CN109748963A - 一种抗lag-3的单克隆抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药抗体领域，更具体地，本发明公开了一种抗LAG‑3的单克隆抗体及其制备方法和用途。本发明的抗LAG‑3单克隆抗体具有良好的生物活性，能够有效结合LAG‑3蛋白，并能够在蛋白水平和细胞水平有效封闭LAG‑3蛋白，并且有效增强免疫功能。该单克隆抗体能够单独或与其它抗肿瘤药物联合应用在肿瘤免疫治疗以及诊断和筛查中，还具有制备治疗肿瘤、抗自身免疫性疾病等药物的良好前景。

Description

一种抗LAG-3的单克隆抗体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种抗LAG-3抗体及其制备方法和用途。

背景技术

淋巴细胞活化基因3或LAG-3(也称作CD223)系免疫球蛋白超基因家族之一员，并且在结构上以及遗传上与CD4有关。LAG-3并不在休眠的外周血淋巴细胞上表达，但在被活化的T细胞以及NK细胞上表达。LAG-3系由位于染色体12的短臂的远程部分、在CD4基因附近的一基因进行编码的膜蛋白，表明该LAG-3基因可能已经藉由基因重复而进化(Triebel etal.(1990)J.Exp.Med.171：1393-1405)。

在抗原特异性T细胞应答的体外研究中，加入抗LAG-3抗体导致T细胞增殖增加、活化抗原(如CD25)的更高表达、以及更高浓度的细胞因子(例如干扰素γ以及白介素4)，从而支持LAG-/MHC II类分子相互作用在下调CD4+T淋巴细胞的抗原依赖性刺激中的作用(Huard et al.(1994)Eur.J.Immunol.24：3216-3221)。已经证明LAG-3的胞质内区与名为LAP的蛋白进行相互作用，此蛋白被认为是与CD3/TCR活化途径的下调有关的信号转导分子(Iouzalen et al.(2001)Eur.J.Immunol.31：2885-2891)。此外，已显示CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)在活化时表达LAG-3，并且针对LAG-3之抗体在体内以及体外均抑制由所诱导的Treg细胞所产生的阻抑，表明LAG-3有助于Treg细胞的阻抑活性(Huang，C.et al.(2004)Immunity 21：503-513)。另外，已显示LAG-3藉由调节性T细胞以T细胞依赖性以及非依赖性这两种机制对T细胞稳态进行负向调节(Workman，C.J.and Vignali，D.A.(2005)J.Immunol.174：688-695)。

此外，已显示可溶性人类LAG-3Ig扩大了在体外产生I型肿瘤特异性免疫(Casatiet al.(2006)Cancer Res.66：4450-4460)。在Triebel(2003)Trends Immunol.24：619-622中对LAG-3的功能活性进行了进一步综述。鉴于以上原因，用于调整LAG-3活性的药物特别是抗LAG-3单抗引起了极大的兴趣。然而，现有的抗LAG-3单克隆抗体还存在选择性不强、亲和力较低的缺陷。因此，研发新型抗LAG-3的单克隆抗体，并将其应用到治疗肿瘤、抗自身免疫性疾病等相关药物的制备，成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服目前抗LAG-3单克隆抗体存在选择性较弱，亲和力较低的缺陷，提供了一种新的供了该单克隆抗体的制备方法和应用，从而完成了本发明。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种抗LAG-3的单克隆抗体。

本发明的第二个目的在于提供编码所述抗LAG-3单克隆抗体的核苷酸分子。

本发明的第三个目的在于提供包含所述核苷酸分子的表达载体。

本发明的第四个目的在于提供包含所述表达载体的宿主细胞。

本发明的第五个目的在于提供一种所述抗LAG-3单克隆抗体的制备方法。

本发明的第六个目的在于提供包含所述抗LAG-3单克隆抗体的组合物。

本发明的第七个目的在于提供所述抗LAG-3单克隆抗体在制备药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案：

