CN101273064A

CN101273064A - 抗-TrkB单克隆抗体及其用途

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Publication number: CN101273064A
Application number: CNA2006800287787A
Authority: CN
Inventors: S·乔; D·S·吉尔; X-Y·谭; M·D·钱
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2005-06-06
Filing date: 2006-06-05
Publication date: 2008-09-24
Also published as: PE20070183A1; NO20076157L; WO2006133164A2; GT200600240A; TW200722437A; EP2298813A3; PA8678401A1; ECSP077978A; NI200700315A; US20070059304A1; AU2006255101A1; KR20080032070A; EP1891114A2; RU2007144678A; EP2298813A2; US7750122B2; US20110150893A1; WO2006133164A3; IL187710A0; BRPI0610938A2

Abstract

本发明提供针对人TrkB的单克隆抗体。在某些实施方案中本发明的抗体结合并激活人TrkB。在某些实施方案中本发明的抗体对人TrkB是选择性的，因为它们不结合(或激活)人TrkA或人TrkC。在一些实施方案中本发明的抗体与鼠TrkB交叉反应。也包括本发明抗体的人化或修饰的变体。(本发明)提供包含发明的抗体的药物组合物以及制备本发明的抗体的方法和使用这些用于治疗、检测或纯化目的的方法。

Description

抗-TrkB单克隆抗体及其用途

优先权信息

本申请要求2005年6月6日提出申请的美国序列号60/687,705的权益，引用其整体内容作为参考。

发明背景

Trk酪氨酸激酶受体是多结构域单次跨膜受体，它在广谱神经元反应包括存活、分化、生长和再生中起到重要作用。它们是神经营养蛋白的高亲和性受体，该神经营养蛋白是蛋白生长因子家族，其包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)和神经营养蛋白-4/5(NT-4/5)。神经营养蛋白共有高度保守的结构特点，而它们独特的氨基酸序列允许其每个成员与特定Trk受体(即TrkA、B或C)的细胞外结构域高亲和性相互作用。因次，NGF是TrkA的优选配体；BDNF和NT-4/5是TrkB的优选配体；且NT-3已显示与TrkC结合，尽管它也显示与TrkA和TrkB可以较低亲和性结合。

在Trk受体中，TrkB在中枢神经系统(CNS)中的作用已被很好表征。TrkB广泛分布在大脑中，包括在新皮质、海马、纹状体、嗅觉结构和脑干中。利用BDNF作为同源配体，在许多神经退化模型包括中风、脊髓损伤、轴突切断术和肌萎缩性侧索硬化症(ALS)中已显示出TrkB在神经元存活、分化和神经再生中不可替代的作用。

通过多种信号分析和受体敲除系统，BDNF的应答已显示取决于TrkB的结合和活化。如前所述，Trk受体是多结构域单次跨膜蛋白质。它们由细胞外配体结合结构域、跨膜区域和细胞内酪氨酸激酶结构域组成。细胞外结构域由富含亮氨酸基序构成，基序侧翼为两个半胱氨酸簇和两个类免疫球蛋白(Ig)结构域。Trk受体已显示主要通过第二个类Ig结构域与其配体相互作用，尽管其它区域如富含亮氨酸的基序和第一个Ig结构域在配体对接中的贡献也已被提出。已确定Trk受体的配体结合结构域以及配体-受体复合体的晶体结构。配体-受体界面显示由两层组成：一层是所有神经营养蛋白中共有的保守的结合基序，而另一层是对每个神经营养蛋白特异的。

神经营养蛋白一旦结合到Trk受体上即发生受体二聚化和随后的构象改变，其被认为导致细胞内酪氨酸激酶结构域的活化。Trk受体的细胞内结构域中含有几个保守性的酪氨酸。激酶结构域的自动调节环的磷酸化激活激酶活性，而其它残基的磷酸化通过为衔接蛋白产生对接位点来促进信号传递，该衔接蛋白将这些受体和细胞内的信号级联结合，包括Ras/细胞外信号调节激酶(ERK)蛋白激酶通路、PI3K/Akt激酶通路和磷脂酶C-γ。尽管有些重叠，这些单独通路涉及非连续生物活性：Ras/MAPK调节神经元分化和增殖，PI3K/Akt通路控制肌动蛋白动力学和存活，且PLCγ涉及钙动员。

目前不存在作为TrkB的有效的和选择性的体内激动剂的成功试剂的实例。而BDNF作为重组蛋白质，已在体内和体外的许多CNS退化模型中显示增进神经元存活和神经再生，临床上BDNF蛋白质治疗的结果是阴性的，很可能由于BDNF具有短的体内半衰期。因此本领域需要作为TrkB的有效和选择性的体内激动剂的药物试剂。

发明概述

本发明提供针对人TrkB的单克隆抗体。在某些实施方案中发明的抗体结合并激活人TrkB。在某些实施方案中发明的抗体选择性的针对人TrkB，因为它们优选地结合到TrkB而不是人TrkA或TrkC。在一些实施方案中，发明的单克隆抗体与鼠的TrkB交叉反应。

本发明也提供包含一种或多种这类抗体的药物组合物。本发明另外提供制备本发明的单克隆抗体的方法。本发明的抗体的人化或修饰的变体也被包括在内，同样包括产生本发明抗体的杂交瘤。

本发明还提供使用这些单克隆抗体作为TrkB激动剂的方法。在某些实施方案中该单克隆抗体被用作人TrkB的激动剂。依据这样的实施方案，该抗体可被用于治疗需要TrkB活化的疾病，包括神经学上的疾病。

本发明另外还提供使用发明的抗体在样品中检测TrkB的方法和从样品中纯化TrkB的方法。

附图简述

图1图示在来自五只免疫小鼠(M1-M5)的免疫血清中的TrkB特异抗体活性。来自用重组蛋白质的ELISA测定产生的免疫血清结合结果显示于(A)，该重组蛋白质包括融合到人IgG1(rhTrkB-EDC-Fc)的Fc区域的人TrkB的细胞外结构域。来自用重组蛋白质的ELISA测定产生的免疫血清结合结果显示于(B)，该重组蛋白质包括鼠的TrkB(rmTrkB-EDC)的细胞外结构域。在竞争性ELISA测定中免疫血清阻碍rhTrkB-EDC-Fc和BDNF相互作用所达到的程度显示于(C)。结合于HEK-293细胞上表面rhTrkB的免疫血清显示于(D)。

图2图示在利用表达表面rhTrkB的HEK-293细胞的萤光素酶活性测定中使用神经营养蛋白获得的对照结果。这些对照结果显示该测定可选择性地代表TrkB的活化。

图3图示在和图2相同的萤光素酶活性测定中用免疫血清获得的结果。这些结果显示用免疫血液孵育hTrkB细胞以剂量依赖性的方式显著增强萤光素酶信号。

图4图示在和图2相同的萤光素酶活性测定中用某些TrkB抗体获得的结果。所有抗体导致信号EC₅₀在10^-10(M)范围内的剂量依赖性增强。对于大多数抗体，最大信号窗口约是基础值的7倍，其相当于由200ng/ml(超过基础值6.2倍)的BNDF诱导的应答。

图5图示在神经突生长测定中用某些TrkB抗体获得的结果。该测定使用人成神经细胞瘤SY5Y细胞，其已知在神经元分化后表达TrkB。如神经突长度(A)和分枝点数(B)的增加所证明，BDNF和多数抗体的加入促进神经突生长。少数治疗组的代表性图片显示于(C)。对于这些抗体的亚类获得的完全剂量应答分析结果显示于(D)。

图6图示在神经保护测定中用某些TrkB抗体获得的结果。该测定测量去血清损伤后分化的SY5Y细胞的存活。结果显示BDNF和几种抗体保护分化的SY5Y细胞，证明细胞活性中的剂量依赖性增强。

图7图示在大鼠小脑颗粒神经元(CGN)培养物中测定三种抗TrkB抗体18C3、29D7和17D11针对内源性大鼠TrkB受体的活性时获得的一些结果，其中抗体被显示结合到重组鼠TrkB(rmTrkB)。结果显示为神经突生长测定和神经保护测定(仅29D7)。

图8图示在Western分析中评估某些抗TrkB抗体诱导TrkB自体磷酸化时获得的结果。所有抗体导致活跃的TrkB磷酸化，并且通过用激酶抑制剂K252a处理来拮抗这些作用，指示这些TrkB结合抗体导致TrkB的活化。

图9图示用某些抗TrkB抗体获得的、来自FACS TrkA结合测定(A)和TrkA萤光素酶活性测定(B)的结果。这些结果显示发明的抗体不结合或激活人TrkA细胞。

图10图示在TrkC萤光素酶活性测定中评估某些抗TrkB抗体时获得的结果。这些结果显示发明的抗体不激活人TrkC细胞。

图11图示基于Levine程序的新生儿缺氧缺血(HI)的啮齿动物模型。

图12图示人TrkB的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。

图13图示鼠TrkB的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图14图示大鼠TrkB的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。

图15图示小鸡TrkB的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。

图16图示人TrkA的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。

图17图示人TrkC的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。

图18显示来自一组代表性的TrkB阳性svFv克隆(BMV文库淘汰筛选)的噬菌体结合ELISA数据。

图19显示利用FACS测定测试的TrkB选择的scFv抗体的结合特异性。数据显示TrkB选择的scFv抗体与膜相关TrkB以特定方式反应(实心直方图)而与对照细胞无交叉反应(空心直方图)。

图20显示29D7 IgG抗体及其Fab片段与人(A)和小鼠(B)TrkB的ELISA结合结果。29D7的总IgG和Fab均显示对人及小鼠TrkB的剂量依赖性结合活性。然而，Fab的ED₅₀值比完整的27D7的值低约100倍。同型对照IgG1或其Fab片段都不结合TrkB。

图21显示29D7 IgG或29D7 Fab处理后16小时测量的HEK-293细胞中萤光素酶活性。29D7的总IgG和Fab两者均诱导剂量依赖性萤光素酶活性，指示TrkB的活化。然而，29D7 Fab的EC₅₀值比27D7 IgG的值高约27倍(对于27D7 IgG和29D7 Fab分别为0.083nM和2.28nM)。同型对照IgG1和它的Fab片段都不影响TrkB活化。

图22显示来自抗TrkB单克隆抗体17D11、29D7、7F5、11E1和19E12的表位作图分析的结果。17D11单克隆抗体识别人TrkB的IgG-2片段的环3(KNEYGKD，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：1的氨基酸364到370)；和人TrkB的IgG-2片段的环1(KGNPKP，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：1的氨基酸308到313)。29D7、7F5、11E1和19E12单克隆抗体都识别人TrkB的IgG-1片段的环3(ENLVGED，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：1的氨基酸269到275)；并且也可识别人TrkB IgG-1片段的环1(AGDPVP，SEQID NO：11，SEQ ID NO：1的氨基酸221到226)。

图23比较从缺氧缺血(HI)损伤后不同处理的纹状体和海马获得的染色。

图24比较HI损伤后不同处理的总大脑组织损失(A)和亚区域组织损失(B)。数据显示为平均数和平均数的标准误差(S.E.M)。BDNF和抗TrkB单克隆抗体29D7显示显著的剂量依赖性保护大脑不受HI损伤。该保护不局限于任何特定的大脑亚区域，但最大保护通常观测于皮质中。

图25显示用于确定HI损伤后不同处理的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活性的DEVD-AMC切割测定的结果。大脑不同区域的结果显示为平均数±S.E.M。BDNF和抗TrkB单克隆抗体29D7阻碍HI损伤导致的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的活化。

图26显示取自HI损伤后给与不同处理的小鼠蛋白质样品的免疫印迹。样品通过SDS-PAGE分离并用针对某些天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3底物(PARP和α-血影蛋白)的抗体进行免疫印迹。针对β-肌动蛋白的抗体被用作对照以检验蛋白质的等上样量。结果显示BDNF和抗TrkB单克隆抗体29D7抑制这些天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3底物的切割(C＝对侧的颈动脉结扎，I＝颈动脉结扎同侧)。

