JP7419544B2 - 抗ＩＬ－１β抗体 - Google Patents

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Description

本開示は、医薬の分野に関する。より具体的には、本開示は、ヒトＩＬ－１βに結合する抗体（ＩＬ－１ベータまたはＩＬ－１βまたはインターロイキン－１βは、本明細書において同じ意味を有する）に関し、炎症性疾患（アテローム性動脈硬化性心血管疾患（ＡＳＣＶＤ）、心不全、がん、およびまれな遺伝性障害（例えば、ＩＬ－１βの過剰生成をもたらす遺伝性変異）を含むが、これらに限定されない）の治療および／または予防に有用であり得る。本開示はまた、これらの炎症性疾患を治療および／または予防する方法に関する。
心血管疾患（ＣＶＤ）は、心臓や血管が関与する疾患の一種である。ＣＶＤの一般的な症状には、とりわけ、狭心症、心筋梗塞（ＭＩ、一般に心臓発作として知られている）、脳卒中、心不全、および不整脈が含まれる。疾患の複雑な性質のために、疾患の開始および進行に寄与する多くの危険因子が特定されている。これらには、脂質異常症、高血圧、糖尿病、タバコの使用、不健康な食事、運動不足、および肥満が含まれる。しかしながら、これらの伝統的な危険因子を制御しようとする努力にもかかわらず、心血管疾患は、依然として米国および世界中で主要な死因となっている。
過去２０年間の研究では、ＣＶＤ、特にアテローム性動脈硬化性心血管疾患（ＡＳＣＶＤ）の病因における重要な要素として、炎症過程が強調されてきた。１９９０年代半ばの疫学データは、高感度Ｃ反応性タンパク質（ｈｓＣＲＰ）またはインターロイキン－６（ＩＬ－６）のいずれかによって測定される炎症が、従来の危険因子とは独立して、一次予防と二次予防の両方の将来の主要な有害心血管事象（ＭＡＣＥ）と強く関連していることを示した（Ｒｉｄｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．７２：３３２０－３３３１）。前臨床研究では、アテローム性動脈硬化症のプラークの開始と進行における炎症の役割も示されている（Ａｄａｙ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｆｒｏｎｔ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．６：１６ ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｃｖｍ．２０１９．０００１６）。重要なことに、炎症はプラークの不安定化および破裂にも寄与し、ＭＩや脳卒中などの急性心血管事象を引き起こす。
インターロイキン－１ファミリーは、炎症の中心的な要素であり、様々な炎症性疾患の治療標的としてよく研究されてきた（Ｓｚｅｋｅｌｙ ｅｔ．ａｌ．（２０１８）Ｃａｒｄｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．７：２５－４４）。ＩＬ－１遺伝子ファミリーには、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１ｒａ）の３つのメンバーがある。ＩＬ－１αおよびＩＬ－１βは、ＩＬ－１受容体のアゴニストであるのに対し、ＩＬ－１ｒａは特異的受容体アンタゴニストであり、したがって、ＩＬ－１（ＩＬ－１αまたはＩＬ－１β）の内因性競合阻害因子である。ＩＬ－１βは、ＩＬ－１の主要な循環形態である。これは、前駆体（プロＩＬ－１β）として生成され、様々な炎症性刺激の下、ＮＬＲＰ３（ＮＯＤ、ＬＲＲ、およびパイリンドメイン含有タンパク質３）インフラマソームを介して活性化される。重要なことに、アテローム性動脈硬化症に関連することが知られている複数の因子が、ＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化することが最近発見された。これらには、コレステロール結晶、アテローム易発性（ａｔｈｅｒｏｐｒｏｎｅ）振動流、低酸素、および好中球細胞外トラップが含まれ、アテローム発生におけるＮＬＲＰ３インフラマソーム－ＩＬ１β経路の重要な役割を支持する（Ｒｉｄｋｅｒ（２０１６）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１１８：１４５－１５６）。
ＩＬ－１βの活性型は、オートクライン、パラクライン、および内分泌作用があり、したがって、広範囲の炎症性疾患に関与している。マックル・ウェルズ症候群（ＭＷＳ）、クリオピリン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）、および新生児期発症多系統炎症性症候群（ＮＯＭＩＳ）などのまれな遺伝性障害は、とりわけ、ＩＬ－１βの過剰生成に関連している。カナキヌマブ（ＩＬ－１β抗体）、アナキンラ（ＩＬ－１Ｒ拮抗薬）、リロナセプト（ＩＬ－１トラップ）による介入はすべて、これらの過剰生成症候群の症状を改善する（Ｒｉｄｋｅｒ（２０１６）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１１８：１４５－１５６）。
ＩＬ－１βの阻害は、炎症性の素地を有するがんの治療にも役割を果たしている可能性がある。多くの悪性腫瘍は、慢性炎症の領域で発生し、炎症の解消が不十分であると、腫瘍の浸潤、進行、および転移に主要な役割を果たす可能性がある（Ｇｒｉｖｅｎｎｉｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｅｌｌ １４０：８８３－８９９）。炎症は、肺がんの病態生理学的な関連性があり、例えば、喫煙またはその他の外部から吸入された毒素は、持続的な炎症反応を引き起こす。この炎症性活性化は、部分的には、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化を介して媒介され、活性型ＩＬ－１βが局所的に生成される。臨床では、ｈｓＣＲＰおよびＩＬ－６の高いベースライン濃度が、その後に診断された肺がんと関連していることがわかっている。カナキヌマブによるＩＬ－１β遮断は、総がん死亡率、偶発的肺がんおよび肺がん死亡率の低下と関連していた（Ｒｉｄｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｌａｎｃｅｔ ３９０：１８３３－１８４２）。
したがって、本開示は、様々ながんの治療または予防に有用であり得、がんとして、肺がん（例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ））、乳がん（例えば、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ））、前立腺がん（例えば、転移性前立腺がん）、血液がん（例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫（例えば、低リスクまたは中リスクの骨髄異形成性白血病））、胃がん（食道がんを含む）、卵巣がん、腎臓がん、肝臓がん（例えば、肝細胞がん（ＨＣＣ））、皮膚がん（例えば、黒色腫）、頭頸部がん、脳がん、大腸がん、膀胱がん、膵臓がん、および腎臓がん（例えば、限局性腎臓がん）が挙げられるが、これらに限定されない。
ヒトＩＬ－１βに結合する治療用抗体を提供する必要性が依然として存在する。特に、好ましい臨床的性状を有するＩＬ－１β抗体を提供する必要性が依然として存在する。
本開示は、ヒトＩＬ－１βに対する操作されたヒト抗体を包含する。本開示の抗体は、以下の特性のうちの１つ以上を有する：（１）望ましい結合親和性ならびに／または会合速度および解離速度で、ヒトおよびカニクイザルＩＬ－１βに結合すること、（２）強力なＩＬ－１βの中和活性、（３）ＩＬ－１βに対する高い特異性、ならびに（４）低い免疫原性リスク。
本開示は、操作されたＩＬ－１β抗体およびそれをコードするＤＮＡを含むベクター、ならびに抗体を生成するための方法を提供する。加えて、本開示は、炎症性疾患（例えば、心血管疾患およびがん）を治療するための操作されたＩＬ－１β抗体の使用を提供し、これは、ＩＬ－１βシグナル伝達の調節（例えば、拮抗）および／またはＩＬ－１βの過剰生成の影響の緩和から恩恵を受ける可能性がある。
したがって、一部の実施形態では、本開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むヒトＩＬ－１βタンパク質に結合する抗体であって、ＶＨが、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＶＬが、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が、ＡＡＳＧＦＴＦＳＤＨＹＭＳ（配列番号７）を含み、
ＨＣＤＲ２が、ＹＩＳＳＳＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号８）を含み、
ＨＣＤＲ３が、ＡＲＥＡＤＳＳＧＹＹＹＶＧＶＤＶ（配列番号９）を含み、
ＬＣＤＲ１が、ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号１１）を含み、
ＬＣＤＲ２が、ＹＧＡＳＳＤＱＳ（配列番号１２）を含み、