本发明采取的技术方案之一为：一种抗LAG-3的单克隆抗体，其结合人LAG-3蛋白且包含重链和轻链可变区，其中所述重链可变区包含来自SEQ ID NO:2的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区。

本领域中，抗体的结合区通常均含有一条轻链可变区和一条重链可变区，每一个可变区都含有互补决定区(CDR区)，即CDR1、CDR2和CDR3三个结构域。本发明所述的单链抗体为常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。较佳的，本发明所述抗LAG-3的单克隆抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其轻链可变区包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，该轻链可变区较佳地包含CDR1’、CDR2’和CDR3’区。

其中所述重链CDR1、CDR2和CDR3区较佳地包括SEQ ID NO:5、6和7所示的氨基酸序列；其中所述轻链CDR1’、CDR2’和CDR3’区较佳地包括SEQ ID NO:8、9和10所示的氨基酸序列。

本发明所述单克隆抗体可以由本领域常规技术制备，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，较佳地是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。

本发明采取的技术方案之二为：一种核苷酸分子，所述核苷酸分子编码如上所述的抗LAG-3单克隆抗体。

其中所述核苷酸分子中，编码重链可变区的核苷酸序列较佳地包括SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，其编码轻链可变区的核苷酸序列较佳地包括SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

本发明所述核苷酸分子的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地包括以下制备方法：通过基因克隆技术例如PCR方法等，获得编码所述单克隆抗体的核苷酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述单克隆抗体的核苷酸分子。

本领域技术人员知晓，编码上述单克隆抗体的氨基酸序列的核苷酸序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该单克隆抗体基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。

本发明采取的技术方案之三为：一种表达载体，所述表达载体含有如上所述的核苷酸分子。

其中所述表达载体为本领域常规的表达载体，是指包含适当的调控序列，例如启动子序列、终止子序列、多腺苷酰化序列、增强子序列、标记基因和/或序列以及其他适当的序列的表达载体。所述表达载体可以是病毒或质粒，如适当的噬菌体或者噬菌粒，更多技术细节请参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989。许多用于核酸操作的已知技术和方案请参见Current Protocols in Molecular Biology，第二版，Ausubel等编著。

本发明所述表达载体较佳地为pDR1，pcDNA3.1，pDHFF，GM-CSF或pCHO1.0，更佳地为pcDNA3.1。

本发明采取的技术方案之四为：一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上所述的表达载体。

本发明所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核苷酸可被有效表达即可。其中所述宿主细胞包括原核表达细胞核真核表达细胞，所述表达载体较佳地包括：COS、CHO(中国仓鼠卵巢，Chinese H amster Ovary)、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)或E.coli TG1，更佳地为E.coli TG1、BL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体)或者CHO-K1细胞(表达全长IgG抗体)。将前述表达载体转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。

本发明采取的技术方案之五为：一种如上所述的抗LAG-3的单克隆抗体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

a)在表达条件下，培养本发明所述的宿主细胞，从而表达抗LAG-3的单克隆抗体；

b)分离并纯化步骤a)所述的抗LAG-3的单克隆抗体。

本发明所述的宿主细胞的培养方法，所述抗LAG-3单克隆抗体的分离和纯化方法为本领域常规方法，具体操作方法请参考相应的细胞培养技术手册以及单克隆抗体分离纯化技术手册。

本发明采取的技术方案之六为：一种组合物，所述组合物含有如上所述的抗LAG-3的单克隆抗体和药学上可接受的载体。

本发明提供的抗LAG-3单克隆抗体，可以和药学上可以接受的载体一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的抗LAG-3单克隆抗体的氨基酸核心序列的构像完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在30℃至少六个月保持稳定。所述抗LAG-3单克隆抗体制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，

