CN105683218A

CN105683218A - 针对toso的抗体

Info

Publication number: CN105683218A
Application number: CN201480048375.3A
Authority: CN
Inventors: T.W.马克; X.赖; M.W.图舍
Original assignee: University of Health Network
Current assignee: University of Health Network
Priority date: 2013-07-03
Filing date: 2014-07-02
Publication date: 2016-06-15
Also published as: AU2014286869A1; EP3016982A1; US9493561B2; JP2016523264A; US20150010542A1; CA2917077A1; WO2015000059A1; EP3016982A4

Abstract

本发明提供了用于调节TOSO活性以及治疗牵涉TOSO的疾病和病症的方法和组合物。所述方法和组合物包括使用一种或多种结合TOSO蛋白或TOSO蛋白配体的抗体。

Description

针对TOSO的抗体

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年7月3日提交的美国临时申请号61/842,766的权益，该美国临时申请的内容出于所有目的以全文引用的方式明确并入本文中。

发明背景

Toso或Faim3(Fas细胞凋亡诱导分子3)是最初通过在作为Fas诱导的凋亡细胞死亡的介体的T细胞白血病细胞系Jurkat细胞中进行逆转录病毒过度表达筛选而被任选表征的单跨膜细胞表面受体(Hitoshi，Y.等人，Toso，acellsurface，specificregulatorofFas-inducedapoptosisinTcells.Immunity，1998.8(4)：第461-71页)。后续研究已经表明，Toso是难以捉摸的IgM受体。Toso的表达似乎还与慢性淋巴细胞性白血病或CLL的特别侵袭性的形式相关。Toso活性的调节还可能影响免疫系统病症。

需要能够调节Toso活性的分子。

发明概述

相应地，本发明提供了用于调节Toso活性以及治疗牵涉Toso的疾病和病症的方法和组合物。

在一个方面，本发明提供了结合Toso或Toso配体的抗体。

在另一个方面，本发明提供了一种抗体，其包含含有SEQIDNO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57中的任一个的重链可变区。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种抗体，其包含具有与SEQIDNO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57中的任一个具有至少约95％序列同一性的序列的重链可变区，其中所述抗体结合Toso。

在另一个方面，本发明提供了一种抗体，其包含含有SEQIDNO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58中的任一个的轻链可变区。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种抗体，其包含具有与SEQIDNO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58中的任一个具有至少约95％序列同一性的序列的轻链可变区，其中所述抗体结合Toso。

在另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含：第一重链CDR，其包含表1中所列出的CDR1序列中的任一个；第二重链CDR，其包含表1中所列出的CDR2序列中的任一个；第三重链CDR，其包含表1中所列出的CDR3序列中的任一个；第一轻链CDR，其包含表2中所列出的CDR1序列中的任一个；第二轻链CDR，其包含表2中所列出的CDR2序列中的任一个；和第三轻链CDR，其包含表2中所列出的CDR3序列中的任一个，其中所述抗体结合Toso。

在另一个方面，本文中所描述的抗体涵盖人源化抗体。

在另一个方面，本发明提供了一种核酸，其编码与上述抗体中的任一种一致的抗体。

在另一个方面，本发明提供了一种表达载体，其编码与上述抗体中的任一种一致的抗体。

在另一个方面，本发明提供了一种制造与上述抗体中的任一种一致的抗体的方法，其中所述方法包括提供包含编码所述抗体的核酸的细胞的步骤，其中在适合于表达所述抗体的条件下培养所述细胞。

在另一个方面，本发明提供了用于治疗Toso相关疾病的方法，所述方法包括用与上述抗体中的任一种一致的抗体来治疗有需要的受试者。

附图简述

图1提供了结合Toso的抗体的序列。星号表示终止密码子，其在一些实施方案中可以通过本领域中已知的蛋白质工程改造方法来去除以允许表达全长序列。

图2提供了不结合Toso的抗体的序列。星号表示终止密码子，其在一些实施方案中可以通过本领域中已知的蛋白质工程改造方法来去除以允许表达全长序列。

发明详述

除非另外指出，否则本发明的实施可以采用在本领域技术人员能力范围内的有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学常规技术和描述。所述常规技术包括聚合物阵列合成、杂交、连接、噬菌体展示和使用标记的杂交检测。合适的技术的具体说明可以参考下文中的实施例。然而，当然也可以使用其他等同的常规程序。所述常规技术和描述可见于标准实验室手册中，诸如GenomeAnalysis：ALaboratoryManualSeries(第I-IV卷)；UsingAntibodies：ALaboratoryManual；Cells：ALaboratoryManual；PCRPrimer：ALaboratoryManual；和MolecularCloning：ALaboratoryManual(都得自于ColdSpringHarborLaboratoryPress)；Stryer，L.(1995)Biochemistry(第4版)Freeman，NewYork；Gait，“OligonucleotideSynthesis：APracticalApproach”1984，IRLPress，London；Nelson和Cox(2000)，Lehninger，PrinciplesofBiochemistry第3版，W.H.FreemanPub.，NewYork，N.Y.；和Berg等(2002)Biochemistry，第5版，W.H.FreemanPub.，NewYork，N.Y.，所有文献都出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

注意，除非上下文另外明确指示，否则如本文中和所附权利要求书中所使用，单数形式“一个/一种”和“该”包括复数个指示物。因而，举例来说，提到“聚合酶”是指一种试剂或这样的试剂的混合物，并且提到“该方法”包括提到本领域技术人员已知的等同步骤和方法等等。

除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义相同的含义。本文中所提到的所有出版物都出于描述和公开出版物中所描述的并且可以与目前描述的发明联合使用的装置、组合物、制剂和方法的目的以引用的方式并入本文中。

在提供数值范围时，应理解，除非上下文另外清楚指出，否则介于该范围的上限与下限之间、直至下限单位的十分之一的各居中值和该所述范围内的任何其他所述值或居中值都涵盖在本发明内。根据所述范围中的任何明确排除的界限，这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述较小范围中，并且还涵盖在本发明内。在所述范围包括一个或两个界限的情况下，排除那些所包括的界限中之任一个或两个的范围也包括在本发明中。

在以下描述中，阐述了许多具体细节以便更透彻地理解本发明。然而，本发明所属领域的技术人员应显而易见，可在不利于这些具体细节中的一个或多个的情况下实施本发明。在其他情况下，没有描述本领域技术人员众所周知的特征和众所周知的程序以避免使本发明不清楚。

为了可以更全面地理解本申请，以下阐述了若干定义。所述定义意在涵盖语法等同物。

如本文中所使用，术语“包含”意在指所述组合物和方法包括所述要素，但不排除其他。“基本上由……组成”当用于定义组合物和方法时应意指不包括对所述组合物或方法具有任何必要意义的任何其他要素。“由……组成”应意指排除要求保护的组合物的超过痕量要素的其他成分和实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案在本发明的范围内。相应地，希望所述方法和组合物可以包括附加步骤和组分，(包含)或可选地包括不具有重要意义的步骤和组合物(基本上由其组成)或可选地仅意指所述方法步骤或组合物(由其组成)。

所有数字标示，例如pH值、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是可改变(+)或(-)增量0.1的近似值。应理解，尽管未必总是明确阐述，但所有数字标示都前缀有术语“约”。术语“约”还包括精确值“X”以及“X”的微小增量，诸如“X+0.1”或“X-0.1”。还应理解，尽管未必总是明确陈述，但本文中所描述的试剂仅仅是示例性的并且所述试剂的等同物在本领域中是已知的。

“组合物”可以包括包含试剂或化合物的任何物质，并且还意在涵盖试剂或化合物与其他物质的任何组合，包括载体，例如惰性(例如可检测的试剂或标记)或活性化合物或组合物，诸如佐剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等等。载体还包括药物赋形剂和添加剂，蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如糖，包括单糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生化糖，诸如糖醇、醛糖酸、酯化糖等等；和多糖或糖聚合物)，其可单独或组合存在，以重量或体积计单独或组合构成1％至99.99％。示例性蛋白质赋形剂包括血清白蛋白，诸如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等等。也可以在缓冲能力方面起作用的代表性氨基酸/抗体组分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等等。碳水化合物类赋形剂还意欲在本发明的范围内，其实例包括但不限于单糖，诸如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等等；二糖，诸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等等；多糖，诸如棉子糖、松三糖、麦芽糊精、葡聚糖、淀粉等等；和糖醇，诸如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨醇(葡糖醇)和肌醇。

术语药学上可接受的载体(或介质)可以与术语生物学上相容的载体或介质互换使用，是指不仅与治疗上施用的细胞和其他试剂相容而且在合理医学判断的范围内、适合用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其他并发症且与合理的效益/风险比相称的试剂、细胞、化合物、材料、组合物和/或剂型。适合用于本发明的药学上可接受的载体包括液体、半固体(例如凝胶)和固体物质(例如如本领域中已知和本文中更详细描述的细胞支架和基质、管板和其他这类材料)。这些半固体和固体材料可以经过设计以便抵抗在体内降解(非生物可降解)，或其可以经过设计以便在体内降解(生物可降解、生物可侵蚀)。生物可降解材料还可以是生物可再吸收的或生物可吸收的，即，其可以溶解并且被吸收到体液中(水溶性移植物是一个实例)，或被降解并且最终通过转化成其他物质或通过天然途径分解并消除而从体内消除。