ＬＣＤＲ３が、ＱＱＧＹＹＦＰＰＴ（配列番号１３）を含む、抗体を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、ＶＨが、配列番号６を含み、ＶＬが、配列番号１０を含む、抗体を提供する。他の実施形態では、本開示は、ＶＨが、配列番号６からなり、ＶＬが、配列番号１０からなる、抗体を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、ＶＨが、配列番号１７または配列番号１８を含み、ＶＬが、配列番号１０を含む、抗体を提供する。他の実施形態では、本開示は、ＶＨが、配列番号１７または配列番号１８からなり、ＶＬが、配列番号１０からなる、抗体を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号２を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号４を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む抗体を提供する。一部の実施形態では、抗体は、配列番号２からなるＨＣと、配列番号４からなるＬＣとを含む。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１５または配列番号１６を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号４を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む、抗体を提供する。他の実施形態では、本開示は、配列番号１５または配列番号１６からなる重鎖（ＨＣ）と、配列番号４からなる軽鎖（ＬＣ）とを含む、抗体を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号２のアミノ酸２～４４５を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号４を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む、抗体を提供する。他の実施形態では、本開示は、配列番号１５または配列番号１６のアミノ酸２～４４５を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号４を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む、抗体を提供する。
一部の実施形態では、抗体のエピトープは、抗体：抗原複合体のＸ線結晶構造を取得し、抗原上のどの残基が目的の抗体上の残基の４．５Å以内にあるかを特定することによって決定される。一実施形態では、本発明の抗体は、残基Ｒ１２０、Ｅ１５３、Ｋ２１９、Ｅ２２１、Ｎ２２４、Ｍ２６４、Ｑ２６５、Ｆ２６６、およびＳ２６８のうちのいくつかまたはすべてを含むエピトープで、ヒトＩＬ－１β（配列番号１）に結合する。
一部の実施形態では、抗体は、操作されたヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプを有する。
好ましい実施形態では、抗体は、操作されたヒトＩｇＧ４アイソタイプを有する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号２または４をコードする核酸配列を含む。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１５または４をコードする核酸配列を含む。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１６または４をコードする核酸配列を含む。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号２をコードする第１の核酸配列と、配列番号４をコードする第２の核酸配列とを含む、ベクターを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１５をコードする第１の核酸配列と、配列番号４をコードする第２の核酸配列とを含む、ベクターを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１６をコードする第１の核酸配列と、配列番号４をコードする第２の核酸配列とを含む、ベクターを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号２をコードする核酸配列を含む第１のベクターと、配列番号４をコードする核酸配列を含む第２のベクターとを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１５をコードする核酸配列を含む第１のベクターと、配列番号４をコードする核酸配列を含む第２のベクターとを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１６をコードする核酸配列を含む第１のベクターと、配列番号４をコードする核酸配列を含む第２のベクターとを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号２をコードする第１の核酸配列と、配列番号４をコードする第２の核酸配列とを含むベクターを含む、細胞を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１５をコードする第１の核酸配列と、配列番号４をコードする第２の核酸配列とを含むベクターを含む、細胞を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１６をコードする第１の核酸配列と、配列番号４をコードする第２の核酸配列とを含むベクターを含む、細胞を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号２をコードする核酸配列を含む第１のベクターと、配列番号４をコードする核酸配列を含む第２のベクターとを含む、細胞を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１５をコードする核酸配列を含む第１のベクターと、配列番号４をコードする核酸配列を含む第２のベクターとを含む、細胞を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１６をコードする核酸配列を含む第１のベクターと、配列番号４をコードする核酸配列を含む第２のベクターとを含む、細胞を提供する。
一実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。
一実施形態では、本開示は、抗体を生成するための方法であって、上記の細胞を、前記抗体が発現される条件下で培養し、次いで前記発現された抗体を培養培地から回収することを含む方法を提供する。
一実施形態では、本開示は、上記の細胞を、抗体が発現される条件下で培養し、前記発現された抗体を培養培地から回収することによって生成される抗体を提供する。
一実施形態では、本開示は、本開示の抗体と、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体とを含む、医薬組成物を提供する。
一実施形態では、本開示は、２つの軽鎖と、２つの重鎖とを含む抗体であって、各軽鎖が、配列番号４で与えられるアミノ酸配列を有し、各重鎖が、配列番号２で与えられるアミノ酸配列を有する抗体を提供する。
一実施形態では、本開示は、２つの軽鎖と、２つの重鎖とを含む抗体であって、各軽鎖が、配列番号４で与えられるアミノ酸配列を有し、各重鎖が、配列番号１５または配列番号１６で与えられるアミノ酸配列を有する抗体を提供する。
一実施形態では、本開示は、疾患を予防するための方法であって、本開示の抗体と、許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを投与することを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、炎症性疾患を治療するための方法であって、炎症性疾患が、心臓血管疾患、がん、マックル・ウェルズ症候群（ＭＷＳ）、クリオピリン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）、新生児期発症多系統炎症性症候群（ＮＯＭＩＳ）、関節リウマチ、全身型若年性特発性関節炎（ｓｏＪＩＡ）、痛風関節炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、１型糖尿病、２型糖尿病、家族性寒冷自己炎症性症候群（ＦＣＡＳ）、および眼疾患（例えば、加齢黄斑変性）を含むがこれらに限定されないリストから選択される方法を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、心血管疾患を治療するための方法であって、心血管疾患が、アテローム性動脈硬化性心血管疾患（ＡＳＣＶＤ）、または心不全を含むがこれらに限定されないリストから選択される、方法を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、がんを治療するための方法であって、がんのタイプが、肺がん（例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ））、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）、転移性前立腺がん、低または中リスクの骨髄異形成白血病、および限局性腎臓がんを含むがこれらに限定されないリストから選択される、方法を提供する。
一実施形態では、本開示は、療法に使用するための本開示の抗体を提供する。一実施形態では、本開示は、炎症性疾患の治療に使用するための本開示の抗体を提供する。一実施形態では、本開示は、心血管疾患の治療に使用するための本開示の抗体を提供する。一実施形態では、本開示は、がんの治療に使用するための本開示の抗体を提供する。さらなる実施形態では、本開示は、炎症性疾患の治療に使用するための本開示の抗体を提供し、炎症性疾患が、心血管疾患である。さらなる実施形態では、本開示は、炎症性疾患の治療に使用するための本開示の抗体を提供し、炎症性疾患が、がんである。
さらなる実施形態では、本開示は、炎症性疾患の治療用の薬剤の製造のための本開示の抗体の使用を提供する。さらなる実施形態では、本開示は、心血管疾患またはがんの治療用の薬剤の製造のための本開示の抗体の使用を提供する。
添付の特許請求の範囲を含めて本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの単数形の単語は、文脈が別途明確に指示しない限り、それらの対応する複数の指示対象を含む。
本明細書で使用される場合、「抗体」は、抗原に結合する免疫グロブリンポリペプチド分子である。天然に存在する完全長抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重鎖（Ｈ）鎖と２つの軽鎖（Ｌ）とを含む免疫グロブリン分子である。各鎖のアミノ末端部分は、その中に含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）を介した抗原認識を主に担う約１００～約１１０アミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を定義する。
