CN118265719A - 具有TrkB结合活性的肽复合物 - Google Patents

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Abstract

[本发明的解决课题]提供一种具有TrkB结合活性的新的化合物。[本发明的解决方案]一种具有TrkB结合活性的肽复合物，其包括第一肽，所述第一肽是具有以X1－X2－X3－X4－3Py－W－X5－X6－X7－X8－X9－X10－V－X11－C(序列识别号1)所示的氨基酸序列的肽，或是由1～4个氨基酸经取代、缺失、加成或插入的氨基酸序列所构成的肽，X1及X10为在侧链具有芳环的氨基酸，X2、X9及X11为任意的氨基酸，X3及X5为二级氨基酸，X4及X7为在侧链具有可被取代的芳环的氨基酸，X6及X8为在侧链具有链状烷基的氨基酸。

Description

具有TrkB结合活性的肽复合物
技术领域
此申请是涉及一种具有TrkB结合活性的新的肽复合物、包括所述肽复合物的医药品组合物。并且，此申请是涉及一种具有TrkB激动剂活性的新的肽复合物、包括所述肽复合物的医药品组合物。
背景技术
TrkB(原肌球蛋白受体激酶B)属于包括TrkA及TrkC的单一跨膜受体酪氨酸激酶的家族。这些受体激酶调节神经细胞的生存及产生所需的神经营养因子的活性。神经营养因子已知有神经生长因子(NGF)、大脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养因子－3(NT－3)及神经营养因子－4/5(NT－4/5)这四种，并分别与这些的高亲和性受体亦即TrkA、TrkB及TrkC特异性地结合。TrkB为BDNF的高亲和性受体，亦已知与NT－3、NT－4/5结合。为二聚体的BDNF对于TrkB的结合会引起为受体的TrkB的二量化，而导致受体上的特定的酪氨酸残基的自我磷酸化以及包括促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酸肌醇3－激酶(PI3K)及磷脂酶C－γ(PLC－γ)的信号传递路径的活化。TrkB是在与BDNF结合后，调节包括神经细胞的分化及生存的神经营养因子的多种作用。TrkB因在神经细胞的生存、分化及功能中起主要的作用，故TrkB激动剂被期待能用于多种神经退化障碍及精神神经疾病的治疗。
为天然存在的TrkB激动剂的BDNF虽已作为上述疾病的治疗药而进行临床试验，但有药物动力学等的问题，之后的研究开发未见进展。近年来，作为BDNF的代替，已报导有TrkB激动剂抗体(专利文献2、5、非专利文献3、4)、低分子化合物(专利文献8、非专利文献1、2)、肽(专利文献9)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2010－513461
专利文献2：日本特表2011－510021
专利文献3：日本特表2018－522016
专利文献4：日本特表2019－517787
专利文献5：日本特表2020－513806
专利文献6：日本特表2021－507677
专利文献7：日本特表2021－527070
专利文献8：日本特许第5946454号
专利文献9：国际公开WO2022/009992号小册子
非专利文献
非专利文献1：PLOS ONE 2014,9,e87923.
非专利文献2：Sci.Signal.2017,10,eaal1670.
非专利文献3：PNAS,115,E7023.
非专利文献4：Neurobiology of Disease 2019,132,104590.
发明内容
发明所欲解决的课题
提供具有TrkB结合活性的新的化合物。并且，亦提供具有TrkB激动剂活性的新的化合物。
解决课题的技术方案
此说明书的最初的发明是关于肽复合物。
此肽复合物包括第一肽，并具有TrkB结合活性。
第一肽是具有以X1－X2－X3－X4－3Py－W－X5－X6－X7－X8－X9－X10－V－X11－C(序列识别号1)所示的氨基酸序列的肽，或
是由在以序列识别号1所示的氨基酸序列中1～4个氨基酸经取代、缺失、加成或插入的氨基酸序列所构成的肽。
X1为在侧链具有芳环的氨基酸。
X2为任意的氨基酸。
X3为二级氨基酸。
X4为在侧链具有可被取代的芳环的氨基酸。
X5为二级氨基酸。
X6为在侧链具有链状烷基的氨基酸。
X7为在侧链具有可被取代的芳环的氨基酸。
X8为在侧链具有链状烷基的氨基酸。
X9为任意的氨基酸。
X10为在侧链具有芳环的氨基酸。
X11为任意的氨基酸。
发明效果
若根据此发明，则可提供具有TrkB结合活性的新的化合物。并且，此发明可进一步提供具有TrkB激动剂活性的新的化合物。
附图说明
[图1]图1表示使用本发明的肽复合物及大脑衍生神经营养因子(BDNF)的由pERK1/2AlphaLISA分析所进行的TrkB激动剂活性测量的结果。图中，○表示大脑衍生神经营养因子，黑圆表示TrkB激动剂活性肽复合物(肽(肽序列识别号15)与连接子(连接子结构编号7)的复合物(表3中的二聚体结构编号48))，黑三角表示TrkB激动剂活性肽复合物(肽(肽序列识别号17)与连接子(连接子结构编号7)的复合物(表3中的二聚体结构编号56))。横轴表示肽复合物或大脑衍生神经营养因子的浓度(nM)，纵轴表示将被大脑衍生神经营养因子诱导的活化信号的最大值设为100时的活化信号的相对值；
[图2]图2表示使用本发明的肽复合物及大脑衍生神经营养因子(BDNF)的由NFAT分析所进行的TrkB激动剂活性测量的结果。图中，○表示大脑衍生神经营养因子，黑圆表示TrkB激动剂活性肽复合物(肽(肽序列识别号15)与连接子(连接子结构编号7)的复合物(表3中的二聚体结构编号48))，黑三角表示TrkB激动剂活性肽复合物(肽(肽序列识别号17)与连接子(连接子结构编号7)的复合物(表3中的二聚体结构编号56))。横轴表示肽复合物或大脑衍生神经营养因子的浓度(nM)，纵轴表示将被大脑衍生神经营养因子诱导的活化信号的最大值设为100时的活化信号的相对值；
[图3]图3表示使用本发明的肽复合物及大脑衍生神经营养因子(BDNF)的由PathHunter分析所进行的TrkB激动剂活性测量的结果。图中，○表示大脑衍生神经营养因子，黑圆表示TrkB激动剂活性肽复合物(肽(肽序列识别号15)与连接子(连接子结构编号7)的复合物(表3中的二聚体结构编号48))，黑三角表示TrkB激动剂活性肽复合物(肽(肽序列识别号17)与连接子(连接子结构编号7)的复合物(表3中的二聚体结构编号56))。横轴表示肽复合物或大脑衍生神经营养因子的浓度(nM)，纵轴表示将被大脑衍生神经营养因子诱导的活化信号的最大值设为100时的活化信号的相对值；
[图4]图4表示对于TrkA、TrkB、TrkC的由本发明的肽复合物的表面等离子共振(SPR)所进行的分子间相互作用的测量结果。此外，上段表示使用表3中的二聚体结构编号48的肽复合物时的结果，下段表示使用表3中的二聚体结构编号56的肽复合物时的结果。
具体实施方式
以下，使用附图，针对用于实施本发明的方式进行说明。本发明并不受限于以下所说明的方式，亦包括本发明所属技术领域的技术人员从以下的方式在可理解的范围内进行适当修正的方式。
此说明书的最初的发明是涉及肽复合物。此肽复合物包括第一肽，并具有TrkB结合活性。并且，此肽复合物具有TrkB激动剂活性。
肽复合物
肽复合物为包括第一肽与其他肽或化合物的肽、含有肽的化合物或其药学上可容许的盐。肽复合物可包括1个或2个以上(3个以上或4个以上)的第一肽。肽复合物亦可进一步包括1或2个以上与第一肽不同的部分肽。肽复合物优选为第一肽或部分肽经由连接子而结合。肽复合物可为仅包括具有同一氨基酸序列的肽的同源多聚体。肽复合物可为包括具有不同氨基酸序列的肽的异源多聚体。肽复合物优选为具有2个具有相同氨基酸序列的第一肽且2个第一肽经由连接子而结合的同源二聚体。肽复合物只要具有TrkB结合活性即可。亦最优选为构成肽复合物的第一肽或部分肽具有TrkB结合活性。如同由实施例所示，第一肽是通过经由连接子成为肽复合物结构而表现TrkB激动剂活性。
肽复合物亦可由第一肽、第二肽以及连接第一肽与第二肽的连接子所构成。此情形，第二肽可与第一肽相同或不同，优选为具有以序列识别号1所示的氨基酸序列的肽，或为由在以序列识别号1所示的氨基酸序列中1～4个氨基酸经取代、缺失、加成或插入的氨基酸序列所构成的肽。优选为第一肽与第二肽的同源性为80％以上且100％以下。优选为第一肽与第二肽为实质上相同的同源二聚体。
第一肽
第一肽是具有以X1－X2－X3－X4－3Py－W－X5－X6－X7－X8－X9－X10－V－X11－C(序列识别号1)所示的氨基酸序列的肽，或是由在以序列识别号1所示的氨基酸序列中1～4个(1个、2个、3个或4个)氨基酸经取代、缺失、加成或插入的氨基酸序列所构成的肽。经取代的氨基酸包括氨基酸的药学上可容许的盐。具有由在以序列识别号1所示的氨基酸序列中氨基酸经取代、缺失、加成或插入的氨基酸序列所构成的序列的肽的优选例，是在以序列识别号1所示的氨基酸序列中具有已被保存性氨基酸取代的序列的肽。
保存性氨基酸取代
从特定的序列取代、缺失、加成或插入1个、2个或3个氨基酸残基的情形，优选为进行保存性氨基酸取代。所谓“保存性氨基酸取代(conservative amino acidsubstitution)”意指与功能性等价或类似的氨基酸的取代。肽中的保存性氨基酸取代会对所述肽的氨基酸序列造成静态变化。例如，具有同样极性的一个或二个以上的氨基酸是功能性且等价地作用，而对此肽的氨基酸序列造成静态变化。一般而言，某一群组内的取代可被认为对于结构及功能为保存性。然而，本发明所属技术领域的技术人员，如其可理解地，特定的氨基酸残基所担任的角色能在包括所述氨基酸的分子的三维结构中的意思而决定。例如，相较于还原型的(硫醇)形式，半胱氨酸残基的极性更低，可为氧化型的(二硫化物)形式。精氨酸侧链的长的脂族的部分能构成结构性及功能性重要的特征。并且，包括芳环的侧链(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)能有助于离子－芳香族相互作用或阳离子－pi相互作用。在此情形中，即使将具有这些侧链的氨基酸取代成属于酸性或非极性群组的氨基酸，结构性及功能性仍能为保存性。脯氨酸、甘氨酸、半胱氨酸(二硫化物形式)等的残基有对于主链的立体结构带来直接效果的可能性，无法屡次无结构上变形地进行取代。