如本文中所使用，术语“患者”或“受试者”意指动物、哺乳动物或更进一步指人类患者。仅出于说明的目的，哺乳动物包括但不限于人类、猿、鼠类、牛、马、猪或绵羊。

如本文中所使用，术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合的短聚合物。寡核苷酸一般是至少约10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个核苷酸长。寡核苷酸可以用作引物或探针。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及稍后经修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，α碳与氢、羧基、氨基和R基团结合，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。所述类似物具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化学化合物。

如本文中所使用的术语“分离”是指基本上不含其他物质的分子或者生物或细胞物质，例如大于70％或80％或85％或90％或95％或98％。在一个方面，术语“分离”是指分别与天然来源中所存在的且允许处理所述物质以实现以其原生或天然状态下存在时不可实现的结果(例如重组复制或通过突变处理)的其他DNA或RNA或蛋白质或多肽或细胞或细胞器或组织或器官分离的核酸(诸如DNA或RNA)，或蛋白质或多肽，或细胞或细胞器，或组织或器官。术语“分离”还指基本上不含细胞物质、病毒物质或当通过重组DNA技术产生时的培养基或当化学合成时的化学前驱物或其他化学物质的核酸或肽。此外，“分离的核酸”意指包括天然情况下不作为片段存在且在天然状态下不会发现的核酸片段。术语“分离”在本文中还用于指与其他细胞蛋白质分离的多肽且意在涵盖经过纯化的和重组的多肽，例如纯度大于70％或80％或85％或90％或95％、98％或99％。术语“分离”在本文中还用于指与其他细胞或组织分离的细胞或组织且意在涵盖培养的和工程改造的细胞或组织。

“重组”核酸是指通过将正常情况下不一起存在的两个或更多个序列组合而产生的人工核酸。在一个实施方案中，其是通过出于诸如抗生素抗性的特定目的而将相关DNA引入现存生物体DNA，诸如细菌质粒中以编码或改变不同的性状而产生。“重组”多肽是来源于重组核酸的多肽。

如本文中所使用，术语“引物”是指足以指导基因转录的核酸序列。本发明中还包括足以使启动子依赖性基因表达可控制、具有细胞类型特异性、组织特异性或可由外部信号或试剂诱导的那些启动子元件。

在一些实施方案中，启动子是可诱导启动子或离散启动子。可诱导启动子可以由诸如温度或光的化学或物理条件开启。化学启动子的实例包括但不限于醇调节的启动子、四环素调节的启动子、类固醇调节的启动子、金属调节的启动子和发病机理相关启动子。离散启动子的实例可见于例如Wolfe等，MolecularEndocrinology16(3)：435-49中。

如本文中所使用，术语“调控元件”是指能够调节基因转录的核酸序列。调控元件的非限制性实例包括启动子、增强子、沉默子、聚腺苷酰化信号、转录终止序列。调控元件可以存在于原生基因的5′或3′区或在内含子内。

本文中还公开了多种蛋白质与其人类蛋白质和编码序列的GenBank登记号。然而，蛋白质不局限于具有由所公开的GenBank登记号表示的氨基酸序列的来源于人类的蛋白质，而是可以具有来源于其他动物，特别是温血动物(例如大鼠、豚鼠、小鼠、小鸡、兔、猪、绵羊、奶牛、猴子等)的氨基酸序列。

如本文中所使用，术语“Toso”、“FAIM3”或“Fas细胞凋亡抑制分子3”是指具有基本上与任何代表性Toso序列同一的氨基酸序列的蛋白质，包括GenBank登记号NP_001135945(人类同种型b)、NP_001180267(人类同种型c)、NP_005440(人类同种型a)、NP_081252(小鼠)或NP_001014843(大鼠)的任何和所有版本。GenBank登记号NM_001142473、NM_001193338、NM_005449、NM_026976和NM_001014843提供了合适的cDNA编码Toso。

如本文中所使用，术语“Toso的生物活性”或“Toso活性”是指与全长原生Toso蛋白相关的任何生物活性。在一些实施方案中，Toso的生物活性是指结合IgM抗体。在其他实施方案中，Toso的生物活性是指抑制CD11b或CD18活性。在其他实施方案中，Toso的生物活性是指增加粒细胞的活化阈值。活化阈值可以通过来自于骨髓的活化粒细胞的数目来测量。在其他实施方案中，Toso的生物活性包括树突状细胞的活化和其向T细胞呈递抗原的能力。在其他实施方案中，Toso的生物活性包括抑制细胞凋亡或增强TNF信号传递。在一些实施方案中，Toso生物活性等于具有由GenBank登记号NP_001135945、NP_001180267、NP_005440、NP_081252或NP_001014843(包括这些登记号的任何和所有版本)表示的氨基酸序列的蛋白质的活性。

如本文中所使用，术语“治疗”是指出于通过减轻、缓解、逆转或预防疾病或病症的至少一种不利影响或症状来改善患者的病状的目的施用药物组合物。

如本文中所使用，术语“预防”是指鉴别对疾病具有增加的敏感性但尚未展现疾病症状的受试者(即，患者)并且根据本公开的原则施用疗法。设计预防疗法以降低易感染受试者稍后将变成有症状患者或与不存在预防疗法时相比疾病将延迟发作或更缓慢进展的可能性。可以通过任何适当的方法，包括例如通过鉴别所述疾病或其他退化性脑病家族史将受试者鉴别为具有增加的发展所述疾病的可能性，或具有一个或多个指示疾病或疾病敏感性的诊断标记物。

如本文中所使用，术语“样品”或“测试样品”是指含有核酸的任何液体或固体物质。在合适的实施方案中，测试样品是获自生物来源(即，“生物样品”)，诸如培养物中的细胞或得自于动物，最优选地得自于人类的组织样品。

如本文中所使用，术语“基本上同一”当提及蛋白质或多肽时意指与参考氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的蛋白质或多肽。比较长度优选地是所述多肽或蛋白质的全长，但一般是至少10、15、20、25、30、40、50、60、80或100个或更多个连续氨基酸。“基本上同一”的核酸是与参考核酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸。比较长度优选地是所述核酸的全长，但一般是至少20个核苷酸、30个核苷酸、40个核苷酸、50个核苷酸、75个核苷酸、100个核苷酸、125个核苷酸或更多个。

如本文中所使用，“氨基酸取代”或“取代”是指在起始多肽序列中的特定位置上将一个氨基酸用另一个氨基酸置换。举例来说，取代M23Y是指23位上的甲硫氨酸经酪氨酸置换的变异多肽。

蛋白质或核酸的“生物等同物”是指在氨基酸或核酸序列方面基本上与所述蛋白质或核酸同一或具有等同的生物活性的蛋白质或核酸。

如本文中所使用，术语“有效量”是指以足以向患者提供医疗益处的频率递送的化合物(例如抗体或其生物学活性片段)的量。在一个实施方案中，蛋白质的有效量是足以治疗或改善疾病症状的量。

细胞“群体”是指在表型和/或基因型方面同一(克隆)或不同一的多于一个细胞的集合。

“基本上同源”描述了其中超过约50％或可选地超过约60％或可选地超过70％或可选地超过75％或可选地超过80％或可选地超过85％或可选地超过90％或可选地超过95％的细胞具有相同或相似的表型的细胞群体。表型可以通过预先选定的细胞表面标记物或其他标记物来确定。

术语自体转移、自体移植、自体移植物等等是指其中细胞供体同样是细胞置换疗法的受体的治疗。术语同种异体转移、同种异体移植、同种异体移植物等是指其中细胞供体与细胞置换疗法的受体属于同一物种，但并非同一个体的治疗。其中供体细胞与受体存在组织相容性匹配的细胞转移有时称为同基因转移。术语异种转移、异种移植、异种移植物等是指其中细胞供体与细胞置换疗法的受体属于不同的物种的治疗。

如本文中所使用，“抗体”包括整个抗体和其任何抗原结合片段或单链。因此，术语“抗体”包括含有包含免疫球蛋白分子的至少一部分的分子的任何蛋白质或肽。其实例包括但不限于重链或轻链的互补性决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架(FR)区或其任何部分或结合蛋白的至少一部分。一般来说，术语“抗体”包括了包括至少一个恒定结构域(包括但不限于CH1、CH2、CH3和CL)的任何多肽。用于本发明的抗体可以呈如本文中所描述的多种形式，包括传统抗体以及抗体衍生物、片段和模拟物。

抗体可以是多克隆的或单克隆的，并且可以从任何合适的生物来源(例如鼠类、大鼠、绵羊和犬类)中分离。

单克隆抗体是由细胞的单克隆或杂交瘤产生的抗体，并且因此是单一纯同源型抗体。

杂交瘤是在实验室中由产生抗体的淋巴细胞与不产生抗体的癌细胞(通常是骨髓瘤或淋巴瘤)融合而产生的细胞。杂交瘤增殖并产生特定单克隆抗体的连续供应。

如本文中所使用的术语“人类抗体”意在包括具有来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人类抗体可以包括并非由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变而引入的突变)。然而，如本文中所使用的术语“人类抗体”不打算包括将来源于另一个哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的CDR序列移植到人类框架序列上的抗体。因此，如本文中所使用，术语“人类抗体”是指其中基本上蛋白质的每个部分(例如CDR、框架、C_L、C_II结构域(例如C_II1、C_II2、C_H3)、铰链、(VL、VH))在人类中基本上都不具免疫原性，而仅具有微小序列变化或变异的抗体。类似地，指定灵长类(猴、狒狒、黑猩猩等)、啮齿动物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠、仓鼠等等)和其他哺乳动物的抗体命名为这些物种、亚属、属、亚科、科特异性抗体。此外，嵌合抗体包括上述抗体的任何组合。相对于未经修饰的抗体，这样的变化或变异任选地且优选地在人类或其他物种中保留或降低免疫原性。因此，人类抗体不同于嵌合抗体或人源化抗体。需要指出，人类抗体可以由非人类动物或能够表达功能重排的人免疫球蛋白(例如，重链和/或轻链)基因的原核细胞或真核细胞产生。此外，当人类抗体是单链抗体时，其可以包含原生人类抗体中未发现的连接肽。举例来说，Fv可以包含诸如二至约八个甘氨酸或其他氨基酸残基的连接肽，其连接重链可变区与轻链可变区。这种连接肽被认为是人类起源的。

