CN109414501A - 用于治疗神经退行性疾病的TrkB激动剂抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供特异性增强TrkB信号传导活性的TrkB激动剂抗体或抗原结合片段。本发明还提供了使用这种抗体促进视网膜神经节细胞的存活和再生，以及用于治疗或预防患有各种神经变性病症如青光眼或有发展这样的方法的受试者的治疗方法。

Description

用于治疗神经退行性疾病的TrkB激动剂抗体

相关申请的交叉引用

本主题专利申请要求美国临时专利申请号62/331,046(于2016年5月3日提交)的优先权。优先权申请的完整公开内容通过引用整体并入本文并用于所有目的。

背景技术

Trk受体家族在神经元和非神经元组织的生理和疾病过程中是重要的。在这些受体激酶中，TrkB在脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT3)和神经营养因子-4(NT4)的信号传导中起关键作用，这对于外周和中枢神经系统的神经元的分化、存活和功能是必不可少的。神经营养蛋白与Trk受体细胞外结构域的结合启动信号转导途径，其导致受体的二聚化和自磷酸化。TrkB的自磷酸化导致信号传导途径的激活，包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酶C-γ和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3-K)的激活。

已经显示BDNF和TrkB都在视网膜中的视网膜神经节细胞的存活中起关键作用。有人提出，异常的TrkB信号传导及其损害有助于各种神经病变和退行性病症(如青光眼)的发展。青光眼是导致失明的第二常见眼病，影响全世界超过6千万的人口，其中美国的患病率约为230万被诊断的病例。主要导致眼内压升高(IOP)的“管道”问题，青光眼会导致视网膜神经节细胞(RGC)及其轴突向大脑传递所有视觉刺激。虽然许多药物和设备被批准用于降低眼压，目前尚未开发出能够预防、减缓或逆转RGC或其他视网膜神经细胞萎缩和损失的药物，这些药物可避免最终在超过10％的青光眼患者中发生失明。特异性调节TrkB信号传导的能力在与该途径相关的各种病理场景中至关重要。

本领域迫切需要在治疗各种视网膜疾病和病症，特别是包括青光眼在内的神经病变中促进TrkB和BDNF信号传导活性的方法。例如，目前的青光眼治疗方案可降低眼压，但不会逆转RGC变性。本发明旨在解决这些和其他需求。

发明内容

在一个方面，本发明提供TrkB激动剂抗体或抗原结合片段，其以与第二抗体的结合特异性相同的结合特异性来特异性结合原肌球蛋白受体激酶B(TrkB)。第二抗体含有重链CDR1-3和轻链CDR1-3序列，所述重链CDR1-3和轻链CDR1-3序列分别与

本发明的一些抗体或抗原结合片段包含重链可变区序列和轻链可变区序列，其中的一个或两个分别与以(1)SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39；(2)SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15；(3)SEQ ID NO：16和SEQ IDNO：17；(4)SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19；(5)SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21；(6)SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23；(7)SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25；(8)SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27；(9)SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29；(10)SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31；(11)SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33；(12)SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35；或(13)SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37显示的重链可变区序列和轻链可变区序列相同。一些抗体或抗原结合片段包含分别以(1)SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39；(2)SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15；(3)SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17；(4)SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19；(5)SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21；(6)SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23；(7)SEQ ID NO：24和SEQID NO：25；(8)SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27；(9)SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29；(10)SEQID NO：30和SEQ ID NO：31；(11)SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33；(12)SEQ ID NO：34和SEQID NO：35；或(13)SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37显示的重链可变区序列和轻链可变区序列。

本发明的一些抗体或抗原结合片段包含重链CDR1-3和轻链CDR1-3序列，所述重链CDR 1-3和轻链CDR 1-3序列分别与

或抗原结合片段包含选自由SEQ ID NO：46-48，51-53，60，62，65-67和70-72组成的群组的重链CDR序列。这些分子中的一些还包含选自由SEQ ID NO：49，50，54-59，61，63，64，68，69和73组成的群组的轻链CDR序列。这些分子中的一些包含分别与(1)SEQ ID No：70-72，(2)SEQ ID NO：46-48，(3)SEQ ID NO：51-53，(4)SEQ ID No：51，52，60，(5)SEQ ID No：46，47和62，或(6)SEQ ID No：65-67相同的重链CDR 1-3序列。这些抗体或抗原结合片段中的一些包含分别以(1)SEQ ID No：65-68，GKN和SEQ ID NO：73；(2)SEQ ID NO：46-49，AAS和SEQ ID NO：50；(3)SEQ ID NO：51-56；(4)SEQ ID No：51-53，57，58和56；(5)SEQ ID No：51-53，57，55和56；(6)SEQ ID No：51-55和59；(7)SEQ ID No：51，52，60，57，61和56；(8)SEQ IDNo：46，47，62，63，YDS和SEQ ID NO：64；(9)SEQ ID No：65-68，GKN和SEQ ID NO：69；或(10)SEQ ID No：70-72和54-56显示的重链CDR1-3和轻链CDR1-3序列。

本发明的一些抗体或抗原结合片段包含选自SEQ ID NO：49，50，54-59，61，63，64，68，69和73，以及序列AAS，YDS和GKN的轻链CDR序列。这些分子中的一些还包含选自由SEQID NO：46-48，51-53，60，62，65-67和70-72组成的群组的重链CDR序列。这些分子中的一些包含分别与(1)SEQ ID No：68，GKN和SEQ ID No：73；(2)SEQ ID NO：49，AAS，和SEQ ID NO：50；(3)SEQ ID NO：54-56；(4)SEQ ID No：57，58和56；(5)SEQ ID No：57，55和56；(6)SEQ IDNo：54，55和59；(7)SEQ ID No：57，61和56；(8)SEQ ID No:63，YDS和SEQ ID NO：64；或(8)SEQ ID NO:68，GKN和SEQ ID NO:69相同的轻链CDR 1-3序列。

本发明的一些抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36或38基本相同的重链可变区。本发明的一些抗体或抗原结合片段是scFv片段，其包含将所述重链和轻链可变区序列连接的接头序列。一些示例性的接头序列以SEQID No:40-45显示。本发明的一些scFv片段包含以SEQ ID No:1-13中的任一者显示的序列。

本发明的抗体或抗原结合片段可以是任何抗体结构形式，例如IgA1，IgA2，IgD，IgE，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，F(ab)2，Fv，scFv，IgGACH2，F(ab')2，scFv2CH3，Fab，VL，VH，scFv4，scFv3，scFv2，dsFv，Fv，scFv-Fc，(scFv)2，非消耗性IgG，双特异性抗体(diabody)和二价抗体。所述分子可以与合成分子缀合。在一些实施方式中，本发明提供了双特异性化合物(例如，双特异性抗体)，其包含本发明所述的TrkB激动剂抗体或抗原结合片段。

在另一方面，本发明提供了一种多核苷酸，其编码本发明的抗体或抗原结合片段的所述重链和/或轻链的所述可变区，以及提供了含有这样的多核苷酸的载体。在另一方面，本发明提供了一种药物组合物或试剂盒，其包含治疗有效量的本发明所述的抗体或抗原结合片段，或者表达所述抗体的多核苷酸或者载体。

在另一方面，本发明提供了一种促进受试者中的视网膜神经节细胞、运动神经元或中枢神经系统(CNS)神经元的存活、突触功能或再生的方法。还提供了治疗或预防受试者的眼部退行性病症、运动神经元疾病或中枢神经系统(CNS)退行性疾病的方法。本发明的这些治疗方法要求向所述受试者施用包含治疗有效量的TrkB激动剂抗体或抗原结合片段或编码本发明所述的抗体的多核苷酸或者表达载体的药物组合物。在多种实施方案中，可以将所述药物组合物施用至所述受试者的一只或两只眼睛。通常，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。适于所述方法的所述受试者可以是患有眼部退行性病症、运动神经元疾病或中枢神经系统(CNS)退行性疾病或处于患有这些疾病的风险中的受试者。适于本发明所述的方法的眼部退行性病症可以是例如：青光眼、视神经损伤、视神经炎、视神经病、视网膜中央动脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、糖尿病性神经病、年龄相关性黄斑变性(AMD)、前缺血性眼神经病变(AION)或糖尿病视网膜病变。适于用本发明所述的方法进行治疗的运动神经元疾病包括例如：ALS、特发性运动神经病、遗传性痉挛性截瘫(HSP)、原发性侧索硬化(PLS)、进行性肌萎缩(PMA)、进行性延髓麻痹(FBP)和假性延髓麻痹、贝尔麻痹或脊髓性肌萎缩症(SMA)。可以用本发明所述的方法进行治疗的CNS退行性疾病的示例包括例如：阿尔茨海默氏病(Alzheimer's Disease)、帕金森氏病(Parkinson's Disease)或亨廷顿舞蹈病(Huntington's Disease)。

通过参考说明书和权利要求的其余部分，可以实现对本发明的本质和优点的进一步理解。

附图说明

图1说明了构建用于选择TrkB激动剂Ab的人TrkB报道分子的方案。

图2显示了通过TrkB报道细胞系检查的培养上清液中几种未纯化的scFv-Fc TrkB激动剂抗体的活性。

图3显示了TkB报道细胞测定中许多TrkB激动剂IgG抗体的活性。

图4显示了鉴定的TrkB激动剂抗体的选择性-对TrkA缺乏作用。

图5显示了TrkB激动剂Ab的信号传导导致TrkB报道细胞中P-PLCγ、P-Akt和P-MAPK的活化。

图6显示了培养的小鼠皮质神经元中激动剂Ab诱导的TrkB磷酸化。

图7显示了由BDNF和TkB激动剂Ab NFAT-85诱导的Arc的表达。

图8显示了在小鼠胚胎干细胞中由激动剂抗体NFAT-85诱导的TrkB磷酸化。

图9显示了TrkB激动剂Ab NFAT-85阻止RGC树突收缩。

图10是TrkB激动剂抗体在青光眼大鼠模型中的作用的功效研究的实验范例。

图11显示了用于大鼠中的OHT模型的IOP特征。

图12显示了TrkB激动剂Ab85和BDNF在OHT大鼠中的作用的Sholl图分析。

图13示出了图12中所示的Sholl分析的树突度量。

具体实施方式

I.概览

本发明部分地基于本发明人开发的TrkB活化抗体，其显示出对视网膜病症(如青光眼)的神经保护和神经再生治疗的能力。BDNF的神经保护和神经再生活性在本文中得到证实，即，BDNF大大减缓了RGC树突状回缩，并且BDNF可以逆转RGC树突变性。重要的是，本发明人证明本发明的TrkB激动剂抗体显示出与作为RGC的神经保护剂的BDNF相同或更好的性质。

如本文详述的，本发明人通过从组合文库中选择罕见的活化激动剂抗体产生了一系列完全人激动剂抗体。在例证的研究中，TrkB激动剂抗体显示出能够模拟BDNF在维持或再生RGC的树突棘(dendritic arbor)中的在轴突切断的成年哺乳动物视网膜中快速缩回的功效。具体地，相对于BDNF，抗体显示在TrkB细胞系和BDNF响应性原代神经元培养物中都是有效的和选择性的。还发现抗体在激活TrkB信号转导中等同于BDNF，并且还具有跨物种活性(例如人和小鼠)。原位发现，在成年小鼠视网膜外植体测定中，抗体在减缓和恢复RGC变性方面具有活性。此外，通过高血压性青光眼的大鼠模型评估，TrkB激动剂Ab对视网膜神经节神经元的树突棘显示出再生作用。

