의 항체에 노출시킨 후, 이들을 용해시키고 TrkB 수용체의 인산화를 검출하기 위해 ELISA를 수행하였다. 추정 TrkB 작용제 각각에 대해 EC₅₀(하기 표 2 및 도 10에 나타남)을 결정하고 천연 리간드 NT-4/5의 것과 비교하였다.

E15 결절성 뉴런 생존 분석:

E15 배아로부터 입수한 결절 신경절 뉴론을, 향신경 인자의 포화 농도에서 생존이 배양 48시간까지 100%에 근접하도록 BDNF에 의해 지지시켰다. BDNF 부재시, 5% 미만의 뉴론이 48시간까지 생존하였다. 따라서, E15 결절성 뉴런의 생존은 항-TrkB 항체의 작용제 활성을 평가하는 민감한 분석이다. 즉, 작용제 항체는 E15 결절성 뉴런의 생존을 촉진시킨다.

제 때에-교미된 임신한 스위스 웹스터(Webster) 암컷 마우스를 CO₂ 흡입에 의해 안락사시켰다. 자궁각을 제거하고 배아 단계 E15에서의 배아를 추출하였다. 결절 신경절을 해부한 후 트립신화하고, 기계적으로 해리하고 폴리-L-오르니틴 및 라미닌으로 코팅된 96-웰 판 중 소정의 무혈청 배지에서 웰 당 200 내지 300 세포의 밀도로 평판 배양하였다. 인간 BDNF에 대해 3배의 투여량-반응 방식으로 항-TrkB 항체의 작용제 활성을 평가하였다. 배양 48시간 후, 세포를 바이오멕(Biomek) FX 액체 처리 워크스테이션(벡맨 컬터(Beckman Coulter))에서 수행되는 자동화된 면역세포화학 프로토콜로 처리하였다. 프로토콜은 고정화(4% 포름알데하이드, 5% 슈크로스, PBS), 투과(PBS 중 0.3% 트립톤 X-100), 비특이적 결합 부위의 차단(5% 정상 염소 혈청, 0.1% BSA, PBS) 및 뉴런을 검출하기 위한 1차 및 2차 항체에 의한 순차적 배양을 포함하였다. 확립된 신경 표현형 마커인 단백질 유전자 생성물 9.5(PGP9.5 케미콘(Chemicon))에 대한 토끼 다클론 항체를 1차 항체로서 사용하였다. 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 염소 항-토끼(몰레큘러 프로브스(Molecular Probes))를, 배양물 중에 존재하는 모든 세포의 핵을 표시하기 위한 핵 염색 훽스트(Hoechst) 33342(몰레큘러 프로브스)와 함께 2차 시약으로서 사용하였다. 디스커버리(Discovery)-1/GenII 이미저(Imager)(유니버살 이미징 코포레이션(Universal Imaging Corporation)) 상에서 이미지 획득 및 이미지 분석을 수행하였다. 알렉사 플루오르 488 및 훽스트 33342에 대한 2개의 파장에서 이미지를 자동적으로 획득하였고, 이때 핵 염색은 이미저의 이미지-바탕 자동 포커스-시스템에 대한 참조점으로 사용하였는데, 이는 이것이 모든 웰에 존재하기 때문이다. 웰마다 이미지가 형성된 적절한 물체 및 여러 부위를 선택하여 각 웰의 전체 표면을 커버하였다. 항-PGP9.5 항체에 의한 그의 특이적 염색을 기반으로 배양 48시간 후에 각 웰에 존재하는 뉴런의 수를 계수하도록 자동화된 이미지 분석을 설정하였다. 선택성 필터에 기반한 형태와 형광 강도의 이미지 및 적용의 주의 깊은 역치는 웰 당 뉴런을 정확히 계수하였다. 추정 TrkB 작용제 항체 각각에 대한 EC₅₀(하기 표 1 및 도 8)을 결정하고 천연 리간드의 것과 비교하였다.

하기 표는 확인된 5개의 항-TrkB 항체 및 그들의 마우스 뉴런 생존에 대한 활성과 인간 TrkB에 대한 인산화 활성을 보여준다.

뉴론 생존 및 인산화에 대한 5개의 항-TrkB 항체의 효과

클론	HuTrkB ELISA	RatTrkB ELISA	마우스 뉴런 생존 분석(평가된 EC50)	인간 KIRA 분석(EC50)	마우스 무게에 대한 효과
18H6	+	+	0.01 pM	0.5 nM	시험되지 않음
38B8	+	+	0.2 pM	5 nM	감소
36D1	+	+	5 pM	5 nM	감소
37D12	+	+	50 pM	56 nM	변화 없음
23B8	+	+	11 pM	50 nM	변화 없음

항-TrkB 작용제 항체의 마우스로의 두개내 주사:

