CN103797030B - 针对组织因子途径抑制物(tfpi)的单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

提供了结合人组织因子途径抑制物(TFPI)的特异性表位的分离的单克隆抗体和编码其的分离的核酸分子。还提供了包含抗TFPI单克隆抗体的药物组合物和通过施用该抗体治疗凝血缺乏或缺陷的方法。

Description

针对组织因子途径抑制物(TFPI)的单克隆抗体
Zhuozhi Wang, John Murphy, Tobias Marquardt, Dieter Moosmayer
序列表提交
与本申请有关的序列表经由EFS网以电子形式提交，并且在此通过引用完整地并入本说明书中。
发明领域
提供了结合人组织因子途径抑制物(TFPI)的分离的单克隆抗体及其片段。
发明背景
血液凝固(blood coagulation)是血液形成稳定的凝块以使出血停止的过程。该过程涉及血液中循环的许多酶原和辅因子原(或“凝固因子”)。那些酶原和辅因子原经由序贯或同时将它们转化成活化形式的数种途径而相互作用。最后，所述过程导致在存在因子Va、离子钙、和血小板的情况下由激活的因子X(FXa)将凝血酶原激活为凝血酶。激活的凝血酶继而诱导血小板聚集，而且将血纤蛋白原转化成血纤蛋白，其然后被激活的因子XIII(FXIIIa)交联以形成凝块。
可以通过两种独特的途径来实施导致因子X激活的过程：接触激活途径(以前称为内源性途径)和组织因子途径(以前称为外源性途径)。先前认为，凝固级联由连接至共同途径的同等重要的两种途径组成。现在知道用于启动血液凝固的主要途径是组织因子途径。
因子X可以被与激活的因子VII(FVIIa)联合的组织因子(TF)激活。FVIIa和其必需的辅因子TF的复合物是凝固(clotting)级联的有力引发剂(initiator)。
凝固的组织因子途径受组织因子途径抑制物(“TFPI”)的阴性控制。TFPI是FVIIa/TF复合物的一种天然的、FXa依赖性反馈抑制物。它是多价Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制物的成员。在生理学上，TFPI结合激活的因子X(FXa)以形成异二聚体复合物，其随后与FVIIa/TF复合物相互作用以抑制其活性，因此关闭凝固的组织因子途径。原则上，阻断TFPI活性可以恢复FXa和FVIIa/TF活性，因此延长组织因子途径作用的持续时间，而且放大FXa的生成，所述FXa是血友病A和B的共同缺陷。
实际上，一些初步实验证据已经指明，通过针对TFPI的抗体来阻断TFPI活性使延长的凝固时间正常化或者缩短出血时间。例如，Nordfang等人显示了血友病血浆的延长的稀释凝血酶原时间(dilute prothrombin time)在用针对TFPI的抗体处理血浆后正常化(Thromb. Haemost., 1991, 66(4): 464-467)。类似地，Erhardtsen等人显示了通过抗TFPI抗体显著缩短血友病A兔模型中的出血时间(Blood Coagulation and Fibrinolysis,1995, 6: 388-394)。这些研究提示了抗TFPI抗体对TFPI的抑制对于治疗血友病A或B可以是有用的。在这些研究中仅使用多克隆抗TFPI抗体。
使用杂交瘤技术，制备并鉴定针对重组人TFPI(rhTFPI)的单克隆抗体(参见Yang等人, Chin. Med. J., 1998, 111(8): 718-721)。测试了单克隆抗体对稀释凝血酶原时间(PT)和激活部分促凝血酶原激酶时间(APTT)的影响。实验显示了抗TFPI单克隆抗体缩短因子IX缺乏型血浆的稀释促凝血酶原激酶凝固时间。提示了组织因子途径不仅在生理学凝固而且在血友病出血中发挥重要作用(Yang等人, Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao, 1997,22(4): 297-300)。
因而，需要对TFPI特异性的抗体来治疗血液学疾病和癌症。
一般而言，已经使用遗传工程改造来生成鼠的、嵌合的、人源化的或完全人的抗体以生成用于人疾病的治疗性抗体。显示了鼠单克隆抗体作为治疗剂具有有限的用途，这是由于短的血清半衰期、不能触发人效应物功能、和人抗-小鼠-抗体的生成(Brekke和Sandlie, “Therapeutic Antibodies for Human Diseases at the Dawn of theTwenty-first Century,” Nature 2, 53, 52-62, Jan. 2003)。已经显示了嵌合抗体引起人抗嵌合抗体应答。人源化抗体进一步使抗体的小鼠组分最小化。然而，完全人抗体完全避免与鼠元件有关的免疫原性。因此，需要开发完全人抗体以避免与其他形式的遗传工程化单克隆抗体有关的免疫原性。特别是，长期预防性治疗诸如血友病治疗需要人源化或优选，完全人抗体。如果使用具有鼠组分或鼠来源的抗体，抗TFPI单克隆抗体具有形成对该治疗的免疫应答的高风险，这是由于需要的许多给药和治疗的持续时间长。例如，血友病A的抗体疗法可以每周需要给药，持续患者一生。这对免疫系统会是连续的挑战。因此，需要用于血友病和相关的遗传性和获得性凝血缺乏或缺陷的抗体疗法的完全人抗体。
已经经由由Koehler和Milstein在“Continuous Cultures of Fused CellsSecreting Antibody of Predefined Specificity,” Nature 256, 495-497 (1975)中所描述的杂交瘤技术来制备治疗性抗体。也可以在原核生物和真核生物中重组制备完全人抗体。治疗性抗体优选抗体在宿主细胞中的重组生成而不是杂交瘤生成。重组生成具有如下的优点，即较大的产物一致性、可能地较高的生产水平、和受控制的制备，其使动物衍生的蛋白质的存在最小化或消除动物衍生的蛋白质的存在。出于这些原因，想要具有重组生成的单克隆抗TFPI抗体。
另外，因为TFPI以高亲和力结合活化的因子X(FXa)，所以有效的抗TFPI抗体应当具有相当的亲和力。因此，期望具有具有可以与TFPI/FXa结合竞争的结合亲和力的抗TFPI抗体。
发明概述
提供了具有特异性结合到人组织因子途径抑制物(TFPI)的特异性表位的单克隆抗体。也提供了编码抗TFPI单克隆抗体的多核苷酸。还提供了包含抗TFPI单克隆抗体的药物组合物和治疗遗传性和获得性凝血缺乏或缺陷诸如血友病A和B的方法。
附图简述
图1描述通过大小排阻分析Fab A和TFPI Kunitz结构域2的复合物形成。
图2描述人组织因子途径抑制物和其抗体(Fab A)之间的相互作用的卡通图示。具有表示的可变轻(VL)和重(VH)结构域的Fab A表示为下面的结构。TFPI的Kunitz结构域2(KD2)表示为上面的结构。
图3描述在Fab A表面的关键表位残基Asp102 (D102)、Ile105 (I105)、Arg107(R107)、Cys106-Cys130二硫键和TFPI的结合。
图4描述TFPI - Fab A复合物和胰蛋白酶结合的Kunitz结构域2 (KD2)的叠加，并且显示TFPI与因子Xa和Fab A同时结合的排除。KD2和Fab A以卡通图示显示，胰蛋白酶显示为透明表面。还表示Fab A和胰蛋白酶的空间位阻。