与BDNF相比，本发明的TrkB激动剂抗体还具有极大改善的生物物理特性(例如，与BDNF不同，这些抗体不是“粘性”蛋白)并且与BDNF本身相比，在人类受试者中具有更长的半衰期(例如，更好的药代动力学)。此外，所有目前批准的青光眼治疗都集中在降低眼前房的眼内压(IOP)。然而，仅这些治疗不足以阻止疾病的进展。相反，本文公开的TrkB激动剂抗体的疾病调节神经保护活性可以减少RGC树突和细胞体萎缩或丧失，从而减缓疾病进展。抗体的神经退行性活动也可以恢复受损RGC的功能完整性。

根据这些研究，本发明提供了单克隆抗体和相关的抗原结合片段，其特异性激活TrkB酪氨酸激酶受体并促进RGC的再生。本发明还提供了在治疗应用中使用这些抗体剂治疗各种神经变性疾病的方法，所述神经变性疾病包括与RGC死亡或变性相关的视网膜变性疾病，或由异常或受损的TrkB信号传导活动介导的眼部疾病，例如青光眼。

II.定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。以下参考文献为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：

Academic Press Dictionary of Science and

Technology，Morris(Ed.)，Academic Press(1^st ed.，1992)；Oxford Dictionary ofBiochemistry and Molecular Biology，Smith et al.(Eds.)，Oxford University Press(revised ed.，2000)；Encyclopaedic Dictionary of Chemistry，Kumar(Ed.)，AnmolPublications Pvt.Ltd.(2002)；Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，Singleton et al.(Eds.)，John Wiley&Sons(3^rd ed.，2002)；Dictionary of Chemistry，Hunt(Ed.)，Routledge(1^st ed.，1999)；Dictionary of PharmaceuticalMedicine，Nahler(Ed.)，Springer-Verlag Telos(1994)；Dictionary of Organic Chemistry，Kumar andAnandand(Eds.)，Anmol Publications Pvt.Ltd.(2002)；和A Dictionary of Biology(Oxford Paperback Reference)，Martin and Hine (Eds.)，Oxford University Press(4^th ed.，2000)。另外，提供以下定义以帮助读者实施本发明。

术语“抗体”或“抗原结合片段”是指多肽链，其表现出与给定抗原、一个或多个表位结合的稳固的单价、二价或多价。除非另有说明，否则本发明中使用的抗体或抗原结合片段可具有衍生自任何脊椎动物物种的序列，包括骆驼科、鸟类或鱼类等。它们可以使用任何合适的技术产生，合适的技术如杂交瘤技术，核糖体展示，噬菌体展示，基因改组文库，半合成或全合成文库或其组合。除非另有说明，否则本发明中使用的术语“抗体”包括完整抗体、抗原结合多肽片段和下文所述或本领域熟知的其他设计者抗体(参见，例如，Serafini,JNucl.Med.34:533-6,1993)。

完整的“抗体”通常包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链(约50-70kD)和两条轻(L)链(约25kD)。编码抗体链的公认免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ，μ，α，δ，ε，其依次分别定义免疫球蛋白类别，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

抗体的每条重链由重链可变区(V_H)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域C_H1、C_H2和C_H3组成。每条轻链由轻链可变区(V_L)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域C_L组成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞和经典补体系统的第一组分(Clq)。

抗体的V_H和V_L区可以进一步细分为高变区，也称为互补决定区(CDR)，其中散布有更保守的框架区(FR)。每个V_H和V_L由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。CDR和FR区的位置和编号系统已由例如Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Departmentof Health and Human Services，U.S.Government Printing Office(1987和1991)定义。

结合亲和力通常以平衡缔合或解离常数(K_a或K_d)表示，其是解离和缔合速率常数的倒数比(分别为k_off和k_on)。因此，等效亲和力可对应于不同的速率常数，只要速率常数的比例保持不变即可。

术语“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体是指那些编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者在核酸不编码氨基酸序列的核酸的情况下，是指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置，密码子可以改变为所述的任何相应密码子而不改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，其是保守修饰变异的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)可以被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异隐含在每个所描述的序列中。

对于多肽序列，“保守修饰的变体”是指具有保守氨基酸取代的变体，其中氨基酸残基被具有带相似电荷的侧链的其他氨基酸残基取代。本技术领域已经定义了具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，β-支链侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

术语“接触”具有其正常含义，并且是指组合两种或更多种药剂(例如多肽或噬菌体)，组合药剂和细胞，或组合两种不同细胞群。接触可以在体外发生，例如，在试管或生长培养基中将抗体和细胞混合或将一群抗体与一群细胞混合。接触也可以在细胞内或原位发生，例如通过在编码两种多肽的重组多核苷酸的细胞中或在细胞裂解物中共表达来使细胞中的两种多肽接触。接触也可以在受试者体内发生，例如，通过向受试者施用药剂以将药剂递送至靶细胞来发生。

术语“表位”是指抗体的互补位结合的抗原上的任何抗原决定簇，并且由一个或多个氨基酸片段组成。表位可以是线性或构象表位，并且可以是连续的或不连续的。通常，线性表位是连续的，即由一段连续的氨基酸组成。构象表位可以是不连续的，即由两个或更多个不连续的氨基酸片段组成，当抗原折叠时，这些氨基酸片段聚集在一起形成表位。用于确定抗体是否结合相同表位的方法是本领域已知的。表位可以通过本技术领域熟知的标准方法定义或定位。例如，可以使用测定法(例如ELISA测定法)，利用肽文库或抗原的定点诱变(例如抗原的丙氨酸扫描)来定位表位。

如本文所使用的，参考两种或更多种抗体“与相同表位结合”意指抗体竞争结合抗原并结合抗原，重叠或包含连续或不连续的氨基酸片段。本领域技术人员理解短语“与相同表位结合”并不一定意味着抗体与完全相同的氨基酸结合。抗体结合的精确的氨基酸可以不同。例如，第一抗体可以结合由第二抗体结合的氨基酸片段完全包含的氨基酸片段。在另一示例中，第一抗体结合一个或多个氨基酸片段，所述氨基酸片段与由第二抗体结合的一个或多个片段显著重叠。为了本文的目的，认为这种抗体“结合相同的表位”。

抗体竞争测定可用于确定抗体是否与另一抗体“结合相同的表位”。此类测定是本技术领域公知的。通常，在第二抗体过量且第一抗体饱和所有位点的条件下，已知抗体中的70％或更多，例如70％，71％，72％，73％，74％，75％，80％，85％，90％，95％或更多和第二抗体竞争与表位相互作用，这表明抗体“结合相同的表位”。例如，评估两种抗体之间的竞争水平，可以使用放射免疫测定或可以使用利用抗体的其他标记(例如生物素)的测定。例如，在存在相同量的第二未标记抗体的情况下可以将抗原与缀合到标记化合物(例如，³H，¹²⁵I，生物素)上的饱和量的第一抗体或抗原结合片段一起孵育。然后对在未标记的封闭抗体存在的情况下与抗原结合的标记抗体的量进行评估，并将其与在没有未标记的封闭抗体存在的情况下的结合进行比较。通过将在未标记的封闭抗体存在的情况下与在没有未标记的封闭抗体存在的情况下进行比较的结合信号的百分比变化来确定竞争。因此，如果与在不存在封闭抗体的情况下的结合相比，在存在封闭抗体的情况下与标记抗体结合的抑制率为70％，则两种抗体之间存在70％的竞争。因此，提及第一和第二抗体之间的70％或更高的竞争，例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的竞争，意指(与第一抗体不存在时第二抗体结合抗原相比)第一抗体抑制70％、71％、72％、73％、74％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的第二抗体(或反之亦然)与抗原的结合。因此，第一抗体与抗原结合被第二抗体抑制70％、71％、72％、73％、74％、75％、80％、85％、90％、95％或更高，表明两种抗体结合相同的表位。在两个或更多个核酸或多肽序列的背景中，术语“相同”或“同一性”百分比是指两个或更多个相同的序列或子序列。如果使用以下序列比较算法之一或通过手动对齐和视觉检查测量，当在比较窗口上或者在指定区域上比较和对齐以获得最大对应关系时，两个序列具有指定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同(即在指定区域上，或者，当未指定时，在整个序列上，有60％同一性，任选65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％的同一性)，则两个序列是“基本相同的”。任选地，同一性存在于长度为至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或更优选长度为100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上。

用于比较的序列比对方法是本技术领域公知的。可以例如通过Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2:482c,1970的局部同源性比对算法；通过Needleman和WunschJ.Mol.Biol.48:443,1970的同源性比对算法；通过Pearson和Lipman Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444,1988的搜索相似性方法；通过这些算法的计算机化实现(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA(the Wisconsin Genetics Software Package,GeneticsComputer Group,Madison,WI))；或通过手动校准和视觉检查(参见例如Brent et al,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(ringbou ed.,2003))来执行用于比较的序列的优选比对。适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的两个示例是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别在Altschul et al,Nuc,AcidsRes.25:3389-3402,1977；和Altschul et al.J.Mol.Biol.215:403-410,1990中描述。

如本文所使用的，眼部退行性病况或病症是指以视网膜神经节细胞(RGC)的变性或死亡为特征或与其相关的眼病，或由受损TrkB信号传导活性介导或与之相关的眼疾。它们包括各种临床表现和病因。这些病症的示例包括青光眼，视神经损伤，视神经炎，视神经病，视网膜中央动脉阻塞和视网膜中央静脉阻塞。

青光眼是一种示例性的眼部退行性病症，其特征在于视神经的病理变化，在视盘上可见，以及相应的视野丧失，如果不治疗则导致失明。青光眼与眼压升高有关，但也涉及其他因素。青光眼包括更常见类型的开角型青光眼和不太常见的类型，例如闭角型青光眼和正常眼压性青光眼。目前治疗青光眼的方法是针对降低眼压。药物治疗包括局部眼药水或口服药物，这可减少眼内液的产生或增加眼内液的流出。然而，这些用于治疗青光眼的药物有时伴有明显的副作用，如头痛、视力模糊、过敏反应、心肺并发症死亡以及与其他药物的潜在相互作用。也使用手术疗法，但它们也有许多缺点和适度的成功率。

运动神经元疾病(MND)是选择性地影响运动神经元的几种神经疾病中的任何一种，所述运动神经元是控制身体的随意肌肉的细胞。它们包括例如肌萎缩侧索硬化(ALS)、遗传性痉挛性截瘫(HSP)、原发性侧索硬化(PLS)、进行性肌萎缩(PMA)、进行性延髓麻痹(PBP)和假性延髓麻痹。脊髓性肌萎缩症有时也包括在该组中。运动神经元疾病本质上是神经退行性疾病并且导致残疾增加并最终导致死亡。本文公开的TrkB激动剂抗体可用于治疗或改善这些疾病中的任何一种(例如ALS)的症状。