ＣＤＲには、フレーム領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在している。各軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ、ＶＬとしても知られている）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ、ＶＨとしても知られている）は、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される。軽鎖の３つのＣＤＲは、「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３」と称され、重鎖の３つのＣＤＲは、「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３」と称される。ＣＤＲは、抗原との特異的相互作用を形成する残基の大部分を含む。よく知られているＫａｂａｔの番号付け規則に従った、ＶＬおよびＶＨ領域内のＣＤＲアミノ酸残基の番号付けと配置。
軽鎖は、カッパまたはラムダとして分類され、当該技術分野で既知の特定の定常領域によって特徴付けられる。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプを、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥとして定義する。ＩｇＧ抗体は、サブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４にさらに分けることができる。各重鎖のタイプは、当該技術分野で周知の配列を有する特定の定常領域によって特徴付けられる。
一部の生物学的システムおよび生成方法では、抗体は、当該技術分野で周知の他の修飾の中でも、グリコシル化、脱アミド化、アシル化、酸化、環化、フコシル化などの翻訳と同時および翻訳後の修飾を受ける可能性がある。別の既知の修飾は、重鎖を含む重鎖可変領域のＮ末端のグルタミンまたはグルタミン酸のピログルタミン酸（しばしば、ｐｙｒＧｌｕ、ｐｙｒＥ、ｐＧｌｕ、またはｐＥと略される）への環化である。使用する方法および抗体に応じて、ピログルタミン酸に変換されるグルタミン酸の割合は異なり、混合物を表す場合があり、実質的にすべての生成される抗体または非常に低い割合の抗体が関与する。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、例えば、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一のコピーまたはクローンに由来する抗体を指し、それが生成される方法ではない。本開示のｍＡｂは、好ましくは、均一または実質的に均一な集団に存在する。完全なｍＡｂには、２つの重鎖および２つの軽鎖が含まれている。モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージ提示技術、合成技術、例えばＣＤＲ移植、またはそのような技術または当該技術分野で既知の他の技術の組み合わせにより生成することができる。
「操作されたヒト」または「操作されたヒトＩＬ－１β抗体」という語句は、本発明による結合特性および機能的特性を有し、ヒトＩＬ－１βに結合し、かつヒトバリアントのフレームワーク配列と実質的に類似もしくは同一のフレームワーク配列（非ヒト抗体に由来するＣＤＲを取り囲む）を含むように操作されているフレームワーク領域を有するように生成および／または操作されたモノクローナル抗体を指す。ヒト抗体およびヒト化抗体は、当該技術分野でよく知られている。本明細書の操作されたヒト抗体は、エフェクター特性もしくは生体機能的特性、または生物物理学的特性（とりわけ、安定性、開発可能性、および／または溶解性など）を変化させるために、例えば、定常領域において、天然配列と比較して意図的に改変され得る。本明細書の別の実施形態は、操作されたヒト抗体を含み、完全にヒトもしくは実質的に完全にヒトの重鎖および／または軽鎖の定常領域を含む。本明細書の別の実施形態は、ジスルフィド結合によって相互接続された２つのＨＣと２つのＬＣとを含む免疫グロブリン分子を含み、完全にヒトまたは実質的に完全にヒトのＨＣおよびＬＣの定常領域を含む。
かかる操作されたヒト抗体の「抗原結合断片」には、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、および単鎖Ｆｖ断片が含まれる。
「フレームワーク領域」または「フレームワーク配列」は、フレームワーク領域１～４のうちのいずれか１つを指す。本開示に包含される操作ヒト抗体およびその抗原結合断片は、フレームワーク領域１～４のうちのいずれか１つ以上が、実質的にまたは完全にヒトである（すなわち、個々の実質的にまたは完全にヒトのフレームワーク領域１～４の可能な組み合わせのいずれかが存在する）分子を含む。例えば、これには、フレームワーク領域１およびフレームワーク領域２、フレームワーク領域１およびフレームワーク領域３、フレームワーク領域１、２、および３などが実質的または完全にヒトである分子が含まれる。実質的にヒトのフレームワークは、既知のヒト生殖系列フレームワーク配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するものである。ヒトフレームワークの生殖系列配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）から、またはＭａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ ＬｅｆｒａｎｃおよびＧｅｒａｒｄ Ｌｅｆｒａｎｃの「Ｔｈｅ ２０ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ＦａｃｔｓＢｏｏｋ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ２００１，ＩＳＢＮ ０１２４４１３５１）から入手することができる。例えば、生殖系列軽鎖フレームワークは、Ａ１１、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２０、Ａ２７、Ａ３０、Ｌ１、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ２、Ｌ５、Ｌ１５、Ｌ６、Ｌ８、Ｏ１２、Ｏ２、およびＯ８からなる群から選択することができ、生殖系列重鎖フレームワーク領域は、ＶＨ２－５、ＶＨ２－２６、ＶＨ２－７０、ＶＨ３－２０、２５ＶＨ３－７２、ＶＨ１－４６、ＶＨ３－９、ＶＨ３－６６、ＶＨ３－７４、ＶＨ４－３１、ＶＨＩ－１８、ＶＨＩ－６９、ＶＩ－１３－７、ＶＨ３－１１、ＶＨ３－１５、ＶＨ３－２１、ＶＨ３－２３、ＶＨ３－３０、ＶＨ３－４８、ＶＨ４－３９、ＶＨ４－５９、およびＶＨ５－５１からなる群から選択することができる。
本明細書で使用される「ＩＬ－１β」（ＩＬ－１ベータまたはＩＬ－１βまたはインターロイキン－１βとしても知られている）は、ＩＬ－１の主要な循環形態を指す。これは、様々な炎症性疾患の下で、ＮＬＲＰ３インフラマソームを介して、活性化される前駆体（プロＩＬ－１βまたはＩＬ－１βプロタンパク質）として生成される。ヒトプロＩＬ－１βは、配列番号１のアミノ酸配列またはそのバリアントを含む。成熟ヒトＩＬ－１βタンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列またはそのバリアントを含む。
本明細書で使用される「炎症性」には、炎症性疾患と自己炎症性疾患の両方が含まれる。「炎症性疾患（複数可）」という用語には、心血管疾患、がん、ＩＬ－１βの過剰生成をもたらすまれな遺伝性疾患、およびＩＬ－１βシグナル伝達の調節（例えば、拮抗）から恩恵を受ける可能性がある他の疾患が含まれるが、これらに限定されない。「炎症性疾患」には、心血管疾患、心不全、がん、マックル・ウェルズ症候群（ＭＷＳ）、クリオピリン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）、新生児期発症多系統炎症性症候群（ＮＯＭＩＳ）、関節リウマチ、全身型若年性特発性関節炎（ｓｏＪＩＡ）、痛風関節炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、１型糖尿病、２型糖尿病、家族性寒冷自己炎症性症候群（ＦＣＡＳ）、および眼疾患（例えば、加齢黄斑変性を含む）が含まれ得る。
本明細書における「心血管疾患」という用語は、心臓または血管が関与する疾患のクラスを指す。ＣＶＤの症状の非網羅的なリストには、狭心症、心筋梗塞（ＭＩ、一般に心臓発作として知られている）、脳卒中、心不全、および不整脈が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書における「がん」という用語は、身体の他の部分に浸潤または拡散する可能性のある異常な細胞増殖を伴う一群の疾患を指す。がんの種類の非網羅的なリストには、肺がん（例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ））、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）、転移性前立腺がん、低リスクまたは中リスクの骨髄異形成白血病、および限局性腎臓がんが含まれるが、これらに限定されない。したがって、がんは、脳、乳房、大腸、皮膚、肝臓、腎臓、肺、膵臓、前立腺、頭頸部、卵巣、子宮、膀胱、胃（食道を含む胃）、結合組織（例えば、肉腫や骨がん）などの固形組織または器官、または血液（例えば、リンパ腫、白血病、および骨髄腫）からの細胞を含み得る。がんはまた、身体の様々な部分の上皮細胞に由来するがん腫、または腺に由来する腺腫などのそれらの細胞起源によって説明され得る。
動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官、または生体液に適用される「治療」は、外因性の医薬品、治療薬、または組成物の、動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官への接触を指す。本明細書で使用される場合、「治療」（または「治療する」または「治療すること」）という用語は、ＩＬ－１β活性に関連する症状、障害、状態、または疾患の進行または重症度を遅延、中断、阻止、制御、停止、軽減、または逆転することを伴うプロセスを指すが、必ずしも、ＩＬ－１β活性に関連するすべての疾患関連の症状、状態、または障害を完全に排除することを伴わない。薬物動態、診断、研究、および実験の方法に適用される「治療」（または「治療する」または「治療すること」）とは、細胞への試薬の接触、ならびに（流体が細胞と接触している場合）流体への試薬の接触を包含する。「予防すること」（または「予防する」）という用語は、何かが発生、存在、もしくは出現しないようにすること、および／または何かを行うことを妨害または停止することを意味する。