찰스 리버 래보래토리즈(Charles River Laboratories)(홀리스터 패실리티(Hollister facility))로부터 번식을 마친 수컷 C57B6 마우스(8 내지 12개월 연령)를 입수하고, 주사 전 적어도 5일 동안 사료와 물에 마음대로 접근하게 하면서 12시간 명/암 주기를 갖는 온도/습도-제어된 환경에 순응시켰다. 각 마우스를 아이소플루란으로 마취시키고 두개골 위쪽의 털 단면을 잘랐다. 마우스를 정위 외과 기구(Kopf 모델 900)에 고정시키고, 마취한 후 배지에 놓인 전기 가열 패드로 따뜻하게 유지시켰다. 면도된 두개골 부분을 베타딘으로 문질러 상기 영역을 멸균화시켰다. 귀의 바로 뒤에서 출발하여 눈을 향하여 두개골 위쪽에서 약 1 cm 길이의 작은 정중 동맥 세로 절개를 하였다. 두개골이 드러났고, 두개골 표면의 약 1 cm 직경의 원형 공간을 임의의 결합 조직이 제거되도록 면 스왑으로 닦았다. 표면을 30% 과산화수소에 침지된 면 스왑으로 닦아 정수리점이 드러났다. 두개골 깊이를 측정하는 프로브로서 드릴 팁을 사용하여, 두개골을 드릴링하기 전 수준을 보증하도록 수편 및 수직으로 조정하였다. 0.5 mm 후단과 비교하여 0.5 mm 두부로부터의 깊이 편차뿐만 아니라 0.5 mm 측면과 비교하여 0.5 mm 중막으로부터의 깊이 편차(정수리점에서 0으로 맞춤)를 ± 0.05 mm의 차이 내로 최소화하였다. 마우스 뇌 환추에 따른(문헌[Franklin, K.B.J. & Paxions, G., The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press, San Diego, 1997]), 단일, 측면, 시상하부내 주사를 위한 좌표는 다음과 같다: 정수리점으로부터 1.30mm 후단; 정중선으로부터 -0.5 mm; 깊이, 두개골 표면으로부터 5.70 mm(정수리점에서). 두개골을 통해 작은 구멍을 드릴링하여, 뇌와의 접촉을 방지하였다. 드릴을 하밀톤(Hamilton) 주사기(모델 84851)에 부착된 경사진 26 가우스 바늘로 교체하고 동일한 좌표로 되돌렸다. 화합물 2 ㎕를 2분의 과정을 거쳐 측면 시상하부에 점증적으로 주사하였다. 주사 후 30초 동안 같은 위치에서 바늘을 유지시킨 후 1 mm 들어올렸다. 다시 30초 후에, 바늘을 추가로 1 mm 들어올렸다. 30초 후에, 바늘을 완전히 제거하였다. 그 후, 절개를 봉합하고 2 내지 9 mm 와운드 클립(wound clips)(오토클립(Autoclip), 브레인트리 사이언티픽, 인코포레이티드(Braintree Scientific, Inc.))과 함께 고정시켰다. 0일째에 주사하였다. 15일까지 체중 및 사료 섭취를 모니터하였다.

표 1(상기)에 나타낸 바와 같이, 지정된 투여량에서 항체 38B8 및 36D1의 두개내 주사는 마우스의 체중 및 사료 섭취를 상당히 감소시켰다. 지정된 투여량에서 주어진 대조군 IgG 항체 및 23B8은 사료 섭취 또는 체중에 상당히 영향을 미치지 않았다. 항체 38B8을 생성하는 뮤린 하이브리도마 균주는 2007년 11월 21일 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801 소재의 미국 미생물 보관 센터(American Type Culture Collection)에 기탁되었고, ATCC 기탁 번호 PTA-8766으로 지정되었다.

실시예 2: TrkB 작용제의 확인

하기 방법 중 하나 이상을 포함한, 당해 분야에서 인정된 방법을 사용하여 TrkB 작용제(예컨대, 항체)를 확인할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제 5,766,863 호 및 제 5,891,650 호에 기재된 키나아제 수용체 활성화(KIRA) 분석을 사용할 수 있다. 이러한 ELISA-유형 분석은 선택된 rPTK의 가능한 작용제 또는 길항제의 확인 및 특성화에 적합할 뿐만 아니라 수용체 단백질 티로신 키나아제(rPTK, 예컨대 Trk 수용체)의 키나아제 도메인의 자가인산화를 측정함으로써 키나아제 활성화를 정성적 또는 정량적으로 측정하는데 적합하다. 상기 분석의 제 1 단계는 TrkB 수용체가 존재하는 경우, 키나아제 수용체의 키나아제 도메인의 인산화를 포함하고, 이때 수용체는 진핵 세포의 세포 막에 존재한다. 수용체는 상기 수용체를 암호화하는 내인성 수용체 또는 핵산, 또는 수용체 구조체일 수 있으며 세포로 형질전환될 수 있다. 전형적으로, 제 1 고체 상(예컨대, 제 1 분석 판의 웰)을, 세포가 고체 상에 부착되도록 실질적으로 균질한 상기 세포(일반적으로 포유류 세포주)의 개체군으로 코팅하였다. 종종, 세포는 부착성이 있으므로 자연적으로 제 1 고체 상에 부착된다. "수용체 구조체"가 사용되는 경우, 이는 일반적으로 키나아제 수용체의 융합부 및 플래그 폴리펩타이드를 포함한다. 플래그 폴리펩타이드는 분석 중 ELISA 부분에서 포획제, 종종 포획 항체에 의해 인식된다. 그 후, 후보 작용제와 같은 분석물을 부착 세포를 갖는 웰에 첨가하여, 티로신 키나아제 수용체(예컨대, TrkB 수용체)가 분석물에 노출(또는 접촉)된다. 이러한 분석으로 관심있는 티로신 키나아제 수용체(예컨대, TrkB)에 대한 작용제 리간드가 확인된다. 분석물에 노출시킨 후, 용해 완충제(그 안에 가용성 세정제가 있다)를 사용하여 부착 세포를 가용화시키고, 온화하게 교반하여, 세포 용해물을 방출시키며, 이는 세포 용해물을 농축 또는 정화할 필요 없이 분석 중 ELISA 부분으로 직접적으로 가해진다.