图27显示取自脑室内注射抗TrkB抗体29D7(或载体作为对照)后的正常小鼠蛋白质样品的免疫印迹。在注射后1、2、6、12和24小时取样。样品用SDS-PAGE分离并用对由TrkB活化(磷酸基(phospho)-ERK1/2和磷酸基-AKT)而磷酸化的蛋白质特异的抗体进行免疫印迹。使用针对β-肌动蛋白的抗体作为检验蛋白质相等上样的对照。结果显示抗TrkB单克隆抗体29D7诱导ERK 1/2和AKT的时间依赖性磷酸化(显示来自海马样品和皮质样品的数据并代表从四个其它样品获得的结果)。

图28是显示于图27中的ERK磷酸化的光密度定量。

图29是显示于图27中的AKT磷酸化的光密度定量。

图30显示载体和29D7处理的脑组织，其已被固定并且用针对神经元特异性标记物NeuN的抗体(左边)和抗磷酸基-ERK1/2抗体(中心)免疫荧光标记。右图显示这两类的合并。ERK1/2磷酸化在29D7处理的样品中显著增强。

图31显示脑室内注射抗TrkB单克隆抗体29D7后，在皮质和海马组织中ERK1/2活化的时间进程。

图32显示(A)MAG和(B)髓磷脂导致的对原发性小脑颗粒神经元的神经突生长的剂量依赖性抑制。

图33显示抗TrkB单克隆抗体29D7导致的(A)MAG和(B)髓磷脂介导的神经突抑制的逆转。

某些实施方案的描述

本发明部分产生于认识到特异地结合到TrkB受体的细胞外结构域的单克隆抗体可以二聚化TrkB并且充分诱导受体的活化和与BDNF介导的那些相似的生物学应答。

单克隆抗体通常意指在研究、医学诊断和疾病的临床治疗中具有多种用途的独特的蛋白质类。有利地，单克隆抗体被认为比重组蛋白质如BDNF具有更强的药物代谢动力学稳定性，因而允许对临床应用具有明显有益的可持续的药理学效应。例如，目前单克隆抗体药物的临床上批准的用途包括器官移植排异的预防，癌症(例如乳腺癌、结肠癌、非霍奇金淋巴瘤、白血病)、风湿性关节炎的治疗，针对呼吸道合胞病毒病、克罗恩氏病、经皮冠状动脉干预和哮喘的预防。其它利用单克隆抗体治疗多种人疾病的医学应用目前也在临床试验中。这些单克隆抗体的生物效应通常通过阻碍或中和由内源性配体产生的分子事件来传达，因而起初作为特异的高亲和性拮抗剂起作用。在本发明中，单克隆抗体被用作模拟受体-配体相互作用的生物效应的激动剂。

1.单克隆抗体和杂交瘤

一方面，本发明提供结合人TrkB(SEQ ID NO：1)的单克隆抗体。在某些实施方案中，这些抗体以ED₅₀为约10pM到约500nM的范围内结合人TrkB(SEQ ID NO：1)，例如在约10pM到约1nM的范围内，约10pM到约100pM，或约10pm到约50pM。这里所用术语“约”定义为包括±15％的变化。

在一个实施方案中本发明的抗体也是人TrkB的激动剂。在某些实施方案中，这些抗体以EC₅₀在约10pM到约500nM的范围内激活人TrkB(SEQ ID NO：1)，例如在约10pM到约1nM的范围内，约10pM到约100pM，或约10pM到约50pM。

在一个实施方案中，本发明的抗体选择性的针对人TrkB(SEQ ID NO：1)，因为它们与TrkB(SEQ ID NO：1)的结合优先于与人TrkA(SEQ IDNO：5)或人TrkC(SEQ ID NO：6)的结合。在一些实施方案中，发明的抗体不结合人TrkA或人TrkC。如此处定义，如果其在浓度大于约1nM，例如大于约10nM、大于约100nM或大于约1μM时，不展示与这些受体可检测的结合，发明的抗体“不结合”人TrkA(SEQ ID NO：5)或人TrkC(SEQ ID NO：6)。

在一个实施方案中，发明的抗体选择性地针对人TrkB，因为它们不激活人TrkA(SEQ ID NO：5)或人TrkC(SEQ ID NO：6)。如此处定义，如果其在浓度大于约1nM，例如大于约10nM、大于约100nM或大于约1μM时不产生与这些受体可检测的激活，发明的抗体“不激活”人TrkA(SEQ IDNO：5)或人TrkC(SEQ ID NO：6)。

在一个实施方案中，发明的抗体以IC₅₀在约100pM到约500nM的范围内，例如在约100pM到约1nM，或约100pM到约500pM的范围内阻碍BDNF和人TrkB(SEQ ID NO：1)之间的结合。在其它的实施方案中这些抗体不阻碍BDNF和人TrkB(SEQ ID NO：1)之间的结合。如此处定义，如果其在浓度大于约1nM，例如大于约10nM、大于约100nM或大于约1μM时不展示可检测的阻碍活性，发明的抗体“不阻碍”BDNF和人TrkB(SEQ ID NO：1)之间的结合。

在某些实施方案中本发明的抗体属于IgG同种型，如IgG1、IgG2a或IgG2b同种型。

另一方面，本发明提供具有上述任意特性的单克隆抗体，其另外结合和/或激活小鼠TrkB(SEQ ID NO：2)。在某些实施方案中，这些抗体以ED₅₀在约10pM到约500nM的范围内结合和/或激活小鼠TrkB(SEQ IDNO：2)，例如在约10pM到约1nM的范围内，包括在约10pM到约500pM的范围内和约10pM到约100pM的范围内。

另一方面，本发明提供具有上述任意特性的单克隆抗体，其另外结合人TrkB(SEQ ID NO：1)的一种或多种特异性表位以及任选地小鼠TrkB(SEQ ID NO：2)的一种或多种特异性表位。在某些实施方案中，这些抗体结合具有序列KNEYGKD(SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：1的氨基酸364到370)的人TrkB表位和具有序列KGNPKP(SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：1的氨基酸308到313)的人TrkB表位中的一个或两个表位。在一个实施方案中，这些抗体也结合具有序列KNEYGKD(SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：2的氨基酸364到370)的小鼠TrkB表位和具有序列RGNPKP(SEQ IDNO：9，SEQ ID NO：2的氨基酸308到313)的小鼠TrkB表位中的一个或两个表位。在其它实施方案中，本发明提供的抗体结合具有序列ENLVGED(SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：1的氨基酸269到275)的人TrkB表位并且任选的结合具有序列AGDPVP(SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：1的氨基酸221到226)的人TrkB表位。在一个实施方案中，这些抗体也结合具有序列ENLVGED(SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：2的氨基酸269到275)的小鼠TrkB的表位。

另一方面，本发明提供产生任意这些单克隆抗体的杂交瘤。例如，提供2005年8月18日在ATCC保藏并获得ATCC专利保藏号PTA-6948(17D11)和PTA-6949(29D7)的杂交瘤。

另一方面，本发明提供由2005年8月18日在ATCC保藏并获得ATCC专利保藏号分别为PTA-6948(17D11)和PTA-6949(29D7)的杂交瘤产生的单克隆抗体。本发明也提供阻碍这些抗体结合并因此在人TrkB(SEQ IDNO：1)上具有相同结合表位的抗体。

2.单克隆抗体和杂交瘤的制备

应当理解本发明的单克隆抗体可通过任何已知的方法制备。例如，它们可使用合成、重组或杂交瘤技术制备(例如在Antibodies：A LaboratoryManual，Ed.by E.Harlow and D.Lane，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1988或Monoclonal Antibodies：Principles and Practice by J.W.Goding，Academic Press，1996中所描述的)。特别地应当理解本发明的抗体可通过用人TrkB或其衍生物(例如，包括人TrkB细胞外结构域的重组蛋白)初始免疫动物，然后从合适制备的杂交瘤中制备单克隆来制备。

一方面，本发明的单克隆抗体使用源于不同物种的TrkB蛋白质的至少两种蛋白质免疫原通过标准杂交瘤技术制备。例如，免疫原可包括衍生自人TrkB的第一类免疫原和衍生自非人TrkB的第二类免疫原。优选地每种免疫原包括TrkB的细胞外结构域。在某些实施方案中至少两种免疫原被组合成混合物用于免疫目的。

在一个实施方案中，这些免疫原的第一类是包括人TrkB的细胞外结构域(ECD)的重组蛋白。人TrkB的ECD包含来自全长蛋白质(其以图12中SEQ ID NO：1、GenBank登录号NP_006171提出)的氨基酸残基C32-H430。注意在GenBank、SwissProt、EMBL数据库或任何其他公开可用的数据库中以提交日期存在的所有蛋白质和核酸序列在此被引用作为参考(包括但不限于神经营养蛋白如NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5等的序列)。第二类免疫原是包括鼠TrkB细胞外结构域的重组蛋白。鼠TrkB的ECD包含来自全长蛋白质(其在图13中以SEQ ID NO：2、GenBank登录号P 15209提出)的氨基酸残基C32-H429。本领域技术人员应当理解包括这些结构域的合适的免疫原可使用标准重组技术制备(例如，参见Protocolsin Molecular Biology Ed.by Ausubel et al.，John Wiley & Sons，New York，NY，1989和Molecular Cloning：A Laboratory Manual Ed.by Sambrook etal.，Cold Spring Harbor Press，Plainview，NY，1989，其内容在此引用作为参考)。

在某些实施方案中，第一类和第二类免疫原以大于1左右的比率(以重量计)施用。例如，比率可以是约2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多。在一个实施方案中比率大于5左右。在一个实施方案中比率约为10。在一个实施方案中第一类和第二类免疫原以混合物同时施用。

在一个实施方案中，一种或两种免疫原包括与天然产生的结构域略有差异的它们各自的细胞外结构域变体。例如，细胞外结构域的N或C端处氨基酸可能缺失。或者天然产生的序列内的少数氨基酸可能突变。优选这些突变是保守取代。应当理解这些非天然产生的变体应包括与发现于SEQID NO：1或SEQ ID NO：2中的细胞外结构域具有至少95％，优选至少96％，更优选地至少97％，还更优选至少98％和甚至更优选至少99％同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，第一类和/或第二类免疫原不包括TrkB细胞外结构域以外发现的任何氨基酸(例如，它们不包括TrkB的跨膜和/或细胞内结构域中发现的氨基酸)。在某些实施方案中，免疫原可包括一种或多种在天然产生的TrkB蛋白质中不存在的末端氨基酸。特别是，作为用于表达的载体的结果等等，可加入末端氨基酸以增加重组蛋白的表达。另外，可将蛋白质过敏原中不存在的氨基酸片段加入到重组蛋白的氨基和/或羧基末端，例如作为纯化的标记、作为检测的标记、增强重组过敏原溶解性的标记、增加免疫原稳定性的标记、与不相关蛋白质或辅助载体蛋白质融合等。可以将蛋白质水解切割位点引入到附加的氨基酸片段和重组蛋白质末端的接合点，从而在重组蛋白质被纯化、吸收等等之后能够移除附加的片段。在重组技术中使用的普通末端修饰被描述于Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel等人编辑，John Wiley & Sons，New York，NY，1989和Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Sambrook等人编辑，Cold Spring Harbor Press，Plainview，NY，1989。

在一个实施方案中，第一类和第二类免疫原具有与描述于实施例中并从R&D systems公司获得的两个免疫原(商品目录编号分别为397-TR/CF和1494-TB/CF)相同的组成。