图5描述通过大小排阻分析Fab B和TFPI Kunitz结构域1+2的复合物形成。
图6描述显示在第一角和相对于第一角旋转90度的另一角处人组织因子途径抑制物和其抗体(Fab B)之间的相互作用的两个卡通图示。具有表示的可变轻( VL )和重( VH )结构域的Fab B显示在图的下面部分(灰色阴影)。TFPI Kunitz结构域1 (KD1)以白色显示，并且TFPI Kunitz结构域2 (KD2)以黑色显示。
图7描述在Fab B表面的关键表位残基Asp31 (D31)、Asp32 (D32)、Pro34 (P34)、Lys36 (K36)、Glu60 (E60)、Cys35-Cys59二硫键和Kunitz结构域1 TFPI的结合。还显示，但未枚举，Kunitz结构域2的结合。
图8描述Kunitz结构域2的表位残基Glu100 (E100)、Glu101 (E101)、Pro103(P103)、Ile105 (I105)、Arg107 (R107)、Tyr109 (Y109)和Fab B的结合和相互作用的视野的两个角。Arg107与Kunitz结构域1的Gly33 (G33)和Cys35 (C35)相互作用。
图9描述TFPI - Fab B复合物和BPTI、因子VIIa和组织因子的复合物的叠加，并且显示TFPI与因子VIIa/组织因子和Fab B的同时结合的排除。Fab B与因子VIIa、和Fab B与组织因子的空间位阻通过箭头表示。
图10描述TFPI - Fab B复合物和胰蛋白酶结合的Kunitz结构域2的叠加，并且显示TFPI与因子Xa和Fab B同时结合的排除。表示Fab B与胰蛋白酶、和Fab B结合的Kunitz结构域1与胰蛋白酶的空间位阻。
图11描述(A) Fab A的轻链和重链(SEQ ID NOs:2和3)和Fab C的轻链和重链(SEQID NOs:6和7)的序列比对以及(B) TFPI - Fab A X-射线结构与Fab C的同源性模型的叠加。(A) 互补位残基为粗体文字并且突出表示。在Fab A和Fab C中不同的互补位残基hc_Asn32用星号标记。(B) Kunitz结构域2 (KD2)显示为黑色卡通。Fab结构显示为灰色带。互补位残基hc_Asn32显示为棒。
图12描述(A) Fab B的轻链和重链(SEQ ID NOs:4和5)和Fab D的轻链和重链(SEQID NOs:8和9)的序列比对以及(B) TFPI - Fab B X-射线结构与Fab D的同源性模型的叠加。 (A) 互补位残基为粗体文字并且突出表示。在Fab B和Fab D中不同的互补位残基用星号标记。(B) Kunitz结构域1 (KD1)和Kunitz结构域2 (KD2)分别显示为浅灰色和黑色卡通。Fab结构显示为灰色带。在Fab B和Fab D中不同的互补位残基显示为棒。
图13描述(A)阻断FXa结合至TFPI上的Fab C和Fab D的表面等离子体共振(Biacore)数据，以及(B) 阻断FVIIa/TF结合至TFPI上的Fab C和Fab D的表面等离子体共振(Biacore)数据。
发明详述
定义
如本文中所使用的，术语“组织因子途径抑制物”或“TFPI”指由细胞天然表达的人TFPI的任何变体、同种型和物种同系物。在本发明的一个优选的实施方案中，本发明的抗体对TFPI的结合减少血液凝固时间。
如本文中所使用的，“抗体”指整个抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。该术语包括天然存在的或由正常的免疫球蛋白基因片段重组过程形成的全长免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)，或免疫球蛋白分子中保留特异性结合活性的免疫学活性部分诸如抗体片段。不管结构，抗体片段与由全长抗体识别的相同抗原结合。例如，抗TFPI单克隆抗体片段结合TFPI的表位。抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。抗体的术语“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，即一种由VL、VH、CL和CH1结构域构成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，即一种包含由铰链区处的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由VH和CH1结构域构成；(iv)Fv片段，其由抗体的单条臂的VL和VH结构域构成，(v)dAb片段 (Ward等人, (1989) Nature 341:544-546)，其由VH结构域构成；(vi)分离的互补决定区(CDR)；(vii)微型抗体(minibody)、双抗体、三抗体、四抗体、和κ体(参见例如Ill等人, Protein Eng 1997;10:949-57)；(viii)骆驼IgG；和(ix)IgNAR。此外，虽然Fv片段的两个结构域，即VL和VH是由不同基因编码的，但是可以使用重组方法通过合成的接头来连接它们，所述合成的接头使它们能够作为单条蛋白质链生成，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人(1988) Science242:423-426; 和Huston等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。此类单链抗体也意图涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”内。使用对于本领域技术人员已知的常规技术来获得这些抗体片段，并以与完整的抗体相同的方式来对片段分析功效。
此外，考虑抗体模拟物中可以涵盖抗原结合片段。如本文中所使用的，术语“抗体模拟物”或“模拟物”意指展现出与抗体类似的结合，但是是更小的备选抗体或非抗体蛋白质的蛋白质。此类抗体模拟物可以包含在支架中。术语“支架”指用于以改编的功能和特征工程改造新产物的多肽平台。
术语“表位”是指抗体特异性结合或相互作用的抗原的范围或区域，在一些实施方案中，其表示抗原与抗体物理接触的地方。相反，术语“互补位”是指抗原特异性结合的抗体的范围或区域。如果相应抗体的结合是相互排斥的，即一种抗体的结合排斥另一种抗体的同时结合，则特征在于竞争结合的表位被称为重叠的。如果抗原能够同时容纳两个相应抗体的结合，则表位被称为是独立的(唯一的)。
如本文中所使用的，术语“竞争性抗体”是指结合与如本文所述的TFPI约、本质上或基本上相同，或甚至相同的表位的抗体。“竞争性抗体”包括具有重叠的表位特异性的抗体。因此，竞争性抗体能够有效地竞争如本文所述的抗体结合TFPI。优选地，竞争性抗体可以结合与本文所述的抗体相同的表位。从另外的观点，竞争性抗体具有与本文所述的抗体相同的表位特异性。