이렇게 제조된 세포 용해물은 그 후 분석 중 ELISA 단계로 가하기 쉽다. ELISA 단계 중 제 1 단계로서, 제 2 고체 상(일반적으로 ELISA 마이크로타이터판의 웰)을 티로신 키나아제 수용체에 특이적으로 결합하거나, 수용체 구조체인 경우 플래그 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 포획제(종종 포획 항체)로 코팅하였다. 제 2 고체 상의 코팅은 포획제가 제 2 고체 상에 부착되도록 수행하였다. 포획제는 일반적으로 단클론 항체이지만, 본원의 실시예에서 기재된 바와 같이, 다클론 항체 또는 다른 제제 또한 사용될 수도 있다. 그 후, 수득된 세포 용해물을 수용체 또는 수용체 구조체가 제 2 고체 상에 부착되도록(또는 제 2 고체 상에 포획되도록) 부착 포획제에 노출시키거나 부착 포획제와 접촉시킨다. 그 후, 세척 단계를 수행하여 결합되지 않은 세포 용해물을 제거하고 포착된 수용체 또는 수용체 구조체를 남긴다. 그 후, 부착 또는 포획된 수용체 또는 수용체 구조체를 티로신 키나아제 수용체에서 인산화된 티로신 잔기로 확인되는 항-포스포티로신 항체에 노출시키거나 항-포스포티로신 항체와 접촉시킨다. 바람직한 실시양태에서, 항-포스포티로신 항체는 비-방사성 색 시약의 색 변화를 촉진시키는 효소에 (직접적 또는 간접적으로) 접합된다. 따라서, 수용체의 인산화는 시약의 연이은 색 변화에 의해 측정될 수 있다. 효소는 항-포스포티로신 항체에 직접적으로 결합될 수 있거나, 접합 분자(예컨대, 비오틴)는 항-포스포티로신 항체에 접합될 수 있고, 효소는 이어서 접합 분자를 거쳐 항-포스포티로신 항체에 결합될 수 있다. 마지막으로, 항-포스포티로신 항체의 포획된 수용체 또는 수용체 구조체로의 결합은, 예컨대 색 시약의 색 변화에 의해 측정한다.

초기의 확인 후, 표적화된 생물학적 활성도를 시험하는 것으로 공지된 생물학적 검정에 의해 후보(예컨대, 항-TrkB 단클론 항체) 작용제 활성도를 추가로 확인하고 상세히 논할 수 있다. 예를 들면, TrkB에 작용하는 후보자의 능력을 전장 TrkB로 형질감염된 PC12 세포를 사용하는 PC12 신경돌기 증식물 분석으로 시험할 수 있다(문헌[Jian et al., Cell Signal. 8: 365-70, 1996]). 이 분석은 적절한 리간드에 의한 자극에 반응하는 래트 크롬친화세포종 세포(PC12)에 의한 신경돌기의 증식물을 측정한다. 이러한 세포는 내인성 TrkA를 발현하고, 따라서 NGF에 대해 반응성이다. 그러나, 이들은 내인성 TrkB를 발현하지 않고, 따라서 TrkB 발현 구조체로 형질감염되어 TrkB 작용제에 대한 반응을 이끌어 낸다. 후보자로 형질감염된 세포를 배양한 후, 신경돌기 증식물을 측정하고, 예컨대 세포 직경의 2배를 넘는 신경돌기를 갖는 세포를 계수하였다. 형질감염된 PC12 세포에서 신경돌기 증식물을 자극하는 후보자(예컨대, 항-TrkB 항체)는 TrkB 작용제 활성을 증명한다.

또한, TrkB의 활성화는 배발생의 특이적 단계에서 다양한 특이적 뉴런을 사용함으로써 결정될 수 있다. 적절하게 선택된 뉴런은 생존을 위한 TrkB 활성화에 의존적일 수 있고, 따라서 시험관내 이들 뉴런의 생존에 이어서 TrkB의 활성화를 결정할 수 있다. 적절한 뉴런의 1차 배양물로 후보자를 첨가하면, 후보자가 TrkB를 활성화시키는 경우, 적어도 며칠 동안 상기 뉴런의 생존이 야기된다. 이는 TrkB를 활성화시키는 후보자(예컨대, 항-TrkB 항체)의 능력을 결정하게끔 한다. 이러한 유형의 분석의 한 예에서, E15 마우스 배아로부터 결절 신경절을 해부하고 해리한 후, 생성된 뉴런을 저 밀도에서 조직 배양 접시에서 평판 배양하였다. 그 후, 후보자 항체를 배지에 첨가하고 판을 24 내지 48시간 동안 배양하였다. 이 시간 후에, 뉴런의 생존을 임의의 다양한 방법으로 평가하였다. 전형적으로, 작용제가 수용된 샘플은 대조군 항체가 수용된 샘플에 비해 증가된 생존률을 보였으며, 이는 작용제의 존재를 결정하게 해준다. 예컨대, 문헌[Buchman et al (1993) Development 118(3): 989-1001]을 참고한다.

TrkB 작용제는 TrkB를 암호화하는 DNA의 형질감염 후 또는 자연적으로 TrkB를 발현하는 여러 가지 세포 유형에서 하류 신호를 활성화하는 능력에 의해 확인될 수 있다. 이러한 TrkB는 인간 또는 다른 포유류(예컨대, 설치류 또는 영장류) TrkB일 수 있다. 하류 신호 연쇄반응은 TrkB 발현 세포의 여러 가지 생화학적 또는 생리학적 매개변수, 예컨대, 단백질 발현의 수준 또는 단백질의 단백질 인산화의 수준 또는 세포의 대사 또는 성장 상태로의 변화 수준(본원에 기재된 뉴런 생존 및/또는 신경돌기 증식물을 포함)으로 변화시킴으로써 검출될 수 있다. 관련된 생화학적 또는 생리학적 매개변수의 검출 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.