在某些实施方案中，第一类免疫原如上所述，但第二类免疫原包括来自不同于鼠类(例如大鼠、鸡、兔等)的非人TrkB物种的细胞外结构域(ECD)。大鼠TrkB的ECD包含来自全长蛋白质(其在图14中以SEQ IDNO：3、GenBank登录号NP_036863提出)的氨基酸残基C32-H429。小鸡TrkB的ECD包含来自全长蛋白质(其在图15中以SEQ ID NO：4、GenBank登录号CAA54468提出)的氨基酸残基C32-T428。

一旦制备合适的免疫原，便将免疫原注射入任意的多种动物(如小鼠、大鼠、兔等)。在一个实施方案中如实施例中所述将免疫原注入小鼠。例如，皮下和腹膜内注射免疫原和完全弗氏佐剂。在某些实施方案中，在多个不同位点皮下注射每个动物。在这一步骤，重组蛋白可作为无另外修饰的免疫原。备选地，如果重组蛋白结合到佐剂载体蛋白质如牛血清白蛋白或钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)，可引发高级免疫应答。将免疫原注入动物宿主，优选按照预定进度掺入一种或多种加强免疫并且将动物周期性放血。例如，在某些实施方案中，静脉内施以一种或多种加强免疫。然后任选地评估免疫血清和第一类(和任选地第二类)免疫原之间的结合以确定产生的抗体的适当滴度。

可通过任意标准方法制备对一种或两种免疫原特异的单克隆抗体。例如，可使用Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.6：511，1976的技术及其改进。简要地，这些方法通常涉及可产生具有期望特异性的抗体的永生细胞系的制备。这样的细胞系可产生于，例如，从如上所述的免疫的一种或多种动物中获得的脾细胞。然后通过将该脾细胞例如与骨髓瘤细胞融合配偶体，优选与免疫动物同源的一种融合而使其永生化。在某些实施方案中，具有合适血清的动物在脾细胞移除前用第一类和/或第二类免疫原加强一次或多次。可采用多种融合技术。例如，脾细胞和骨髓瘤细胞可与非离子型洗涤剂组合数分钟，并且接着以低密度铺平板培养在支持杂交瘤而非骨髓瘤细胞生长的选择性培养基上。某一选择技术利用HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶脱氧核苷)选择。在充足时间后，通常约1至2周，观察到杂种体的集落。选择单个集落并且将它们的培养上清液对针对如下所述的第一类(且任选地第二类)免疫原的结合活性进行测试。

单克隆抗体可从生长的杂交瘤集落的上清液中分离。另外，可采用多种技术以增加产量，例如将杂交瘤细胞系注射到合适脊椎动物宿主如鼠类的腹腔中。因而可从腹水液体或血液中获得单克隆抗体。通过常规技术如色谱、凝胶过滤、沉淀和萃取可从抗体中移除污染物。同型抗体可用标准方法确定。如在实施例中讨论的并且如在表1中所示，我们用这些方法已制备属于同型IgG1、IgG2a和IgG2b的特异性鼠抗体。

3.抗体结合的特征

在某些实施方案中，对发明的抗体对人TrkB的结合活性(例如使用实施例中描述的ELISA和/或FACS)进行表征。在某些实施方案中也可评估与在细胞表面上表达的人TrkB蛋白质的结合(例如使用实施例中所述的HEK293细胞)。优选地，也测试发明的抗体的物种间结合活性(例如与第二类免疫原)。这允许鉴别结合来自两个物种的TrkB的单克隆抗体。这些抗体是令人感兴趣的抗体，因为它们可在动物模型中测试，并且认识到也可将其应用于人临床试验中。

在某些实施方案中，可证明最好进一步表征任意给出的单克隆抗体的结合特性。特别是，可使用竞争性测定(比如ELISA)以确定抗体是否阻碍TrkB和BDNF的相互作用。也可评估抗体是否结合非人TrkB和/或人TrkA或TrkC。

也可对TrkB(人或其它)上相关抗体的结合表位进行作图，例如，通过测定每个单独抗体在阻碍其它抗体对TrkB的结合中的活性。例如，观察到两个抗体阻碍彼此的结合指示这些抗体可结合到TrkB上相同表位或重叠表位。

4.抗体功能的表征

在某些实施方案中，发明的抗体被表征其具有激活人TrkB的功能。可用任意激动剂测定。实施例描述示例性的萤光素酶测定，该测定已显示选择性地代表TrkB的活性。TrkB自体磷酸化(例如通过Western印迹测量的)也可用作TrkB活性的测量。

备选地或附加地，在涉及内源性TrkB的测定中可评估发明的抗体的人TrkB激动剂活性(例如在人成神经细胞瘤SY5Y细胞中)。如实施例中所述，这些测定测试每个抗体促进神经突生长或增强损伤(如无血清损伤)之后分化细胞的存活。在某些实施方案中测量发明的抗体对于神经突生长和/或细胞活性的剂量依赖性影响。

在某些实施方案中也表征纯化的单克隆抗体激活非人TrkB(例如鼠、大鼠、小鸡、兔等)的功能。实施例描述在大鼠小脑颗粒神经元(CGN)培养物中测试抗体针对内源性大鼠TrkB受体的活性的测定。如用人细胞可进行神经突生长测定和神经保护测定。其它有用的测定是本领域公知的并且应当为本领域技术人员所知。

在另外的其它实施方案中并且如实施例中所述，还表征纯化的单克隆抗体激活人TrkA和/或TrkC的功能。

5.人化和修饰的抗体

当使用发明的抗体用于治疗目的时，可证明最好使用目的抗体的人化或修饰的变体以减少任何潜在的免疫原反应。通常，人化或修饰的抗体将不期望的免疫应答最小化，该应答在人接受者中限制非人抗体治疗应用的持续性和有效性。

在本领域中已描述用于制备包含来自非人抗体的抗原结合部分的人化抗体的许多方法。特别是，已描述具有啮齿动物可变区及其相联的融合到人恒定结构域的互补决定区(CDR)的抗体(例如参见Winter等，Nature349：293，1991；Lobuglio等，Proc.Nat.Acad.ScL USA 86：4220，1989；Shaw等，J.Immunol.138：4534，1987；和Brown等，Cancer Res.47：3577，1987)。啮齿动物的CDR在与适合的人抗体恒定结构域融合前接合进人支撑框架区(FR)(例如参见Riechmann等，Nature 332：323，1988；Verhoeyen等，Science 239：1534，1988和Jones等，Nature 321：522，1986)，且由重组修饰的啮齿动物的FR支撑的啮齿动物的CDR也已有描述(例如参见EPO专利公开号519,596)。

完整的人抗体特别适用于人患者的治疗处理。可使用不能表达内源性免疫球蛋白重链和轻链基因，但可表达人重链和轻链基因的转基因小鼠来产生这样的抗体(例如参见Lonberg和Huszar M Rev.Immunol 13：65-93，1995及美国专利号5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661,016)。

发明的抗体的修饰变体也可用在本发明的方法中。修饰的过程涉及用人FR残基选择性地替换来自例如鼠的重链或轻链可变区的FR残基以提供抗体，该抗体包含基本保留全部天然FR蛋白质折叠结构的抗原结合部分。修饰技术基于此理解，即抗原结合部分的抗原结合特性主要由置于抗原缔合表面内的重链和轻链CDR的结构和相关配置决定(例如参见Davies等，Ann.Rev.Biochem.59：439，1990)。因而，仅在其中该CDR结构、它们彼此的相互作用以及它们与可变区结构域其余部分的相互作用被小心维持的人化抗体中保存抗原缔合特异性。通过使用修饰技术，用人残基选择性地替换易受免疫系统作用的外部(例如溶剂可及的)FR残基以提供包含弱免疫原性的或基本无免疫原性的修饰表面的杂种分子。

6.单链抗体

单链抗体也可基于本发明的抗体进行制备。例如，可如Colcher等，Ann.N Y Acad.ScL 880：263-80，1999和Reiter，Clin.Cancer Res.2：245-52，1996中所述设计单链抗体(scFv)。特别的方法描述于实施例中。可将单链抗体二聚化或多聚化以产生对人TrkB的不同表位具有特异性的多价抗体。

7.药物组合物

依据本发明，可单纯施用发明的单克隆抗体以激活TrkB。尽管如此，它们更普遍的以药物组合物的状况被施用，该组合物包含治疗有效量的一种或多种抗体和用于配制药物组合物的本领域技术人员所知的一种或多种其它成分。

如此处所用，术语“药物有效量”或“治疗有效量”意指药物组合物的每种活性成分的总量或充分显示有意义的患者利益的方法，即需要TrkB活化的疾病的治疗、预防或改善。当应用于单独施用的个别活性成分时，该术语指该单独成分。当应用于活性成分的组合时，该术语指产生治疗效果的活性成分的组合量，不论是组合地、连续地或同时地施用。

在本发明的某些实施方案中，以每周一次的剂量施用发明的抗体，在约0.1到约1000mg/kg体重，或约1到约500mg/kg体重，在某些实施方案中约10到约300mg/kg体重的范围内。可以单独疗法或以一天或一周的期间分两次或多次剂量的连续疗法施用药剂。给药可以是以快速注射(bolus)或在某些实施方案中以逐步输液方式(例如通过超过30分钟的注射)。在某些实施方案中最初可施用一种或多种较高剂量(如高于2倍、3倍或4倍)，继之以一种或多种较低维持剂量。较高剂量可只在治疗开始时或在每一治疗周期开始时施用。此处这些剂量水平和其它剂量水平是针对静脉内或腹膜内施用。技术人员应当能够容易地确定不同途径施用所需的剂量水平。应当理解，通常，使用的精确剂量应由开处方的医师确定并且不仅取决于受试者的重量和施用途径，也取决于受试者的年龄和症状的严重程度。

在依据本发明制备的药物组合物中有用的附加成分包括，例如，载体(如以液体或固体形式)、调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、填料、助流剂、压缩助剂、粘合剂、药片分解剂、胶囊材料、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、增稠剂、着色剂、粘性调节剂、稳定剂或渗透调节剂，或其组合。

液体药物组合物优选含有一种或多种本发明的单克隆抗体和一种或多种液体载体以形成溶液、悬浮液、乳剂、糖浆、酏剂或加压的组合物。药物可接受的液体载体包括，例如水、有机溶剂、药物可接受的油或脂肪，或其组合。液体载体可含有其它合适的药物添加剂，比如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、色素、粘性调节剂、稳定剂或渗透调节剂，或其组合。如果液体制剂意在用于儿科用途，通常最好避免包含醇。

适于口服或肠胃外施用的液体载体的实例包括水(优选含有添加剂，例如纤维素衍生物，如羧甲基纤维素钠)、醇或其衍生物(包括单羟基醇或多羟基醇如乙二醇)或油(如分馏的椰子油和花生油)。用于肠胃外施用的载体也可以是油酯，例如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。用于加压组合物的液体载体可以是卤代烃或其它药物可接受的推进剂。

固体药物组合物优选含有一种或多种固体载体，并任选一种或多种其它添加剂例如调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、填料、助流剂、压缩助剂、粘合剂或药片分解剂或胶囊材料。适当的固体载体包括，例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、糖类、乳糖、糊精、淀粉、凝胶、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷、低熔点蜡或离子交换树脂，或其组合。在粉末药物组合物中，载体优选是与细颗粒活性成分混合的细颗粒固体。在药片中，活性成分通常与具有必要浓缩特性的载体，和任选地其它添加剂以适当比例混合，并压缩成期望的形状和大小。

在本发明的一些实施方案中，药物组合物以单位剂量形式提供，例如药片或胶囊。在这样的形式中，组合物再分于含有适量活性成分的单位剂量中。单位剂量形式可以是包装的组合物，例如包装的粉末、小瓶、针剂、预装填的注射器或装有液体的囊剂。单位剂量形式可以是，例如，胶囊或药片本身，或者它可以是包装形式的任何这类组合物的适当数量。

因此，本发明也提供单位剂量形式的药物组合物用于激活TrkB，其中组合物含有本发明的至少一种单克隆抗体的治疗有效单位剂量。如本领域技术人员所公认的，某些治疗有效单位剂量取决于施用方法。