如本文中所使用的，术语“抑制结合”和“阻断结合”(例如，指抑制/阻断TFPI配体对TFPI的结合)可互换使用，并且涵盖部分和完全抑制或阻断两者。抑制和阻断还意图包括与不与抗TFPI抗体接触的TFPI相比在与抗TFPI抗体接触时TFPI对生理学底物的结合亲和力的任何可测量降低，例如阻断TFPI与因子Xa的相互作用或者阻断TFPI-因子Xa复合物与组织因子、因子VIIa或组织因子/因子VIIa的复合物的相互作用达至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物展示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。因而，术语“人单克隆抗体”指具有从人种系免疫球蛋白序列衍生的可变区和恒定区的展示单一结合特异性的抗体。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。
如本文中所使用的，“分离的抗体”意图指基本上没有具有不同抗原性特异性的其他抗体的抗体(例如结合TFPI的分离的抗体基本上没有结合与TFPI不同的抗原的抗体)。然而，结合人TFPI的表位、同种型或变体的分离的抗体可以具有与其他相关抗原(例如来自其他物种的(例如TFPI物种同系物))的交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上没有其他细胞材料和/或化学物。
如本文中所使用的，“特异性结合”指抗体对预定抗原的结合。典型地，抗体以至少约105M-1的亲和力结合，而且以比其结合与预定抗原或紧密相关抗原不同的无关抗原(例如BSA、酪蛋白)的亲和力高(例如大至少两倍)的亲和力结合预定抗原。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异性的抗体”在本文中与术语“特异性结合抗原的抗体”可互换使用。
如本文中所使用的，关于IgG抗体的术语“高亲和力”指至少约107M-1、在一些实施方案中至少约108M-1、在一些实施方案中至少约109M-1、1010M-1、1011M-1或更大，例如多达1013M-1或更大的结合亲和力。然而，对于其他抗体同种型，“高亲和力”结合可以有所变化。例如，IgM同种型的“高亲和力”结合指至少约1.0x107M-1的结合亲和力。如本文中所使用的，“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体种类(例如IgM或IgG1)。
“互补决定区”或“CDR”指抗体分子的重链可变区或轻链可变区内形成与结合的抗原的三维结构互补的N端抗原结合表面的三个高变区之一。从重链或轻链的N端出发，这些互补决定区分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。CDR参与抗原-抗体结合，而且CDR3包含对于抗原-抗体结合特异性的独特区域。因此，抗原结合位点可以包括6个CDR，其包含来自各个重链和轻链V区的CDR区。
如本文中所使用的，“保守取代”指涉及用一种或多种氨基酸取代具有相似生物化学特性的氨基酸且不导致多肽的生物学或生物化学功能损失的多肽修饰。“保守氨基酸取代”指用具有相似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基的取代。本领域中已经限定了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。涵盖的是，本发明的抗体可以具有保守的氨基酸取代，而且仍保留活性。
对于核酸和多肽，术语“实质同源性”指明在最佳比对和比较时两个核酸或两个多肽或其指定序列在至少约80%的核苷酸或氨基酸，通常至少约85%，优选地约90%、91%、92%、93%、94%、或95%，更优选地至少约96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、或99.5%的核苷酸或氨基酸中是相同的，具有适当的核苷酸或氨基酸插入或缺失。或者，当区段在选择性杂交条件下与该链的互补物杂交时存在核酸的实质同源性。本发明包括与本文中所列举的特定核酸序列和氨基酸序列具有实质同源性的核酸序列和多肽序列。
两个序列间的百分比同一性是序列共享的相同位置的数目的函数(即，%同源性=相同位置的数目/位置总数x 100)，其考虑缺口的数目和每个缺口的长度，它们需要被引入以进行两个序列的最佳比对。可以使用数学算法(诸如不限于VectorNTITM(InvitrogenCorp., Carlsbad, CA)的AlignXTM模块)来实现两个序列间的序列比较和百分比同一性测定。对于AlignXTM，多重比对的默认参数是：缺口开放罚分：10；缺口延伸罚分：0.05；缺口分开罚分范围：8；比对延迟的%同一性：40。(进一步的详情参见 。
可以使用CLUSTALW计算机程序(Thompson等人, Nucleic Acids Research,1994, 2(22): 4673-4680)来测定用于测定询问序列(本发明的序列)与主题序列之间的最好总体匹配的另一种方法(也称为总体序列比对)，所述CLUSTALW计算机程序基于Higgins等人(Computer Applications in the Biosciences (CABIOS), 1992, 8(2): 189-191)的算法。在序列比对中，询问和主题序列都是DNA序列。所述总体序列比对的结果按百分比同一性计。DNA序列的CLUSTALW比对中经由成对比对来计算百分比同一性所使用的优选参数是：矩阵=IUB，k-元组=1，顶部对角线的数目=5，缺口罚分=3，缺口开放罚分=10，缺口延伸罚分=0.1。对于多重比对，优选下列CLUSTALW参数：缺口开放罚分=10，缺口延伸参数=0.05；缺口分开罚分范围=8；比对延迟的%同一性=40。
核酸可以存在于全细胞中、细胞裂解物中，或者以部分纯化的或基本上纯的形式存在。核酸在纯化得离开与其在天然环境中正常相关的其他细胞成分时是“分离的”或“给予基本上纯的”。为了分离核酸，可以使用标准的技术诸如下列各项：碱/SDS处理、CsCl分带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域中公知的其他技术。
结合TFPI的特异性表位的单克隆抗体
本文提供了与如SEQ ID NO:1所示的人TFPI特异性结合的单克隆抗体。在一些实施方案中，抗TFPI单克隆抗体抑制TFPI配体与TFPI的结合。因此，在一些实施方案中，抗TFPI单克隆抗体可以抑制TFPI的活性。
提供了结合人组织因子途径抑制物(SEQ ID NO:1)的表位的分离的单克隆抗体，其中所述表位包含一个或多个Kunitz 结构域2的残基。在一些实施方案中，分离的单克隆抗体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中所示的轻链。在一些实施方案中，分离的单克隆抗体包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5中所示的重链。在一些实施方案中，分离的单克隆抗体包含SEQ ID NO:2中所示的轻链和SEQ ID NO:3中所示的重链。在一些实施方案中，分离的单克隆抗体包含SEQ ID NO:4中所示的轻链和SEQ ID NO:5中所示的重链。在一些实施方案中，还考虑，分离的单克隆抗体可以包含与提供的那些具有实质同源性的轻链或重链。例如，包含实质同源性的分离的单克隆抗体可以包含一个或多个保守取代。