「活性化」という用語は、内部メカニズムによって、ならびに外部要因または環境要因によって調節される細胞の活性化を指し得る。
分子の「活性」は、分子のリガンドまたは受容体への結合、触媒活性、遺伝子発現もしくは細胞シグナル伝達、分化、または成熟化を刺激する能力、抗原性活性、他の分子の活性の調節などを指し得る。分子の「活性」はまた、細胞間相互作用（例えば、接着）を調節もしくは維持する活性、または細胞の構造（例えば、細胞膜もしくは細胞骨格）を維持する活性を指し得る。「活性」はまた、比活性（例えば、［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］、または［免疫学的活性］／［ｍｇタンパク質］）、生物学的コンパートメントにおける濃度などを意味し得る。
本開示に従って同様の機能的特性を示す本明細書に開示された抗体に加えて、操作されたヒト抗体は、いくつかの異なる方法を使用して生成することができる。本明細書に開示される特定の抗体化合物は、追加の抗体化合物を調製するためのテンプレートまたは親抗体化合物として使用することができる。１つのアプローチでは、親抗体化合物のＣＤＲは、親抗体化合物のフレームワークと高い配列同一性を有するヒトフレームワークに移植される。新しいフレームワークの配列同一性は、一般に、親抗体化合物の対応するフレームワークの配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％同一であろう。この移植により、親抗体と比較して、結合親和性が低下する可能性がある。この場合、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．Ａｌ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳ ８８：２８６９によって開示された特定の基準に基づいて、親フレームワークの特定の位置で、フレームワークに、復帰変異を導入することができる。抗体のヒト化に有用な方法を記載している追加の参考文献としては、米国特許第４，８１６，３９７号、同第５，２２５，５３９号、および同第５，６９３，７６１号、Ｌｅｖｉｔｔ（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６８：５９５－６２０に記載されているコンピュータプログラムＡＢＭＯＤおよびＥＮＣＡＤ、ならびにＷｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ Ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７、およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６）が挙げられる。
復帰変異を考慮すべき残基の特定は、以下のように実行することができる。
アクセプターフレームワークのヒトフレームワーク領域のアミノ酸がその位置のヒトフレームワークでは珍しいが、ドナー免疫グロブリンの対応するアミノ酸がその位置のヒトフレームワークで典型的であるカテゴリーに、アミノ酸が分類される場合、使用されるヒト生殖系列配列のフレームワークアミノ酸（「アクセプターフレームワーク」）は、親抗体化合物のフレームワーク（「ドナーフレームワーク」）からのフレームワークアミノ酸に置き換えられる。
アクセプターフレームワークのヒトフレームワーク領域の各々のアミノ酸、およびドナーフレームワークの対応するアミノ酸が、その位置のヒトフレームワークでは一般に珍しい場合、かかるアミノ酸は、その位置のヒトフレームワークに典型的なアミノ酸に置き換えることができる。この復帰変異の基準により、親抗体化合物の活性を回復することができる。
別のアプローチは、本明細書に開示される抗体化合物と同様の機能的特性を示す操作されたヒト抗体を生成するために、移植されたＣＤＲ内のアミノ酸を、フレームワークを変えることなく、ランダムに変異導入し、得られた分子を、親抗体化合物と同等かまたはそれよりも優れている結合親和性および他の機能的特性について、スクリーニングすることを含む。各ＣＤＲ内の各アミノ酸位置に単一の変異を導入し、続いて、結合親和性および他の機能的特性に対するかかる変異の影響を評価することもできる。改善された特性を生み出す単一の変異を組み合わせて、それらの影響を互いに組み合わせて評価することができる。
さらに、前述のアプローチの両方の組み合わせが可能である。ＣＤＲ移植後、ＣＤＲにアミノ酸変化を導入することに加えて、特定のフレームワーク領域に復帰変異を導入することができる。この方法論は、Ｗｕ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１－１６２に記載されている。
本開示の操作されたヒト抗体は、様々な経路によって投与される、ヒトの医療における医薬品として使用することができる。最も好ましくは、そのような組成物は、非経口投与用である。かかる薬学的組成物は、当該技術分野で周知の方法（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ；１９ｔｈ ｅｄ．（１９９５）、 Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）によって調製することができ、本明細書に開示される抗体と、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む。
以下のアッセイの結果は、本開示の例示されたモノクローナル抗体およびその抗原結合断片が、ＩＬ－１βに結合および／または中和し、したがって、炎症性疾患（例えば、心血管疾患またはがん）を治療するために使用され得ることを実証する。
実施例１：抗体の発現および精製
本開示の抗ＩＬ－１β抗体を構築する際に、化学的および物理的安定性に関する重大な問題に遭遇した。例えば、初期の構築物で遭遇した問題には、低い結合親和性、可変領域の脱アミド化、酸化、および低い力価が含まれた。
克服すべき結合親和性ならびに化学的および物理的安定性に重大な問題があった。驚くべきことに、本開示の化学的および物理的修飾により、これらの問題が克服された。重鎖および軽鎖の両方で、全体にわたってアミノ酸修飾を導入した。本開示の抗体は、元の構築物からの複数の残基の変化を含み、高い結合親和性を有し、化学的および物理的に安定であることが明らかになった。本開示の抗体を含むいずれの修飾も、初期構築物には見られなかった。
表１に、本開示の例示された抗体を提示する。
本開示の抗体は、以下のように作製および精製することができる。ＨＥＫ２９３またはＣＨＯなどの適切な宿主細胞は、それぞれ、抗体ＩおよびＩＩの、抗体Ｉ＿ＨＣまたは抗体ＩＩ＿ＨＣの配列および共通のＬＣ配列をコードする最適な所定のＨＣ：ＬＣベクター比を使用して、抗体を分泌させるための発現システムで一過的にトランスフェクトする。抗体が分泌された、清澄化した培地を、多くの一般的に使用される技術のいずれかを使用して精製する。例えば、培地は、適合する緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４））で平衡化されたプロテインＡまたはプロテインＧに都合よく適用され得る。カラムを洗浄して、非特異的結合成分を除去する。結合した抗体を、例えば、ｐＨ勾配（例えば、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）から０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）へ）によって、溶出される。抗体断片をＳＤＳ－ＰＡＧＥ等により検出し、次いでプールする。意図する使用に応じて、さらなる精製は任意選択的である。抗体を、一般的な技術を使用して濃縮および／または滅菌濾過し得る。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、またはイオン交換クロマトグラフィーを含む一般的な技術によって効率的に除去することができる。これらのクロマトグラフィーステップ後の抗体の純度は、９９％を上回る。生成物は、－７０℃ですぐに凍結するか、または凍結乾燥するか、または、すぐに使用する場合は、４℃で保存することができる。
実施例２：抗体の発見および操作
ヒト抗ＩＬ－１β抗体のパネルは、完全ヒト酵母ディスプレイライブラリーを使用して得られ、効果的なＩＬ－１β中和抗体であり得る試薬を特定するためにスクリーニングされる。変異が、各抗体の個々の相補性決定領域（ＣＤＲ）に体系的に導入され、得られたバリアントは、抗原濃度を低下させ、かつ／または解離の時間の増やしながら、複数ラウンドの選択にかけて、親和性が改善されたクローンを単離する。個々のバリアントの配列を決定し、コンビナトリアルライブラリーを構築するために使用することでき、それを、ストリンジェンシーを高めながら追加の選択ラウンドにかけて、個々のＣＤＲ領域間の相加的または相乗的な変異のペアリングを特定する。個々のコンビナトリアルクローンを、配列決定し、結合特性を決定する。選択した抗体を変異誘発して、ＩＬ－１βに対する結合親和性を維持しながら、メチオニンの酸化などの翻訳後修飾を修正することもできる。追加的に、抗体に対して、潜在的な免疫原性を減少させるために、これらのＦＷ１配列をそれらの生殖系列状態に復帰させるフレームワーク（ＦＷ）の置換を行う。
操作および／または最適化された抗ＩＬ－１β抗体が得られる（本明細書で抗体Ｉおよび抗体ＩＩと呼ばれる）。これらは、重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を有し、完全な重鎖および軽鎖アミノ酸ならびにそれをコードするヌクレオチド配列が、「アミノ酸およびヌクレオチド配列」と題するセクションに列挙されている。以下の表１に、これらの断片に対応する配列ＩＤ、ならびに軽鎖および重鎖のＣＤＲアミノ酸配列を示す。
Figure 0007419544000001