本发明也提供治疗包装用于将本发明的单克隆抗体分配到正对需要TrkB活化的疾病进行治疗的个体。在一些实施方案中，治疗包装含有至少一种发明的单克隆抗体的一个或多个单位剂量，含有一个或多个单位剂量的容器，以及指导治疗包装使用的标记。在某些实施方案中，单位剂量是药片或胶囊形式。在一些情况中，每一单位剂量是治疗有效量。

8.其它药物制剂

根据本发明，可单独施用该发明的单克隆抗体以调节TrkB活性。备选地，抗体可与一种或多种其它药物制剂组合施用(同时地或顺序地)，该制剂有助于治疗、预防或改善需要TrkB活性的一种或多种其它疾病(包括症状、紊乱或疾病)。

例如，可以将可调节TrkB活性的其它药物制剂与该发明的单克隆抗体组合使用，包括TrkB的其它活化剂。美国专利号5,770,577、6,077,829、6,723,701和6,800,607(在这里各自以其整体引用作为参考)描述了依据本发明的实际可能有用的BDNF衍生物和组合物。

另外地或备选地，单克隆抗体可与在神经性紊乱和疾病的治疗、预防或改善中有用的其它药物制剂联合使用。在某些实施方案中，单克隆抗体与有助于治疗、预防或改善由神经系统损伤(如创伤、手术、缺血、感染、代谢疾病、营养失调、恶性瘤、毒素类药物等)导致的紊乱和疾病的制剂组合。应当理解可使用本领域公知的任何合适的物质，包括在Monvale，NJ的Medical Economics Company，Inc.于2001年出版的第55版Physicians′Desk Reference中列出的那些，其相关部分在此引用作为参考。

9.治疗用途

一方面，发明的抗体对于治疗需要TrkB激活的疾病(包括症状、紊乱或疾病)是有用的。这样的方法涉及向个体施用治疗有效量的一种或多种发明的抗体。在某些实施方案中，本发明提供治疗神经疾病的方法。例如(而非限制)，发明的抗体可被用来治疗具有已被创伤、手术、缺血、感染、代谢疾病、营养失调、恶性瘤、毒素类药物等损伤的神经系统的个体。特异的实例包括中风、脊髓损伤、外伤性脑损伤、视网膜退化和轴突切断术。本发明的抗体也可用于治疗紊乱，例如注意力缺陷多动症(ADHD)、抑郁症和年龄相关性智力缺损(即通过提供认知的增加)。发明的抗体也可用于治疗先天性或神经退化性疾病，包括阿尔茨海默病、帕金森氏症、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)及其相关疾病。也已描述在治疗非神经性疾病如癌症和糖尿病中TrkB活化的益处并且在这些疾病情况下发明的抗体可因此得到利用(比如美国专利号5,877,016和6,800,607分别描述TrkB活化用于治疗癌症和糖尿病的益处)。

本发明的方法有助于在成人和儿童中治疗此处描述的疾病。它们也可被用于兽医用途，特别包括犬科和猫科应用。如果需要，此处的方法也可被用于农畜，例如羊、牛、猪和马的品种。

发明的方法涉及经由任何合适的施用途径递送发明的单克隆抗体，包括例如肠胃外的、静脉内的、局部的、经鼻的、经口的(包括口腔的或舌下的)、直肠的或其它方式。通常，可配制抗体用于立即的、延时的、改进的、持续的、脉冲的或控释的递送。

在某些实施方案中，配制抗体用于通过注射来递送。在这样的实施方案中，施用可以是，例如海绵体内、静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌肉内或皮下的，或经由输液或无针头注射技术。对于这样的肠胃外施用，可以传统的冻干制剂制备并保存本发明的抗体，且在施用前用药物可接受盐溶液例如0.9％盐溶液重建。如本领域公知的，可用药物可接受酸，例如甲基磺酸调节可注射制剂的pH。可应用的其它可接受载体和溶剂包括林格氏溶液和U.S.P.。另外，传统上将灭菌的不挥发性油用作溶剂或悬浮介质。为此目的可应用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，脂肪酸例如油酸被用于血管注射剂的制备。可将注射制剂灭菌，例如，通过经由滞留细菌滤膜的过滤，或通过以灭菌的固体组合物形式掺入灭菌剂，该组合物可于使用前在无菌水或其它无菌注射介质中溶解或分散。

为延长本发明抗体的效果，可期望延缓其从肌肉内或皮下注射的吸收。这种施用的抗体的延时吸收可通过在油类载体中溶解或悬浮该制剂来完成。通过在可生物降解的多聚体例如聚交酯-聚乙醇酸中形成抗体的微胶囊基质来制备可注射的储存型制剂。依据抗体对聚合体的比率和使用的特定聚合体的性质可控制抗体释放的比率。其它可生物降解的聚合体的实例包括聚(原酸酯)和聚(酐)。通过将抗体诱导入与身体组织兼容的脂质体或微乳剂中也可制备可注射的储存型制剂。

为局部地应用于皮肤，可将抗体配制为含有活性成分的合适的油膏，将该活性成分悬浮或溶解于，例如具有一种或多种下列物质的混合物：矿物油、液态矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯化合物、乳化蜡和水。备选地，它们可被配制为合适的洗剂或霜剂，悬浮或溶解于例如一种或多种下列物质的混合物：矿物油、山梨糖醇酐单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、棕榈醇(cetearyl alcohol)、2-辛基十二醇、苯甲醇和水。

发明的抗体也可鼻内地或通过吸入来施用并以干粉吸入器或气雾剂喷雾形式，由加压容器、泵、气雾器、雾化器或喷雾器便利地给药，可用或不用适当的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷、二氧化碳或其它合适的气体。在加压气雾剂的情况中，通过提供阀门以递送可计量的量来确定剂量单位。加压容器、泵、气雾器、雾化器或喷雾器可含有抗体的溶液或悬浮液，例如，使用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂，其可另外含有润滑剂，例如去水山梨糖醇三油酸酯。可将在吸入器或吹药器中使用的胶囊和药筒(例如从凝胶制备)制成含有本发明抗体和适当的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。

为将发明的方法用于口服给药，可以使用固体或液体制剂来完成这种给药，例如以药片、胶囊、多微粒、凝胶、薄膜、卵状小体、酏剂、溶液或悬浮液形式。在某些实施方案中，以口服药片或胶囊施用单克隆抗体。如果需要(例如以有助于对儿童、对吞咽药片能力困难的个体，或对动物的施用)，这种制备可以是混合的可咀嚼的或液体的制剂，或食物原料或液体。

用于直肠施用的组合物优选是栓剂，其可通过混合发明的抗体和适当的无刺激性赋形剂或载体来制备，所述载体例如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡，其在环境温度下是固体但在体温下为液体并因此在直肠穹窿融化并释放出抗体。如本领域公知的也可利用滞留灌肠和直肠导管。粘性增强载体如羟丙基纤维素也是本发明用于直肠施用的某种载体，因为它们有助于直肠内药物组合物的停滞。通常，选择加入到药物组合物的载体的量以便使组合物的停滞最大化。特别地，载体量不应多至危害施用的组合物在直肠穹窿中的停滞。

10.诊断用途

另一方面，发明的抗体可用于检测样品中的TrkB(例如用于诊断其特征在于TrkB的过度或不足表达的疾病)。根据这样的方法，将发明的抗体与样品在允许特异性结合的情况下组合。然后检测特异性结合从而指示样品中TrkB的存在。

样品可来源于体液(例如来自脑脊髓液、血液、血清、尿液等)或细胞或组织的抽提物(例如活组织检查样品)。通过偶联(即生理上连接)抗体到可检测的物质(即抗体标记)可有助于结合的检测。可检测物质的实例包括多种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质的实例包括7-羟基香豆素、萤光素、异硫氰酸萤光素、罗丹明、二氯三嗪基胺萤光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括发光氨(luminol)；生物发光物质的实例包括萤光素酶、萤光素和水母荧光素；并且合适的放射性物质的实例包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。

测定抗体结合的多种方案，包括ELISA和FACS，在本领域是公知的并为诊断改变的或异常的TrkB表达水平提供基础。在实施例中另外描述了ELISA和FACS。通过在适合复合物形成的情况下将取自正常个体的样品与发明的抗体组合来确定TrkB表达的正常或标准值。通过取决于可检测物质性质的多种方法可定量标准复合物形成的量。优选地通过光度测定方法定量标准复合物形成的量。然后将来自患病个体的样品中TrkB表达水平与标准值比较。标准值和患病值之间的偏差确定诊断疾病的参数。

在某些实施方案中，本发明方法可用于诊断其特征在于TrkB过度或不足表达的神经疾病。例如，而非限制，发明方法可被用于识别被创伤、手术、缺血、感染、代谢疾病、营养失调、恶性瘤、毒素类药物等损伤的神经系统。特殊的实例包括中风、脊髓损伤、外伤性脑损伤、视网膜退化和轴突切断术。本发明的方法也可用于诊断紊乱，例如注意力缺陷多动症(ADHD)、抑郁症和年龄相关性智力缺损(即通过提供认知增加)。发明的方法也可用于诊断先天性或神经退化性疾病，包括阿尔茨海默病、帕金森氏症、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)及其相关疾病。

11.纯化用途

本发明也提供使使用抗体从样品中纯化TrkB的方法，该方法包括在允许特异性结合条件下组合发明的抗体和样品，从而产生抗体-TrkB受体复合物，从样品残余物中分离抗体-TrkB受体复合物并且然后从TrkB受体分离抗体，由此获得纯化的TrkB受体。应当理解可使用本发明抗体通过任何标准技术例如亲和层析或免疫沉淀反应来分离TrkB。

实施例

通过下列实施例进一步阐明和支持本发明。然而，不应认为这些实施例进一步限制本发明的范围。相反，本领域普通技术人员应当容易理解存在不背离本发明精神和/或所附权利要求范围的本发明的其它实施方案、修改和等同。

实施例1

本实施例描述多数TrkB抗体的制备和体外表征以及测试。

原料和方法

免疫原

使用两种蛋白质免疫原的混合物制备鼠抗TrkB抗体：包括人TrkB细胞外结构域(ECD)(rhTrkB-ECD)的第一类重组蛋白(R&D systems，Inc.，商品目录号397-TR/CF)和包括鼠TrkB细胞外结构域(rmTrkB-ECD)的第二类重组蛋白(R&D system，Inc.，商品目录号1494-TB/CF)。

人TrkB的细胞外结构域包含全长蛋白质(其在图12中以SEQ ID NO：1、GenBank登录号NP_006171提出)的氨基酸残基C32-H430。在鼠骨髓瘤细胞系NS0中表达rhTrkB-ECD。计算出的单体rhTrkB-ECD分子量是44kDa；然而，当被糖基化时，在还原条件下的SDS-PAGE中其作为80-100kDa的宽带迁移。

鼠TrkB的细胞外结构域包含全长蛋白质(其在图13中以SEQ IDNO：2、GenBank登录号P15209提出)的氨基酸残基C32-H429。在用于本实施例的mhTrkB-ECD中，该序列侧翼为表达期间被切割的N末端人CD33信号肽和C末端组氨酸标记。在鼠骨髓瘤细胞系NS0中也表达rhTrkB-ECD。计算出的单体mhTrkB-ECD分子量是45.9kDa；然而，当被糖基化时，在还原条件下的SDS-PAGE中其作为70-100kDa的宽带迁移。

免疫进度

用预先混合有完全弗氏佐剂(CFA)的10μg的rhTrkB-ECD免疫五只8周龄的雌性BALB/c小鼠。混合物被分成每两周(即在第0、2、4和6周)皮下和腹膜内注射4次的若干份。在第7周还通过用预先混合有完全弗氏佐剂(CFA)的1μg的rmTrkB-ECD皮下和腹膜内注射来免疫小鼠。在第5周和第7周收集小鼠血液并且评估血清中的抗体应答。

