JP2016503293A - IL−1βへの結合メンバー - Google Patents
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Abstract
Description
インターロイキン−1β(IL−1β)は、活性化マクロファージによって前駆体として生成される炎症促進性サイトカインである。タンパク質分解切断されると、その活性形態がIL−1受容体I型(IL−1R1)に結合し、次にはまた膜貫通型IL−1受容体アクセサリータンパク質(IL−1RAP)と会合することにより、シグナル伝達が開始される。形成される複合体は、シグナル伝達能力がある。炎症応答における重要な媒介因子であるサイトカインは、多数の細胞活性、例えば、細胞増殖、分化およびアポトーシスに影響を及ぼす。したがって、IL−1βは、様々な医薬の重要な標的と考えられている。
第一の態様において、本発明は、ヒトIL−1βの生物学的作用を阻害することに関して最大半量阻害濃度IC50によって決定して、50ピコモル濃度(pM)より低い効力を有するIL−1βに対する一価抗体断片を提供する。
(a)それぞれ配列番号1、2および3またはそれらのバリアントで示される可変重鎖(VH)相補性決定領域(CDR)配列CDR−H1、CDR−H2もしくはCDR−H3のうちの少なくとも1つ;および/または
(b)それぞれ配列番号4、5および6またはそれらのバリアントで示される可変軽鎖(VL)CDR配列CDR−L1、CDR−L2もしくはCDR−L3のうちの少なくとも1つ
を含む抗体、特に、上記一価抗体断片を提供する。
(a)それぞれ配列番号155、156および157またはそれらのバリアントで示される可変重鎖(VH)相補性決定領域(CDR)配列CDR−H1、CDR−H2もしくはCDR−H3のうちの少なくとも1つ;および/または
(b)(i)それぞれ配列番号158、159および160、もしくはそれらのバリアントで示されるか、または
(ii)それぞれ配列番号161、162および163、もしくはそれらのバリアントで示される、可変軽鎖(VL)CDR配列CDR−L1、CDR−L2もしくはCDR−L3のうちの少なくとも1つ
を含む。
(a)配列番号7および配列番号146から成る群より選択される配列との少なくとも85%の同一性を有するVH;および/または
(b)配列番号8、配列番号136および配列番号145から成る群より選択される配列との少なくとも85%の同一性を有するVL
を含む。
(ii)診断に使用するための、
(iii)化粧品に使用するための、および/または
(iv)検出目的のための、
上記抗体、上記結合メンバー、上記核酸配列、上記ベクター、または本明細書に開示する宿主細胞も提供する。
本発明がより容易に理解され得るように、ある一定の用語を最初に定義する。本明細書中に別段の定義がない限り、本明細書において用いるすべての技術用語および科学用語は、それらの技術分野において認知されている意味を持つ。本明細書に記載するものと同様または等価の方法および材料を本発明の実施または試験の際に使用することはできるが、適する方法および材料を下に記載する。本明細書において言及するすべての出版物、特許出願、特許および他の参考文献は、それら全体を参照により援用している。矛盾がある場合、定義を含めて、本明細書が優先する。材料、方法および例は、単に例示のためのものであり、限定する意図はない。
1.非極性側鎖(例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン)、
2.無電荷極性側鎖(例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、プロリン、システイン、トリプトファン)、
3.塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン)、
4.酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、
5.β分岐側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および
6.芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)
に基づいてファミリーに分けられる。保存的置換は、非天然アミノ酸の使用を含むこともある。
(a)それぞれ配列番号1、2および3またはそれらのバリアントで示されるVH CDR配列CDR−H1、CDR−H2もしくはCDR−H3のうちの少なくとも1つ;および/または
(b)それぞれ配列番号4、5および6またはそれらのバリアントで示されるVL CDR配列CDR−L1、CDR−L2もしくはCDR−L3のうちの少なくとも1つ
を含む抗体を提供する。
(a)それぞれ配列番号155、156および157またはそれらのバリアントで示されるVH CDR配列CDR−H1、CDR−H2もしくはCDR−H3のうちの少なくとも1つ;および/または
(b)
(i)それぞれ配列番号158、159および160、もしくはそれらのバリアントで示されるか、または
(ii)それぞれ配列番号161、162および163、もしくはそれらの変異型で示される、VL CDR配列CDR−L1、CDR−L2もしくはCDR−L3のうちの少なくとも1つ
を含み得る。
(i)配列番号1から6もしくはそれらのバリアント;
(ii)配列番号155から160もしくはそれらのバリアント;または
(iii)配列番号155から157および配列番号161から163もしくはそれらのバリアント
の6つすべてのCDRを含む。
1.バリン(V)によるアラニン(A)の置換;
2.リジン(K)によるアルギニン(R)の置換;
3.グルタミン(Q)によるアスパラギン(N)の置換;
4.グルタミン酸(E)によるアスパラギン酸(D)の置換;
5.セリン(S)によるシステイン(C)の置換;
6.アスパラギン酸(D)によるグルタミン酸(E)の置換;
7.アラニン(A)によるグリシン(G)の置換;
8.アルギニン(R)またはリジン(K)によるヒスチジン(H)の置換;
9.ロイシン(L)によるイソロイシン(I)の置換;
10.ロイシン(L)によるメチオニン(M)の置換;
11.チロシン(Y)によるフェニルアラニン(F)の置換;
