CN114874324A

CN114874324A - 一种检测可溶性lag-3蛋白含量的酶联免疫检测试剂盒及应用

Info

Publication number: CN114874324A
Application number: CN202210522680.8A
Authority: CN
Inventors: 张学光; 古彦铮; 吴妹英; 王强
Original assignee: Suzhou Xuguang Kexing Antibody Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Xuguang Kexing Antibody Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-05-13
Filing date: 2022-05-13
Publication date: 2022-08-09
Anticipated expiration: 2042-05-13
Also published as: CN114874324B

Abstract

本发明公开了一种检测可溶性LAG‑3蛋白含量的酶联免疫检测试剂盒及应用，所述试剂盒包括两种抗人LAG‑3单克隆抗体；其中LAG‑3‑4F4抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：2；LAG‑3‑4E12抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：4。本发明还提供一种酶联免疫检测试剂盒，是使用LAG‑3‑4F4抗体作为包被抗体，而抗体LAG‑3‑4E12作为检测抗体。本发明的试剂盒能够有效检测可溶性LAG‑3含量，临床上辅助诊断肿瘤病患，且辅助鉴别诊断炎症和自身免疫性疾病患者。

Description

一种检测可溶性LAG-3蛋白含量的酶联免疫检测试剂盒及应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种用于检测人可溶性LAG-3蛋白(1ymphocyteactivationgene-3，淋巴细胞活化基因-3，CD223)的单克隆抗体及其应用。

背景技术

免疫检查点(immune checkpoints)是存在于免疫系统中的抑制性信号，是免疫系统维持自身免疫耐受和机体免疫稳态、避免组织损伤、调节适度的外周免疫应答的众多抑制性分子。目前最常见的免疫检查点包含有细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)，PD-1，LAG-3，Tim-3，TIGHT，而应用最广泛的免疫检查点分子为CTLA-4和PD-1。研究发现，肿瘤部位用阻断型抗体CTLA-4虽然可大大消除Treg细胞，能够有效诱导抗肿瘤免疫反应，但当Treg细胞功能受到抑制同时可能会增加自身免疫毒性的风险。所以CTLA-4在免疫检查点共抑制受体分级中安全系数最小，毒性最大。而抗PD-1/PD-L1抗体单药治疗或者联合放疗等方案在抗肿瘤临床试验中已表现出了良好的疗效和相对较低的不良反应。因此，PD-1抑制剂的作用更具有针对特异性，接受抗PD-1抗体治疗的患者表现出较小的免疫毒性。但还有相当数量的患者PD-1并不敏感，因此，是否存在其他更重要的免疫检查点分子参与了宫颈癌的肿瘤免疫逃逸成为当今研究的热点。

LAG-3是新发现的一种免疫抑制性受体，定位于12号染色体(12p13.3)，是由498个氨基酸构成的I型免疫球蛋白超家族成员，含有四个胞外免疫球蛋白超家族结构域。LAG-3主要表达于活化的CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和NK细胞。MHC-Ⅱ分子是其天然配体，主要表达在APC细胞、部分肿瘤细胞或MDSC细胞上。LAG-3在多种肿瘤微环境中异常表达，对肿瘤免疫应答发挥重要的免疫检查点作用。针对抗LAG-3的免疫检查点药物(如BMS986016，REGN3767和LAG525)，在多种实体肿瘤(包括晚期非小细胞肺癌、晚期胃癌等)和白血病中的临床疗效和安全性正进行I/II期临床研究。2017年9月，ASCO公布的治疗黑色素瘤的I/IIa期临床试验数据显示，将Relatlimab与PD-1抗体Nivolumab联用，可适当提高缓解率。

LAG-3的可溶性单体形式最先在炎症性疾病患者体内发现，治疗有效时，其表达水平增高。Triebel等在雌激素受体(ER)和/或孕激素受体(PR)阳性的乳腺癌患者体内检测到sLAG-3，其表达水平与预后呈正相关，而与患者临床病理特征之间无明显相关性。Jiang的实验组对胃癌患者及体检健康者血清的含量进行检测，并与常用的肿瘤标记物癌胚抗原进行比较诊断效率，发现sLAG-3在胃癌诊断中的敏感性和准确性高于CEA。但目前sLAG-3的EILSA试剂盒灵敏度有限。

发明内容

基于上述的缺陷，本发明在提供一种可用于检测人可溶性LAG-3蛋白的单克隆抗体基础上，构建了一种基于双抗体夹心ELISA方法研制的人可溶性LAG-3的ELISA试剂盒，并利用该试剂盒来进行人sLAG-3的定量检测。