鼠抗TrkB单克隆抗体的产生(mAb)

在细胞融合(其发生在第12周)前3天用10μg的rhTrkB和1μg的rmTrkB另外加强静脉注射五只小鼠中的三只。使用50％聚乙二醇(MW1500)以4∶1比例融合来自这三只小鼠的脾细胞和鼠骨髓瘤细胞P3X63Ag8.653(ATCC，商品目录号CRL-1580)(Roche Diagnostics Corp.，商品目录号783641)。融合后，在96孔板中以1×10⁵个细胞/孔将细胞接种并培养于选择培养基(含有20％FBS和5％三甲氧唑辛的RPMI1640)(IGEN International，Inc.，商品目录号210001)、2mM L-谷氨酸盐、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、1×HEPES和1×HAT(次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷)(Sigma，商品目录号H0262)中。筛选杂交瘤上清液用于通过ELISA与rhTrkB结合并通过FACS分析将表达rhTrkB的HEK293稳定细胞染色(见下文)。随后使用萤光素酶测定测试选择为阳性的杂交瘤上清液对rhTrkB的激动剂活性(见下文)。选择的杂交瘤通过连续稀释四次亚克隆和通过FACS分选一次(见下文)。从稳定的杂交瘤培养物中获得条件培养基。使用Prosep-A(Montage Antibody Purification Spin columns，Millipore，商品目录号P36486)纯化来自杂交瘤条件培养基的IgG。用鼠mAb同种型试剂盒(IsoStrip，Boehringer Mannheim Corp.，商品目录号1493027)确定每个mAb的Ig类。

ELISA

为检测TrkB特异性抗体的存在，96孔板(Maxisorp，Nunc)涂上一层1μg/ml rhTrkB-EDC-Fc(R&D system，商品目录号688-TK)或rmTrkB-Fc(R&D system)并在4℃孵育过夜。用含有1％BSA和0.05％吐温-20的PBS(10mM磷酸钠，150mM NaCl，pH 7.2)洗平板并且封闭板孔之后，加入100μl稀释的免疫血清或杂交瘤上清液并于室温孵育1小时。冲洗平板并且使用过氧化物酶缀合的山羊抗鼠IgG(H+L)(PIERCE，商品目录号31434)来检测结合的抗TrkB抗体，接着用底物TMB(BioFX Laboratories，商品目录号TMBW_1000-01)孵育。在分光光度计中于450nm处测定吸光度值。

为确定杂交瘤上清液中mAb浓度，将96孔板用PBS中1μg/ml的山羊抗鼠IgG(Fcγ)(PIERCE，商品目录号31123)包被并在4℃孵育过夜。用含有1％BSA和0.05％吐温-20的PBS冲洗平板并且封闭板孔之后，于室温下加入100μl稀释的杂交瘤上清液1小时。使用纯化的同型匹配鼠IgG作为抗TrkB IgG浓度的定量标准。冲洗平板，并加入HPR标记的山羊抗鼠IgG-Fc并于室温孵育1小时。冲洗板孔后，加入底物TMB。于450nm处测定吸光度。

使用竞争性结合来表征相关抗体结合表位

为确定抗TrkB IgG与TrkB蛋白质的结合如何影响BDNF与TrkB的相互作用，用PBS中0.3μg/ml的BDNF(R&D system，商品目录号248-BD/CF)包被96孔板并在4℃孵育过夜。用含1％BSA和0.05％吐温-20的PBS冲洗并封闭板孔后，向平板加入混合有rhTrlcB-EDC-Fc的100μl预孵育的杂交瘤上清液(或稀释的免疫血清)并于室温孵育1小时。冲洗平板后，加入过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG(Fcγ)(PIERCE，商品目录号31416)并于室温孵育1小时。冲洗板孔并加入底物TMB。于450nm处测定吸光度。

为对rhTrkB上相关抗体结合表位作图，用PBS中1μg/ml的每种单一TrkB特异性mAb包被96孔板并在4℃孵育过夜。用含1％BSA和0.05％吐温-20的PBS冲洗并封闭板孔后，向板孔加入100μl每种单一预孵育的TrkB mAb(20μg/ml)和rhTrlcB-EDC-Fc(0.1μg/ml)的混合物并于室温孵育1小时。冲洗平板并用过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG(Fcγ)孵育1小时。冲洗平板后，加入底物TMB。于450nm处测定吸光度。

萤光素酶测定

通过用pcDNA-hTrkB(全长，参见GenBank登录号NM_006180)转染HEK-293细胞来产生表达rhTrkB的HEK-293细胞的稳定系。在潮霉素存在下以限定的稀释度对转染的细胞选择2周。初步评估后，选择用于研究的单克隆细胞。对于萤光素酶测定，在96孔板上的100μl生长培养基中以1.5×10⁴个细胞/孔铺板。第二天，用10μl的10×终浓度的BDNF或测试抗体处理细胞。根据制造商的方案在处理16小时后使用PromegaSteady-Glo测定试剂盒检测萤光素酶活性。简言之，用100μl PBS代替培养基并且加入100μl的Steady-Glo试剂。用TopSeal将平板密封后，在Titer Plate Shaker中以速度约5摇动平板5分钟，然后使用TopCount NXTv2.13仪器(Packard)测量发光。

FACS分析

用含有5mM EDTA的PBS从平板上分离表达rhTrkB的HEK-293细胞并以2×l0⁵个细胞每管转移到5ml Falcon管中(Becton Dickinson，商品目录号352063)。通过在4℃以800rpm离心3分钟，用PBS洗涤细胞一次，并于4℃用100μl的杂交瘤培养物上清液、纯化的抗体或在含1％FBS的PBS中稀释的免疫血清孵育30分钟。细胞用含1％FBS的1ml PBS洗涤3次并在黑暗处于4℃与PE标记的山羊抗鼠IgG、F(ab′)₂片段(DAKOCorporation，商品目录号R0480)在含有1％FBS的PBS中孵育30分钟。细胞被再次洗三次并在含1％FBS的250μl PBS中重悬。使用碘化丙啶检测死亡细胞，将其从分析中去除。用FACScan流量细胞荧光测量仪(BectonDickinson)计算5000个细胞/管的荧光。

TrkB自磷酸化测定

将表达rhTrkB的HEK-293细胞在DMEM培养基中以2×10⁵个细胞/孔在24孔板中铺板。第二天，细胞在无血清的DMEM中孵育90分钟，然后用BDNF或不同浓度的测试抗体在37℃下刺激30分钟。用PBS冲洗一次后，细胞在95℃预热的电泳示踪缓冲剂样品缓冲液(Bio-Rad)中裂解。裂解产物通过QIAshredder柱(Qiagen)并且将20μl的样品溶解在4-12％甲叉双丙烯酰胺-三羟甲基氨基甲烷(Bis-Tris)凝胶(Invitrogen)中。转移至硝化纤维素膜后，使用PY490磷酸基-Trk-特异性抗体(1∶100，CellSignaling，商品目录号9141)检测磷酸化的TrkB带，接着与HRP缀合的抗兔第二抗体(Molecular Probes)孵育。使用ECL plus试剂盒(Amersham)检测信号。

神经突生长测定

人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞在添加了2mM L-谷氨酸盐、15％FBS和青霉素/链霉素的DMEM∶F12(1∶1)中生长。对于神经突生长测定，细胞以4×10³个细胞/孔的密度在96孔组织培养平板中铺板并且与10μM全反式视黄酸(RA)孵育以诱导神经原分化。第三天，用含有或不含BDNF或测试抗体的新鲜培养液替换培养基，如结果所示。另外培养三天后，细胞用IC-Fix于室温固定30分钟并进一步进行β-微管蛋白III的免疫染色。首先，通过在0.2％Triton的磷酸盐缓冲溶液(TPBS)中短时孵育来渗透化处理细胞。然后将样品在含1.5％正常山羊血清(NGS)的TPBS中孵育30分钟以封闭非特异性结合，接着在1.5％NGS/TPBS中与抗β-微管蛋白III mAb(Tuj1，1∶1000，Covance)孵育。使用Alexa 488鼠抗山羊抗体(1∶500，Molecular Probes)检测Tuj1信号并且使用Cellomics arrayscan分析神经突生长。

为检测神经突在初级神经元中的促进作用，制备大鼠或鼠的小脑颗粒神经元(CGN)培养物。简言之，从出生后7天的动物中切离小脑并切成小片。将组织用木瓜蛋白酶(Worthington Biochemical Corp.)在37℃下处理30分钟并通过温和的研磨分散。接着以300g离心5分钟，解离的细胞在含有B27添加物、0.5mM L-谷氨酸盐和25mM氯化钾的神经基础(Neurobasal)培养基中再生并以1.2×10⁴个细胞/孔的密度在预包被聚-d-细胞溶解酵素(BD bioscience)的96孔Biocoat板上铺板。用BDNF或测试抗体处理细胞24小时，在室温下用IC-Fix固定30分钟并进行如上所述的Tuj1免疫染色。

细胞存活测定

SH-SY5Y细胞以1×10⁴个细胞/孔在96孔板中铺板并与RA(10μM)孵育以诱导神经元分化。3天后，将培养基转换为不含血清的培养基(无血清培养基)，并且用BDNF、测试抗体或载体处理细胞。另外培养两天后，根据制造商方案通过使用CellTiter 96无放射性细胞增殖测定试剂盒(Promega)的MTT测定来检测细胞活性。

神经保护测定

从如上所述的7天大的幼仔中制备大鼠或鼠CGN培养物并且以7.3×10⁴个细胞/孔的密度在预包被有聚-d-细胞溶解酵素(BD bioscience)的96孔Biocoat板中铺板。铺板24小时后，细胞接受血清除钾(KSD)损伤，其已知可导致小脑颗粒神经元显著的死亡。同类的培养物(sister culture)用BDNF或测试抗体共同处理。24小时培养后，使用CellTiter 96无放射性细胞增殖测定试剂盒(Promega)检测细胞活性。

结果

来自TrkB免疫小鼠的抗体应答评估

为评估对TrkB的特异性免疫应答，在第三和第四次免疫处理后一周将五只免疫小鼠(M1-M5)放血。通过在第三和第四次放血中ELISA和FACS分析来确定血清中的高抗TrkB抗体滴度。图1显示来自第四次免疫处理后放血的结果。在ELISA中全部五只小鼠都产生识别rhTrkB-ECD和rmTrkB-ECD的高滴度(图1A和1B)。

也评估相对于BDNF结合位点的在hTrkB上的抗体结合表位的位置。来自竞争性ELISA的结果显示免疫血液可以M2＝M5＞M3＞M4＝Ml的顺序阻碍rhTrkB-EDC-Fc和BDNF的相互作用(表1C)。有趣地，在阻碍rhTrkB-BDNF相互作用中抗体的功效与抗体结合滴度有关(比较图1A和1C)。如FACS分析所示，全部免疫血液也显示结合到HEK-293细胞上表达rhTrkB的细胞表面(图1D)。

免疫血清对hTrkB的高滴度特异性结合的观察后，在萤光素酶报告测定中评估这些免疫血液以测试其激动活性。表达rhTrkB的HEK-293细胞中的萤光素酶活性已显示选择性地代表TrkB的活化(图2)。这些细胞与免疫血液的孵育以剂量依赖方式显著增强萤光素酶信号(表3)。同样，激动活性功效的顺序为M2＝M5＞M3＞M4＝Ml。选择具有最高抗体滴度和强烈激动活性的三只小鼠(M2、M3和M5)用于随后的杂交瘤的产生。

单克隆抗体的产生

如前所述，在细胞融合前三天对挑选的三只小鼠(M2、M3和M5)静脉内注射10μg的rhTrkB-ECD和1μg的rmTrkB-ECD。从第一轮杂交瘤筛选中，选出在ELISA测定中强力结合到rhTrkB-EDC-Fc的94个克隆。在ELISA试验中这些克隆的20个与rmTrkB-ECD交叉反应。FACS分析确认54个克隆结合到HEK-293细胞表面上表达的TrkB。