12.アラニン(A)によるプロリン(P)の置換;
13.トレオニン(T)によるセリン(S)の置換;
14.チロシン(Y)によるトリプトファン(W)の置換;
15.トリプトファン(W)によるフェニルアラニン(F)の置換;および/または
16.ロイシン(L)によるバリン(V)の置換
を含み、逆もまた含む。
(i)可変軽鎖のAHo位置32にアラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、プロリン(P)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)、トリプトファン(W)、チロシン(Y);
(ii)可変軽鎖のAHo位置33にアラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、プロリン(P)、グルタミン(Q)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)、トリプトファン(W)、チロシン(Y);および/または
(iii)可変軽鎖のAHo位置40にグルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、セリン(S)、トリプトファン(W)、チロシン(Y)
を含み得る。
(i)可変軽鎖のAHo位置58にアラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、プロリン(P)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、トレオニン(T)、トリプトファン(W)、チロシン(Y);および/または
(ii)可変軽鎖のAHo位置69にアラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、プロリン(P)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)、トリプトファン(W)、チロシン(Y)
を含み得る。
(i)可変軽鎖のAHo位置109にアラニン(A)、システイン(C)、イソロイシン(I)、アスパラギン(N)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V);
(ii)可変軽鎖のAHo位置111にアラニン(A)、グリシン(G)、プロリン(P)、セリン(S);
(iii)可変軽鎖のAHo位置112にアラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、プロリン(P)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)、トリプトファン(W)、チロシン(Y);
(iv)可変軽鎖のAHo位置135にアラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、プロリン(P)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)、トリプトファン(W)、チロシン(Y);および/または
(v)可変軽鎖のAHo位置136にアラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、プロリン(P)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)、トリプトファン(W)、チロシン(Y)
を含み得る。
(i)可変重鎖のAHo位置33にアラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、プロリン(P)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)、トリプトファン(W)、チロシン(Y);および/または
(ii)可変重鎖のAHo位置39にアラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)、トリプトファン(W)、チロシン(Y)
を含み得る。
(i)可変重鎖のAHo位置59にアラニン(A)、システイン(C)、グリシン(G)、メチオニン(M)もしくはチロシン(Y);
(ii)可変重鎖のAHo位置60にアスパラギン酸(D)、アスパラギン(N)もしくはプロリン(P);および/または
(iii)可変重鎖のAHo位置69にアラニン(A)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、フェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、プロリン(P)、セリン(S)、トレオニン(T)、トリプトファン(W)もしくはチロシン(Y)
を含み得る。
(i)可変重鎖のAHo位置110にアラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)、トリプトファン(W)、チロシン(Y);
(ii)可変重鎖のAHo位置111にアラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン酸(D)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、リジン(K)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、プロリン(P)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)、トリプトファン(W)、チロシン(Y);
(iii)可変重鎖のAHo位置112にアラニン(A)、システイン(C)、フェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)、チロシン(Y);
(iv)可変重鎖のAHo位置113にフェニルアラニン(F)もしくはイソロイシン(I);
(v)可変重鎖のAHo位置114にアラニン(A)、システイン(C)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V);
(vi)可変重鎖のAHo位置115にアラニン(A)、グリシン(G)、メチオニン(M)もしくはアスパラギン(N);