在一些实施方案中，提供了结合人组织因子途径抑制物(SEQ ID NO:1)的表位的分离的单克隆抗体，其中所述表位包含选自以下的一个或多个残基：SEQ ID NO: l的 及其组合。
在一些实施方案中，表位包含SEQ ID NO:1的残基Glu100。在一些实施方案中，表位包含SEQ ID NO:1的残基Glu101。在一些实施方案中，表位包含SEQ ID NO:1的残基Asp102。在一些实施方案中，表位包含SEQ ID NO:1的残基Pro103。在一些实施方案中，表位包含SEQ ID NO:1的残基Gly104。在一些实施方案中，表位包含SEQ ID NO:1的残基Ile105。在一些实施方案中，表位包含SEQ ID NO:1的残基Cys106。在一些实施方案中，表位包含SEQID NO:1的残基Arg107。在一些实施方案中，表位包含SEQ ID NO:1的残基Gly108。在一些实施方案中，表位包含SEQ ID NO:1的残基Tyr109。在一些实施方案中，表位包含SEQ ID NO:1的残基Lys126。在一些实施方案中，表位包含SEQ ID NO:1的残基Gly128。在一些实施方案中，表位包含SEQ ID NO:1的残基Gly129。在一些实施方案中，表位包含SEQ ID NO:1的残基Cys130。在一些实施方案中，表位包含SEQ ID NO:1的残基Leu131。在一些实施方案中，表位包含SEQ ID NO:1的残基Gly132。在一些实施方案中，表位包含SEQ ID NO:1的残基Asn133。
在一些实施方案中，表位包含SEQ ID NO:1的残基Ile105和Asp102。在一些实施方案中，表位包含SEQ ID NO:1的残基Ile105和Leu131。在一些实施方案中，表位包含SEQ IDNO:1的残基Ile105、Asp102和Leu131。在一些实施方案中，表位进一步包含SEQ ID NO:1的残基 。
在一些实施方案中，提供了结合人组织因子途径抑制物(SEQ ID NO:1)的表位的分离的单克隆抗体，其中所述表位包含通过在SEQ ID NO:1的残基Cys 106和Cys130之间的二硫键连接的两个氨基酸环。在一些实施方案中，表位进一步包含一个或多个选自以下的残基：SEQ ID NO:1的 。
在一些实施方案中，表位包含SEQ ID NO:1的残基Ile105。在其他实施方案中，表位包含SEQ ID NO:1的残基Asp102。在其他实施方案中，表位包含SEQ ID NO:1的残基Leu131。并且在一些实施方案中，表位进一步包含一个或多个选自以下的残基：SEQ ID NO:l的 。
也提供了结合人组织因子途径抑制物(SEQ ID NO:1)的表位的分离的单克隆抗体，其中所述表位包含一个或多个Kunitz结构域1的残基和一个或多个Kunitz结构域2的残基。在一些实施方案中，分离的单克隆抗体包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8中所示的轻链。在一些实施方案中，分离的单克隆抗体包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9中所示的重链。在一些实施方案中，分离的单克隆抗体包含SEQ ID NO:6中所示的轻链和SEQ ID NO:7中所示的重链。在一些实施方案中，分离的单克隆抗体包含SEQ ID NO:8中所示的轻链和SEQ IDNO:9中所示的重链。在一些实施方案中，还考虑，分离的单克隆抗体可以包含与提供的那些具有实质同源性的轻链或重链。例如，包含实质同源性的分离的单克隆抗体可以包含一个或多个保守取代。
在一些实施方案中，Kunitz结构域1的残基包含一个或多个选自以下的残基：SEQID NO: 1的及其组合。在一些实施方案中，Kunitz结构域1的残基包含SEQ ID NO:1的残基Asp31。在一些实施方案中，Kunitz结构域1的残基包含SEQ ID NO:1的残基 Asp32。在一些实施方案中，Kunitz结构域1的残基包含SEQ ID NO:1的残基Gly33。在一些实施方案中，Kunitz结构域1的残基包含SEQID NO:1的残基Pro34。在一些实施方案中，Kunitz结构域1的残基包含SEQ ID NO:1的残基Cys35。在一些实施方案中，Kunitz结构域1的残基包含SEQ ID NO:1的残基Lys36。在一些实施方案中，Kunitz结构域1的残基包含SEQ ID NO:1的残基Cys59。在一些实施方案中，Kunitz结构域1的残基包含SEQ ID NO:1的残基Glu60。在一些实施方案中，Kunitz结构域1的残基包含SEQ ID NO:1的残基Asn62。
在一些实施方案中，Kunitz结构域1的残基包含SEQ ID NO:1的残基Pro34和Glu60。在一些实施方案中，Kunitz结构域1的残基包含SEQ ID NO:1的残基Pro34和Lys36。在一些实施方案中，Kunitz结构域1的残基包含SEQ ID NO:1的残基Pro34、Lys36和Glu60。
在一些实施方案中，Kunitz结构域2的残基包含一个或多个选自以下的残基：SEQID NO: 1的 及其组合。在一些实施方案中，Kunitz结构域2的残基包含SEQ ID NO:1的残基Glu100。在一些实施方案中，Kunitz结构域2的残基包含SEQID NO:1的残基Glu101。在一些实施方案中，Kunitz结构域2的残基包含SEQ ID NO:1的残基Pro103。在一些实施方案中，Kunitz结构域2的残基包含SEQ ID NO:1的残基Gly104。在一些实施方案中，Kunitz结构域2的残基包含SEQ ID NO:1的残基Ile105。在一些实施方案中，Kunitz结构域2的残基包含SEQ ID NO:1的残基Cys106。在一些实施方案中，Kunitz结构域2的残基包含SEQ ID NO:1的残基Arg107。在一些实施方案中，Kunitz结构域2的残基包含SEQID NO:1的残基Gly108。在一些实施方案中，Kunitz结构域2的残基包含SEQ ID NO:1的残基Tyr109。在一些实施方案中，Kunitz结构域2的残基包含SEQ ID NO:1的残基Phe114。在一些实施方案中，Kunitz结构域2的残基包含SEQ ID NO:1的残基 Asn116。在一些实施方案中，Kunitz结构域2的残基包含SEQ ID NO:1的残基Glu123。在一些实施方案中，Kunitz结构域2的残基包含SEQ ID NO:1的残基Arg124。在一些实施方案中，Kunitz结构域2的残基包含SEQID NO:1的残基Lys126。在一些实施方案中，Kunitz结构域2的残基包含SEQ ID NO:1的残基Tyr127。
在一些实施方案中，Kunitz结构域2的残基包含SEQ ID NO:1的残基Arg107和Glu101。在一些实施方案中，Kunitz结构域2的残基包含SEQ ID NO:1的残基Arg107和Tyr109。在一些实施方案中，Kunitz结构域2的残基包含SEQ ID NO:1的残基Arg107、Glu101和Tyr109。在一些实施方案中，Kunitz结构域2的残基包含SEQ ID NO:1的残基Gly128。