利用萤光素酶试验测定每个克隆的TrkB激动剂活性并且选择17个高活性的杂交瘤克隆用于进一步的表征。在稳定化这些克隆、以连续稀释进行三轮亚克隆以及以FACS分选进行一轮亚克隆之后，收集来自每一条件培养基的单克隆抗体并使用ProSep-A(Montage抗体纯化试剂盒)纯化。通过鼠同种型测试试剂盒鉴定每种抗体的IgG同种型(表1)。通过鼠IgG定量ELISA测定抗体浓度并且所有17个克隆都在培养上清液中产生较好水平的Ig。

表1

单克隆抗体的表征

纯化的TrkB特异性单克隆抗体通过ELISA表征其对hTrkB的结合活性。大多数抗体以高结合亲和性结合到TrkB(ED₅₀＝10^-11(M)，除了克隆29D7，纯化后其ED₅₀从10^-11(M)降至10^-10(M)(数据未显示)。两个克隆12F4和18C8在纯化后丧失了它们的结合活性并因此从优选列表中被取消(且因此未包含在表1中)。利用FACS分析，所有15个保留的TrkB结合mAb也显示特异性地结合到在HEK-293细胞表面上表达的hTrkB。通过ELISA也对抗体测试它们与rmTrkB的种间交叉结合活性。尽管发现大多数抗体弱结合于rmTrkB，但发现克隆体17D11、18C3和29D7以ED₅₀＝10^-10～11(M)结合rmTrkB(表2)。

使用竞争性ELISA测定来确定抗体是否阻碍rhTrkB和BDNF的相互作用。克隆29D7不显示阻碍活性，而克隆17D11、18C3和19E12部分阻碍rhTrkB-BDNF相互作用。所有其它克隆体以IC₅₀＝3-5×10^-10(M)阻碍rhTrkB-BDNF相互作用(表2)。

表2

W^＊：弱结合 NB^＊＊：无结合

通过检测在阻碍其它抗体对rhTrkB的结合中每一单独抗体的活性来进行rhTrkB上的相关抗体结合表位的作图。例如，观察到两种抗体阻碍彼此与rhTrkB的结合，指示这些抗体可在rhTrkB上结合到相同表位或重叠表位(表3)。在表3中，在每一行中显示预结合的抗体而在每一列中显示竞争的(即包被)抗体。结果显示克隆11E1、19E12和29D7可识别独特的表位。克隆17D11和18C3显示出竞争相同结合位点。所有余下的克隆都彼此竞争且可共有相同的结合表位。

萤光素酶活性

利用萤光素酶测定检测纯化的TrkB特异性抗体以证明激动剂活性。所有抗体导致信号中EC₅₀在10^-10(M)范围内的剂量依赖性增强(表4)。对于大多数抗体，最大信号窗口约是基础值的7倍，其相当于200ng/mlBDNF诱导的应答(超过基础值6.2倍)。

mAbs的功能活性

为检测TrkB结合抗体是否具有由内源性TrkB受体活化介导的功能激动活性，用这些抗体处理后评估神经突促进作用。基于抗体的物种特异结合特征，我们首先利用人成神经细胞瘤SY5Y细胞，其已知在神经元分化时表达TrkB。与先前报道相一致，如在神经突长度和分枝点数量上的增加所示，我们观察到BDNF的添加促进神经突生长(图5A和5B)。重要的是，大多数抗体也显著增强神经突生长，其效果相当于或甚至超过BDNF(图5A和5B)。一些治疗组的典型图像的实例显示于图5C中。

选择具有最高活性的七个TrkB抗体(6E2、7F5、11E1、16E11、17D11、19E12和29D7)用于完整剂量应答分析。它们以约10^-10(M)的EC₅₀诱导神经突生长中的剂量依赖性增强(图5D，未获得6E2的数据)。也对这些抗体检测其增强无血清损伤后分化的SY5Y细胞存活的能力。结果显示BDNF和几种抗体保护分化的SY5Y细胞，证明细胞活性中剂量依赖性增强(表6)。

还在大鼠小脑颗粒神经元(CGN)培养中检测显示结合到rmTrkB的两种TrkB抗体17D11、18C3和29D7针对内源性大鼠TrkB受体的活性。在神经突生长测定和神经保护测定中，只有29D7显示相当于BDNF的值的活性，而17D11和18C3无活性(表7和数据未显示)。这可能表明17D11和18C3识别鼠TrkB上的表位，而该表位在大鼠TrkB中含有不同的氨基酸。

TrkB磷酸化作用分析

在Western分析中评估基于上述所有活性选择的七种TrkB抗体(6E2、7F5、11E1、16E11、17D11、19E12和29D7)对TrkB自体磷酸化的诱导。所有抗体导致强的TrkB磷酸化，且通过用激酶抑制剂K252a处理来拮抗这些作用，指示这些TrkB结合抗体导致TrkB活化(图8)。

还在大鼠小脑颗粒神经元(CGN)培养物中检测两种TrkB抗体17D11、18C3和29D7针对内源性大鼠TrkB受体的活性，所述抗体显示结合rmTrkB。同时在神经元生长测定和神经保护测定中，仅29D7显示相当于BDNF的值的活性，而17D11和18C3无活性(表7和数据未显示)。这可能表明17D11和18C3识别鼠TrkB上的表位，而该表位在大鼠TrkB中含有不同的氨基酸。

ATCC保藏

产生17D11和29D7 TrkB抗体的杂交瘤于2005年8月18日在ATCC保藏并且已分别获得ATCC专利保藏号PTA-6948和PTA-6949。

实施例2

本实施例还描述多个TrkB抗体的体外表征和测试。特别地，该实施例描述为评估实施例1中一些抗体对TrkB相对于TrkA和TrkC的特异性而进行的实验。

原料和方法

FACS分析

用含有5mM EDTA的PBS从平板分离表达人TrkA的HEK-293细胞并以2×10⁵个细胞每管转移至5ml Falcon管中(Becton Dickinson，商品目录号352063)。通过在4℃以800rpm离心3分钟用PBS洗涤一次细胞，并用100μl杂交瘤培养上清液或用含1％FBS的PBS稀释的免疫血清于4℃孵育30分钟。用含1％FBS的1ml PBS冲洗细胞三次并在黑暗处与PE标记的山羊抗鼠IgG、F(ab′)₂片段(DAKO Corporation，商品目录号R0480)在含有1％FBS的PBS中于4 ℃孵育30分钟。再次冲洗细胞三次并在含1％FBS的250μl PBS中重悬。使用碘化丙啶检测死亡细胞，其从分析中被去除。用FACScan流量细胞荧光测量仪(Becton Dickinson)计算5000个细胞/管的荧光。

萤光素酶测定

制备表达人TrkA(或人TrkC)的HEK-293的稳定细胞系。在潮霉素存在2周后以限定的稀释度选择转染的细胞。初步评估后，选择细胞的单一克隆用于研究。对于萤光素酶测定，在96孔板上的100μl培养基中以1.5×10⁴个细胞/孔涂布细胞。第二天，用10μl的10×最终浓度的NGF(或NT-3)或测试抗体处理细胞。根据制造商的方案在处理后16小时使用Promega Steady-Glo测定试剂盒检测萤光素酶活性。简言之，用100μl的PBS代替培养基并且加入100μl的Steady-Glo试剂。用TopSeal将平板密封后，平板在Titer Plate Shaker中以速度约5摇动5分钟并且然后使用TopCount NXT v2.13仪器(Packard)检测发光。

结果

单克隆抗体的FACS分析

通过FACS来表征表1的每种TrkB特异性的单克隆抗体的纯条件培养基对人TrkA的结合活性。所有待测抗体都未结合人TrkA。特定地，以范围从约5到约60μg/ml的浓度(参见表1中每种抗体的特定浓度，这些相当于范围在约30到约500nM的浓度)测试抗体并且每种抗体都未显示任何可检测的结合。FACS数据显示于图9A。

萤光素酶活性

使用TrkA或TrkC萤光素酶测定也测定表2中纯化的TrkB特异性抗体的亚类以评估激动剂活性。没有测试的抗体激活TrkA或TrkC。特定地，以达到约3μg/ml(约20nM)的浓度测试抗体并且在每种情况中抗体都不能导致超出基础值的可检测的增长(TrkA参见图9B且TrkC参见图10)。相反地，NGF在300ng/ml时诱导TrkA超出基础值约6倍的增长(图9A)且NT-3在300ng/ml时诱导TrkC超出基础值约6倍的信号增长(图10)。

实施例3

本实施例描述在新生的缺氧缺血(HI)啮齿动物模型中多种TrkB抗体的体内测试。

原料和方法

动物和手术程序

新生的缺氧缺血(HI)的啮齿动物模型基于图11中提出的Levine程序(例如参见Levine，Am.J.Pathol.36：1-17，1960；Rice等人，Ann.Neurol，9：131-141，1981和Gidday等人，Neurosci.Lett.168：221-224，1994每项都在此引用作为参考)。简要地，用2.5％氟烷麻醉P7的幼仔并且永久性结扎左颈总动脉。缝合切口后，幼仔被放回笼中康复并喂养。两小时后，幼仔被置于流通8％的潮湿氧气的单独容器中。在2.5小时的缺血缺氧阶段后，幼仔被放回笼中。为了处理，恰好在缺氧损伤前，使动物接受5μl的0.1或0.3nmol的BDNF、抗TrkB单克隆抗体29D7、对照IgG1或载体的脑室内注射。

大脑组织损伤的评估

在P14，从一些小鼠中制备大脑切片以测定由HI损伤导致的损害。纹状体的冠状部分、皮质和海马用甲酚紫染色并且与完整部分比较损伤的脑半球中的区域损伤百分比。图23比较了从不同处理的纹状体和海马获得的染色。图24A和24B分别对不同处理比较总大脑组织损伤和亚区域组织损伤。数据以平均值和平均值标准误差(S.E.M)显示。BDNF和抗TrkB单克隆抗体29D7显示显著剂量依赖性的保护大脑不受HI损伤。该保护不局限于任何特定的大脑亚区域，但最大保护通常在皮质中观测到。

生化分析

HI损伤后24小时，从小鼠的亚类中制备大脑切片用于生化分析。海马和皮质脑组织被切离、溶解并接受几种生化测定。

DEVD-AMC切割测定被用于测定天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活性(例如参见此处引用作为参考的Nagase等人，Immunol Lett.84：23，2002)。施用0.1nmol不同测试试剂的小鼠的大脑不同区域的结果显示于图25中(平均值±S.E.M.)。BDNF和抗TrkB单克隆抗体29D7阻碍由HI损伤导致的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活化。

通过SDS-PAGE分离来自用0.3nmol不同测试试剂处理的小鼠的蛋白质样品(30μg/泳道)并使用针对某些天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3底物(PARP和α-血影蛋白)的抗体进行免疫印迹。针对β-肌动蛋白的抗体被用作对照以检验蛋白质的等上样。图26中显示的结果证明由BDNF和抗TrkB单克隆抗体29D7对这些天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3底物的切割抑制(C＝对侧的颈动脉结扎，I＝颈动脉结扎同侧)。

后续试验

以下是可实施于本研究的小鼠的预期的后续试验。可评估在空间学习和记忆测试中剩余小鼠的表现(例如并非限制，描述于Almli等人，Exp.Neurology 166：99-114，2000中的测试在此处被引用作为参考)。例如可在P20-P30之间测试小鼠。任选地，可在超过该时段期间几天或甚至更迟的时间点评估该表现。

可在更大的剂量范围上重复产生阳性结果的处理方案(如由脑组织损伤减少、空间学习和记忆的改善或其它度量)。备选地或附加地，可以不同的施用模式(例如腹膜内施用、静脉内施用等)、以不同的起始点(例如结扎前、缺氧后即刻、缺氧后可变地延迟等)、和/或以不同的持续时间或频率(例如损伤后日常处理2周等)来重复处理方案。

