KR20190094253A - 변형 항체 및 그의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

공여자 면역 글로불린의 구조 영역의 아미노산 잔기들을, 표적 종으로부터 유래하는 하나 이상의 면역 글로불린의 구조 영역 내 대응하는 위치에 존재하는 아미노산 잔기들로 치환하는 것을 포함하는 상기 표적 종에 투여하기 위한 비(非)면역원성 면역 글로불린의 제조방법이 제공된다. 또한, 상기 본 발명의 방법에 의하여 제조되는 항체들, 예컨대 신규한 인간화 및 견화(犬化) 항-NGF 항체들이 제공된다. 본 발명은 이를 인코딩하는 핵산 및 상기 항체들 및/또는 핵산을 이용하여 인간 또는 개의 통증 및 관절염을 치료하는 방법에까지 이른다.

Description

변형 항체 및 그의 제조방법 {MODIFIED ANTIBODIES AND METHOD FOR THE PRODUCTION OF SAME}
본 발명은 치료 방법에 사용될 수 있는 비(非)면역원성 결합 제제, 특히 면역 글로불린들 및 그들의 단편을 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히, 상기 방법은 공여자 면역 글로불린으로 하여금 그것이 그에 대하여 발생하는 중화 항체의 위험을 최소화하면서 표적 종에 투여될 수 있도록 변형될 수 있도록 한다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의하여 제조되는 면역 글로불린 및 치료시 그들의 용도에까지 이른다.
재조합 DNA 기술의 진보는 약학 응용 분야에 있어 다양한 단백질들의 개발이라는 결과를 이끌어 냈다. 이는 임상 시험 또는 시장의 승인 대상인 다수의 단백질계 약물들, 더 일반적으로는 생물제제 (biologics)라고 일컬어질 수 있는 약물들이라는 결과를 낳았다. 그들의 내재적인 특성 및 구조로 인하여, 단백질계 약물들은 보다 전통적인 소분자 유기계 및 무기계 분자들보다 현저히 크고 더 복잡하다. 특히, 단백질의 접히는 3차 구조는 그 생물학적 기능에 필수적이다.
항체는 인간의 치료 응용 분야에서 광범위하게 개발되고 사용되는 하나의 단백질 패밀리이다. 치료 응용 분야에 있어서 항체의 인기는 사실상 모든 원하는 표적 분자를 특이적으로 표적할 수 있는 그들의 다재다능함에 기인한다. 대다수의 단백질계 치료 산물들은 모노클로날 항체이다. 그러나, 모노클로날 항체계 치료의 이용과 관련한 한 가지 중대한 단점은 대상체에 투여시 그 치료적 모노클로날 항체에 대한 중화 항체의 생성이다. 이들 중화 항체들은 상기 투여된 모노클로날 항체에 존재하는 아미노산 서열을 외래의 것으로 인식하는 대상체의 면역계로부터 비롯되는 것이다. 그 결과, 상기 투여된 치료 항체에 대하여 면역 반응이 일어난다. 대상체에 의한 중화 항체의 생성은 그 대상체를 상기 모노클로날 항체로 계속 치료할 능력을 현저히 손상시킬 수 있다. 통상, 일단 중화 항체가 대상체에서 생성되면, 그 중화 항체가 상기 투여된 모노클로날 항체의 치료 효과를 효율적으로 저감시키거나 무력화하기 때문에 그 치료 항체의 사용을 증가시킬 필요가 있다. 이것은 치료 항체의 이용을, 상기 치료 항체의 반복 투여 또는 장기 투여는 선택지가 되지 못하는 단지 초기 치료로 제한할 수 있다. 요컨대, 치료 항체에 대한 중화 항체의 생성은 그 항체의 치료적 사용을 심각하게 제한할 수 있고, 이것은 차례로 그 항체의 만성 또는 재발성 질병 치료에의 이용을 심히 제한하거나 완전히 봉쇄할 수 있다.
치료 항체에 대하여 생성되는 중화 항체의 가능성을 저감시키기 위한 시도로, 항체의 구조를 변형함으로써 그 항체의 면역원성을 감소시키기 위하여 설계된 많은 접근법이 개발되어 왔다. 이러한 접근법 중 하나는 키메라 항체의 제조인데, 이 항체의 중쇄 및 경쇄 불변 도메인들은 그 항체를 투여받을 대상체와 동일한 종으로부터 얻은 항체로부터 유래하게 되는 것이다. 대부분의 치료 항체들은 인간에의 사용을 위하여 개발되었으므로, 이러한 키메라 항체는 통상 비(非)인간 항체, 가장 일반적으로는 마우스 또는 래트 기원의 비인간 항체로부터 유래하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 접목시킨 인간 유래의 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
치료 항체의 면역원성을 감소시키는 또 다른 접근법은 인간화 (humanisation)라고 불리는 기법을 이용한다. 인간화라는 용어는 결과되어질 면역 반응 가능성을 제한하기 위하여 인간에 의하여 제조될 항체와 더 유사하게 변형된 항체를 제조하는 것을 의미한다. 인간화 기법은 항체를 더 인간의 것과 유사하게 하는 많은 상이한 접근법에까지 이른다.
한 가지 흔히 사용되는 인간화 기법은 CDR 그라프팅으로서, 그로 인하여 공여자 항체, 예컨대 쥐과 유래 항체로부터 유래하는 상보성 결정 영역 (CDRs)은 인간 기원 항체로부터 유래하는 구조 영역과 조합되어 중괘 및 경쇄 가변 도메인을 형성하고, 그 후 인간 항체 유래 중쇄 및 경쇄 불변 도메인과 조합된다. 그러므로, 결과되는 항체는 오로지 제한된 수의 비인간 유래 아미노산을 함유하고, 이것은 인간 면역계에 의하여 외래의 것으로 비춰질 에피토프의 존재를 제한하는 데 기여하게 된다.
인간화와 관련한 한 가지 심각한 단점은 이것이 종종 그 결과 형성되는 인간화 항체의 결합 친화도를 비인간화 공여자 항체에 의하여 나타나는 결합 친화도보다 현저한 감소시키는 결과를 낳는다는데 있다. 치료적 모노클로날 항체에 대하여 중화 항체를 생성하는 경우와 꼭 같이, 이것은 그 항체의 치료적 용도를 현저히 손상시키는 결과를 낳을 수 있다. 특히, 결합 친화도의 감소는 그 치료적 항체의 투여량을 더 높일 필요를 야기하고, 또한 투여 빈도 증가를 요구할 수도 있다. 이들 인자들 양자 모두는 화자에게 있어서 치료 비용 및 불편을 증가시키는 원인이 된다. 또한, 다량의 항체를 대상체에게 투여하는 것은 중화 항체가 그 치료 항체에 대하여 발생할 위험을 높이는 결과를 낳는다.
인간화 항체가 그 최초의 공여자 항체보다 낮은 친화도로 원하는 에피토프에 결합하는 경우, 이것은 상기 에피토프 결합 CDR 서열을 갖는 구조 영역 서열의 구조적 정렬상 부적합성에 기인한 것일 수 있다. 공여자 항체의 동일한 위치의 아미노산으로 인간 잔기들을 반복적으로 복귀 돌연변이시키는 과정을 통하여, 상기 인간화 항체의 친화도는 종종 회복될 수 있다. 상기 복귀 돌연변이 과정이 상기 인간화 항체 내로 추가적인 비-인간 아미노산을 재도입하는 원인이 됨에도, 최종 서열 중 상당한 공여자 아미노산의 존재에도 불구하고 그 결과되는 항체는 여전히 인간화 항체라고 불리운다.
직접적인 유추에 의하여, 인간 외 종들에서 사용하기 위한 항체의 종화 (speciesisation)도 유사하게 그 변형되는 항체의 결합 친화도를 유지하는 구조 영역 변화를 만들기 위한 요구에 의하여 손상되고, 동시에 결과되는 항체의 선택된 표적 종들에서의 면역원성은 감소된다. 상업적 관점에서, 인간 외 종들에서 항체의 사용이 바람직한데, 그 이유는 유용하게 치료될 수 있는 일반적인 질병 프로세스의 범위 때문으로, 특히, 고부가가치의 종들, 예컨대 반려 동물 (고양이 및 개) 및 지구력 동물들 (말 및 낙타)에 있어서, 또는 식품 생산 동물들, 예컨대 소, 양, 돼지 및 닭의 육질 향상을 위하여 그러하다. 따라서, 이들 종들에 사용하기 위한 항체의 보다 간단한 전환을 가능하게 하는 방법이 매우 요구되고 있다.
그러므로, 그들에 대하여 발생할 중화 항체의 공산을 낮추기 위하여 수용자 항체 서열의 변화를 최소화하면서, 결과되는 항체는 표적 항원에 대한 결합 친화도의 손실을 나타내지 않고 표적 대상체에 투여될 수 있는 공여자 항체를 변형하는 개선된 방법에 대한 요구가 있다. 뒤이어, 공여자 항체 서열을 최소한의 변화만으로 표적 종들의 서열로 전환하여 CDR 구조에 최소한의 충격을 가하는 표적 종 구조 영역 구조를 달성하는 방법이 매우 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명은 표적 종에서 사용하기 위하여 공여자 항체를 변형하여 그 결과되는 항체는 구조 영역 내 임의의 위치에서 그 종의 그 위치에서 외래일 어떠한 아미노산을 함유하지 않도록 하는 방법을 개시한다. 그러므로, 상기 변형된 항체는 상기 공여자 항체의 특이성 및 친화도를 보유하지만 동시에 변형을 통하여 어떠한 잠재적 외래 에피토프를 생성하지 않을 것이다. 그러므로, 상기 변형된 항체는 표적 종에서 외래의 것으로 비춰지지 않을 것이고 따라서 그 효능을 중화, 특히 뒤이은 장기간 투여를 이끌어내는 면역 반응을 유도하지 않을 것이다. 이렇게 달성될 수 있는 방법은 종래 방법들에 내재하는 모든 불리점을 극복하고 괄목할만한 간이성 및 간결성을 특징으로 한다.
막대한 노력을 기울인 결과, 본 발명의 발명자들은 놀랍게도 공여자 항체 또는 그들로부터 유래하는 항원 결합 단편을 변경하는 방법을 개발하였고, 그로써 이들이 표적 종에 투여시 완전히 비면역원성이거나 유의미하게 비면역원성이고, 상기 표적 종은 상기공여자 항체가 유래하는 종과는 상이한 종인 그러한 방법을 개발하였다. 통상, 중화 항체는 대상체에 투여 후 결과되는 항체에 대하여는 발생하지 아니한다. 또한, 상기 항체를 비면역원성으로 만드는 변경은 그 목적하는 표적에 대한 결합 특이성 또는 친화도에 감소를 초래하지는 않을 것이다.
본 발명의 제1 측면에 따르면, 표적 종에 투여하기 위한 비면역원성 면역 글로불린의 제조 방법이 제공되고, 상기 방법은:
- 상기 표적 종 이외의 종으로부터 유래하는 공여자 면역 글로불린을 식별하는 단계로서, 상기 공여자 면역 글로불린은 상기 표적 종에 존재하는 표적 에피토프에 결합 특이성을 갖는 것인 단계,
- 상기 공여자 면역 글로불린의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 구조 영역의 아미노산 서열들을 결정하는 단계,
- 상기 공여자 면역 글로불린의 상기 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 구조 영역의 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기와 상기 표적 종으로부터 유래하는 하나 이상의 면역 글로불린의 구조 영역의 아미노산 서열 내 대응하는 위치에 존재하는 아미노산 잔기를 비교하여 상기 표적 종으로부터 유래하는 하나 이상의 면역 글로불린 중 적어도 하나의 구조 영역의 아미노산 서열 내 대응하는 위치에 존재하지 않는 상기 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 구조 영역의 아미노산 서열 내 하나 이상의 아미노산 잔기들을 식별하는 단계, 및
- 상기 공여자 면역 글로불린의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 구조 영역의 아미노산 서열 내에 존재하지만 상기 표적 종으로부터 유래하는 하나 이상의 면역 글로불린의 적어도 하나의 구조 영역의 아미노산 서열의 대응하는 위치에는 존재하지 않는 상기 공여자 면역 글로불린의 상기 하나 이상의 식별된 아미노산 잔기들을, 상기 표적 종으로부터 유래하는 하나 이상의 면역 글로불린의 적어도 하나의 구조 영역의 아미노산 서열 내 대응하는 위치에 존재하는 아미노산 잔기로 치환하는 단계
를 포함한다.
상기 방법은 상기 공여자 면역 글로불린 내 특정 구조 영역 (framwork region, FW region)에 존재하고, 또한 상기 표적 종으로부터 유래하는 면역 글로불린 내 대응하는 구조 영역 위치 중 적어도 하나에 존재하는 임의의 비변경 (즉, 비치환된) 아미노산을 남겨둔다. 특정 구현예에 있어서, 상기 표적 종의 면역 글로불린의 구조 영역의 상기 아미노산 서열들은 상기 공여자 면역 글로불린 내 대응하는 위치에 존재하는 아미노산 잔기와 비교될 수 있는 잔기들의 풀 (pool)을 포함한다. 통상 이러한 풀은 다수의 표적 종 면역 글로불린들로부터 유래하는 위치 특이적 아미노산 잔기들을 포함한다. 통상 상기 풀은 가능한 많은 표적 종의 면역 글로불린들로부터 유래하는 구조 영역 서열 데이터, 및 가능하다면 간행된 데이터베이스들에 존재하는 특정 종에 대하여 공지된 모든 면역 글로불린들의 모든 구조 영역 서열을 포함한다.
상이한 종으로부터 유래하는 면역 글로불린들의 구조 영역의 아미노산 서열들은 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려진 다수의 공개적으로 이용가능한 데이터베이스로부터 유래할 수 있다. 예컨대, 국가생물공학센터 (NCBI)에서 제공되는 데이터베이스들은 다양한 종으로부터 유래하는 항체들에 대한 면역 글로불린 서열 정보를 포함한다. 또 다른 데이터베이스로는 공개적으로 이용가능한 생식세포 및 발현 cDNA 서열을 포함하는 임의의 데이터베이스 및 저널 간행물 또는 데이터베이스, 예컨대 면역 글로불린 서열에 대한 카바트 데이터베이스 (URL: www.kabatdatabase.com) 및 V BASE, 인간 항체 데이터베이스 (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 가능한 표적 아미노산의 표를 만드는 과정은 숙련자에게는 일상적인 것이다.
비교는 상기 공여자 서열과 상기 표적 서열 중 1개의 원 (member) 간에 이루어질 수 있는 것이지만, 표적 서열들의 풀과의 비교가 양호하다는 것은 자명한데, 이것이 상기 표적 종의 각 카바트 위치에서 자연적인 옵션의 수를 확장시키기 때문이다. 이것은 상기 공여자와 표적 간 "매치 (match)" 확률을 증가시킬 뿐 아니라, 매치가 존재하지 않는 대체에 대한 옵션을 확장하기도 한다.