在一些实施方案中，Kunitz结构域2的残基可以额外地包含一个或多个选自以下的残基：SEQ ID NO: 1的及其组合。
在一些实施方案中，分离的单克隆抗体包含Kunitz结构域1的残基和Kunitz结构域2的残基，所述Kunitz结构域1的残基包含一个或多个选自以下的残基： ；所述Kunitz结构域2的残基包含一个或多个选自以下的残基： 。
也提供了结合人组织因子途径抑制物(SEQ ID NO:1)的表位的分离的单克隆抗体，其中所述表位包含通过在SEQ ID NO:1的残基Cys35和Cys59之间的二硫键连接的两个氨基酸环。在一些实施方案中，表位进一步包含一个或多个Kunitz结构域1的残基和一个或多个Kunitz结构域2的残基。在一些实施方案中，Kunitz结构域1的残基包含一个或多个选自以下的残基：SEQ ID NO: l的 。在一些实施方案中，Kunitz结构域2的残基包含一个或多个选自以下的残基：SEQ ID NO: l的 。
还提供了可以竞争本文所述的任何抗体结合TFPI的抗体。例如，与本文所述的抗体结合相同表位的抗体将能够有效地竞争结合TFPI。在一些实施方案中，提供了结合TFPI的分离的单克隆抗体，其中所述分离的单克隆抗体与本文所述的任何分离的单克隆抗体是竞争的。在一些实施方案中，所述抗体与具有如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示的轻链的抗体是竞争的。在一些实施方案中，所述抗体与具有如SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7 或SEQ ID NO:9所示的重链的抗体是竞争的。在一些实施方案中，所述抗体与具有如SEQ ID NO:2所示的轻链和如SEQ ID NO:3所示的重链的抗体是竞争的。在一些实施方案中，所述抗体与具有如SEQ ID NO:4所示的轻链和如SEQ ID NO:5所示的重链的抗体是竞争的。在一些实施方案中，所述抗体与具有如SEQ ID NO:6所示的轻链和如SEQ ID NO:7所示的重链的抗体是竞争的。在一些实施方案中，所述抗体与具有如SEQ ID NO:8所示的轻链和如SEQ ID NO:9所示的重链的抗体是竞争的。
还提供了可以竞争本文所述的任何抗体结合TFPI的双特异性抗体。例如，此类双特异性抗体可以结合如上所述的一个或多个表位。
抗体可以是物种特异性的或者可以与多种物种交叉反应。在一些实施方案中，抗体可以与人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猴、猪、犬、猫或其他哺乳动物物种的TFPI特异性反应或交叉反应。
抗体可以是各类抗体中任一种的，诸如但不限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌性IgA、IgD和IgE抗体。
核酸、载体和宿主细胞
尽管提供了单克隆抗体的氨基酸序列，但是考虑可以设计核酸序列以编码任何这些单克隆抗体。此类多核苷酸可以编码抗TFPI抗体的轻链或重链。在一些实施方案中，此类多核苷酸可以编码通过可降解的键分开的抗TFPI抗体的轻链和重链两者。进一步，上述抗体可以使用包含编码任何所述单克隆抗体的分离核酸分子的表达载体和包含此类载体的宿主细胞来产生。
制备针对TFPI的抗体的方法
可以通过在宿主细胞中表达编码依照本发明的实施方案的单克隆抗体的可变区的核苷酸序列来重组生成单克隆抗体。借助于表达载体，可以将含有所述核苷酸序列的核酸在适合于生成的宿主细胞中转染并表达。因而，还提供了用于生成与人TFPI结合的单克隆抗体的方法，包括：
(a)将编码本发明的单克隆抗体的核酸分子转染入宿主细胞中，
(b)培养所述宿主细胞以便在宿主细胞中表达所述单克隆抗体，和任选地
(c)分离并纯化所生成的单克隆抗体，其中所述核酸分子包含编码本发明的单克隆抗体的核苷酸序列。
在一个实例中，为了表达抗体或其抗体片段，将通过标准的分子生物学技术获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入表达载体中以使基因与转录和翻译控制序列可操作连接。在此背景中，术语“可操作连接”意图指将抗体基因连接入载体中以使载体内的转录和翻译控制序列行使其预期的调节抗体基因转录和翻译的功能。表达载体和表达控制序列选择为与所使用的表达宿主细胞相容。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入分开的载体中，或者更典型地，将这两种基因都插入同一表达载体中。通过标准的方法来将抗体基因插入表达载体中(例如，连接抗体基因片段和载体上的互补的限制性位点，或者如果没有限制性位点存在，则为平端连接)。可以使用本文中所描述的抗体的轻链和重链可变区来创建任何抗体同种型的全长抗体基因，其通过将它们插入已经编码想要的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中以使VH区段与载体内的CH区段可操作连接并使VL区段与载体内的CL区段可操作连接来实现。另外/或者，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆入载体中以使信号肽以符合读码框方式与抗体链基因的氨基末端连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。
除了抗体链编码基因以外，本发明的重组表达载体还携带调节序列，其在宿主细胞中控制抗体链基因的表达。术语“调节序列”意图包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如多聚腺苷酸化信号)，其控制抗体链基因的转录或翻译。此类调节序列记载于例如 。本领域技术人员将理解的是，表达载体的设计(包括调节序列的选择)可以取决于诸如要转化的宿主细胞的选择、想要的蛋白质表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的调节序列的实例包括指导哺乳动物细胞中高水平的蛋白质表达的病毒元件，诸如源自巨细胞病毒(CMV)、猿病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤的启动子和/增强子。或者，可以使用非病毒调节序列，诸如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。
除了抗体链基因和调节序列以外，重组表达载体可以携带额外的序列，诸如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)和选择标志基因。选择标志基因促进已经导入载体的宿主细胞的选择(参见例如均为Axel等人的美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，典型地，选择标志基因对已经导入载体的宿主细胞赋予对药物诸如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。选择标志基因的实例包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于通过甲氨蝶呤选择/扩增在dhfr-宿主细胞中使用)和neo基因(用于G418选择)。