実施例３：インビトロでのヒトまたはカニクイザルＩＬ－１βの中和
組換えヒトまたはカニクイザルＩＬ－１βは、Ｎ末端ＨＩＳ－ＳＵＭＯ融合タンパク質として、Ｅ．ｃｏｌｉで生成される。ＨｉｓＰｕｒＮｉ－ＮＴＡクロマトグラフィーを使用してタンパク質を精製し、続いて、エンドトキシンを除去する。次いで、精製された融合タンパク質を、ＳＵＭＯプロテアーゼＵｌｐ１で処理して、ＨＩＳ－ＳＵＭＯを融合タンパク質から切断する。次いで、切断されたＨＩＳ－ＳＵＭＯタンパク質を、ＨｉｓＰｕｒＮｉ－ＮＴＡによって反応物から除去し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、タグを除いたＩＬ－１βをさらに精製して均一にする。
本開示の抗体は、ＩＬ－１βを中和すると予想される。抗体Ｉおよび／または抗体ＩＩによるＩＬ－１β活性の中和は、例えば、以下に記載されるように、１つ以上のＩＬ－１β細胞ベースの活性アッセイによって評価され得る。
ＩＬ－１β／ＩＬ－１Ｒ結合の中和剤のスクリーニングは、ＮＦ－ｋＢプロモーターの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を発現するＨｅＬａ細胞を使用して、ハイスループットの細胞ベースのアッセイによって、最初に行うことができる。このアッセイでは、組換えＩＬ－１βで誘導されたシグナル伝達の読み出しとして、ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーターシグナルを使用する。次いで、ＩＬ－１βの中和は、抗ＩＬ－１β抗体の滴定によるルシフェラーゼ活性の減少のレベルを測定することによって定量化される。代替的に、別のインビトロ中和アッセイ（例えば、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞ベースのアッセイ）を、以下に詳述する。
具体的には、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－１β細胞を、増殖培地（ＤＭＥＭ、４．５ｇ／ｌのグルコース、２ｍＭのＬ－グルタミン、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００μｇ／ｍＬのノルモシン（商標）、１００μｇ／ｍＬのゼオシン（商標）、および２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ Ｇｏｌｄ）中、Ｔ－７５フラスコで、９０％コンフルエンスになるまで培養する。細胞を、ＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋なし）で２回洗浄し、１ｍＬのＰＢＳで２分間インキュベートする。次いで、フラスコの側面を軽くたたくことによって細胞を剥離し、１０ｍＬの試験培地（ＤＭＥＭ、４．５ｇ／ｌのグルコース、２ｍＭのＬ－グルタミン、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活性化ＦＢＳ（５６℃で３０分）、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００μｇ／ｍＬのノルモシン（商標））で再懸濁し、カウントし、試験培地で０．３３ｘ１０６細胞／ｍＬに希釈する。組換えヒトまたはカニクイザルＩＬ－１βおよび試験品を、試験培地で、所望の濃度に調製する。ＢｉｏＣｏａｔポリ－Ｄ－リジンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３５４４６１）で、４０μＬの抗体（５×濃度）を、１０μＬのＩＬ－１β（２０×濃度、アッセイの最終濃度が４ｐＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。１５０μＬの０．３３ｘ１０６細胞／ｍＬのＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－１β細胞懸濁液を、抗体とＩＬ－１βとの混合物を含むポリ－Ｄ－リジンプレートの各ウェルに分注する。プレートを、３７℃、５％ ＣＯ２、９０％の相対湿度で、一晩インキュベートする。２日目に、ポリ－Ｄ－リジンプレートからの２５μＬの培地を、Ｃｏｓｔａｒアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６９５）に移す。３７℃に予温した７５μＬのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ検出溶液（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ カタログ番号ｒｅｐ－ｑｂ１，ｒｅｐ－ｑｂ２）をアッセイプレートに添加する。アッセイプレートを覆い、３７℃で１時間インキュベートした後、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）でＯＤ６５０ｎｍで読み取る。データは正規化され、４ｐＭ ＩＬ－１βの阻害率（％）（０％阻害＝４ｐＭ ＩＬ－１β、１００％阻害＝０ｐＭ ＩＬ－１β）として表される。中和抗ｈＩＬ－１β抗体は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－１β細胞を刺激する組換えヒトＩＬ－１βの活性を遮断する。中和抗体の相対力価は、４パラメータのロジスティック適合を使用して計算され、ＩＣ５０値で表される。
Figure 0007419544000002
実施例４：インビボでのヒトＩＬ－１βの中和
ヒトＩＬ－１βは、マウスＩＬ－１受容体に結合して刺激し、血清中のマウスサイトカインＩＬ－６の上昇をもたらす。ヒトＩＬ－１βの最適な用量およびマウスＩＬ－６の誘導に最適な時間を特定するために、時間および用量範囲試験が実施される。本開示の抗体のインビボでの中和活性を試験するために、最適化されたプロトコルを以下に記載する。具体的には、Ｅｎｖｉｇｏからの雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、約９週齢で研究に使用する。マウスには、通常の固形飼料を与え（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ ｄｉｅｔ，２０１４）、体重によって処置群に無作為化される（ｎ＝５～８／群）。本開示の抗体および対照抗体を、生理食塩水に溶解し、示された用量レベルで皮下投与される。２４時間後、ヒトＩＬ－１βを、生理食塩水に溶解し、１μｇ／ｋｇの用量レベルで腹腔内投与する。２時間後、血液試料を後眼窩出血によって採取し、続いて、２０００ｇで３分間遠心分離して、血清試料を単離する。
血清中のマウスＩＬ－６のレベルは、Ｖ－ＰＬＥＸマウスＩＬ－６キット（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、カタログ番号Ｋ１５２ＱＸＤ－２）を使用して、製造元の説明書に従って、決定される。簡潔に、ＭＳＤプレートを、１５０μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄する。５０μＬの前もって調製したキャリブレーター（段階希釈）、対照および試験試料（１：１０希釈）を、プレート上の適切なウェルに移し、室温で２時間振盪する（５００～１０００ｒｐｍ）。このプレートを、１５０μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄する。次いで、２５μＬの検出用抗体溶液を、各ウェルに添加し、続いて、室温で２時間振盪する（５００～１０００ｒｐｍ）。このプレートを、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄する。１５０μＬの２×読み取り用緩衝液を、各ウェルに添加する。プレートを、ＭＳＤ ＳＱ１２０プレートリーダーで、すぐに読み取る。試験試料のＩＬ－６の濃度は、４パラメータのロジスティック適合を使用して、検量線から分析される。
アイソタイプが一致する対照抗体（ＩｇＧ４－ＰＡＡ）は、研究の陰性対照として使用される。データは、対照群の平均ＩＬ－６レベルと比較した阻害率（％）として計算される。平均の差の統計的有意性は、ＪＭＰ１１ソフトウェアを用いて、一元配置分散分析、Ｄｕｎｎｅｔｔの事後分析を使用して評価される。本開示の抗体は、用量依存的に、ヒトＩＬ－１βの効果を遮断して、マウスＩＬ－１受容体を介したマウスＩＬ－６の増加を刺激する（表３－１、３－２）。
Figure 0007419544000003
Figure 0007419544000004
実施例５：ＭＳＤ－ＳＥＴによる抗体Ｉおよび抗体ＩＩの結合親和性の測定
ＭＳＤ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）エレクトロケミルミネッセンスアッセイを、ヒトＩＬ－１βに対する抗体Ｉ、抗体ＩＩ、およびカナキヌマブの親和性を測定するために利用する。まず、抗体およびヒトＩＬ－１βの平衡混合物を設定する。混合物中の抗体濃度を、１ｐＭ、１０ｐＭ、および１００ｐＭで一定に保ち、リガンドを、０．９ｎＭから０．００００４ｎＭの範囲の濃度で滴定する（濃度間は２．５倍希釈）。平衡混合物を、密封された非結合９６ウェルプレートに、３７℃で７２時間設定する。
ＭＳＤ Ｇｏｌｄストレプトアビジンプレートは、平衡混合物中の遊離抗体を検出するために使用される。ＭＳＤプレートは、最初に、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）で、８００ｒｐｍに設定されたシェーカーで、１時間ブロッキングし、次いで、洗浄緩衝液ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄される。プレートを、ビオチン化ヒトＩＬ－１βでコーティングした後、ＰＢＳＴで３回洗浄する。平衡混合物をコーティングされたプレートに加え、室温で２．５分間振盪しながらインキュベートし、すぐにＰＢＳＴで３回洗浄する。ヤギ抗ヒトＳｕｌｆｏ－ＴＡＧ抗体をプレートに添加し、振盪しながら室温で１時間インキュベートする。さらに３回洗浄した後、ＭＳＤ読み取り用緩衝液を、ＭｉｌｌｉＱ水で１：２の濃度に希釈して、ウェルに添加する。その後すぐに、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ＳＩ６０００機器を使用して、プレートを読み取る。