실시예 3: 항체 결합 친화도 결정

항체의 일작용성 Fab 단편의 결합 친화도를 측정함으로써 항체의 TrkB로의 결합 친화도를 결정할 수 있다. 일작용성 Fab 단편을 얻기 위해, 항체(예컨대, IgG)는 파파인으로 절단되거나 재조합적으로 발현될 수 있다. 항체의 항-TrkB Fab 단편의 친화도는 표면 플라즈몬 공명(미국 뉴저지주 피스카웨이 소재의 바이아코어 인코포레이티드(BIAcore, Inc.)의 BIAcore3000(상표명) 표면 플라즈몬 공명(SPR) 시스템)에 의해 결정될 수 있다. CM5 칩은 공급자의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이니드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)에 의해 활성화될 수 있다. 인간 TrkB-Fc 융합 단백질("hTrkB")(또는 임의의 다른 TrkB, 예컨대 래트 TrkB)은 pH 5.0의 아세트산나트륨 10 mM로 희석되고 0.0005 mg/ml의 농도에서 활성화된 칩 상에 주입될 수 있다. 개별 칩 채널을 건너는 가변적인 시간 흐름을 사용하여, 두 가지 범위의 항원 밀도가 달성될 수 있다: 상세한 동역학적 연구에 있어서는 200 내지 400 반응 단위(UR) 및 스크리닝 분석에 있어서는 500 내지 1000 RU. 칩은 에탄올아민에 의해 차단될 수 있다. 재생성 연구는 피어스(Pierce) 용리 완충제(미국 일리노이주 락포드 소재의 피어스 바이오테크놀로지(Pierce Biotechnology)의 제품 번호 21004)와 4 M NaCl(2:1)의 혼합물이 효과적으로 결합 Fab를 제거하면서 200 주입에 걸쳐 칩 상의 hTrkB의 활성도를 유지함을 보여주었다. HBS-EP 완충제(0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P29)를 바이아코어 분석용 실행 완충제로서 사용하였다. 정제된 Fab 샘플의 계열 희석물(0.1-10× 평가된 K_D)을 100 ㎕/분에서 1분 동안 주입하고, 2시간까지의 해리 시간이 허용되었다. 표준물로서 공지된 농축(아미노산 분석에 의해 결정됨)의 Fab를 사용하는 Fab 단백질의 농도를 ELISA 및/또는 SDS-PAGE 전기이동에 의해 결정하였다. BIA평가 프로그램을 사용하여 데이터를 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델(문헌[Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994), Methods Enzymology 6: 99-110])에 동시에 맞춤으로써 동역학적 결합률(k_온) 및 해리율(k_오프)(일반적으로 25℃에서 측정됨)을 얻었다. 평형 해리 상수(K_D) 값을 k_오프/k_온으로서 계산하였다.

실시예 4: 바이아코어에 의해 측정된 리간드/수용체 상호작용의 동역학적 분석

일반적인 방법:

CM5 센서 칩이 장착된 바이아코어 3000 기계(스웨덴 업살라 소재의 바이아코어 AB)를 사용하여 25℃에서 상호작용 분석을 수행하였다. 바이아코어로부터 HBS-EP 실행 완충제(수용체를 고정시키기 위해 사용됨)를 아민-커플링 시약(NHS, EDC, pH 4.5의 아세테이트 및 에탄올아민)과 함께 구매하였다. R&D 시스템스에서 Fc-융합된 재조합 인간 수용체(TrkA, TrkB, TrkC 및 P75) 및 천연 리간드(NGF, BDNF, NT4/5 및 NT3)를 구매하거나 사내에서 제조하였다.

수용체의 고정:

저 농도(전형적으로 500 RU 또는 4 fmol/mm²)에서 CM5 센서 칩 상에 수용체(칩 당 3)를 고정시켜 표준 표면으로서 작용하는 비변형된(칩에 대해) 하나의 흐름 세포를 남겼다. 표준 아민-커플링 프로토콜을 5 ㎕/분으로 HBS-EP 실행 완충제에서 사용하였고, 3 단계를 포함하였다. 요약하면, 이는 3 단계를 포함한다. 먼저, 흐름 세포를 50 mM NHS 중 EDC 200 mM의 새롭게 제조된 혼합물을 7분 주입하여 활성화시키며, 이 단계는 칩의 카복실산 기를 반응성 에스터로 전환시켰다. 다음으로, 수용체를 pH 4.5에서 10 mM 아세트산나트륨 완충제 중 약 10 ㎍/ml로 희석시키고 목적하는 수준에 도달할 때까지 칩에 커플링시켰다. 마지막으로, 과량의 반응성 에스터를 1 M 소듐 에탄올아민-HCl(pH 8.5)을 7분 주입하여 차단시켰다.

리간드의 분석:

리간드(NGF, BDNF, NT4/5 및 NT3)를 실행 완충제(10 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM (NH₄)₂SO₄, 1.5 mM CaCl₂, 1 mM EGTA 및 0.005% (v/v) 트윈-20)에서 5배의 증분으로 0.08 내지 250 nM 범위의 농도로 계열 희석시켰다. 항체 200.38B8(38B8)의 Fab 단편을 3배 증분으로 0.7 내지 480 nM로 희석시켰다. 샘플을 100 ㎕/분으로 30초 동안 주입하여 해리 시간을 10분 이하로 하였다. 각 결합 주기 후, 수용체 표면을 온화한 산성 칵테일(10 mM 글라이신-HCl (pH 4.0), 500 mM NaCl 및 20 mM EDTA)로 재생성시켰다. 중복 주입으로 분석이 재현가능함을 확인하였다. 결합 데이터를 모두 대량 수송 모델로 맞춤으로써 동역학적 속도 상수(k_온 및 k_오프)를 결정하고, 그들의 비로부터 결합 친화도를 계산하였다(K_D = k_오프/k_온).