对于轻链和重链的表达，通过标准的技术将编码重链和轻链的表达载体转染入宿主细胞中。术语“转染”的各种形式意图涵盖极其多种通常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞中的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。虽然理论上有可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是抗体在真核细胞，且最优选地哺乳动物宿主细胞中的表达是最优选的，这是因为此类真核细胞，且特别地哺乳动物细胞比原核细胞更有可能装配并分泌正确折叠且有免疫学活性的抗体。
用于表达重组抗体的哺乳动物宿主细胞的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括与DHFR选择标志(例如如记载于R. J. Kaufman和P. A. Sharp (1982) Mol. Biol.159:601-621的)一起使用的dhfr-CHO细胞，其记载于Urlaub和Chasin,(1980) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞、HKB11细胞和SP2细胞。在将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过培养宿主细胞达足以容许抗体在宿主细胞中表达或将抗体分泌入培养宿主细胞的培养基中的一段时间来生成抗体。可以使用标准的蛋白质纯化方法诸如超滤、大小排阻层析、离子交换层析和离心来从培养基回收抗体。
部分抗体序列表达完整抗体的用途
抗体主要经由位于6个重链和轻链CDR的氨基酸残基与靶抗原相互作用。出于此原因，CDR内的氨基酸序列比CDR外部的序列在各抗体间更加多种多样。因为CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，所以有可能表达模拟特定天然存在抗体的特性的重组抗体，其通过构建包含嫁接到来自具有不同特性的不同抗体的框架序列的来自特定天然存在抗体的CDR序列的表达载体来实现(参见例如 。此类框架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库获得。这些种系序列会与成熟的抗体基因序列不同，因为它们不会包括完全装配的可变基因，其在B细胞成熟过程中通过V(D)J连接而形成。获得特定抗体的整个DNA序列以再创建具有与初始抗体的那些结合特性相似的结合特性的完整重组抗体是不必要的(参见WO 99/45962)。跨越CDR 区的部分重链和轻链序列对于此目的通常是足够的。使用部分序列来确定哪些种系可变和连接基因区段促成重组的抗体可变基因。然后，使用种系序列来填充可变区的缺少部分。重链和轻链前导序列在蛋白质成熟过程中被切割，而且不促成最终抗体的特性。出于此原因，对表达构建体使用相应的种系前导序列是必要的。为了添加缺少的序列，可以通过连接或PCR扩增来组合克隆的cDNA序列与合成的寡核苷酸。或者，整个可变区可以合成为一套短的、重叠的寡核苷酸，并通过PCR扩增来组合以创建完全合成的可变区克隆。此方法具有某些优点，诸如消除或包含特定的限制性位点，或优化特定的密码子。
使用重链和轻链转录物的核苷酸序列来设计重叠的一组合成的寡核苷酸，以创建与天然序列具有相同的氨基酸编码能力的合成的V序列。合成的重链和轻链序列可以在三个方面与天然序列不同：中断重复核苷酸碱基串以便于寡核苷酸合成和PCR扩增；依照Kozak的规则(Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870)来掺入最佳的翻译起始位点；和在翻译起始位点上游工程改造限制的核酸内切酶位点。
对于重链和轻链可变区两者，近似地在相应的非编码寡核苷酸的中点将经优化的编码和相应的非编码链序列分解为30-50个核苷酸的部分。因此，对于每条链，可以将寡核苷酸装配成跨越150-400个核苷酸的区段的重叠双链组。然后，使用合并物作为模板来生成150-400个核苷酸的PCR扩增产物。典型地，将单一可变区寡核苷酸组分解为两个合并物，对它们进行分开扩增以生成两种重叠的PCR产物。然后，通过PCR扩增来组合这些重叠的产物以形成完整的可变区。可能还想要包括PCR扩增中的重链或轻链恒定区的重叠片段以生成可以容易地克隆入表达载体构建体中的片段。
然后，将再构建的重链和轻链可变区与克隆的启动子、翻译启动、恒定区、3’非翻译的、多聚腺苷酸化、和转录终止序列组合以形成表达载体构建体。可以将重链和轻链表达构建体组合入单一载体中，共转染、连续转染、或分开转染入宿主细胞中，然后将所述宿主细胞融合以形成表达这两条链的宿主细胞。
因此，在另一个方面，使用人抗TFPI抗体的结构特征来创建保留结合TFPI的功能的结构相关人抗TFPI抗体。更具体地，可以将本发明的单克隆抗体的明确鉴定的重链和轻链区的一个或多个CDR与已知的人框架区和CDR 重组组合以创建本发明的额外的、经重组工程改造的人抗TFPI抗体。
药物组合物
还提供了药物组合物，其包含治疗有效量的抗TFPI单克隆抗体和药学可接受的载体。“药学可接受的载体”是可以添加至活性成分以帮助配制或稳定制剂而不对患者引起显著不利的毒物学效果的物质。此类载体的实例是本领域技术人员公知的，包括水、糖诸如麦芽糖或蔗糖、白蛋白、盐诸如氯化钠等。其他载体记载于例如E.W.Martin的Remington’sPharmaceutical Sciences。此类组合物将含有治疗有效量的至少一种抗TFPI单克隆抗体。在一些实施方案中，此类组合物可以包含治疗有效量的一种或多种抗TFPI单克隆抗体。在一些实施方案中，药物组合物可以包含如上所述的特异性结合Kunitz结构域1的抗体和如上所述的特异性结合Kunitz结构域1和2的抗体。
药学可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉剂。对药学活性物质使用此类介质和药剂是本领域中已知的。优选地，组合物配制用于胃肠外注射。组合物可以配制为溶液、微乳、脂质体、或其他适合于高药物浓度的有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、及液态聚乙二醇等)、及其合适的混合物。在一些情况下，它在组合物中包括等张剂，例如糖、多元醇诸如甘露醇、山梨醇、或氯化钠。
可以如下制备无菌可注射溶液，即根据需要在具有上文所列举的一种成分或成分组合的合适溶剂中掺入需要量的活性化合物，接着微过滤灭菌。一般而言，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有基础分散介质及来自那些上文所列举的成分的其他所需成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，一些制备方法是从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何其他想要成分的粉末的真空干燥和冷冻干燥(冻干)。