본 발명에서 정의되는 바, 비면역원성 면역 글로불린은 그것이 표적 종에 투여되는 경우 그에 대하여 발생하는 면역 반응이 없는 면역 글로불린이다. 특히, 체액성 (항체 매개) 반응은 상기 구조 영역으로부터 유래하는 아미노산 잔기들을 포함하는 항체, 특히 에피토프에 대항하여 매개되지 않는다.
공여자 아미노산과 표적 아미노산이 임의의 카바트 번호에서 상이하면, 그 아미노산은 상기 표적의 그 위치에서 자연적인 것으로 알려진 것으로부터 선택되어야 한다. 이것은 다수의 가능한 서열들을 이끌어 내는데, 이들 중 임의의 것이 본 발명의 양호한 또는 적어도 적합한 서열일 수 있다. 공여자 면역 글로불린 구조 영역에 존재하는 아미노산 잔기의 치환이 필요한 경우, 통상 이것은 보존적 치환 원리를 이용하여 이루어진다. 통상, 보존적 치환은 그 아미노산의 상동 아미노산 잔기로의 교체, 즉 유사한 성격 또는 특성을 공유하는 잔기로의 교체를 요구한다. 이러한 교체는 상동 치환으로 알려진 것일 수 있다.
치환되는 아미노산이 보존되는 아미노산으로 교체될 수 있는지 여부를 결정하는데 있어서, 통상 (a) 그 치환 구역에서 폴리펩타이드 백본의 구조, 예컨대 시트 또는 헬릭스 형태, (b) 그 표적 위치에서 그 분자의 전하 또는 소수성, 및/또는 (c) 측쇄(들)의 벌키함과 같은 인자들로 구성되는 평가가 있을 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 한 잔기가 공통된 성격을 갖는, 예컨대 유사한 측쇄 또는 유사한 전하 또는 소수성을 갖는 잔기로 치환될 수 있다면, 이러한 잔기가 치환체로 양호하다.
대응하는 위치에 존재하는 표적 종 면역 글로불린 잔기들의 풀에 존재하지 않는 공여자 면역 글로불린 유래 잔기가 보존적으로 치환될 수 있는지 여부를 고려할 때, 그들의 측쇄 특성에 있어 유사성에 따라 함께 그룹화된 아미노산들에 기초하여 그 특정 위치에 대하여 상기 표적 종으로부터 유래하는 대응하는 잔기들의 풀에서 상동 아미노산이 이용가능한지를 평가하는 것이 바람직할 수 있다 (A. L. Lehninger, in Biochemistry, 2nd Ed., 73-75, Worth Publishers, New York (1975)). 예컨대, 하기 그룹들이 결정될 수 있다: (1) 비-극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M); (2) 비전하 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q); (3) 산성: Asp (D), Glu (E); 및 (4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His (H). 그러므로, 한 아미노산 잔기의 상기 동일한 그룹 내 존재하는 다른 것으로의 치환이 양호하다.
또는, 상기 아미노산은 다음과 같이 그룹화될 수 있다: (1) 방향족성: Phe (F), Trp (W), Tyr (Y); (2) 무극성: Leu (L), Val (V), Ile (I), Ala (A), Met (M); (3) 지방족성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I); (4) 산성: Asp (D), Glu (E); (5) 염기성: His (H), Lys (K), Arg (R); 및 (6) 극성: Gln (Q), Asn (N), Ser (S), Thr (T), Tyr (Y). 다시금, 한 아미노산 잔기의 상기 동일한 그룹 내 존재하는 다른 것으로의 치환이 양호하다.
또는 아미노산 잔기들은 공통적인 측쇄 특성에 기초하여 그룹들로 나뉠 수 있다: (1) 소수성: Met (M), Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I); (2) 중성 친수성: Cys (C), Ser (S), Thr (T), Asn (N), Gln (Q); (3) 산성: Asp (D), Glu (E); (4) 염기성: His (H), Lys (K), Arg (R); (5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기들: Gly (G), Pro (P); 및 (6) 방향족성: Trp (W), Tyr (Y), Phe (F). 다시금, 한 아미노산 잔기의 상기 동일한 그룹 내 존재하는 다른 것으로의 치환이 양호하다.
따라서, 보존적 치환은 이들 부류 중 한 가지의 원을 그 동일한 부류의 다른 원으로 교환 (치환)하는 것을 수반할 것이다. 특정 구현예에 있어서, 상기 공여자 면역 글로불린 구조 영역 서열로 도입되는 아미노산 잔기는 상기 표적 종으로부터 유래하는 면역 글로불린의 풀로부터 유래하는 그 특정 위치에서 정의된 공통 (consensus) 아미노산이다. 상기 공통 아미노산은 그 풀에 기여하는 표적 종 면역 글로불린들의 모음을 포함하는 면역 글로불린들의 그 위치에서 가장 흔히 발견되는 아미노산이다.
통상 상기 구조 영역 잔기들의 치환은 면역 글로불린의 그 목적하는 리간드에의 결합 감소를 일으키지 않는다. 특히, 결합 친화도 또는 특이성의 감소는 없다.
특정 구현예에 있어서, 상기 방법은 상기 공여자 면역 글로불린의 중쇄 및/또는 경쇄 불변 도메인의 하나 이상 및 좋기로는 모두를, 상기 표적 종으로부터 유래하는 면역 글로불린으로부터 유래하는 균등한 중쇄 및/또는 경쇄로 교체하는 단계를 더 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 표적 종 유래 불변 도메인들은 항체 서브타입 면역 글로불린 G (IgG)의 것이다.
특정 구현예에 있어서, 상기 구조 영역의 아미노산 잔기들을 평가하는데 사용되는 공여자 면역 글로불린 아미노산 서열들의 풀은 표적 종으로부터 유래하는 면역 글로불린의 서브타입, 예컨대 카파 또는 람다 경쇄로부터의 것으로 제한될 수 있다.
이론에 얽매일 것 없이, 상기 방법은 그 결과되는 구조 영역 서열의 아미노산 전부가 표적 종의 아미노산들과 정렬될 것을 보장하면서, 상기 공여자 면역 글로불린 구조 영역 서열에 최소한의 필요적 변화 (아미노산 치환)을 일으킨다. 이것은 결과적으로 공여자 면역 글로불린으로부터 표적 대상체에 투여시 완전히 또는 실질적으로 비면역원성일 항체로의 항체 변형으로부터 야기되는 구조적 변화를 최소화한다. 상기 방법이 치환 가능한 잔기들의 치환을 거의 포함하지 않기 때문에, 이 방법은 간결 필수적 번역 (parsimonious essential translation, PET)이라고 부를 수 있다. 더 나아가, 표적 동물 종에 투여시 공여자 면역 글로불린이 비면역원성이 될 수 있도록 하는 그에 가하여지는 변화를 PET화라고 말할 수 있고, 그 결과되는 항체를 PET화되었다고 말할 수 있다. 예컨대, 이러한 과정은 기존의 인간, 마우스 또는 래트 항체 종화를 야기할 수 있고, 그렇게 그것은 그들에 대한 중화 항체를 발생시킴이 없이 다른 표적 종, 특히 동물 종, 예컨대 인간, 개, 고양이 또는 말에게 투여될 수 있다.
특정 구현예에 있어서, 상기 표적 종은 포유류 표적 종이다. 한 가지 구현예에 있어서, 상기 포유류 종은 동물, 특히 반려 동물, 예컨대 개, 고양이 또는 말 또는 가축 동물이지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또 다른 구현예에 있어서, 상기 포유류 표적 종은 인간이다.
특정 구현예에 있어서, 상기 표적 에피토프는 신경 성장 인자 (NGF) 또는 종양 괴사 인자 (TNF)이다.
다양한 추가의 구현예에 있어서, 전술한 본 발명의 측면의 방법에 의하여 제공되는 면역 글로불린 또는 그들의 항원 결합 단편을 함유하는 조성물이 제공된다. 상기 조성물은 1종 이상의 약학적으로 허용되는 희석제 또는 캐리어를 더 포함할 수 있다. 또 다른 하나의 측면은 질병의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서 전술한 본 발명의 측면의 방법에 의하여 제조되는 면역 글로불린 또는 그들의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다. 다양한 추가의 측면에 있어서, 본 발명은 치료 방법 및 진단 방법들에 있어서 전술한 면역 글로불린 또는 그들의 항원 결합 단편의 용도에 이른다. 본 발명은 또한 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 청구항 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 따라 제조된 면역 글로불린 또는 그들의 항원 결합 단편에 이른다.
본 발명의 또 다른 측면은 질병의 치료 또는 예방을 위한, 본 발명에 기재된 방법들 중 어느 하나에 따라 제조되는 면역 글로불린 또는 그들의 항원 결합 단편의 대상체, 특히 포유류 대상체로의 투여에 관한 것이다.
탈-면역화 (De-immunisation)
다양한 추가의 측면에 있어서, 본 발명은 특정 종에 투여시 비면역원성이도록 하는 치료적 면역 글로불린의 변형에 이른다. 상기 변형은 키메라 항체, CDR 그라프팅 기법에 의하여 제조된 항체 또는 인간화 항체에 적용될 수 있다.
그러므로, 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 치료적 면역 글로불린을 비면역원성으로 만들기 위하여 그를 변형하는 방법을 제공하고, 상기 방법은:
- 공여자 치료 면역 글로불린을 제공하는 단계,
- 상기 공여자 면역 글로불린의 경쇄 및/또는 중쇄 가변 도메인의 하나 이상의 구조 영역의 아미노산 서열을 결정하는 단계,
- 상기 면역 글로불린이 투여될 표적 종으로부터 유래하는 면역 글로불린들의 경쇄 및/또는 중쇄의 가변 도메인의 하나 이상의 구조 영역에 관한 아미노산 서열들의 풀을 얻는 단계,
- 상기 공여자 면역 글로불린의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 하나 이상의 구조 영역의 아미노산 서열의 아미노산 잔기들과 상기 아미노산 서열들의 풀에서 동일한 카바트 번호를 갖는 아미노산 잔기들을 비교하는 단계, 및
- 상기 공여자 면역 글로불린의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 하나 이상의 구조 영역의 아미노산 서열의 임의의 아미노산 잔기를 상기 아미노산 서열들의 풀에서 동일한 카바트 번호를 갖는 아미노산 잔기로 치환하는 단계로, 여기서 상기 공여자 면역 글로불린의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 하나 이상의 구조 영역의 아미노산 서열에 존재하는 상기 아미노산 잔기는 상기 아미노산 서열들의 풀에서 동일한 카바트 번호를 갖는 아미노산 잔기와는 상이한 것인 단계
를 포함한다.
통상, 이러한 방법론을 이용한 재인간화 치료 면역 글로불린은 미변경 공여자 치료 항체보다 덜 면역원성인 면역 글로불린이라는 결과를 낳는다. 또한, 상기 변형된 항체는 그 결합 친화도 및 특이성을 보유한다. 그러므로, 상기 결과되는 변형된 항체는 치료적으로 더 유용하다.
특정 구현예에 있어서, 상기 결과되는 PET화 항체 또는 그들의 결합 단편은 결합 친화도 KD 1x10-8 또는 그 미만으로 원하는 표적 에피토프에 결합한다.
본 발명의 또 다른 측면은 면역 글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인에 이용되기 위한 하나 이상의 구조 영역을 제공하는 것에 이른다. 본 발명의 이러한 측면의 방법은 특히 항체의 인간화와 같은 공정 또는 인간 외 종에 투여하기 전 항체를 탈면역화시키기 위하여 변경하는 데 사용되는 등가의 과정에 있어서 특히 유용할 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에 의하여 제공되는 상기 구조 영역은 인간화 또는 유사한 종화 과정 중 어느 하나를 겪게 될 항체로 도입될 수 있고, 또는 이미 종화를 겪은 항체로 소급적으로 도입될 수도 있다. 구체적으로, 상기 변형된 구조 영역은 CDR 그라프팅과 같은 과정에 의하여 변형되었거나 변형될 항체, 또는 그 항체의 Fab 영역이 제1의 종으로부터 유래하고 그 항체의 Fc 영역은 제2의 종으로부터 유래하는 키메라 항체로 도입될 수 있다.
따라서, 이러한 추가의 측면은 공여자 면역 글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 하나 이상의 구조 영역의 아미노산 서열을 변형하는 방법을 제공하고, 상기 방법은:
- 상기 공여자 면역 글로불린의 하나 이상의 구조 영역 서열의 아미노산 서열을 결정하는 단계;
- 잔기 대 잔기 방식에 기초하여, 상기 공여자 면역 글로불린의 하나 이상의 구조 영역의 각 위치의 특정 아미노산 잔기들을 변형원 면역 글로불린이 투여될 종으로부터 유래하는 항체들에서 발견되는 구조 영역 서열들의 대응하는 아미노산 위치에서 발견되는 아미노산 잔기들의 풀을 포함하는 데이터베이스와 비교하는 단계;
- 상기 공여자 면역 글로불린의 하나 이상의 구조 영역 내 특정 위치에 존재하지만 상기 대응하는 아미노산 위치에서 발견되는 아미노산 잔기들의 풀에는 존재하지 않는 임의의 아미노산 잔기들을, 상기 대응하는 아미노산 위치에서 발견되는 아미노산 잔기들의 풀에 존재하는 아미노산 잔기로 치환하는 단계; 및
- 상기 공여자 면역 글로불린의 하나 이상의 구조 영역 내 특정 위치에 존재하고 또한 상기 대응하는 아미노산 위치에서 발견되는 아미노산 잔기들의 풀에도 존재하는 임의의 미변경 아미노산 잔기들을 남기는 단계
를 포함한다.
통상, 임의의 교체되는 아미노산 잔기들은 상기 교체되는 아미노산 잔기와 가장 상동성인 아미노산 잔기로 치환된다. 이전에 정의한 바와 같이, 아미노산 잔기들의 상동 그룹들이 알려져 있다. 상동의 아미노산 잔기가 그 풀에 존재하지 않으면, 그 아미노산은 그 특정 위치에서 가장 높은 빈도로 존재하는 아미노산 잔기, 소위 공통 아미노산 잔기로 치환될 수 있다.
특정 구현예에 있어서, 상기 방법은 상기 변형된 구조 영역 서열을 상보성 결정 영역 (CDRs) 및 중쇄 및/또는 경쇄 불변 도메인과 함께 발현시키는 단계를 포함하는 변형된 항체의 제조 방법에 이르고, 이로써 상기 변형된 구조 영역 서열을 포함하는 헤테로4량형 (heterotetrameric) 항체가 제조된다.
본 발명의 또 다른 특정 측면은 상기 변형된 구조 영역 서열의 아미노산 서열을 발현하는 올리고뉴클레오티드의 제공 및 숙주 세포에서의 그 발현에 이른다.