术语“受试者”是指人和非人动物(尤其是非人哺乳动物)。术语“受试者”在本文中例如与治疗和诊断方法相关联地使用，以指人或动物受试者。动物受试者包括但不限于动物模型，例如与视网膜神经节细胞变性或死亡相关的病况或病症的哺乳动物模型。非人类受试者的其他具体示例包括，例如牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴子。

术语“靶”、“靶分子”或“靶细胞”是指待分析或检测的感兴趣的分子或生物细胞，例如，其死亡将被调节的真核细胞。

本文使用的术语“治疗”("treat")，“治疗”("treating")，“治疗”("treatment")和“治疗上有效的”不一定意味着100％或完全治疗。相反，本领域普通技术人员认识到具有潜在益处或治疗效果的不同程度的治疗。在这方面，本发明的方法可以提供任何量的任何水平的治疗。此外，本发明方法提供的治疗可包括治疗所治疗疾病的一种或多种病况或症状。

原肌球蛋白受体激酶B(TrkB)，也称为酪氨酸受体激酶B，BDNF/NT-3生长因子受体或2型神经营养受体酪氨酸激酶，是人体中由NTRK2基因编码的蛋白。TrkB是脑源性神经营养因子(BDNF)的受体。Klein et al,Cell 61:647-56,1990；和Squinto et al.,Cell 65:885-93,1991。TrkB是几种“神经营养蛋白”的高亲和力催化受体，它们是诱导不同细胞群存活和分化的小蛋白生长因子。激活TrkB的神经营养因子是：BDNF(脑源性神经营养因子)，神经营养因子-4(NT4)和神经营养因子-3(NT-3)。因此，TrkB介导这些神经营养因子的多重作用，其包括神经元分化和存活。研究表明，TrkB受体的激活可导致CNS的细胞中KCC2氯化物转运蛋白的下调。

“载体”是复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒，其上可以连接另一个多核苷酸片段，以便引起连接片段的复制。能够指导编码一种或多种多肽的基因表达的载体称为“表达载体”。

III.TrkB激动剂抗体和相关的抗原结合分子

本发明提供特异性结合TrkB(例如，人TrkB)并激活TrkB信号传导途径的抗体或抗原结合片段。优选地，本发明的TrkB激动剂抗体具有与本文示例的TrkB激动剂抗体(例如表1中显示的抗体NFAT-85或抗体CRE-30)相同的结合特异性。因此，本发明包括具有与有重链CDR 1-3与轻链CDR 1-3序列的抗体的结合特异性相同的结合特异性的抗体或抗原结合片段，所述重链CDR 1-3与轻链CDR 1-3序列分别与(1)VSDNSGAWN(SBQ ID NO:65)

本发明的一些抗体可以与示例性抗体竞争结合TrkB。本发明的一些抗体与由本文举例说明的TrkB抗体中的一种所识别的表位相同的表位结合。本发明的一些抗体与TrkB上的相同表位以与本文示例的TrkB抗体之一的亲和力相同或相似的亲和力结合。在与TrkB结合后，本发明的一些抗体能够以与通过本文举例说明的TrkB抗体之一所使用的方式相同或相似的方式调节TrkB生物活性中的一种或多种或产生细胞应答(例如，MAPK，磷脂酶Cγ和/或PI3-K信号传导途径的活化)。

本发明的抗体包括完整抗体(例如IgG1抗体)、抗体片段或抗原结合片段(例如本文示例的scFv抗体)，其含有完整抗体的抗原结合部分，其保留结合同源的抗原的能力。典型的完整抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。本发明的功能性TrkB激动剂抗体包括具有它们的重链CDR序列和轻链CDR序列中的与示例性TrkB激动剂抗体的相应CDR序列相同或基本相同的至少一个CDR序列的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明的TrkB激动剂是衍生自示例性抗体的抗体片段或抗原结合分子。此类抗体片段的示例包括(i)Fab片段，由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')₂片段，其包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由V_H和C_H1结构域组成的Fd片段；(iv)由完整抗体的单臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段；(v)二硫键稳定的Fv(dsFv)，其具有在结构上保守的框架区之间工程化的链间二硫键；(vi)由V_H或V_L结构域组成的单结构域抗体(dAb)(参见，例如，Ward et al.，Nature 341:544-546，1989)；以及(vii)作为线性或环状肽的分离的互补决定区(CDR)。

本发明的抗体还包括单链抗体。术语“单链抗体”是指多肽连接中包含V_H结构域和V_L结构域的多肽，其通常通过间隔肽或接头序列连接，并且可以在氨基-和/或羧基-末端处包含额外的结构域或氨基酸序列。例如，单链抗体可包含用于连接编码多核苷酸的系链片段。例如，单链可变区片段(scFv)是单链抗体。与由分离的基因(separate genes)编码的Fv片段的V_L和V_H结构域相比，scFv具有通过合成接头连接(例如，通过重组方法)的两个结构域。这使得它们能够作为单个蛋白链制造，其中V_L和V_H区配对以形成单价分子。本发明的一些scFv TrkB激动剂抗体显示在表1中。这些scFV抗体的V_L和V_H序列以及连接接头序列示于表2中。

如本文举例说明的，scFv TrkB激动剂抗体可以与IgG的Fc结构域融合，以提供scFv-Fc融合分子。与Fc结构域的融合提供了许多有益的生物学和药理学性质。例如，Fc结构域的存在可显著增加杂交分子的血浆半衰期，由于其与补救新生儿Fc受体的相互作用以及用于较大尺寸分子的较慢肾清除，其延长了治疗活性。此外，添加Fc区还可以改善融合配偶体的溶解度和稳定性，并且允许在制造期间通过蛋白-G/A亲和层析进行简单的成本有效的纯化。含有scFv抗体片段和融合配偶体如Fc结构域的杂合或融合分子可以根据标准重组技术、常规实施的蛋白合成方法或本文所述的方案容易地产生。

本发明的抗体还包括具有骆驼科支架的单结构域抗原结合单元。骆驼科的动物包括骆驼、美洲驼和羊驼。骆驼科动物产生缺乏轻链的功能性抗体。重链可变(V_H)结构域自主折叠并独立地作为抗原结合单元起作用。与经典抗原结合分子(Fab)或单链可变片段(scFv)中的六种CDR相比，其结合表面仅涉及三个CDR。骆驼科动物抗体能够获得与常规抗体结合亲和力相当的结合亲和力。

除了最初通过功能筛选鉴定的本文示例的TrkB激动剂抗体之外，本发明的各种其他抗体或抗原结合片段还可以通过完整抗体的酶促或化学修饰产生，或者使用重组DNA方法学从头合成，或使用噬菌体展示文库鉴定。作为示例，表1中所示的特异性scFv抗体可以通过标准重组技术容易地转化为scFv-Fc融合体，例如通过克隆到本文所述的pFUSE IgG骨架载体中而转化为scFv-Fc融合体。可以用于产生本发明的其他TrkB激动剂抗体或抗原结合分子的其他方法都是本领域公知的。例如，可以使用噬菌体展示文库或核糖体展示文库、基因改组文库鉴定单链抗体(参见，例如，McCafferty et al.,Nature 348:552-554,1990；和美国专利No.4,946,778)。特别地，scFv抗体可以使用例如Bird et al.,Science 242:423-426,1988；和Huston et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883,1988中描述的方法获得。如Skerra和Plickthun，Science 240：1038 41，1988中所述，可以产生Fv抗体片段。可以使用例如Reiter et al,Int.J.Cancer 67:1 13-23,1996中描述的方法制备二硫化物稳定的Fv片段(dsFv)。类似地，单结构域抗体(dAb)可以通过例如在Ward et al.,Nature 341:544-546,1989；和Cai and Garen,Proc.Natl,Acad.Sci.USA 93:6280-85,1996中描述的多种方法产生。可以使用本领域公知的方法产生骆驼科动物单结构域抗体，公知的方法例如Dumoulin et al.,Nat.Struct.Biol.11:500-515,2002；Ghahroudi etal.,FEBS Letters 414:521-526,1997；和Bond et al.,J.Mol.Biol.332:643-55,2003。其他类型的抗原结合片段(例如，Fab，F(ab')₂或Fd片段)也可以用常规实施的免疫学方法容易地产生。参见，例如，Harlow&Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1998。

在一些实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段具有其重链CDR1、CDR2和CDR3序列和/或其轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，其与表1中所示抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3序列和/或轻链CDR1、CDR2和CDR3序列基本相同。示例性抗体的轻链和重链CDR序列均在表2中示出。在这些实施方案的一些中，抗体或抗原结合片段具有重链CDR1-3序列和轻链CDR1-3序列，该重链CDR1-3序列和轻链CDR1-3序列基本上与(1)SEQ ID NO:46-49，AAS和SEQ ID NO:50；(2)SEQ ID NO:51-56；(3)SEQ ID No:51-53，57，58和56；(4)SEQ ID No:51-53，57，55和56；(5)SEQ ID No:51-55和59；(6)SEQ ID No:51，52，60，57，61和56；(7)SEQ ID No:46，47，62，63，YDS和SEQ ID NO:64；(8)SEQ ID No:65-68，GKN和SEQ ID NO:69；(9)SEQ ID No:70-72和54-56；或(10)SEQ ID No:65-68，GKN和SEQ ID NO:73相同。

在这些实施方案的一些中，序列同一性的百分比可以至少为91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或者至少99％，或甚至100％。因此，本发明的一些抗体或抗原结合片段含有相应地与至少一个示例性抗体的相应CDR具有至少90％的同一性的重链CDR1-3和/或轻链CDR1-3序列。这些抗体中的一些含有相应地与至少一个示例性抗体的相应CDR具有至少95％的同一性的重链CDR和/或轻链CDR序列。在本发明的一些其他抗体或抗原结合片段中，重链CDR序列和/或轻链CDR序列分别与示例抗体之一的相应CDR具有至少95％的同一性。在一些实施方案中，抗体的重链CDR1-CDR3和轻链CDR1-CDR3序列分别与以(1)SEQ ID NO:46-49，AAS和SEQ ID NO:50；(2)SEQ ID NO:51-56；(3)SEQ ID No:51-53，57，58和56；(4)SEQ ID No:51-53，57，55和56；(5)SEQ ID NO:51-55和59；(6)SEQ ID No:51，52，60，57，61和56；(7)SEQ ID NO:46，47，62，63，YDS和SEQ ID NO:64；(8)SEQ ID No:65-68，GKN和SEQ ID NO:69；(9)SEQ ID NO:70-72和54-56；或(10)SEQID No:65-68，GKN和SEQ ID NO:73所示的序列相同。在其他实施方案中，特异性结合人TrkB的抗体或抗原结合片段含有(a)与SEQ ID NO:14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36或38基本相同的重链可变区，(b)与SEQ ID NO:15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37或39基本相同的轻链可变区，或(c)(a)的重链可变区和(b)的轻链可变区两者。在一些实施方案中，抗体包含(a)的重链和(b)的轻链。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段含有(a)与SEQ ID NO:14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36或38中的任一个具有至少90％的同一性的重链可变结构域；(b)与SEQ ID NO:15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37或39中的任一个具有至少90％的序列同一性的轻链可变结构域，或(c)(a)的重链和(b)的轻链两者。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段含有与SEQ ID NO:15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37或39中的任一个具有至少90％的同一性的轻链可变结构域。在这些实施方案的一些中，序列同一性的百分比可以是至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，或甚至100％。在一些实施方案中，轻链可变结构域与SEQ ID NO:15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37或39中的任一个具有至少95％的同一性；在一些实施方案中，轻链可变结构域与SEQ ID NO:15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37或39中的任一个具有100％的同一性。在一些其他实施方案中，抗体或抗原结合片段含有与SEQ ID NO:14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36或38中的任一个具有至少90％同一性的重链可变结构域。在其他实施方案中，百分比同一性可以是至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，或甚至100％。在一些实施方案中，重链可变结构域与SEQ ID NO:14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36或38中的任一个具有至少95％的同一性。在一些实施方案中，重链可变结构域与SEQ ID NO:14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36和38中的任一个具有100％的同一性。