保存性氨基酸取代是如同以下所示，包括基于侧链的类似性的特异性取代(Lehninger，生化学，改订第2版，1975年刊登，73至75页：L.Lehninger,Biochemistry,2ndedition,pp73-75,Worth Publisher,New York(1975))及典型性取代。
并且，保存性氨基酸取代优选为例如如以下般，在将天然的氨基酸基于其共通的侧链的性质而进行分类的群组中，将一氨基酸取代成与所属群组属于相同群组的氨基酸。
疏水性(亦称为非极性)氨基酸：为显示疏水性(非极性)的氨基酸，包括丙氨酸(“Ala”或亦简称为“A”)、甘氨酸(“Gly”或亦简称为“G”)、缬氨酸(“Val”或亦简称为“V”)、亮氨酸(“Leu”或亦简称为“L”)、异亮氨酸(“Ile”或亦简称为“I”)、脯氨酸(“Pro”或亦简称为“P”)、苯丙氨酸(“Phe”或亦简称为“F”)、色氨酸(Trp”或亦简称为“W”)、酪氨酸(“Tyr”或亦简称为“Y”)、甲硫氨酸(“Met”或亦简称为“M”)。
脂肪族氨基酸：为在侧链具有脂肪酸或氢的氨基酸，包括Ala、Gly、Val、Ile、Leu。
脂肪族支链氨基酸：为在侧链具有支链脂肪酸的氨基酸，包括Val、Ile、Leu。
芳香族氨基酸：为在侧链具有芳香环的氨基酸，包括Trp、Tyr、Phe。
亲水性(亦称为极性)氨基酸：为表现亲水性(极性)的氨基酸，包括丝氨酸(“Ser”或亦简记为“S”)、苏氨酸(“Thr”或亦简记为“T”)、半胱氨酸(“Cys”或亦简记为“C”)、天冬酰胺(“Asn”或亦简记为“N”)、谷氨酰胺(“Gln”或亦简记为“Q”)、天冬氨酸(“Asp”或亦简记为“D”)、谷氨酸(“Glu”或亦简记为“E”)、赖氨酸(亦记载为Lysine。“Lys”或亦简记为“K”)、精氨酸(“Arg”或亦简记为“R”)、组氨酸(“His”或亦简记为“H”)。
此外，亲水性氨基酸亦可进一步分类成以下的群组。
酸性氨基酸：为侧链表现酸性的氨基酸，包括Asp、Glu，
碱基性氨基酸：为侧链表现碱性的氨基酸，包括Lys、Arg、His。
中性氨基酸：为侧链表现中性的氨基酸，包括Ser、Thr、Asn、Gln、Cys。
并且，针对Gly及Pro，亦可分类成“对主链的方向造成影响的氨基酸”，在侧链包括硫分子的氨基酸、Cys及Met亦可分类成“含硫氨基酸”。
在本说明书中，“氨基酸”不仅包括天然的氨基酸，亦包括非天然的氨基酸。在非天然的氨基酸中，包括例如上述所记载的天然的氨基酸经N－烷基化而成的N－烷基氨基酸、形成肽键的氮被已分支或未分支的低级(例如，C1－C5，优选为C1－C3，更优选为C1)的烷基修饰而成者。在N－烷基氨基酸中，优选为N－乙基氨基酸、N－丁基氨基酸或N－甲基氨基酸，再优选为N－甲基氨基酸。并且，在非天然的氨基酸中，包括D型氨基酸(亦记载为D－氨基酸)、β－氨基酸、γ－氨基酸、氨基酸变异体、氨基酸衍生物等经化学修饰的氨基酸、正亮氨酸、鸟氨酸等在活体内无法成为蛋白质的构成材料的氨基酸等。再者，包括在天然的氨基酸的侧链中已进一步加成官能基或官能基已被取代成别的官能基而成的氨基酸(例如，在侧链的亚芳基、亚烷基等的部分具有取代或加成的氨基酸；侧链的亚芳基、亚烷基或烷基的C数已增加的氨基酸；在侧链的芳香环具有取代的氨基酸；已杂环化或缩合环化的氨基酸等)。
此外，通过在天然的氨基酸的侧链将官能基等的结构进行加成或取代等，而可赋予与天然的氨基酸不同的性质。例如，A4p是在侧链已加成哌啶基的丙氨酸，但通过已加成所述哌啶基，而与属于非极性氨基酸群组的丙氨酸不同，成为碱性，并显示极性。
亦即，在将天然的氨基酸基于其共通的侧链的性质进行区分而成的前述的群组中，可包括具有同样的侧链的性质的非天然氨基酸。例如，属于碱性氨基酸的精氨酸的N－甲基化氨基酸亦即N－甲基精氨酸(MeR)虽为非天然氨基酸，但因表现碱性，故可被分类成碱性氨基酸。如此，针对表现与一氨基酸同样的侧链的性质的非天然氨基酸，亦可作为保存性氨基酸取代的对象而包括。
非限定性地，在非天然的氨基酸中，包括N－甲基氨基酸、4Py、alT、Cit、P4Sh、F4CON、F4COO、3Py、HyP、SMe、A4paa、Atp、Hgl、KAc、Nal1、W6N、W7N、PeG等。此外，针对N－甲基氨基酸，亦可作为N－烷基氨基酸而进行分类，亦可依循未被N－甲基化的原本的氨基酸的侧链的性质而进行分类。
肽长
第一肽例如可为序列识别号2～41所记载的氨基酸序列，或除了那些氨基酸序列的第1～15个的氨基酸序列的外还包括加成性的氨基酸残基。加成性的氨基酸残基可被包括在呈环状结构的肽中，或可从所述环状肽进一步连接子状地加成氨基酸残基。肽、肽部位的酰胺键的数量(氨基酸的数量、长度)未被特别限定，但优选为总氨基酸残基(是指呈环状结构的肽所含的氨基酸残基数，在从所述环状肽进一步连接子状地加成氨基酸残基的情形，不包括那些氨基酸)为20残基以内。优选的肽长是氨基酸残基为6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、11以上，优选为氨基酸残基为19以下、18以下。更优选的肽长是氨基酸残基为15以上且17以下，最优选为氨基酸为16。
第一肽的优选例为：
X1为在侧链具有芳环的氨基酸，
X2为任意的氨基酸，
X3为二级氨基酸，
X4为在侧链具有可被取代的芳环的氨基酸，
X5为二级氨基酸，
X6为在侧链具有链状烷基的氨基酸，
X7为在侧链具有可被取代的芳环的氨基酸，
X8为在侧链具有链状烷基的氨基酸，
X9为任意的氨基酸，
X10为在侧链具有芳环的氨基酸，
X11为任意的氨基酸。
第一肽的优选例为：
X2为在侧链具有链状或环状烷基的氨基酸，
X3为脯氨酸或脯氨酸衍生物，
X4为酪氨酸或酪氨酸的侧链的羟基被取代成其他官能基的氨基，
X5为脯氨酸或脯氨酸衍生物，
X6为在侧链具有链状烷基与极性基的氨基酸，
X7为酪氨酸或酪氨酸的侧链的羟基被取代成其他官能基的氨基酸，
X8为在侧链具有链状烷基与极性基的氨基酸，
X9为在侧链中的官能基的碳数为3以上的氨基酸。
第一肽的优选例为：
X2为在侧链进一步具有极性基的氨基酸(在侧链具有链状或环状烷基与极性基的氨基酸)，
X6为在侧链具有链状烷基与羟基的氨基酸，
X7为酪氨酸或酪氨酸的侧链的羟基被取代成其他官能基的氨基酸，
X8为在侧链具有链状烷基与可被取代的羟基的氨基酸，
X9为在侧链具有链状或环状烷基的氨基酸。
在侧链具有可被取代的芳环的氨基酸
所谓“在侧链具有可被取代的芳环的氨基酸”，是指在侧链具有芳环的氨基酸，例如，作为芳环，具有苯基、吲哚环，其一部分的C等可取代成N等其他分子。芳环可为杂环。并且，例如，可为如酪氨酸的侧链的羟基被取代成其他官能基般的氨基酸。“在侧链具有可被取代的芳环的氨基酸”在一态样中，优选为在侧链具有缩合环的氨基酸。例如，可为具有吲哚环、萘结构的氨基酸，再者，其一部分的C等可被取代成N等其他分子。取代基未被特别限定，是任意选择烷基、环烷基、羟基、卤素等。“在侧链具有可被取代的芳环的氨基酸”例如包括酪氨酸、色氨酸、组氨酸、苯基丙氨酸等。非天然型氨基酸例如可为4Py、F4CON、F4COO或3Py。
“在侧链具有可被取代的芳环的氨基酸”亦可为“在侧链具有芳环的氨基酸”。
在侧链具有链状或环状烷基的氨基酸
所谓“在侧链具有链状或环状烷基的氨基酸”，是指在侧链具有烷基的氨基酸，例如为赖氨酸、丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、亮氨酸等，且为这些氨基酸的侧链可被取代亦可不被取代的氨基酸，所述烷基可为链状亦可为环状。
“在侧链具有链状烷基的氨基酸”为在侧链具有链状烷基的氨基酸。
在侧链具有极性基的氨基酸
所谓“在侧链具有极性基的氨基酸”，是指在侧链具有极性基的氨基酸，可列举例如酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸等。作为进行结合的极性基，可列举例如，非限定性地，羟基、脲基、羧酸、酰胺基、醚等。
酪氨酸的侧链的羟基被取代成其他官能基的氨基酸
所谓“酪氨酸的侧链的羟基可被取代成其他官能基的氨基酸”，可指酪氨酸的羟基被取代成其他极性基的氨基酸，所述其他极性基例如非限定性地为脲基、羧酸、酰胺基、醚等。例如，非限定性地，可列举F4CON、F4COO及Y等。
二级氨基酸
二级氨基酸意指具有二级氨(在氨基附有2个氢以外的基的氨基酸)的氨基酸。二级氨基酸的例子为脯氨酸及脯氨酸衍生物。脯氨酸衍生物的例子为HyP及P4Sh。
在侧链具有链状烷基与极性基的氨基酸
在侧链具有链状烷基与极性基的氨基酸中的链状烷基及极性基是如同先前所说明。极性基的例子为羟基。在侧链具有链状烷基与极性基的氨基酸的例子为S及SMe。
在侧链具有链状或环状烷基与极性基的氨基酸
在侧链具有链状或环状烷基与极性基的氨基酸中的链状或环状烷基及极性基是如同先前所说明。在侧链具有链状或环状烷基与极性基的氨基酸的例子为alT、Cit、D、E、L、Q及S。
在侧链中的官能基的碳数为3以上的氨基酸
所谓在侧链中的官能基的碳数为3以上的氨基酸，意指在侧链有1个或多个官能基，且官能基所含的碳的数量的合计为3以上的氨基酸。在侧链中的官能基的碳数为3以上的氨基酸的例子为A4paa、Atp、E、Hgl、KAc及L。
第一肽的优选例为：
X1为3－(4－吡啶基)－L－丙氨酸(4Py)或F，
X2为别苏氨酸(alT)、L－瓜氨酸(Cit)、D、E、L、Q或S，
X3为P或cis－4－羟基－L－脯氨酸(P4Sh)，
X4为L－4－氨甲酰基苯基丙氨酸(F4CON)、4－羧基－L－苯基丙氨酸(F4COO)或Y，
X5为羟基脯氨酸(HyP)、P或cis－4－羟基－L－脯氨酸(P4Sh)，
X6为S或T，
X7为L－4－氨甲酰基苯基丙氨酸(F4CON)或Y，
X8为S或(S)－2－氨基－3－甲氧基丙酸(SMe)，
X9为(S)－2－氨基－3－(1－(羧甲基)哌啶－4－基)丙酸(A4paa)、(2S)－2－氨基－3－(四氢吡喃－4－基)丙酸(Atp)、E、L－2－氨基己二酸(Hgl)、N6－乙酰基－L－赖氨酸(KAc)或L，
X10为3－(3－吡啶基)－L－丙氨酸(3Py)或3－(4－吡啶基)－L－丙氨酸(4Py)，
X11为A、E、N－甲基谷氨酸(MeE)、P、S或W。
第一肽的优选例是具有以F－L－P－Y－3Py－W－P－T－Y－S－L－3Py－V－W－C(序列识别号2)所示的氨基酸序列(3py意指3－(3－吡啶基)－L－丙氨酸)的肽，或是由在以序列识别号2所示的氨基酸序列中1～4个氨基酸经取代、缺失、加成或插入的氨基酸序列所构成的肽。氨基酸被取代或缺失的情形，所述氨基酸的位置优选为在序列识别号2中的氨基酸序列的第1个、第2个、第3个、第4个、第7个、第8个、第9个、第10个、第11个、第12个及第14个中的任一者。