如本文中所使用，人类抗体“来源于”特定的种系序列，如果所述抗体是获自使用人类免疫球蛋白序列的系统，例如通过对携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行免疫或通过筛选人免疫球蛋白基因文库的话。“来源于”人类种系免疫球蛋白序列的人类抗体可以通过比较所述人类抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白的氨基酸序列来鉴定。所选择的人类抗体的氨基酸序列典型地与由人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少90％同一性，并且含有当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，小鼠种系序列)比较时鉴定所述人类抗体属于人类的氨基酸残基。在某些情况下，人类抗体的氨基酸序列可以与所述种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列具有至少95％、或甚至至少96％、97％、98％或99％同一性。典型地，来源于特定人类种系序列的人类抗体相对于人类种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列将呈现不超过10个氨基酸差异。在某些情况下，人类抗体可以与所述种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列呈现不超过5个、或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。

如本文中所使用的术语“重组人类抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，诸如从人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(例如小鼠)或由其制得的杂交瘤分离的抗体，从经过转化以表达所述抗体的宿主细胞(例如从转染瘤)分离的抗体，从重组、组合人类抗体文库分离的抗体，以及通过涉及剪接人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。所述重组人类抗体具有来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，所述重组人类抗体可以经受体外诱变(或者当使用人类Ig序列的转基因动物时进行体内体细胞诱变)，并且重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是当来源于人类种系VH和VL序列或与其相关时可能不会天然存在于体内人类抗体种系谱系内的序列。本文中描述了用于制造这些抗体的方法描述。

如本文中所使用的“同种型”意指由其恒定区的化学特征和抗原特征定义的任何免疫球蛋白亚类。应理解，治疗抗体还可以包含同种型和/或亚类的杂合物。

如本文中所使用的术语“多克隆抗体”或“多克隆抗体组合物”是指来源于不同的B细胞系的抗体制剂。其为针对特定抗原分泌的免疫球蛋白分子的混合物，每个分子识别不同的表位。

如本文中所使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指具有单一分子组成的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物对特定表位呈现单一结合特异性和亲和力。

如本文中所使用，术语“标记”意指直接或间接缀合于待检测组合物以产生经“标记”的组合物的可直接或间接检测的化合物或组合物，例如N末端组氨酸标签(N-His)、磁活性同位素(例如¹¹⁵Sn、¹¹⁷Sn和¹¹⁹Sn)、非放射性同位素(诸如¹³C和¹⁵N)、多核苷酸或蛋白质(诸如抗体)。该术语还包括与将会在表达插入的序列后提供诸如绿色荧光蛋白(GFP)等信号的多核苷酸缀合的序列。标记可以是自身可检测的(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者，在酶促标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化。标记可能适用于小规模检测或更适用于高通量筛选。因此，合适的标记包括但不限于磁活性同位素、非放射性同位素、放射性同位素、荧光染料、化学发光化合物、染料和蛋白质，包括酶。标记可以简单地被检测或可以被定量。被简单检测的反应一般包括仅证实其存在的反应，而被定量的反应一般包括具有可定量(例如可用数值报告)的值，诸如强度、极化度和/或其他性质的反应。在发光或荧光测定中，可以使用与实际上涉及结合的测定组分相关的发光团或荧光团直接产生或者使用与另一组分(例如报告分子或指示分子)相关的发光团或荧光团间接产生可检测的反应。

产生信号的发光标记的实例包括但不限于生物发光和化学发光。可检测的发光反应一般包括发光信号的变化或发生。用于发光标记测定组分的合适的方法和发光团在本领域中是已知的并且描述于例如Haugland，RichardP.(1996)HandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals(第6版)中。发光探针的实例包括但不限于水母发光蛋白和荧光素酶。

合适的荧光标记的实例包括但不限于荧光素、若丹明、四甲基若丹明、曙红、藻红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀绿、芪、荧光黄、CascadeBlue^TM和得克萨斯红。其他合适的光学染料描述于Haugland，RichardP.(1996)HandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals(第6版)中。

在另一个方面，荧光标记被功能化以促进共价连接于细胞或组织中或表面上所存在的细胞组分，诸如细胞表面标记物。合适的官能团包括但不限于异硫氰酸酯基、氨基、卤代乙酰基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺基酯和磺酰基卤化物，所有这些都可以用于将荧光标记连接于第二分子。荧光标记的官能团的选择将取决于与连接子、试剂、标记物或第二标记试剂连接的位点。

如本文中所使用的“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”意指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体且随后引起靶细胞溶解。ADCC跟与FcγRIIIa的结合相关；与FcγRIIIa的结合增加导致ADCC活性增加。

如本文中所使用的“ADCP”或抗体依赖性细胞介导的吞噬意指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体且随后造成靶细胞的吞噬。

“修饰”在本文中意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失，或与蛋白质化学连接的部分的变化。举例来说，修饰可以是与蛋白质连接的碳水化合物或PEG结构的变化。“氨基酸修饰”在本文中意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。为清楚起见，除非另外指出，否则氨基酸修饰始终针对由DNA编码的氨基酸，例如具有DNA和RNA中的密码子的20个氨基酸。

“氨基酸取代”或“取代”在本文中意指用不同的氨基酸置换亲本多肽序列中特定位置上的氨基酸。具体来说，在一些实施方案中，取代是针对特定位置上非天然存在的氨基酸，即天然情况下不存在于生物体内或任何生物体中的氨基酸。举例来说，取代E272Y是指272位上的谷氨酸经酪氨酸置换的变异多肽。为清楚起见，已经过工程改造以改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如将CGG(编码精氨酸)交换成CGA(仍是编码精氨酸)以增加宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸取代”；即，尽管产生了编码相同蛋白质的新基因，但如果所述蛋白质在特定位置上具有与起始时相同的氨基酸，则其不是氨基酸取代。

如本文中所使用的“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列中的特定位置上添加氨基酸序列。举例来说，-233E或233E指示在233位之后和在234位之前插入谷氨酸。另外，-233ADE或A233ADE指示在233位之后和在234位之前插入AlaAspGlu。

如本文中所使用的“氨基酸缺失”或“缺失”意指去除亲本多肽序列中的特定位置上的氨基酸序列。举例来说，E233-或E233#指示缺失233位上的谷氨酸。另外，EDA233-或EDA233#指示从233位开始缺失序列GluAspAla。

如本文中所使用的“变异蛋白质”或“蛋白质变体”或“变体”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本蛋白质不同的蛋白质。蛋白质变体可能是指所述蛋白质本身、包含所述蛋白质的组合物或编码其的氨基序列。优选地，蛋白质变体与亲本蛋白质相比具有至少一个氨基酸修饰，例如与亲本相比具有约一至约七十个氨基酸修饰且优选地具有约一至约五个氨基酸修饰。在一些实施方案中，亲本多肽，例如Fc亲本多肽，是人类野生型序列，诸如来自于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区，但具有变体的人类序列也可以充当“亲本多肽”。本文中的蛋白质变体序列优选地将与亲本蛋白质序列具有至少约80％同一性，且最优选地具有至少约90％同一性，更优选地具有至少约95％-98％-99％同一性。变异蛋白质可能是指变异蛋白质本身、包含所述蛋白质变体的组合物或编码其的DNA序列。相应地，如本文中所使用的“抗体变体”或“变异抗体”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本抗体的抗体，如本文中所使用的“IgG变体”或“变异IgG”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本IgG(再次，在许多情况下，来自于人类IgG序列)的抗体，且如本文中所使用的“免疫球蛋白变体”或“变异免疫球蛋白”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本免疫球蛋白序列的免疫球蛋白序列。如本文中所使用的“Fc变体”或“变异Fc”意指在Fc结构域中包含氨基酸修饰的蛋白质。本发明的Fc变体是根据构成其的氨基酸修饰来定义。因此，举例来说，N434S或434S是相对于亲本Fc多肽在434位上具有取代丝氨酸的Fc变体，其中编号是根据EU指数。同样，M428L/N434S定义了相对于亲本Fc多肽具有取代M428L和N434S的Fc变体。可能未规定WT氨基酸的同一性，在这种情况下，上述变体被称为428L/434S。应指出，提供取代的顺序是任意的，那就是说，举例来说，428L/434S是与M428L/N434S相同的Fc变体，等等。对于本发明中所讨论的涉及抗体的所有位置，除非另外指出，否则氨基酸位置编号是根据EU指数。如Kabat或EU编号方案中的EU指数或EU指数是指EU抗体的编号(Edelman等，1969，ProcNatlAcadSciUSA63：78-85，以全文引用的方式并入在此)。修饰可以是添加、缺失或取代。取代可以包括天然存在的氨基酸和在一些情况下合成氨基酸。实例包括美国专利号6,586,207；WO98/48032；WO03/073238；US2004-0214988A1；WO05/35727A2；WO05/74524A2；J.W.Chin等，(2002)，JournaloftheAmericanChemicalSociety124：9026-9027；J.W.Chin，&P.G.Schultz，(2002)，ChemBioChem11：1135-1137；J.W.Chin等，(2002)，PICASUnitedStatesofAmerica99：11020-11024；和L.Wang，&P.G.Schultz，(2002)，Chem.1-10，全部以全文引用的方式并入。