对于本发明公开的抗LAG-3单克隆抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的载体较佳地包括但不限于：表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合。其中表面活性剂较佳地包括但不限于：非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；poloxamer(如poloxamer 188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUAT^TM等，其加入量应使抗LAG-3单克隆抗体的颗粒化趋势最小。溶液稳定剂较佳地包括但不限于以下列举之一或其组合：糖类，例如，还原性糖和非还原性糖；氨基酸类，例如，谷氨酸单钠或组氨酸；醇类，例如：三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇等，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态。等渗调节剂较佳地包括但不限于氯化钠、甘露醇之一或其组合。缓冲液较佳地包括但不限于：Tris、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一或其组合。

本发明采取的技术方案之七为：本发明所述的抗LAG-3的单克隆抗体在制备药物中的应用。

本发明所述的药物较佳地为抗肿瘤、治疗自身免疫性疾病、治疗感染性疾病和/或抗移植排斥反应的药物，更佳地为抗肿瘤药物、治疗自身免疫性疾病药物，优选地为抗肿瘤药物。本发明所述抗LAG-3的单克隆抗体可以单独使用或与抗PD-1单克隆抗体、抗PD-1单抗或其它抗肿瘤药物联合使用。

其中所述抗肿瘤药物所针对的肿瘤较佳地包括但不限于：肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、结肠癌、神经胶质瘤、膀胱癌、乳腺癌、肾癌、食道癌、胃癌、口腔鳞状细胞癌、尿道上皮细胞癌、胰腺癌和/或头颈肿瘤中的一种或多种。

本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，进一步还包括已存在的肿瘤伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还包括减少或防止肿瘤的转移等。

本发明中抗LAG-3单克隆抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是1-1800mg/天。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明提供的抗LAG-3单克隆抗体具有良好的生物活性，能够有效结合LAG-3蛋白，从而在蛋白水平和细胞水平有效封闭LAG-3蛋白。该单克隆抗体能够单独，或与其它抗肿瘤药物联合应用在肿瘤免疫治疗以及诊断和筛查中，能够有效运用于治疗肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病以及抗免疫排斥等药物的制备中。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所述的室温为本领域常规的室温，一般为10～30℃。

本发明中公开的抗LAG-3单克隆抗体的制备方法包括：在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达抗LAG-3单克隆抗体；分离和纯化所述的抗LAG-3单克隆抗体。利用上述方法，可以将重组蛋白纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。

可以利用亲和层析的方法对本发明公开的抗LAG-3单克隆抗体进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的单克隆抗体。本发明的发明人对所得抗LAG-3的单克隆抗体进行了检测实验，实验结果表明该单克隆抗体能很好地与LAG-3蛋白结合，具有较高的亲和力。

实施例1制备和筛选产生抗LAG-3抗体的杂交瘤细胞株

使用LAG-3抗原的纯化或富集配制物、重组LAG-3蛋白、或表达LAG-3蛋白的细胞对人Ig小鼠实施免疫，(参见Lonberg等人(1994)Nature368(6474):856-859；Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology14:845-851，以及PCT公开文本WO 98/24884\WO 01/14424，其内容通过提述完整并入本文中)。在一个优选的实施方案中，使用5-50μg LAG-3蛋白对6-16周龄小鼠实施免疫。或者，使用融合至非LAG-3多肽的LAG-3的部分。

在腹膜内(IP)或静脉内(IV)使用在完全弗氏佐剂(completeFreund's adjuvant)中的LAG-3抗原对转基因小鼠实施免疫，随后使用在不完全弗氏佐剂中的抗原实施后续IP或IV免疫。在其他实施方案中，使用除弗氏佐剂外的佐剂或在不存在佐剂的全细胞。可通过ELISA筛选血浆且可使用来自小鼠的具有足够抗LAG-3人免疫球蛋白效价的细胞进行融合。用抗原进行静脉内加强免疫后3天，处死小鼠并取出脾。通常，对每种抗原进行10-35次融合。每种抗原免疫数十只小鼠。