본 발명의 또 다른 측면은 비면역원성 구조 영역 서열을 함유하는 치료 항체의 제조 방법에 관한 것이고, 상기 방법은:
- 특정 위치에서 상이한 하나 이상의 아미노산 잔기들을 식별하기 위하여, 구조 영역의 아미노산 서열들을 상기 치료 항체가 투여될 종으로부터 유래되는 다수의 면역 글로불린들의 대응하는 아미노산 위치에 존재하는 대응하는 아미노산 잔기들의 풀과 비교함으로써 치환될 구조 영역 아미노산 잔기들을 식별하는 단계; 및
- 상기 하나 이상의 아미노산 잔기들을, 대응하는 아미노산 잔기들의 풀에 존재하는 아미노산 잔기로 치환하는 단계
를 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 구조 영역 아미노산 잔기가 상기 항체가 투여될 종의 아미노산 잔기들로 이루어지는 대응하는 위치적 풀에 존재하는지 여부에 대한 식별은 상기 서열과 상기 풀 잔기들의 정렬을 수행함으로써 달성된다. 근본적으로, 치환되는 상기 잔기들은 결과되는 변형된 항체의 결합 활성을 감소시키지 않는다. 즉, 상기 치환되는 아미노산은 그 항체의 결합 성격에 심히 영향을 미치지 않으면서 상이한 아미노산으로 치환될 수 있다. 이것은 기본적으로 상기 아미노산을 상동 아미노산, 즉 유사하거나 관련된 성격을 갖는 아미노산, 예컨대 크기, 표적 위치에서 분자의 극성/전하 또는 소수성, 또는 측쇄의 벌키함과 같은 성격을 갖는 아미노산으로 치환함으로써 달성된다. 또는, 상기 잔기는 대응하는 위치에서 표적 종에 존재하는 공통 잔기로 치환될 수 있다.
치환되는 (또는 치환될 수 있는) 상기 아미노산 잔기들은 변이 내성 위치 (variant tolerant positions)로 알려질 수 있다. 즉, 그 잔기의 다른 잔기로의 치환이 구조 영역들 사이에 위치하는 상보성 결정 영역들의 결합 특이성을 변경시키지 않는다. 이러한 치환은 한 가지 종의 구조 영역의 특정 위치에 존재하는 잔기가 제2의 종의 구조 영역 서열의 대응하는 위치에서 부재할 수 있다는 사실에 근거하여 필요한 것으로 여겨질 수 있다. 그러므로, 상기 아미노산은 통상 그 아미노산 잔기가 구조 영역 서열의 그 위치에 존재하지 않는 종의 면역계에 의하여 외래의 것으로 보일 에피토프를 형성함으로써 그에 대하여 발생하는 면역원성 반응을 야기할 수 있다. 그 영외의 (outlier) 잔기를 표적 종에 존재하는 상동 잔기 또는 공통 잔기로 치환하는 방법론을 이용하면, 잠재적 외래 에피토프가 변경되어 외래의 것으로 인식되지 않을 에피토프를 형성할 수 있다. 그러므로, 항체의 구조 영역으로부터 이러한 에피토프들을 모두 제거하면 그 항체가 최초로 유래한 종과 상이한 종에 해당하는 대상체에 투여시 항체의 일부에 대하여 발생할 체액성 반응을 방지할 수 있다.
보편적인 종-특이적 구조 영역 생성
또한, 본 발명의 발명자는 상보성 결정 영역 (CDRs)과 조합되어 비면역원성 PET화 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 형성할 수 있는 일련의 구조 영역 (framework regions, FR)을 정의하였다. 각각의 중쇄 및 경괘 도메인은 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 지정된, 4개의 구조 영역들을 갖는다. 이러한 방법론은 원하는 종에 투여될 수 있도록 임의의 항체 (면역 글로불린)을 탈면역화하는 데 적용할 수 있다. 그러나, 오직 예시적 목적을 위하여, 하기 주목할 실시예들은 인간, 개, 고양이 및 말 계열 항체의 그 구조 영역들의 제조 및 용도를 구현할 것이다.
항체 구조
항체 분자는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들 및 사이에 위치하는 연관된 구조 영역들을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 상기 중쇄 가변 도메인 (VH) CDRs은 카바트 번호 시스템 (Kabat numbering system)에 따라 하기 위치에서 발견되는 VHCDRs로 알려져 있다: VHCDR1 - 카바트 잔기 31-35, VHCDR2 - 카바트 잔기 50-65, 및 VHCDR3 - 카바트 잔기 95-102 (Kabat EA et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, 5th edition. Bethesda: US Department of Health and Human Services).
또한, 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들 및 사이에 위치하는 연관된 구조 영역들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 상기 경쇄 가변 도메인 (VL) CDRs은 카바트 번호 시스템에 따라 하기 아미노산 잔기 위치에서 발견되는 VLCDRs로 알려져 있다: VLCDR1 - 카바트 잔기 24-34, VLCDR2 - 카바트 잔기 50-56, 및 VLCDR3 - 카바트 잔기 89-97.
경쇄 가변 도메인 또는 중쇄 가변 도메인은 하기의 배열로 CDRs이 끼어든 4개의 구조 영역, FR1, FR2, FR3 및 FR4을 포함한다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
본 발명의 또 다른 측면은 표적 종에 투여하기 위한 면역 글로불린을 제공하고, 이는
- 상기 표적 종의 면역 글로불린으로부터 유래하는 경쇄 및 중쇄 불변 도메인,
- 상기 표적 종에 존재하는 리간드에 특이적으로 결합하는 것인 공여자 면역 글로불린으로부터 유래하는 상보성 결정 영역 (CDRs), 및
- 상기 표적 종들의 임의의 면역 글로불린의 대응하는 위치에 존재하지 않는 임의의 아미노산 잔기들은 상기 표적 종의 대응하는 위치에서 발견되는 아미노산으로 치환된 것인 상기 공여자 면역 글로불린으로부터 유래하는 구조 영역
을 포함한다.
통상, 항체의 CDR 영역에는 어떠한 아미노산 치환이 이루어지지 않는다. 또한, 특정 구현예에 있어서, 상기 구조 영역은 표적 종의 잔기들로 치환되는 연속적 아미노산 잔기들을 7개 이하로 포함한다. 또한, 특정 구현예에 있어서, 상기 구조 영역은 표적 종의 잔기들로 치환되는 연속적 아미노산 잔기들을 5개 이하로 포함한다. 또한, 특정 구현예에 있어서, 상기 구조 영역은 표적 종의 잔기들로 치환되는 연속적 아미노산 잔기들을 3개 이하로 포함한다.
또한, 특정 구현예에 있어서, 상기 공여자 면역 글로불린 구조 영역 (중쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4 및 경쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4)의 10개 이하의 아미노산 잔기들이 표적 종의 잔기로 치환된다. 또한, 특정 구현예에 있어서, 상기 공여자 면역 글로불린 구조 영역 (중쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4 및 경쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4)의 7개 이하의 아미노산 잔기들이 표적 종의 잔기로 치환된다. 또한, 특정 구현예에 있어서, 상기 공여자 면역 글로불린 구조 영역 (중쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4 및 경쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4)의 5개 이하의 아미노산 잔기들이 표적 종의 잔기로 치환된다.
특정 구현예에 있어서, 상기 표적 종은 포유류 종이다. 특히 상기 표적 종은 인간, 개, 고양이 또는 말일 수 있다.
따라서, 상기 면역 글로불린이 표적 종으로서 개에게 투여되는 경우의 구현예에 있어서, 상기 면역 글로불린은 개 유래 항체 또는 항체들로부터 유래하는 불변 도메인 영역을 포함하거나, 상기 공여자 면역 글로불린 구조 영역 내로 치환된 잔기들이 대응하는 개의 구조 영역 아미노산 잔기들로부터 유래한다.
상기 면역 글로불린이 표적 종으로서 고양이에게 투여되는 경우의 구현예에 있어서, 상기 면역 글로불린은 고양이 유래 항체 또는 항체들로부터 유래하는 불변 도메인 영역을 포함하거나, 상기 공여자 면역 글로불린 구조 영역 내로 치환된 잔기들이 대응하는 고양이의 구조 영역 아미노산 잔기들로부터 유래한다.
상기 면역 글로불린이 표적 종으로서 말에게 투여되는 경우의 구현예에 있어서, 상기 면역 글로불린은 말 유래 항체 또는 항체들로부터 유래하는 불변 도메인 영역을 포함하거나, 상기 공여자 면역 글로불린 구조 영역 내로 치환된 잔기들이 대응하는 말의 구조 영역 아미노산 잔기들로부터 유래한다.
상기 면역 글로불린이 표적 종으로서 인간에게 투여되는 경우의 구현예에 있어서, 상기 면역 글로불린은 인간 유래 항체 또는 항체들로부터 유래하는 불변 도메인 영역을 포함하거나, 상기 공여자 면역 글로불린 구조 영역 내로 치환된 잔기들이 대응하는 인간의 구조 영역 아미노산 잔기들로부터 유래한다.
다양한 또 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 전술한 측면의 면역 글로불린 또는 그들의 항원 결합 단편을 함유하는 조성물이 제공된다. 상기 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 캐리어를 더 포함할 수 있다. 또 다른 측면은 질병의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서 전술한 본 발명의 측면의 면역 글로불린 또는 그들의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다. 또 다른 다양한 구현예에 있어서, 본 발명은 치료 방법 및 진단 방법에 있어서 전술한 면역 글로불린 또는 그들의 항원 결합 단편의 용도에 이른다. 또한, 본 발명은 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 전술한 본 발명의 측면의 면역 글로불린 또는 그들의 항원 결합 단편에까지 이른다.
본 발명의 또 다른 측면은 질병의 치료 또는 예방을 위한 전술한 본 발명의 측면의 면역 글로불린 또는 그들의 항원 결합 단편의 대상체, 특히 포유류 대상체로의 투여에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은:
- 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 단계로서, 상기 뉴클레오티드는 본 발명에 기재된 방법에 따라 제조되는 구조 영역을 포함하는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 것인 단계, 및
- 세포 내에서 상기 뉴클레오티드를 발현시켜 상기 면역 글로불린을 제조하는 단계
를 포함하는 면역 글로불린의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 표적 종에 투여시 실질적으로 비면역원성인 면역 글로불린의 제조 방법을 제공하고, 상기 방법은:
(1) 공여자 면역 글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 구조 영역의 서열들을 표적 종 면역 글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 구조 영역의 서열들 모음과 비교하는 단계;
(2) 상기 공여자 면역 글로불린 구조 영역 서열들 내 특정 위치에는 존재하지만 상기 표적 종 면역 글로불린 구조 영역 서열들의 모음 내 대응하는 위치에는 존재하지 않는 임의의 아미노산 잔기들을, 상기 표적 종 면역 글로불린 구조 영역 서열들의 모음 내 대응하는 위치에 존재하는 아미노산 잔기로 치환하는 단계;
(3) 종-적합 중쇄 및/또는 경쇄 불변 도메인과 함께, 상기 공여자 면역 글로불린 가변 영역으로부터의 CDRs 및 상기 치환된 구조 영역을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA 분절을 합성하는 단계;
(4) 세포 내로 상기 DNA 분절을 도입하는 단계; 및
(5) 상기 세포 내에서 상기 DNA 분절을 발현시켜 상기 면역 글로불린을 제조하는 단계
를 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 상기 방법은 상기 공여자 면역 글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 시퀀싱하는 단계를 더 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 방법은 상기 면역 글로불린을 정제하는 단계를 더 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 상기 방법은 약학적으로 허용가능한 캐리어 또는 희석제 내에서 상기 면역 글로불린을 제제화하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 인간 신경 성장 인자 (NGF)에 특이적으로 결합할 수 있는 중화 항체 또는 그들의 항원 결합 단편을 제공하는데, 여기서 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열 또는 그와 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지거나, 필수적으로 이들로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열 또는 그와 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지거나, 필수적으로 이들로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 상동성은 약 15개, 좋기로는 약 20개, 더욱 좋기로는 약 25개 이상의 아미노산 길이에 걸친 것이다.
상기 항체는 본 발명의 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
특정 구현예에 있어서, 상기 경쇄는 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열 또는 그와 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지거나, 필수적으로 이들로 이루어진다. 특정 구현예에 있어서, 상기 상동성은 약 15개, 좋기로는 약 20개, 더욱 좋기로는 약 25개 이상의 아미노산 길이에 걸친 것이다.
특정 구현예에 있어서, 상기 중쇄는 SEQ ID NO:24의 아미노산 서열 또는 그와 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지거나, 필수적으로 이들로 이루어진다. 특정 구현예에 있어서, 상기 상동성은 약 15개, 좋기로는 약 20개, 더욱 좋기로는 약 25개 이상의 아미노산 길이에 걸친 것이다.
본 발명의 발명자들은 상보성 결정 영역 (CDRs)와 조합되어 인간화 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 형성할 수 있는 일련의 구조 영역 (FR)을 더 정의한다. 상기 인간 중쇄 및 경쇄 도메인 각각은 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 지정되는 4개의 구조 영역을 갖는다.
따라서, 인간 신경 성장 인자 (NGF)에 특이적으로 결합할 수 있는 중화 항체 또는 그들의 항원 결합 단편 역시 제공되고, 여기서 상기 항체 또는 항원 결합 단편은:
SEQ ID NO:60의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR1 구조 영역,
SEQ ID NO:61의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR2 구조 영역,
SEQ ID NO:62의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR3 구조 영역, 및
SEQ ID NO:63의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR4 구조 영역 중 하나 이상을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는
SEQ ID NO:64의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR1 구조 영역,
SEQ ID NO:65의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR2 구조 영역,
SEQ ID NO:66의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR3 구조 영역, 및
SEQ ID NO:67의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR4 구조 영역
중 하나 이상을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 상기 경쇄는 경쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4 모두를 포함하고 및/또는 상기 중쇄는 중쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4 모두를 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 측면의 상기 항체 또는 결합 단편은 평형 해리 상수 (KD) 1x10-8 또는 그 미만의 결합 친화도로 인간 NGF에 특이적으로 결합한다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 측면의 상기 항체 또는 결합 단편은 인간 NGF의 p75 또는 TrkA 인간 NGF 수용체로의 결합 능력을 억제한다.
좋기로는, 본 발명의 상기 측면의 상기 항체 또는 결합 단편은 인간에서 면역원성이 아니다.
통상 본 발명의 상기 측면의 상기 항체는 인간으로부터 유래하는 면역 글로불린으로부터 유래하는 경쇄 및/또는 중쇄 불변 도메인을 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 측면의 상기 결합 단편은 단쇄 Fv (scFv) 항체 단편, Fab 항체 단편, Fab' 항체 단편, F(ab')2 항체 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
다양한 다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 상기 항체 또는 항원 결합 단편들을 인코딩하는 단리된 핵산에까지 이른다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 전술한 측면들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
특정 구현예에 있어서, 그 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열 또는 그와 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항-NGF 항체 또는 항원 결합 단편의 경쇄 가변 도메인을 인코딩한다.
또한, SEQ ID NO:25의 아미노산 서열 또는 그와 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항-NGF 항체 또는 항원 결합 단편의 경쇄를 인코딩하는 단리된 핵산도 제공된다.
특정 구현예에 있어서, 그 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열 또는 그와 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항-NGF 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 가변 도메인을 인코딩한다.
또한, SEQ ID NO:24의 아미노산 서열 또는 그와 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항-NGF 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄를 인코딩하는 단리된 핵산도 제공된다.