第一肽的优选例在C端进一步具有已加成甘氨酸的氨基酸序列。
第一肽的优选例是第一肽为由序列识别号2～41中任一者所示的氨基酸序列所构成的肽或其药学上可容许的盐。药学上可容许的盐的例子为无机酸盐、有机酸盐、无机碱盐、有机碱盐、酸性或碱性氨基酸盐。无机酸盐的例子为盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐。有机酸盐的例子为乙酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、硬酯酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐及对甲苯磺酸盐。无机碱盐的例子为：钠盐、钾盐等碱金属盐；钙盐、镁盐等碱土类金属盐；铝盐及铵盐。有机碱盐的例子为二乙胺盐、二乙醇胺盐、葡甲胺盐及N,N’－二苄基乙烯二胺盐。酸性氨基酸盐的例子为天冬氨酸盐及谷氨酸盐。碱性氨基酸盐的例子为精氨酸盐、赖氨酸盐及鸟氨酸盐。第一肽及复合物可为药学上可容许的盐或溶剂合物。溶剂合物的例子为水合物。
第一肽的优选例为环状肽。第一肽的优选例是N端的氨基酸残基为已氯乙酰基化的氨基酸残基，且具有肽内的半胱氨酸残基，并且N端的氨基酸残基与半胱氨酸残基已结合的环状肽。
环状肽
所谓环状肽，是指肽中的2个氨基酸结合，其全部或一部分成为环状者。此外，在本申请案中，亦包括：肽中的氨基酸形成交联结构者、通过形成内酰胺环或巨环化反应而形成环状结构者、具有套索肽状结构者等。亦即，在本申请案中，环状肽只要为其一部分形成环状结构者即可，亦可具有直链部。
在本说明书中，有因肽的环化而改变氨基酸的一部分的情形。肽中亦包括含有此种已改变一部分的氨基酸的肽。作为因环化而改变的例子，有以下情形：在位于N端的氨基酸加成氯乙酰基，与肽中的半胱氨酸残基进行结合而环化。本申请案的肽亦包括含有已加成氯乙酰基的各种(天然/非天然)氨基酸的肽。
一般而言，肽在活体内的代谢稳定性差，且因尺寸大故有难以通过细胞膜的问题。对于此种课题，已有使肽进行环化的方法。若将肽进行环化，则蛋白酶耐性提升，代谢稳定性提升，且亦不会对构形改变造成限制，因此暗示刚性会增加且膜通透性及与目标蛋白质的亲和性会提升。
针对肽的环化，可依循已知的方法进行。虽不限于此，但例如通过设计成在肽中包括2个以上的半胱氨酸残基，而在转译后可通过双硫键而形成环状结构。并且，依循Goto等人的方法(Y.Goto,et al.ACS Chem.Biol.3 120－129(2008))，通过遗传密码的重编程技术，合成在N端具有氯乙酰基的肽，在肽中配置半胱氨酸残基，借此亦可环状化。借此，在转译后巯基自动地对于氯乙酰基进行亲核攻击，肽通过硫醚键而环状化。亦可通过遗传密码的重编程技术，将进行结合而形成环状的其他氨基酸的组合配置于肽内而进行环状化。或者，合成在N端具有环酰胺的肽，在肽中配置L－2－氨基己二酸残基，通过在这些的间进行结合而可进行环化。如此，只要为已知的环化方法，则可未被特别限制地使用。
连接子
第一肽或部分肽可加成有连接子。并且，连接子亦可为在包括肽的复合物中将多个包括肽的化合物互相连接的结构。作为连接子，可列举例如氨基酸连接子(肽连接子)、化学连接子、脂肪酸连接子、核酸连接子及糖链连接子，并且，例如可为化学连接子与肽连接子等的复合物。化学连接子的例子为PEG(Polyethyleneglycol)连接子。PEG连接子可为由1～24个或1～36个乙二醇单元所构成的连接子。并且，连接子可为包括会被脂肪酸诱导的二价化学部分的脂肪酸连接子。氨基酸(肽)连接子是至少包括1个氨基酸的连接子，例如，可使用如美国专利第7,271,149号所记载般的具有序列[Gly－Gly－Gly－Gly－Ser]n(式中，n为1、2、3、4、5或6)的肽等富含甘氨酸的肽、美国专利第5,525,491号所记载的富含丝氨酸的肽连结子。非限定性地，有因连接子的加成而肽的物性(例如溶解度)产生变化的情形。再者，可将上述的连接子组合使用。例如，作为氨基酸连接子，可为结合Gly－Lys且已在所述Lys的侧链末端结合PEG连接子的形式。并且，连接子可如PEG―氨基酸－PEG般为氨基酸与PEG交互结合的结构。连接子的优选例为具有表2所示的结构的连接子。
针对连接子的加成位置，可被加成在任意处。例如，位于肽的N端侧，可与第1个氨基酸结合并与形成环状结构的Cys结合，亦可与环状肽所含的氨基酸结合。连接子的优选例是与位于N端侧的Cys结合或与环状肽所含的氨基酸的侧链结合者。
此外，例如在序列识别号3～41所表示的氨基酸序列中，亦可将第16个的Gly视为连接子。非限定性地，例如，在序列识别号3～41所表示的氨基酸序列的第1个氨基酸已与第15个氨基酸亦即Cys结合的环状肽亦即第15个的Cys已进一步加成甘氨酸的环状肽结构物为2个，并由所述被加成的甘氨酸经由表2所表示的结构而成为二聚体结构的情形中，连接子结构亦可为表2所表示的结构，并且，亦可视为甘氨酸已结合表2所表示的结构而成的结构。
TrkB
TrkB是指原肌球蛋白受体激酶B。TrkB亦作为酪氨酸受体激酶B、BDNF/NT－4受体及高亲和性神经营养因子受体而为人所知。人类的TrkB是通过NTRK2基因而被编码的蛋白质(Entrez Gene ID：4915)。TrkB被配置于细胞膜，并通过配体与受体的细胞外区域结合而被活化。TrkB是用于大脑衍生神经营养因子(BDNF)的受体，并利用配体特异性方式而与BDNF结合。若为二聚体的BDNF与TrkB结合，则TrkB会二聚体化，并通过激酶区域而引起酪氨酸残基的自我磷酸化，其结果，会发生包括促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酸肌醇3－激酶(PI3K)及磷脂酶C－γ1(PLC－γ1)的三个主要的信号传递路径的活化。已有报导指出数种的神经营养因子例如BDNF、神经营养因子－4(NT－4)及神经营养因子－3(NT－3)会活化TrkB，并借此而活化神经的分化、神经修复、神经可塑性、增殖及生存等多种作用。本说明书中的TrkB非限定性地为人类TrkB或非人类动物TrkB，例如小鼠TrkB、大鼠TrkB、兔TrkB，优选为人类TrkB。
TrkB结合活性
本发明的肽复合物具有TrkB结合活性。此发明的肽复合物优选为与TrkB特异性结合者。例如，此发明的肽复合物优选为对TrkA、TrkC不表现结合性，对TrkB表现结合性。TrkA属于与TrkB相同的神经营养因子家族，但与TrkB不同，不是结合BNDF而是结合NGF(神经生长因子)。TrkC属于与TrkB相同的神经营养因子家族，并结合神经营养因子－3。并且，非限定性地，对于TrkB的本发明的肽的结合状态可将亲和性常数Ka、解离常数Kd、结合速度常数kon及解离速度常数koff等作为指标而表示。
亲和性常数Ka及解离常数Kd是在平衡状态下的两分子间的结合亲和性，亦即是表示结合的强度的指标，解离常数Kd为亲和性常数Ka的倒数。而且，解离常数Kd的值愈小，意指结合愈强。表示前述肽对于TrkB(例如，人类TrkB)的结合状态的亲和性常数Ka、解离常数Kd、结合速度常数kon及解离速度常数koff等，可使用本发明所属技术领域的技术人员所周知的任意的分子间相互作用测量法而决定。对于TrkB的前述肽的结合状态，例如可通过表面等离子共振光谱分析(SPR)而进行测量。非限定性地，表面等离子共振光谱分析例如可使用为生物传感器(活体分子间相互分析装置)的BIACORE系统(BIACORE公司)而进行。
为肽的TrkB结合活性的指标之一，有解离常数Kd。解离常数Kd愈低则结合活性(亲和性)愈高。非限定性地，前述肽与人类TrkB的结合的解离常数Kd为100nM以下、75nM以下、50nM以下、30nM以下、20nM以下、15nM以下、10nM以下、5nM以下、1nM以下、100pM以下。前述肽与人类TrkB的结合的解离常数koff的下限未被特别限定。
TrkB激动剂活性
本发明的肽复合物优选为具有TrkB激动剂活性。
所谓TrkB激动剂活性，是指产生类似于通过天然存在的TrkB激动剂亦即BDNF及NT4所产生的效果的能力。并且，是指与TrkB特异性结合并活化上述的受体的二聚化及信号传递路径的能力。
“TrkB激动剂活性”例如可通过使用TrkB作为目标蛋白质的激酶分析系统等而进行评价。例如，非限定性地可通过以下分析等而进行评价：检测ERK的磷酸化的AlphaLISA分析或NFAT分析；通过测量由β－半乳糖苷酶活性所水解的基质的化学发光信号的等级而辨识化合物对于受体型酪氨酸激酶的作用的Pathhunter分析。非限定性地可列举例如使用HunterPathHunter(注册商标)eXpress TrkB Functional Assay Kit(DiscoveRx公司)、PathHunter(注册商标)TrkB Functional Assay Kit(COSMO BIO公司)、CellSensor(注册商标)TrkB－NFAT－bla CHO－K1 Cell Line(Invitrogen公司)等的评价。即使为任一评价系统，亦遵循标准流程，在最适条件中使用最适浓度的肽或肽复合物的情形中可检测TrkB激动剂活性时，可称为具有TrkB激动剂活性。非限定性地，可使用EC50计算肽的激动剂活性。
核酸
此说明书亦提供编码第一肽或肽复合物的核酸。在本说明书中，“核酸”可为天然亦可为非天然，并包括DNA、RNA及这些的嵌合体，但不受限于这些。此核酸可基于第一肽或肽复合物的序列并利用已知的方法而设计、制造。
肽药物复合物(PDC)
肽复合物的例子为包括以下成分的复合物：上述的任一肽、已与这些肽结合的连接子以及已与此连接子结合的物质。因上述肽可与TrkB结合，故复合物能将物质搬运至TrkB。
物质只要为希望送达至TrkB的物质，则可为本发明所属技术领域的技术人员所希望的任何物质。作为前述物质的例子，虽未被限制，但可列举以下：
化合物：包括低分子化合物、中分子化合物，可列举例如已知的低分子药剂。
肽：可为与体内的目标结合而表现某种效果的肽，例如可为环状肽。
RI：经放射性同位素标记的低分子、中分子化合物或抗体等，只要为被放射性同位素标帜的化合物即可。可列举例如PET检查用的化合物。
蛋白质：只要为抗体、酵素等在体内表现有用功能的蛋白质即可。可列举例如能用于酵素补充疗法的酵素。