(vii)可変重鎖のAHo位置135にアラニン(A)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、ヒスチジン(H)、アスパラギン(N)、セリン(S)、トレオニン(T);
(viii)可変重鎖のAHo位置136にアラニン(A)、システイン(C)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)、トリプトファン(W)、チロシン(Y);
(ix)可変重鎖のAHo位置137にアラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、プロリン(P)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)、トリプトファン(W)、チロシン(Y);および/または
(x)可変重鎖のAHo位置138にアラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、プロリン(P)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)、トリプトファン(W)、チロシン(Y)
を含み得る。
(i)重鎖アミノ酸位置12(AHo番号付けによる)にセリン(S);
(ii)重鎖アミノ酸位置103(AHo番号付けによる)にセリン(S)もしくはトレオニン(T);および/または
(iii)重鎖アミノ酸位置144(AHo番号付けによる)にセリン(S)もしくはトレオニン(T)。
(i)IL−1βへの、特に、hIL−1βへの特異的結合を保持する;
(ii)ヒトIL−1βの生物学的作用を阻害することに関して500pMより低い、好ましくは400pM、300pM、200pM、100pM、50pMより低い、さらに好ましくは25pMより低い効力(IC50)を有する;
(iii)カニクイザルIL−1β、アカゲザルIL−1βおよび/またはラットIL−1βと交差反応性である;および/または
(iv)IL−1β、好ましくは、ヒトIL−1β、カニクイザルIL−1β、アカゲザルIL−1βおよび/またはラットIL−1β、最も好ましくはhIL−1βへの結合について、本明細書に開示する抗体と競合する。
核酸、ベクター、宿主細胞および生成方法
1つの態様では、本発明の抗体を化学的におよび/もしくは生物学的に改変する。そのような改変は、グリコシル化、PEG化、HES化、アルブミン融合技術、PAS化、色素および/または放射性同位元素での標識付け、酵素および/もしくは毒素とのコンジュゲーション、リン酸化、ヒドロキシル化ならびに/または硫酸化を含み得るが、これらに限定されない。同様に、上に記載した任意の結合メンバー、核酸配列、ベクターおよび/または宿主細胞をしかるべく改変することができる。
本発明の抗体、任意の結合メンバー、本明細書に開示する核酸配列またはベクターを、適するキャリア、賦形剤または希釈剤をさらに含む組成物において提供することができる。本明細書に記載する抗体を含む組成物は、非常に好ましい。
前記抗体、結合メンバー、核酸配列またはベクターを、固体支持材、例えばビーズおよび微粒子上に備えさせてもよい。典型的には、前記分子を、そのようなキャリアに、共有結合により(必要に応じて、リンカーを伴う)、非共有結合的に、または混合により結合させる。前記ビーズおよび微粒子は、例えば、デンプン、セルロース、ポリアクリレート、ポリラクテートポリグリコレート(polylacetate polyglycolate)、ポリ(ラクチド−co−グリコリド)、ラテックスまたはデキストランを含み得る。
本明細書に記載する分子、特に、抗体、結合メンバー、核酸またはベクターは、医薬として有用である。典型的に、かかる医薬は、治療有効量の本明細書に提供する分子を含む。したがって、前記分子を、IL−1β関連障害の処置に有用な医薬の生成のために使用することができる。
本発明の抗体をインビボおよび/またはインビトロでの検出または診断の目的のために使用してもよい。例えば、特定の細胞または組織における発現を検出するために抗体を関与させる広範なイムノアッセイが当業者には公知である。同様に、前に記載した任意の結合メンバー、核酸配列、ベクターおよび/または宿主細胞を、このセクションで詳述するようにしかるべく使用することができる。
本明細書中に開示される配列は以下のとおりである:
FSLSSAAMA
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FSLSNSAMA
IIYDSASTYYASWAKG
ERAIFSGDFAL
QASQSIDNWLS
RASTLAS
QNTGGGVSIA
RASQSIGNWLS
RASNLAS
QNTGGGINIA
ウサギの免疫処置:組換えヒトIL−1βタンパク質(Peprotech、米国、カタログ番号200−01B)でウサギに免疫した。最後の追加免疫後にリンパ節および脾細胞を単離し、それらの細胞を凍結保存した。
先ず、DLX2323によるrhIL−1βの特異的認識をELISAによって確認した(図1)。簡単に言うと、rhIL−1β(Peprotech、カタログ番号200−01B)を、PBS中、2mcg/mlの濃度で一晩、4℃でMaxisorp 96ウェルマイクロプレートにコーティングした。5%脱脂粉乳でブロックした後、漸増濃度のscFv(10から300ng/ml)を添加し、scFvをプロテインL−HRP(Sigma−Aldrich、カタログ番号P3226)によって検出した。BM Blue POD基質(Roche Applied Science)でELISAを発色させた。陰性対照として、関連性のない特異性のscFvを使用した。この結果は、DLX2323がrhIL−1βに特異的に結合することを示す。