データの評価のために、ＭＳＤ機器の読み取り値は、カスタマイズされたＥｘｃｅｌまたはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８ベースの評価プログラムにインポートされる。これにより、滴定データが自動的にプロットされ、ＫＤ値および統計パラメータが計算される。
Figure 0007419544000005
実施例６：免疫原性リスク評価
抗体ＩＩは、以下に示すように、ＵＳ７，７１４，１２０（ここでは、ＵＳ’１２０）およびカナキヌマブを代表する抗体との比較により、インシリコおよびエクスビボの方法を使用して、臨床免疫原性の相対リスクについて特徴付けられる。
樹状細胞（ＤＣ）内在化アッセイ
このアッセイは、被検抗体を内在化させるヒトＤＣの能力を評価する。ＣＤ１４＋細胞を培養し、ＩＬ－４およびＧＭ－ＣＳＦを用いて、未成熟ＤＣに分化させる。被検抗体、アイソタイプ対照、または陽性対照を、検出剤（Ｆａｂ－ＱＳＹ７－ＴＡＭＲＡ）と１：１の比率でプレインキュベートして、複合体を形成させ、次いで、培養物に添加する。細胞を、１日間インキュベートする。内在化および切断時に、フローサイトメトリーによって陽性ＴＡＭＲＡシグナルを検出し、ＩｇＧ１－ＥＮアイソタイプ対照および抗ＣＸＣＲ抗体を使用して、正規化された内在化指数を計算する。
ＭＡＰＰＳアッセイ（ＭＨＣ関連ペプチドプロテオミクス）
ＭＡＰＰＳは、被検抗体で前もって処理されたヒト樹状細胞上のＭＨＣ－ＩＩ提示ペプチドの特性を明らかにする。正常なヒトドナーのＰＢＭＣから単離されたＣＤ１４＋細胞を培養し、ＩＬ－４およびＧＭ－ＣＳＦとインキュベーションすることによって、未成熟ＤＣに分化させる。４日目に、培地を、被検抗体を含む新鮮な培地と交換する。５日目に、ＬＰＳを添加して、細胞を、成熟ＤＣに変換する。６日目に、細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含むＲＩＰＡ緩衝液に溶解する。ＭＨＣ－ＩＩ複合体の免疫沈降は、ストレプトアビジンビーズに結合したビオチン化抗ＭＨＣ－ＩＩ抗体を使用して行う。結合した複合体を溶出し、濾過する。単離されたＭＨＣ－ＩＩペプチドは、質量分析計によって分析される。ペプチドの同定は、酵素を使用しない検索アルゴリズムと、試験配列が追加されたウシ／ヒトデータベースとを使用して、内部プロテオミクスパイプラインによって生成され、試験候補の相補性決定領域からのＭＨＣ－ＩＩペプチドを表すドナーの割合を決定する。ＫＮＩＭＥワークフローは、試料の識別ファイルを処理するために使用される。試験品から同定されたペプチドは、親配列に対して整列される。
インシリコＴＣＥＭ（Ｔ細胞露出モチーフ）分析
この分析は、ＭＡＰＰＳによって同定された特定のペプチドクラスターが、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する可能性を評価する。非生殖系列残基を含むＭＡＰＰＳで同定されたペプチド配列は、ＩｍｍｕｎｏＥｐｉｔｏｐｅデータベース（ＩＥＤＢ）分析リソースＭＨＣＩＩ結合予測ページに入力される。ＩＥＤＢ推奨の予測方法が選択される。予測では、２７の最も頻度の高いＨＬＡ－ＤＲ、－ＤＰ、および－ＤＱアレルが、人口のかなりの部分をカバーしているとみなされる。１５残基と等しいかまたはそれ以上の長さの各入力配列は、配列全体にまたがる重複する１５ｍｅｒ（１アミノ酸のオフセット）に分割される。各ペプチドについて、ペプチドのスコアを、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースから選択された５００万のランダム１５ｍｅｒのスコアと比較することによって、パーセンタイルランクが生成される。レジスターの推定Ｐ－１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ７、およびＰ８位置に位置するアミノ酸は、ＴＣＥＭを生成し、リスクは、これらの位置における非生殖系列残基の存在に基づいて定義される。非生殖系列列の残基および複数のアレルへのコア結合の可能性は、グラフィックレンダリングで報告され、免疫原性リスク評価用に考慮される。
ＭＳ血清結合
このアッセイは、試験候補の血清タンパク質へのオフターゲット結合を評価する。被検抗体は、Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ ＨＢＸマイクロプレートにコーティングされる。ブロッキング後、ヒト血清を添加し、一晩インキュベートする。結合したタンパク質を、溶出、還元、アルキル化、消化する。ペプチドは、質量分析計で分析される。ペプチドおよびタンパク質の同定は、トリプシン酵素による検索アルゴリズムおよび試験抗体の配列が追加されたヒトデータベースを使用して、内部プロテオミクスパイプラインによって生成される。イオンは、内部プロテオミクスツール（Ｃｈｒｏｍ－Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ、Ｍｅｔａｃｏｎｓｅｎｓｅ、Ｑｕａｎｔ）によって定量化され、ＪＭＰで、一元配置分析／各対、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定のプラットフォームを使用して分析される。ＪＭＰを使用したイオンのｌｏｇ２ａｕｃの分析：各イオンごとにＹをＸで近似／平均の比較／すべての対、Ｔｕｋｅｙ ＨＳＤ。
Ｔ細胞増殖アッセイ
このアッセイは、細胞増殖を誘導することによって、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する被検抗体または被検ＭＡＰＰＳペプチドの能力を評価する。ＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させたＰＢＭＣを調製し、ＣＦＳＥで標識する。各試料は、培地対照、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ；陽性の臨床ベンチマーク対照）、被検抗体、または被検ＭＡＰＰＳペプチドで試験される。培養物を、７日間インキュベーションする。７日目に、試料を、フローサイトメトリーによって分析する。
既存の反応性（ＡＣＥ架橋形式（ＡＣＥ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｆｏｒｍａｔ））
このアッセイは、ヒト血清中の被検抗体に対する既存の抗体の存在を評価する。希釈された血清は、ビオチン化された被検抗体でコーティングされたプレート上で一晩捕捉される。翌日、捕捉された反応性タンパク質を、酸で溶出し、次いで、ビオチン化およびルテニル化された被検抗体の存在下で中和される。抗薬物抗体が存在する場合、それらは標識された被検抗体を架橋し、複合体を形成する。複合体は、ストレプトアビジンでコーティングされたメソスケールプレートによって捕捉され、得られたシグナルは、ティア１シグナル（電気化学発光として表される）と呼ばれる。このシグナルは、ティア２で、検出ステップで過剰な非標識の被検抗体を添加することによって確認される。これにより、ティア１シグナルが抑制される。既存の抗薬物抗体の存在は、ティア２阻害の９０パーセンタイルの大きさとして表される。
Figure 0007419544000006
実施例７：抗ヒトＩＬ－１β抗体ＩＩのエピトープマッピング
Ｘ線結晶構造解析を使用して、ＩＬ－１β－抗体ＩＩ Ｆａｂ複合体の高解像度構造を取得する。ＩＬ－１β（配列番号１４）および抗体ＩＩを、発現させ、精製し、ＩＬ１β－抗体ＩＩ Ｆａｂ複合体を形成させるために混合する。複合体を、一般的に知られている技術を使用して結晶化する。Ｖｏｎｒｈｅｉｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ６７，２９３－３０２ （２０１１）、Ｅｖａｎｓ，Ｐ．Ｒ．＆ Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，Ｇ．Ｎ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ６９，１２０４－１２１４ （２０１３）、ＭｃＣｏｙ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ４０，６５８－６７４ （２００７）、Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．，Ｌｏｈｋａｍｐ，Ｂ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｗ．Ｇ．＆ Ｃｏｗｔａｎ，Ｋ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ６６，４８６－５０１（２０１０）、Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，Ｇ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ６７，３５５－３６７（２０１１）、Ｗｉｎｎ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ６７，２３５－２４２（２０１１）、およびＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７，２９３－３１５（２０１８）を参照されたい。
エピトープは、抗体ＩＩの残基の４．５Å以内にＩＬ－１βのアミノ酸残基があることを示し、これには、（配列番号１に従って）Ｒ１２０、Ｅ１５３、Ｋ２１９、Ｅ２２１、Ｎ２２４、Ｍ２６４、Ｑ２６５、Ｆ２６６、およびＳ２６８が含まれる。
アミノ酸およびヌクレオチド配列
配列番号１：（ヒトＩＬ－１βプロタンパク質またはプロｈＩＬ－１β）
ＭＡＥＶＰＥＬＡＳＥＭＭＡＹＹＳＧＮＥＤＤＬＦＦＥＡＤＧＰＫＱＭＫＣＳＦＱＤＬＤＬＣＰＬＤＧＧＩＱＬＲＩＳＤＨＨＹＳＫＧＦＲＱＡＡＳＶＶＶＡＭＤＫＬＲＫＭＬＶＰＣＰＱＴＦＱＥＮＤＬＳＴＦＦＰＦＩＦＥＥＥＰＩＦＦＤＴＷＤＮＥＡＹＶＨＤＡＰＶＲＳＬＮＣＴＬＲＤＳＱＱＫＳＬＶＭＳＧＰＹＥＬＫＡＬＨＬＱＧＱＤＭＥＱＱＶＶＦＳＭＳＦＶＱＧＥＥＳＮＤＫＩＰＶＡＬＧＬＫＥＫＮＬＹＬＳＣＶＬＫＤＤＫＰＴＬＱＬＥＳＶＤＰＫＮＹＰＫＫＫＭＥＫＲＦＶＦＮＫＩＥＩＮＮＫＬＥＦＥＳＡＱＦＰＮＷＹＩＳＴＳＱＡＥＮＭＰＶＦＬＧＧＴＫＧＧＱＤＩＴＤＦＴＭＱＦＶＳＳ