核酸：只要为DNA、RNA等包括核酸者即可。可列举例如核酸医药品。
药物传递系统(DDS)所使用的分子：可为脂质体、微胞等能使用于DDS的已知的分子。在所述DDS分子的内部亦可进一步包括医药品等化合物。
希望送达至TrkB的物质可为上述所列举的物质的复合物。
组合物
关于包括肽复合物与载体的组合物。载体的例子为：灭菌水、纯水、蒸馏水等水；生理食盐水；葡萄糖溶液；乙醇等醇；甘油、丙二醇、聚乙二醇等多元醇；灭菌有机溶剂；或水性淀粉；PBS中的任一种或二种以上的混合物。
医疗用组合物
作为医疗用组合物(在本说明书中亦称为“医药组合物”)，包括上述的肽、其药学上可容许的盐或溶剂合物(为了简化，以下亦将这些仅标记为肽)。此医药组合物优选为包括有效量的上述的肽作为有效成分。
与成为医药对象的TrkB相关的疾病是指通过TrkB的表现或活性的增加或减少所引起的疾病、因此而恶化的疾病或除此以外的相关的所有疾病、或者通过BDNF信号传递或经由TrkB而被活化的其他所有细胞内信号传递级联反应的减少所引起的障碍或因此而恶化的障碍。作为此种神经障碍及精神障碍的例子，可列举神经退化疾病(虽不受限于这些，但为阿兹海默病以及与其相关的认知病、帕金森氏病、亨廷顿病、路易体病以及与其相关的运动障碍、肌肉萎缩性侧索硬化症、青光眼及弗里德赖希共济失调以及与其相关的脊椎小脑失调症等)、抑郁症、焦虑症、自闭症、精神分裂症及创伤后应激障碍、CNS障碍、中风及外伤性脑损伤害等。作为代谢性疾病的例子，可列举肥胖症及贪食症。癌或癌性疾病是指以恶性细胞的成长或新生物、异常增殖、浸润或转移为特征的所有医学性疾病，作为此种疾病，可列举实体肿瘤癌及非实体癌(血液系统肿瘤)双方，例如白血病。作为实体肿瘤，可列举肉瘤及癌肿。肉瘤为在血管、骨、脂肪组织、韧带、淋巴管、肌肉或肌腱中的非上皮性肿瘤，相对于此，癌瘤为在皮肤、腺体及脏器的内层中的上皮性肿瘤。肿瘤是指新生物及/或恶性细胞的个体块。
上述医药组合物的投予方式未被特别限定，可经口投予亦可非经口投予。作为非经口投予，可列举例如肌肉内注射、静脉内注射、皮下注射等注射投予、经皮投予、经粘膜投予(经鼻、经口腔、经眼、经肺、经阴道、经直肠)投予等。
医药组合物中的肽是有鉴于容易被代谢及排泄的性质而可进行各种的修饰。例如，在多肽加成聚乙二醇(PEG)或糖链可增长血中滞留时间、使抗原性降低。并且，亦可将由聚乳酸－乙二醇(PLGA)等活体内分解性的高分子化合、多孔性羟基磷灰石、脂质体、表面修饰脂质体、不饱和脂肪酸所制备的乳液、纳米粒子、纳米球等使用作为缓释化基剂，并在此中包括多肽。在进行经皮投予的情形，亦可将弱电流流经皮肤表面而使其穿透角质层(离子电渗法)。
医药组成物可将有效成分直接使用，亦可添加药学上可容许的载体、赋形剂、添加剂等而进行制剂化。作为剂形，可列举例如液剂(例如注射剂)、分散剂、悬浮剂、锭剂、丸剂、粉末剂、坐剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、口含锭剂、吸入剂、软膏剂、滴眼剂、滴鼻剂、滴耳剂、泥敷剂等。
制剂化可适当使用例如赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、溶解剂、溶解补助剂、着色剂、矫味矫臭剂、稳定化剂、乳化剂、吸收促进剂、表面活性剂、pH调整剂、防腐剂、抗氧化剂等并通过常规方法而进行。
作为能使用于制剂化的成分的例子，可列举精制水、食盐水、磷酸缓冲液、右旋糖、甘油、乙醇等药学上可容许的有机溶剂、动植物油、乳糖、甘露醇、葡萄糖、山梨醇、结晶纤维素、羟丙基纤维素、淀粉、玉米淀粉、二氧化硅、硅酸铝镁、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚醣、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、黄蓍胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、双甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、肉豆蔻酸辛基十二酯、肉豆蔻酸异丙酯、高级醇、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白等，但不受限于这些。
作为改善难吸收性药物的吸收的吸收促进剂，可使用聚氧乙烯月桂基醚类、月桂基硫酸钠、皂苷等表面活性剂；甘胆酸、脱氧胆酸、牛磺胆酸等胆汁酸盐；EDTA、水杨酸类等螯合剂；己酸、癸酸、月桂酸、油酸、亚麻油酸、混合胶束等脂肪酸类；烯胺衍生物、N－酰基胶原蛋白肽、N－酰基氨基酸、环糊精类、几丁聚糖类、一氧化氮供体等。
丸剂或锭剂亦可被糖衣、胃溶性、肠溶性物质被覆。注射剂可包括注射用蒸馏水、生理食盐水、丙二醇、聚乙二醇、植物油、醇类等。再者，可添加湿润剂、乳化剂、分散剂、稳定化剂、溶解剂、溶解补助剂、防腐剂等。
本发明的医药组合物亦可并用对上述疾病为有用的其他医药或治疗法进行投予。
将本发明的医药组合物投予至哺乳类(例如，人类、小鼠、大鼠、天竺鼠、兔、狗、马、猴、猪、羊等)尤其人类的情形的投予量是依据症状、患者的年龄、性别、体重、耐受性差异、投予方法、投予间隔、有效成分的种类、制剂的种类而异，未被特别限定，但例如可将30μg～1000mg、100μg～500mg、100μg～100mg以1次或分成数次进行投予。注射投予的情形，可依据患者的体重，将1μg/kg～3000μg/kg、3μg/kg～1000μg/kg以1次或分成数次进行投予。
诊断用组合物
本发明的肽因与TrkB结合，故亦能被使用作为检测TrkB的诊断药。作为诊断药，可为检测TrkB的表现量的检测药，在被使用作为检测药的情形中，本发明的肽亦可被能检测地标识。如此进行，第一肽、肽复合物或包括所述等的组合物可被利用作为检测TrkB的诊断药。
研究用组合物
本发明的肽因与TrkB结合，故可优选地使用于与TrkB相关的研究。
细胞培养用组合物
细胞培养用组合物为能用于细胞培养的组合物。本申请案的肽因具有TrkB激动剂活性，故亦能被使用作为用于细胞培养的培养基，优选为被使用作为用于培养哺乳类细胞再优选为人类细胞的培养基用试剂、添加剂。
并且，本发明的肽亦能被使用作为针对治疗神经退化疾病等所使用的用于制作移植用神经细胞的培养基的试剂、添加剂。上述移植用神经细胞是非限定性地通过培养富潜能干细胞、多潜能干细胞或前驱细胞所制作。天然存在的TrkB激动剂亦即BDNF亦在骨、软骨、肾脏、牙胚等非神经系统的组织中表现，在细胞等级中，牙周韧带细胞、骨芽细胞、免疫活性细胞、血管内皮细胞、上皮细胞亦会产生。如此，BDNF不仅是在神经细胞中发挥功能性作用的信号分子，亦是在各种非神经系统细胞中发挥功能性作用的信号分子，因此本申请案的肽能被利用作为用于制作如上述般的各种细胞的试剂及添加剂。
培养基只要为用于培养细胞或组织的培养基则未被特别限定。培养基可为血清培养基，优选为无血清培养基、低血清培养基。
培养用培养基添加物可为溶液形态，亦可为已干燥的固体(例如，固状、粉末状等)形态。在为溶液形态的情形中，可直接使用作为培养用的培养基，亦可将利用溶剂进行稀释并因应需要添加上述添加剂者使用作为培养用的培养基。作为稀释时所使用的溶剂，可列举例如水、缓冲液、生理食盐水、能使用于各种细胞或组织培养的培养基等，这些可单独使用，亦可组合二种以上而使用。
在培养用培养基添加物为已干燥的固体形态的情形中，例如亦可将溶解于水、缓冲液、生理食盐水、各种细胞或组织培养所能使用的培养基等溶剂并因应需要添加上述的添加剂者使用作为培养用的培养基。
用于培养细胞或组织的培养基中或由此所得的细胞用的培养基中的本发明的肽复合物的含量，例如，相对于组合物全量或培养基全量，作为最终浓度，能为约0.01～约10000nmol/L，优选能为约0.1～约1000nmol/L，更优选能为约0.5～约1000nmol/L，再优选能为约1～约100nmol/L。
缩写(一般)
埃(单位)为
牛血清白蛋白为BSA；
氯乙酰基为ClAc；
二氯甲烷或氯甲烷为DCM；
N,N’－二异丙基碳化二亚胺为DIPCI；
N,N－二异丙基乙基胺为DIPEA或DIEA；
二甲亚砜为DMSO；
N,N－二甲基甲酰胺为DMF；
3,6－二氧杂－1,8－辛烷二硫醇为DODT；
杜氏改良伊格尔培养基为DMEM；
50％有效浓度为EC50；
胎牛血清为FBS；
9－芴基甲基氧基羰基为Fmoc；
N2,N6－双(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－L－赖氨酸为Fmoc－Lys(Fmoc)－OH；
克(单位)为g；
O－(7－氮杂苯并三唑－1－基)－N,N,N’,N’－四甲基脲六氟磷酸盐为HATU；
高效液相色谱法为HPLC；
液相色谱法质量分析计为LC－MS或LC/MS；
摩尔(单位)为M；
毫克(单位)为mg；
毫升(单位)为mL；
纳米摩尔(单位)为mM；
乙腈为MeCN；
分钟(单位)为min：
毫米(单位)为mm；
N－羟基丁二酸酰亚胺为NHS；
纳米(单位)为nm；
微升(单位)为μL；
琥珀酰亚胺为OSu；
2,2,4,6,7－五甲基二氢苯并呋喃－5－磺酰基为Pbf；
聚乙二醇为PEG；
每分钟转数(单位)为rpm；
三氟乙酸为TFA；
三异丙基硅烷为TIS；
三苯甲基为Trt或Tr；
缩写(非天然氨基酸)
Ahp (S)－2－氨基庚酸(CAS编号：44902－02－5)
Atp (2S)－2－氨基－3－(四氢吡喃－4－基)丙酸(CAS编号：1344910－91－3)
A4paa (S)－2－氨基－3－(1－(羧甲基)哌啶－4－基)丙酸(KISHIDA CHEMICAL株式会社)
Cit L－瓜氨酸(CAS编号：372－75－8)
cPEG1c 3,3’－氧基二丙酸
cPEG5c 4,7,10,13,16－五氧杂十九烷二油酸
cPEG9c 4,7,10,13,16,19,22,25,28－九氧杂三十一烷二油酸
cPEG13c 4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40－十三氧杂三十四烷二油酸
cPEG17c 4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52－十七氧杂五十五烷二油酸
df D－苯基丙氨酸
dc D－半胱氨酸