결과:

패널 중 대부분의 리간드/수용체 상호작용은 속도에 대해 빠른 확산-제한을 특징으로 하며, 이는 바이오코어의 분해(k_온 약 1 × 10⁷ 1/Ms)를 넘는 것이었다. 주목할 만한 예외는 ProNGF인데, 이는 전형적으로 속도가 느리게 나타났다. 오프 속도는 보다 가변적이며, 예컨대 ProNGF 또는 성숙 NGF의 TrkA와의 상호작용은 속도를 매우 늦췄으나(T1/2 > 1시간), NT3/TrkA 상호작용은 수초내에 감속되었다(T1/2 = 9초). 38B8-Fab/TrkB 상호작용은 2상 오프 속도를 가졌고, 따라서 단지 감속의 초기 상만을 모델에 맞추었다. 수용체를 낮은 농도에서 칩에 코팅하여, 이량체 리간드가 이웃한 수용체 분자들 사이에서 분자간 시스-가교될 수 없도록 이들을 충분히(평균) 이격시켰다. 이량체 리간드는 입체 구속으로 인해 Fc-융합된 수용체 분자의 두 팔들 사이에서 분자내 가교될 수 있는 것으로 보이지 않는다. 리간드가 그들의 이용가능한 2개의 결합 부위 중 1개를 통해서만 강제로 결합되는 조건을 촉진시킴으로써, 우리는 데이터를 단순한 1:1 결합 모델로 맞추는 것이 당연하다는 욕구와 느낌을 최소화시켰다.

전체 동역학적 분석(상호작용은 높은 친화도에서 낮은 친화도까지 매겨졌다)

리간드/수용체	k온(1/MS)	k오프(1/s)	KD(nM)
NGF/TrkA	>1e7	(1.88±0.02)e-4	<0.018±0.009
ProNGF/TrkA	7.16e5	1.41e-5	0.02
BDNF/TrkB	>1e7	1.3e-3	<0.034
NT45/TrkB	>1e7	(2.0±0.2)e-3	<0.20±0.02
NT3/TrkC	>1e7	0.0151	<0.9
NGF/P75	>1e7	(4.9±0.5)e-2	<1.7±0.2
NT3/P75	>1e7	0.164	<1.7
BDNF/P75	8.38e6	0.0174	<2.1
NT3/TrkB	>1e7	(4.4±0.8)e-2	<4.4±0.8
NT45/TrkA	(2.1±0.6)e6	(4±2)e-2	17±11
NT3/TrkA	(4.4±1.0)e6	(8±2)e-2	18±6
38B8-Fab/TrkB	(1.4±0.9)e5	(6±3)e-3	46±10
NT45/P75	3.45e6	0.305	88
ProNGF/P75	6.58e5	0.0858	130
ProNGF/TrkB	-	-	NB
ProNGF/TrkC	-	-	NB
NGF/TrkB	-	-	NB
NGF/TrkC	-	-	NB
BDNF/TrkA	-	-	NB
BDNF/TrkC	-	-	NB
NT45/TrkC	-	-	NB
38B8-Fab/TrkA	-	-	NB
38B8-Fab/TrkC	-	-	NB
38B8-Fab/P75	-	-	NB
주: 1. "평균 ± 표준편차"는 두 개의 독립적 실험에서 분석된 상호작용들에 대해 주어진다. 2. 이태릭체의 온 속도는 바이오코어의 분해에서(> 1e7 1/Ms) 매우 빠른 오프 속도를 보여주는데 이는 이들이 확산 제한에 접근하기 때문이다. 이를 컷-오프 값으로 사용하였고, 이는 전체 KD가 단지 한계로서만 인용될 수 있음을 의미한다. 3. NB는 특정 리간드/수용체 쌍에 대해 어떠한 결합도 검출되지 않음을 나타낸다(문헌으로부터 공지된 특이성과 일치됨).

실시예 5: TrkB 작용제의 직접적인 투여는 동물의 이환률을 감소시킨다

본 발명을 지지하여 수행되는 실험에서, TrkB 작용제의 직접적인 투여는 CNS-특이적 자가면역 질환을 갖는 동물의 이환률 및 CNS 조직 손상을 감소시키는 것으로 나타났다(도 1A 및 1B). 천연 TrkB 작용제 NT4의 재조합 형태를 미국 특허 출원 공개 제 2005/0209148 호에 기재된 바와 같이 생성시켰고, 이를 MOG-유도 후 C57BL/6 암컷 마우스에게 투여하였다(0일째).

MOG-유도 후 10일이 되는 날 동물에게 매일 NT4(10 mg/kg, n =8)를 투여하였다(도 1A). 대조군 동물에게 비히클을 투여하였다(n = 8). 동물을 다음과 같은 이환률로 점수를 매겼다: 0 = 정상; 1 = 절뚝거리는 꼬리; 2 = 중등도 뒷 다리 쇠약; 3 = 중등 고도 뒷 다리 쇠약(동물은 여전히 어렵게 걸을 수 있다); 4 = 고도 뒷 다리 쇠약(동물은 그들의 뒷 다리를 움직일 수 있지만 걸을 수는 없다); 5 = 완전한 뒷 다리 마비; 6 = 폐사. NT4로 처리된 동물은 대조군 동물에 비해 이환률이 상당히 감소한 것으로 나타났다. 이 결과로 TrkB 작용제가 만성 EAE의 진행을 늦추는데 효과적임이 증명되었다.

도 1B는 MOG 유도 후 상이한 시간 동안 NT4로 매일 처리된 동물의 이환률을 도시한다. 동물은 대조군 IgG(n = 9), 3일부터 9일까지(n = 8) NT4, 또는 9일부터 15일까지(n = 8) NT4로 처리되었다. 모든 투여 계획은 동물 이환률을 감소시키는데 효과적이었다. NT4에 의해 제공된 보호성이 초기에 투여될 경우(즉, 초기 "펄스 치료") 말기에 투여되는 것보다 (낫지는 않더라도) 적어도 우수하다. 이러한 결과는 효과적인 치료를 위해 TrkB 작용제로의 처리를 증상 발병시까지 계속할 필요가 없음을 보여준다. TrkB 활성화는 EAE 유도에서 상대적으로 상류인 단계를 표적으로 할 수 있다.