除了如上所述的重链之外，本发明的抗体或抗原结合片段还可以包含使用连续幼稚链改组选自Fab文库的轻链。同样地，除了如上所述的轻链之外，本发明的抗体还可以包含使用连续的幼稚链改组从Fab文库中选择的重链。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段可含有如本文所述的与任何合适的轻链(例如本文举例说明的那些)组合的任何重链(例如，以SEQ ID NO:14，16，28，20，22，24，26，28，30，32，34，36和38所示的重链)。同样地，抗体可包含如上所述的与任何合适的重链(例如本文举例说明的那些)组合的任何轻链(例如，以SEQ ID NO:15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37和39中所示的轻链)。例如，在一些优选的实施方案中，抗体含有重链可变区序列和轻链可变区序列，它们分别与SEQ ID NO:14和15，SEQ ID NO:16和17，SEQ ID NO:18和19，SEQ ID NO:20和21，SEQ IDNO:22和23，SEQ ID NO:24和25，SEQ ID NO:26和27，SBQ ID NO:28和29，SEQ ID NO:30和31，SEQ ID NO:32和33，SEQ ID NO:34和35，SEQ ID NO:36和37，或SEQ ID NO:38和39具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，抗体可含有分别以SEQ ID NO:14和15，SEQ ID NO:16和17，SEQ ID NO:18和19，SEQ ID NO:20和21，SEQ ID NO:22和23，SEQ ID NO:24和25，SEQ ID NO:26和27，SEQ ID NO:28和29，SEQ ID NO:30和31，SEQ ID NO:32和33，SEQ IDNO:34和35，SEQ ID NO:36和37，或SEQ ID NO:NO:38和39显示的重链和轻链序列。在各种实施方案中，例如，可以将肽序列的百分比(％)同一性计算成100×[(相同的位置)/min(TGA，TGB)]，其中TGA和TGB是在使TGA和TGB最小化的比对中在肽序列A和B中的残基数和内部缺口位置的总和。参见，例如，Russell et al.,J.Mol.Biol.,244:332-350(1994)。

本发明的抗体或抗原结合片段可以是包括全长抗体或抗体片段的任何抗体，所述全长抗体或抗体片段特异性识别TrkB(例如，人TrkB)的细胞外结构域或以与本文举例说明的任何一个TrkB激动剂抗体(表1)的特异性相同的特异性结合TrkB(例如，人TrkB)的细胞外结构域。本发明的TrkB抗体优选是单克隆的。它们可以是重组、嵌合、人源化或完全人抗体。此外，抗体可以是任何同种型，其包括但不限于IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。因此，例如，抗体可以是任何IgA，例如IgA1或IgA2，或任何IgG，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，或合成IgG。抗体也可以是对人TrkB的细胞外结构域具有特异性的任何抗体片段，例如F(ab)2,Fv,scFv,IgGACH2,F(ab')2,scFv2CH3,Fab,VL,VH,scFv4,scFv3,scFv2,dsFv,Fv,scFv-Fc,(scFv)2，双特异性抗体和二价抗体。抗体可以是任何修饰的或合成的抗体，包括但不限于非消耗性IgG抗体，CAR，或抗体的其他Fc或Fab变体。

在一些实施方案中，本发明提供抗体或抗原结合片段，其是本文示例的抗TrkB抗体的保守修饰的变体。通常，这些变体的可变区除了在一个或多个氨基酸残基处的保守取代之外，具有与这些示例序列之一相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗原片段特异性结合TrkB并含有(a)至少一种HCDR，其具有选自SEQ ID No:46-48，51-53，60，62，65-67，和70-72的序列；和/或(b)至少一个LCDR，其具有选自SEQ ID No:49，50，54-59，61，63，64，68，69和73的序列，以及序列AAS，YDS和GKN。本发明还提供TrkB激动剂抗体，其特异性结合TrkB并含有前述CDR序列的一种或多种变体或基本相同的CDR序列。这些抗体中的变体CDR序列可以在选自SEQ ID NO:46-73和序列AAS、YDS和GKN的序列中包括1，2或3个取代、插入、缺失或其组合。例如，重组嵌合或人源化抗体(或其片段)可包括一个、两个、三个、四个、五个或六个前述CDR序列。

在一些实施方案中，本发明的TrkB激动剂抗体或抗原结合片段包括表1中的抗体的相同轻链或重链的三个CDR序列。这些包括例如以(1)SEQ ID No:49，AAS和SEQ ID NO:50，(2)SEQ ID NO：54-56，(3)SEQ ID No:57，58和56，(4)SEQ ID No:57，55和56，(5)SEQ IDNo:54，55和59，(6)SEQ ID No:57，61和56，(7)SEQ ID NO:63，YDS和SEQ ID NO:64，(8)SEQID NO:68，GKN和SEQ ID NO:69，和(9)SBQ ID NO:68，GKN和SEQ ID NO:73所示的轻链CDR；或以(1)SEQ ID NO:46-48，(2)SEQ ID NO:51-53，(3)SEQ ID No:51，52，60，(4)SEQ ID No:46，47，和62，(5)SEQ ID No:65-67，和(6)SEQ ID No:70-72所示的重链CDR。在一些实施方案中，本发明的TrkB激动剂抗体或抗原结合片段可含有相同抗体的六个CDR序列，例如，(1)SEQ ID NO:46-49，AAS和SEQ ID NO:50(抗体CRE-6)；(2)SEQ ID NO:51-56(抗体CRE-30或CRE-83)；(3)SEQ ID NO:51-53，57，58和56(抗体CRE-31或CRE-53)；(4)SEQ ID No:51-53，57，55和56(抗体CRE-39或NFAT-79)；(5)SEQ ID No:51-55和59(抗体CRE-87)；(6)SEQ IDNO:51，52，60，57，61和56(抗体CRE-93)；(7)SEQ ID No:46，47，62，63，YDS和SEQ ID NO:64(抗体NFAT-27)；(8)SEQ ID No:65-68，GKN和SEQ ID NO:69(抗体NFAT-40)；(9)SEQ ID No:70-72和54-56(抗体NFAT-44)；或(10)SEQ ID No:65-68，GKN和SEQ ID NO:73(抗体NFAT-85)。

在一些实施方案中，本发明提供了抗体或抗原结合片段，其对TrkB的亲合力为约10μM或更低，5μM或更低，2μM或更低，1μM或更低，500nM或更低，400nM或更少，300nM或更少，或200nM或更少。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段以约100nM或更低，约75nM或更低，约50nM或更低，约25nM或更低，约10nM或更低，或约5nM或更少的亲合力结合TrkB。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段以约1nM或更低，约800pM或更低，约700pM或更低，约600pM或更低，约500pM或更低，约400pM或更低，约300pM或更低，约200pM或更低，或约100pM或更低的亲合力结合TrkB。可以使用本技术领域已知的技术(例如ELISA或表面等离子体共振)测量亲合力。

本发明的抗体可以通过任何合适的技术产生，例如，使用任何合适的真核或非真核表达系统。在某些实施方案中，使用哺乳动物表达系统产生抗体。本文举例说明了用于产生本发明的抗体或抗原结合片段的一些特定技术。在一些实施方案中，可以使用合适的非真核表达系统(例如细菌表达系统)产生本发明的抗体或抗原结合片段。细菌表达系统可用于产生片段，例如F(ab)2，Fv，scFv，IgGACH2，F(ab')2，scFv2CH3，Fab，VL，VH，scFv4，scFv3，scFv2，dsFv，Fv，scFv-Fc，(scFv)2和双特异性抗体。用于改变DNA编码序列以产生此类片段的技术是本技术领域已知的。

可以使用任何类型的合适缀合将本发明的抗体或抗原结合片段缀合至合成分子。重组工程和掺入的硒代半胱氨酸(例如，如2014年12月23日公布的美国专利8,916,159中所述)可用于缀合合成分子。其他缀合方法可包括与天然或工程化赖氨酸侧链胺或半胱氨酸侧链硫醇的共价偶联。参见，例如，Wu et al.,Nat.Biotechnol,23:1 137-1 146(2005)。合成分子可以是任何分子，例如靶向目标分子的分子(例如，细胞表面受体)。在一些实施方案中，用于与抗体缀合的合成分子是蛋白(例如抗体)或RNA或DNA适体。在一些实施方案中，本发明的TrkB激动剂抗体(例如，scFv分子)作为双特异性分子或多特异性分子中的组分存在。通常，本发明的双特异性或多特异性化合物含有TrkB激动剂抗体或抗原结合片段，其与至少一种特异性识别目标靶标(例如TrkC或TNFα)的其他结合部分共价或非共价缀合。结合部分可以是任何化学性质的分子，例如另一种抗体或抗原结合片段，多肽或肽试剂，或小分子试剂。在一些实施方案中，本发明的多特异性分子是双特异性抗体，其含有TrkB激动剂抗体和本技术领域公知的另一种抗体或抗原结合片段，例如，如本文举例说明的TNFα抗体阿达木单抗。在各种实施方案中，这些双特异性或多特异性分子中的其他结合部分可以是依决洛单抗(Edrecolomab)、卡罗单抗(capromab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、阿昔单抗(abciximab)、利妥昔单抗、巴利昔单抗、英夫利昔单抗、西妥昔单抗、本妥昔单抗(brentuximab)、西妥昔单抗(siltuximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、曲妥珠单抗、阿仑单抗、奥马珠单抗(omalizumab)、贝伐单抗、那他珠单抗、兰尼单抗、依库珠单抗、塞妥珠单抗、培妥珠单抗、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、维多珠单抗、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、依达赛珠单抗(Idarucizumab)、美泊利单抗、阿达木单抗、帕尼单抗、卡那津单抗(canakinumab)、戈利木单抗、奥法木单抗、优特克单抗、狄诺塞麦(denosumab)、贝利木单抗(belimumab)、伊匹单抗(ipilinumab)、瑞西巴库(Raxibacumab)、纳武单抗(nivolumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、阿利库单抗(alirocumab)、达雷木单抗(daratumumab)、依洛尤单抗(evolocumab)、耐昔妥珠单抗(neciturmumab)和苏金单抗(secukinumab)。在一些其他实施方案中，本发明的多特异性分子是双特异性小分子抗体缀合物。相对于单特异性抗体，此类双特异性化合物会导致增强的药物功效和/或期望的靶向操作。