转基因HuMab和KM小鼠使用HuMab转基因小鼠的HCo7品系和转基因转染色体小鼠的KM品系来制备针对LAG-3的完全人的单克隆抗体，这两种品系都表达人抗体基因。在这些小鼠品系的每一种中，已经如Chen等人(1993)EMBO J.12:811-820中所述纯合性破坏了内源小鼠κ轻链基因，并且如PCT公开文本WO01/09187的实施例1中所述纯合性破坏了内源小鼠重链基因。如Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology14:845-851中所述，这些小鼠品系中的每一种都携带人κ轻链转基因，KCo5。如美国专利号5,545,806；5,625,825和5,545,807中述，HCo7品系携带HCo7人重链转基因。如PCT公开文本WO02/43478中所述，KM品系包含SC20转染色体。

使用LAG-3融合蛋白抗原的纯化重组制品(5-50μg)，用完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原两次腹膜内免疫转基因小鼠，接着于3-21天后用不完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原进行腹膜内免疫(可多达总共11次免疫)。通过眼窝后放血监测免疫应答。通过ELISA筛选血浆(如下所述)，使用具有足够抗LAG-3人免疫球蛋白滴度的小鼠来进行融合。选择产生抗LAG-3抗体的HuMab或KM小鼠：为了选择产生与LAG-3结合的抗体的HuMab或KM小鼠TM，如Fishwild,D.等人(1996)所述通过ELISA对来自经免疫小鼠的血清进行测试。简言之，用100μl/孔PBS中的1-2μg/ml来自经转染CHO细胞的纯化的重组LAG-3融合蛋白包被微量滴定板即于4℃温育过夜，随后用200μl/孔PBS/Tween(0.05％)中的5％胎牛血清进行封闭。向每孔加入来自LAG-3免疫小鼠的血清稀释液并于环境温度温育1-2小时。用PBS/Tween洗涤板，然后与偶联有辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗人IgG多克隆抗体一起于室温温育1小时。洗涤后，用ABTS底物(Sigma,A-1888,0.22mg/ml)对板进行显色，并于OD415-495通过分光光度计进行分析。利用产生最高抗LAG-3抗体滴度的小鼠进行融合。如下所述进行融合并通过ELISA方法对杂交瘤上清液测试抗LAG-3活性。

利用基于PEG的标准方案或使用Cyto Pulse大室细胞融合电穿孔仪(Cyto PulseSciences,Inc.,Glen Burnie,MD)的基于电场的电融合，将分离自HuMab或KM小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后对得到的杂交瘤筛选抗原特异性抗体的产生。用50％PEG(Sigma)将来自经免疫小鼠的脾细胞的单细胞悬浮液与四分之一数目的SP2/0不分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC,CRL1581)融合。将细胞以大约1x10⁵/孔铺在平底微量滴定板中，随后在选择性培养基中温育大约两周，所述培养基在DMEM(Mediatech,CRL10013,含高葡萄糖,L-谷氨酰胺和丙酮酸钠)加5mM HEPES,0.055mM2-巯基乙醇,50mg/ml庆大霉素和1x AT(Sigma,CRL P-7185)中含有10％胎牛血清,10％P388D1(ATCC,CRL TIB-63)条件培养基,3-5％origen(IGEN)。1-2周后，将细胞在用HT替换HAT的培养基中进行培养。然后通过ELISA方法，对各个孔筛选人抗LAG-3单克隆IgG抗体。一旦发生广泛的杂交瘤生长，通常在10-14天后监测培养基。对分泌抗体的杂交瘤重新铺板，再次筛选，并且，如果对人IgG仍然是阳性的，那么通过有限稀释将抗LAG-3单克隆抗体亚克隆至少两次。然后体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中生成小量抗体用于进一步表征。根据24孔板筛选结果，挑选ELISA实验中OD_450nm>1.0阳性克隆，并通过有限稀释法进行亚克隆，获得稳定表达所述LAG-3单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将所得杂交瘤细胞株进行保种建库，并可用于后续的抗体生产和纯化。