抗体およびscFvを、ヒト皮膚線維芽細胞アッセイ(NHDF−Neo、カタログ番号CC−2509、Lonza、米国ウォーカーズビル)で、それらのIL−1β中和能力について試験した。IL−1βでのそのような線維芽細胞の活性化は、特異的IL−6放出をもたらし、それをELISAによって定量する。特異的抗体によるIL−1βの阻害は、そのような線維芽細胞からのIL−6放出量を減少させる。抗IL−1β抗体の阻害効力を、IL−1β誘導IL−6放出の最大半量低減(IC50)を測定することによって定量する。IL−1β添加の16〜20時間前に、ヒト皮膚線維芽細胞を96ウェルマイクロプレートに5,000細胞/ウェルで播種した。線維芽細胞を、細胞供給業者(Lonza 米国ウォーカーズビル:Clonetics(商標)皮膚線維芽細胞系)による記載のとおりサプリメント(hFGF−B、インスリン、FBS、GA−1000)を有する線維芽細胞基本培地(FBM;Lonza、カタログ番号CC−3131)で培養した。その後、FBMを除去し、細胞をダルベッコ改変イーグル培地(DMEM;Gibco、Life Technologies、カタログ番号11880)で1回洗浄して、増殖因子を除去した。その後、細胞を7時間、DMEM培地中でインキュベートした。抗体またはscFvおよびrhIL−1βをDMEM中で1時間、37℃でプレインキュベートした。その混合物を細胞に10pg/mlのIL−1β最終濃度で添加した。陰性対照として、10pg/mlのIL−1βを、一切の抗IL−1β抗体なしで、細胞に添加した。陽性対照として、IL−1βに対するマウスモノクローナル抗体を適用した(R&D Systems、米国、カタログ番号MAB201)。細胞をIL−1β/抗IL−1β抗体混合物とともに18〜24時間インキュベートし、Human IL−6 DuoSet ELISA Kitをその製造業者の説明書(R&D Systems、米国、カタログ番号DY206)に従って使用して、細胞培養上清をIL−6放出について分析した。
DLX2323のIC50を、8回の独立したアッセイで3pM±1.05であると決定した。
DLX2323をIL−1β中和scFvとして同定した。DLX2323および他の阻害剤の生物学的効力を、実施例3に記載のとおりヒト皮膚線維芽細胞アッセイで評価した。ウェルへの添加前に、組換えヒトIL−1βを、漸増濃度のscFv DLX2323、抗ヒトIL−1βモノクローナルIgG抗体MAB201、IL−1β受容体アンタゴニスト(rhIL−1ra)(R&D systems、カタログ番号280−RA−010/CF)またはFDAによって承認された市販のカナキヌマブIgG(Novartis、Ilaris(商標))とともにプレインキュベートした。2回の独立した実験を行った:図3Aは、DLX2323とMAB201との比較を描写するが、図3Bは、DLX2323とrhIL−1raおよびカナキヌマブとの比較を示す。次のIC50値を決定した:MAB201:2〜3pM;DLX2323:2〜4pM;rhIL−1ra:40pM、およびカナキヌマブ:90pM。結論として、一価単量体scFv DLX2323は、二価モノクローナルマウス抗体MAB201とほぼ同様に強力である。それは、ヒトIL−1βを中和することについて市販の阻害剤カナキヌマブおよびrhIL−1raより明確に高い効力を示す。さらに、DLX2323は、IL−1β誘導IL−6放出を完全に遮断することができた。
DLX2323をPBS緩衝液pH7.2(リン酸緩衝食塩水1×、Gibco、Life Technologies(商標)、カタログ番号20012)中で保管した。その最大溶解度を決定するために、Vivaspin 20遠心濃縮機(Sartorius Stedim Biotech、カタログ番号VS2001)を使用して室温でDLX2323を濃縮した。その濃縮プロセスを高い試料粘度のため71mg/mlで停止した。得られたDLX2323タンパク質溶液は、粘稠であり、透明であり、目視検査により沈殿は観察されなかった。
scFvの安定性に関しては、それらの不安定性の一因となる2つの異なるプロセスを観察することができる。第一に、scFvは、二量体化、しばしば、続いてオリゴマー化、そして最終的に凝集する傾向があり得る。第二に、より小さい断片をもたらすscFv分解が経時的に起こり得る。DLX2323が安定しているかどうかを判断するために、HPLC(Dionex、Summit system)サイズ排除クロマトグラフィー(Tosoh、TSKgel G2000SWxl、カタログ番号08540)を展開して、ある時点での、異なるタンパク質濃度および温度(例えば、4℃、室温および37℃)で、単量体の非分解scFvタンパク質の百分率を決定した。モノマーの百分率を、研究開始時点(T0)および1mg/mlのDLX2323については1カ月後に、別の実験では50mg/mlのDLX2323溶液について2週間後に測定した。タンパク質をPBS、pH7.2中に配合した。安定性研究の結果を表1および2に列挙する。
ヒト以外の種のIL−1βホモログに対するDLX2323の交差反応性をELISAで評価した。次の種の組換え発現IL−1βタンパク質への結合を調査した:カニクイザル(Sino Biological Inc.、米国、カタログ番号90010−CNAE)、アカゲザル(R&D Systems、米国、カタログ番号1318−RL/CF)、ブタ(Kingfisher Biotech、米国、カタログ番号RP0297S−025)、イヌ(Kingfisher Biotech、米国、カタログ番号RP0085D−025)、モルモット(Kingfisher Biotech、カタログ番号RP0343GP−025)、ラット(Peprotech、カタログ番号400−01B)およびマウス(BioLegend、カタログ番号575102)。DLX2323の結合をELISA陽性対照抗体(R&D Systems、米国、ヤギ抗ヒトIL−1βポリクローナルIgG、カタログ番号AB−201−NA;BioLegend,Inc.、米国、ビオチン抗マウス/ラットIL−1β抗体、カタログ番号503505)と比較した。簡単に言うと、タンパク質を、PBS中、2mcg/mlの濃度で一晩、4℃でMaxisorp 96ウェルマイクロプレートにコーティングした。5%脱脂粉乳でブロックした後、漸増濃度(0.1mcg/ml、0.3mcg/mlおよび1.0mcg/ml)のDLX2323をウェルに添加した。IL−1β特異的対照抗体を利用して、すべてのタンパク質のコーティングの成功を別々に確認した。DLX2323をプロテインL−HRP(Sigma−Aldrich、米国、カタログ番号P3226)によって検出したが、対照抗体は、ストレプトアビジン−HRP(BD Pharmingen、米国、カタログ番号554060)、またはHRPで標識された他の適格な二次抗体、いずれかによって検出した。BM Blue POD基質(Roche Applied Science)を使用してELISAを発色させ、450nmで吸光度を測定した。DLX2323は、4つの種のIL−1βオルソログ、すなわち、ヒト、カニクイザル、アカゲザルおよびラットのIL−1βを認識した。ブタ、モルモット、イヌおよびマウスのIL−1βについては、交差反応性は観察できなかった。