实施例4

本实施例描述针对人TrkB的人单链Fv(scFv)的制备和检测。使用以下方法来选择含有单链Fv片段的人抗体噬菌体展示文库(CS、BMV和DP-47；Cambridge Antibody Technology)用于TrkB结合。

原料和方法

通过淘选选择抗体

在100μl中将10μg hTrkB-EDC-Fc包被在Nunc Maxisorp板上并于4℃.过夜。噬菌体文库被预封闭(将50μl噬菌体整分试样添加到2×PBS中的50μl的6％脱脂乳中)并针对PSGL-Fc(Wyeth，货号00H25M004)于室温阴性选择1小时以耗尽抗Fc反应的噬菌体。将未选择的噬菌体(deselected phage)转移至包被靶标蛋白(hTrkB-EDC-Fc)的平板并于室温孵育2小时。板孔用PBS/0.1％吐温20冲洗10次并用PBS冲洗5次。用50μl/孔的新鲜配制的100mM TEA(10ml超纯水中加140μl TEA)洗脱结合的噬菌体。使用25μl无菌的1M Tris-HCl pH 7.5中和洗脱的噬菌体。使噬菌体感染进入10ml对数中期(O.D 600nm＝0.5)的大肠杆菌TG1细胞中。将转化的细胞涂布在2×TYAGC琼脂生物测定平板上并于30℃孵育过夜。

可溶相选择(生物素选择)

除以下例外，依照上述方案使用生物素化的hTrkB-EDC-Fc来选择噬菌体抗体。针对100nM生物素化的PSGL-Fc首先取消选择(deselect)预封闭的噬菌体，随后对100nM生物素化的hTrkB-EDC-Fc阳性选择。使用预封闭的链霉亲和素磁珠(Dynabeads M-280链霉亲和素，商品目录号112.06)捕获人TrkB特异性噬菌体。用PBS/0.1％吐温20冲洗珠子10次并用PBS冲洗3次。用200μl新鲜配制的100mM TEA(10ml超纯水中加140μl TEA)洗脱结合的噬菌体并用100μl无菌的1M Tris-HCl pH 7.5对洗脱的噬菌体进行中和以中和TEA。将噬菌体感染到大肠杆菌中并如前面步骤中所述地繁殖。

噬菌体复苏

从生物测定琼脂平板上刮下感染噬菌体的大肠杆菌并与每生物测定平板10ml的2×TYAG(具有100μg/ml一磷酸腺苷(Amp)和2％葡萄糖的2×TY)混合。用100μl的细胞悬浊液接种20ml2×TYAG并于37℃(300rpm)生长至OD_600nm＝0.3-0.5。大肠杆菌用3.3μl的MK13KO7辅助噬菌体重复感染并于37℃(150rpm)孵育1小时。重复感染的细胞重悬于20ml2×TYAK培养基中(2×TY/100μg/ml一磷酸腺苷/50μg/ml卡那霉素)并以280rpm于25℃生长过夜。大肠杆菌以3500rpm离心15分钟并且将含噬菌体的上清液用于下一轮筛选。

用于ELISA的噬菌体抗体的制备

将感染的大肠杆菌的单菌落挑入每孔含150ml的2×TYAG培养基(2％葡萄糖)的微量滴定孔(Costat Cellwells)中。使克隆于37℃(100-120rpm)生长5-6小时(OD_600nm＝0.5)。用2×TYAG培养基以1∶1000稀释M13K07辅助噬菌体储备株(10¹³pfu/ml)且每孔加入20μl。该孔于37℃(100rpm)孵育1小时。平板以3200rpm离心10分钟，移去上清液并且将细胞重悬于150μl的2×TYAK培养基中。使培养液于25℃(120rpm)生长过夜。第二天，平板以3200rpm离心15分钟并且将上清液转移至新鲜平板中用于噬菌体ELISA测定。

噬菌体ELISA

用每孔50μl的PBS中1μg/ml的hTrkB-EDC-Fc(BSA作为对照)包被ELISA平板于40C过夜。孔用PBS冲洗3次并以每孔300μl的PBS/3％脱脂乳于室温封闭1小时。用同样体积的PBS/6％脱脂乳封闭噬菌体并于室温孵育1小时。将50μl封闭的噬菌体加入ELISA孔中并于室温孵育1小时。平板用PBS/0.1％吐温冲洗3次，接着用PBS冲洗3次。将50μlPBS/3％脱脂乳中的HRP-小鼠抗-M13抗体(1∶5000，Amersham Pharmaciabiotech，商品目录号27-9421-01)加入每孔并于室温孵育1小时。如前所述冲洗平板并且向每孔中加入50μl TMB底物并反应2-5分钟。加入50μl的0.5M硫酸终止反应并于450nm处读取吸光度。

用于FACS的单链Fv制备

挑出单菌落并在含0.9ml 2×TYAG培养基的深孔微量滴定平板中于37℃生长5-6小时。通过在2×TY培养基中加入IPTG至终浓度为0.02mM并于30℃生长过夜来诱导scFv表达。过夜生长后收获大肠杆菌并用在水中以1∶5稀释的150μl TES缓冲液渗透性休克(osmotically shocked)和在冰上孵育30分钟。将细胞离心且将上清液转移至新鲜平板中用于FACS测定。用如所述制备的scFv将用TrkB稳定转染的293细胞染色。细胞于冰上孵育30分钟然后用PBS缓冲液冲洗。使用含1∶1000稀释的9E10抗myc抗体的溶液检测单链Fv，随后加入1∶500稀释的PE缀合的抗小鼠IgG-Fc抗体。在Bectin-Dickinson流式细胞仪上分析染色的细胞。

结果

噬菌体ELISA

表4显示来自不同噬菌体文库筛选(淘选和可溶解筛选)的噬菌体ELISA测定的结果。图18显示来自一组典型的TrkB阳性克隆(BMV文库淘汰筛选)的噬菌体结合ELISA数据。大多数TrkB选择的克隆显示针对TrkB-EDC-Fc而非对照蛋白质PSGL-Fc的强烈和特异性的反应。

表4

两轮淘选后，来自CS文库的78％的随机挑选的克隆对TrkB-EDC-Fc结合呈阳性，但对PSGL-Fc结合呈非阳性。同样地，在两轮溶解选择后3％的克隆呈阳性。对于BMV和DP-47文库，淘选的阳性克隆数目为58％和45％并且溶解选择的数值为6％和10％。利用DNA测序，我们确认53％的CS淘选克隆是单一的而100％的CS溶解选择的克隆是单一的。对于BMV和DP-47文库，来自淘选的单一克隆数目为23％和39％而来自溶解选择的单一克隆数目为50％和50％。

FACS分析

图19显示利用FACS测定测试选择TrkB的scFv抗体的结合特异性。数据显示选择TrkB的scFv抗体与膜连接的TrkB以特异性方式反应(实心蓝色直方图)，而与对照细胞无交叉反应(空心绿色直方图)。

实施例5

本实施例比较29D7 TrkB抗体和29D7 Fab片段针对人和小鼠TrkB的结合活性。如以上实施例1中所述将小鼠(rhTrkB-EDC-Fc)和人(rmTrkB-EDC)TrkB包被在ELISA平板上。

图20A和20B分别显示人和小鼠TrkB的ELISA结合结果。29D7 IgG抗体和其Fab片段都对人和小鼠TrkB具有剂量依赖性结合活性。然而，Fab的ED₅₀值比完整29D7的值低约100倍。同型对照IgG1及其Fab片段都不结合TrkB。

实施例6

本实施例比较实施例5的29D7 TrkB抗体和Fab片段针对人TrkB的激动活性。用萤光素酶测定和如实施例1中所述的表达表面rhTrkB的HEK-293细胞来检测激动活性。

用29D7 IgG或29D7 Fab以指示浓度来处理HEK-293细胞并且在处理后16小时检测积聚的萤光素酶活性。如图21中所示，29D7的总IgG和Fab都诱导剂量依赖性萤光素酶活性，指示TrkB的活化。然而，29D7Fab的EC₅₀值比27D7 IgG的值高约27倍(对于27D7 IgG和29D7 Fab分别为0.083nM和2.28nM)。同型对照IgG1及其Fab片段都不影响TrkB活化。

实施例7

本实施例描述某些发明的TrkB单克隆抗体的表位作图分析。针对源于人TrkB细胞外结构域内序列的线性、单环和双环肽进行作图。

如图22所示，17D11单克隆抗体识别人TrkB的IgG-2片段的环3(KNEYGKD，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：1的氨基酸364到370)；及人TrkB的IgG-2片段的环1(KGNPKP，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：1的氨基酸308到313)。前一表位的小鼠序列(KNEYGKD，SEQ ID NO：7，SEQ IDNO：2的氨基酸364到370)与人序列一致。后一表位的小鼠序列(RGNPKP，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：2的氨基酸308到313)有一个氨基酸差异。

如图22所示，29D7、7F5、11E1和19E12单克隆抗体都识别人TrkB的IgG-1片段的环3(ENLVGED，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：1的氨基酸269到275)；且也可能识别人TrkB的IgG-1片段的环1(AGDPVP，SEQ IDNO：11，SEQ ID NO：1的氨基酸221到226)。前一表位的小鼠序列(ENLVGED，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：2的氨基酸269到275)与人序列一致。后一表位的小鼠序列(GGDPLP，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：2的氨基酸221到226)有两个氨基酸差异。

实施例8

本实施例描述用抗TrkB抗体29D7进行的体内TrkB活性试验。简要地，P7的幼仔接受5μl的0.3nmol抗TrkB单克隆抗体29D7或载体的脑室内注射。然后在注射后1、2、6、12和24小时切离脑组织。溶解组织并且通过SDS-PAGE分离等量的蛋白质样品(30μg/泳道)并用对因TrkB活化(磷酸基-ERK1/2和磷酸基-AKT)而磷酸化的蛋白质特异的抗体接受免疫印迹。使用针对β-肌动蛋白的抗体作为检验蛋白质等上样的对照。图27的结果显示抗TrkB单克隆抗体29D7诱导ERK1/2和AKT的时间依赖性磷酸化(显示来自海马和皮质样品的数据并代表从四个其它样品获得的结果)。

图28是显示于图27中的ERK磷酸化的光密度定量。图29是显示于图27中的AKT磷酸化的光密度定量。图30显示载体和29D7处理的大脑组织，其已被固定并用针对神经元特异性标记物NeuN的抗体(左边)和抗磷酸基-ERK1/2抗体(中心)免疫荧光标记。右图显示这两者的重合。ERK1/2磷酸化在29D7处理的样品中显著增强。图31显示脑室内注射抗TrkB单克隆抗体29D7后，在皮质和海马组织中ERK1/2活化的时间进程。

实施例9

本实施例描述用抗TrkB抗体29D7进行的MAG/髓磷脂诱导的神经突抑制测定。简要地，将50μl整分试样的重组大鼠MAG(1-5)或纯化的大鼠髓磷脂加入到96孔平底组织培养板并于室温风干过夜。除非特别指出，MAG(1-5)或髓磷脂的总量为0.25-0.5μg每孔。第二天，将以MAG或髓磷脂包被的平板用50μl聚-D-赖氨酸(17μg/ml)处理1.5小时，接着用含10％FBS的培养基于37℃孵育1小时。吸除培养基后，将大鼠CGN细胞以8000个细胞/孔的密度在含200mM L-谷氨酸盐、2M KCl和100U/ml青霉素及链霉素的添加B27的神经基础生长培养基中铺板。当特别指出时，在细胞平板培养时加入处理试剂。神经元在以5％CO₂平衡的孵育箱中于37℃生长。铺板大约20小时后，将细胞用4％多聚甲醛固定并进行Tuj 1染色。用0.2％ Triton X/PBS(TPBS)将细胞于室温渗透处理5分钟，接着用TPBS中的1.5％普通山羊血清(S-TPBS)孵育30分钟以封闭非特异性结合。向细胞中加入整分试样的抗神经元家族III b-微管蛋白单克隆抗体(Tuj1，1∶1000；Covance # MMS-435P)。于室温孵育1小时后，不结合的抗体用PBS冲洗3次并且加入整分试样的Alexa Fluor 488小鼠抗山羊IgG抗体(1∶500，Molecular Probe # A-11001)以显现信号。加入Hoechst 33342(Molecular Probe # H-3570，2μg/ml)以标记细胞核。冲洗后，密封平板并使用Cellomics array scan分析神经突生长。通常每孔分析9个视野的约300个细胞且一式四份进行每个处理。