实施例2抗LAG-3单克隆抗体的生产和纯化

杂交瘤细胞产生的抗体浓度较低，大约仅1-15μg/毫升，浓度变化较大。且培养基中细胞培养所产生的多种蛋白和培养基所含胎牛血清成分对很多生物活性分析方法都有不同程度的干扰，因此需要进行小规模(1-5毫克)抗体生产纯化。

将实施例1所得的杂交瘤细胞接种到T-75细胞培养瓶并用生产培养基(Hybridomaserum free medium，购自Invitrogen公司)驯化传代3代。待其生长状态良好，接种细胞培养转瓶。每个2升的培养转瓶中加入500毫升生产培养基，接种细胞密度为1.0×10⁵/毫升。盖紧瓶盖，将转瓶置于37℃培养箱中的转瓶机上，转速5RPM。连续旋转培养16天后，收集细胞培养液，过滤去除细胞，并用0.45微米的滤膜过滤至培养上清液澄清。澄清的培养上清液可马上进行纯化或-30℃冻存。

澄清的杂交瘤细胞的培养上清液(500mL)中的单克隆抗体用3mL蛋白G柱(购自GEHealthcare)纯化。蛋白G柱先用平衡缓冲液(PBS磷酸缓冲液，pH7.5)平衡，然后将澄清的培养上清液上样到蛋白G柱，控制流速在5mL/分钟。上样完毕后用平衡缓冲液清洗蛋白G柱，平衡缓冲液的体积为5倍蛋白G柱柱床体积。用洗脱液(0.1M甘氨盐酸缓冲液，pH3.0)洗脱结合在蛋白G柱上的LAG-3抗体，用紫外检测器监测洗脱情况(A280紫外吸收峰)。收集洗脱的抗体，加入10％1.0M Tris-HCl缓冲液中和pH值，所述百分比为体积百分比，然后立即用PBS磷酸缓冲液透析过夜，第二天换液1次并继续透析6小时。收集透析后的LAG-3抗体，用0.22微米的滤器进行无菌过滤，无菌保存，即得纯化的抗LAG-3单克隆抗体。

将纯化的抗LAG-3抗体进行蛋白浓度(A280/1.4)、纯度、内毒素(Lonza试剂盒)等检测分析，检测结果显示：所得单克隆抗体终产品的内毒素浓度在1.0EU/毫克以内。

实施例3抗LAG-3单克隆抗体基因序列的测定

使用Trizol(购自上海生工生物)提取实施例1所得杂交瘤细胞株的总RNA，用逆转录试剂盒(购自Takara公司)将mRNA逆转录成cDNA，通过PCR方法扩增抗LAG-3单克隆抗体的轻链和重链可变区基因，然后将PCR产物克隆入pMD18-T载体，交由生工公司测序并分析可变区基因序列。结果：编码所得抗LAG-3单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

实施例4抗LAG-3单克隆抗体的亲和力分析

利用ELISA方法测定抗LAG-3的单克隆抗体的结合亲和力。通过室温孵育4小时(或在4℃过夜)将人hLAG-3/Fc(R&D Systems)固定化在Maxisorp 96-孔板(Nunc)上。通过与含3％BSA的PBST室温孵育1小时来阻断非特异性结合位点。包被后，用PBST洗涤所述板3次。用结合缓冲液(含有0.1％Tween 20和0.3％BSA的PBS)制备本发明所述抗LAG-3单克隆抗体以及市售可得阳性对照LAG-3抗体的稀释液，将所得稀释液与固定化的融合蛋白在25℃下孵育1小时。结合后，用PBST洗涤所述板3次，在25℃下用含稀释至1/4,000的过氧化物酶标记的二抗(Southern Biotech)的结合缓冲液孵育1小时，再次洗涤，用TMB显色。用半最大结合浓度(EC₅₀)表示相对结合亲和力的量值，检测结果如表1所示。