配列番号２：（抗体Ｉおよび抗体ＩＩのＨＣ）
Ｘ１ＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＨＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＡＤＳＳＧＹＹＹＶＧＶＤＶＷＧＱＧＴＸ２ＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
ここで、Ｘ１は、ＥまたはｐＥであり
Ｘ２は、ＭまたはＬである
配列番号３：（抗体Ｉおよび抗体ＩＩのＨＣのＤＮＡ）
ｇａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｇａｇｔｃｔｇｇｇｇｇａｇｇｃｔｔｇｇｔｃｃａｇｃｃｔｇｇｇｇｇｇｔｃｃｃｔｇａｇｇｃｔｃｔｃｃｔｇｔｇｃａｇｃｃｔｃｔｇｇａｔｔｃａｃｃｔｔｃａｇｔｇａｃｃａｃｔａｃａｔｇａｇｃｔｇｇａｔｃｃｇｃｃａｇｇｃｔｃｃａｇｇｇａａｇｇｇｇｃｔｇｇａｇｔｇｇｇｔｔｔｃａｔａｃａｔｔａｇｔａｇｔａｇｔｇｇｔａｇｔａｃｃａｔａｔａｃｔａｃｇｃａｇａｃｔｃｔｇｔｇａａｇｇｇｃｃｇａｔｔｃａｃｃａｔｃｔｃｃａｇｇｇａｃａａｃｇｃｃａａｇａａｃｔｃａｃｔｇｔａｔｃｔｇｃａａａｔｇａａｃａｇｃｃｔｇａｇａｇｃｃｇａｇｇａｃａｃｇｇｃｇｇｔｇｔａｃｔａｃｔｇｃｇｃｃａｇａｇａｇｇｃｔｇａｃａｇｃａｇｃｇｇａｔａｃｔａｃｔａｃｇｔｇｇｇｃｇｔａｇａｃｇｔａｔｇｇｇｇｔｃａｇｇｇｔａｃａａｔｇｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｃｔｃａｇｃｃａｇｃａｃｃａａｇｇｇｃｃｃａｔｃｇｇｔｃｔｔｃｃｃａｃｔａｇｃｇｃｃｃｔｇｃｔｃｃａｇｇａｇｃａｃｃｔｃｃｇａｇａｇｃａｃａｇｃｃｇｃｃｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｃｃｃｇａｇｃｃｇｇｔｇａｃｇｇｔｇｔｃｇｔｇｇａａｃｔｃａｇｇａｇｃｃｃｔｇａｃｃａｇｃｇｇｃｇｔｇｃａｃａｃｃｔｔｃｃｃｇｇｃｔｇｔｃｃｔａｃａｇｔｃｃｔｃａｇｇａｃｔｃｔａｃｔｃｃｃｔｃａｇｃａｇｃｇｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇｃｃｃｔｃｃａｇｃａｇｃｔｔｇｇｇｃａｃｇａａｇａｃｃｔａｃａｃｃｔｇｃａａｃｇｔａｇａｔｃａｃａａｇｃｃｃａｇｃａａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｃａａｇａｇａｇｔｔｇａｇｔｃｃａａａｔａｔｇｇｔｃｃｃｃｃａｔｇｃｃｃａｃｃｃｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａｇｇｃｃｇｃｃｇｇｇｇｇａｃｃａｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｇｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｔｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔａａｃｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｇｇａａｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｃｃａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｔｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｇｃｃｔｃｃｃｇｔｃｃｔｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａｇｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃａｇｇａｇｇａｇａｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａａａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａｇｇｃｔａａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｇａｇｇｇｇａａｔｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃａｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｔｇｇｇｔ
配列番号４：（抗体Ｉおよび抗体ＩＩのＬＣ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＳＳＤＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＹＹＦＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号５：（抗体Ｉおよび抗体ＩＩのＬＣのＤＮＡ）
ｇａｃａｔｃｃａｇａｔｇａｃｃｃａｇｔｃｔｃｃａｔｃｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｇｃａｔｃｔｇｔａｇｇａｇａｃａｇａｇｔｃａｃｃａｔｃａｃｔｔｇｃｃｇｇｇｃａａｇｔｃａｇａｇｃａｔｔａｇｃａｇｃｔａｔｔｔａａａｔｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃａｇｇｇａａａｇｃｃｃｃｔａａｇｃｔｃｃｔｇａｔｃｔａｔｇｇｔｇｃａｔｃｃａｇｔｇａｔｃａａａｇｔｇｇｇｇｔｃｃｃａｔｃａａｇｇｔｔｃａｇｔｇｇｃａｇｔｇｇａｔｃｔｇｇｇａｃａｇａｔｔｔｃａｃｔｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｃａｇｔｃｔｇｃａａｃｃｔｇａａｇａｔｔｔｔｇｃａａｃｔｔａｃｔａｃｔｇｔｃａｇｃａａｇｇａｔａｃｔａｃｔｔｃｃｃｔｃｃｔａｃｔｔｔｔｇｇｃｇｇａｇｇｇａｃｃａａｇｇｔｔｇａｇａｔｃａａａｃｇａａｃｃｇｔｇｇｃｔｇｃａｃｃａｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｔｃｔｇａｔｇａｇｃａｇｔｔｇａａａｔｃｔｇｇａａｃｔｇｃｃｔｃｔｇｔｔｇｔｇｔｇｃｃｔｇｃｔｇａａｔａａｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇａｇａｇｇｃｃａａａｇｔａｃａｇｔｇｇａａｇｇｔｇｇａｔａａｃｇｃｃｃｔｃｃａａｔｃｇｇｇｔａａｃｔｃｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｔｃａｃａｇａｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇａｃａｇｃａｃｃｔａｃａｇｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｃｃｔｇａｃｇｃｔｇａｇｃａａａｇｃａｇａｃｔａｃｇａｇａａａｃａｃａａａｇｔｃｔａｃｇｃｃｔｇｃｇａａｇｔｃａｃｃｃａｔｃａｇｇｇｃｃｔｇａｇｃｔｃｇｃｃｃｇｔｃａｃａａａｇａｇｃｔｔｃａａｃａｇｇｇｇａｇａｇｔｇｃ
配列番号６：（抗体Ｉおよび抗体ＩＩのＶＨ）
Ｘ１ＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＨＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＡＤＳＳＧＹＹＹＶＧＶＤＶＷＧＱＧＴＸ２ＶＴＶＳＳ
ここで、Ｘ１は、ＥまたはｐＥであり
Ｘ２は、ＭまたはＬである
配列番号７：（抗体Ｉおよび抗体ＩＩのＨＣＤＲ１）
ＡＡＳＧＦＴＦＳＤＨＹＭＳ
配列番号８：（抗体Ｉおよび抗体ＩＩのＨＣＤＲ２）
ＹＩＳＳＳＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号９：（抗体Ｉおよび抗体ＩＩのＨＣＤＲ３）
ＡＲＥＡＤＳＳＧＹＹＹＶＧＶＤＶ
配列番号１０：（抗体Ｉおよび抗体ＩＩのＶＬ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＳＳＤＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＹＹＦＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号１１：（抗体Ｉおよび抗体ＩＩのＬＣＤＲ１）
ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ
配列番号１２：（抗体Ｉおよび抗体ＩＩのＬＣＤＲ２）
ＹＧＡＳＳＤＱＳ
配列番号１３：（抗体Ｉおよび抗体ＩＩのＬＣＤＲ３）
ＱＱＧＹＹＦＰＰＴ
配列番号１４：（成熟ヒトＩＬ－１β；配列番号１の残基１１７－２６９）
ＡＰＶＲＳＬＮＣＴＬＲＤＳＱＱＫＳＬＶＭＳＧＰＹＥＬＫＡＬＨＬＱＧＱＤＭＥＱＱＶＶＦＳＭＳＦＶＱＧＥＥＳＮＤＫＩＰＶＡＬＧＬＫＥＫＮＬＹＬＳＣＶＬＫＤＤＫＰＴＬＱＬＥＳＶＤＰＫＮＹＰＫＫＫＭＥＫＲＦＶＦＮＫＩＥＩＮＮＫＬＥＦＥＳＡＱＦＰＮＷＹＩＳＴＳＱＡＥＮＭＰＶＦＬＧＧＴＫＧＧＱＤＩＴＤＦＴＭＱＦＶＳＳ
配列番号１５：（抗体ＩのＨＣ）
Ｘ１ＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＨＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＡＤＳＳＧＹＹＹＶＧＶＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
ここで、Ｘ１は、ＥまたはｐＥである
配列番号１６：（抗体ＩＩのＨＣ）
Ｘ１ＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＨＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＡＤＳＳＧＹＹＹＶＧＶＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
ここで、Ｘ１は、ＥまたはｐＥである
配列番号１７：（抗体ＩのＶＨ）