특정 구현예에 있어서, 상기 단리된 핵산은 그와 작동적으로 연관된 하나 이상의 조절 서열을 인코딩하는 핵산을 더 포함한다.
다른 측면에 있어서, 본 발명의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인 또는 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 특정 구현예에 있어서, 상기 발현 벡터는 하나 이상의 조절 서열을 더 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 또는 레트로바이러스 벡터이다.
또 다른 측면은 본 발명의 전술한 측면의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 전술한 측면들 중 어느 하나의 항체를 생산하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 인간화 NGF 중화 항체를 생산하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명의 전술한 측면의 숙주 세포를 배양하여 세포로 하여금 인간화 NGF 중화 항체를 발현하도록 하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 NGF 중화 항체를 생산하는 방법을 제공하는데, 이는 적절한 숙주 세포에서 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 발현하는 본 발명의 전술한 측면들의 폴리뉴클레오티드/핵산 또는 벡터 하나 이상을 발현시키는 단계와, 숙주 세포에서 함께 발현되거나 다른 숙주 세포에서 별개로 발현될 수 있는 그 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계와, 항체를 단리하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 항체 또는 결합 단편 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 캐리어가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면은 질병, 예컨대 관절염의 치료 또는 예방을 위한, 또는 통증, 예컨대 질병과 관련된 통증 (예컨대, 신경성 통증, 수술 후 통증, 만성 통증, 종양 통증 등)의 치료, 예방 또는 개선을 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 상기 관점들의 항체 또는 결합 단편, 핵산, 약학적 조성물 또는 발현 벡터의 용도를 제공한다. 다양한 다른 측면에 있어서, 본 발명은 치료 방법 및 진단 방법에 있어서 본 발명의 상기 관점의 항체 또는 결합 단편의 용도에까지 이른다.
본 발명의 또 다른 측면은 질병 (예컨대, 관절염) 또는 통증의 치료 또는 예방을 위하여 대상체, 특히 포유류 대상체에 본 발명의 상기 측면들의 항체 또는 결합 단편, 핵산, 약학적 조성물 또는 발현 벡터를 투여하는 것에 관한 것이다.
특정 구현예에 있어서, 상기 질병은 신경 성장 인자 (NGF)에 대한 감수성 증가에 의하여 야기되거나, 그와 관련되거나 그 원인이 되는 질환이다. 특정 구현예에 있어서, 상기 질병은 NGF로 증식 유도되는 종양 (예컨대, 골육종)에 관한 것이다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 전술한 방법들은 본 발명의 상기 항-NGF 항체의 효과를 증강 및/또는 보완할 수 있는 하나 이상의 추가 제제를 공투여하는 단계를 더 포함한다. 예컨대, 상기 항체 또는 그들의 항원 결합 단편은 1종 이상의 진통제, NSAID, 오피오이드, 코르티코스테로이드, 스테로이드, 히알루로난 또는 히알루론산과 함께 공투여될 수 있다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명에 따른 항-인간 NGF 중화 모노클로날 항체, 또는 그들의 단편을 제조하는 세포주, 또는 그들의 유도체 또는 자손 세포가 제공된다.
본 발명의 또 하나의 측면은 인간의 통증을 치료하기 위한, 또는 통증과 관련된 질환을 치료하기 위한, 또는 골관절염, 류마티스 관절염 및 염증과 관련된 통증을 치료, 개선 또는 억제하기 위한 키트를 제공하는데, 이는 본 발명의 전술한 측면들 중 어느 하나에 따른 항-NGF 항체와, 이들의 사용에 대한 지침을 포함한다.
본 발명의 또 하나의 측면은 시험관 내 (in vitro), 생체 외 (ex vivo) 및 생체 내 (in vivo)에서 유액 중 항-인간 NGF 모노클로날 항체를 검출하기 위한 진단 키트를 제공하는데, 이는 상기 항체의 농도를 측정하는 데 사용하기 위한 것이다. 상기 키트는 본 발명의 항체들 중 어느 하나 또는 그들의 결합 단편을 포함할 수 있다. 상기 키트는 이들을 사용하기 위한 지침을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 견(犬) 종양 괴사 인자 (TNF)에 특이적으로 결합할 수 있는 중화 항체 또는 그들의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 SEQ ID NO:71의 아미노산 서열 또는 그와 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 또는 필수적으로 이들로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열 또는 그와 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 또는 필수적으로 이들로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 상동성은 약 15개, 좋기로는 약 20개, 더욱 좋기로는 약 25개 이상의 아미노산 길이에 걸친 것이다.
상기 항체는 본 발명의 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 통상 본 발명의 상기 측면들의 항체는 개로부터 유래하는 면역 글로불린으로부터 유래하는 경쇄 및/또는 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 중쇄는 SEQ ID NO:18, 19, 20 또는 21의 아미노산 서열 또는 그와 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 또는 필수적으로 이들로 이루어진다. 특정 구현예에 있어서, 상기 상동성은 약 15개, 좋기로는 약 20개, 더욱 좋기로는 약 25개 이상의 아미노산 길이에 걸친 것이다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 측면들의 항체 또는 결합 단편은 평형 해리 상수 (KD) 1x10-8 또는 그 미만의 결합 친화도로 견 TNF에 특이적으로 결합한다. 좋기로는 본 발명의 상기 측면들의 항체 또는 결합 단편은 개에서 면역원성이 아니다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 측면의 상기 결합 단편은 단쇄 Fv (scFv) 항체 단편, Fab 항체 단편, Fab' 항체 단편, F(ab')2 항체 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
다양한 다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 상기 항체 또는 항원 결합 단편들을 인코딩하는 단리된 핵산에까지 이른다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 전술한 측면들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
특정 구현예에 있어서, 그 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:71의 아미노산 서열 또는 그와 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항-TNF 항체 또는 항원 결합 단편의 경쇄 가변 도메인을 인코딩한다.
특정 구현예에 있어서, 상기 단리된 핵산은 그와 작동적으로 연관된 하나 이상의 조절 서열을 인코딩하는 핵산을 더 포함한다.
다른 측면에 있어서, 본 발명의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인 또는 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 특정 구현예에 있어서, 상기 발현 벡터는 하나 이상의 조절 서열을 더 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 또는 레트로바이러스 벡터이다.
또 다른 측면은 본 발명의 전술한 측면의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 전술한 측면들 중 어느 하나의 항체를 생산하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 견화 TNF 중화 항체를 생산하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명의 전술한 측면의 숙주 세포를 배양하여 세포로 하여금 견화 TNF 중화 항체를 발현하도록 하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 TNF 중화 항체를 생산하는 방법을 제공하는데, 이는 적절한 숙주 세포에서 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 발현하는 본 발명의 전술한 측면들의 폴리뉴클레오티드/핵산 또는 벡터 하나 이상을 발현시키는 단계와, 숙주 세포에서 함께 발현되거나 다른 숙주 세포에서 별개로 발현될 수 있는 그 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계와, 항체를 단리하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 항체 또는 결합 단편 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 캐리어가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면은 질병, 특히 견 TNF의 발현 증가 또는 개의 TNF에 대한 감수성 증가에 의하여 야기되거나, 그와 관련되거나 또는 그의 원인이 되는 임의의 질환의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 상기 관점들의 항체 또는 결합 단편, 핵산, 약학적 조성물 또는 발현 벡터의 용도를 제공한다. 다양한 다른 측면에 있어서, 본 발명은 치료 방법 및 진단 방법에 있어서 본 발명의 상기 관점의 항체 또는 결합 단편의 용도에까지 이른다.
본 발명의 또 다른 측면은 질병의 치료 또는 예방을 위하여 개에게 본 발명의 상기 측면들의 항체 또는 결합 단편, 핵산, 약학적 조성물 또는 발현 벡터를 투여하는 것에 관한 것이다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명에 따른 항-견 TNF 중화 모노클로날 항체, 또는 그들의 단편을 제조하는 세포주, 또는 그들의 유도체 또는 자손 세포가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면은 견(犬) 신경 성장 인자 (NGF)에 특이적으로 결합할 수 있는 중화 항체 또는 그들의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 또는 그와 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 또는 필수적으로 이들로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO:69의 아미노산 서열 또는 그와 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 또는 필수적으로 이들로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 상동성은 약 15개, 좋기로는 약 20개, 더욱 좋기로는 약 25개 이상의 아미노산 길이에 걸친 것이다.
상기 항체는 본 발명의 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
특정 구현예에 있어서, 상기 경쇄는 SEQ ID NO:7의 아미노산 서열 또는 그와 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 또는 필수적으로 이들로 이루어진다. 특정 구현예에 있어서, 상기 상동성은 약 15개, 좋기로는 약 20개, 더욱 좋기로는 약 25개 이상의 아미노산 길이에 걸친 것이다.
특정 구현예에 있어서, 상기 중쇄는 SEQ ID NO:70의 아미노산 서열 또는 그와 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 또는 필수적으로 이들로 이루어진다. 특정 구현예에 있어서, 상기 상동성은 약 15개, 좋기로는 약 20개, 더욱 좋기로는 약 25개 이상의 아미노산 길이에 걸친 것이다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 측면들의 항체 또는 결합 단편은 평형 해리 상수 (KD) 1x10-8 또는 그 미만의 결합 친화도로 견 TNF에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 측면들의 항체 또는 결합 단편은 견 NGF의 p75 또는 TrkA 견 NGF 수용체에 결합하는 능력을 억제한다. 좋기로는 본 발명의 상기 측면들의 항체 또는 결합 단편은 개에서 면역원성이 아니다.
통상, 본 발명의 상기 측면들의 항체는 개로부터 유래하는 면역 글로불린으로부터 유래하는 경쇄 및/또는 중쇄 불변 도메인을 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 측면의 상기 결합 단편은 단쇄 Fv (scFv) 항체 단편, Fab 항체 단편, Fab' 항체 단편, F(ab')2 항체 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
다양한 다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 상기 항체 또는 항원 결합 단편들을 인코딩하는 단리된 핵산에까지 이른다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 전술한 측면들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
특정 구현예에 있어서, 그 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 또는 그와 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항-NGF 항체 또는 항원 결합 단편의 경쇄 가변 도메인을 인코딩한다.
또한, SEQ ID NO:7의 아미노산 서열 또는 그와 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항-NGF 항체 또는 항원 결합 단편의 경쇄를 인코딩하는 단리된 핵산도 제공된다.
특정 구현예에 있어서, 그 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:69의 아미노산 서열 또는 그와 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항-NGF 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 가변 도메인을 인코딩한다.
또한, SEQ ID NO:70의 아미노산 서열 또는 그와 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항-NGF 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄를 인코딩하는 단리된 핵산도 제공된다.
특정 구현예에 있어서, 상기 단리된 핵산은 그와 작동적으로 연관된 하나 이상의 조절 서열을 인코딩하는 핵산을 더 포함한다.
다른 측면에 있어서, 본 발명의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인 또는 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 특정 구현예에 있어서, 상기 발현 벡터는 하나 이상의 조절 서열을 더 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 또는 레트로바이러스 벡터이다.
또 다른 측면은 본 발명의 전술한 측면의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 전술한 측면들 중 어느 하나의 항체를 생산하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 견화 NGF 중화 항체를 생산하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명의 전술한 측면의 숙주 세포를 배양하여 세포로 하여금 견화 NGF 중화 항체를 발현하도록 하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 NGF 중화 항체를 생산하는 방법을 제공하는데, 이는 적절한 숙주 세포에서 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 발현하는 본 발명의 전술한 측면들의 폴리뉴클레오티드/핵산 또는 벡터 하나 이상을 발현시키는 단계와, 숙주 세포에서 함께 발현되거나 다른 숙주 세포에서 별개로 발현될 수 있는 그 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계와, 항체를 단리하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 항체 또는 결합 단편 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 캐리어가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면은 개의 질병, 예컨대 관절염의 치료 또는 예방을 위한, 또는 통증, 예컨대 질병과 관련된 통증 (예컨대, 신경성 통증, 수술 후 통증, 만성 통증, 종양 통증 등)의 치료, 예방 또는 개선을 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 상기 관점들의 항체 또는 결합 단편, 핵산, 약학적 조성물 또는 발현 벡터의 용도를 제공한다. 다양한 다른 측면에 있어서, 본 발명은 치료 방법 및 진단 방법에 있어서 본 발명의 상기 관점의 항체 또는 결합 단편의 용도에까지 이른다.
본 발명의 또 다른 측면은 질병 (예컨대, 관절염) 또는 통증의 치료 또는 예방을 위하여 개에게 본 발명의 상기 측면들의 항체 또는 결합 단편, 핵산, 약학적 조성물 또는 발현 벡터를 투여하는 것에 관한 것이다.
특정 구현예에 있어서, 상기 질병은 신경 성장 인자 (NGF)에 대한 감수성 증가에 의하여 야기되거나, 그와 관련되거나 그 원인이 되는 질환이다. 특정 구현예에 있어서, 상기 질병은 NGF로 증식 유도되는 종양 (예컨대, 골육종)에 관한 것이다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 전술한 방법들은 본 발명의 상기 항-NGF 항체의 효과를 증강 및/또는 보완할 수 있는 하나 이상의 추가 제제를 공투여하는 단계를 더 포함한다. 예컨대, 상기 항체 또는 그들의 항원 결합 단편은 1종 이상의 진통제, NSAID, 오피오이드, 코르티코스테로이드, 스테로이드, 히알루로난 또는 히알루론산과 함께 공투여될 수 있다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명에 따른 항-견 NGF 중화 모노클로날 항체, 또는 그들의 단편을 제조하는 세포주, 또는 그들의 유도체 또는 자손 세포가 제공된다.
본 발명의 또 하나의 측면은 개의 통증을 치료하기 위한, 또는 통증과 관련된 질환을 치료하기 위한, 또는 골관절염, 류마티스 관절염 및 염증과 관련된 통증을 치료, 개선 또는 억제하기 위한 키트를 제공하는데, 이는 본 발명의 전술한 측면들 중 어느 하나에 따른 항-NGF 항체와, 이들의 사용에 대한 지침을 포함한다.
본 발명의 또 하나의 측면은 시험관 내 (in vitro), 생체 외 (ex vivo) 및 생체 내 (in vivo)에서 유액 중 항-견 NGF 모노클로날 항체를 검출하기 위한 진단 키트를 제공하는데, 이는 상기 항체의 농도를 측정하는 데 사용하기 위한 것이다. 상기 키트는 본 발명의 항체들 중 어느 하나 또는 그들의 결합 단편을 포함할 수 있다. 상기 키트는 이들을 사용하기 위한 지침을 포함할 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 그 항체가 유래된 종과 상이한 종에 투여시 면역원성을 저감시키지만 동시에 표적 리간드에 대한 그 항체의 결합 친화도, 항체 결합능 (avidity) 또는 특이성은 유지하는 (즉, 감소시키지 않는) 공여자 항체의 변이체를 설계 및 제조하는 신규한 방법에 이른다. 특히, 상기 항체 또는 항체 결합 단편의 구조 영역의 서열이 평가되고 그 항체가 투여될 종으로부터 유래하는 항체들의 풀에서 대응하는 위치에서 발견되지 않는 잔기들을 제거하도록 변형된다.