如本文中所使用，“蛋白质”在本文中意指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。肽基可以包含天然存在的氨基酸和肽键，或合成肽模拟结构，即，“类似物”，诸如类肽(参见Simon等，PNASUSA89(20)：9367(1992)，以全文引用的方式并入)。氨基酸可以是天然存在的或合成的(例如，并非由DNA编码的氨基酸)；如本领域中技术人员应了解。举例来说，出于本发明的目的，高苯丙氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸和正亮氨酸被视为合成氨基酸，而且可以利用D和L(R或S)构象的氨基酸。本发明的变体可以包含修饰，包括使用例如由Schultz和同事开发的技术并入的合成氨基酸的使用，包括但不限于以下所描述的方法：Cropp和Shultz，2004，TrendsGenet.20(12)：625-30；Anderson等，2004，ProcNatlAcadSciUSA101(2)：7566-71；Zhang等，2003，303(5656)：371-3；和Chin等，2003，Science301(5635)：964-7，全部以全文引用的方式并入。另外，多肽可以包括一个或多个侧链或末端的合成衍生化、糖基化、PEG化、环状排列、环化、与其他分子的连接子、与蛋白质或蛋白质结构域的融合和肽标签或标记的添加。

如本文中所使用的“残基”意指蛋白质中的位置和其相关氨基酸同一性。举例来说，IgG1中的天冬酰胺297(也称为Asn297或N297)是人类抗体IgG1中297位上的残基。

如本文中所使用的“Fab”或“Fab区”意指包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以指呈分离状态的这个区域或在全长抗体、抗体片段或Fab融合蛋白质情况下的这个区域。如本文中所使用的“Fv”或“Fv片段”或“Fv区”意指包含单一抗体的VL和VH结构域的多肽。

如本文中所使用的“非天然存在的修饰”意指不是同种型的氨基酸修饰。举例来说，因为无IgG在434位上包含丝氨酸，所以IgG1、IgG2、IgG3或IgG4(或其杂合物)中的取代434S被视为非天然存在的修饰。

如本文中所使用的“效应功能”意指由抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用引起的生物化学事件。效应功能包括但不限于ADCC、ADCP和CDC。

如本文中所使用的“亲本多肽”意指随后经修饰以产生变体的起始多肽。亲本多肽可以是天然存在的多肽或天然存在的多肽的变体或工程改造版本。亲本多肽可以指多肽本身、包含所述亲本多肽的组合物或编码其的氨基酸序列。相应地，如本文中所使用的“亲本免疫球蛋白”意指未经修饰的免疫球蛋白多肽，其经修饰以产生变体，且如本文中所使用的“亲本抗体”意指未经修饰的抗体，其经修饰以产生变异抗体。应指出，“亲本抗体”包括如以下所概述的已知的市售重组产生的抗体。

如本文中所使用的“位置”意指蛋白质序列中的位置。位置可依序或根据确定的格式，例如用于抗体编号的EU指数进行编号。

如本文中所使用的“靶抗原”意指被指定抗体的可变区特异性结合的分子。靶抗原可以是蛋白质(诸如Toso蛋白)、碳水化合物、脂质或其他化合物。

如本文中所使用的“靶细胞”意指表达靶抗原的细胞。

如本文中所使用的“可变区”意指包含基本上由分别组成κ、λ和免疫球蛋白重链基因座的Vκ、Vλ和/或VH基因中的任一个编码的一个或多个Ig结构域的免疫球蛋白区域。

“野生型或WT”在本文中意指在自然界中发现的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因变异。WT蛋白质具有尚未有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。

尽管主要参考具体实施方案描述了描述本发明，但也预见了在阅读本公开内容后其他实施方案对于本领域技术人员将显而易见，并且希望所述实施方案包含在本发明方法内。

I.发明概述

本发明涉及用于调节Toso蛋白(其在本文中还被可互换地称为“Toso”或“Toso受体”或“Faim3”或“FCMR”)的活性的方法和组合物。本发明的方法和组合物可以根据且在一些实施方案中与调节Toso蛋白的活性的其他已知方法组合使用，举例来说，诸如2013年3月14日提交的USSN13/831,031中所描述的那些方法，该史献的全史且具体来说是与调节Toso蛋白的活性的方法和组合物有关的任何公开内容、权利要求、附图或其他教导内容出于所有目的以引用的方式并入在此。

在一些实施方案中，本发明的方法和组合物可增加Toso蛋白的活性。在其他实施方案中，本发明的方法和组合物可抑制Toso蛋白的活性。

在某些方面，用于调节Toso蛋白的活性的组合物包括能结合Toso蛋白或Toso蛋白的配体的药剂。在其他实施方案，本发明的组合物包括能结合Toso蛋白或Toso蛋白的配体的抗体。

本发明进一步涉及通过施用在受试者中调节Toso活性的抗体来治疗病症和疾病的方法。如本文中更详细论述，本发明的抗体可用于治疗罹患不限于以下各项疾病的受试者：II型糖尿病、自身免疫性病症(包括但不限于1型糖尿病、多发性硬化或类风湿性关节炎)、哮喘、过敏、慢性阻塞性肺病(“COPD”)、高IgM综合征、CLL、狼疮或中性白细胞增多相关病症(包括但不限于中性粒细胞减少、严重先天性中性粒细胞减少、环形中性粒细胞减少、抗体介导的中性粒细胞减少、网状细胞发育不全、白细胞粘附缺陷、家族性骨髓增生性疾病、慢性骨髓性白血病、家族性冷激性荨麻疹和白细胞增多以及慢性肉芽肿病)。

II.针对Toso的抗体

本发明的抗体调节Toso活性。在一些实施方案中，本发明的抗体能增加Toso活性。在其他实施方案中，本发明的抗体能降低Toso活性。在一些实施方案中，本发明的抗体直接结合Toso蛋白。在其他实施方案中，本发明的抗体结合Toso蛋白的配体。在其他实施方案中，本发明的抗体与中间蛋白质或其他分子结合或以其他方式相互作用，并且通过与所述中间蛋白质或其他分子的相互作用间接地影响Toso活性。

制备抗体的方法在本领域中一般是已知的。举例来说，美国专利号6,727,350讨论了Toso抗体和用于制备其的方法，并且其全文且具体来说是与针对Toso蛋白的抗体有关的所有教导内容出于所有目的在此以引用的方式并入。

在一些实施方案中，使用本领域中已知的和本文中更详细描述的方法，通过噬菌体展示筛选来鉴别本发明的抗体。在其他实施方案中，所述方法将包括通过将噬菌体展示筛选的结果克隆到人类IgG的表达载体中来产生完全人类抗体。

用于本发明的抗体可以呈如本文中所描述的多种形式，包括下文所描述的传统抗体以及抗体衍生物、片段和模拟物。一般来说，术语“抗体”包括了包括至少一个恒定结构域(包括但不限于CH1、CH2、CH3和CL)的任何多肽。

传统抗体结构单元典型地包含四聚体。各四聚体典型地由两对同一的多肽链构成，各对具有一个“轻”链(典型地具有约25kDa的分子量)和一个“重”链(典型地具有约50至70kDa的分子量)。人类轻链分类为κ和λ轻链。本发明涉及IgG类别，其具有若干个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。因此，如本文中所使用的“同种型”意指由其恒定区的化学特征和抗原特征定义的任何免疫球蛋白亚类。应理解，治疗抗体还可以包含同种型和/或亚类的杂合物。

各链的氨基末端部分包括约100至110或更多个氨基酸的主要负责抗原识别的可变区，在本领域中和本文中一般被称为“Fv结构域”或“Fv区”。在可变区中，针对重链和轻链的各V结构域的三个环聚集以形成抗原结合位点。各环被称为互补性决定区(下文称为“CDR”)，其中氨基酸序列中的变异最显著。“可变”是指可变区的某些节段的序列在抗体中在序列方面广泛差异。可变区内的变异性不均匀分布。相反，V区由被称为“高变区”的各自为9至15个氨基酸长或更长的极端变异性较短区域隔开的称为框架区(FR)的具有15至30个氨基酸的相对不变的区段组成。

各VH和VL由三个高变区(“互补性决定区”，“CDR”)和四个FR构成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

高变区一般涵盖轻链可变区中的约氨基酸残基24至34(LCDR1；“L”表示轻链)、50至56(LCDR2)和89至97(LCDR3)的氨基酸残基和重链可变区中的约31至35B(HCDR1；“H”表示重链)、50至65(HCDR2)和95至102(HCDR3)；Kabat等，SEQUENCESOFPROTEINSOFIMMUNOLOGICALINTEREST，第5版.PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，Md.(1991)，和/或形成高变环的那些残基(例如轻链可变区中的残基26至32(LCDR1)、50至52(LCDR2)和91至96(LCDR3)和重链可变区中的26至32(HCDR1)、53至55(HCDR2)和96至101(HCDR3)；Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917。以下描述本发明的特定CDR。

贯穿本说明书，当提到可变结构域(大约轻链可变区中的残基1至107和重链可变区中的残基1至113)中的残基时一般使用Kabat编号系统(例如Kabat等，同上(1991))。