F4CON L－4－氨甲酰基苯基丙氨酸(CAS编号：223593－04－2)
F4COO 4－羧基－L－苯基丙氨酸(CAS编号：126109－42－0)
Hgl L－2－氨基己二酸(CAS编号：1118－90－7)
Hty 同源－L－酪氨酸(CAS编号：221243－01－2)
KAc N6－乙酰基－L－赖氨酸(CAS编号：92－04－6)
MeF N－甲基－L－苯基丙氨酸
MeA N－甲基－L－丙氨酸
MeG N－甲基甘氨酸
NHS－cPEG13c－NHS 双(2,5－二侧氧基吡咯烷－1－基)4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40－十三氧杂三十四烷二酸酯
NHS－OCOPEG13OCO－NHS 双(2,5－二侧氧基吡咯烷－1－基)(3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33－十一氧杂三十五烷－1,35－二基)双碳酸酯
OCOPEG13OCO 3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33－十一氧杂三十五烷－1,35－二基双(碳酸氢盐)
PEG2c 3－(2－(2－氨基乙氧基)乙氧基)丙酸
PEG4c 1－氨基－3,6,9,12－四氧杂十五烷－15－油酸
PEG6c 1－氨基－3,6,9,12,15,18－六氧杂二十一烷－21－油酸
PEG8c 1－氨基－3,6,9,12,15,18,21,24－八氧杂二十七烷－27－油酸
PEG12c 1－氨基－3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36－十二氧杂三十九烷－39－油酸
P4Sh cis－4－羟基－L－脯氨酸(CAS编号：618－27－9)
SMe (S)－2－氨基－3－甲氧基丙酸(CAS编号：32620－11－4)
Tic L－1,2,3,4－四氢异喹啉－3－羧酸(CAS编号：74163－81－8)
3Py 3－(3－吡啶基)－L－丙氨酸(CAS编号：64090－98－8)
4Py 3－(4－吡啶基)－L－丙氨酸(CAS编号：37535－49－2)
alT 别苏氨酸
HyP 羟基脯氨酸
MeE N－甲基谷氨酸
实施例
以下，虽基于实施例而详细地说明本发明，但本发明并不受限于这些实施例。本发明所属技术领域的技术人员可基于本说明书的记载而容易地对本发明施加修饰、变更，那些被包括于本发明的技术范围。
化学合成
以下的实施例中的在化学合成中所使用的全部原料、结构单元、试剂、酸、碱、固相树脂、溶剂是直接使用市售品，或为本发明所属技术领域的技术人员使用有机化学的手法可合成者。此外，包括保护基的氨基酸只要未被特别注明则直接使用市售品。
在固相树脂中的肽链的伸长是将各实施例所记载的树脂作为起始原料，并使用通常能使用的肽偶合反应条件与Fmoc去除反应条件而进行。反应是使用肽自动合成机亦即Biotage公司的Syro I、Biotage公司的Syro II、CEM公司的Liberty Blue、CEM公司的Liberty Blue HT12或CEM公司的Liberty Prime并遵循制造商的手册而进行。
所使用的树脂是使用NovaPEG Rink Amide resin或Seiber Amide resin，所使用的量是因应各肽而为5mg～2g的范围。
侧链的去保护及从固相树脂的切出所使用的反应剂鸡尾酒液是因应各肽而为4mL～50mL，并使用以下的组成的溶液。
A：TFA/H2O/TIS/DODT(92.5/2.5/2.5/2.5)
B：TFA/H2O/TIS/DODT(90/2.5/2.5/5)
下述列举所使用的一般的氨基酸，侧链保护基表示于括号内。
Fmoc－Ala－OH；
Fmoc－Arg(Pbf)－OH；
Fmoc－Asn(Trt)－OH；
Fmoc－Asp(OMpe)－OH；
Fmoc－Cys(Trt)－OH；
Fmoc－Gln(Trt)－OH；
Fmoc－Glu(OtBu)－OH；
Fmoc－Gly－OH；
Fmoc－Leu－OH；
Fmoc－Lys(Boc)－OH；
Fmoc－Lys(Fmoc)－OH；
Fmoc－Phe－OH；
Fmoc－Pro－OH；
Fmoc－Ser(tBu)－OH；
Fmoc－Ser(Trt)－OH；
Fmoc－Thr(tBu)－OH；
Fmoc－Trp(Boc)－OH；
Fmoc－Tyr(tBu)－OH；
Fmoc－Val－OH。
作为所得的粗精制肽的精制方法，只要未特别记载，则使用以下a)/b)/c)/d)中任一反相分取精制装置。
a)：Shimadzu prep-HPLC system(LC－20AP、SPD－M20A、CTO－20AC及CBM－20A)；
b)：Waters AutoPurification System；
c)：Waters AutoPurification System with SQD；
d)：Waters Preparative HPLC System；
此外，包括所使用的管柱的精制条件是在各实施例中揭示。
经化学合成的肽的结构决定是将考虑遵循目标序列所使用的氨基酸与因应需要所使用的结构单元而计算出的分子量，通过质谱分析法中的ESI－MS(+)而进行确认。此外，所谓“ESI－MS(+)”，表示在正离子模式所实施的电喷雾游离质谱分析法。所检测的质量是以“m/z”单位标记而表示。此外，分子量约大于1000的化合物是作为多价离子而高频率地被检测。
在以下的实施例中所合成的肽的质谱分析法中，只要未特别记载，则使用以下的基本分析装置及基本条件1或2。梯度B(％)是使用X/Y/Z中任一条件进行分析。
基本分析装置及基本条件1
装置：Shimadzu LC/MS system(LC－20ADXR、CTO－20AC、SPD－M20A、SIL－20AXR、CBM－20A及LCMS－2020)
管柱：Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm，
管柱温度：60℃
流动相A：0.025％TFA in H2O
流动相B：0.025％TFA in MeCN
流速：0.5mL/min
波长：225nm PDA
梯度B(％)：X：20－60％/7.15min，60－95％/0.3min，95－95％/1.55min；Y：5－45％/7.15min，45－95％/0.3min，95－95％/1.55min
基本分析装置及基本条件2
装置：UPLC H-Class with SQD2 mass spectrometer(Waters)
管柱：Kinetex EVO C18 1.7μm 2.1x50mm，
管柱温度：60℃
流动相A：0.025％TFA in H2O
流动相B：0.025％TFA in MeCN
流速：0.6mL/min
波长：220nm
梯度B(％)：Z：5－95％/2.10min，95－95％/0.75min
实施例1肽复合物(二聚体结构编号2)的合成
在本实施例中，合成具有以下的结构的肽复合物(为肽序列识别号3与连接子结构编号2的复合物，表3的二聚体结构编号2)。所述肽复合物亦可使用实施例1－1或实施例1－2中任一方法而进行合成。
[化1]
实施例1－1
使用NovaPEG Rink amide resin(Merck，0.49mmol/g)，利用前述的一般的方法，从Fmoc基的去除开始，合成目标的肽。此时，将Biotage公司的Syro II使用作为固相合成机，遵循制造商的手册而进行合成。在各残基的导入中，相对于树脂1当量，使用Fmoc－AA/HATU/DIEA(12.6当量/11.2当量/25.2当量)，在25℃下，在60分钟进行2次反应。但是，连接子部分PEG8c的导入是在25℃下，在60分钟进行1次反应。
Fmoc去除是在25℃下与20％哌啶的DMF溶液反应5分钟后，在去除溶液后，再次在25℃下与20％哌啶的DMF溶液反应15分钟。
氯乙酰基的导入是对于已保持由前工序所得的经Fmoc保护的肽的固相树脂，利用前述的方法去除α－氨基的Fmoc基后，在固相树脂中添加氯乙酸(12.6当量)的DMF溶液、HCTU(12当量)的DMF溶液、DIEA(25当量)的DMF溶液，在室温振荡30分钟，借此而进行。
侧链的去保护及从固相树脂的切出，首先，在氯乙酰基导入工序后，将所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥，接下来，在已置入固相树脂的反应容器中，添加反应剂鸡尾酒液－A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5：2.5：2.5：2.5的混合物)，在室温振荡60分钟。由玻璃料过滤回收反应液。若将此滤液添加至已冷却的过剩的二异丙基醚，则产生白浊沉淀，将此混合物进行离心分离，将溶液进行倾析。将所得的固体再次利用已冷却的少量的二乙基醚/己烷(1/1)的混合溶剂进行清洗后，在减压下进行干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。
肽的环化反应是以肽的最终浓度基于固相树脂的摩尔数成为2.5mM的方式溶解于DMSO后，添加三乙胺(10当量)，在室温振荡整晚。将所得的反应溶液使用Genevac EZ－2Elite以肽浓度成为25mM的方式进行减压浓缩。
所得的上述反应溶液是使用Gilson公司的管柱进行固相萃取(管柱：GilsonASPEC C1850mg 1mL)：(1)以萃取液A(0.1％TFA in 95％MeCN/H2O，0.3mL)清洗管柱。(2)以萃取液B(0.1％TFA in 5％MeCN/H2O，0.3mL)将管柱进行平衡化。(3)将上述反应溶液0.02mL滴加(loading)至管柱。(4)以萃取液B(0.4mL)清洗管柱。(5)以萃取液A(0.4mL)进行萃取。将所得的萃取液使用EZ－2Elite进行减压浓缩。
目标物的主峰之一的纯度是从以下的分析条件的LC/MS(UV波长220nm)色谱图的面积比进行计算，为55.3％。
分析条件：保持时间＝1.52分钟；管柱：Kinetex EVO C18 1.7μm 2.1x50mm，流动相：A＝0.025％TFA in H2O，B＝0.025％TFA in MeCN；温度：60℃；梯度(％B conc)：耗费2.10分钟5－95％，之后耗费0.75分钟95－95％；流速：0.6mL/分钟
ESI－MS(+)观测值m/z＝1274.4(M+4H)4+.