실시예 6: 매우 선택적인 TrkB 작용제 항체의 확인

TrkB 작용제 항체를 확인하는 실험 및 관찰은 실시예 1 내지 4에 기재되어 있다. 항체 중 하나, 즉 항체 38B8의 추가의 특성화는 항체가 TrkA, TrkC 또는 p75에 공칭 결합하는 것을 보여주면서 TrkB에 대해 매우 선택적이라는 것을 나타내었다(도 2). TrkA, TrkB, TrkC 및 p75에 대한 38B8 Fab 단편의 상대적인 친화도를 천연 작용제 NGF, BDNF 및 NT4의 것과 비교하였다. 도 2의 각 패널은 시간에 대한 상대적 결합을 나타내는 그래프이다. 항체 38B8은 TrkB에 특이적이고 분석된 다른 수용체 티로신 키나아제에 현저히 결합하지 않는 것으로 나타났다. 38B8은 천연 작용제 BDNF 및 NT4보다 TrkB에 대해 훨씬 더 선택적이며, 이는 일부 교차-반응성을 나타내었다. 예상되는 바와 같이, NGF는 TrkB에 거의 결합하지 않으며 TrkA 및 p75 뉴로트로핀 수용체에 우선적으로 결합하는 것으로 입증되었다. 38B8의 결합 친화도는 46 ± 10 nM로 결정되었다. 이들 리간드-수용체 상호작용의 동역학적 분석(k_온, k_오프 및 k_D 포함)은 실시예 4, 특히 표 2에 제공되어 있다.

BDNF 및 NT4는 38B8 항체 작용제보다 TrkB에 대해 더 큰 친화도를 갖는 것으로 보인다. 그러나, 결합 실험은 천연 리간드의 이량체 형태 및 38B8 Fab의 단량체 형태로 수행하였다. 또한, 일반적으로 항체는 성장 인자보다 훨씬 더 긴 순환 반감기를 가져서 심지어 그의 표적 수용체에 대해 낮은 결합 친화도를 가지면서도 효과적이게 한다. TrkB 작용제 항체를 추가의 연구에 사용하였다.

실시예 7: TrkB 작용제 항체는 자가면역 질환의 이환률을 감소시키는데 효과적이다

동물 실험은 TrkB 작용제 항체가 대조군 면역글로불린과 비교하여 EAE 이환률로부터 현저히 보호한다는 것을 보여주었다(도 3). MOG 유도 후, 5 mg/kg 작용제 항체(38B8, n = 9) 또는 대조군 IgG(n = 9)을 9일 및 16일째에 투여하여 마우스를 처리하였다. TrkB 작용제 항체는 MOG-유도 후 16일만큼 늦게 그리고 임상 증상 발병 후 투여될 경우 효과적이다(도 4). 투여 후, 예컨대, 유도 후 18일날 이환률 감소는 덜 효과적이었다(도 5A). 후 처리 후 임상 증상의 차이는 이원 ANOVA 분석에 기초하여 현저하지 않았다.

다른 동물에서, MOG-유도 후 22일째 글라티라머 아세테이트(GA, 코팍손, 티삽리(TYSABRI))의 투여는 이환률을 감소시키는데 효과적이었다(도 5B). 이러한 결과는 TrkB 작용제의 작용 메커니즘이 GA 및 다른 현행 MS 약물과 상이하다는 것을 시사한다.

TrkB 작용제 항체를 MS 치료를 위한 다른 현행 약물, 즉 덱사메타손과 비교하였다. 도 6A는 TrkB 작용제 항체 38B8(5 mg/kg, 9일째 및 16일째에 주 1회씩) 또는 3 내지 12일째에 매일 덱사메타손(4 mg/kg) 또는 에탄올 비히클(대조군)을 투여 한 후 동물의 이환률을 나타내는 그래프를 도시하고 있다. 결과는 TrkB 작용제의 유리한 효과가 면역억제성 덱사메타손의 효과와 유사하다는 것을 증명하였다. TrkB 작용제-처리된 동물은 대조군 동물과 비교하여 체중이 감소하는 경향이 있다(도 6B).

TrkB 작용제 항체의 유리한 효과는 투여량-의존적이었다. 도 7A 및 7B는 1(n = 8) 또는 5 mg/kg(n = 9) 38B8 또는 5(n = 10) 및 10 mg/kg(n =9 ) 38B8의 투여 후 동물 이환률의 차이를 보여준다. 결과는 5 mg/kg 작용제 항체가 1 mg/kg보다 이환률로부터 더 보호(즉, 이환률이 낮다)하면서, 10 mg/kg이 5 mg/kg과 비교하여 이환률을 더욱 감소시킨다는 것을 증명하였다. 증가된 보호성은 보다 높은 투여량에서 덜 표명되었고, 이는 추가의 TrkB 작용제를 투여할 경우 한계 치료 값을 가진다는 것을 시사한다.

실시예 8: TrkB 작용제 항체 및 NT는 배양물에서 신경 세포를 보호한다

NT는 시험관내 뉴런 세포 생존 분석(문헌[Davies, A., et al. (1993) Neuron 11565-74])을 사용하여 뉴런 생존을 촉진시키는 것으로 나타났다. 유사한 분석을 사용하여 TrkB 작용제 항체가 천연 TrkB 작용제와 동일한 방식으로 뉴런 세포에 영향을 미침을 증명하였다(실시예 1 참고). 대조군 배양물(향신경 인자가 없음) 중의 모든 뉴런은 실질적으로 48시간 내에 사멸되었다. 그러나, BDNF, NT3, NT4 또는 NGF의 존재하에 배양된 뉴런 중 60 내지 80%는 48시간 동안 생존하였다(동일 문헌).