本发明首先提供两种抗人LAG-3蛋白的单克隆抗体，包含有LAG-3-4F4抗体和LAG-3-4E12抗体，

其中LAG3-4F4的重链可变区(mVH)的氨基酸序列如下：

QLQLKESGPEVVRPGVSVKISCKGSGYTFTDYAMYWVKQSHAKSLEWIGVISTYNGNTNYNQRFKGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCARERGAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：1)、

LAG3-4F4的轻链可变区(mVL)的氨基酸序列如下：

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHNNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSSRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：2)；

LAG-3-4E12抗体的重链可变区(mVH)的氨基酸序列如下：

EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAVSGFAIRSYDMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYSYYPDSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTALYYCASLSTAPAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO：3)、

LAG3-4E12的轻链可变区(mVL)的氨基酸序列如下：

DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNTYPHMYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：4)；

本发明所提供的本发明首先提供两种抗人LAG-3蛋白的单克隆抗体用于制备用于检测可溶性LAG-3含量的制品；

所述的制品，作为本发明实施例的具体记载，为酶联免疫检测试剂盒。

更进一步的，本发明还提供一种酶联免疫检测试剂盒，是使用LAG-3-4F4抗体作为包被抗体，而抗体LAG-3-4E12作为检测抗体；

所述的检测抗体使用生物素进行标记。

本发明所提供的酶联免疫检测试剂盒用于检测可溶性LAG-3蛋白含量，可用于检测临床肿瘤病人，自身免疫性病人血浆及实验细胞分泌的可溶性LAG-3含量。

本发明的试剂盒能够有效检测可溶性LAG-3含量，临床上辅助诊断肿瘤病患，且辅助鉴别诊断炎症和自身免疫性疾病患者。

附图说明

图1为本发明的ELISA试剂盒的标准曲线方程图。

图2为本发明的ELISA试剂盒的特异性考察曲线图。

图3为sLAG-3在正常人和肿瘤患者外周血清中的表达水平示意图。

具体实施方式

检测发现，与健康人相比，自身免疫性病患者如甲亢和肾炎病人的外周血的血浆中sLAG-3表达水平远高于健康人(p<0.05)；而肿瘤患者，尤其是宫颈癌患者的外周血的血浆中sLAG-3则低于正常人(p<0.01)。感染病人，如手足口病患者的外周血的血浆中sLAG-3则高于正常人(p<0.01)。因此，提供能够检测可溶性LAG-3蛋白的试剂盒在肿瘤，炎症，自身免疫性疾病的诊断和鉴别诊断中具有一定的应用价值。

本发明在筛选获得了两种抗人LAG-3蛋白的单克隆抗体的基础上，构建酶联免疫检测试剂盒。

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1：制备抗人LAG-3单克隆抗体杂交瘤细胞

1.1小鼠的免疫

使用融合重组蛋白对BALB/c小鼠进行四次免疫，间隔时间为21天，在第四次免疫之后5-7天后采取小鼠的眼眶血并测定效价，效价较好时则再次进行加强免疫。

1.2滋养层细胞的培养

1.2.1在融合实验开始的前一天，取周龄6周以上的BALB/c小鼠，脊椎脱臼处死后将其放入盛满75％酒精的烧杯中浸泡2分钟。

1.2.2在无菌超净台中取出小鼠的脾脏并置于200目无菌不锈钢筛网中，通过研磨获得单细胞悬液。经1640基础培养基离心重悬清洗两次后，用适量含15％FBS的1640培养基再次重悬细胞，使用无菌巴氏玻璃吸管将细胞液均匀滴入96孔培养板中，每孔的体积约为80μl，最后将培养板放于培养箱中过夜培养，培养条件为37摄氏度及5％的CO₂浓度。

1.3细胞融合及筛选

1.3.1采用颈椎脱臼的方法处死免疫后的小鼠，置于装满75％酒精的烧杯中浸泡2min。

1.3.2在无菌操作台中取出小鼠的脾脏，于200目的无菌筛网中进行研磨以此来获得单细胞悬浮液，之后用37℃预热的1640基础培养基依照1400rpm/5min的条件离心重悬清洗2次。

1.3.3收集生长良好且处于生长对数期的sp2/0细胞，同样用预热的1640基础培养基依照1400rpm/5min的条件离心重悬清洗2次。

1.3.4将清洗后的脾脏细胞和sp2/0细胞按大约5:1的比例在离心管中混匀，并加入预热的1640基础培养基充分混匀，之后1400rpm/5min的条件离心一次，弃上清后用手指轻弹管底来混匀两种细胞。