특히, 본 발명의 방법은 공여자 항체 (모항체)의 구조를 변형하여 상기 공여자 이외의 종인 목적하는 수용자와 최적 적합성이 된다.
종래 이 기술 분야에서, 항체를 탈면역화시키기 위하여 가장 흔히 사용되는 접근법은 수용자 종의 생식세포 서열로부터 적합한 구조를 선택하고 CDR 영역을 이 구조 내로 그라프팅하는 것이었다. 이러한 접근법의 문제점은 상기 선택된 구조가 상기 CDRs와 완벽히 매치되는 경우가 드물고 그 결과 목적하는 표적 에피토프에 대한 결합 친화도가 감소된다는 것이다. 그 후, 그들이 도입되는 위치에서 수용자에게 때로 외래인 아미노산의 도입이라는 결과를 낳는 친화도 성숙이 필요하다. 본 발명의 과정이 해법인데, 여기서 공여자 구조의 변형은 오직 아미노산이 특정 위치에서 수용자에게 외래인 경우에 이루어진다. 상기 교체는 본 발명의 일부로서 모아놓은 옵션들의 목록으로부터 선택된다. 그 결과, 본 발명의 가장 핵심인, 공여자 구조에 근본적으로 어떠한 구조적 변형이 없고, 따라서 CDRs 형태에 근본적으로 어떠한 뒤틀림도 없지만 동시에 그 구조 내에 어떠한 "비-자가 (non-self)" 아미노산이 없어 결과되는 면역 글로불린은 표적 종에서 외래인 구조 에피토프를 갖지 않는다. 상기 방법론은 임의의 원하는 표적 종에 투여하기 위한 면역 글로불린 변형에 사용될 수 있다.
지금까지 가장 발전적인 면역 글로불린 서열 다양성에 관한 연구로, Glanville과 그 동료들 (2009)은 654 명의 인간 공여자의 천연 (naive) IgM으로부터 증폭된 거의 100,000종의 중쇄 및 경쇄 cDNAs로 이루어진 아미노산 조성물을 연구하였다. 95%의 서열들이 각각 많게는 30 가지 돌연변이로서 생식세포와는 상이하였다. 그 당시 오로지 체세포 돌연변이를 통하여 돌연변이된 CDRs 1 및 2가 단지 17%로 생식세포 DNA로부터 변경없이 존재하고 CDR 1 및 2 서열의 78%는 1개 내지 6개의 아미노산 차이를 보였다. 이 연구는 본 발명의 표에 개시되는 비-CDR 구조 잔기들의 돌연변이를 개시하지 못했다. 체세포성 (somatic) 초돌연변이가 오류가 나기 쉬운 DNA 복제 기작을 통한다는 점을 고려하면, 상기 돌연변이율 자체는 CDR 1 또는 2에 대하여 관찰되는 비율과 나머지 구조 서열들 간에 차이가 있어 보이지 않고, 또한 면역 반응의 성숙 중에 항원-경험 레퍼토리 (antigen-experienced repertoire)의 체세포성 초돌연변이 후의 심오한 2차적 선택은 구조 영역에 추가적인 아미노산 다양성을 허여할 것이다. 이러한 이유로, 본 발명에 기재되는 인간, 개, 말 및 고양이 IgG 서열 모음에서 관찰되는 다양성은 순환 IgG 서열을 대표할 공산이 있다. 놀랍게도, 각 종의 체세포성 초돌연변이 후 면역 글로불린의 상동성 "카바트" 구조 위치에서 인코딩되는 아미노산들 간에는 상당한 중첩이 있고, 그 결과 이것은 본 발명의 방법에 따라 하나의 종에서 다른 종으로 전환하는 데 필요한 변화를 감소시킨다.
본 발명의 실시예 및 하기의 방대한 실험 후, 본 발명의 발명자는 견 TNF 알파 또는 견 NGF에 결합한다고 알려지지 않았던, D2E7 항-인간 TNF 항체 및 αD11 래트 항-마우스 NGF 항체를 얻었고 이들을 기본으로 사용하여 놀랍게도 개에 사용하기에 적합한 비면역원성 항체들을 생산하였다. 결과물인 표준 CDR 그라프팅 방법을 이용하여 생산된 것이 아닌 비면역원성 항체들은 개의 TNF 및 NGF 각각에 대하여 고친화 결합을 나타냄을 보여준다. 또한, 상기 항체들은 그 구조 영역 및 불변 영역이 오직 견 IgG 분자들에 존재하는 잔기들만을 포함하여, 개에게 투여되는 경우 그에 대한 이종항체들이 생성될 개연성이 낮도록 설계되었다. 따라서, 본 발명의 상기 견화 항체들은 개의 질병 치료를 위한 장기적 투여에 적합하다. 유사하게, 본 발명의 묘화, 인간화 및 마화 NGF 항체들은 각각 고양이, 인간 및 말의 질병 치료를 위한 장기적 투여에 적합하다.
본 발명의 발명자에 의하여 이용된 본 발명의 항체를 위한 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 생성하는 공정은, 그 위치에서 표적 (예컨대, 개)에게 외래인 것으로 알려진 특이적인 공여자 아미노산 잔기들을, 본 발명자들의 분석에 기초하여, 그것이 비변형된 형태로 표적 (예컨대, 개)에게 투여된다면 그 항체에 대응하여 생성되는 중화 항체를 야기할 수 있는 면역원성 에피토프의 존재를 감소시키면서 CDR 영역의 형태를 보유하므로 결합 특이성 및 결합 활성을 유지하는 표적 (예컨대, 개)의 잔기로 교체하게 되는 결과를 낳는다. 구체적으로, 본 발명의 항체 제조 방법은 (PETisation으로 알려짐) 표적 (예컨대, 개)에게 투여하는 적합성에 대하여 공여자 항체의 구조 영역의 서열을 개로부터 유래하는 항체 또는 항체 풀의 서열과 비교함으로써 상기 공여자 (예컨대, 인간) 항체의 구조 영역의 서열을 평가하는 단계를 포함한다. 공여자 서열과 표적 서열 중 단 하나의 제공원 간에만 상기 비교가 이루어질 수 있다고 하여도, 표적 서열의 풀과의 비교가 바람직하다는 것은 자명한데, 이것은 표적 종들에 있어서 각 카바트 위치에서 자연 선택의 수가 확장될 것이기 때문이다. 이것은 공여자와 표적 간의 "매치" 확률을 증가시킬 뿐 아니라, 매치가 존재치 않는 교체에 대한 선택 역시 확장시킬 것이다. 그 결과로서, 공여자와 가능한 근접한 특징을 갖는 교체의 선택이 가능해질 것이다. 공여자 서열과 개의 서열이 임의의 카바트 번호 또는 대응하는 위치에서 상이한 경우, 공여자 서열은 문제의 아미노산 잔기가, 표적 (예컨대, 개)에서 그 위치에 천연적으로 존재하는 것으로 알려진 아미노산 잔기로 치환되도록 변형된다.
공여자 면역 글로불린 구조 영역에 존재하는 아미노산 잔기의 치환이 필요한 경우, 통상적으로 이것은, 아미노산 잔기가 표적 (예컨대, 개)의 그 카바트 위치에서 자연적으로 존재하고, 크기, 전하 및 소수성에 있어서 공여자 서열에서 치환되는 아미노산과 가능한 근접하여 관련되는 아미노산 잔기로 교체되는 보존적 치환의 원리를 이용하여 이루어진다. 그 목적은 상기 공여자 항체의 3차원 구조에 어떠한 동요 또는 혼란을 야기하지 않거나, 또는 오직 최소한의 동요 또는 혼란만을 야기하는 교체를 선택하기 위함이다. 특정 경우에 있어서는, 어떠한 명확한 선택권이 없을 것이고 각각의 선택은 유리 및 불리를 동시에 가질 것이다. 최종 결정은 3차원 모델링이나 다양한 대안 서열의 발현을 필요로 할 수 있다. 그러나, 일반적으로, 명확한 선호가 있을 것이다. 이러한 방법의 결과로, 공여자 서열의 변화는 그 잔기가 표적에서 외래의 것이고 그 교체 아미노산이 대체되는 아미노산과 가능한 근접하게 관련된 경우에만 이루어진다. 따라서, 외래의 에피토프의 생성은 회피되지만, 총 3차원 구조는 보존되고 그 결과로 친화도 및 특이성 역시 보존된다. 본 발명의 이러한 측면의 예시적 실시예들은:
- 경쇄 서열 SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 25, 27 및 71
- 중쇄 서열 SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 24, 26, 68, 69 및 70
을 포함한다.
항체 생산
본 발명의 항체 및 결합 일원은 전적으로 또는 부분적으로 화학적 합성에 의하여 생산될 수 있다. 예컨대, 상기 본 발명의 항체 및 결합 일원들은 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있는 방법들, 예컨대 표준 액체 펩타이드 합성 또는 고상 펩타이드 합성 방법에 의하여 제조될 수 있다. 또는, 상기 항체 및 결합 일원들은 액상 펩타이드 합성 기법을 이용하여 용액 중에서 제조되거나, 또는 고상, 액상 및 용액 화학의 조합에 의하여 제조될 수도 있다.
또한, 본 발명은 적절한 발현 시스템으로 본 발명의 항체인 하나 이상의 아미노산을 인코딩하는 핵산 발현에 의하여, 그로써 목적하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 인코딩될 수 있는 본 발명의 항체 또는 결합 일원들의 생산에까지 이른다. 예컨대, 아미노산 경쇄를 인코딩하는 제1 핵산 및 아미노산 중쇄를 인코딩하는 제2 핵산은 발현되어 본 발명의 항체를 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 특정 측면에 있어서, 본 발명의 항체 또는 결합 일원들을 형성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산이 제공된다.
통상적으로, 본 발명의 항체 또는 결합 일원을 형성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산들은 단리되거나 정제된 형태로 제공되거나, 또는 하나 이상의 조절 서열을 제외하고는 자연적으로 그와 관련되어 있을 수 있는 물질을 실질적으로 포함하지 않는 형태로 제공된다. 본 발명의 항체 또는 결합 일원을 발현하는 핵산들은 전적으로 또는 부분적으로 합성된 것일 수 있고, DNA, cDNA 및 RNA를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항체 또는 결합 일원들을 인코딩하는 핵산 서열은, 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려진 기법들, 예컨대 문헌 [Sambrook et al. "Molecular Cloning", A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Volumes 1-3, 2001 (ISBN-0879695773)], 및 문헌 [Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, 4th Edition, 1999 (ISBN-0471250929)]에 기술된 기법들을 이용하여 숙련자에 의하여 쉽게 제조될 수 있다. 상기 기법들은 (i) 핵산 시료를 증폭하기 위한 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)의 이용, (ii) 화학적 합성, 또는 (iii) cDNA 서열의 제조 등을 포함한다. 본 발명의 항체 또는 결합 일원들을 인코딩하는 DNA는, 예컨대 DNA 인코딩시키고, 발현될 부분 양 옆의 적절한 제한 효소 인식 부위를 동정하고, DNA로부터 상기 부분을 잘라내는 등 이 기술 분야의 숙련자에게 알려진 임의의 적절한 방식으로 생성 및 사용될 수 있다. 잘려진 부분은 그 후 적절한 프로모터와 작동적으로 연결, 적절한 발현 시스템, 예컨대 시판 발현 시스템으로 발현될 수 있다. 또는, 관련 DNA 부분은 적절한 PCR 프라이머를 이용하여 증폭될 수 있다. DNA 서열에 대한 변형은 위치 지정 돌연변이법 (site directed mutagenesis)을 이용하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 항체 또는 결합 일원들을 인코딩하는 핵산 서열은 전술한 핵산 하나 이상을 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트의 형태로 컨스트럭트로서 제공될 수 있다. 상기 컨스트럭트는 상기 컨스트럭트를 하나 이상 포함하는 재조합 숙주 세포 내에 포함될 수 있다. 편리하게는, 발현은 적당한 조건하에서, 적절한 핵산 서열을 함유한 재조합 숙주 세포를 배양함으로써 달성될 수 있다. 발현 이후, 항체 또는 항체 단편들은 임의의 적절한 기법을 이용하여 단리 및/또는 정제된 후, 적절히 사용될 수 있다.
여러 다양한 숙주 세포에서 폴리펩타이드를 클로닝 및 발현하기 위한 시스템이 잘 알려져 있다. 적절한 숙주 세포로는 박테리아, 포유동물 세포, 효모, 곤충 및 배큘로바이러스 시스템을 들 수 있다. 이 기술 분야에서 이형접합 폴리펩타이드의 발현을 위하여 이용가능한 포유동물 세포주로는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 세포 및 NS0 마우스 골수종 세포를 들 수 있다. 흔한, 양호한 박테리아 숙주는 이. 콜라이 (E. coli)이다. 이. 콜라이와 같은 원핵 세포에서의 항체 및 항체 단편의 발현은 이 기술 분야에 잘 구축되어 있다. 진핵 세포에서의 배양 발현 역시 결합 일원 생산의 한 가지 선택지로서 이 기술 분야의 숙련자에게 이용 가능하다.
예컨대, 문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497]; 미국특허 제4,376,110호; 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor]에 기재된 방법들로 항체를 생산하는 일반적인 기술들이 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 상기 참고 문헌들과, 예컨대 유럽특허 제0,368,684호에는 재조합 항체 분자들의 제조 기술이 기술되어 있다.
본 발명의 특정 구현예에 있어서, 항체 또는 결합 일원들의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 삽입체 (insert)를 포함하는 재조합 핵산이 사용된다. 정의에 의하면, 이러한 핵산은 단일 가닥 핵산, 상기 코딩 핵산과 그에 상보적인 핵산으로 이루어지는 이중 가닥 핵산, 또는 이들 상보적 (단일 가닥) 핵산 그들 자체를 포함한다.
또한, 항체들의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산은 자연적으로 존재하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 진정 서열 또는 그들의 돌연변이를 갖는 효소적으로 합성되거나 화학적으로 합성된 핵산일 수 있다.
본 발명의 항체는 직접적인 방법이 아닌, 재조합 방법에 의하여 이형접합 폴리펩타이드를 갖는 융합 폴리펩타이드로로서 생산될 수 있는데, 이형접합 폴리펩타이드는 좋기로는 신호 서열 또는 성숙된 단백질 또는 폴리펩타이드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩타이드이다. 선택되는 이형접합 신호 서열은 좋기로는 숙주 세포에 의하여 인식되고 가공되는 (즉, 신호 펩티다아제에 의한 분해) 것이다. 본래의 항체 신호 서열을 인식 및 가공하지 못하는 원핵 숙주 세포에 대하여는, 상기 신호 서열은 예컨대 알칼리 인산가수분해효소, 페니실리나아제, lpp 및 열-안정 엔테로톡신 II 리더로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원핵 세포 신호 서열에 의하여 치환된다.
