JP6753946B2 - 抗人pd−1人源化単クローン抗体及び応用 - Google Patents
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Description
(1)SEQ ID NO:17−19;
(2)前述(1)と比較すると下記二者中の最低一者の序列を満足:a)同じの抗原表の位置を結合;b)同一性70%、80%、85%、90%或は97%以上。
(1)SEQ ID NO:35−37;
(2)前述(1)と比較すると下記二者中の最低一者の序列を満足:a)同じの抗原表の位置を結合;b)同一性70%、80%、85%、90%或は97%以上。
1.1動物免疫
経典の免疫時間表を使って、BALB/c小鼠に免疫、免疫源はhPD−1(人源PD−1)蛋白(北京義翹神州生物技術有限会社から購入)、動物にhPD−1を抵抗する抗体を発生させる。具体的な方案は表1の通りである。
融合前に小鼠の骨髄腫SP2/0の状態を調整して、それの生長密度は1.0×106個の細胞を超えない事を保証して、3日間前に終免を行って、終免は尾静脈注射の方式を採用、一日前に飼育細胞を準備して、敷く板数量は2.0×104個細胞/穴である。PEG融合を通じて、脾臓の細胞とSP2/0細胞の数量比は10:1〜5:1の間で、穴ごとに敷く脾臓の細胞の数量は1.0×105個以下である。7日間融合後、上清液を収穫して、培養基を交換する。
A、ELISA結合方法
バッグhPD−1−Fcは板にある、段差希釈の抗体を入れて、孵化洗浄後、羊抗鼠−HRPも入れて、色が出て、読数から反応曲線をまねて作成して、EC50値を計算する。
B、細胞結合実験
1日前にhPD−1−Fc過剰発現細胞を検測、培養用の細胞板に敷いて、翌日閉鎖してから段差希釈の抗体を入れて、anti−mouse−EUも入れて、データを読み取っていい。
C、細胞抑制実験
1日前にhPD−1−Fc過剰発現細胞を検測、培養用の細胞板に敷いて、翌日閉鎖してから段差希釈の抗体を入れて、PD1−Fc−Biotinも入れて、Europium−labeled streptavidinも入れて、データを読み取っていい。
選択された陽性亜クローンハイブリドーマ細胞をSFM培養基に接種して、7日間頃培養後、上清を収集して、遠心で濾してからProtein G精製カラムで精製して、精製抗体を其々ELISA結合活性、ELISA抑制活性、細胞結合活性、細胞抑制活性の検測を行う、MLR実験。スクリーニングして、活性が最高の鼠源抗PD−1単クローン抗体を収穫して、mouse anti−PD−1と命名する。
A、ELISA結合活性
バッグPD1−Hisは板にある、段差希釈の抗体を入れて、孵化洗浄後、羊抗鼠−HRPも入れて、色が出て、読数から反応曲線を作成して、結果が図1の通り、EC50値を計算して、それとhPD−1の結合活性EC50は2.402ng/mLである。
B、ELISA抑制活性
段差希釈された抗体は一定濃度のPD1−Fc−Hisと事前に孵化して、混合物をバッグPD1−Fcの板に入れて、孵化洗濯してからanti−His−HRPも入れて、発色、読数から反応曲線をフィッティングして、結果は図2の表示で、IC50値を計算して、それの抑制活性IC50は3.827nMである。
C、細胞結合活性
一日前にPD1−27(PD1過剰発現CHO−K1定常細胞)を検測培養用の細胞板に敷いて、翌日閉鎖してから段差希釈の抗体を入れて、洗濯後またanti−mouse−EUを入れて、後で洗濯して、蛍光増強液を入れて、データを読み出し、反応曲線をフィッティングして、結果は図3の表示で、それの細胞結合活性EC50は87.80ng/mLを計算できる。
D、細胞抑制活性
一日前にPD1−27(PD1過剰発現CHO−K1定常細胞)を検測培養用の細胞板に敷いて、翌日閉鎖後段差希釈の抗体を入れて、PD1−Fcも入れて、洗濯してanti−Human−EUを入れて、後で洗濯して、蛍光増強液を入れて、反応曲線をフィッティングして、結果は図4の表示で、それの細胞結合活性IC50は284.1ng/mLを計算できる。
E、MLR実験
磁気ビーズでスクリーニングされたCD4+T細胞とDC細胞を一定の比例で混合して舗装して、違う濃度のanti−PD1鼠単抗を入れて、5日間培養してから、試薬箱でIFN−γの濃度を検測して、結果は図5の表示で、anti−PD1鼠単抗は顕著的にIFN−γの表現を促進できる。
2.1 鼠源抗体遺伝子の獲得
Purelink RNA Micro kitを利用して、mouse anti−PD−1雑交腫の総RNAを抽出して、PrimeScript TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit逆回転録RNAでcDNAを生産準備する。別々にLeader primerを使って抗体の重鎖と軽鎖の可変区を拡増して、反応システムとPCR条件は其々表2と3の表示である。