CDR有助于形成抗体的抗原结合或更具体来说表位结合位点。“表位”是指与抗体分子的可变区中被称为互补位的特定抗原结合位点相互作用的决定子。表位是诸如氨基酸或糖侧链的分子的组群且通常具有特定的结构特征以及特定的电荷特征。单一抗原可以具有多于一个表位。

表位可以包含直接涉及结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和不直接涉及结合的其他氨基酸残基，诸如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基；换句话说，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的足迹内。

表位可以是构象的或线性的。构象表位是由来自于线性多肽链的不同节段的空间上毗连的氨基酸产生。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。构象和非构象表位的不同之处可能在于在存在变性溶剂的情况下，与前者而不是后者的结合丧失。

在独特的空间构象下，表位典型地包括至少3个且更通常至少5或8至10个氨基酸。可以在简单免疫测定法中验证识别相同表位的抗体，所述免疫测定法显示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原结合，例如“绑定(binning)”的能力。

在一些实施方案中，所述抗体是全长。“全长抗体”在本文中意指组成抗体的天然生物学形式的结构，包括可变区和恒定区，包括一个或多个如本文中所概述的修饰。

可选地，所述抗体可以具有多种结构，包括但不限于抗体片段、单克隆抗体、双特异性抗体、微抗体、结构域抗体、合成抗体(在本文中有时被称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合物(有时被称为“抗体缀合物”)和各自相应的片段。

抗体片段

在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段。特别感兴趣的是包含Fc区、Fc融合物和重链恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3)此外还包括恒定重区融合物的抗体。

特定抗体片段包括但不限于(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由单一可变组成的dAb片段(Ward等，1989，Nature341：544-546，以全文引用的方式并入)；(v)分离的CDR区；(vi)包含两个连接的Fab片段的二价片段F(ab′)2片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域由允许这两个结构域缔合以形成抗原结合位点的肽连接子连接(Bird等，1988，Science242：423-426；Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5879-5883，以全文引用的方式并入)；(viii)双特异性单链Fv(WO03/11161，以引用的方式并入在此)；和(ix)通过基因融合构建的多价或多特异性片段“二抗体”或“三抗体”(Tomlinson等，2000，MethodsEnzymol.326：461-479；WO94/13804；Holliger等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-6448，全部以全文引用的方式并入)。抗体片段可以经修饰。举例来说，分子可以通过并入连接VH和VL结构域的二硫桥加以稳定(Reiter等，1996，NatureBiotech.14：1239-1245，以全文引用的方式并入)。

嵌合和人源化抗体

在一些实施方案中，支架组分可以是来自于不同的物种的混合物。因而，如果蛋白质是抗体，则所述抗体可以是嵌合抗体和/或人源化抗体。一般来说，“嵌合抗体”和“人源化抗体”是指组合了来自多于一个物种的区域的抗体。举例来说，“嵌合抗体”在传统上包含来自于小鼠(或在一些情况下大鼠)的可变区和来自于人类的恒定区。“人源化抗体”一般是指可变结构域框架区交换为人类抗体中所发现的序列的非人类抗体。一般来说，在人源化抗体中，除了CDR以外的整个抗体是由人类来源的多核苷酸编码，或除了其CDR内以外与此种抗体同一。将CDR(其中一些或全部是由起源于非人类生物体的核酸编码)移植到人类抗体可变区的β片框架中以产生抗体，其特异性由移植的CDR决定。所述抗体的产生描述于例如以下文献中：WO92/11018；Jones，1986，Nature321：522-525；Verhoeyen等，1988，Science239：1534-1536，所述文献以全文引用的方式并入。通常需要选定的受体框架残基至相应的供体残基的“回复突变”以重新获得初始移植构建体所丧失的亲和力(美国专利号5,530,101；美国专利号5,585,089；美国专利号5,693,761；美国专利号5,693,762；美国专利号6,180,370；美国专利号5,859,205；美国专利号5,821,337；美国专利号6,054,297；美国专利号6,407,213，所有专利都以引用的方式并入)。人源化抗体最适宜还将包含免疫球蛋白恒定区(典型地为人类免疫球蛋白恒定区)的至少一部分，且因此典型地将包含人类Fc区。还可以使用具有经过基因工程改造的免疫系统的小鼠来产生人源化抗体。Roque等，2004，Biotechnol.Prog.20：639-654，所述文献以全文引用的方式并入。用于人源化和重构非人类抗体的多种技术和方法在本领域中是众所周知的。(参见Tsurushita和Vasquez，2004，HumanizationofMonoclonalAntibodies，MolecularBiologyofBCells，533-545，ElsevierScience(USA)和其中所引用的参考文献，所述文献全部以全文引用的方式并入)。人源化方法包括但不限于以下文献中所描述的方法：Jones等，1986，Nature321：522-525；Riechmann等，1988，Nature332：323-329；Verhoeyen等，1988，Science，239：1534-1536；Queen等，1989，ProcNatlAcadSci，USA86：10029-33；He等，1998，J.Immunol.160：1029-1035；Carter等，1992，ProcNatlAcadSciUSA89：4285-9；Presta等，1997，CancerRes.57(20)：4593-9；Gorman等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：4181-4185；O′Connor等，1998，ProteinEng11：321-8，所述文献全部以全文引用的方式并入。降低非人类抗体可变区的免疫原性的人源化或其他方法可以包括表面重建法，如例如Roguska等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：969-973中所描述，所述文献以全文引用的方式并入。在一个实施方案中，亲本抗体已进行了亲和力成熟，如本领域中已知。基于结构的方法可以用于人源化和亲和力成熟，举例来说，如美国序列号11/004,590中所描述。基于选择的方法可以用于对抗体可变区进行人源化和/或亲和力成熟，包括但不限于以下文献中所描述的方法：Wu等，1999，J.Mol.Biol.294：151-162；Baca等，1997，J.Biol.Chem.272(16)：10678-10684；Rosok等，1996，J.Biol.Chem.271(37)：22611-22618；Rader等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：8910-8915；Krauss等，2003，ProteinEngineering16(10)：753-759，所述文献全部以全文引用的方式并入。其他人源化方法可能包括仅移植CDR的一部分，包括但不限于以下文献中所描述的方法：美国序列号09/810,510；Tan等，2002，J.Immunol.169：1119-1125；DePascalis等，2002，J.Immunol.169：3076-3084，所述文献全部以全文引用的方式并入。

在一个实施方案中，所述抗体是微抗体。微抗体是包含与CH3结构域连接的scFv的最小化抗体样蛋白质。Hu等，1996，CancerRes.56：3055-3061，该文献以全文引用的方式并入。在一些情况下，scFv可以连接于Fc区，并且可以包括一些或整个铰链区。

Toso抗体和变体

如本文中所使用，术语“Toso抗体”是指结合Toso或结合Toso配体的任何抗体，包括包含本文中所描述的任何序列和其变体的抗体。

在某些方面，本发明的Toso抗体包括包含如图1中和以下表1和表2中所提供的CDR序列的抗体。

表1：Toso抗体的CDR序列-重链

表2：Toso抗体的CDR序列-轻链

在其他实施方案中，本发明的Toso抗体包含如图1中所提供的CDR序列的变体。一般来说，如本文中所描述，变体可以包括任何数目的修饰，只要蛋白质的功能仍存在即可。也就是说，在利用包含如图1中所提供的序列的任何抗体的CDR产生的氨基酸变体的情况下，举例来说，抗体仍将特异性结合Toso或Toso配体。类似地，举例来说，如果用Fc区产生氨基酸变体，则变异抗体将维持所述抗体的具体应用或适应症所需的受体结合功能。

然而，一般来说，由于一般利用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代，正如通常发生的那样，所以目标是利用最少数目的修饰来改变功能。在一些情况下，存在1至5个修饰，而1至2、1至3和1至4也用于多个实施方案中。

在一些实施方案中，在本发明的Toso抗体的一个或多个CDR中进行如图1以及表1和表2中所提供的一个或多个氨基酸修饰。一般来说，任何单一CDR中仅有1或2或3个氨基酸被取代，并且一般在一组CDR内进行不超过4、5、6、7、8、9或10个变化。然而，应了解，特定抗体的任何CDR中无取代、1、2或3个取代的任何组合可以独立地且任选地与任何其他取代组合。

在一些情况下，CDR中的氨基酸修饰被称为“亲和力成熟”。“亲和力成熟”抗体是与不具有那些变化的亲本抗体相比在一个或多个CDR中具有一个或多个变化，由此改善抗体对抗原的亲和力的抗体。在一些情况下，尽管很少，但可能需要降低抗体对其抗原的亲和力，但这一般不是优选的。

可以进行亲和力成熟以使抗体对抗原的结合亲和力与“亲本”抗体相比增加至少约10％至50％-100％-150％或更多或1至5倍。优选的亲和力成熟抗体将对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟抗体是通过已知的程序来产生。参见例如Marks等，1992，Biotechnology10：779-783，其描述了通过可变重链(VH)和可变轻链(VL)结构域改组来进行亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机诱变描述于例如以下文献中：Barbas等，1994，Proc.Nat.Acad.Sci，USA91：3809-3813；Shier等，1995，Gene169：147-155；Yelton等，1995，J.Immunol.155：1994-2004；Jackson等，1995，J.Immunol.154(7)：3310-9；和Hawkins等，1992，J.Mol.Biol.226：889-896。