この実施例では、DLX2323によるヒトIL−1β活性のインビボ阻害を実証する。ヒトIL−1βは、マウスIL−1受容体に結合することができ、そしてその受容体を活性化することができ、それによってマウスにおいてインビボで炎症応答を誘導することができる。この炎症は、マウスIL−6(mIL−6)を含む血清中のサイトカインのレベル上昇をもたらす。組換えヒトIL−1β(Peprotech、カタログ番号200−01B)を1.5mcg/kg体重の用量で、8週齢オスBALB/cマウス(Charles River、ドイツ)に皮下投与した。2時間後、血清中のmIL−6レベルは、有意に上昇した。インビボでのDLX2323の中和能力を試験するために、IL−1β投与の2時間前にDLX2323を腹腔内(i.p.)注射した。マウスの1つの群に5mg/kg用量のDLX2323を注射し、第二の群に15mg/kg用量のDLX2323を注射した。陰性対照群は、PBS i.p.または関連性のない特異性のscFv、いずれかで処置した。マウスの第五の群には、10mg/kgのカナキヌマブ(Novartis、Ilaris(登録商標))を陽性対照として静脈内注射した。rhIL−1β適用の2時間後、血液試料を採取し、Mouse IL−6 DuoSet ELISAキットを製造業者の説明書(R&D Systems、カタログ番号DY406)に従って使用してmIL−6の血清レベルを測定した。DLX2323およびカナキヌマブで処置したマウスの群については、非常に少量のmIL−6しか検出できず、またはmIL−6を全く検出できないことさえあった(0.0〜2pg/mlのmIL−6;図4)。PBSまたは対照scFvを受けたマウスは、50から170pg/mlの有意に上昇したIL−6レベルを示した。DLX2323は、5mg/kg用量においてさえ、インビボ設定でヒトIL−1βを非常に効率的に中和していた。
DLX2323とヒトIL−1βとの会合をよりよく特徴づけるために、アミノ酸変異を設計し、DLX2323のCDR領域に部位特異的に挿入した。CDR位置は、それらの表面露出、相同性モデルから演繹して予想されるヒトIL−1βとの相互作用、または先行ウサギIgGとの配列比較に基づいて、変異誘発のために選んだ。軽鎖においては、DLX2323のバリアントの設計のために、CDR−L1ではモチーフDNWを選択し(配列番号14)、CDR−L2ではアミノ酸残基RおよびTを選択し(配列番号15)、CDR−L3ではトレオニンおよびモチーフGGVSを選択した(配列番号16)。重鎖においては、モチーフSAをCDR−H1において選び(配列番号11)、CDR−H2ではモチーフYDおよびその後のチロシンを選んだ(配列番号12)。CDR−H3では、N末端グルタミン酸(E)を除くすべての位置を置換のために選択した(配列番号13)。すべての前記位置を配列番号11〜16中にそれぞれXで示す。部位特異的変異誘発、クローンのシークエンシングおよびライブラリーのアセンブリを、GeneArt(Life Technologies(商標)、ドイツ、レーゲンスブルク)によって行った。
上記に基づき、前に調査したCDR一部位変化のうちの3つから9つを組み合わせて、DLX2323のコンビナトリアル変異体を設計した。個々の残基変化を、(i)親抗体DLX2323のものに匹敵するまたはそれより良好な、強いELISA結合結果、(ii)複数のCDR領域に同時に影響を与える広範な一部位変化の組み合わせ、および(iii)CDR−H3の蓄積調節のみに基づいて選択した。設計した変異体を大規模形式で発現させ、単一変異体について上で説明したように精製した後、実施例3のヒト線維芽細胞アッセイで中和能力を評価した。配列あたりの個々のアミノ酸変化および対応するscFvタンパク質のIC50データを表5に詳述する。これらの単離されたscFvタンパク質すべてが、インビトロでrhIL−1βに対する中和活性を有した。上位5候補は、低ピコモル濃度の範囲のIC50値を提示した。したがって、これらは、親scFv DLX2323に高度に匹敵する。
Claims (63)
- ヒト線維芽細胞からのIL−6のIL−1β刺激性放出を阻害することによって決定して、ヒトIL−1βの生物学的作用を阻害することに関して5pMより低い、好ましくは約1pMより低い効力(IC50)を有する、IL−1βに対する一価抗体断片。
- IL−1βに対する抗体であって、
a.(i)それぞれ配列番号1、2および3、もしくはそれらのバリアント、または
(ii)それぞれ配列番号155、156および157、もしくはそれらのバリアント
で示される可変重鎖(VH)CDR配列CDR−H1、CDR−H2またはCDR−H3のうちの少なくとも1つ;および/または
b.(i)それぞれ配列番号4、5および6、もしくはそれらのバリアント;または
(ii)それぞれ配列番号161、162および163、もしくはそれらの変異型
で示される可変軽鎖(VL)CDR配列CDR−L1、CDR−L2またはCDR−L3のうちの少なくとも1つ
を含む、抗体。 - ヒト線維芽細胞からのIL−6のIL−1β刺激性放出を阻害することによって決定して、ヒトIL−1βの生物学的作用を阻害することに関して50pMより低い効力(IC50)を有する、請求項2に記載の抗体。
- 前記IC50が、約30、20、10、5、4、3、2pMより低い、好ましくは約1pMより低い、請求項3に記載の抗体。
- 請求項1の一価抗体断片である、請求項2〜4のいずれか一項に記載の抗体。
- Fab、Fab’、scFv、Fv断片、ナノボディ、VHHまたは最小認識単位である、請求項5に記載の抗体。
- 完全長免疫グロブリンまたは二価抗体断片、好ましくはF(ab’)2である、請求項2〜4のいずれか一項に記載の抗体。
- a.全体として見ると前記バリアントのVH CDR配列が、
(i)配列番号1、2および3で示されるか;もしくは
(ii)配列番号155、156および157で示される