药学用途
可以为治疗目的使用单克隆抗体来治疗遗传性和获得性凝血缺乏或缺陷。例如，可以使用上文所描述的实施方案中的单克隆抗体来阻断TFPI与FXa的相互作用，或者以阻止对TF/FVIIa活性的TFPI依赖性抑制。另外，还可以使用单克隆抗体来恢复TF/FVIIa驱动的FXa生成以回避FVIII或FIX依赖性FXa扩增的不足。
单克隆抗体在止血病症诸如血小板减少(thrombocytopenia)、血小板病症和出血病症(例如血友病A、血友病B和血友病C)的治疗中具有治疗用途。可以通过对有需要的患者施用治疗有效量的抗TFPI单克隆抗体来治疗此类病症。单克隆抗体在治疗适应症诸如外伤和出血性中风(hemorrhagic stroke)等中不受控制的出血中也具有治疗用途。因此，还提供了用于缩短出血时间的方法，包括对有需要的患者施用治疗有效量的本发明的抗TFPI单克隆抗体。
抗体可以作为单一疗法或者与其他疗法联合使用以解决止血病症。例如，认为本发明的一种或多种抗体与凝固因子诸如因子VIIa、因子VIII或因子IX的共施用对于治疗血友病是有用的。在一个实施方案中，提供了用于治疗遗传性和获得性凝血缺乏或缺陷的方法，包括施用(a)第一量的结合人组织因子途径抑制物的单克隆抗体和(b)第二量的因子VIII或因子IX，其中所述第一和第二量在一起对于治疗所述缺乏或缺陷是有效的。在另一个实施方案中，提供了用于治疗遗传性和获得性凝血缺乏或缺陷的方法，包括施用(a)第一量的结合人组织因子途径抑制物的单克隆抗体和(b)第二量的因子VIII或因子IX，其中所述第一和第二量在一起对于治疗所述缺乏或缺陷是有效的，且进一步其中因子VII不是共施用的。本发明还包括药物组合物，其包含治疗有效量的本发明的单克隆抗体和因子VIII或因子IX的组合，其中所述组合物不含因子VII。“因子VII”包括因子VII和因子VIIa。这些联合疗法有可能降低凝固因子的必要输注频率。共施用或联合疗法意指各自分开配制或在一种组合物中共同配制且当分开配制时在近似相同时间或在不同时间，但在相同治疗期里施用的两种治疗药物的施用。
可以以如下剂量和频率对患有血友病A或B的受试者胃肠外施用药物组合物，所述剂量和频率可以随出血事件的严重程度而变化，或者在预防疗法的情况下，可以随患者的凝固缺乏的严重程度而变化。
可以以推注或者通过连续输注来对有需要的患者施用组合物。例如，作为Fab片段存在的发明性抗体的推注施用可以在0.0025至100mg/kg体重、0.025至0.25mg/kg、0.010至0.10mg/kg或0.10-0.50mg/kg的量中。对于连续输注，可以以0.001至100mg/kg体重/分钟、0.0125至1.25mg/kg/分钟、0.010至0.75mg/kg/分钟、0.010至1.0mg/kg/分钟或0.10-0.50mg/kg/分钟施用作为Fab片段存在的发明性抗体，持续一段1-24小时、1-12小时、2-12小时、6-12小时、2-8小时、或1-2小时的时间。对于施用作为全长抗体(具有完整的恒定 区)存在的发明性抗体，剂量量可以是约1-10mg/kg体重、2-8mg/kg、或5-6mg/kg。此类全长抗体通常会通过延续一段30分钟至3小时的时间的输注来施用。施用频率将取决于状况的严重程度。频率范围可以为每周三次至每两周或每三周一次。
另外，可以经由皮下注射来对患者施用组合物。例如，可以经由皮下注射每周、每两周或每月对患者施用10至100mg抗TFPI抗体的剂量。
如本文中所使用的，“治疗有效量”指有效增加体内的凝固时间或者在其他情况下对有需要的患者引起可测量的体内益处所需要的抗TFPI单克隆抗体或此类抗体与因子VIII或因子IX的组合的量。精确量将取决于许多因素，包括但不限于治疗组合物的成分和物理特征、预期的患者群体、个体患者考虑等，而且本领域技术人员可以容易地确定。
实施例
实施例1. 从大肠杆菌表达重组TFPI(Kunitz结构域2)并纯化.
表达系统
采用命名为pD Eco5 N的目标载体(根据Gateway命名法)。pD Eco5 N基于pET-16b (Novagen)，并且额外编码His10和NusA标签以及用于表达融合蛋白的Gateway克隆盒，所述融合蛋白由His10/NusA和目标蛋白组成。
将编码融合至Kunitz结构域2的N-末端(Lys93至Phe154，参考Uniprot 10646)的凝血酶切割位点和Gateway结合位点(attBl-5#, attB2-3#, Invitrogen)的TFPI构建体克隆到pD Eco5 N载体中，导致产生命名为pD Eco5 N TFPI KD2的表达载体。采用BL21 DE3(Novagen)表达菌株。
使用pD Eco5 N TFPI KD2表达的融合蛋白的氨基酸序列, 600 AA
序列组分
表达
用pD Eco5 N #209转化的BL21 DE3菌株作为具有200 μg/mL氨苄青霉素的2x 50mL LB培养基中的预培养物在37℃下生长14 h，搅动速率为180 rpm。接下来，具有400 mLCirclegrow培养基(Q-Biogene)的8个摇瓶各接种8 mL预培养物并在37℃孵育，搅动速率为180 rpm。在OD600的培养密度，添加IPTG(100 mM终浓度)用于诱导基因，并进一步在17℃下以180 rpm培养24 h。大肠杆菌通过离心(3000 g, 10 min)沉淀，储存在-80℃。
纯化
将从3.2 L培养物沉淀的大肠杆菌质量重新悬浮于200 mL裂解缓冲液(50 mMTris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 10% (w/w) 甘油, 40 mM咪唑, 蛋白酶抑制剂混合物，完全无EDTA (Roche))，在高压设备(Microfluidics)中均质化，并且随后离心裂解物(100.000 g, 60 min, 4 ℃)。使用Äkta Explorer系统进行几个纯化步骤。在初始IMAC层析步骤中将浓缩样品上样至Hi- Trap-琼脂糖HP基质(GE)的两个连接的5 mL单元。使用缓冲液A (50 mM Tris HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 40 mM咪唑)平衡、融合蛋白结合和洗涤Hi- Trap-琼脂糖HP基质。对于NusA-TFPI融合蛋白的洗脱，使用在缓冲液B (50 mM TrisHCl pH 8.0, 150 mM NaCl)中40至500 mM的咪唑线性梯度。将洗脱级分合并并浓缩(使用Amicon超滤装置浓缩6-7倍) 并且缓冲液交换至Tris HCl pH 8.0。使用Tris HCl pH 8.0中Sephacryl-100 (XK26/74)将浓缩样品(6-7 mL)进一步应用于大小排阻层析。将含有融合蛋白的主峰级分合并，通过超滤(Amicon)浓缩至5 mL体积。将凝血酶(HTI)添加至样品(酶：融合蛋白比例，1:50 w/w)，在21℃下孵育5 h，并且通过PMSF (1 mM终浓度)最终终止反应。随后，进行第二次大小排阻层析步骤(Tris HCl pH 8.0中的Sephacryl-100 (XK26/74))，并且通过PAGE监测峰级分。将含有游离单体TFPI Kunitz结构域2的级分收集并浓缩(Amicon)，从3.2 L大肠杆菌培养物产生约4 mg产物。