본 발명의 항체, 또는 그들로부터 유래되는 결합 일원 또는 이들을 인코딩하는 폴리펩타이드에 관하여 사용되는 경우 "단리된"이라는 용어는 그 상태에서 상기 항체 , 결합 일원들 또는 핵산 (폴리뉴클레오티드)이 단리된 및/또는 정제된 형태로 제공되는 상태를 말하고, 즉 그들이 그들의 자연적 조건으로부터 분리, 단리 또는 정제되었고 실질적으로 순수하거나 균질한 형태로 제공되거나, 또는 핵산의 경우, 필요로 되는 기능을 가진 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열을 제외한 제공원의 핵산 또는 유전자가 없는 또는 실질적으로 없는 핵산을 말한다. 따라서, 이러한 단리된 항체, 결합 일원 및 단리된 핵산은 그들이 자연적으로 관련되어 있는 물질, 예컨대 그들의 자연 조건에서, 또는 그 제조가 시험관 내 또는 생체 내에서 실시되는 재조합 DNA 기술인 경우 그들이 제조되는 조건 (예컨대, 세포 배양)에서 함께 발견되는 다른 폴리펩타이드 또는 핵산을 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않을 것이다.
항체, 결합 일원 및 핵산은 희석제 또는 아쥬반트와 함께 제제화될 수 있고, 또한, 실시 목적을 위하여 단리된 형태로 제공되는 것으로 고려될 수 있다. 예컨대, 상기 항체 및 결합 일원들은 면역분석에 사용하기 위한 마이크로타이터 플레이트를 피폭하는 데 사용된다면 젤라틴 또는 기타 캐리어와 함께 혼합되거나, 진단 또는 치료요법에 사용되는 경우 약학적으로 허용가능한 캐리어나 희석제와 함께 혼합될 것이다. 상기 항체 또는 결합 일원들은 자연적으로 또는 이형접합 진핵 세포 시스템 (예컨대, CHO 또는 NSO 세포)에 의하여 글리코실화될 수 있고, 또는 이들은 (예컨대, 원핵 세포에서 발현에 의하여 생산된다면) 비글리코실화될 수 있다.
본 발명의 항체를 포함하는 이종혼합 (heterogeneous) 제제 역시 본 발명의 일부를 형성한다. 예컨대, 이러한 제제는 전장 중쇄 및 C-말단 리신을 결여하는 중쇄를 갖는, 다양한 정도로 글리코실화 및/또는 유도 아미노산을 갖는, 예컨대 N-말단 글루탐산의 고리화로 피로글루탐산 잔기를 형성한, 항체들의 혼합물일 수 있다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 모든 기술적 및 과학 용어는 본 발명의 기술 분야의 숙련자에 의하여 통상 이해되는 의미를 갖는다. 이 용어들의 의미 및 범위는 명확하여야 하나, 모호한 경우, 본 발명에서 제공되는 정의가 사전적 또는 외적 정의에 우선한다.
명세서 전체에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 용어 "포함하다 (comprise)" 또는 "포함하다 (include)" 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 서술된 정수 또는 정수들의 그룹을 포함하지만 기타 임의의 정수 또는 정수들의 그룹을 배제하는 것은 아닌 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바, "하나 (a, an)" 및 "그 (the)"와 같은 용어는 문맥상 명확히 달리 요구되지 않는 한 단수 및 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예컨대 "활성 제제" 또는 "약학적으로 활성인 제제"라는 언급은 단일한 활성 제제 뿐 아니라 2 이상의 상이한 활성 제제의 조합을 포함하고, "캐리어"라는 언급은 2 이상의 캐리어의 혼합물 뿐 아니라 단일한 캐리어 등등을 포함한다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수의 용어는 단수를 포함할 것이다.
"대응하는 아미노산"이라는 용어는 2 이상의 아미노산 서열들을 정렬하여 그 서열들 간 최대의 서열 상동성이 가능케되는 때 동일한 위치에서 발견되는 (즉, 그들은 서로의 맞은 편에 놓인다) 아미노산 잔기를 의미한다. 대응하는 위치의 아미노산 잔기들은 동일한 카바트 번호를 갖는다. 특히, 상이한 항체들의 구조 영역의 아미노산 서열들이 정렬될 수 있고, 또는 한 항체의 구조 영역 서열의 아미노산 서열이 특정 종의 다수 면역 글로불린들로부터 유래하는 위치 특이적 구조 영역 아미노산 잔기들의 풀과 비교될 수 있다. 항체 서열을 정렬 및 번호매김하는 방법은 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있고, 참조로서 그 내용이 포함되는 카바트 등의 문헌 [Kabat,E.A., Wu,T.T., Perry,H., Gottesman,K. and Foeller,C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242]에 개시되어 있다.
본 발명에서 사용되는 바 "상보성 결정 영역 (CDR)"이라는 용어는, 카바트 등에 의하여 기술된 (Kabat,E.A., Wu,T.T., Perry,H., Gottesman,K. and Foeller,C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242), 본래 면역 글로불린 결합 위치의 자연적 Fv 영역의 결합 친화도 및 특이성을 함께 정의하는 아미노산 서열을 말한다. 본 발명에서 사용되는 바 "구조 영역 (FR)"이라는 용어는 CDRs 사이에 자리하는 아미노산 서열을 말한다. 항체 중 이들 부분은 CDRs을 적당한 배향으로 잡아주는 역할을 한다 (CDRs로 하여금 항원과 결합할 수 있도록 함).
본 발명에서 사용되는 바 "불변 영역 (CR)"이라는 용어는 효과자 기능을 부여하는 항체 분자의 부분을 말한다. 본 발명에서, 불변 영역은 통상적으로 표적 종의 불변 영역을 의미, 즉, 대상 종화 항체의 불변 영역이 표적 종의 면역 글로불린으로부터 유래한다는 것을 의미한다. 예컨대, 개의 항체에 있어서 중쇄 불변 영역은 4개의 아이소타입: A, B, C 또는 D 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바 "키메라 항체"라는 용어는 통상적으로 서로 다른 종의 것인, 2개의 서로 다른 항체로부터 유래하는 서열을 함유하는 항체를 의미한다. 가장 통상적인 키메라 항체는 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 공여자 종으로부터 유래하는 가변 도메인과, 상기 항체가 투여될 표적 종으로부터 얻어지는 항체로부터 유래하는 불변 도메인을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 바 "면역원성"이라는 용어는 수용자에게 투여되는 경우 면역 반응 (체액성 또는 세포성 반응)을 이끌어내는 표적 단백질 또는 치료 모이어티 능력의 척도를 말한다. 본 발명은 대상 종화 항체의 면역원성에 관한 것이다. 본 발명의 상기 항체는 좋기로는 어떠한 면역원성도 없는데, 즉, 표적 종에 투여되었을 때 그들에 대항하여 어떠한 중화 항체도 발생되지 않는다는 것이다.
본 발명에서 사용되는 "필수적으로 ~로 이루어지다" 또는 "필수적으로 ~로 이루어지는"이라는 용어는 추가적인 특징 또는 요소가 원하는 표적에 결합 특이성을 갖는 항체 또는 항체 단편의 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않는다면, 폴리펩타이드가 기술된 것을 넘어선 이러한 추가적인 특징 또는 요소를 가질 수 있음을 의미한다. 즉, 상기 폴리펩타이드를 포함하는 상기 항체 또는 항체 단편은 원하는 표적에 결합하고 그 기능 활성에 길항 작용을 하는 항체 또는 항체 단편들의 능력을 간섭하지 않는 추가적인 특징 또는 요소를 가질 수 있다. 이러한 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위하여 아미노산 서열로 도입될 수 있다. 예컨대, 필수적으로 특정된 서열로 이루어지는 폴리펩타이드는 그 아미노산들이 원하는 표적에 대한 결합 및 그 생물학적 기능을 봉쇄하는 데 있어 상기 항체 또는 단편의 역할을 간섭, 억제, 차단 또는 중단시키지 않는다면, 상기 서열의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단 모두에 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 그 이상의 추가, 결실 또는 치환된 아미노산을 함유할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 길항 항체로 기여하는 폴리펩타이드 분자는 그 기능기들이 원하는 표적에 결합하고 그 기능을 길항 작용하는 항체 또는 항체 단편의 능력을 간섭하지 않는다면 이러한 하나 이상의 기능기로 화학적 변형될 수 있다.
본 발명은 설명의 목적으로 제공되고 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지는 않는 하기 실시예들을 참조하여 설명될 것이다.
도 1은 래트 αD11 항체의 경쇄 구조 영역 서열 FR1 내지 FR4와 개, 고양이 및 말 종 특이적 버전 (SEQ ID NO:28 내지 43)과의 정렬을 보여준다.
도 2는 래트 αD11 항체의 중쇄 구조 영역 서열 FR1 내지 FR4와 개, 고양이 및 말 종 특이적 버전 (SEQ ID NO:44 내지 59)과의 정렬을 보여준다.
도 3은 αD11 항-NGF MAb의 개 버전 중쇄 (SEQ ID NO:2) 및 경쇄 (SEQ ID NO:1) 가변 도메인 및 완전한 경쇄 (SEQ ID NO:7) 및 중쇄 (SEQ ID NO:8)의 아미노산 서열을 보여준다.
도 4는 αD11 항-NGF MAb의 고양이 버전 중쇄 (SEQ ID NO:4) 및 경쇄 (SEQ ID NO:3) 가변 도메인 및 완전한 경쇄 (SEQ ID NO:9) 및 중쇄 (SEQ ID NO:10)의 아미노산 서열을 보여준다.
도 5는 αD11 항-NGF MAb의 말 버전 중쇄 (SEQ ID NO:6) 및 경쇄 (SEQ ID NO:5) 가변 도메인 및 완전한 경쇄 (SEQ ID NO:11) 및 중쇄 (SEQ ID NO:12)의 아미노산 서열을 보여준다.
도 6은 αD11 MAb의 개, 고양이 및 말 종화 버전의 발현에 대한 겔을 보여준다.
도 7a는 발현되고 정제된 견 NGF에 대한 견 MAb가 생물학적으로 활성이라는 것을 보여주는 그래프이다. 도 7b는 발현되고 정제된 묘(猫) NGF에 대한 묘 MAb가 생물학적으로 활성이라는 것을 보여주는 그래프인 반면 도 7c는 발현되고 정제된 마(馬) NGF에 대한 마 MAb가 생물학적으로 활성이라는 것을 보여주는 그래프이다. 도 7d는 NGF 생물학적 활성을 중화시키는 개, 고양이 및 말의 MAbs의 능력을 비교한 그래프이다.
도 8a는 래트 알파 D11 항체의 공지된 인간화 버전 (Pavone et al, WO 06/131951)과 αD11의 신규한 인간화 변이체 (New Hu - SEQ ID NO:60-63) 간 경쇄 구조 영역 변형의 비교를 보여주는 아미노산 정렬이다. 도 8b는 래트 알파 D11 항체의 공지된 인간화 버전 (Pavone et al, WO 06/131951)과 αD11의 신규한 인간화 변이체 (New Hu - SEQ ID NO:64-67) 간 중쇄 구조 영역 변형의 비교를 보여주는 아미노산 정렬이다.
도 9a는 도 8의 신규 인간화 알파 D11 항체의 경쇄 (SEQ ID NO:13) 및 중쇄 (SEQ ID NO:14) 가변 도메인 아미노산 서열을 보여준다 - CDRs은 밑줄 표시. 도 9b는 도 9a에 보여지는 경쇄 및 중쇄를 이용하여 설계된 완전한 중쇄 및 경쇄 (SEQ ID NO:24 및 25)를 보여준다. 도 9c는 도 9b의 서열로부터 제작된 항체와 Pavone과 그 동료들에 의하여 종래 기술된 바와 같이 CDR 그라프팅을 이용하여 설계된 항체를 비교한 ELISA 분석을 보여준다. 도 9d는 도 9c에서 사용된 알파 D11 모노클로날 항체의 두 가지 인간화 변이체들에 의한 TF-1 세포의 NGF 증식 억제를 보여준다.
도 10은 인간 MAb D2E7 (Salfield et al., US 특허 No. 6,090,382) 계열 견화 항-TNF 항체의 경쇄 (SEQ ID NO:15) 및 중쇄 (SEQ ID NO:16) 가변 도메인 아미노산 서열을 보여준다.
도 11은 견화 항-TNF 항체의 카파 경쇄 아미노산 서열 (SEQ ID NO:17)을 보여준다.
도 12는 견화 항-TNF 항체의 4 가지 서브타입 (중쇄 타입 A,B,C 및 D)의 중쇄 아미노산 서열을 보여준다.
도 13은 키메라 인간-견 항-TNF 항체의 완전한 경쇄 (SEQ ID NO:22) 및 중쇄 (SEQ ID NO:23) 아미노산 서열을 보여준다.
도 14a는 단백질 A를 이용하여 정제하고 SDS-PAGE로 분석된 공발현 견화 (Ca) 및 키메라 (Ch) 항-TNF 항체들의 결과를 보여주는 반면, 도 14b는 ELISA 결과를 나타내는데 발현된 재조합 단백질들의 견 TNF-알파에의 결합을 보여준다. 5 μg/ml에서 0.05 μg/ml까지 다양한 항체 희석을 이용한 결과를 보여준다.
도 15는 NF-kB-EGFP 리포터 컨스트럭트 pTRH1로 트랜스펙션된 293-HEK 세포를 이용한 견 TNF 생활성의 억제를 보여준다. 이들 세포는 형광으로 견 TNF에 반응한다. 견화 MAbs (도 15a) 및 키메라 MAbs (도 15b) 양자 모두 도 15c에 정량된 바와 같이 TNF-유도 형광을 똑같이 잘 억제하였다.
도 16은 CHO 세포에서 발현되고 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 정제된 항-TNF MAb 클론 148계 또 다른 견화 MAb와의 비교를 보여준다 (패널 A, 좌측 레인). 이 MAb를 도 14의 상기 견화 (Ca) 및 키메라 (Ch) D2E7계 MAbs와 비교하여 인간 TNF (패널 B) 및 견 TNF (패널 C)에의 결합에 대하여 시험하였다 (백그라운드 음성 대조 결합은 화살표로 나타내었다).
도 17은 견화 MAb 148의 중쇄 (SEQ ID NO:26 - ca148-HCB) 및 경쇄 (SEQ ID NO:27 - ca148-kLC)를 보여준다.
도 18은 본 발명의 방법에 의하여 제조된 항-견 NGF 모노클로날 항체가 개의 염증성 통증을 저감시킴을 보여준다.
실시예
실시예 1 - 쥐과 항체들의 개, 고양이, 말 및 인간 항체들로의 전환
공중이 이용가능한 발현 cDNA 서열 데이터베이스 및 간행물들로부터 얻어지는 인간, 고양이 개 및 말 기원의 면역 글로불린 감마 (IgG) 가변 도메인 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 단백질 서열을, BLOSUM 코스트 매트릭스 및 갭 개방 코스트 10 및 갭 연장 코스트 0.1을 이용한 프로그램 ClustalW를 이용하여 종에 따른 그룹으로 정렬하였다. 구조 영역 내 허위의 갭들을 회피하기 위하여 정렬로부터 낮은 상동성의 열악한 품질의 서열들을 삭제하였다. 카바트 명명법에 따라 구조 및 CDR 영역들을 식별하고 각 카바트 구조 영역 위치의 아미노산 잔기들을 경쇄 및 중쇄에 따라 식별 및 도표화하였다 (표 1-8). 카파 경쇄 모음으로부터 경쇄의 표를 제작하였지만, 본 특허에 개시되는 방법에 따라 하나의 종으로부터 다른 종으로 람다 경쇄를 전환하는 데 사용하기 위하여 람다 경쇄로부터 유사한 표를 제작할 수 있다.