可选地，可以在本发明抗体的一个或多个CDR中进行“沉默”，例如不显著改变抗体对抗原的亲和力的氨基酸修饰。这些可能出于多种原因而进行，包括优化表达(如可以对编码本发明抗体的核酸进行)。

因此，本发明的CDR和抗体的定义内包括变异CDR和抗体；即，本发明的抗体可以在抗体3kr7、k-2-5、5/7k5、5/7k1、5/7k6、5/15kL24、5/15kL26、5/15kL30、k-4.15、k-4.16、k-4.18、k-4.20、k-4.17、L-1-13、1R2kr3、K3-22、k-2-48、K3-24、5/15L28、5/15kL19、k-5.10、k-2-42、1R2kr30、K1、L1、k-2-32、L-8.2、L-8.6、L-8.17的一个或多个CDR中包括氨基酸修饰，其重链和轻链序列提供于图1中。另外，氨基酸修饰还可以独立地且任选地在CDR外的区域，包括框架区和恒定区中进行。

在一些实施方案中，本发明的Toso抗体(在本文中也称为“抗Toso”或“抗Toso抗体”)包含变异Fc结构域。如本领域中已知，抗体的Fc区与许多Fc受体和配体相互作用，从而赋予被称为效应功能的一系列重要的功能性能力。这些Fc受体包括但不限于(在人类)中FcγRI(CD64)，包括同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；以及FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158，与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)相关)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)、FcRn(新生儿受体)、C1q(涉及补体依赖性细胞毒性(CDC)的补体蛋白)和FcRn(涉及血清半衰期的新生儿受体)。可以如例如以下文献中所概述在一个或多个位置上进行合适的修饰：US2004/013210、US2005/0054832、US2006/0024298、US2006/0121032、US2006/0235208、US2007/0148170、美国专利号6,737,056、美国专利号7,670,600、美国专利号6,086,875，所有文献都以全文引用的方式明确并入，且具体来说是能增加与Fc受体的结合的特定氨基酸取代。

在其他方面，本发明的Toso抗体包含图1中所提供的任何全长重链或轻链序列。在其他实施方案中，本发明的Toso抗体包含具有与图1中所提供的任何全长重链或轻链序列具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％序列同一性的序列。

在其他方面，本发明的Toso抗体包含了涵盖如图1以及表1和表2中所提供的CDR序列的共有序列。所述共有序列可以通过比对CDR序列和通过使用可得自公开数据库的工具来鉴别。

在示例性实施方案中，本发明的Toso抗体包含含有以下共有序列的重链CDR1：G-X1-TFS-X2-Y-X3，其中X1是F、D或Y，X2是N、D或S，且X3是A、G、W或N。

在其他实施方案中，本发明的Toso抗体包含含有以下共有序列的重链CDR2：I-X1-PSG-X2-T-X3，其中X1是S、D或Y，X2是G或D，且X3是T或P。

在其他实施方案中，本发明的Toso抗体包含含有以下共有序列的轻链CDR1：Q-S-X1-S-X2-Y，其中X1是V或I，且X2是S、D或N。

在其他实施方案中，本发明的Toso抗体包含含有以下共有序列的轻链CDR3：QQ-X1-Y-X2-TP-X3-T，其中X1是F、R或S，X2是N、G、T、S或I，且X3是L、I、E或C。

如应了解，尽管用于鉴别针对特定蛋白质的抗体的方法在本领域中是已知的，但并非所述方法中所鉴别的所有抗体都会结合目标蛋白质。因此，本发明的一个方面是鉴别结合Toso的抗体与不结合Toso的抗体的不同，参见例如图1的来自于结合Toso的抗体的抗体重链和轻链序列，与图2中的不结合Toso的抗体重链和轻链序列相对。

在其他方面，本发明提供了一种表达载体，其编码与本文中所描述的任何序列一致和与图1中所提供的任何序列一致的抗体或蛋白质。

在其他方面，本发明提供了一种制造与本文中所描述的任何序列一致和与图1中所提供的任何序列一致的抗体或蛋白质的方法，所述方法包括提供包含编码该抗体或蛋白质的核酸的细胞，其中在适合于表达所述抗体或蛋白质的条件下培养所述细胞。

在其他方面，本发明提供了一种治疗Toso相关疾病的方法，所述方法包括用与本文中所描述的任何序列一致和与图1中所提供的任何序列一致的抗体或蛋白质治疗有需要的受试者。

在其他方面，本发明的抗体用于多种应用，包括Toso相关疾病的诊断和其治疗。

对Toso抗体的其他修饰

除以上概述的任何修饰和变体以外，可以进行其他修饰。举例来说，分子可以通过并入连接VH和VL结构域的二硫桥加以稳定(Reiter等，1996，NatureBiotech.14：1239-1245，全文且具体来说与分子(包括抗体)的修饰相关的所有教导内容出于所有目的以引用的方式并入)。另外，可如以下所概述对抗体进行多种共价修饰。

抗体的共价修饰包括在本发明的范围内，且一般但并不总是在翻译后进行。举例来说，通过使抗体的特定氨基酸残基与能够与所选侧链或者N或C末端残基反应的有机衍生化剂反应将抗体的若干种类型的共价修饰引入所述分子中。

最通常使半胱氨酰残基与α-卤代乙酸酯(和相应的胺)，诸如氯乙酸或氯乙酰胺反应，得到羧甲基或羧酰胺基甲基衍生物。半胱氨酰残基还可以通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑等等反应来进行衍生化。

另外，半胱氨酸上的修饰特别适用于抗体-药物缀合物(ADC)应用，如以下进一步描述。在一些实施方案中，抗体的恒定区可以经过工程改造以含有一个或多个特别具有“硫醇反应性”的半胱氨酸，以便允许更具特异性地且更受控制地放置药物部分。参见例如美国专利号7,521,541，以全文引用的方式并入本文中。

通过在pH5.5至7.0下与焦碳酸二乙酯反应对组氨酰残基进行衍生化，因为这种试剂对组氨酰侧链具有相对特异性。对溴苯甲酰甲基溴也有用；所述反应优选地在0.1M二甲胂酸钠中在pH6.0下进行。

使赖氨酰和氨基末端残基与琥珀酸或其他羧酸酐反应。利用这些试剂的衍生化具有逆转赖氨酰残基的电荷的作用。用于衍生化含α-氨基的残基的其他合适的试剂包括亚氨酸酯，诸如甲基吡啶亚胺甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氢化物；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4-戊二酮；和利用乙醛酸的转氨酶催化反应。

通过与一种或若干种常规试剂反应来修饰精氨酰残基，其中有苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮。精氨酸残基的衍生化需要在碱性条件下进行反应，因为存在高pKa的胍官能团。此外，这些试剂可能与赖氨酸基团以及精氨酸ε-氨基反应。

可对酪氨酰残基进行特定修饰，特别感兴趣的是通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应将光谱标记引入酪氨酰残基中。最通常分别使用N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷来形成O-乙酰基酪氨酰物质和3-硝基衍生物。使用125I或131I对酪氨酰残基进行碘化以制备经过标记的蛋白质以用于放射免疫测定法，以上所描述的氯胺T法是合适的。

通过与碳化二亚胺(R′-N＝C＝N--R′)反应对羧基侧基(天冬氨酰或谷氨酰)进行选择性修饰，其中R和R′任选地是不同的烷基，诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳化二亚胺或1-乙基-3-(4-氮阳离子-4，4-二甲基戊基)碳化二亚胺。此外，通过与铵离子反应将天冬氨酰和谷氨酰残基转化成天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。

利用双官能试剂的衍生化可用于使抗体与水不溶性支撑基质或表面交联以用于多种方法以及下文所描述的方法。通常使用的交联剂包括例如1，1-双(二叠氮乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如与4-叠氮基水杨酸的酯，同型双官能亚氨酸酯，包括二琥珀酰亚胺基酯，诸如3，3′-二硫双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)和双官能马来酰亚胺，诸如双-N-马来酰亚胺基-1，8-辛烷。诸如3-[(对叠氮基苯基)二硫]丙酰胺甲酯的衍生化剂产生能够在光的存在下形成交联的光活化中间物。可选地，诸如溴化氰活化的碳水化合物的反应性水不溶性基质和美国专利号3,969,287、3,691,016、4,195,128、4,247,642、4,229,537和4,330,440中所描述的反应性底物可用于蛋白质固定，所述专利全部以全文引用的方式并入。

谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基经常脱去酰胺基而成为相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。可选地，这些残基在轻度酸性条件下进行脱酰胺。这些残基的任一种形式都在本发明的范围内。

其他修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化、丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：StructureandMolecularProperties，W.H.Freeman&Co.，SanFrancisco，第79-86页[1983]，以全文引用的方式并入)、N末端胺的乙酰化和任何C末端羧基的酰胺化。

另外，如本领域技术人员应了解，标记(包括荧光、酶、磁性、放射性等)可以全部添加至抗体(以及本发明的其他组合物)。

另一种类型的共价修饰是糖基化变化。在另一个实施方案中，本文中所公开的抗体可以经修饰以包括一种或多种工程改造的糖形。如本文中所使用的“工程改造的糖形”意指共价连接至抗体的碳水化合物组成，其中所述碳水化合物组成在化学上不同于亲本抗体的碳水化合物组成。工程改造的糖形可用于各种目的，包括但不限于提高或降低效应功能。