实施例1－2
使用NovaPEG Rink amide resin(Merck，0.49mmol/g)，利用前述的一般的方法，从Fmoc基的去除开始，合成目标的肽。此时，将Biotage公司的Syro I使用作为固相合成机，遵循制造商的手册而进行合成。在各残基的导入中，相对于树脂1当量，使用Fmoc－AA/HATU/DIEA(8.4当量/8当量/16当量)，在DMF中且75℃下，在20分钟进行2次反应。但是，第15个残基是在室温下在20分钟进行1次反应。第16个残基、连接子部分PEG8c及K的导入是在75℃下在20分钟进行1次反应。
Fmoc去除是在室温下与20％哌啶的DMF溶液反应5分钟后，在去除溶液后，再度在室温下与20％哌啶的DMF溶液反应15分钟。
氯乙酰基的导入是对于已保持由前工序所得的经Fmoc保护的肽的固相树脂，利用前述的方法去除α－氨基的Fmoc基后，在固相树脂中添加在DCM中搅拌氯乙酸(10.6当量)、DIPCI(10.5当量)及HOSu(10.6当量)并添加与DCM同量的DMF而调整成ClAcOSu的DCM/DMF溶液者，在室温振荡150分钟，借此而进行。
侧链的去保护及从固相树脂的切出，首先，在氯乙酰基导入工序后，将所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥，接下来，在已置入固相树脂的反应容器中，添加反应剂鸡尾酒液－A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5：2.5：2.5：2.5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。若将此滤液添加至已冷却的过剩的二异丙基醚，则产生白浊沉淀，将此混合物进行离心分离，将溶液进行倾析。将所得的固体再次利用已冷却的少量的二乙基醚进行清洗后，在减压下进行干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。
肽的环化反应是以肽的最终浓度基于固相树脂的摩尔数成为1mM的方式溶解于DMSO/H2O(9/1)后，添加三乙胺(10当量)，在室温搅拌3小时。在所得的反应溶液中添加乙酸后，使用Genevac HT－12进行减压浓缩。
将所得的粗生成物使用以下的条件进行精制。(管柱：Waters XBridge(注册商标)C18，50x150mm；流动相：A＝0.1％TFA in H2O，B＝0.1％TFA in MeCN；温度：40℃；梯度(％Bconc)：耗费3分钟12－37％，之后耗费8分钟37－42％，之后耗费1分钟42－60％；流速：120mL/分钟。
目标物的纯度是从以下的分析条件的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，为85.03％。
分析条件：保持时间＝4.82分钟；管柱：Kinetex EVO C18，2.6μm 2.1x150mm，流动相：A＝0.025％TFA in H2O，B＝0.025％TFA in MeCN；温度：60℃；梯度(％Bconc)：耗费7.15分钟20－60％，之后耗费0.30分钟60－95％，之后耗费1.55分钟95－95％；流速：0.5mL/分钟
ESI－MS(+)观测值m/z＝1274.1(M+4H)4+.
实施例2肽复合物(二聚体结构编号48)的合成
在本实施例中，合成具有以下的结构的肽复合物(为肽序列识别号15与连接子结构编号7的复合物，表3的二聚体结构编号48)。
[化2]
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.57mmol/g)，利用前述的一般的方法，从Fmoc基的去除开始，合成目标的肽。此时，将CEM公司的Liberty Blue使用作为固相合成机，遵循制造商的手册而进行合成。在各残基的导入中，相对于树脂1当量，使用Fmoc－AA/DIPCI/Oxyma pure(4.2当量/8当量/4当量)，在DMF中且75℃下，在10分钟进行1次反应。但是，第2个残基、第3个残基、第6个残基、第7个残基是在75℃下在10分钟进行2次反应。第15个残基是在50℃下在20分钟进行1次反应。Fmoc去除基本上使用在75℃下与20％哌啶的DMF溶液反应3分钟的条件。但是，第1个残基、第5个残基是使用在室温下与20％哌啶的DMF溶液反应5分钟后，在去除溶液后，再次在室温下与20％哌啶的DMF溶液反应10分钟的条件。
氯乙酰基的导入是对于已保持由前工序所得的经Fmoc保护的肽的固相树脂，利用前述的方法去除α－氨基的Fmoc基后，在固相树脂中添加0.2M氯乙酸(5当量)的DMF溶液、0.5MHATU(5当量)的DMF溶液及1M DIEA(10当量)的DMF溶液，在室温振荡30分钟，借此而进行。
侧链的去保护及从固相树脂的切出，首先，在氯乙酰基导入工序后，将所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥，接下来，在已置入固相树脂的反应容器中，添加反应剂鸡尾酒液－A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5：2.5：2.5：2.5的混合物)，在室温振荡60分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用鸡尾酒液进行再度振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与前述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却的过剩的二乙基醚/己烷(1/1)的混合溶剂，则产生白浊沉淀，将此混合物进行离心分离，将溶液进行倾析。将所得的固体再次利用已冷却的少量的二乙基醚进行清洗后，在减压下进行干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。
肽的环化反应是以肽的最终浓度基于固相树脂的摩尔数成为5mM的方式溶解于MeCN/H2O(1/1)后，添加三乙胺(10当量)，在室温振荡6小时。将所得的反应溶液使用Genevac HT－12进行减压浓缩。
将所得的粗生成物使用以下的条件进行精制。(管柱：Waters XBridge(注册商标)C18，50x150mm；流动相：A＝0.1％TFA in H2O，B＝0.1％TFA in MeCN；温度：40℃；梯度(％Bconc)：2分钟5％，之后耗费1分钟5－19％，之后耗费8分钟19－24％，之后耗费1分钟24－60％；流速：1分钟(20mL/分钟)，之后耗费1分钟(20mL/分钟－120mL/分钟)，之后(120mL/分钟)。
于此，将所得的环状肽设为肽A，其纯度是从以下的分析条件的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，为99.43％。
分析条件：保持时间＝4.52分钟；管柱：Kinetex EVO C18，2.6μm 2.1x150mm，流动相：A＝0.025％TFA in H2O，B＝0.025％TFA in MeCN；温度：60℃；梯度(％Bconc)：耗费7.15分钟5－45％，之后耗费0.30分钟45－95％，之后耗费1.55分钟95－95％；流速：0.5mL/分钟
ESI－MS(+)观测值m/z＝710.4(M+3H)3+.
肽复合物的合成是将由上述所得的肽A以肽复合物的最终浓度成为25mM的方式溶解于DMF后，在添加10当量的三乙胺后，在0℃添加0.5当量的NHS－cPEG13c－NHS，在室温振荡1小时。
将所得的粗生成物使用以下的条件进行精制(管柱：Waters XBridge(注册商标)C18，30x150mm；流动相：A＝0.1％TFA in H2O，B＝0.1％TFA in MeCN；温度：50℃；梯度(％Bconc)：耗费3分钟5－26％，之后耗费8分钟26－31％，之后耗费1分钟31－60％；流速：45mL/分钟。
目标物的纯度是从以下的分析条件的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，为93.88％。
分析条件：保持时间＝6.02分钟；管柱：Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm，流动相：A＝0.025％TFA in H2O，B＝0.025％TFA in MeCN；温度：60℃；梯度(％Bconc)：耗费7.15分钟5－45％，之后耗费0.30分钟45－95％，之后耗费1.55分钟95－95％；流速：0.5mL/分钟
ESI－MS(+)观测值m/z＝1228.8(M+4H)4+.