경쇄 구조 위치 Q6, C23, W35, P44, Y83, C85 및 G98과, 중쇄 구조 위치 G8, C22, W36, R38, D86, Y90, C92 및 G106에서 4 가지 종들의 IgG 서열 간의 서열 보존은, 개시 데이터 세트에 있어서 단순 뉴클레오티드 서열 오류로 인한 아미노산 데이터 세트 풀에의 최소한의 오염이 있음을 시사한다. 표 1-8의 각 구조 영역에 존재하는 잔기들의 풀에 대한 조성은 각 종에 대한 이용가능한 데이터에 의하여 결정된다. 임의의 분석 종으로부터 유래하는 면역 글로불린에 대한 추가적인 아미노산 서열 결정은 상기 표의 임의의 위치에서의 조성 선택을 더욱 다양화할 수 있다. 이것은 특히 고양이 유래 가변 경쇄에 대하여 그러한데, 그에 대하여 오로지 하나의 예가 현재 문헌상 이용가능하고 그에 대하여 본 발명의 발명자는 표 1-8에 나타낸 대로 고양이 비장 조직 mRNA IgG 경쇄 서열의 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 증폭으로 새로운 세트를 생성하였다. 그럼에도 불구하고, 하기에 입증된 대로, 현재의 표들은 본 발명에 개시된 방법론들과 함께 사용되어 다수의 상이한 종으로의 투여에 적합한 항체를 생산할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 공여자 면역 글로불린의 경쇄 및/또는 중쇄의 구조 영역의 각 위치에 존재하는 아미노산 잔기들과 표적 종으로부터 유래하는 면역 글로불린의 풀에 존재하는 잔기를 비교하기 위하여 표 1 내지 8에 제공되는 정보를 이용한다. 상기 공여자 구조 영역의 특정 위치에 존재하는 아미노산 잔기가 상기 표적 종으로부터 유래하는 면역 글로불린의 풀 내 그 위치에 존재하는 아미노산이 아니면, 그 잔기를 그 위치에 해당하는 풀에 존재하는 아미노산으로 치환한다. 어떤 아미노산이 상기 공여자 서열의 치환되는 잔기를 대신해야할지 결정할 때, 상기 공여자 잔기를 가장 근접한 상동 잔기인 풀의 잔기로 치환하는 것이 양호하다. 즉, 상기 치환은 좋기로는 보존적 치환이다. 어떠한 상동 잔기가 이용가능하지 않다면, 표적 종의 공통의 풀 아미노산 (즉, 그 위치에서 가장 흔히 발견되는 아미노산)이 치환용으로 선택되는 것이 양호할 수 있다.
치환되는 아미노산이 보존된 아미노산으로 치환될 수 있을지를 결정하는데 있어서, 통상 (a) 그 치환 구역에서 폴리펩타이드 백본의 구조, 예컨대 시트 또는 헬릭스 형태, (b) 그 표적 위치에서 그 분자의 전하 또는 소수성, 및/또는 (c) 측쇄의 벌키함과 같은 인자들로 구성되는 평가가 있을 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
표적 풀에 존재하지 않는 공여자 아미노산이 보존적으로 치환될 수 있는지 여부를 고려할 때, 그들의 측쇄 특성에 있어 유사성에 따라 함께 그룹화된 아미노산들에 기초하여 상동 아미노산이 존재하는지를 평가하는 것이 바람직할 수 있다 (A. L. Lehninger, in Biochemistry, 2nd Ed., 73-75, Worth Publishers, New York (1975)). 예컨대, 하기 그룹들이 결정될 수 있다: (1) 비-극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M); (2) 비전하 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q); (3) 산성: Asp (D), Glu (E); 및 (4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His (H).
또는 아미노산 잔기들은 공통적인 측쇄 특성에 기초하여 그룹들로 나뉠 수 있다: (1) 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기들: Gly, Pro; 및 방향족성: Trp, Tyr, Phe.
보존적 치환은 이들 부류 중 한 가지의 원을 그 동일한 부류의 다른 원으로 교환 (치환)하는 것을 수반할 것이다.
예시용으로, 래트 항-마우스 NGF 모노클로날 항체 (αD11)으로부터 결정된 공여자 면역 글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 서열을 이들 표와 함께 정렬하고, PET화 개, 말 및 고양이 변이체들을 발현용으로 설계하고 제작하였다. 각 종에 대하여 선택된 구조 영역 잔기들을 도 1에 나타내었고, 공여자 래트 서열과의 차이점을 도 2에 보였다. 도 1 및 2로부터 알 수 있는 바와 같이, αD11의 개, 고양이 또는 말 버전을 만드는데 필요한 변화는 각 종마다 그 수 및 유형에 있어서 상이하다.
도 3, 4 및 5에 보여지는 바와 같이 각 종의 불변 도메인과의 C-말단 융합 및 CHO 세포로 트랜스펙션된 발현 벡터에서의 적절한 중쇄 및 경쇄 쌍의 공발현으로 αD11의 개, 고양이 및 말 버전의 가변 도메인을 전장 항체로서 발현시켰다 (가변 도메인 SEQ ID NO 1-6, 전장 항체 SEQ ID NO 7-12). 상기 발현된 중쇄 및 경쇄 쌍을 전체 IgG로서 함유하는 상층액을 SDS-PAGE로 분석하고 배양체 내에서 신경 성장 인자에 의한 TF-1 세포 증식을 억제하는 그들의 능력을 시험하였다. 중쇄 및 경쇄가 쿠마시 블루 염색된 SDS-PAGE 겔에서 관찰되었고 (도 6) 상기 상층액은 NGF에 의하여 유도되는 TF-1 세포들의 증식을 억제할 수 있었다 (도 7). 비교하면, αD11의 견화 변이체의 정제 시료는 αD11의 인간화 버전 (Pavone et al. WO 2006/131951)만큼 NGF 활성 억제에 효과적이었고 (도 5a) 이것은 본 발명의 PET화 기법이 Pavone et al.에 의하여 항체를 인간화하기 위하여 사용된 표준 CDR 그라프팅 방법과 비교하여 항체 구조 그 자체의 효능 감소를 가져오지 않는다는 것을 설명한다. αD11의 개, 고양이 및 말 버전에 대한 유사한 생활성이 도 7d에 더 기재되어 있다.
표 1 - 경쇄 가변 도메인 FR1 잔기들
Figure pat00001
표 2 - 경쇄 가변 도메인 FR2 잔기들
Figure pat00002
표 3 - 경쇄 가변 도메인 FR3 잔기들
Figure pat00003
Figure pat00004
표 4 - 경쇄 가변 도메인 FR4 잔기들
Figure pat00005
표 5 - 중쇄 가변 도메인 FR1 잔기들
Figure pat00006
Figure pat00007
표 6 - 중쇄 가변 도메인 FR2 잔기들
Figure pat00008
표 7 - 중쇄 가변 도메인 FR3 잔기들
Figure pat00009
Figure pat00010
표 8 - 중쇄 가변 도메인 FR4 잔기들
Figure pat00011
실시예 2 - 항-인간 NGF 탈면역화 항체의 제조
전술한 방법 및 표 1-8에 나타낸 인간 유래 구조 영역 위치 특이적 아미노산 잔기들의 풀을 이용하여 Pavone et al.의 항체들의 대안의 인간 아미노산 중쇄 및 경쇄 서열들을 갖는 인간 용도의 항체들 (이전에 "재인간화"로 언급)로 전환하기 위하여, 상기 PET화 기법을 사용할 수 있다.
결과물 VH 및 VL 서열들 (도 9a) 뿐 아니라 경쇄 (도 8a) 및 중쇄 (도 8b)의 재인간화 구조 서열에 대한 비교를 나타내었다. Pavone과 그 동료들의 표준 CDR 그라프팅 방법에서 이용되는 것보다 (43개 아미노산 변화) 본 발명에 개시된 방법을 이용하여 αD11 MAb를 인간화하는데 훨씬 적은 변화가 요구됨이 명백하다 (구조 영역에 3개 아미노산 변화).
재인간화 αD11 항체 (New-Hu αD11, 도 9a)의 가변 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 변이체들의 단백질 서열들은 각각 래트 αD11의 N-말단 신호 서열들과, IgG4 중쇄 및 인간 카파 경쇄로부터의 C-말단 인간 IgG 불변 도메인들을 이용하여 설계되었다 (도 9b). 이들을 인코딩하는 합성 유전자들을 올리고뉴클레오티드 기반 유전자 합성으로 제조하여 각각을 포유류 발현 벡터 pcDNA3.1+로 서브클로닝하였다. CHO 세포로의 공트랜스펙션 및 단백질 A 크로마토그래피를 이용한 세포 상층액 정제로 정제된 항체를 수득하였다. ELISA로 항체들을 NGF에 대한 결합에 관하여 시험하고 Pavone et al. (WO 06/131951, CDR 그라프팅으로 설계)에 의하여 개시된 αD11의 인간화 변이체의 결합과 비교하였다. 도 9c에 나타낸 ELISA로부터 볼 수 있는 바와 같이, 본원 특허의 New Hu αD11 변이체는 Pavone et al.에 개시된 것과 구별이 가능하지 않을 정도로 NGF에 결합한다. 도 9c에 개시된 항체들을 도 7c에 개시된 방법으로 NGF 억제에 대하여 시험하였다. 양자의 인간화 항체들 모두 동등한 생활성을 보였다.
실시예 3 - 견 TNF에 대한 결합 특이성을 갖는 견 항체들의 제조
추가적인 실시예로, 그 견 변이체를 만들기 위한 개시점으로서 종양 괴사 인자에 결합하는 인간 항체 D2E7를 이용, 본원 특허의 PET화 방법을 사용하였다.
하기 나타낸 바와 같이, 표 9-16은 인간 모노클로날 항체 항체 D2E7의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인들의 구조 영역과 견 면역 글로불린 구조 영역 서열의 각 위치에 대하여 정의되는 아미노산 잔기들 (표 1-8에 나타냄)의 풀과의 정렬을 보여준다. 이전에 그 카바트 서열 위치에서 외래인 것으로 여겨졌던 특정 잔기들 (표 9에서 *로 표시)이 지금은 개에게서 자연적인 것으로 여겨지므로, 따라서 *로 표시된 위치들에서 보이는 변화는 더 이상 만들어지지 않거나, 더 보존된 대안의 잔기들이 선택될 수 있다 (표 10에서 **로 표시). 이러한 추가적인 정보에 기초하여 Ser9, Ala13 및 Gly16 (표 9에서 *로 표시)을 포함하는 3개의 경쇄 위치들이 변화하지 않는다. 경쇄 His42가 그 위치에서 대안의 선택 잔기일 것이다 (표 10에서 **로 표시). 이들 위치에서 상기 견화 D2E7 구조 잔기들의 변형, 및 이러한 변형을 포함하는 항체들이 본 발명의 범위 내인 것으로 의도된다. 이러한 항체들은 SEQ ID NO:15의 이들 위치에서 나타나는 잔기들을 대신하여 9번 위치에 세린 잔기가 제공되고, 13번 위치에 알라닌 잔기가, 16번 위치에 글리신 잔기가 제공된다는 점을 제외하고는 SEQ ID NO:15에 나타나 있는 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 것이다. 필요에 따라 글루타민을 대신하여 SEQ ID NO:15의 42번 위치에 히스티딘이 제공될 수 있다. 이들 변화를 반영한 변형 서열을 SEQ ID NO:71로 제공한다. 본 발명은 SEQ ID NO:71을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체들 및 그들로부터의 항원 결합 단편에까지 이른다.
표 9 - 인간 유래 D2E7 모노클로날 항체의 견화 경쇄 FR1 서열
Figure pat00012
표 10 - 인간 유래 D2E7 모노클로날 항체의 견화 경쇄 FR2 서열
Figure pat00013
표 11 - 인간 유래 D2E7 모노클로날 항체의 견화 경쇄 FR3 서열
Figure pat00014
Figure pat00015
표 12 - 인간 유래 D2E7 모노클로날 항체의 견화 경쇄 FR4 서열
Figure pat00016
표 13 - 인간 유래 D2E7 모노클로날 항체의 견화 중쇄 FR1 서열
Figure pat00017
Figure pat00018
표 14 - 인간 유래 D2E7 모노클로날 항체의 견화 중쇄 FR2 서열
Figure pat00019
표 15 - 인간 유래 D2E7 모노클로날 항체의 견화 중쇄 FR3 서열
Figure pat00020
Figure pat00021
표 16 - 인간 유래 D2E7 모노클로날 항체의 견화 중쇄 FR4 서열
Figure pat00022
도 10, 11 및 12는 SEQ ID NO:15 내지 SEQ ID NO:21에서 D2E7의 견 PET화 Mab 변이체들을 인코딩하는 가변 도메인 (도 10) 및 전체 항체 (도 11 (경쇄) 및 도 12 (중쇄)) 서열들을 보여주고 있다. 상기 서열들은 상기와 같이 올리고뉴클레오티드 합성을 이용하여 DNAs로 제조되고 발현 벡터로 서브클로닝되고 CHO 세포로 트랜스펙션되었다. 특히, SEQ ID NO:17 (경쇄) 및 SEQ ID NO:18-21 (중쇄 이형 A,B,C 및 D)의 서열들은 올리고뉴클레오티드 합성을 이용하여 DNAs로 설계 및 제조되고 pcDNA3.1+ 발현 벡터로 서브클로닝되고 다양한 조합으로 CHO 세포로 트랜스펙션되었다.
SEQ ID NO:17 (경쇄) 및 SEQ ID NO:19 (중쇄, 이형 B)의 아미노산 서열을 갖는 견화 항-TNF 모노클로날 항체 및 SEQ ID NO:22의 아미노산를 포함하는 경쇄 및 SEQ ID NO:23의 중쇄를 갖는 키메라 항-TNF 모노클로날 항체를 인코딩하는 cDNAs (도 13)을 아미노-말단 분비 신호 서열들과 함께 (미표시) pcDNA3.1+ (Invitrogen/ Life technologies)로 서브클로닝하였다. CHO 세포를 견화 중쇄 및 경쇄 서열 (ca-HCB + ca-kLC) 또는 키메라 중쇄 및 경쇄 서열 (ch-HCB + ch-kLC) 중 하나의 조합으로 공트랜스펙션시켰다. 결과물 상층액을 단백질 A 상에서 정제, SDS-PAGE로 분석하고 (도 14a) ELISA로 표시된 항체 농도 (ug/ml)에서 견 TNF 알파에 대한 결합을 시험하여 (5 ug/ml에서 코팅; R&D systems) 항-견 폴리클로날 항체-홀스래디쉬 퍼옥시다아제 컨쥬게이트를 이용하여 검출하였다 (Sigma A9042) (도 14b). 음성 대조군은 항원만으로 코팅된 상에서 검출된 폴리클로날 항체였다.