Ｘ１ＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＨＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＡＤＳＳＧＹＹＹＶＧＶＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
ここで、Ｘ１は、ＥまたはｐＥである
配列番号１８：（抗体ＩＩのＶＨ）
Ｘ１ＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＨＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＡＤＳＳＧＹＹＹＶＧＶＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ここで、Ｘ１は、ＥまたはｐＥである
配列番号１９：（カナキヌマブのＨＣ）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＶＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＩＩＷＹＤＧＤＮＱＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＧＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＲＴＧＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
配列番号２０：（カナキヌマブのＬＣ）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＧＳＳＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＬＩＫＹＡＳＱＳＦＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＡＹＹＣＨＱＳＳＳＬＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

Claims (34)

  1. 重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、ヒトＩＬ－１βタンパク質に結合する抗体であって、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
    前記ＨＣＤＲ１が、ＡＡＳＧＦＴＦＳＤＨＹＭＳ（配列番号７）を含み、
    前記ＨＣＤＲ２が、ＹＩＳＳＳＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号８）を含み、
    前記ＨＣＤＲ３が、ＡＲＥＡＤＳＳＧＹＹＹＶＧＶＤＶ（配列番号９）を含み、
    前記ＬＣＤＲ１が、ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号１１）を含み、
    前記ＬＣＤＲ２が、ＹＧＡＳＳＤＱＳ（配列番号１２）を含み、
    前記ＬＣＤＲ３が、ＱＱＧＹＹＦＰＰＴ（配列番号１３）を含む、抗体。
  2. 前記ＶＨが、配列番号６を含み、前記ＶＬが、配列番号１０を含む、請求項１に記載の抗体。
  3. 前記ＶＨが、配列番号１７を含み、前記ＶＬが、配列番号１０を含む、請求項１に記載の抗体。
  4. 前記ＶＨが、配列番号１８を含み、前記ＶＬが、配列番号１０を含む、請求項１に記載の抗体。
  5. 前記抗体が、配列番号２を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号４を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む、請求項１または２に記載の抗体。
  6. 前記抗体が、配列番号１５を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号４を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む、請求項１または２に記載の抗体。
  7. 前記抗体が、配列番号１６を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号４を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む、請求項１または２に記載の抗体。
  8. 前記抗体が、配列番号２のアミノ酸２～４４９を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号４を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む、請求項１に記載の抗体。
  9. 前記抗体が、配列番号２からなるＨＣと、配列番号４からなるＬＣとを含む、請求項１または２に記載の抗体。
  10. 前記抗体が、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプを有する、請求項１または２に記載の抗体。
  11. 前記抗体が、ヒトＩｇＧ４アイソタイプを有する、請求項１０に記載の抗体。
  12. 配列番号２および４をコードする配列を含む核酸。
  13. （ａ）配列番号２をコードする第１の核酸配列、および配列番号４をコードする第２の核酸配列を含むベクター、または
    （ｂ）配列番号２をコードする核酸配列を含む第１のベクター、および配列番号４をコードする核酸配列を含む第２のベクター
    を含む、組成物。
  14. （ａ）配列番号２をコードする第１の核酸配列、および配列番号４をコードする第２の核酸配列を含むベクター、または
    （ｂ）配列番号２をコードする核酸配列を含む第１のベクター、および配列番号４をコードする核酸配列を含む第２のベクター
    を含む、細胞。
  15. 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１４に記載の細胞。
  16. 抗体を生成するための方法であって、請求項１４または１５に記載の細胞を、抗体が発現される条件下で培養し、次いで前記発現された抗体を培養培地から回収することを含む、方法。
  17. 請求項１４または１５に記載の細胞を、抗体が発現される条件下で培養し、次いで前記発現された抗体を培養培地から回収することによって生成される、抗体。
  18. 請求項１～１１および１７のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体とを含む、薬学的組成物。
  19. ヒトＩＬ－１βに関連する炎症性疾患の治療を必要とする対象における、ヒトＩＬ－１βに関連する炎症性疾患を治療するための薬剤であって、請求項１～１１および１７のいずれか一項に記載の抗体を含み、前記対象に、治療有効量の前記抗体を投与することを含むことを特徴とする、薬剤。
  20. 前記炎症性疾患が、マックル・ウェルズ症候群（ＭＷＳ）、クリピリン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）、新生児期発症多系統炎症性症候群（ＮＯＭＩＳ）、関節リウマチ、全身型若年性特発性関節炎（ｓｏＪＩＡ）、痛風関節炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、１型糖尿病、２型糖尿病、家族性寒冷自己炎症性症候群（ＦＣＡＳ）、または加齢黄斑変性である、請求項１９に記載の薬剤。
  21. 心血管疾患の治療を必要とする対象における、心血管疾患を治療するための薬剤であって、請求項１～１１および１７のいずれか一項に記載の抗体を含み、前記対象に、治療有効量の前記抗体を投与することを含むことを特徴とする、薬剤。
  22. 前記心血管疾患が、狭心症、心筋梗塞（ＭＩ）、脳卒中、心不全、または不整脈である、請求項２１に記載の薬剤。
  23. がんの治療を必要とする患者における、がんを治療するための薬剤であって、請求項１～１１および１７のいずれか一項に記載の抗体を含み、前記対象に、治療有効量の前記抗体を投与することを含むことを特徴とする、薬剤。
  24. 前記がんが、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）、転移性前立腺がん、低または中リスクの骨髄異形成白血病、または限局性腎臓がんである、請求項２３に記載の薬剤。
  25. 療法に使用するための、請求項１～１１および１７のいずれか一項に記載の抗体を含む、薬学的組成物。
  26. 炎症性疾患の治療に使用するための、請求項１～１１および１７のいずれか一項に記載の抗体を含む、薬学的組成物。
  27. 前記炎症性疾患が、マックル・ウェルズ症候群（ＭＷＳ）、クリピリン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）、新生児期発症多系統炎症性症候群（ＮＯＭＩＳ）、関節リウマチ、全身型若年性特発性関節炎（ｓｏＪＩＡ）、痛風関節炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、１型糖尿病、２型糖尿病、家族性寒冷自己炎症性症候群（ＦＣＡＳ）、または加齢黄斑変性である、請求項２６に記載の薬学的組成物。
  28. 心血管疾患の治療に使用するための、請求項１～１１および１７のいずれか一項に記載の抗体を含む、薬学的組成物。
  29. 前記心血管疾患が、狭心症、心筋梗塞（ＭＩ）、脳卒中、心不全、または不整脈である、請求項２８に記載の薬学的組成物。
  30. がんの治療に使用するための、請求項１～１１および１７のいずれか一項に記載の抗体を含む、薬学的組成物。
  31. 前記がんが、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）、転移性前立腺がん、低または中リスクの骨髄異形成白血病、または限局性腎臓がんである、請求項３０に記載の薬学的組成物。
  32. 炎症性疾患の治療用の薬剤の製造における、請求項１～１１および１７のいずれか一項に記載の抗体の使用。
  33. 心血管疾患の治療用の薬剤の製造における、請求項１～１１および１７のいずれか一項に記載の抗体の使用。
  34. がんの治療用の薬剤の製造における、請求項１～１１および１７のいずれか一項に記載の抗体の使用。
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