实施例3肽复合物(二聚体结构编号57)的合成
在本实施例中，合成具有以下的结构的肽复合物(为肽序列识别号17与连接子结构编号14的复合物，表3的二聚体结构编号57)。
[化3]
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.57mmol/g)，利用前述的一般的方法，从Fmoc基的去除开始，合成目标的肽。此时，将CEM公司的Liberty Blue使用作为固相合成机，遵循制造商的手册而进行合成。在各残基的导入中，相对于树脂1当量，使用Fmoc－AA/DIPCI/Oxyma pure(4.2当量/8当量/4当量)，在DMF中且75℃下，在10分钟进行1次反应。但是，第2个残基、第6个残基是在75℃下在10分钟进行2次反应。第15个残基是在50℃下在15分钟或20分钟进行1次反应。
Fmoc去除是使用在室温下与20％哌啶的DMF溶液反应5分钟后，在去除溶液后，再度在室温下与20％哌啶的DMF溶液反应10分钟的条件，或在75℃下与20％哌啶的DMF溶液反应3分钟的条件。
氯乙酰基的导入是对于已保持由前工序所得的经Fmoc保护的肽的固相树脂，利用前述的方法去除α－氨基的Fmoc基后，在固相树脂中添加在DCM中搅拌氯乙酸(5当量)、DIPCI(5当量)及HOSu(5当量)并添加与DCM同量的DMF而调整成ClAcOSu的DCM/DMF溶液者，在室温振荡60分钟，借此而进行。
侧链的去保护及从固相树脂的切出，首先，在氯乙酰基导入工序后，将所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥，接下来，在已置入固相树脂的反应容器中，添加反应剂鸡尾酒液－B(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比90：2.5：2.5：5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用鸡尾酒液进行再度振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与前述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的二异丙基醚/己烷(1/1)的混合溶剂，则产生白浊沉淀，将此混合物进行离心分离，将溶液进行倾析。所得的固体再度以已冷却至0℃的少量的二乙基醚进行清洗后，在减压下进行干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。
肽的环化反应是以肽的最终浓度基于固相树脂的摩尔数成为5mM的方式溶解于DMSO/H2O(9/1)后，添加三乙胺(10当量)，在室温振荡10小时。将所得的反应溶液使用Genevac HT－12进行减压浓缩。
将所得的粗生成物使用以下的条件进行精制(管柱：Waters XBridge(注册商标)C18，50x150mm；流动相：A＝0.1％TFA in H2O，B＝0.1％TFA in MeCN；温度：40℃；梯度(％Bconc)：2分钟5％，之后耗费1分钟5－19％，之后耗费8分钟19－24％，之后耗费1分钟24－60％；流速：1分钟(20mL/分钟)，之后耗费1分钟(20mL/分钟－120mL/分钟)，之后(120mL/分钟)。
于此，将所得的环状肽设为肽B，其纯度是从以下的分析条件的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，为99.69％。
分析条件：保持时间＝4.51分钟；管柱：Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm，流动相：A＝0.025％TFA in H2O，B＝0.025％TFA in MeCN；温度：60℃；梯度(％Bconc)：耗费7.15分钟5－45％，之后耗费0.30分钟45－95％，之后耗费1.55分钟95－95％；流速：0.5mL/分钟
ESI－MS(+)观测值m/z＝724.4(M+3H)3+.
肽复合物的合成是将由上述所得的肽B以肽复合物的最终浓度成为25mM的方式溶解于DMF后，在添加10当量的三乙胺后，在0℃添加0.5当量的NHS－OCOPEG13OCO－NHS，在室温振荡1小时。
所得的混合物是使用以下的条件进行精制(管柱：Waters XBridge(注册商标)C18，30x150mm；流动相：A＝0.1％TFA in H2O，B＝0.1％TFA in MeCN；温度：50℃；梯度(％Bconc)：耗费3分钟5－26％，之后耗费8分钟26－31％，之后耗费1分钟31－60％；流速：45mL/分钟)。
目标物的纯度是从以下的分析条件的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，为91.04％。
分析条件：保持时间＝5.95分钟；管柱：Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm，流动相：A＝0.025％TFA in H2O，B＝0.025％TFA in MeCN；温度：60℃；梯度(％Bconc)：耗费7.15分钟5－45％，之后耗费0.30分钟45－95％，之后耗费1.55分钟95－95％；流速：0.5mL/分钟
ESI－MS(+)观测值m/z＝1235.7(M+4H)4+.
实施例4肽复合物(二聚体结构编号40)的合成
在本实施例中，合成具有以下的结构的肽复合物(肽序列识别号36与连接子结构编号4的复合物，表3的二聚体结构编号40)。
[化4]
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.48mmol/g)，利用前述的一般的方法，从Fmoc基的去除开始，合成目标的肽。此时，将CEM公司的Liberty Blue使用作为固相合成机，遵循制造商的手册而进行合成。在各残基的导入中，相对于树脂1当量，使用Fmoc－AA/DIPCI/Oxyma pure(4.2当量/8当量/4当量)，在DMF中且90℃下，在3分钟进行1次反应。但是，第2个残基、第3个残基、第6个残基、第7个残基是在90℃下，在3分钟进行2次反应。第15个残基是在50℃下，在15分钟进行1次反应。
Fmoc去除是使用在室温下与10％吡咯烷的DMF溶液反应1分钟后，在去除溶液后，再次在室温下与10％吡咯烷的DMF溶液反应1分钟的条件，或在90℃下与10％吡咯烷的DMF溶液反应1分钟的条件。
氯乙酰基的导入是对于已保持由前工序所得的经Fmoc保护的肽的固相树脂，利用前述的方法去除α－氨基的Fmoc基后，在固相树脂中添加0.2M氯乙酸(5当量)的DMF溶液、0.5MHATU(5当量)的DMF溶液及1M DIEA(10当量)的DMF溶液，在室温振荡30分钟，借此而进行。
侧链的去保护及从固相树脂的切出，首先，在氯乙酰基导入工序后，将所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥，接下来在已置入固相树脂的反应容器中，添加反应剂鸡尾酒－A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5：2.5：2.5：2.5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用鸡尾酒液进行再度振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与前述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却的过剩的二乙基醚/己烷(1/1)的混合溶剂，则产生白浊沉淀，将此混合物进行离心分离，将溶液进行倾析。所得的固体再度以已冷却至0℃的少量的二乙基醚进行清洗后，在减压下进行干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。
肽的环化反应是以肽的最终浓度基于固相树脂的摩尔数成为2.5mM的方式溶解于DMSO/H2O(9/1)后，添加三乙胺(10当量)，在室温振荡4小时。将所得的反应溶液使用Genevac EZ－2Elite进行减压浓缩。将所得的粗生成物使用于肽复合物的合成。
肽复合物的合成是以肽的最终浓度基于固相树脂的摩尔数成为25mM的方式溶解于DMSO后，添加NHS－cPEG1c－NHS(0.46当量)及DIEA(5当量)，在室温振荡2小时后，添加乙酸。
将所得的粗生成物使用以下的条件进行精制(管柱：Waters XBridge(注册商标)C18，30x150mm；流动相：A＝0.1％TFA in H2O，B＝0.1％TFA in MeCN；温度：50℃；梯度(％Bconc)：耗费0.1分钟5－1.1％，之后耗费4.9分钟1.1％，之后耗费1分钟1.1－5％，之后耗费3分钟5－30.6％，之后耗费9分钟30.6－35.7％，之后耗费1分钟35.7－60％；流速：耗费0.1分钟(44mL/分钟－9mL/分钟)，之后4.9分钟(9mL/分钟)，之后耗费1分钟(9mL/分钟－44mL/分钟)，之后(44mL/分钟)
目标物的纯度是从以下的分析条件的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，为79.87％。
分析条件：保持时间＝3.75分钟；管柱：Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm，流动相：A＝0.025％TFA in H2O，B＝0.025％TFA in MeCN；温度：60℃；梯度(％Bconc)：耗费7.15分钟20－60％，之后耗费0.30分钟60－95％，之后耗费1.55分钟95－95％；流速：0.5mL/分钟
ESI－MS(+)观测值m/z＝1341.8(M+4H)4+.
实施例5各种肽合成
在本实施例中，与实施例1～4同样地，将各种肽复合物进行化学合成。将所合成的环状肽的序列揭示于表1，将连接子的结构揭示于表2，将环状肽经由连接子而二聚体化的肽复合物揭示于表3。
所合成的肽复合物是利用实施例1～4所记载的分析条件进行分析，并通过在质谱法中的ESI－MS(+)而确认结构。将所得的ESI－MS(+)观测值、保持时间以及此情形中的价数揭示于表3。
[表1－1]
[表1－2]
[表1－3]
[表2]
[表3－1]
[表3－2]
[表3－3]
实施例6由pERK AlphaLISA分析所进行的TrkB激动剂活性评价
为了评价本发明的TrkB激动剂肽的TrkB的活化能力，而检验ERK的磷酸化。以包括10％FBS(Thermo)与1×非必需氨基酸(Thermo)、25mM HEPES(Thermo)、50ug/mL庆大霉素、5ug/mL杀稻瘟菌素(Thermo)、200ug/mL吉欧霉素(Thermo)的DMEM、高葡萄糖、GlutaMAX(注册商标)补充剂、丙酮酸盐(Thermo)培养CellSensor(注册商标)TrkB－NFAT－bla CHO－K1Cell(Invitrogen)。使用Accutase(Innovative cell technologies)剥离细胞后，以每1孔成为12500细胞的方式，播种于接着细胞用96孔盘，并培养一晚。隔天，为了饥饿而更换成营养饥饿培养基并培养4小时，所述营养饥饿培养基是在已从上述的培养液去除FBS与杀稻瘟菌素、吉欧霉素的培养基中包括0.1％BSA(Sigma)而成。之后，添加重组人类BDNF蛋白质(R&D systems)或肽，刺激15分钟后，以AlphaLISA SureFire Ultra p-Erk1/2(Thr202/Tyr204)Assay Kit(PerkinElmer)所附的Lysis Buffer溶解细胞。遵循套组的使用规程进行实施，信号的检测是使用SpectraMax Paradigm multimode microplate reader(Molecular Devices)。将所得的信号以GraphPad Prism进行分析，将被BDNF诱导的信号的最大值设为100％，将无刺激设为0％，计算％活性。在添加1nM肽时具有50％以上活性者设为A，将添加10nM肽时具有50％以上活性者设为B。