表1、抗LAG-3单克隆抗体对LAG-3的亲和力

抗体	EC<sub>50</sub>(pM)	Kd(1/s)	KD(pM)
				本发明抗LAG-3的单克隆抗体	96	1.55E+06	2.32E-11
阳性对照抗LAG-3抗体	480	8.82E+04	1.98E-09

表1的结果说明，本发明所得抗LAG-3单克隆抗体的亲和力高于阳性对照LAG-3抗体，能够有效与LAG-3结合，具有较高的亲和力。

实施例5抗LAG-3mAb对LAG-3与MHC II类结合的抑制

为了测试抗LAG-3抗体抑制LAG-3与MHC II类分子结合的能力，进行了一项体外合测定，其中一种LAG-3融合蛋白(包括与小鼠Fc相融合的人类LAG-3细胞外结构域(hLAG-3-mIg))与表达人类MHC II类分子的Daudi细胞进行反应。为了测试抗体对LAG-3与MHC II类的结合的抑制，将本发明所得抗LAG-3单抗在PFAE缓冲液中从20μg/mL进行系列稀释，并向该等系列稀释液中加入1μg/ml的hLAG-3-mIg融合蛋白。将这一混合物在室温孵育20分钟，然后加入2×10⁵个经1×PFAE洗涤的Daudi细胞。将这一混合物应用于Daudi细胞并在4℃下孵育30分钟。将细胞粒化(pellet)(三分钟，400xg)，用1×PFAE缓冲液洗涤一次，并再次粒化，并且使用重组的PE标记的抗mIgG Fcγ第二试剂检测hLAG-3-mIg与Daudi细胞的结合。用FACScalibur流式细胞仪(BD Bioscience)进行LAG-3-mIg结合的分析。在以下的表2中总结了结果，该表显示了以nM计量的IC50值。

表2、抗LAG-3单克隆抗体对LAG-3与MHC II类结合的抑制

抗体	IC<sub>50</sub>(nM)
		本发明所得抗LAG-3单抗	0.12
阳性对照抗LAG-3抗体	0.86

结果表明，本发明所得抗LAG-3单抗在抑制LAG-3与MHC II类抗体的结合中是有效的。

实施例6抗LAG-3单抗介导的T细胞活化

为了测试抗LAG-3抗体刺激抗原特异性T细胞应答的能力，使用了一项3A9T细胞肽刺激测定(参见，例如Workman et al.(2003)J.Immunol.169：5392-5395；Workman etal.(2002)Eur.J.Immunol.32：2255-2263)。

在这项测定中，对肽HEL48-62特异的一小鼠T细胞杂交瘤3A9作为反应者T细胞(responder T cell)而被使用。将反应者3A9T细胞以逆转录病毒的方式进行转导以在其细胞表面上表达人类LAG-3或小鼠LAG-3。用来将HEL48-62肽抗原呈递给3A9细胞的抗原呈递细胞(APC)系小鼠MHC II类阳性的细胞系LK35.2。多个分别的研究确定一人类LAG-3融合蛋白能够与小鼠MHC II类分子进行结合，由此确认了LK35.2小鼠APC在这项测定中的用途。藉由白介素-2(IL-2)的产生表明了3A9细胞的抗原特异性刺激，藉由ELISA测量白介素-2的分泌(小鼠IL-2OptEIA试剂盒，BD Bioscience，Cat#555148根据制造商的建议)。

当经转染的T细胞与呈递HEL48-62肽抗原的LK35.2APC一起孵育时，人类或小鼠LAG-3在3A9T细胞上的异位表达在不存在任何抗体时导致对抗原特异性反应的抑制作用，正如由以下所显示：与对照3A9T细胞的肽的剂量反应性质相比，刺激3A9细胞产生IL-2所需的肽抗原的量增加。为了测试抗体对抗原特异性T细胞应答的刺激，首先将APC(2.5×10⁴个细胞)与抗原性肽(200nM)在37℃下进行预孵育30分钟，并将3A9T细胞(5.0×10⁴个表达mLAG-3或hLAG-3的细胞或对照细胞)与从25μg/mL起经三倍系列稀释的抗hLAG-3抗体在37℃下预孵育15分钟。然后将3A9T细胞加入至经抗原脉冲(antigen-pulsed)的APC中，并将培养物在37℃下预孵育24小时，检测结果如表3所示。