IV.多核苷酸、载体和用于产生TrkB抗体的宿主细胞

本发明提供了基本上纯化的多核苷酸(DNA或RNA)，其与编码包含本文所述抗体链或抗原结合分子的片段或结构域的多肽的序列相同或互补。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸编码表1中所示的重链和/或轻链结构域序列。当从适当的表达载体表达时，由这些多核苷酸编码的多肽能够表现出抗原结合能力。本发明还提供了编码来自本文所述抗体的重链或轻链的至少一个CDR区并且通常所有三个CDR区的多核苷酸。一些其他多核苷酸编码示例性抗体的重链和/或轻链的全部或基本上所有可变区序列。例如，这些多核苷酸中的一些编码以SEQ ID NO:14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36或38中的任何一个所示的重链可变区的氨基酸序列，和/或以SEQ ID NO:15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37或39中任何一个所示的轻链可变区的氨基酸序列。由于对于代码的简并性，各种核酸序列将编码免疫球蛋白氨基酸序列中的每一种。

本发明的多核苷酸可仅编码示例性抗体的可变区序列。它们还可以编码抗体的可变区和恒定区。本发明的核酸的一些多核苷酸序列编码成熟的重链可变区序列，其与以SEQID NO：14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36或38中任何一个所示的成熟重链可变区序列基本相同(例如，至少80％，90％或99％相同)。一些其他多核苷酸序列编码与以SEQ IDNO:15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37或39中任一个所示的成熟轻链可变区序列基本相同的成熟轻链可变区序列。一些多核苷酸序列编码包含示例性抗体中的一个的重链和轻链两者的可变区的多肽。一些其他多核苷酸编码分别与示例性抗体中的一个的重链和轻链的可变区基本相同的两个多肽片段。

多核苷酸序列可以通过从头固相DNA合成或通过PCR诱变产生编码示例性功能性抗体的现有序列(例如，如下文实施例中所述的序列)来产生。核酸的直接化学合成可以通过本技术领域已知的方法完成，已知的方法例如Narang et al.,Meth.Enzymol.68:90,1979中的磷酸三酯方法；Brown et al.,Meth Enzymol.68:109,1979中的磷酸二酯方法；Beaucage et al.,Tetra.Lett.,22:1859,1981中的二乙基亚磷酰胺方法；和美国专利No.4,458,066的固体支持方法。通过PCR引入多核苷酸序列的突变可以如例如在PCRTechnology:Principles and Applications for DNA Amplification,HA.Erlich(Ed.),Freeman Press,NY,NY,1992；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Innis et al.(Ed.),Academic Press,San Diego,CA 1990；Mattila et al.,NucleicAcids Res.19:967,1991；和Eckert et al.,PCR Methods and Applications 1:17,1991中所述进行。

本发明还提供了用于产生本文所述功能性抗体的表达载体和宿主细胞。用于表达抗体的基于慢病毒的载体的具体示例描述于以下实施例中。还可以使用各种其他表达载体来表达编码功能性抗体链或结合片段的多核苷酸。基于病毒的表达载体和非病毒表达载体均可用于在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包括：质粒，附加型载体(通常具有用于表达蛋白或RNA的表达盒)，以及人工染色体(参见例如Hrrington et al.,Nat.Genet.15:345,1997)。例如，用于在哺乳动物(例如人)细胞中表达抗体多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pCEP4，pREP4，pThioHis A，B&C，pcDNA3./His，pEBVHis A，B&C(Invitrogen，San Diego，CA)，MPSV载体和本技术领域已知的用于表达其他蛋白的许多其他载体。其他有用的非病毒载体包括Sleeping Beauty、PiggyBack和其他转座子系统。有用的病毒载体包括基于慢病毒或其他逆转录病毒的载体，腺病毒，腺相关病毒，疱疹病毒，基于SV40的载体，乳头瘤病毒，HBP Epstein Barr病毒，牛痘病毒载体和Semliki Forest病毒(SFV)。参见Brent et al.,supra；Smith,Annu.Rev.Microbiol.49:807,1995；和Rosenfeidet al.,Cell 68:143,1992。

表达载体的选择取决于要在其中表达载体的预期宿主细胞。通常，表达载体含有与编码功能性抗体链或片段的多核苷酸可操作地连接的启动子和其他调节序列(例如增强子)。在一些实施方案中，除了在诱导条件下外，使用诱导型启动子来阻止插入序列的表达。诱导型启动子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。转化生物体(organism)的培养物可以在非诱导条件下扩增，而不会使群体偏好编码所表达产物被宿主细胞更好地耐受的序列。除了启动子之外，还可能需要或期望其他调节元件以有效表达功能性抗体链或片段。这些元件通常包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其他序列。此外，通过包含适合于使用中的细胞系统的增强子可以增强表达效率(参见，例如，Scharf et al,Results Probl.Cell Differ.20；125,1994；和Bittner et al,Meth.Enzymol,153:516,1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可用于增加哺乳动物宿主细胞中的表达。

表达载体还可以提供分泌信号序列位置，以与由插入的功能性抗体序列编码的多肽形成融合蛋白。更常见的是，插入的功能性抗体序列在包含在载体中之前与信号序列连接。用于接收编码功能性抗体轻链和重链可变结构域的序列的载体有时也编码恒定区或其部分。此类载体允许可变区表达为具有恒定区的融合蛋白，从而导致完整抗体或其片段的产生。通常，这种恒定区是人的。

用于包含(harbor)和表达功能性抗体链的宿主细胞可以是原核的或真核的。在一些优选的实施方案中，哺乳动物宿主细胞用于表达和产生本发明的抗体多肽。例如，它们可以是表达内源免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系或包含外源表达载体的哺乳动物细胞系。这些包括任何正常的凡人或正常或异常的不朽动物或人类细胞。除了本文举例说明的细胞系外，本领域还已知许多能够分泌完整免疫球蛋白的其他合适的宿主细胞系。这些包括例如CHO细胞系，各种HEK 293细胞系，各种Cos细胞系，HeLa细胞，骨髓瘤细胞系，转化的B细胞和杂交瘤。哺乳动物组织细胞培养物用于表达多肽的用途通常在例如Winnacker,From Genesto Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987中讨论。哺乳动物宿主细胞的表达载体可包括表达控制序列，例如复制起点，启动子和增强子，以及必要的加工信息位点，例如核糖体结合位点，RNA剪接位点，多腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有衍生自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异性的、阶段特异性的和/或可调制的或可调节的。有用的启动子包括但不限于本文例示的EF1α和人UbC启动子，金属硫蛋白启动子，组成型腺病毒主要晚期启动子，地塞米松诱导型MMTV启动子，SV40启动子，MRP pol III启动子，组成型MPSV启动子，四环素诱导性CMV启动子(例如人类立即早期CMV启动子)，组成型CMV启动子和本技术领域已知的启动子-增强子组合。

用于引入含有目标多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转化通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主(参见Sambrook et al.,Molecular Cloning；A Laboratory Manual,Cold Spring HarborPress(3^rd,2001))。其他方法包括，例如电穿孔，磷酸钙处理，脂质体介导的转化，注射和显微注射，冲击法，病毒微体，免疫脂质体，聚阳离子：核酸缀合物，裸DNA，人工病毒粒子，融合疱疹病毒结构蛋白VP22(Elliot and O'Hare，Cell 88：223，1997)，代谢增强的DNA摄取，以及离体转导。对于长期的高产量的重组蛋白生产，通常需要稳定表达。例如，可以使用本发明的表达载体制备稳定表达抗体链或结合片段的细胞系，所述表达载体含有病毒复制起点或内源表达元件和选择性标记基因。在引入载体后，可以使细胞在富集培养基中生长1-2天，然后将它们转换为选择性培养基。选择标记的目的是赋予对选择的抗性，并且其存在允许细胞生长，从而在选择性培养基中成功表达引入的序列。使用适合细胞类型的组织培养技术可以增殖抗性稳定转染的细胞。

V.治疗应用

本文公开的TrkB抗体可用于各种治疗应用中。本发明的一些方法涉及在表达TrkB的细胞(例如视网膜神经节细胞)中诱导TrkB信号传导途径的激活或增强其信号传导活动。这些方法可用于细胞的体外或体内修饰。在这些方法中，通常使治疗有效量的本发明的TrkB激动剂与细胞接触。本发明的一些其他方法涉及促进哺乳动物受试者中视网膜神经节细胞的再生或存活。例如，这些方法可用于恢复、改善或保持患有眼部退行性病症或有发展眼部退行性病症风险的受试者眼睛的视觉功能。本发明的一些其他方法涉及治疗患有眼部退行性病症或有发展眼部退行性病症风险的受试者或预防受试者患上眼部退行性病症或发展眼部退行性病症的风险。在这些方法中，向受试者施用含有治疗有效量的本发明的TrkB激动剂的药物组合物。除含有本发明的TrkB抗体的药物组合物外，本发明的治疗应用还可利用本文所述的编码和表达抗体的多核苷酸或载体。例如，含有编码本发明多核苷酸或载体的抗体的组合物可用于本文所述的各种神经变性疾病的基因治疗。

许多眼部退行性病症适合于用本发明的治疗方法进行治疗性或预防性治疗。这些包括以视网膜神经节细胞(RGC)的变性或死亡为特征或与其相关的任何眼部疾病或病症。这些疾病或病症的具体示例包括例如青光眼、视神经损伤、视神经炎、视神经病、视网膜中央动脉阻塞和视网膜中央静脉阻塞。可以适合用本发明的治疗性抗体组合物治疗的其他眼部疾病包括例如糖尿病性神经病，包括湿性和干性形式的年龄相关性黄斑变性(AMD)在内的黄斑变性，前部缺血性眼神经病(AION)，缺血性视网膜病，糖尿病性视网膜病，早产儿视网膜病，色素沉着炎和视网膜变性。

在一些实施方案中，本发明提供了通过使细胞与本发明的抗体或抗原结合片段接触来增强表达TrkB(例如视网膜神经节细胞)的细胞中的TrkB信号传导活性的方法。在一些相关的实施方案中，本发明的TrkB激动剂可用于促进受试者中视网膜神经节细胞的存活或再生。在这些实施方案中，视网膜神经节细胞的功能完整性可以由于施用的TrkB激动剂引起的更新的TrkB信号传导活性而得以保留或恢复。在各种实施方案中，施用的TrkB激动剂抗体或抗原结合片段可以是裸(未缀合的)分子或与合成分子缀合的抗体分子，例如靶向部分或另一种治疗剂。该方法可用于在体外或受试者(即体内)中上调细胞中的TrkB信号传导。接触的表达TrkB的细胞可以存在于例如与异常或受损的TrkB信号传导激活或信号传导活动相关的疾病或以视网膜神经节细胞的变性或死亡为特征的疾病的细胞培养物或动物模型中。

在一些其他实施方案中，本发明提供了用于治疗需要增强的TrkB信号传导的受试者的方法。这包括患有、怀疑患有或有风险发生与TrkB信号传导活动受损相关的疾病或可通过增强的TrkB信号传导治疗的疾病(例如运动神经元疾病，例如肌萎缩侧索硬化症(ALS))的受试者。在一些实施方案中，本发明提供了促进运动神经元的存活、再生和突触功能的方法。这些方法可用于治疗患有各种运动神经元疾病的受试者，这些疾病包括ALS，特发性运动神经病，遗传性痉挛性截瘫(HSP)，原发性侧索硬化症(PLS)，进行性肌萎缩症(PMA)，进行性延髓麻痹(PBP)和假性延髓麻痹，贝尔麻痹或脊髓性肌萎缩症(SMA)。在一些其他实施方案中，本发明提供了用于促进中枢神经系统(CNS)神经元的存活、再生和突触功能的方法。这些方法可以容易地用于治疗患有CNS退行性疾病的受试者。许多CNS退行性疾病或病症适合用本发明的治疗组合物治疗。这些包括例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病和图雷特综合征。