鼠抵抗の序列を分析して、人の生殖系列(germ line)遺伝子と比較して、重鎖FR1テンプレートはHM855688(IGHV3−21*04)から由来する、重鎖FR2テンプレートはL06614(IGHV3−30*07)から由来する、重鎖FR3テンプレートはM77327(IGHV3−30*15)から由来する事を最終的に確定した、軽鎖の人源化テンプレートはX63397(IGKV2−28*01)も確定された。CDR−移植を通じて、重鎖と軽鎖のCDRを構造序列に並行して、人源化抗体を構築して、人源化抗体可変区の断片を遺伝子合成させる。重鎖可変区の核酸序列はSEQ ID NO:5の表示、軽鎖可変区の核酸序列はSEQ ID NO:6の表示することを得た。
鼠源抗体CDRのDNA序列を分析して、可変区CDR中の突変位点を確定する。プライマーの序列を設計して、突変位点の位置をNNSに設定して、任意のアミノ酸をコードさせる。人源化抗体scFvをテンプレートとして、PCRにscFv抗体庫を拡増し、scFv抗体庫はsfiI酵素の切位点を通じて、バクテリオファージの質粒に構築して、二級抗体庫を構築する。
その後、バクテリオファージの展示を通じて、高く親和力の抗体スクリーニングを行う。具体的な方法は下記の通りである。
A、電転化を通じて、scFvを含む抗体庫のバクテリオファージ質粒を大腸菌TG1に転化して、37℃、220rpm、1hの恢復を経って、補助バクテリオファージ(helper phage)を残りの菌液に入れて、別にアンモニアシリンを入れて、37℃、220rpm、1h。2500rpm×5min遠心方法で上清を取り除いて、2×YT−AK培養基で菌泥を吹き、37℃、220rpm一晩置いて培養する。
B、バッグ抗原:バッグ緩衝液でPD1−Fc−Hisを希釈して、均一に混合してから免疫管に入れて、4℃バッグで一晩置く。
C、再編バクテリオファージの収集:上記の一晩置いた培養菌液は2500rpm×5min遠心して上清10mlを収集して、2ml PEG/NaClを入れて、均一に混合してから氷に30−60minを置いて、10000g×20min遠心して、上清を取り除いて、2×YT培養基でバクテリオファージ庫を溶解する。
D、閉鎖:PBSで免疫管を2回洗浄して、閉鎖液を入れて、室温1hそれに、相同体積の閉鎖液とバクテリオファージ庫を混合して、室温で10−15min閉鎖する。
E、バクテリオファージ庫の孵化:PBSで免疫管を2回洗浄して、閉鎖したバクテリオファージ庫を入れて、37℃の培養箱2−3h。
F、洗脱:100μl のTG1菌液(前日の接種)を10ml 2×YTの中に入れて、37℃、220rpmでA600値0.4−0.5まで培養する。PBSTで免疫管を8回洗浄して、もう一回PBSで免疫管を2回洗浄して、5mlの対数期生長の菌液を入れて、37℃、220rpm、1h。
G、OUTPUT:上記の菌液を10−1、10−2まで希釈してから別々に100ulを取って平板に塗り付ける。
H、次回のスクリーニング:200μl helper phageを5mlの洗脱後の菌液に入れて、同時に5μlアンモニアシリンを入れて、37℃、220rpm、1h2500rpm×5min遠心して上清を取り除いて、10ml 2×YT−AKで菌泥を吹き、37℃、220rpm一晩置いて培養する。
A、バッグhPD−1−FC、4℃一晩置く;
B、PBSTで2回を洗浄して、phage上清を入れて、25℃、1h;
C、PBSTで3回を洗浄して、希釈のanti−M13−biotinAbを入れて、25℃、1h;
D、PBSTで3回を洗浄して、希釈のHRP−streptavidin、25℃、1h;
E、PBSTで3回を洗浄して、予熱したTMBを入れて、25℃、10min、1M H2SO4を入れれ反応を中止になり、OD450で光熱値を検測する。陽性クローンを選択して、序列の測定に送って、PCRを通じて、重鎖可変区或は軽鎖可変区がそれの対応の人源抗体の恒定区の序列と連接して、拡増した抗体重鎖と軽鎖の全長断片(信号ペプチドが含む)は別々にpcDNA3.1GSにクローンする共トランスフェクション軽鎖プラスミド、重鎖プラスミドからEXPI 293細胞株まで、7日間培養後、Protein A(GE)で上清を純化して、最終親和力が成熟の抗体を獲得する。親和力が成熟の抗体を其々Elisa結合活性、Elisa抑制活性とCell結合活性を検測する事を行う。
バッグPD1−Hisは板にある、段差希釈の抗体を入れて、孵化洗浄後、羊抗鼠−HRPも入れて、色が出て、読数から反応曲線を作成して、結果が図6の通り、EC50値を計算して、それとhPD−1の結合活性EC50は6.094ng/mLである。