工程改造的糖形可以通过本领域中已知的多种方法来产生(等，1999，NatBiotechnol17：176-180；Davies等，2001，BiotechnolBioeng74：288-294；Shields等，2002，JBiolChem277：26733-26740；Shinkawa等，2003，JBiolChem278：3466-3473；US6,602,684；USSN10/277,370；USSN10/113,929；PCTWO00/61739A1；PCTWO01/29246A1；PCTWO02/31140A1；PCTWO02/30954A1，全部以全文引用的方式并入；(技术[Biowa，Inc.，Princeton，NJ]；糖基化工程改造技术[GlycartBiotechnologyAG，Zürich，Switzerland])。这些技术中有许多是基于控制共价连接至Fc区的海藻糖基化和/或平分型寡糖的水平，例如通过在各种工程改造或其他生物体或细胞系(例如Lec-13CHO细胞或大鼠杂交瘤YB2/0细胞)中表达IgG、通过调节涉及糖基化途径的酶(例如FUT8[α1，6-海藻糖基转移酶]和/或β1-4-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶III[GnTIII])、或通过在已经表达IgG之后修饰碳水化合物。举例来说，SeattleGenetics的“糖工程改造的抗体”或“SEA技术”通过添加能抑制在产生期间发生海藻糖基化的经修饰的糖而起作用；参见例如20090317869，以全文引用的方式并入在此。工程改造的糖形典型地是指不同的碳水化合物或寡糖；因此抗体可以包括工程改造的糖形。

可选地，工程改造的糖形可以指包含不同的碳水化合物或寡糖的IgG变体。如本领域中已知，糖基化模式可以取决于蛋白质的序列(例如，存在或不存在以下所讨论的特定糖基化氨基酸残基)或产生蛋白质的宿主细胞或生物体。以下讨论特定的表达系统。

多肽的糖基化典型地是经N连接或经O连接。N连接是指碳水化合物部分连接于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为除脯氨酸外的任何氨基酸)是用于碳水化合物部分至天冬酰胺侧链的酶连接的识别序列。因此，多肽中的这些三肽序列中的任一者的存在产生了潜在糖基化位点。经O连接的糖基化是指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖之一连接至羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。

糖基化位点至抗体的添加宜通过改变氨基酸序列以使其含有上述三肽序列中的一个或多个来实现(对于经N连接的糖基化位点)。所述改变还可以通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基添加至起始序列或者通过以一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代来进行(对于经O连接的糖基化位点)。为方便起见，抗体氨基酸序列优选地通过DNA层面上的变化来改变，尤其是通过使编码靶多肽的DNA在预选的碱基处突变以使得产生将翻译成所需氨基酸的密码子。

增加抗体上的碳水化合物部分的数目的另一种手段是糖苷与蛋白质的化学或酶促偶联。这些程序的有利之处在于其不需要在宿主细胞中产生具有糖化能力以用于N连接或O连接的糖基化的蛋白质。取决于所使用的偶联模式，糖可以连接于(a)精氨酸和组氨酸；(b)游离羧基；(c)游离硫氢基，诸如半胱氨酸的硫氢基；(d)游离羟基，诸如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的羟基；(e)芳族残基，诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族残基；或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述于WO87/05330以及Aplin和Wriston，1981，CRCCrit.Rev.Biochem.，第259-306页中，两者以全文引用的方式并入。

去除起始抗体上所存在的碳水化合物部分(例如翻译后)可以用化学或酶促方式实现。化学去糖基化需要使蛋白质暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物。这种处理导致除连接糖(N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基半乳糖胺)以外的大部分或所有糖裂解，而留下多肽完好无损。化学去糖基化由Hakimuddin等，1987，Arch.Biochem.Biophys.259：52及Edge等，1981，Anal.Biochem.118：131描述，这两者以全文引用的方式并入。多肽上的碳水化合物部分的酶促裂解可以通过如Thotakura等，1987，Meth.Enzymol.138：350所描述使用各种内切糖苷酶和外切糖苷酶来实现，该文献以全文引用的方式并入。可以通过如Duskin等，1982，J.Biol.Chem.257：3105所描述使用化合物衣霉素来防止潜在糖基化位点处的糖基化，该文献以全文引用的方式并入。衣霉素阻断蛋白质-N-糖苷键联的形成。

抗体的另一种类型的共价修饰包括用例如得自于NektarTherapeutics的2005-2006PEGCatalog(可在Nektar网站获得)美国专利号4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337中所阐述的方式将抗体连接于各种非蛋白质聚合物，包括但不限于各种多元醇，诸如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，所述文献全部以全文引用的方式并入。另外，如本领域中已知，氨基酸取代可以在抗体内的各种位置上进行以促进诸如PEG的聚合物的添加。参见例如美国公布号2005/0114037A1，其以全文引用的方式并入。

III.调节Toso活性的方法

在一个方面，本发明涉及调节Toso活性的方法。在一个实施方案中，调节Toso活性的方法包括抑制Toso活性。在其他实施方案中，调节Toso活性的方法包括增加Toso活性。

在一些实施方案中，本发明的方法包括直接调节Toso活性。在示例性实施方案中，所述方法包括应用可结合Toso的试剂，诸如抗体。

在其他实施方案中，通过诸多机制的组合来调节Toso活性，例如通过施用包含能结合Toso的试剂的组合物与包含能结合Toso的同源配体的试剂的组合物或与能结合Toso的第二试剂的组合。在一个示例性实施方案中，所述组合可以包括但不限于Toso抗体和可溶性Toso蛋白，诸如2013年3月14日提交的USSN13/831,031中所描述的可溶性Toso蛋白，该文献全文且特别是与可溶性Toso蛋白有关的任何公开内容、权利要求、附图或其他教导内容出于所有目的以引用的方式并入在此。

如应了解，调节Toso活性的方法可以包括使用本文中所描述的任何组合物的任何组合，包括如本文中所描述的包含SEQIDNO.1-62中的任何一个或多个以及其任何变体或修饰的抗体。

V.治疗病症的方法

在一个方面且根据任何上述内容，本发明提供了通过用调节Toso活性的组合物治疗有需要的受试者来治疗病症的方法，其中在优选的实施方案中，该组合物包括一种或多种Toso抗体。

在一个具体实施方案中且根据任何上述内容，本发明提供了通过用包括Toso抗体的组合物治疗有需要的受试者来治疗病症的方法。不受理论束缚，Toso抗体有效治疗这些病症的一种潜在机制是通过调节Toso活性。在某些实施例中，根据本发明治疗病症的方法包括施用治疗有效量的本文中所描述的任何Toso抗体，包括了包含SEQIDNO：1-62中的任何一个或多个或其任何变体的抗体。在其他实施方案中，用于治疗病症(包括糖尿病、多发性硬化、哮喘和癌症)的可溶性Toso蛋白包括了包含与SEQIDNO：1-28中的任一个具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的重链或轻链序列的抗体。所述抗体可以根据本文中所描述的方法进行进一步修饰，包括化学修饰，以用于治疗本文中所描述的任何病症。

在其他方面，本发明涉及通过向受试者施用Toso抗体或其变体来治疗病症和疾病的方法。本发明的抗体可用于治疗罹患不限于以下各项疾病的受试者：自身免疫性病症(包括但不限于1型糖尿病、多发性硬化或类风湿性关节炎)、2型糖尿病、哮喘、过敏、慢性阻塞性肺病(“COPD”)、高IgM综合征、狼疮、癌症或中性白细胞增多相关病症(包括但不限于中性粒细胞减少、严重先天性中性粒细胞减少、环形中性粒细胞减少、抗体介导的中性粒细胞减少、网状细胞发育不全、白细胞粘附缺陷、家族性骨髓增生性疾病、慢性骨髓性白血病、家族性冷激性荨麻疹和白细胞增多以及慢性肉芽肿病)。如应了解，本文中所描述的任何Toso抗体可以呈单独或任何组合形式用于治疗这些病症或疾病中的任一种。

如以上所讨论，在一些实施方案中，本发明的可溶性Toso蛋白被用于治疗癌症。在其他实施方案中，根据本发明治疗癌症的方法包括通过调节Toso活性来抑制肿瘤侵袭和/或转移的方法。在示例性实施方案中，本发明的组合物用于在有需要的受试者中治疗腺癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或畸胎癌组群中任一种。在其他实施方案中，本发明的组合物用于治疗罹患肾上腺、膀胱、骨、骨髓、脑、胸部、颈、胆囊、神经节、胃肠道、心脏、肾、肝脏、肺、肌肉、卵巢、胰脏、副甲状腺、阴茎、前列腺、唾液腺、皮肤、脾、睾丸、胸腺、甲状腺或子宫中的一个或多个中的癌症的受试者。

实施例1：人类原生噬菌体scFv文库构建

外周血单核细胞(PBMC)是获自捐赠和市售血样。使用Ficoll-paqueTMPLUS(GEHealthcare)分离PBMC。然后使用Trizol分离总RNA与所分离的PBMC，然后使用得自于TotalRNAPreps(Ambion)的mRNA纯化用mRNA纯化试剂盒从总RNA中纯化mRNA。

使用RT-PCR用SuperScriptIII第一股合成系统(Invitrogen)由mRNA进行第一股cDNA合成。汇集cDNA文库且测量浓度。

使用60至90ngcDNA作为模板和2.5μl所提供的各恒定和可用区DNA引物组1(F2000，Progen)、25μl2×terraPCR缓冲剂、1μlterra聚合酶混合物，以50μl的总体积分别扩增可变κ、λ和γ链基因。PCR条件：95℃，30秒(变性)；55℃，1min(退火)；和75℃，1min(延长)，总计30个循环。在第一个循环开始时，将反应混合物在95℃下孵育3min且在最后一个循环结束时在75℃下孵育5min。