表3、抗LAG-3抗体对抗原特异性T细胞应答的刺激

抗体	3A9-hLAG-3肽测定IC<sub>50</sub>(nM)
		本发明抗LAG-3单抗	0.12-1.64
阳性对照抗LAG-3抗体	3.25-13.90

结果显示，在抗原特异性T细胞应答测定中，本发明所得抗LAG-3单抗能够刺激IL-2产生，而且效果优于阳性对照，证明了该刺激效应的特异性和高效性。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 三生国健药业（上海）股份有限公司

<120> 一种抗LAG-3的单克隆抗体及其制备方法和用途

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt tacgataact ggtactggat ccgccagccc 120

ccagggaagg ggctggagtg gattgggctc gaatccccga tcaagaatca tcgtggaagc 180

acaaagtcca actcccgagt caccctatca ctagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240

aagctgaggt ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgtt ttatagttct 300

aaggactggt accccgacga gtacgactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360

<210> 3

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Tyr Asp

20 25 30

Asn Trp Tyr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Leu Glu Ser Pro Ile Lys Asn His Arg Gly Ser Thr Lys Ser Asn

50 55 60

Ser Arg Val Thr Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Phe Tyr Ser Ser Lys Asp Trp Tyr Pro Asp Glu Tyr Asp Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagcca gagtagtatt gccttataca gctggtacca acagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctatgca gatgcctcca ggactaacgg catcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240

gaagattttg cagtttatta ctgtcagcgt agccagaaca cttggctccc ttttggccag 300

gggaccaacc tggagatcaa a 321

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ser Ile Ala Leu

20 25 30

Tyr Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Asp Ala Ser Arg Thr Asn Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Arg Ser Gln Asn Thr Trp Leu

85 90 95

Pro Phe Gly Gln Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Tyr Asp Asn Trp Tyr

1 5

<210> 6

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Leu Glu Ser Pro Ile Lys Asn His Arg Gly Ser Thr Lys Ser Asn Ser

1 5 10 15

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Tyr Ser Ser Lys Asp Trp Tyr Pro Asp Glu Tyr Asp

1 5 10

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Arg Ala Ser Gln Ser Ser Ile Ala Leu Tyr Ser

1 5 10

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ala Asp Ala Ser Arg Thr Asn

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gln Arg Ser Gln Asn Thr Trp Leu Pro

1 5

Claims (10)

1.一种抗LAG-3的单克隆抗体，其特征在于，其结合人LAG-3蛋白且包含重链和轻链可变区，其中所述重链可变区包含来自SEQ ID NO:2的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述重链CDR1、CDR2和CDR3区分别包括SEQ IDNO:5、6和7的氨基酸序列。

3.权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述轻链可变区包含来自SEQ ID NO:4的轻链可变区的CDR1’、CDR2’和CDR3’区。

4.权利要求3所述的单克隆抗体，其中所述轻链CDR1’、CDR2’和CDR3’区分别包含SEQID NO:8、9和10的氨基酸序列。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有编码如权利要求1所述单克隆抗体的核苷酸分子。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求5所述的表达载体。

7.一种如权利要求1所述的抗LAG-3的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

a)在表达条件下，培养如权利要求6所述的宿主细胞，表达抗LAG-3的单克隆抗体；

b)分离并纯化步骤a)所述的抗LAG-3的单克隆抗体。

8.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有如权利要求1所述的抗LAG-3的单克隆抗体和药学上可接受的载体。

9.如权利要求1所述的抗LAG-3的单克隆抗体在制备药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的药物为抗肿瘤、治疗自身免疫性疾病、治疗感染性疾病和/或抗移植排斥反应的药物。