본 발명을 지지하여 수행되는 실험에서, 증가량의 TrkB 작용제 항체 38B8, 23B8, 36D1, 37D12 및 19H8(예컨대, 표 1을 포함한 실시예 1 참조)을 상기 기재한 뉴런 배양물에 첨가하였다(도 8). 몇몇 변화와 함께, 증가량의 TrkB 작용제 항체를 첨가하여 뉴런 생존을 증가시켰다(38B8에 대해서는 10 내지 100 pM 범위에서 75% 이상까지였고, 19H8에 대해서는 0.1 내지 10 pM 범위에서 100% 이상까지였다). 뉴런 생존 분석에서 항체 38B8의 EC₅₀ 값은 0.2 pM였다. 뉴런 생존 분석에서 38B8, 23B8, 36D1 및 37D12에 대한 EC₅₀ 값 및 인간 KIRA 분석에서 이들 항체의 EC₅₀ 값 및 이들의 동물 체중에 대한 효과(TrkB 작용제에 대해 인식된 반응)를 실시예 1에서 논하고 표 1에 요약하였다. 11 pM이라는 보다 높은 EC₅₀ 값을 갖는 항체 23B8이 동물 체중에 대한 효과를 생성하지 못하였음을 주목하고, 이는 TrkB 작용제 생물학적 활성을 위해 11 pM 미만의 EC₅₀ 값이 필요하다는 것을 시사한다. 5 pM의 EC₅₀ 값을 갖는 항체 36D1은 동물 체중에 대한 효과를 생성하였다. 이러한 데이터는 NT에 대해 보고된 결과와 일치하였으며, 이는 TrkB 작용제 항체가 천연 TrkB 작용제와 동일한 방식으로 뉴런 세포에 영향을 미친다는 것을 증명하였다.

실시예 9: TrkB 작용제는 주로 면역억제를 통해 작용하지 않는다

MS 치료를 위한 현행 약물(GA 및 덱사메타손 포함)은 면역조절제이며, 면역 반응에 대해서 면역억제 효과 및 다른 효과를 나타낸다. TrkB 작용제의 치료 효과가 또한 면역 억제 수준인지 아닌지를 결정하기 위해, 동물을 TrkB 작용제 항체(38B8) 또는 비히클 단독(대조군)으로 처리하였고, 상이한 동형(즉, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgM)에 대해 순환 MOG(미엘린)-특이적 항체의 수준을 측정하였다(도 9). MOG-특이적 항체 수준의 몇몇 변화가 TrkB 항체 처리 후 관찰되었지만, 동물 이환률의 현저한 감소를 설명하기에 충분한 것으로 보이지 않는다. 본 발명에 따른 특정 메커니즘에 속하지 않지만, 상기 결과는 TrkB 작용제가 항-MOG 항체의 생성을 억제함으로써 작용하지 않고, 따라서 통상적인 면역억제제로서 작용하는 것으로 보이지 않음을 시사한다.

TrkB 작용제가 미엘린에 의해 자극되는 T-세포 및 B-세포의 능력을 억제하는 지 아닌지를 결정하기 위해, 비장단핵세포 증식 분석을 사용하여 TrkB 작용제의 존재하에 단리된 비장 세포를 자극하는 MOG의 능력을 측정하였다. 비교를 위해, 비장단핵세포를 면역억제제 덱사메타손의 존재 하에 MOG로 자극시켰다.

MOG-유도된 비처리된 동물(대조군)(n = 9) 또는 MOG-유도된 TrkB 작용제 항체(38B8)-처리된 동물(n = 8)로부터의 비장 세포를 MOG 단독(0), 또는 TrkB 작용제 항체(38B8; 50 ㎕/mg)와 MOG, 또는 두 가지 농도(10^-8 M 및 10^-5 M) 중 하나의 농도에서의 덱사메타손의 존재하에 시험관내에서 배양하였다. 도 10을 참조하여, MOG에 의해 시험관내에서 자극되지 않은 비장단핵세포에 대한 다양한 양의 비장단핵세포 자극을 y 축 상에 표시하였다.

TrkB 작용제 항체의 존재는 비장단핵세포 자극에 뚜렷한 영향을 미치지 않았으며, 보다 낮은 농도의 면역억제제 덱사메타손을 갖는 경우도 그러하였다. 덱사메타손은 10^-5 M의 높은 농도에서 MOG-자극을 방해하였다.

전반적으로, TrkB 작용제-처리된 동물로부터 입수한 비장단핵세포는 대조군-처리된 동물과 동일한 방식으로 MOG 자극에 반응하며, 이는 TrkB 작용제로 처리된 동물이 정상적인 항-MOG T-세포 및/또는 B-세포 반응을 생성하는 능력을 보유한다는 것을 나타낸다. 추가적으로, TrkB 작용제-처리된 동물 및 대조군 동물로부터 입수한 비장단핵세포는 배양 매질 중 TrkB 작용제의 존재와 유사하게 반응한다. 이러한 관찰은 면역억제제 덱사메타손과 TrkB 작용제의 작용 메커니즘이 상이하며, TrkB 작용제의 작용 메커니즘이 주로 백혈구 증식 수준에서가 아님을 더욱 시사한다.

실시예 10: TrkB 작용제는 CNS의 염증성 세포 침입을 차단하며 미엘린탈락을 감소시킨다

동물에서 TrkB 작용제가 보호를 매개하는 메커니즘을 더욱 이해하기 위해 조직학적 분석을 수행하였다. 척수 절편을 대조군 및 TrkB 작용제 항체 (38B8)-처리된 동물로부터 제조한 후 미엘린을 염색하기 위해 루솔 패스트 블루로 염색하고 세포체를 염색하기 위해 크레실 바이올렛으로 염색하였다(도 11). 대조군 동물에서, 염색은 미엘린-발현 뉴런 세포의 배경에 대한 백혈구 침입 및 세포 파괴 영역을 나타냈다. 감소된 백혈구 침입은 TrkB 작용제로 처리된 동물로부터 제조된 절편에서 관찰되었다. 일부 TrkB 작용제-처리된 동물은 CNS 백혈구 침입의 증거가 실질적으로 나타나지 않았다.