VH CDR配列に少なくとも85%類似している;および/または
b.全体として見ると前記バリアントのVL CDR配列が、
(i)配列番号4、5および6で示されるか;もしくは
(ii)配列番号161、162および163で示される
VL CDR配列に少なくとも85%類似している、
請求項2から7のいずれか一項に記載の抗体。 - a.全体として見ると前記バリアントのVH CDR配列が、
(i)配列番号1、2および3で示され;もしくは
(ii)配列番号155、156および157で示される
VH CDR配列と少なくとも80%同一である;および/または
b.全体として見ると前記バリアントのVL CDR配列が、
(i)配列番号4、5および6で示され;もしくは
(ii)配列番号161、162および163で示される
VL CDR配列と少なくとも75%同一である、
請求項2から8のいずれか一項に記載の抗体。 - 前記バリアントが、
(a)以下のアミノ酸配列を有する、可変重鎖(VH)CDR配列CDR−H1、CDR−H2またはCDR−H3のうちの少なくとも1つ:
CDR−H1:FSLSX1X2AMA(配列番号11)(ここで、
X1は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WもしくはYであり;および/または
X2は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYである);
CDR−H2:IIX1X2SASTX3YASWAKG(配列番号12)(ここで、
X1は、A、C、G、MもしくはYであり;
X2は、D、NもしくはPであり;および/または
X3は、A、D、E、G、F、H、I、K、L、M、N、P、S、T、WもしくはYである);
CDR−H3:EX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10(配列番号13)(ここで、
X1は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WもしくはYであり;
X2は、A、C、D、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYであり;
X3は、A、C、F、H、I、L、M、N、Q、S、T、VもしくはYであり;
X4は、FもしくはIであり;
X5は、A、C、E、G、S、TもしくはVであり;
X6は、A、G、MもしくはNであり;
X7は、A、D、E、H、N、SもしくはTであり;
X8は、A、C、F、G、H、I、L、M、N、Q、S、T、V、WもしくはYであり;
X9は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYであり;および/または
X10は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYである);および/または
(b)以下のアミノ酸配列を有する、可変軽鎖(VL)CDR配列CDR−L1、CDR−L2またはCDR−L3のうちの少なくとも1つ:
CDR−L1:QASQSIX1X2X3LS(配列番号14)(ここで、
X1は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYであり;
X2は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、WもしくはYであり;および/または
X3は、E、F、G、M、N、Q、S、WもしくはYである);
CDR−L2:X1ASX2LAS(配列番号15)(ここで、
X1は、A、C、D、E、F、G、H、(I)、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、WもしくはYであり;および/または
X2は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYである);
CDR−L3:QNX1GX2X3X4X5IA(配列番号16)(ここで、
X1は、A、C、I、N、S、TもしくはVであり;
X2は、A、G、PもしくはSであり;
X3は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYであり;
X4は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYであり;および/または
X5は、A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYである)
を含む、請求項2から9のいずれか一項に記載の抗体。 - 少なくとも1つの、配列番号18の軽鎖可変フレームワーク領域FR−L1、配列番号19の軽鎖可変フレームワーク領域FR−L2、配列番号20の軽鎖可変フレームワーク領域FR−L3および/または配列番号21の軽鎖可変フレームワーク領域FR−L4を含む、請求項2から10のいずれか一項に記載の抗体。
- 少なくとも1つの、配列番号22、26もしくは30の重鎖可変フレームワーク領域FR−H1;配列番号23、27もしくは31の重鎖可変フレームワーク領域FR−H2;配列番号24、28もしくは32の重鎖可変フレームワーク領域FR−H3;および/または配列番号25、29もしくは33の重鎖可変フレームワーク領域FR−H4を含む、請求項2から11のいずれか一項に記載の抗体。
- a.配列番号7および配列番号146から成る群より選択される配列との少なくとも85%の同一性を有するVH配列;および/または
b.配列番号8、配列番号136および配列番号145から成る群より選択される配列との少なくとも85%の同一性を有するVL配列
を含む、IL−1βに対する抗体、特に請求項2から12のいずれか一項に記載の抗体。 - a.配列番号7および配列番号146から成る群より選択される配列との少なくとも85%の類似性を有するVH配列;および/または
b.配列番号8、配列番号136および配列番号145から成る群より選択される配列との少なくとも85%の類似性を有するVL配列