1.3.5将装有混匀细胞的离心管放于37℃条件下水浴加热，并逐滴加入1ml已预热过的PEG溶液，期间不停轻轻震荡离心管，使融合过程更加有效。

1.3.6 PEG溶液加完后，匀速滴入14ml 1640基础培养基来终止融合过程。将离心管置于37℃培养箱中静置10min后800rpm/5min条件下离心，弃上清液。

1.3.7加入预热的1640全培养基轻柔重悬融合后的细胞，用灭菌的5ml巴氏玻璃吸管均匀滴加到含有滋养层细胞的96孔培养板中，每孔大约80ul/孔，之后放于37℃,5％CO₂培养箱中培养，每隔3-4天用HT培养基进行换液，共进行两次换液，之后每孔取少量上清液进行ELISA检测。

1.3.8挑选检测值较高的孔进行亚克隆，每次亚克隆后都进行ELISA检测，通常经过3-4次亚克隆后才能获得稳定分泌抗体表型的细胞，并对最后一次亚克隆后的细胞进行冻存。

实施例2：测定抗人LAG-3单克隆抗体的轻重链可变区序列

测定抗人LAG-3单克隆抗体重链和轻链可变区，包括以下步骤：

2.1杂交瘤细胞cDNA的获取

从获取的杂交瘤细胞中提取RNA，通过RT-PCR技术将获得的RNA反转录为cDNA。利用特定设计的上下游引物PCR克隆该杂交瘤细胞的重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)。

2.2重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)分别与克隆载体(pJET cloningvector)连接，连接的产物转化至感受态细菌(DH5a)，因为pJET克隆载体含有氨苄抗性基因(Amp+)，所以可将转化后的菌液均匀涂布于Amp抗性的LB固体培养基上，放于培养箱中，37℃条件下过夜培养。

2.3挑选培养基上边缘清晰、生长良好的菌落进行测序鉴定。

2.4根据测序结果保留候选的轻重链可变区序列，再次通过PCR克隆出可与表达载体连接的轻链和重链的可变区序列，并将PCR产物与提前用双酶切处理的线性表达载体连接，连接后的产物转化至DH5a，由于表达载体中含有卡那霉素抗性基因(Kana+)，因此可将转化后的菌液均匀涂布于Kana抗性的LB固体培养基上，置于培养箱中，37℃条件下过夜培养。

2.5挑选生长良好的细菌测序，并对比两次测序结果从而得到具有正确的序列的转化细菌，通过扩大培养后进行质粒抽提。

2.6将连有当克隆抗体重链和轻链可变区基因的表达载体一起共同转染真核表达细胞293。293细胞用无血清培养基SFM4Transfx-293without L-Glutamine悬浮培养，在转染时培养基替换为无血清培养基Gibco

FreeStyle^TM 293Expression Medium。连续培养一周后收取上清培养液离心(5000rpm 20min)，得到的上清液用0.22um过滤膜过滤除菌。

2.7利用ELISA试剂盒检测含有目的抗体的上清液，结果显示良好。

通过上述方法来获得抗人LAG-3-4F4单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如下：

QLQLKESGPEVVRPGVSVKISCKGSGYTFTDYAMYWVKQSHAKSLEWIGVISTYNGNTNYNQRFKGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCARERGAMDYWGQGTSVTVSS；

LAG-3-4F4单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如下：

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHNNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSSRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIK；

LAG-3-4E12单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如下：

EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAVSGFAIRSYDMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYSYYPDSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTALYYCASLSTAPAYWGQGTLVTVSA；

LAG-3-4E12单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如下：

DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNTYPHMYTFGGGTKLEIK。

本发明从表达抗人LAG-3单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取到抗体的重链和轻链的可变区，根据测序结果保留候选的轻重链可变区序列，并通过PCR扩增出与表达载体匹配的轻重链可变区序列，连接PCR产物与双酶切预处理的表达载体，之后转化至感受态细菌DH5a。将连有目的单抗轻链和重链可变区的表达载体共同转染真核表达细胞株293，收取培养后的上清含有目的抗体，说明得到的重链和轻链可变区序列是正确的。

实施例3：构建检测可溶性LAG-3含量的ELISA试剂盒

3.1试剂盒的组成

本发明的ELISA试剂盒包括包被于酶标板上的实施例1中制备的LAG-3包被抗体(LAG-3-4F4)、经生物素标记的LAG-3检测抗体(LAG-3-4E12)、可溶性LAG-3蛋白标准品(R&DSystems)、辣根过氧化物酶(HRP)、样本稀释液、洗涤液(PBST)、显色液(TMB)及终止液组成。

3.2样本的采集及处理

采用正确的医用技术收集一批医院心衰病人的血清，收集后的血清样本如在8h内不能检测则放置于4℃冰箱低温保存，如果需要72h以上时间保存或运输，应将样本-20℃冻存，并避免反复冻融。检测前提前将样本常温放置半小时，并震荡混匀，取适量病人血清用样本稀释液稀释至20倍。