B、ELISA抑制活性
段差希釈された抗体は一定濃度のPD1−Fc−Hisと事前に孵化して、混合物をバッグPD1−Fcの板に入れて、孵化洗濯してからanti−His−HRPも入れて、発色、読数から反応曲線をフィッティングして、結果は図7の表示で、IC50値を計算して、それの抑制活性IC50は406.1nMである。
C、細胞結合活性
一日前にPD1−27(PD1過剰発現CHO−K1定常細胞)を検測培養用の細胞板に敷いて、翌日閉鎖後段差希釈の抗体を入れて、洗濯してanti−mouse−EUを入れて、後で洗濯して、蛍光増強液を入れて、データを読み出し、反応曲線をフィッティングして、結果は図8の表示で、それの細胞抑制活性IC50は103.2ng/mLを計算できる。
三回のスクリーニングを行ってから、単クローン76個を選択し検測して、この中の40個のクローンを選択し序列を測定して、結果にクローン序列は原始の人源化抗体可変区の序列が一致と表示された。人源化抗体可変区の序列と人源抗体の工程区の序列を連接して、全抗体序列を形成して、表現プラスミドP3.1GS−hup01−HCとP3.1GS−hup01−LCを構築して、293細胞準備抗体に瞬回転して抗体活性を検測する。
GAGGTGCAACTGGTGGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGAAGCCCGGAGGATCCCTGAGGCTGTCCTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACACCATGTCCTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGAAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCTACCATCAGCAACGGAGGCTCCTTCACCTATTACCCTGACTCCATGAAGGGCAGGTTCACAATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGTCCAGCCTGAGGGCTGAGGACACCGCCGTGTATTACTGCGCCAGGGACAGCGACTATTACGGCATCTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACAACCGTGACAGTGAGCTCC (SEQ ID NO: 5)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISNGGSFTYYPDSMKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARDSDYYGIFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 16)
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCTCTGTCCCTGCCTGTGACACCCGGAGAGCCTGCCTCCATCAGCTGCAGGAGCTCCAAGAGCCTGCTGTACAAAGACGGCAAGACCTACCTGAACTGGTATTTACAGAAGCCTGGCCAGTCCCCCCAGCTGCTGATCTACCTCATGTCCACCAGGGCCTCCGGAGTGCCTGATCGGTTCAGCGGATCCGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTCAAGATCTCCAGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGAGTGTACTATTGCCAGCAGCTGGTGGAGGACCCCTTCACCTTCGGCCAAGGCACAAAGCTGGAGATCAAGAGGACTGTG (SEQ ID NO: 26)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWYLQKPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEDPFTFGQGTKLEIKRTV ( SEQ ID NO: 34)
P3.1GS−hup01−HCとP3.1GS−hup01−LCをテンプレートとしてPCRを通じて全長抗体、重鎖断片と軽鎖断片を増幅して、人源化抗体の表現プラスミドを構築する。