を含む、請求項2から13のいずれか一項に記載の抗体。 - a.配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121、配列番号122、配列番号124、配列番号126、配列番号128、配列番号130、配列番号132、配列番号134、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号152から成る群より選択されるVH配列;および/または
b.配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号123、配列番号125、配列番号127、配列番号129、配列番号131、配列番号133、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号139、配列番号141、配列番号143、配列番号145、配列番号147、配列番号149、配列番号151および配列番号153から成る群より選択されるVL配列
を含む、請求項2から14のいずれか一項に記載の抗体。 - 配列番号9のリンカー配列を含む、請求項2から15のいずれか一項に記載の抗体。
- 配列番号10、配列番号73および配列番号82から成る群より選択される配列との少なくとも85%の配列類似性を有する、請求項2から16のいずれか一項に記載の抗体。
- 配列番号10、配列番号73および配列番号82から成る群より選択される配列との少なくとも85%の配列同一性を有する、請求項2から17のいずれか一項に記載の抗体。
- 配列番号34から63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68から70、配列番号71から76、配列番号77から88、配列番号89から95および配列番号154から成る群より選択される配列を含む、請求項17または18に記載の抗体。
- 以下の残基:
a.重鎖アミノ酸位置12(AHo番号付けによる)におけるセリン(S);
b.重鎖アミノ酸位置103(AHo番号付けによる)におけるセリン(S)またはトレオニン(T);および/または
c.重鎖アミノ酸位置144(AHo番号付けによる)におけるセリン(S)またはトレオニン(T)
の少なくとも1つを含む、請求項2から19のいずれか一項に記載の抗体。 - ヒト化されている、請求項2から20のいずれか一項に記載の抗体。
- カニクイザルIL−1β、アカゲザルL−1βおよび/またはラットIL−1βと交差反応性である、請求項2から21のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項1から22のいずれか一項に記載の抗体の可変軽鎖および重鎖の配列を含む結合メンバー。
- ヒトIL−1βへの結合について請求項1から22のいずれか一項に記載の抗体または請求項23に記載の結合メンバーと競合する結合メンバー。
- 請求項1から22のいずれか一項に記載の抗体とヒトIL−1β上の同じまたはオーバーラップするエピトープに結合する結合メンバー。
- 一価または多価である、特に、多価および多重特異性である、請求項23から25のいずれか一項に記載の結合メンバー。
- Fab、Fab’、scFv、Fv断片、ナノボディまたはVHHである、請求項26に記載の一価結合メンバー。
- 完全長免疫グロブリン、ダイアボディまたはビス−ScFvである、請求項26に記載の多価結合メンバー。
- 請求項23から28のいずれか一項に記載の結合メンバーを含むTボディ。
- 化学的にまたは生物学的に改変される、請求項2から22のいずれか一項に記載の抗体、請求項23から28のいずれか一項に記載の結合メンバー、または請求項29に記載のTボディ。
- 血清中でのインビボ半減期滞留時間を延長するように改変される、請求項30に記載の抗体、請求項30に記載の結合メンバーまたは請求項30に記載のTボディ。
- 請求項1から22のいずれか一項に記載の抗体、請求項23から28のいずれか一項に記載の結合メンバー、または請求項29に記載のTボディをコードする、単離された核酸配列。
- 配列番号17を含む、請求項32に記載の核酸配列。
- 請求項32または33に記載の核酸配列を含むベクター。
- クローニングベクターまたは発現ベクターである、請求項34に記載のベクター。
- 請求項32もしくは33に記載の核酸配列または請求項34もしくは35に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 原核細胞または真核細胞である、請求項36に記載の宿主細胞。
- 請求項1から22、30もしくは31のいずれか一項に記載の抗体、請求項23から28のいずれか一項に記載の結合メンバー、請求項29に記載のTボディ、請求項32もしくは33に記載の核酸配列、請求項34もしくは35に記載のベクターまたは請求項36もしくは37に記載の宿主細胞を含み、適するキャリア、希釈剤または賦形剤をさらに含む組成物。
- 化粧品組成物、診断用組成物または医薬組成物である、請求項38に記載の組成物。
- 医薬的に許容され得るキャリア、希釈剤または賦形剤を含み;好ましくは、非経口、経口、直腸、尿生殖器、局所、硝子体内、静脈内、眼内、耳、鼻腔内、吸入、皮膚、舌下または口腔での投与用に製剤化される、請求項39に記載の医薬組成物。
- (i)IL−1β媒介疾患の処置に使用するための、
(ii)診断に使用するための、
(iii)化粧品に使用するための、および/または
(iv)検出目的のための、
請求項1から22、30もしくは31のいずれか一項に記載の抗体、請求項23から28のいずれか一項に記載の結合メンバー、請求項29に記載のTボディ、請求項32もしくは33に記載の核酸配列、請求項34もしくは35に記載のベクターまたは請求項36もしくは37に記載の宿主細胞。 - 前記IL−1β媒介疾患が、増殖性糖尿病性網膜症、通風性関節炎、シュニッツラー症候群、全身性若年性特発性関節炎、関節リウマチ、急性通風性関節炎、慢性通風性関節炎、蕁麻疹、脈管炎、1型糖尿病、2型糖尿病、強直性脊椎炎、再発性多巣性骨髄炎、再発性多発性軟骨炎、クリオピリン関連周期性症候群(CAPS)、ベーチェット病、家族性地中海熱、慢性閉塞性肺疾患、リウマチ性多発性筋痛症、NALP3−変異、壊疽性膿皮症、慢性特発性蕁麻疹、変形性関節症、滲出型加齢性黄斑変性、ドライアイ症候群、膿疱性乾癬、滑膜炎−ざ瘡−膿疱症−骨化過剰症−骨炎症候群、マクロファージ活性化症候群、周期性発熱・腺炎・咽頭炎・アフタ性潰瘍症候群、成人発症スティル病、メバロン酸キナーゼ欠損症、アテローム性動脈硬化症、TNF受容体関連周期性症候群(TRAPS)、尋常性ざ瘡および/または反対型ざ瘡である、請求項41に記載の抗体、結合メンバー、Tボディ、核酸配列、ベクターまたは宿主細胞。