3.3可溶性LAG-3含量的测定方法

3.3.1Na₂CO₃和NaHCO₃组成的包被液稀释包被抗体LAG-3-4F4(1ug/ml),在96孔酶标板中各加入100ul,4℃过夜，使包被抗体与酶标板紧密结合。

3.3.2包被后用洗涤液(PBST)洗板3次，每孔加入100ul的3％牛血清封闭液37℃条件下封闭1h。封闭结束后甩干，并加入稀释好的待测血清样品以及梯度稀释好的可溶性LAG-3蛋白标准品(从2ng/ml开始对比稀释，共设置7个浓度，最后一空加样品稀释液为空白对照，每个梯度做3个重复)，加液体积为100ul/孔，室温条件下75rpm震荡孵育1h。

3.3.3PBST洗板三次甩干，接着加入生物素标记的检测抗体LAG-3-4E12，100ul/孔，室温条件下75rpm震荡孵育1h。

3.3.4PBST洗板三次甩干，加入辣根过氧化物酶(HRP)，100ul/孔，室温条件下75rpm震荡孵育1h。

3.3.5PBST洗板六次甩干，加入显色液TMB，100ul/孔，室温震荡孵育10min，之后加入终止液(100ul/孔)终止颜色反应，通过酶标仪测定每孔的OD450值。

3.3.6以LAG-3标准品浓度乘以样品稀释倍数(×50)的值为纵坐标，以相应测得的OD450值为横坐标制作标准曲线(如图1)，并得到计算公式，根据待测样品的OD450值计算出样品中可溶性LAG-3的含量。

试剂盒的具体组合和操作如下表1所示。

表1：ELISA试剂盒的具体组成信息

本发明试剂盒可达到以下指标：

标准曲线线性：R²>0.9990、

准确度：添加率95％、

最低检测限≤7.91pg/ml、

重复性：变异系数<5％。

3、检测结果：

(1)LAG-3-Ig融合蛋白的检测数据如下表所示。

表2：LAG-3-Ig融合蛋白的检测数据表

(2)曲线方程：y＝-1E-06x2+0.0043x+0.1592，R2＝0.9922(参见图1)

(3)血清样品的检测数据如下3所示。

表3：血清样品的检测数据表

4、准确性考察：

(1)板内准确性分析：在同一次实验中，将三个已知浓度的样本(200、100、30pg/ml)分别设置10个复孔，进行sLAG-3检测，分析该试剂盒的准确性。

(2)板间准确性分析：在不同实验室中，将三个已知浓度的样本(200、50、30ng/ml)分别设置10个复孔，进行sLAG-3检测，分析该试剂盒的准确性。

(3)结果与讨论：

表4：检测结果的数据准确性信息表

如上表4所示，结果表明变异系数CV<10％，证实该检测方法具有良好的准确性。

5、特异性考察：

将不同浓度梯度的PD-L1Ig、B7-H3Ig和CD80Ig的蛋白(10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.1562和0ng/ml)加入抗LAG-3单抗(克隆：4E12)预包被的ELISA检测孔，用建立的ELISA检测方法测定每种蛋白不同浓度的吸光值。如图2所示，sLAG-3蛋白组OD450吸光值与蛋白浓度之间呈现显著的依赖性，吸光值随着蛋白浓度增加而升高，其他2种蛋白组吸光值都很低(OD450<0.1)，且无蛋白浓度相关性。因此，该检测方法具有良好的特异性。

序列表

<110> 苏州旭光科星抗体生物科技有限公司

<120> 一种检测可溶性LAG-3蛋白含量的酶联免疫检测试剂盒及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Leu Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Val Val Arg Pro Gly Val

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Arg Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Asn

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 3

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ala Ile Arg Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Leu Ser Thr Ala Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ala

115

<210> 4

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro His

85 90 95

Met Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

Claims

1.抗人LAG-3蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述的抗体包含有LAG-3-4F4抗体或LAG-3-4E12抗体，

其中LAG-3-4F4抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：2；

LAG-3-4E12抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：4。

2.权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于检测可溶性LAG-3蛋白含量的制品中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的制品为酶联免疫检测试剂盒。

4.一种酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的酶联免疫检测试剂盒是使用权利要求1所述的单克隆抗体中的LAG-3-4F4抗体作为包被抗体，而LAG-3-4E12抗体作为检测抗体。

5.如权利要求4所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的检测抗体使用生物素进行标记。

6.权利要求4所述的酶联免疫检测试剂盒在检测可溶性LAG-3蛋白中的应用。

7.一种检测可溶性LAG-3蛋白的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求4所述的酶联免疫检测试剂盒对样品进行检测。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的样品为非疾病诊断治疗用的样品。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的样品为临床肿瘤病人，自身免疫性病人血浆。