本发明的一些治疗方法特别涉及治疗患有以视网膜神经节细胞变性或死亡为特征的眼病或有发展该眼病的风险的受试者。这些包括许多眼部退行性病症，例如青光眼、视神经损伤、视神经炎、视神经病、视网膜中央动脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、糖尿病性神经病、包括湿性和干性形式的年龄相关性黄斑变性(AMD)在内的黄斑变性、前缺血性眼神经病变(ΑIΟΝ)或糖尿病性视网膜病变。

通常，本文所述的各种治疗方法包括向受试者施用含有本发明的治疗有效量的分离或纯化的TrkB激动剂抗体或抗原结合片段(或表达抗体的多核苷酸或载体)的药物组合物。抗体可以是如本文表1中所述的本发明的任何抗-TrkB激动剂抗体或其衍生物，例如衍生自抗体NFAT-85的抗体和/或具有与NFAT-85的结合特异性相同的结合特异性。因此，施用的抗体可以是合成的、嵌合的、人源化的或完全人抗体或抗原结合片段。其可以是F(ab)2、Fv、scFv、IgGACH2、F(ab')2、scFv2CH3、Fab、VL、VH、scFv4、scFv3、scFv2、dsFv、Fv或(scFv)2。在一些实施方案中，该方法包括施用IgG、scFv、dsPv、F(ab')2、双特异性抗体或二价抗体。在一些实施方案中，施用的抗体或抗原结合片段可以与另一种治疗剂(例如用于治疗眼部退行性病症的已知药物或化合物)或其他药剂(例如靶向剂)缀合。

本发明的TrkB激动剂抗体可以与其他已知试剂组合以用于促进TrkB信号传导和用于治疗眼部退行性病症。这些已知的TrkB激动剂化合物包括例如神经营养因子BDNF和神经营养因子模拟物。已知的TrkB激动剂化合物的具体示例包括，例如，L-783,281腺苷，CGS21680等。参见，例如，Pollack et al.Curr.Drug Targ-CNS and Neurol.Disorders 1:59-80 2002。TrkB激动剂化合物也可以是模拟神经营养蛋白的关键区域的小分子。例如，小分子可以是BDNFβ-转角环的模拟物。可根据本发明使用的此类小分子模拟物的具体示例描述于，例如，美国公开申请No.2007/0060526。优选地，用于本发明方法的TrkB激动剂抗体和其他已知的TrkB激动剂化合物对TrkB具有选择性并且相比于TrkA或TrkC在更大程度地激活TrkB。在一些实施方案中，所使用的药剂对TrkB具有特异性，并且不激活TrkA或TrkC。

在一些治疗应用中，本发明的TrkB激动剂抗体可以与其他已知的药物或方案组合使用，以治疗视神经病或视网膜变性病，例如青光眼。例如，抗体可以与任何现有的IOP降低药物一起使用。这些已知药物包括例如前列腺素类似物，如适利达(Xalatan)(拉坦前列素)和卢美根(Lumigan)(比马前列素(bimatroprost))，β受体阻滞剂，如噻吗洛尔(timolol)，倍他洛尔(betaxolol)和美替洛尔(metipranolol)。除治疗性IOP降低药物外，还有许多批准的引流装置可与本发明的抗体组合使用。

在一些实施方案中，本发明的TrkB激动剂抗体或抗原结合分子当用于本文所述的治疗方法时可以与靶向部分缀合。靶向部分可以是蛋白或肽，其指导定位于身体的某一部分，例如，定位于脑或其中的隔室。在一些实施方案中，TrkB抗体激动剂可以与脑靶向部分连接或融合。脑靶向部分可以共价(例如，直接、翻译融合，或通过直接或经由间隔分子(其可任选地可裂解)化学连接)附接或非共价(例如通过可逆相互作用，例如抗生物素蛋白、生物素、蛋白A、IgG等)附接。与本发明的TrkB抗体激动剂缀合的脑靶向部分可以增强TrkB激动剂的脑递送。在本发明的实践中，许多试剂可用作脑靶向部分。这些包括可以通过血脑屏障(BBB)递送融合蛋白或治疗剂的多肽或抗体片段。此类药剂的实例包括单结构域抗体FC5(Abulrob et al.J.Neurochem.95,1201-1214,2005)；mAB 83-14，人胰岛素受体的单克隆抗体(Pardridge et al.Pharmacol Res.12,807-816,1995)；结合人转铁蛋白受体(hTfR)的B2、B6和B8肽(Xia et al.，J.Virol.74，159-11366，2000)；转铁蛋白受体的OX26单克隆抗体(Pardridge et al.J.Pharmnacol.Exp.Ther.259,66-70,1991)；以及美国专利No.6,306,365中描述的几种多肽。

VI.药物组合物和组合

本发明提供了使用本发明的TrkB激动剂制备用于治疗眼部退行性疾病(例如青光眼)的药物的方法。需要治疗或减轻这种病症的受试者可以单独施用本发明的TrkB激动剂。然而，更优选施用含有TrkB激动剂和药学上可接受的载体的药物组合物。可以在药物组合物中使用的本发明的TrkB激动剂的示例包括本文所述的任何TrkB激动剂抗体或抗原结合分子。示例性组合物包括一种或多种具有成熟重链和轻链可变结构域序列的抗体，所述成熟重链和轻链可变结构域序列分别以SEQ ID NO:14和15，SEQ ID NO:16和17，SEQ ID NO:18和19，SEQ ID NO:20和21，SEQ ID NO:22和23，SEQ ID NO:24和25，SEQ ID NO:26和27，SEQ ID No:28和29，SEQ ID NO:30和31，SEQ ID NO:32和33，SEQ ID No:34和35，SEQ IDNo:36和37，或SEQ ID No:38和39显示。在一些实施方案中，抗体可含有分别以SEQ ID NO:14和15，SEQ ID NO:16和17，SEQ ID NO:18和19，SEQ ID NO:20和21，SEQ ID NO:22和23，SEQ ID NO:24和25，SEQ ID NO:26和27，SEQ ID No:28和29，SEQ ID NO:30和31，SEQ IDNO:32和33，SEQ ID No:34和35，SEQ ID No:36和37，或SEQ ID No:38和39显示的重链和轻链序列。适用于本发明药物组合物的其他抗体包括以SEQ ID NO:14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36或38所示的成熟链序列和/或如以SEQ ID NO:15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37或39所示的成熟轻链序列的那些抗体。

本发明另外的示例性治疗组合物可含有具有选自SEQ ID NO:46-73和序列AAS、YDS和GKN中的一个，两个，三个，四个，五个，六个CDR的抗体。然而，在一些实施方案中，抗体包括表1中所示的相同示例性轻链或重链的三个CDR序列。在一些实施方案中，药物组合物包含具有表1中例示的相同抗体的六个CDR序列的抗体，例如，(1)SEQ ID NO:46-49，AAS和SEQ ID NO:50(抗体CRE-6)；(2)SEQ ID NO:51-56(抗体CRE-30或CRE-83)；(3)SEQ ID No:51-53，57，58和56(抗体CRE-31或CR-53)；(4)SEQ ID No:51-53，57，55和56(抗体CRE-39或NFAT-79)；(5)SEQ ID No:51-55和59(抗体CRE-87)；(6)SEQ ID No:51，52，60，57，61和56(抗体CRE-93)；(7)SEQ ID No:46，47，62，63，YDS和SEQ ID NO:64(抗体NFAT-27)；(8)SEQID No:65-68，GKN和SEQ ID NO:69(抗体NPAT-40)；(9)SEQ ID No:70-72和54-56(抗体NFAT-44)；或(10)SEQ ID No:65-68，GKN和SEQ ID NO:73(抗体NFAT-85)。另一种示例性药物组合物包括dsFv片段，其可以包括对氨基酸序列进行合适的并且能被本领域普通技术人员理解的一种或多种修饰。

本发明还提供了药物的组合，例如，试剂盒。此类药物组合可含有活性剂，其为本文公开的游离形式或组合物形式的TrkB激动剂，一种或多种非活性剂或其他组分，以及施用药剂的说明书。在一些实施方案中，本发明的治疗试剂盒可含有一种或多种剂量的存在于本文所述的药物组合物中的TrkB激动剂(例如抗体NFAT-85)，用于玻璃体内注射药物组合物的合适装置，以及详细说明合适的受试者和用于进行注射的方案的说明书。

可以以各种形式制备包含TrkB激动剂抗体的药物组合物。合适的固体或液体药物制剂形式是例如颗粒、粉末、片剂、包衣片剂、(微)胶囊、栓剂、糖浆、乳液、悬浮液、乳膏、气溶胶、滴剂或安瓿形式的可注射溶液以及具有延长释放的活性化合物的制剂。还可以制备本发明的抗体组合物，并将其以表面活性剂的形式施用给受试者。本发明的药物组合物可以按照本领域公知的标准方案制备(例如Remington:The Science and Practice ofPharmacy,Gennaro(ed.),Lippncott Williams&Wilkins(20^th ed.,2003))。药物组合物通常含有有效量的TrkB激动剂抗体，其足以减轻或改善眼部退行性疾病的症状。除了TrkB激动剂抗体外，药物组合物还可含有某些药学上可接受的载体，其增强或稳定组合物，或促进组合物的制备。例如，TrkB激动剂抗体可在其施用前与载体蛋白(如卵清蛋白或血清白蛋白)复合，以增强稳定性或药理学性质。各种形式的药物组合物还可含有赋形剂和添加剂和/或助剂、例如崩解剂、粘合剂、包衣剂、溶胀剂、润滑剂、调味剂、甜味剂和含有本领域常用惰性稀释剂(例如纯净水)的酏剂。

药学上可接受的载体部分地通过所施用的特定组合物以及通过用于施用组合物的特定方法来确定。它们在与其他成分相容并且对受试者无害的意义上也应该是药学上和生理学上可接受的。载体可以采取多种形式，具体取决于给药所需的制剂形式，给药形式例如口服、舌下、直肠、鼻、静脉内或肠胃外给药。例如，非水溶剂的示例是丙二醇，聚乙二醇，植物油，如橄榄油，和可注射的有机酯如油酸乙酯。用于封闭敷料的载体可用于增加皮肤渗透性并增强吸收。用于口服给药的液体剂型通常可包含含有液体剂型的脂质体溶液。