- 請求項1から22、30もしくは31のいずれか一項に記載の抗体、請求項23から28のいずれか一項に記載の結合メンバーまたは請求項29に記載のTボディの生成方法であって、
(i)前記抗体、前記結合メンバーまたはTボディを発現するように、請求項36または37に記載の宿主細胞を培養する工程;
(ii)回収する工程;および
(ii)前記抗体、前記結合メンバーまたは前記Tボディをそれぞれ精製する工程
を含む方法。 - 請求項1から22、30もしくは31のいずれか一項に記載の抗体、請求項23から28のいずれか一項に記載の結合メンバーまたは請求項29に記載のTボディの生成方法であって、
(i)無細胞系を供給する工程;
(ii)核酸産物テンプレートを供給する工程;
(iii)前記核酸産物テンプレートの転写および翻訳を可能にする工程;
(iv)回収する工程;および
(v)必要に応じて、前記抗体、前記結合メンバーまたは前記Tボディをそれぞれ精製する工程
を含む方法。 - 化学合成の少なくとも1つの工程を含む、請求項1から22、30もしくは31のいずれか一項に記載の抗体、請求項23から28のいずれか一項に記載の結合メンバーまたは請求項29に記載のTボディの生成方法。
- 前記化学合成の工程が、請求項44に記載の方法に含まれる、請求項45に記載の方法。
- 治療有効量の請求項1から22、30もしくは31のいずれか一項に記載の抗体、請求項23から28のいずれか一項に記載の結合メンバーまたは請求項29に記載のTボディ、請求項32もしくは33に記載の核酸配列、請求項34もしくは35に記載のベクターまたは請求項36もしくは37に記載の宿主細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む、IL−1β関連疾患の処置方法。
- 前記IL−1β媒介疾患が、増殖性糖尿病性網膜症、通風性関節炎、シュニッツラー症候群、全身性若年性特発性関節炎、関節リウマチ、急性通風性関節炎、慢性通風性関節炎、蕁麻疹、脈管炎、1型糖尿病、2型糖尿病、強直性脊椎炎、再発性多巣性骨髄炎、再発性多発性軟骨炎、クリオピリン関連周期性症候群(CAPS)、ベーチェット病、家族性地中海熱、慢性閉塞性肺疾患、リウマチ性多発性筋痛症、NALP3−変異、壊疽性膿皮症、慢性特発性蕁麻疹、変形性関節症、滲出型加齢性黄斑変性、ドライアイ症候群、膿疱性乾癬、滑膜炎−ざ瘡−膿疱症−骨化過剰症−骨炎症候群、マクロファージ活性化症候群、周期性発熱・腺炎・咽頭炎・アフタ性潰瘍症候群、成人発症スティル病、メバロン酸キナーゼ欠損症、アテローム性動脈硬化症、TNF受容体関連周期性症候群(TRAPS)、尋常性ざ瘡および/または反対型ざ瘡である、請求項47に記載の方法。
- 前記被験体がヒトである、請求項47または48に記載の方法。
- 請求項1から22、30もしくは31のいずれか一項に記載の抗体、請求項23から28のいずれか一項に記載の結合メンバーまたは請求項29に記載のTボディ、請求項32もしくは33に記載の核酸配列、請求項34もしくは35に記載のベクターまたは請求項36もしくは37に記載の宿主細胞が、請求項39または40のいずれか一項に記載の医薬組成物で提供される、請求項47から49のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体、前記結合メンバー、前記Tボディ、前記核酸配列、前記ベクターまたは前記宿主細胞が、非経口投与、経口投与、直腸投与、尿生殖器投与、局所投与、硝子体内投与、静脈内投与、眼内投与、耳投与、鼻腔内投与、吸入により投与、皮膚投与、舌下投与または口腔投与される、請求項47から50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体、前記結合メンバー、前記Tボディ、前記核酸配列、前記ベクターまたは前記宿主細胞が、それぞれ、少なくとも1つのさらなる治療有効化合物とともに提供される、請求項47から51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記化合物が、前記抗体、前記結合メンバー、前記Tボディ、前記核酸配列、前記ベクターまたは前記宿主細胞と同時にまたは逐次的に投与される、請求項52に記載の方法。
- 生体試料中のIL−1βの存在を検出する方法であって、
a.IL−1βへの結合を許容する条件下で、前記生体試料を請求項1から22、30もしくは31のいずれか一項に記載の抗体、請求項23から28のいずれか一項に記載の結合メンバーまたは請求項29に記載のTボディと接触させるステップ、および
b.IL−1βとの複合体が形成されるかどうかを検出するステップ
を含む方法。 - インビトロまたはインビボでの方法である、請求項54に記載の方法。
- 前記生体試料が、ヒト起源のものである、請求項54または55に記載の方法。
- 前記生体試料が、血液、尿、脳脊髄液、生検材料および/またはリンパ液である、請求項54から56のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から22、30もしくは31のいずれか一項に記載の抗体、請求項23から28のいずれか一項に記載の結合メンバーまたは請求項29に記載のTボディでの治療に適格である被験体を選択するために用いられる、請求項54から57のいずれか一項に記載の方法。
- パッケージ化された組み合わせの試薬および使用のための説明書とともに、請求項1から22、30もしくは31のいずれか一項に記載の抗体、請求項23から28のいずれか一項に記載の結合メンバーまたは請求項29に記載のTボディを含むキット。
- 約12500ng/l以下の関数Kについての値を有する、IL−1βに対するナイーブ結合メンバー。
- 1250ng/lより低いK値を有する、請求項60に記載の結合メンバー。
- 請求項1から22のいずれか一項に記載の抗体である、請求項60または61に記載の結合メンバー。
- scFvである、請求項60から62のいずれか一項に記載の結合メンバー。
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