人源化抗体表現プラスミドP3.1GS−PD−1はトランスフェクション前にPvuIでリニア化して、電気トランスフェクションの方法で人源化抗体軽鎖、重鎖遺伝子を含有しているリニア化プラスミドをCHO−KSM4にトランスフェクションして、四回トランスフェクションして、トランスフェクション後の細胞を其々に20150703T、20150704T、20150708T及び20150714Tと命名される。
Biacoreを利用して実施例四中の細胞株の表現抗体の親和力と結合動力学を分析する。標準アミン偶聯化学とBiacoreから提供した試剤ボックスを利用して、バスタミン経由して、羊抗人IgGをCM5チップと共価連接する。抗体が30μL/minの流速でHBS EP緩衝液の中に流動させて、結合を測定する。結合時間300秒、解離時間7200秒計算で取ったka、kdとKD値は表11の通りである。
PBS緩衝液1:1血液を希釈して、3mLのLSMを遠心管に移動して、希釈された血液4mLを入れて、注意:入れる時、希釈後の血液はLSMの上層にある、均一に混合する事が不可である。400g、RT 30−40min遠心最後、分離された上層のPBMCを吸出し、100g 10min遠心。BD公司のCD4+細胞分離磁珠を使て、CD4+T細胞を分離する。BD公司のDC細胞分離磁珠を使て、DC細胞を分離する。96穴板の穴ごとにCD4+T細胞の数量は1×10 105、DC数量は1×10 104、体積合計100μL 共培養する。段差希釈された抗体を入れて、5日間培養後、IFN−γ、IL−2の濃度を検測する。
猿血清で人源化抗体anti−PD−1を希釈して、濃度は0.5mg/mLである。37℃で其々0日間、1日間、4日間、7日間置く。
Claims (12)
- 抗人PD−1ヒト化単クローン抗体またはその抗原結合部分であって、下記のCDR領域を含み、重鎖CDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号17−19で示され、軽鎖CDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号35−37で示される、抗人PD−1ヒト化単クローン抗体或はそれの抗原結合部分。
- 請求項1記載の抗人PD−1ヒト化単クローン抗体またはその抗原結合部分であって、下記の重鎖可変部フレームワーク領域を含み、FR1、FR2、FR3、FR4のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号20−23で示される、抗人PD−1ヒト化単クローン抗体またはその抗原結合部分。
- 請求項2記載の抗人PD−1ヒト化単クローン抗体またはその抗原結合部分において、重鎖のアミノ酸配列は配列番号8で示される、抗人PD−1ヒト化単クローン抗体またはその抗原結合部分。
- 請求項1で述べた抗人PD−1ヒト化単クローン抗体またはその抗原結合部分において、それの特徴:また下記の軽鎖可変部フレームワーク領域を含み、FR1、FR2、FR3、FR4のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号38−41で示される、抗人PD−1ヒト化単クローン抗体またはその抗原結合部分。
- 請求項4記載の抗人PD−1ヒト化単クローン抗体またはその抗原結合部分において、軽鎖のアミノ酸配列は配列番号25で示される、抗人PD−1ヒト化単クローン抗体またはその抗原結合部分。
- 核酸分子であって、請求項1に記載の抗人PD−1ヒト化単クローン抗体或はその抗原結合部分をコードできる核酸配列を含む、核酸分子。
- 請求項6記載の核酸分子において、前記抗人PD−1ヒト化単クローン抗体或はその抗原結合部分の重鎖可変部は、配列番号16のアミノ酸配列を含む、核酸分子。
- 請求項6記載の核酸分子において、前記抗人PD−1ヒト化単クローン抗体或はその抗原結合部分の軽鎖可変部は、配列番号34のアミノ酸配列を含む、核酸分子。
- ベクターであって、請求項6〜8のいずれか1項記載の核酸分子を含む、ベクター。
- 宿主細胞であって、請求項6〜8のいずれか1項記載の核酸分子或は請求項9のベクターを含む、宿主細胞。
- 組成物であって、請求項1〜5のいずれか1項記載の抗人PD−1ヒト化単クローン抗体或はそれの抗原結合部分、請求項6〜8の核酸分子、請求項9のベクター、または請求項10の宿主細胞、及び任意選択された薬学で受け入れるキャリヤー或は造形剤、及び任意選択された他の生物活性物質を含む、組成物。
- 請求項1〜5のいずれか1項の抗人PD−1ヒト化単クローン抗体またはその抗原結合部分、請求項6〜8の核酸分子、請求項9のベクター、請求項10の宿主細胞、或は請求項11の組成物を含む腫瘍、免疫システム関係の病気、微生物或はウイルスが引き起こす感染の予防または治療用の薬物。
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