두 개의 백혈구 마커, 즉 T-세포 상에 존재하는 CD3 및 대식세포에 존재하는 CD68에 특이적인 항체를 사용하여 침입 세포를 확인하였다. 도 12는 CD3 항체로 염색한 결과를 나타낸다. 다수의 밝게 염색된 강조 영역이 특히 크레실 바이올렛으로 어둡게 염색된 동일한 영역에서 뚜렷하였다. TrkB 작용제-처리된 마우스로부터 입수한 척수 절편은 상당히 염색이 덜 되었으며, 이는 상기 처리된 동물에서 T-세포 침입이 실질적으로 감소되었음을 나타낸다. 또한, 척수 절편을 단핵구와 결합된 CD68 마커에 특이적인 항체로 염색하였다(도 13). 대조군 마우스로부터 제조된 절편은 특히 크레실 바이올렛 및 CD3-특이적 항체로 강하게 염색된 동일한 영역에서 TrkB 작용제-처리된 마우스로부터의 절편보다 더 강하게 염색되었다. 이러한 관찰은 TrkB 작용제-처리된 동물로부터의 척수 조직을 대조군 동물과 비교할 경우 실질적으로 감소된 T-세포 및 단핵구 침입이 보인다는 것을 나타낸다.

척수 절편을 루솔 패스트 블루로 염색하여 미엘린탈락을 측정하였다. 대조군 마우스의 뇌는 다량의 림프구 침입을 갖는 구역에 상응하는 고도 미엘린탈락 영역(즉, 도 14에서 검정 화살표로 표시한 바와 같은 염색 부재)을 보였으며, 이는 TrkB 작용제로 처리된 마우스에서는 뚜렷하지 않았다. 고도 미엘린탈락 및/또는 뉴런 사멸 영역은 TrkB 작용제-처리된 동물의 절편에서 관찰되지 않았다. 이와 함께, CNS 조직 절편의 조직화학적 염색 결과는 TrkB 작용제 처리가 CNS의 림프구 및 단핵구 침입을 감소시킨다는 것을 증명하였다.

천연 및 인공 TrkB 작용제 둘 다는 EAE 진행을 늦추는데 효과적이다. 천연 작용제 NT4 및 작용제 항체는 둘 다 질병 진행을 늦추는데 효과적이다. 작용제 항체는 TrkB에 대한 가장 높은 선택성을 입증하였고, 이를 사용하여 TrkB 작용제가 EAE 진행에 영향을 미치는 메커니즘을 더욱 연구하였다. TrkB 작용제는 EAE 증상의 발병 전 및 발병 후 수일에 투여될 경우 효과적이다(일반적으로 이러한 특정 동물에서 12일 또는 13일). MOG-유도 후 16일전(또는 증상 발병 후 약 4일)에 투여하는 것이 이환률을 감소시키는데 효과적이다. TrkB 작용제의 유리한 효과는 투여량-의존적이며, 감소된 이환률은 증가하는 TrkB 작용제의 투여량과 관련된다. 조직화학적 실험은 TrkB 작용제가 T-세포 및 단핵구에 의한 CNS 조직의 침입을 감소시킨다는 것을 보여주었다. 미엘린에 대한 염색은 TrkB 작용제-처리된 동물의 신경 세포에 대해 감소된 손상을 나타내었다.

상기 분석에서 시험되는 다른 약물과 달리, TrkB 작용제는 주로 면역억제를 통해 작용하지 않는다. 이는 TrkB 작용제가 MOG-특이적 자가면역 항체의 생성에 영향을 미치지 않는다는 관찰로 증명되었다. 또한, TrkB 작용제로 처리된 MOG-유도된 동물로부터 단리된 비장단핵세포는 시험관내에서 MOG에 의해 자극되는 능력을 보유하였다. 따라서, TrkB 작용제는 다른 화합물, 예컨대 GA 및 덱사메타손과 상이한 방식으로 작용한다.

본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 예시적인 목적이며 이러한 견지로서 다양한 변경 또는 변화가 당해 분야의 숙련자에게 제시될 것이며 이는 본원의 범주 및 범위에 포함되는 것으로 이해된다. 본원에서 인용된 모든 문헌, 특허 및특허 출원은 각 개별적인 문헌, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로서 인용된 것으로 나타낸 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로서 인용된다.

Claims (10)

1. 포유류의 중추 신경계에 영향을 미치는 자가면역 장애를 치료하는데 사용되는 약제의 제조에 있어서 티로신 수용체 키나아제 B(TrkB) 작용제의 용도.
2. 제 1 항에 있어서,

   자가면역 장애가 실험적 자가면역성 뇌척수염인 용도.
3. 제 1 항에 있어서,

   자가면역 장애가 다발경화증인 용도.
4. 제 1 항에 있어서,

   TrkB 작용제가 천연 TrkB 작용제인 용도.
5. 제 4 항에 있어서,

   천연 TrkB 작용제가 NT4인 용도.
6. 제 4 항에 있어서,

   천연 TrkB 작용제가 BDNF인 용도.
7. 제 1 항에 있어서,

   TrkB 작용제가 항체인 용도.
8. 제 7 항에 있어서,

   TrkB 작용제가 항체 단편 또는 그의 유도체인 용도.
9. ATCC 기탁 번호 PTA-8766으로 기탁된 하이브리도마 균주에 의해 생성된 단리된 단클론성 TrkB 작용제 항체.
10. ATCC 기탁 번호 PTA-8766으로 기탁된 하이브리도마 균주.

Images