인간 TNF에 대하여 형광으로 반응하는 TNF 감수성 NF-kB-EGFP 리포터 세포주를 생산하는 pTRH1 (Vince et al, Cell 131, 682, 2007)로 트랜스펙션시킨 293-HEK 세포들을 이용하여 정제된 항체들을 그들의 견 TNF 활성 억제능에 대하여 시험하였다. 견 TNF가 이들 세포들에서 GFP 발현을 활성화시킨다는 것이 최초로 입증되었고 (대략 1 ng/ml로 50% 최대 자극) 그 후 도 14에 보여진 견 항체들을 그들의 1 ng/mL 견 TNF를 억제하는 능력에 대하여 시험하였다.
도 15 (a-c)에 나타난 바, 이 시험에서 상기 견화 항체 및 키메라 항체 양자 모두는 견 TNF에 대한 강력한 억제자이다.
이들 결과들은 함께 본 발명의 견화 항체들과 인간-견 키메라 항체가 견 TNF에 결합하고 대등하다는 것을 ELISA 및 억제 시험 양자 모두를 통하여 보여주었고, 이는 견화 프로세스가 오리지날 D2E7 항체의 온전히 활성인 견 버전을 생산하였음을 입증하는 것이다.
도 16은 항-인간 TNF MAb 클론 148계 다른 견화 항체와 상기 견화 및 키메라 D2E7 모노클로날 항체들 (MAbs)의 비교를 나타내고 있다. 견화 항--huTNF MAb 148 (SEQ ID NO:26 및 SEQ ID NO:27, 도 17)를 CHO 세포에서 발현시키고 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다 (패널 A, 좌 레인). 도 14 및 15의 견화 (Ca) 및 키메라 (Ch) D2E7계 MAbs와 비교하여 인간 TNF에의 결합 (패널 B) 및 견 TNF에의 결합 (패널 C)에 대하여 상기 견화 148 MAb를 시험하였다 (백그라운드 음성 대조군 결합을 화살표로 나타내었다). 패널 B와 C로부터, 견화 MAb 148은 인간 TNF에 결합하지만 견 TNF에는 결합하지 않음을 알 수 있었다. 따라서, D2E7계 견화 및 키메라 MAbs 및 본 발명의 대상은 인간 TNF에의 결합과 동등한 견 TNF에의 예측치 못한 강한 결합을 보여주는 반면, 견화 MAb 148은 인간 TNF에만 결합을 보인다. 그러므로, 견화 D2E7계 MAbs은 견 TNF에 의하여 매개되는 개의 질병 치료에 놀랍도록 유용하다.
PET화 래트 항-NGF MAb αD11의 개, 말, 고양이 및 신규한 인간 버전과 인간 항-TNF MAb의 견 PET화 버전이 함께, 본원 특허에 기술되는 방법에 의한 가변 도메인 구조의 PET화 전환이 견고하고, 재현가능하며 다수의 MAbs의 다수 종 전환에 응용 가능하다는 것을 입증한다.
* 실시예 4 - 생체 내에서 염증성 통증을 감소시키는 항-견 NGF 모노클로날 항체의 효과
항체 요법:
SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:70을 발현하는 발현 벡터로부터 유래하는 항-견 NGF 모노클로날 항체 (견 HCA형 중쇄)를 CHO 세포에서 발현시키고 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피의 조합으로 정제하여 인산 완충액으로 완충액 교환하였다.
염증에 대한 개 모델:
모든 실험은 기관 윤리 위원회 (CRL, Ireland)의 사전 승인을 얻어 수행되었다. 대략 24 시간 후에 개시되고, 개를 일시적으로 절름발이가 되게 하는 자가-해소 염증을 생성하기 위하여 비글견의 한쪽 뒷다리 풋패드에 카올린을 주사하였다 (= -1 일). 이 모델에서, 카올린에 대한 초기의 염증 반응이 일단 약화되면, 대략 1~2 주의 시간에 걸쳐 개는 점차 덜 다리를 절게되고, 그 후 완전히 회복하게 된다.
3 마리 개로 이루어진 그룹들에 200 μg/kg체중으로 항-견 NGF 모노클로날 항체 또는 비히클 대조군으로서 인산 완충액 둘 중 하나를 정맥 내 주사하였다 (= 0 일). 육안 점수 방법으로, 7일에 걸쳐 개들의 다리 절음을 평가하였다 (점수 0, 절지 않음 (온전한 체중 지지); 점수 1, 약간 절음 (온전한 체중 지지는 아니나 잘 걸음); 점수 2, 중간 정도 절음 (약한 체중 지지 및 잘 걷지 못함), 점수 3, 심하게 절음 (체중 지지 못함)). 어떠한 개가 어떠한 주사를 맞았는지는 맹검 관찰되었다.
그 결과를 도 18에 나타내었다. 비히클 대조군과 비교하여, 주사 3일 후에 항-NGF 모노클로날 항체를 투여받은 개들에서 다리 절음 점수가 감소하였고, 이는 상기 항-NGF 모노클로날 항체가 비히클만으로 나타나는 효과에 비하여 개의 통증을 저감시키는 효과가 있음을 나타내는 것이다. 지연된 활성은 대량 30 시간의 느린 조직 분산기 (알파)를 보여주었던 항-견 NGF 모노클로날 항체의 혈장 약동학 및 비교적 좋지 않은 풋패드 부위의 혈관신생과 일치하는 것이다. 도 18에 나타낸 결과는 본 발명의 방법에 의하여 제조된 항-견 NGF 항체가 다리 절음에 있어서 결과적인 감소로 개의 염증성 통증을 감소시킨다는 것을 보여준다.
본 명세서에 언급된 모든 문헌은 참조로서 본 발명에 포함된다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 본 발명에 기재된 구현예들에 대한 다양한 변형 및 변경이 이 기술 분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 구체적인 양호한 구현예와 관련하여 본 발명을 설명하였지만, 청구된 바 본 발명이 그러한 구체적인 구현예들로 부당하게 한정되어서는 아니됨이 이해되어야 한다. 실제로, 이 기술 분야의 숙련자에게 자명한 본 발명에 기재된 모드 수행에 대한 다양한 변형은 본 발명에 의하여 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> NVIP Pty Ltd Gearing, David <120> Modified antibodies and method for the production of same <130> P120110.WO.01 <150> US 61/531439 <151> 2011-09-06 <160> 71 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable domain of a canine version of alpha D11 anti-NGF MAb - canine VK <400> 1 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Thr Asp Thr Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Phe His Tyr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys 100 105 <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable domain of a canine version of alpha D11 anti-NGF MAb - canine VH <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Asn Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Asn 20 25 30 Asn Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Leu Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Gly Val Trp Ala Gly Gly Ala Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Thr Val Phe Leu 65 70 75 80 Gln Met His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Ala Met Asp Ala Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable domain of a feline version of alpha D11 anti-NGF MAb - feline VK <400> 3 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Thr Asp Thr Leu His Thr 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D11 FR4 region of VK light chain <400> 40 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 1 5 10 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> caninised FR4 region of VK light chain of rat alpha D11 antibody <400> 41 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys 1 5 10 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> felinised FR4 region of VK light chain of rat alpha D11 antibody <400> 42 Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> equinised FR4 region of VK light chain of rat alpha D11 antibody <400> 43 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 1 5 10 <210> 44 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rat alpha D11 FR1 region of heavy chain <400> 44 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe 20 25 <210> 45 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> caninised FR1 region of heavy chain of rat alpha D11 antibody <400> 45 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Asn Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe 20 25 <210> 46 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> felinised FR1 region of heavy chain of rat alpha D11 antibody <400> 46 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe 20 25 <210> 47 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> equinised FR1 region of heavy chain of rat alpha D11 antibody <400> 47 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Asn Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe 20 25 <210> 48 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rat alpha D11 FR2 region of heavy chain <400> 48 Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 49 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> caninised FR2 region of heavy chain of rat alpha D11 antibody <400> 49 Trp Val Arg Gln Ala Leu Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val Gly 1 5 10 <210> 50 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> felinised FR2 region of heavy chain of rat alpha D11 antibody <400> 50 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 51 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> equinised FR2 region of heavy chain of rat alpha D11 antibody <400> 51 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 1 5 10 <210> 52 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rat alpha D11 FR3 region of heavy chain <400> 52 Arg Leu Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys 1 5 10 15 Met His Ser Leu Gln Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 53 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> caninised FR3 region of heavy chain of rat alpha D11 antibody <400> 53 Arg Leu Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Thr Val Phe Leu Gln 1 5 10 15 Met His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 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FR4 region of heavy chain of rat alpha D11 antibody <400> 58 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 59 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> equinised FR4 region of heavy chain of rat alpha D11 antibody <400> 59 Trp Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 60 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 region of light chain of a novel humanised variant of alpha D11 (new Hu) <400> 60 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Asn Cys 20 <210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 region of light chain of a novel humanised variant of alpha D11 (new Hu) <400> 61 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 62 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 region of light chain of a novel humanised variant of alpha D11 (new Hu) <400> 62 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Ser 1 5 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Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr 130 135 140 Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu His Ser Leu Ser Ser Met Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn Val Val 195 200 205 His Pro Ala Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Phe Asn Glu Cys 210 215 220 Arg Cys Thr Asp Thr Pro Pro Cys Pro Val Pro Glu Pro Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile 245 250 255 Thr Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His 275 280 285 Thr Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu Gln Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys 305 310 315 320 Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu 325 330 335 Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Arg Ala His Lys Pro Ser Val Tyr 340 345 350 Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Ser 355 360 365 Ile Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu 370 375 380 Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Arg Lys His Arg Met Thr 385 390 395 400 Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp Pro Phe Thr Cys Ala 420 425 430 Val Met His Glu Thr Leu Gln Asn His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser 435 440 445 His Ser Pro Gly Lys 450 <210> 69 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable domain of an alternative canine version of alpha D11 anti-NGF MAb - canine VH <400> 69 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Asn 20 25 30 Asn Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Gly Val Trp Ala Gly Gly Ala Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Phe Leu 65 70 75 80 Gln Met His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Ala Met Asp Ala Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 70 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> complete heavy chain of an alternative caninised version of alpha D11 anti-NGF MAb - VH and HCA <400> 70 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Asn 20 25 30 Asn Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Gly Val Trp Ala Gly Gly Ala Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Phe Leu 65 70 75 80 Gln Met His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Ala Met Asp Ala Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr 130 135 140 Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu His Ser Leu Ser Ser Met Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn Val Val 195 200 205 His Pro Ala Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Phe Asn Glu Cys 210 215 220 Arg Cys Thr Asp Thr Pro Pro Cys Pro Val Pro Glu Pro Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile 245 250 255 Thr Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His 275 280 285 Thr Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu Gln Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys 305 310 315 320 Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu 325 330 335 Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Arg Ala His Lys Pro Ser Val Tyr 340 345 350 Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Ser 355 360 365 Ile Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu 370 375 380 Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Arg Lys His Arg Met Thr 385 390 395 400 Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp Pro Phe Thr Cys Ala 420 425 430 Val Met His Glu Thr Leu Gln Asn His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser 435 440 445 His Ser Pro Gly Lys 450 <210> 71 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> updated light chain variable domain of a canine version of human D2E7 anti-TNF MAb - canine VK <400> 71 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Gln Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (22)

  1. 개의 신경 성장 인자 (NGF)에 특이적으로 결합할 수 있는 중화 항체 또는 그들의 항원 결합 단편으로서,
    상기 항체 또는 항원 결합 단편은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO:69의 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 중화 항체 또는 그들의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 경쇄는 SEQ ID NO:7의 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그들의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 중쇄는 SEQ ID NO:70의 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그들의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편과, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 캐리어를 포함하는 약학적 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산.
  6. 개의 신경 성장 인자 (NGF)에 특이적으로 결합할 수 있는 중화 항체의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 단리된 핵산으로서,
    상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:69의 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  7. 개의 신경 성장 인자 (NGF)에 특이적으로 결합할 수 있는 중화 항체의 중쇄 를 인코딩하는 단리된 핵산으로서,
    상기 중쇄는 SEQ ID NO:70의 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 조절 서열과 작동적으로 연결된 것인 단리된 핵산.
  9. 제5항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 기재된 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 하나 이상의 조절 서열을 더 포함하는 것인 발현 벡터.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 발현 벡터는 플라스미드 또는 레트로바이러스 벡터인 것인 발현 벡터.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 기재된 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  13. 견화 NGF 중화 항체 또는 그들의 항원 결합 단편을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 세포로 하여금 견화 항-NGF 중화 항체 또는 그들의 항원 결합 단편을 발현하도록 하기 위하여 제12항에 기재된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  14. 그를 필요로 하는 개에게서 통증을 치료, 경감 또는 억제하는 방법으로서, 상기 방법은,
    제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편,
    제4항에 기재된 약학적 조성물,
    제5항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 기재된 핵산 또는
    제9항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 기재된 발현 벡터
    의 치료적 유효량을 상기 개에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  15. 개의 통증을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한,
    제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편,
    제4항에 기재된 약학적 조성물,
    제5항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 기재된 핵산 또는
    제9항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 기재된 발현 벡터.
  16. 제15항에 있어서, 상기 통증은 급성 통증, 급성 통증, 만성 통증, 수술전후 통증, 수술 후 통증, 염증성 통증, 소양증 통증, 정형외과술로부터 야기되는 통증, 연조직 수술과 관련된 통증, 암 또는 암 유사 질환과 관련된 만성 통증 및 류마티스 관절염, 면역 매개 다발성 관절염이나 골관절염으로부터 야기되거나 그와 관련된 통증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 항체, 항원 결합 단편, 약학적 조성물, 핵산 또는 발현 벡터.
  17. 개의 관절염 치료에 사용하기 위한,
    제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편,
    제4항에 기재된 약학적 조성물,
    제5항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 기재된 핵산 또는
    제9항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 기재된 발현 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 상기 관절염은 골관절염, 면역 매개 다발성 관절염 및 류마티스 관절염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 항체, 항원 결합 단편, 약학적 조성물, 핵산 또는 발현 벡터.
  19. 개의 통증을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서,
    제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편,
    제4항에 기재된 약학적 조성물,
    제5항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 기재된 핵산 또는
    제9항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 기재된 발현 벡터
    의 용도.
  20. 개의 관절염을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서,
    제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편,
    제4항에 기재된 약학적 조성물,
    제5항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 기재된 핵산 또는
    제9항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 기재된 발현 벡터
    의 용도.
  21. 개의 관절염을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은
    제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편,
    제4항에 기재된 약학적 조성물,
    제5항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 기재된 핵산 또는
    제9항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 기재된 발현 벡터
    의 치료적 유효량을 개에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  22. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 기재된 항-견 NGF 중화 모노클로날 항체 또는 그들의 단편을 생성하는 세포주 또는 그들의 유도체 또는 자손 세포.
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