对于治疗性或预防性应用，含有TrkB激动剂抗体的药物组合物可以以治疗有效量或剂量局部或全身给药。例如，它们可以肠胃外、肠内、注射、快速输注、鼻咽吸收、皮肤吸收和口服给药。然而，在优选的实施方案中，需要局部施用组合物以达到预期的治疗效果。在这些实施方案的一些中，组合物可以通过玻璃体内注射给予需要治疗的受试者。这可以根据本领域已知的标准程序进行。参见，例如，Russelakis Cameiro et al.,Neuropathol.Appl.Neurobiol.25:196-206，1999；和Wray et al.,Arch.Neurol.33；183-5,1976。可用于将本发明的药物组合物递送至受试者眼睛的其他局部给药途径包括例如眼内、眶内、结膜下、视网膜下或经巩膜的途径。预期局部给药方式可以减少或消除在全身给药期间可能发生的潜在副作用(例如，全身毒性)的发生率。在一些其他实施方案中，本发明的药物组合物还可以例如通过口服或肠胃外途径等全身施用给患者。肠胃外途径包括例如静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下、鼻内和腹膜内途径。

治疗有效量是指足以减少或抑制受试者中待治疗的病症或疾病的症状的量。在本发明的实践中，施用的TrkB激动剂抗体的量应该有效减缓，停止或逆转眼睛变性，例如RGC的变性或死亡。这样的有效量将因受试者而异，具体取决于受试者所患的眼部疾病、疾病的阶段和严重程度、受试者的一般状况(例如身高、体重、年龄和健康状况)，所施用的特定化合物以及其他因素。对于给定的TrkB激动剂抗体，本领域技术人员可以通过使用常规实践的药学方法容易地鉴定化合物的有效量。通常，体外使用的剂量可以在对原位施用药物组合物有用的量方面提供有用的指导，并且动物模型可以用于确定治疗人受试者中特定病症的有效剂量。更常见的是，可以通过对哺乳动物物种的临床研究来确定合适的治疗剂量以确定最大可耐受剂量，并且对正常人受试者的临床研究来确定安全剂量。

通常，除了在某些情况下可能需要更高剂量时，TrkB激动剂抗体的优选剂量通常在约0.001至约1000mg的范围内，更通常为约0.01至约500mg/天。作为一般规则，施用的TrkB激动剂抗体的量是有效且可靠地预防或最小化受试者病况的最小剂量。而且，给药剂量和给药频率可根据治疗是预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中，可以在相对不频繁的间隔内长时间施用相对较低的剂量。一些受试者可能会在其余生中继续接受治疗。在治疗应用中，可能在相对短的间隔需要相对较高的剂量，直到疾病的进展减缓或终止，并且优选直到受试者显示眼部血管疾病的症状的部分或完全改善。此后，可以给受试者施用预防方案。显而易见的是，上述剂量范围意在为本文的教导提供一般指导和支持，但不意在限制本发明的范围。现有技术还描述了制备和施用本发明药物组合物的其他指导。参见，例如，Goodman&Gilman's The Pharmacological Bases of Therapeutics,Hardman et al.,eds.,McGraw-Hill Professional(10^th ed.,2001)；Remington:The Science andPractice of Pharmacy,Gennaro,ed.,Lippincott Williams&Wilkins(20^th ed.,2003)；以及Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Ansel et al.(eds.),Lippincott Williams&Wilkins(7^th ed.,1999)。

实施例

提供以下实施例以进一步说明本发明，但不限制其范围。本发明的其他变体对于本领域普通技术人员来说是显而易见的，并且包含在所附权利要求中。

实施例1TrkB激动剂Ab的开发

细胞系：通过scFv抗体的组合文库的基于功能的筛选来选择和鉴定本文示例的特异性TrkB激动剂抗体。用于实施筛选的详细程序描述于Zhang et al.,Proc.Natl,Acad.Sci.USA 109:15728-33,2012；和Zhang et al.,Chem.Biol,20:734-41,2013。简而言之，采用了两阶段过程。首先，通过使用慢病毒载体将人TrkB转染到CHO细胞中来产生报告细胞系。还使用与GAT报告基因连接的NFAT启动子用报告盒转染细胞，使得在激活同源配体BDNF后，产生荧光信号。其次，使用10¹¹scFv噬菌体文库来淘选(pan)人TrkB的etco结构域。淘选过程中的阳性物(命中物)克隆到慢病毒载体中，并以约1的感染复数(MOD)将克隆物感染到报告细胞中(图1)。在第二个筛选中，代替使用NFAT激活作为读数，报道盒利用与GFP报告基因连接的CRE启动子。

在深度测序时，收获来自该功能选择的命中物，并且三轮感染/选择产生多个scFv克隆。将scFv序列克隆到pFUSE IgG骨架(人IgG1)中以产生scFv-Fc融合抗体。在对所选TrkB抗体活性的初步研究中，将ScFv-Fc构建体转染到HEK293细胞中。培养2天后，使用每种培养克隆的上清液检查对激活TrkB报告细胞系的影响。该研究的结果显示在图2中。如图所示，鉴定的TrkB scFv激动剂抗体(例如scFv CRE-30)在激活TrkB报告细胞系中显示出不同程度的活性。

为了进一步表征所鉴定的抗体的活性，使用蛋白G亲和柱纯化所选择的scFv-Fc抗体，并在报告细胞测定中测试以测量相对于BDNF的效力(图3)。如图中所示，与BDNF相比，几种Ab是完全激动剂，而其他显示出部分激动作用。在纯化和测试的Ab中，效力在0.3-30nM之间变化。Ab NFAT-85显示出最高的效力(EC₅₀＝1nM)并显示出完全功效。所有TrkB激动剂Ab在TrkA报告细胞中测试其选择性。图4显示BDNF和任何Ab均未激活TrkA，而NGF给出预期强大的响应，从而确认选择性。

一些选定的TrkB激动剂scFv抗体的氨基酸序列示于表1中。来自“CRE”报告物筛选的所鉴定的抗体克隆在表中表示为“CRE-”，并且来自“NFAT”报告物筛选的所鉴定的抗体称为“NFAT-”。scFv抗体的重链和轻链可变区序列和其他序列元件(例如，CDR)由表2中列出的序列标识符指定。

每个scFV序列包括通过富含GS的接头(斜体)连接到轻链可变区序列的重链可变区序列。重链CDR序列加下划线，轻链CDR序列加双下划线。

表2.TrkB激动剂scFV抗体的序列组分

实施例2.TrkB激动剂抗体在信号转导中的功能

通过激动剂Ab对TrkB信号传导的另外的表征在CHO报告细胞中进行，并与BDNF的那些进行比较。激动剂Ab在5和30分钟刺激P-PLCγ，P-Akt和P-MAPK信号传导的磷酸化，但是程度不同(图B5)；水平和时间过程与BDNF相比有所不同，但信号强度倾向于与对报告细胞中的荧光信号的影响相关(见图5)。

BDNF/TrkB的典型信号传导涉及通过Akt、MAPK和PLCγ途径的磷酸化级联。BDNF功能，例如存活、分化、神经突向外生长和突触可塑性已归因于这些途径的各个方面。还测试了所鉴定的TrkB激动剂Ab在原代神经元中的营养活性和信号传导。发现Ab NFAT-85，NFAT-44和NFAT-27在培养物中3天内维持小鼠感觉神经元的存活，其类似于BDNF(未显示)。用AbNFAT-85孵育小鼠皮质神经元导致TrkB的时间-依赖性酪氨酸磷酸化。然而，TrkB磷酸化蛋白(phospho-proteins)的模式与BDNF的模式不同，从而可能揭示裂解的TrkB产物(图6)。目前正在研究与TrkB激动剂Ab的潜在差异信号转导。

为了检查BDNF活化的下游靶标，在Ab或BDNF处理后测量在小鼠原代皮层神经元中的突触蛋白Arc。Arc最初被鉴定为与细胞骨架相关的蛋白。最近的研究将Arc表达的瞬时增加与树突小棘中F-肌动蛋白网络的稳定扩展联系起来，这被认为是突触的形态学扩大和稳定的LTP的基础。长期涉及突触可塑性和记忆储存的BDNF激活依赖于Arc的巩固，并且是肌动蛋白依赖性小棘增大所必需的。目前的证据进一步表明在LTP巩固期间在F-肌动蛋白形成、Arc和翻译之间有可能的相互作用。该研究的结果显示在图7中。与BDNF一样，抗体NFAT-85在孵育2-4小时后刺激Arc。

由于通过用人TrkB受体淘选和选择发现了抗TrkB激动剂抗体Ab，我们确定了Ab对啮齿动物细胞的相对效力，以用于未来的体外和体内研究。为了检验这一点，我们利用先前显示的小鼠胚胎干细胞系细胞来响应BDNF并比较Ab NFAT-85和BDNF刺激的TrkB磷酸化。发现Ab NFAT-85以浓度依赖性方式增加磷酸化。然而，效力比其对人类报告细胞的作用(～1nM)低至少两个数量级。在小鼠和人细胞中，BDNF在约2nM时产生稳健的信号传导(图8)。

总体上，信号转导和下游标记物研究与激动剂Ab以选择性方式进行的TrkB扩大结合一致。小鼠细胞中的浓度-反应定义了Ab NFAT-85的用于进一步啮齿动物研究的相对效力。

实施例3.TrkB激动剂Ab在视网膜培养系统中的作用

为了开始研究TrkB激动剂体外对视网膜生理学的影响，建立了小鼠视网膜外植体培养系统。简而言之，解剖来自成年小鼠的视网膜并将其置于培养基(RGC层面朝上)中，持续0-14天。根据定义，RGC是轴突切断的；在此期间，各种视网膜层和RGC树突野(dendriticfield)逐渐丧失，如通过Sholl分析评估的，RGC树突回缩在培养的早期6小时是明显的，如通过Sholl分析评估的，其测量作为距体细胞(cell soma)的距离的函数的树突野参数。在培养3天后，树突交叉和树突棘显著减少。

3天培养期提供了良好的动态范围，以测试BDNF和TrkB激动剂Ab对RGC的树突棘的神经保护剂或神经再生作用。观察到外植体与100ng/ml的BDNF孵育显著阻挡树突回缩，使得在培养3天后Sholl曲线和树突棘下的面积类似于时间零外植体的那些，从而表明完全保护了对轴突切断术的树突回缩反应。为了确定BDNF是否能够逆转轴突切断诱导的树突回缩，将外植体在培养物中维持3天，此时加入BDNF并进行Sholl分析。引人注目的是，延迟施用BDNF逆转了对参数的收缩反应，这同样类似于时间-零外植体的那些，表明BDNF在受损神经元中诱导神经再生发芽反应。

该范例为测试TrkB激动剂Ab是否可以阻止视网膜外植体中的类似于针对BDNF所观察到的树突状回缩建立了基础。图9显示Ab NFAT-85维持轴突切断的RGC树突的树突参数在数量上与BDNF的那些相同，证实了在其他细胞类型中观察到的Ab NFAT-85的生物化学和信号转导参数。未来的实验将确定延迟Ab NFAT-85给药的效果，以及激动剂Abs在该培养系统中的作用的持久性。

在上述未公开结果的证实中，两个最近的报道显示了BDNF对RGC的营养作用。首先，Johnson et al.(Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.57:253-264,2016)显示向小鼠视网膜外植体施用BDNF+CNTF(睫状神经营养因子)在第7天能够改善RGC的分支片段、连接点和末端分支的数量。此外，Domenici et al.(PloS One 9(12):e115579,2014)显示玻璃体内或局部施用BDNF改善了视觉功能，如在自发性青光眼的DBA/2J小鼠模型中电生理学评估的(未显示)。有趣的是，这些影响与IOP升高无关。