MAG和髓磷脂抑制培养中的初级小脑颗粒神经元的神经突生长。将增加浓度的重组大鼠MAG(1-5)或纯化的大鼠髓磷脂包被在96孔组织培养板上且如上所述在20小时检测初级神经元的神经突伸长。如图32中所示，(A)MAG和(B)髓磷脂导致神经突生长的剂量依赖性抑制。

然后将CGN神经元在MAG或髓磷脂包被的、具有对照或一定范围浓度的TrkB抗体29D7的平板上铺板。处理后20小时测量神经突伸长。如图33中所示，29D7导致(A)MAG和(B)髓磷脂介导的神经突抑制的逆转。

其它实施例

考虑到此处公开的本发明的说明书或实例，本发明的其它实施方案对本领域技术人员是显而易见的。说明书和实施例仅意在被视为示例，通过以下权利要求指示本发明的确切范围。

申请人或代理人卷号2004658-0338

国际申请号待指定

与保藏的微生物或其它生物材料有关的声明

(PCT细则第13条之2)

PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月重印)

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(PCT细则第13条之2)

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Claims

1. 结合人TrkB的单克隆抗体。

2. 权利要求1的单克隆抗体，其中与人TrkB的结合具有约10pM到约500nM范围内的ED₅₀。

3. 权利要求1的单克隆抗体，其中与人TrkB的结合具有约10pM到约1nM范围内的ED₅₀。

4. 权利要求1的单克隆抗体，其中与人TrkB的结合具有约10pM到约100pM范围内的ED₅₀。

5. 权利要求1的单克隆抗体，其中与人TrkB的结合具有约10pM到约50pM范围内的ED₅₀。

6. 权利要求1的单克隆抗体，其中该单克隆抗体以约10pM到约500nM范围内的EC₅₀激活人TrkB。

7. 权利要求1的单克隆抗体，其中该单克隆抗体以约10pM到约1nM范围内的EC₅₀激活人TrkB。

8. 权利要求1的单克隆抗体，其中该单克隆抗体以约10pM到约100pM范围内的EC₅₀激活人TrkB。

9. 权利要求1的单克隆抗体，其中该单克隆抗体以约10pM到约50pM范围内的EC₅₀激活人TrkB。

10. 权利要求1的单克隆抗体，其中该单克隆抗体不结合和/或不激活人TrkA。

11. 权利要求10的单克隆抗体，其中该单克隆抗体在抗体浓度高于约1nM时不显示与人TrkA的可检测的结合和/或不导致任何可检测的人TrkA的活化。

12. 权利要求10的单克隆抗体，其中该单克隆抗体在抗体浓度高于约10nM时不显示与人TrkA的可检测的结合和/或不导致任何可检测的人TrkA的活化。

13. 权利要求10的单克隆抗体，其中该单克隆抗体在抗体浓度高于约100nM时不显示与人TrkA的可检测的结合和/或不导致任何可检测的人TrkA的活化。

14. 权利要求10的单克隆抗体，其中该单克隆抗体在抗体浓度高于约1μM时不显示与人TrkA的可检测的结合和/或不导致任何可检测的人TrkA的活化。

15. 权利要求1的单克隆抗体，其中该单克隆抗体不结合和/或不激活人TrkC。

16. 权利要求15的单克隆抗体，其中该单克隆抗体在抗体浓度高于约1nM时不显示与人TrkC的可检测的结合和/或不导致任何可检测的人TrkC的活化。

17. 权利要求15的单克隆抗体，其中该单克隆抗体在抗体浓度高于约10nM时不显示与人TrkC的可检测的结合和/或不导致任何可检测的人TrkC的活化。

18. 权利要求15的单克隆抗体，其中该单克隆抗体在抗体浓度高于约100nM时不显示与人TrkC的可检测的结合和/或不导致任何可检测的人TrkC的活化。

19. 权利要求15的单克隆抗体，其中该单克隆抗体在抗体浓度高于约1μM时不显示与人TrkC的可检测的结合和/或不导致任何可检测的人TrkC的活化。

20. 权利要求10的单克隆抗体，其中该单克隆抗体不结合和/或不激活人TrkC。

21. 权利要求1的单克隆抗体，其中该单克隆抗体阻碍BDNF和人TrkB之间的结合。

22. 权利要求21的单克隆抗体，其中该单克隆抗体以约100pM到约500nM范围内的IC₅₀阻碍BDNF和人TrkB之间的结合。

23. 权利要求21的单克隆抗体，其中该单克隆抗体以约100pM到约1nM范围内的IC₅₀阻碍BDNF和人TrkB之间的结合。

24. 权利要求21的单克隆抗体，其中该单克隆抗体以约100pM到约500pM范围内的IC₅₀阻碍BDNF和人TrkB之间的结合。

25. 权利要求1的单克隆抗体，其中该单克隆抗体不阻碍BDNF和人TrkB之间的结合。

26. 权利要求25的单克隆抗体，其中该单克隆抗体在抗体浓度高于约1nM时不显示可检测的阻碍活性。

27. 权利要求25的单克隆抗体，其中该单克隆抗体在抗体浓度高于约10nM时不显示可检测的阻碍活性。

28. 权利要求25的单克隆抗体，其中该单克隆抗体在抗体浓度高于约100nM时不显示可检测的阻碍活性。

29. 权利要求25的单克隆抗体，其中该单克隆抗体在抗体浓度高于约1μM时不显示可检测的阻碍活性。

30. 权利要求1的单克隆抗体，其中该单克隆抗体具有IgG1同种型。

31. 权利要求1的单克隆抗体，其中该单克隆抗体具有IgG2a同种型。

32. 权利要求1的单克隆抗体，其中该单克隆抗体具有IgG2b同种型。

33. 权利要求1-32中任一项的单克隆抗体，其中该单克隆抗体结合和/或激活鼠TrkB。

34. 权利要求33的单克隆抗体，其中与鼠TrkB的结合具有约10pM到约500nM范围内的ED₅₀。

35. 权利要求33的单克隆抗体，其中与鼠TrkB的结合具有约10pM到约1nM范围内的ED₅₀。

36. 权利要求33的单克隆抗体，其中与鼠TrkB的结合具有约10pM到约500pM范围内的ED₅₀。

37. 权利要求33的单克隆抗体，其中与鼠TrkB的结合具有约10pM到约100pM范围内的ED₅₀。

38. 权利要求1的单克隆抗体，其中该单克隆抗体结合具有序列KNEYGKD(SEQ ID NO：7)的人TrkB表位和具有序列KGNPKP(SEQ IDNO：8)的人TrkB表位中的一个或两个表位。

39. 权利要求38的单克隆抗体，其中该单克隆抗体还结合具有序列KNEYGKD(SEQ ID NO：7)的小鼠TrkB表位和具有序列RGNPKP(SEQID NO：9)的小鼠TrkB表位中的一个或两个表位。

40. 权利要求1的单克隆抗体，其中该单克隆抗体结合具有序列ENLVGED(SEQ ID NO：10)的人TrkB表位并且任选地结合具有序列AGDPVP(SEQ ID NO：11)的人TrkB表位。

41. 权利要求40的单克隆抗体，其中该单克隆抗体还结合具有序列ENLVGED(SEQ ID NO：10)的小鼠TrkB的表位。

42. 由2005年8月18日在ATCC保藏的且具有ATCC专利保藏号PTA-6948的杂交瘤或由其祖先细胞产生的单克隆抗体。

43. 由2005年8月18日在ATCC保藏的且具有ATCC专利保藏号PTA-6949的杂交瘤或由其祖先细胞产生的单克隆抗体。

44. 权利要求1的单克隆抗体，其中该单克隆抗体与权利要求42的单克隆抗体结合到相同表位。

45. 权利要求1的单克隆抗体，其中该单克隆抗体与权利要求43的单克隆抗体结合到相同表位。

46. 产生依照权利要求1-41中任一项的单克隆抗体的杂交瘤。

47. 于2005年8月18日在ATCC保藏的且具有ATCC专利保藏号PTA-6948的杂交瘤或其祖先细胞。

48. 于2005年8月18日在ATCC保藏的且具有ATCC专利保藏号PTA-6949的杂交瘤或其祖先细胞。

49. 一种方法，其包括：

用至少两种衍生自不同物种的TrkB蛋白质的蛋白质免疫原免疫动物；和

用骨髓瘤细胞融合来自免疫动物的脾细胞以产生杂交瘤。

50. 权利要求49的方法，其中至少两种蛋白质免疫原包括衍生自人TrkB的第一类免疫原和衍生自非人TrkB的第二类免疫原。

51. 权利要求50的方法，其中第一类免疫原包括人TrkB的细胞外结构域且第二类免疫原包括非人TrkB的细胞外结构域。

52. 权利要求51的方法，其中第二类免疫原包括选自鼠TrkB、大鼠TrkB和小鸡TrkB组成的组的非人TrkB的细胞外结构域。

53. 权利要求52的方法，其中第二类免疫原包括鼠TrkB的细胞外结构域。

54. 权利要求50的方法，其中在免疫化步骤中以比率大于约1的量(按重量计)施用第一类免疫原和第二类免疫原。

55. 权利要求54的方法，其中该比率大于约5。

56. 权利要求55的方法，其中该比率约为10。

57. 权利要求51的方法，其中第一类和第二类免疫原不包括TrkB细胞外结构域之外发现的任何氨基酸。

58. 依照权利要求49-57中任一项的方法制备的杂交瘤。

59. 权利要求49-57中任一项的方法，其还包括：从杂交瘤产生单克隆抗体。

60. 依照权利要求59的方法制备的单克隆抗体。

61. 在个体中激活人TrkB的方法，其包括：向个体施用权利要求1-41中任一项的治疗有效量的单克隆抗体。

62. 权利要求61的方法，其中所述个体患有需要TrkB活化的神经疾病。

63. 权利要求61的方法，其中所述个体的神经系统已受到创伤、手术、缺血、感染、代谢疾病、营养不良、恶性瘤或毒素类药物损伤。

64. 权利要求61的方法，其中所述个体遭受中风、脊髓损伤或轴突切断术。

65. 权利要求61的方法，其中所述个体患有先天性或神经退化性疾病。

66. 权利要求65的方法，其中所述疾病选自由阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿舞蹈病和肌萎缩性侧索硬化(ALS)组成的组。

67. 权利要求61的方法，其中对所述个体肠胃外施用所述单克隆抗体。

68. 权利要求61的方法，其中对所述个体静脉内或腹膜内施用所述单克隆抗体。

69. 一种方法，其包括：

在允许单克隆抗体和人TrkB之间特异性结合的条件下使权利要求1-41中任一项的单克隆抗体与包含一定量的人TrkB的样品结合；和

检测该特异性结合，从而指示样品中人TrkB的存在。

70. 一种方法，其包括：

在允许单克隆抗体和人TrkB之间特异性结合的条件下使权利要求1-41中任一项的单克隆抗体与包含一定量的人TrkB的样品结合，从而产生抗体-TrkB复合物；

从剩余样品中分离抗体-人TrkB复合物；和

从人TrkB中分离抗体，从而获得纯化的人TrkB。