为了引入限制位点，在含有以下各物的总计50μl中进行PCR：1μl可变基因PCR产物(分别使用κ、λ和γ链基因作为模板)、2.5μl所提供的各恒定和可变区DNA引物组2(F2000，Progen)、25μl2×terraPCR缓冲剂、1μlterra聚合酶混合物。PCR条件：95℃，30秒(变性)；57℃，1min(退火)；和75℃，1min(延长)，总计14个循环。在第一个循环开始时，在95℃下孵育3min且在最后一个循环结束时在75℃下孵育5min。使用凝胶DNA提取试剂盒(Clontech)纯化PCR产物。汇集分别经纯化的κ、λ和γDNA。

通过以下方式将轻链DNA克隆到噬菌粒载体pSEX81中：通过添加25μl缓冲液H、6μlNotI(40u/μl)和0.5μlRNA酶A(10μg)消化10μg噬菌粒载体pSEX81(Progen)，总体积是224μl。混合并且在37℃下孵育8min，随后加入20μlMluI(10u/μl)，在37℃下孵育6min。在那之后，添加碱性磷酸酶(CIP)且在37℃下继续孵育15分钟。然后，添加0.25μl0.5MpH8.0EDTA，随后在65℃下孵育20min。使混合物在凝胶上跑电泳且切下含有MluI/NotI-pSEX81片段的凝胶带并使用凝胶DNA提取试剂盒进行提取。然后通过添加7.5μl缓冲液H、0.9μlNotI(40u/μl)分别消化1.5μg所汇集的κ和所汇集的λ链PCR产物，在37℃下孵育20min，然后添加3μlMluI(10u/μl)，随后在37℃下进一步孵育40分钟。用1.5％琼脂糖凝胶对反应产物进行跑电泳且切下400bp的条带并使用凝胶DNA提取试剂盒进行纯化。使用介于1∶1与1∶3之间的摩尔比将经消化的载体(pSEX81)和插入物(κ或λ可变链基因)连接。反应混合物包括50ngDNA、1UT4连接酶、连接缓冲剂和H₂O，最终体积是15μl。在16℃下孵育过夜之后，通过添加1/10体积的3M乙酸钠、20μg糖原、2.5倍体积的绝对乙醇使DNA沉淀。在-20℃下孵育1.5小时，随后通过在13,000rpm下离心30分钟使沉淀物沉降。用80％乙醇将球粒洗涤至少两次，然后允许球粒在室温下干燥。使经过干燥的球粒再悬浮于2至5μlH2O中。

然后通过以下方式将重链DNA克隆到含有轻链DNA的pSEX81载体中：分别用10μlHindIII(10u/μl)、25μl缓冲液H、0.5μlRNA酶A(10μg)消化10μg含轻链的载体(κ-pSEX81和λ-pSEX81)，总体积是230μl，在37℃下孵育20min，然后添加10μlNcol(10u/μl)，然后在37℃下孵育90分钟。用于消化载体的其余程序与上文所述相同。为了消化重链插入物，用7.5ul10×缓冲液H、2.7ulHindIII(10u/ul)、4ulNcoI(10u/ul)消化1μg所汇集的γ链PCR产物，总体积是75μl，随后在37℃下孵育4小时，然后在65℃下孵育20min。使用凝胶DNA提取试剂盒纯化经过消化的DNA。如上所述完成DNA的连接和沉淀。

通过以下方式建立文库储备液：将1.5μl的一种连接反应物用于40μl电感受态大肠杆菌XL-蓝(Stratagene)的电穿孔。将连接DNA文库的各转化接种到SOB-GA琼脂板上且在30℃下孵育过夜。将6ml2×YT-GA培养基添加至各板并且将细菌刮到培养基中。汇集细胞并且制成甘油储备液。

实施例2：文库的生物淘选

在37℃下在以250rpm振荡的情况下使接种培养物生长，直至达到A₆₀₀为0.1。添加M13K07辅助噬菌体，然后在37℃下在不振荡的情况下将培养物孵育15分钟，然后在37℃下在以250rpm振荡的情况下孵育1小时。在1500g下使细胞球粒化10min，然后再悬浮于400ml2×YT-AK培养基中。在30℃下在以250rpm振荡的情况下使悬浮液生长过夜。旋转培养物，然后使用PEG溶液使噬菌体沉淀。测定噬菌体的效价。可以制造甘油储备液或文库可以直接用于淘选。

nunc96孔板中两个孔涂布有200μl/孔含100μg/ml经纯化的Toso-Fc的PBS溶液；两个孔涂布有200μl100μg/mlrhIgGFc(SinoBiologicalInc.)；向另2个孔中添加200μl5％牛奶PBS(MPBS)(无抗原)，并且在4℃下将板孵育过夜。

从原生文库中取出0.6ml10¹²pfu/ml噬菌体到1.5ml管中，向管中加入蛋白G珠粒，然后在4℃下在旋转下将管子孵育过夜。

次日早晨倒空Toso-Fc涂布的孔且用PBST洗涤3次，并且用250ul5％MPBS阻断，随后在室温下孵育2小时。

将rhIgGFc(SinoBiologicalInc.)涂布的孔倒空。对噬菌体-蛋白G珠粒溶液进行离心并且将100μl上清液转移到两个rhIgGFc涂布的孔中的每一个中。以100μl/孔加入100ug/mlrhIgGFc(SinoBiologicalInc.)，且在室温下孵育1小时。

将未经蛋白质涂布的孔倒空且将噬菌体溶液个别地转移到未经蛋白质涂布的孔并且在室温下孵育1小时。

从Toso-Fc涂布的孔中去除阻断缓冲液，然后用PBST洗涤若干次。将200μl噬菌体溶液转移到Toso-Fc涂布的孔并且在室温下孵育1.5小时。

将Toso-Fc涂布的孔倒空，并且用PBST洗涤若干次。通过向两个孔中的每一个中加入200μl100mM三乙胺随后孵育10分钟来洗脱噬菌体。

将洗脱的噬菌体转移到2×1.5ml含有800ul1MTris-HCl(pH7.5)的管中以中和pH值。

使用2×10ul洗脱的噬菌体来进行滴定。将其余洗脱的噬菌体用于感染10ml新鲜TGl细胞(OD₆₀₀＝0.4)。将200ul的这种样品散布在含有100ul/ml氨苄青霉素和1％葡萄糖的2xYT琼脂板上，在32℃下生长过夜。在37℃下在以250rpm振荡的情况下将其余被感染的细胞孵育1小时，此后用含有100ug/mlamp的2xYT培养基将体积增至110ml，随后在37℃下在以250rpm振荡的情况下孵育。

将M13KO7辅助噬菌体(100μl10¹²pfu)加入到被感染的培养物中且也在37℃下生长，还向培养物中加入卡那霉素，最终浓度是50μg/ml。在37℃下在以250rpm振荡的情况下将这种培养物孵育过夜，以用于下一轮淘选。

尽管上文已经在某种详细程度上或参考一个或多个个别方面描述了这种技术的不同方面，但本领域技术人员可以对所公开的方面进行许多变化而不背离此技术的精神或范围。因为许多方面可以在不背离本发明所描述的技术的精神和范围的情况下进行，但适当的范围存在于以下所附的权利要求书中。因此涵盖其他方面。此外，应理解，除非另外明确要求或权利要求书的措辞内在地使得有必要按特定顺序，否则任何操作都可以按任何顺序进行。意在以上描述中所含有的和附图中所示出的所有物质都应解释为仅说明具体方面且不限于所示的实施方案。除非从上下文显而易见或明确陈述，否则本文中所提供的任何浓度值一般相对于混合物值或百分比给出，而不考虑添加混合物的特定组分时或之后发生的任何转化。在未明确并入本文中的程度上，本公开内容中所提及的所有公开参考文献和专利文件都出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。可以在细节或结构上进行变化而不背离如以下权利要求书中所定义的本发明技术的基本要素。

Claims

1.一种抗体，其包含含有SEQIDNO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57中的任一个的重链可变区。

2.一种抗体，其包含具有与SEQIDNO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57中的任一个具有至少约95％序列同一性的序列的重链可变区，其中所述抗体结合Toso。

3.一种抗体，其包含含有SEQIDNO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58中的任一个的轻链可变区。

4.一种抗体，其包含具有与SEQIDNO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58中的任一个具有至少约95％序列同一性的序列的轻链可变区，其中所述抗体结合Toso。

5.一种抗体，其包含：第一重链CDR，其包含表1中所列出的CDR1序列中的任一个；第二重链CDR，其包含表1中所列出的CDR2序列中的任一个；第三重链CDR，其包含表1中所列出的CDR3序列中的任一个；第一轻链CDR，其包含表2中所列出的CDR1序列中的任一个；第二轻链CDR，其包含表2中所列出的CDR2序列中的任一个；和第三轻链CDR，其包含表2中所列出的CDR3序列中的任一个，其中所述抗体结合Toso。

6.如上述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。

7.一种核酸，其编码如上述权利要求中任一项所述的抗体。

8.一种表达载体，其中所述表达载体编码根据权利要求1至5所述的抗体。

9.一种制造根据权利要求1至5所述的抗体的方法，所述方法包括提供包含编码所述抗体的核酸的细胞，其中在适合于表达所述抗体的条件下培养所述细胞。

10.一种治疗Toso相关疾病的方法，所述方法包括用根据权利要求1至5所述的抗体治疗有需要的受试者。