实施例4.TrkB激动剂Ab在青光眼大鼠模型中的功效。

青光眼的眼高压(OHT)模型在Brown Norway大鼠中通过将5μm无菌磁性微珠注射到前眼室中来进行。实验程序基本上如Samsel et al.,Invest.Ophthalmol.52:1671,2011；和Morgan and Tibble,Exp.Eye Res.141:9-14,2015中所述进行。使用磁铁将所述珠吸引到虹膜角膜管，破坏小梁网，防止玻璃体外流，随后升高眼内压(IOP)。用反弹式眼压计定期测量IOP的升高。在左眼进行珠注射，右眼作为对照。

在珠注射后5周，通过玻璃体内注射给大鼠的所述左眼施用体积为1μl的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、500ng TrkB激动剂抗体NFAT-85(Ab85)或500ng BDNF。在一些动物中，在正常血压(NT)眼(未接受磁性微珠注射)中测定Ab85或BDNF的作用。两周后(微珠注射后7周)处死大鼠；将视网膜取下并准备用于视网膜神经节细胞及其树突棘的散射标记(diolisticlabeling)。通过Sholl分析量化棘形态(树突分支指数、树突长度和树突交叉)，每个视网膜分析平均6-10个细胞。实验范例在图10中概述。

图11显示用PBS、Ab85或BDNF处理的大鼠的OHT和NT组的平均IOP和峰IOP水平(以mm Hg计)。在该方法中，IOP在微珠注射后早期升高，保持升高约3周并且在4周后恢复到正常水平。

图12显示了通过Sholl分析评估的平均树突棘交叉点的量化。上图比较了与正常血压眼(NT)对照相比，用各种药剂处理的OHT大鼠。与经PBS处理的眼睛相比，BDNF和更大程度的Ab85显示交叉点增加，并且与NT眼睛没有差异。下图显示用BDNF或Ab85处理NT眼没有显著改变平均交叉点(OHT作为比较点绘制)。

图13表示图12中所示的Sholl分析的曲线下面积(AUC)、分支指数和树突长度的统计学比较。对于所有测量，与NT眼相比，OHT+PBS大鼠显著减少。此外，OHT+Ab85或BDNF将这些测量值改为与NT眼的相等的值。对于NT眼，Ab85和BDNF治疗都没有不同于NT对照。

这些研究的结果证明了TrkB激动剂Ab对高压性青光眼模型中大鼠视网膜神经节神经元的树突棘具有阳性的再生作用。重要的是，这些再生效应发生在由眼内压升高引起的损伤诱导之后，类似于临床上用于治疗青光眼的损伤后治疗范例。

实施例5.靶向TrkB和TNF的双特异性抗体

然后，我们尝试从本文所述的TrkB激动剂抗体Ab85和众所周知的抗TNF抗体Humira(阿达木单抗)产生双特异性抗体，并产生概念验证性(a proof of concept)双特异性抗体构型。该双特异性分子构型含有Ab85的一条臂(TrkB抗体)和阿达木单抗的另一条臂。简言之，将Ab85scFv片段与具有Y407T突变的人IgG1Fc片段融合，得到的融合蛋白以SEQID NO:74(Ab85-Fc(407))显示。同时，将阿达木单抗Fab重链与具有T366Y突变的人IgG1Fc片段融合。得到的融合蛋白以SEQ ID NO:75(阿达木单抗-重-Fc(366))显示。

为了表达和组装双特异性抗体，将这两种融合序列(Ab85-Fc(407)，阿达木单抗-重-Fc(366))与阿达木单抗轻编码的编码载体一起转染到Expi 293细胞中。然后可以通过蛋白G亲和层析纯化组装的抗体。

SEQ ID NO：74(Ab85-Fc(407)

SEQ ID NO：75阿达木单抗-重-Fc(366)

尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和实施例详细地描述了前述发明，但是本领域普通技术人员根据本发明的教导，将容易明白，可以进行某些改变和修改而不脱离所附权利要求的精神或范围。

本说明书中引用的所有出版物、数据库、GenBank序列、专利和专利申请均通过引用并入本文，如同每个都被具体和单独地表示通过引用并入。

Claims (36)

1.一种以与第二抗体的结合特异性相同的结合特异性来特异性结合原肌球蛋白受体激酶B(TrkB)的抗体或抗原结合片段，

2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区序列和轻链可变区序列，其中的一个或两个分别与以(1)SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39；(2)SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15；(3)SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17；(4)SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19；(5)SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21；(6)SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23；(7)SEQ ID NO：24和SEQID NO：25；(8)SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27；(9)SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29；(10)SEQID NO：30和SEQ ID NO：31；(11)SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33；(12)SEQ ID NO：34和SEQID NO：35；或(13)SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37显示的重链可变区序列和轻链可变区序列相同。

3.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其包含分别以(1)SEQ ID NO：38和SEQID NO：39；(2)SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15；(3)SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17；(4)SEQID NO：18和SEQ ID NO：19；(5)SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21；(6)SEQ ID NO：22和SEQ IDNO：23；(7)SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25；(8)SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27；(9)SEQ IDNO：28和SEQ ID NO：29；(10)SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31；(11)SEQ ID NO：32和SEQ IDNO：33；(12)SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35；或(13)SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37显示的重链可变区序列和轻链可变区序列。

4.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其包含重链CDR 1-3和轻链CDR 1-3序列，所述重链CDR 1-3和轻链CDR 1-3序列分别与

5.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其包含选自由SEQ ID NO：46-48，51-53，60，62，65-67和70-72组成的群组的重链CDR序列。

6.根据权利要求5所述的抗体或抗原结合片段，其还包含选自由SEQ ID NO：49，50，54-59，61，63，64，68，69和73组成的群组的轻链CDR序列。

7.根据权利要求5所述的抗体或抗原结合片段，其包含分别与(1)SEQ ID No：70-72，(2)SEQ ID NO：46-48，(3)SEQ ID NO：51-53，(4)SEQ ID No：51，52，60，(5)SEQ ID No：46，47和62，或(6)SEQ ID No：65-67相同的重链CDR 1-3序列。

8.根据权利要求7所述的抗体或抗原结合片段，其包含分别以(1)SEQ ID No：65-68，GKN和SEQ ID NO：73；(2)SEQ ID NO：46-49，AAS和SEQ ID NO：50；(3)SEQ ID NO：51-56；(4)SEQ ID No：51-53，57，58和56；(5)SEQ ID No：51-53，57，55和56；(6)SEQ ID No：51-55和59；(7)SEQ ID No：51，52，60，57，61和56；(8)SEQ ID No：46，47，62，63，YDS和SEQ ID NO：64；(9)SEQ ID No：65-68，GKN和SEQ ID NO：69；或(10)SEQ ID No：70-72和54-56显示的重链CDR 1-3和轻链CDR1-3序列。

9.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO：49，50，54-59，61，63，64，68，69和73，以及序列AAS，YDS和GKN的轻链CDR序列。

10.根据权利要求9所述的抗体或抗原结合片段，其还包含选自由SEQ ID NO：46-48，51-53，60，62，65-67和70-72组成的群组的重链CDR序列。

11.根据权利要求9所述的抗体或抗原结合片段，其包含分别与(1)SEQ ID No：68，GKN和SEQ ID No：73；(2)SEQ ID NO：49，AAS，和SEQ ID NO：50；(3)SEQ ID NO：54-56；(4)SEQID No：57，58和56；(5)SEQ ID No：57，55和56；(6)SEQ ID No：54，55和59；(7)SEQ ID No：57，61和56；(8)SEQ ID No:63，YDS和SEQ ID NO：64；或(8)SEQ ID NO:68，GKN和SEQ ID NO:69相同的轻链CDR 1-3序列。

12.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO：14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36或38基本相同的重链可变区。

13.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其是scFv片段，其中所述重链和轻链可变区序列通过接头序列连接。

14.根据权利要求13所述的抗体或抗原结合片段，其中所述接头序列包含以SEQ IDNo:40-45中的任一者显示的序列。

15.根据权利要求13所述的抗体或抗原结合片段，其包含以SEQ ID No:1-13中的任一者显示的序列。

16.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其为IgA1，IgA2，IgD，IgE，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，F(ab)2，Fv，scFv，IgGACH2，F(ab')2，scFv2CH3，Fab，VL，VH，scFv4，scFv3，scFv2，dsFv，Fv，scFv-Fc，(scFv)2，非消耗性IgG，双特异性抗体和二价抗体。

17.根据权利要求16所述的抗体或抗原结合片段，其是选自IgG1，IgG2，IgG3，IgG4和合成IgG中的IgG。

18.根据权利要求16所述的抗体或抗原结合片段，其是Fab、scFv或dsFv。

19.根据权利要求16所述的抗体或抗原结合片段，其与合成分子缀合。

20.一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体。

21.一种双特异性化合物，其包含根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段。

22.一种试剂盒，其包含根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段。

23.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段的所述重链和/或轻链的所述可变区。

24.一种载体，其含有根据权利要求23所述的多核苷酸。

25.一种促进受试者中的视网膜神经节细胞、运动神经元或中枢神经系统(CNS)神经元的存活、突触功能或再生的方法，其包括向所述受试者施用包含治疗有效量的根据权利要求1所述的TrkB激动剂抗体或抗原结合片段或根据权利要求24所述的载体，从而促进所述受试者中的视网膜神经节细胞的存活或再生。

26.根据权利要求25所述的方法，其中将所述药物组合物施用至所述受试者的一只或两只眼睛。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

28.根据权利要求25所述的方法，其中所述受试者患有眼部退行性病症、运动神经元疾病或中枢神经系统(CNS)退行性疾病或处于患有这些疾病的风险中。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述眼部退行性疾病是青光眼、视神经损伤、视神经炎、视神经病、视网膜中央动脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、糖尿病性神经病、年龄相关性黄斑变性(AMD)、前缺血性眼神经病变(AION)或糖尿病视网膜病变。

30.根据权利要求28所述的方法，其中所述运动神经元疾病是ALS、特发性运动神经病、遗传性痉挛性截瘫(HSP)、原发性侧索硬化(PLS)、进行性肌萎缩(PMA)、进行性延髓麻痹(FBP)和假性延髓麻痹、贝尔麻痹或脊髓性肌萎缩症(SMA)。

31.根据权利要求28所述的方法，其中所述中枢神经系统(CNS)退行性疾病是阿尔茨海默氏病、帕金森氏病或亨廷顿舞蹈病。

32.一种治疗或预防受试者眼部退行性病症的方法，其包括给所述受试者施用包含治疗有效量的根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段或根据权利要求24所述的载体的药物组合物，从而治疗或预防所述受试者的所述眼神经病变。

33.根据权利要求32所述的方法，其中将所述药物组合物施用于所述受试者的一只或两只眼睛。

34.根据权利要求32所述的方法，其中所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

35.根据权利要求32所述的方法，其中所述受试者患有眼部退行性病症或有发展眼部退行性病症的风险。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述眼部退行性病症是青光眼、视神经损伤、视神经炎、视神经病、视网膜中央动脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、糖尿病性神经病、年龄相关性黄斑变性(AMD)、前缺血性眼神经病变(ΑIΟΝ)或糖尿病性视网膜病变。