BDNF的添加浓度是在从10nM起4倍稀释8点(0.0006nM～10nM)进行评价。
关于肽的添加浓度，二聚体结构编号1～3是以1、10、100nM进行评价，除此以外是以0.1、1、10nM进行评价。并且，制作浓度依赖性曲线时是在从100nM起4倍稀释8点(0.006nM～100nM)进行评价。
将结果揭示于表4及图1。如同表4所示，所合成的肽复合物显示具有TrkB激动剂活性。并且，如同图1所示，所合成的肽复合物(在表3中的二聚体结构编号48及56)显示具有与大脑衍生神经营养因子(BDNF)同样的TrkB激动剂活性。
[表4－1]
二聚体结构编号 pERK(aLISA)分析结果 NFAT分析结果
1 B C
2 B B
3 B B
4 B B
5 B not tested
6 A A
7 B A
8 B not tested
9 B A
10 B B
11 A A
12 A A
13 A A
14 A A
15 A A
16 A A
17 A A
18 A A
19 A A
20 A A
[表4-2]
二聚体结构编号 pERK(aLISA)分析结果 NFAT分析结果
21 A A
22 A A
23 A A
24 A A
25 A A
26 A A
27 A A
28 A A
29 A A
30 A A
31 A A
32 A A
33 A A
34 A A
35 A A
36 A A
37 A A
38 A A
39 A A
40 A A
[表4-3]
二聚体结构编号 pERK(aLISA)分析结果 NFAT分析结果
41 A A
42 A A
43 A A
44 A A
45 A A
46 A A
47 A A
48 A A
49 A A
50 A A
51 A A
52 A A
53 A A
54 A A
55 A A
56 A A
57 A A
实施例7由NFAT分析所进行的TrkB激动剂活性评价
为了评价本发明的TrkB激动剂肽的TrkB的活化能力，而检验由报导基因所导致的转录活性。以上述的培养基培养AlphaLISA所使用的CellSensor(注册商标)TrkB-NFAT-blaCHO-K1 Cell(Invitrogen)。使用Accutase(Innovative cell technologies)剥离细胞后，以每1孔成为12500细胞的方式，利用已从培养基去除杀稻瘟菌素与吉欧霉素的分析用培养基进行悬浮后，播种于接着细胞用96孔盘，并培养一晚。之后，放入BDNF或肽，在CO2培养箱培养5小时。从培养箱取出并回到室温后，在遮光下添加检测试剂(LiveBLAzer(注册商标)-FRET B/G(CCF4-AM)基质混合物)，加盖且在湿箱内在遮光下培养2小时。信号的检测是使用Multilabel Reader Envision 2104(PerkinElmer)，并计算460nm/535nm激发信号。将所得的数值以GraphPad Prism进行分析，将被BDNF诱导的信号的最大值设为100％，将无刺激设为0％，计算％活性。将在添加1nM肽时具有50％以上活性者设为A，将在添加10nM肽时具有50％以上活性者设为B，将在100nM肽时具有50％以上活性者设为C。并且，将未实施评价者设为not tested。
BDNF的添加浓度是在从10nM起4倍稀释7点(0.0024nM～10nM)进行评价。
关于肽的添加浓度，二聚体结构编号1～3是以1、10、100nM进行评价，除此以外是以0.1、1、10nM进行评价。并且，制作浓度依赖性曲线时是在从25nM起4倍稀释7点(0.006nM～100nM)进行评价。
将结果揭示于表4及图2。如同表4所示，所合成的肽复合物显示具有TrkB激动剂活性。并且，如同图2所示，所合成的肽复合物(在表3中的二聚体结构编号48及56)显示具有与大脑衍生神经营养因子(BDNF)同样的TrkB激动剂活性。
实施例8由PathHunter分析所进行的TrkB激动剂活性评价
为了评价本发明的TrkB激动剂肽的TrkB的活化能力，而检验TrkB的磷酸化。使用PathHunter(注册商标)eXpress TrkB Functional Assay Kit(DiscoveRx公司；附细胞、96孔盘、培养基、检测试剂)，并遵循附加的使用规程而实施并评价。将冷冻细胞进行融解并以培养基进行悬浮后，以每1孔10000细胞播种于96孔盘，并培养48小时。之后，添加重组人类BDNF蛋白质(R&D systems)或肽，刺激3小时后，添加检测试剂。在遮光下以室温使其反应60分钟，利用SpectraMax Paradigm multimode microplate reader(Molecular Devices)测量发光信号。将所得的信号以GraphPad Prism进行分析，将被BDNF诱导的信号的最大值设为100％，将无刺激设为0％，计算％活性。
BDNF的添加浓度是在从100nM起4倍稀释8点(0.006nM～100nM)进行评价，肽的添加浓度是在以下所示的A～C的测量范围进行评价。
测量范围A＝从100nM起5倍稀释6点(0.032nM～100nM)
测量范围B＝从100nM起4倍稀释8点(0.006104nM～100nM)
测量范围C＝从10nM起10倍稀释4点(0.01nM～10nM)
将结果揭示于表5及图3。如同表5所示，所合成的肽复合物显示具有TrkB激动剂活性。并且，如同图3，所合成的肽复合物(在表3中的二聚体结构编号48及56)显示具有与大脑衍生神经营养因子(BDNF)同样的TrkB激动剂活性。
[表5]
实施例9由表面等离子共振(SPR)所进行的TrkA、TrkB、TrkC与肽的分子间相互作用评价试验
在本实施例中，针对所合成的肽复合物(表3中的二聚体结构编号48及56)，将对于TrkA、TrkB、TrkC的肽的由表面等离子共振(SPR)所导致的分子间相互作用，通过以下所示方法而实施试验。将具体的试验方法显示于以下。
[SPR测量]
将CM5传感晶片(Cytiva)插入BiacoreT200(Cytiva)，以电泳缓冲液：HBS－EP+(Cytiva)实施3次主要操作，以流速30μL/min进行平衡化。使60mM EDC溶液(Cytiva)、650mMNHS溶液(Cytiva)各混合50μL后，以流速10μL/min使其反应420秒钟。以10mM乙酸溶液(pH5.0)进行稀释，制备30ng/uL抗人类IgG(Fc)抗体(Cytiva)溶液135μL，以流速10μL/min使其反应360秒钟，将抗人类IgG(Fc)抗体固定化在CM3传感晶片。固定化后，使1.0M乙醇胺水溶液(Cytiva)以流速10μL/min反应420秒钟，进行加帽。以流速10μL/min使200nM重组人类TrkA Fc嵌合体蛋白、重组人类TrkB Fc嵌合体蛋白、重组人类TrkC Fc嵌合体蛋白(R&Dsystems)溶液反应60秒钟，使其进行捕获。以最终浓度成为10μM的肽溶解液的方式，将在DMSO溶液中制备成10mM的肽溶解液以电泳缓冲液进行稀释后，制作50nM、25nM、12.5nM、5nM、2.5nM的肽溶液。使用上述的样本，通过SPR测量而取得对于TrkA、TrkB、TrkC的肽的动力学。使TrkA、TrkB、TrkC与肽进行反应后，使3M MgCl溶液以10μL/min反应180秒钟，实施再生化。
动力学评价模型设为Single Cycle Kinetics，使用Biacore T200 EvaluationSoftware Version3.0(Cytiva)而进行曲线拟合。对于所得的传感图，实施由最小平方法所进行的曲线拟合，通过求取其Kd值(解离常数)而评价肽对于TrkA、TrkB、TrkC的结合。
将结果揭示于图4。如同图4所示，所合成的肽复合物(表3中的二聚体结构编号48及56)未见到对于TrkA及TrkC的结合，确认到仅对TrkB进行结合。在所合成的肽复合物对于TrkB的结合中，因koff(解离速度常数)超过测量极限，故采用下限理论值koff：0.00001(1/s)而计算Kd。Kd为100pM以下。
产业可利用性
此发明能被利用于医药产业或生物技术产业。

Claims (17)

1.一种肽复合物，其包括第一肽，并具有TrkB结合活性，其特征在于，
所述第一肽是具有以X1－X2－X3－X4－3Py－W－X5－X6－X7－X8－X9－X10－V－X11－C(序列识别号1)所示的氨基酸序列的肽，或
是由在以序列识别号1所示的氨基酸序列中1～4个氨基酸经取代、缺失、加成或插入的氨基酸序列所构成的肽，
X1为在侧链具有芳环的氨基酸，
X2为任意的氨基酸，
X3为二级氨基酸，
X4为在侧链具有可被取代的芳环的氨基酸，
X5为二级氨基酸，
X6为在侧链具有链状烷基的氨基酸，
X7为在侧链具有可被取代的芳环的氨基酸，
X8为在侧链具有链状烷基的氨基酸，
X9为任意的氨基酸，
X10为在侧链具有芳环的氨基酸，
X11为任意的氨基酸。
2.根据权利要求1所述的肽复合物，其特征在于，
X2为在侧链具有链状或环状烷基的氨基酸，
X3为脯氨酸或脯氨酸衍生物，
X4为酪氨酸或酪氨酸的侧链的羟基被取代成其他官能基的氨基酸，
X5为脯氨酸或脯氨酸衍生物，
X6为在侧链具有链状烷基与极性基的氨基酸，
X7为酪氨酸或酪氨酸的侧链的羟基被取代成其他官能基的氨基酸，
X8为在侧链具有链状烷基与极性基的氨基酸，
X9为在侧链中的官能基的碳数为3以上的氨基酸。
3.根据权利要求2所述的肽复合物，其特征在于，
X2为在侧链进一步具有极性基的氨基酸，
X6为在侧链具有链状烷基与羟基的氨基酸，
X7为酪氨酸或酪氨酸的侧链的羟基被取代成其他官能基的氨基酸，
X8为在侧链具有链状烷基与可被取代的羟基的氨基酸，
X9为在侧链具有链状或环状烷基的氨基酸。
4.根据权利要求1所述的肽复合物，其特征在于，
X1为4Py或F，
X2为alT、Cit、D、E、L、Q或S，
X3为P或P4Sh，
X4为F4CON、F4COO或Y，
X5为HyP、P或P4Sh，
X6为S或T，
X7为F4CON或Y，
X8为S或SMe，
X9为A4paa、Atp、E、Hgl、KAc或L，
X10为3Py或4Py，
X11为A、E、MeE、P、S或W。
5.根据权利要求1所述的肽复合物，其特征在于，
所述第一肽是具有以F－L－P－Y－3Py－W－P－T－Y－S－L－3Py－V－W－C(序列识别号2)所示的氨基酸序列的肽，或是由在以序列识别号2所示的氨基酸序列中1～3个氨基酸经取代、缺失、加成或插入的氨基酸序列所构成的肽。
6.根据权利要求1所述的肽复合物，其特征在于，
所述第一肽在C端具有已加成甘氨酸的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的肽复合物，其特征在于，
所述第一肽是由以序列识别号2～41中任一者所示的氨基酸序列所构成的肽。
8.根据权利要求1所述的肽复合物，其特征在于，
所述第一肽为环状肽。
9.根据权利要求1所述的肽复合物，其特征在于，
具有TrkB激动剂活性。
10.根据权利要求1所述的肽复合物，其特征在于，
所述第一肽的N端的氨基酸残基为经氯乙酰基化的氨基酸残基，且所述第一肽具有肽内的半胱氨酸残基，所述第一肽是所述N端的氨基酸残基与所述半胱氨酸残基结合而成的环状肽。
11.根据权利要求1所述的肽复合物，其特征在于，
所述肽复合物是由所述第一肽、第二肽以及连接所述第一肽与所述第二肽的连接子所构成，
所述第二肽可与所述第一肽相同亦可不同，且是具有以序列识别号1所示的氨基酸序列的肽，或
是由在以序列识别号1所示的氨基酸序列中1～4个氨基酸经取代、缺失、加成或插入的氨基酸序列所构成的肽。
12.根据权利要求11所述的肽复合物，其特征在于，
所述第一肽与所述第二肽的同源性为80％以上且100％以下。
13.根据权利要求11所述的肽复合物，其特征在于，
所述第一肽与所述第二肽为实质上相同的同源二聚体。
14.根据权利要求11所述的肽复合物，其特征在于，所述连接子为PEG连接子。
15.一种组合物，其特征在于，包括根据权利要求1所述的肽复合物与载体。
16.一种组合物，其特征在于，包括根据权利要求1所述的肽复合物与载体，并用于医疗用、诊断用或研究用。
17.一种细胞培养用组合物，其特征在于，包括根据权利要求1所述的肽复合物与载体，并用于细胞培养。
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