实施例2. 产生针对TFPI的重组单克隆抗体Fab A、在大肠杆菌中表达并纯化
表达
Fab A使用表达载体pET28a和大肠杆菌菌株BL21 Star DE3进行共表达。将在表达载体上编码的轻链和重链区域分别在其N -末端融合到周质信号序列。重链区域还在其C-末端编码His6标签用于纯化Fab。在TB-Instant表达培养基中过夜生长的转化的大肠杆菌菌株用于自身诱导重组蛋白表达(#71491, Novagen)。简而言之，将10 mL转化的大肠杆菌培养物(在50 mL Falcon管中)作为具有30 μg/mL卡那霉素的LB培养基中的预培养物在37℃下生长14 h，搅动速率为180 rpm。随后，具有500 mL TB-Instant过夜表达培养基的4个Erlenmeyer烧瓶各接种2 mL预培养物，在30℃下以180 rpm孵育24 h。将培养物在10℃下以10,000 g离心30 min，并且含有Fab的上清液立即用于进一步产物纯化或储存于-20℃或-80℃。
或者，Fab使用表达载体pET28a和大肠杆菌菌株BL21 Star DE3在10 L生物反应器(Sartorius)中进行共表达。将500 mL转化的大肠杆菌培养物在具有30 μg/mL卡那霉素的LB培养基中在37℃下生长17 h，以165 rpm搅动，之后用于用10 L自身诱导培养基接种搅拌的生物反应器。自身诱导培养基含有以下组分(每升)：12 g胰蛋白胨、24 g酵母提取物、9.9g甘油(87%)、12.54 g K2HPO4、2.31 g KH2PO4、0.25 g MgSO4 x 7 H2O、1 g葡萄糖、2.5 g乳糖、30 mg卡那霉素。用生物反应器进行培养24 h(在30℃下，以350 - 最大800 rpm) ，随后通过用离心机(Heraeus)中的离心取出生物量而收获培养上清液。
纯化
用Äkta Explorer 10s设备使用两步层析程序纯化Fab。应用中空纤维模块( 10kDa截止阈值)来将1L澄清培养上清液浓缩至100 mL的终体积并且用缓冲液A (50 mM磷酸钠 pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM咪唑)平衡缓冲液组合物。在使用Äkta Explorer系统的初始固定化金属亲和层析( IMAC )步骤中，将浓缩样品上样至5 mL Ni-NTA超流基质(Qiagen)。使用缓冲液A进行Ni-NTA基质的平衡、样品结合和洗涤 (结合在21℃下进行，所有其他层析步骤在4℃)。对于Fab的洗脱，使用在缓冲液A中10至250 mM的咪唑线性梯度。将来自单一洗脱峰的级分合并(60 mL总体积)，通过超滤浓缩至10 mL，并且使用Hi- Prep26/10脱盐柱缓冲液调整至PBS pH 7.4。随后，将用PBS平衡的2 mL抗κ轻链抗体基质(KappaSelect Affinity Media, 0833.10，来自BAC)与浓缩的IMAC洗脱物在室温下在搅拌下孵育1 h。将结合样品的基质转移到层析柱，并用PBS洗涤。Fab样品用2 mL甘氨酸pH 2.0洗脱，用1 M HEPES pH 7.5中和，并且用PD10脱盐柱(GE, 17-0851-01)缓冲液调整至PBS。
当使用10 L生物反应器(Sartorius)在大肠杆菌中表达Fab时，使用以下纯化程序。将经离心的培养上清液依次过滤通过两个孔径为5和0.2μm的一次性滤器模块(GE,KMP-HC-9204TT; KGF-A- 0504TT)。应用中空纤维模块( 10 kDa截止阈值)来将澄清培养上清液浓缩至1500 mL的终体积并且用缓冲液A 调整缓冲液组合物。将25 mL Ni-NTA超流基质(Qiagen，在缓冲液A中平衡)添加至浓缩的样品，并在21℃下孵育1.5 h。将结合样品的基质转移到空层析柱(25 x 125 mm)，连接至Äkta Explorer层析设备，并用缓冲液A(约250mL) 洗涤。对于Fab的洗脱，应用具有5% (30 mL)和10 % (35 mL)缓冲液B的随后两个步骤梯度和随后的最高达100％缓冲液B的线性洗脱梯度。随后如下处理合并的洗脱级分(72mL)：用离心超滤装置(截止10 kDa，Amicon)浓缩至终体积20mL，以三个部分上样至脱盐柱(GE HiPrep, 26/10)以便将缓冲液调整至PBS pH 7.4 ，并在离心超滤装置(Amicon)中进一步浓缩至终体积40 mL。将浓缩样品在室温下在搅拌下与5 mL抗κ轻链抗体基质(KappaSelect Affinity Media, BAC, 用PBS平衡)孵育1 h。将结合样品的琼脂糖基质转移到层析柱，并用以下顺序的洗涤步骤进行处理：用15mL PBS洗涤4次；用5 mL洗涤缓冲液( 100mM磷酸钠pH 6.0，100 mL氯化钠，500 mM精氨酸)洗涤两次。洗脱步骤包括3次应用5 mL 100mM甘氨酸HCl pH 3.0。将洗脱物立即用1 M Tris HCl pH 8.0中和，并且通过离心(10 min,3.200 g)去除形成的沉淀。将样品通过超滤(Amicon)浓缩，并应用至具有TBS缓冲液的ÄktaExplorer层析系统上的Superdex-75制备级16/60柱。峰级分通过PAGE进行分析，并且合并代表1.1摩尔比的Fab的重链和轻链的级分，并再次通过超滤(Amicon)浓缩至终体积1 mL。从10 L大肠杆菌培养上清液分离出约4 mg Fab A。
分析大小排阻层析(Äkta Micro system, S75 5/150柱, 100 mM Tris HCl, ph7.5)用来证明Fab A/TFPI KD2复合物的形成。因此，分别分析 Fab A、TFPI KD2和Fab A加TFPI KD2的混合物(图1)。
实施例3 . TFPI-Fab A复合物的结晶和X-射线结构测定
结晶
使用座滴法使TFPI Kunitz结构域2和单克隆抗体Fab A的共晶体在20℃下生长。将蛋白复合物浓缩至9 mg/mL，并通过混合等体积的蛋白溶液和作为沉淀剂的孔溶液(wellsolution)(15% PEG8000, Tris HCl pH 7.5)进行结晶。一天后出现晶体。
数据采集与处理
在液氮中将晶体在结晶缓冲液中的30％甘油中快速冷冻而用于冷冻保护。在MARCCD检测器上以束线BL14.1, BESSY同步加速器(Berlin)收集数据。将数据编入索引并与XDS 整合，用POINTLESS(P.R. Evans, (2005) ActaCryst. D62, 72-82)准备用于放大(scale)，并且用SCALA (P.R. Evans, (2005) ActaCryst. D62, 72-82)放大。晶体衍射高达2.6 Å，并且具有空间群P212121，晶胞常数(cellconstants) a=65.7，b=114.7，c=151.9；α=β=γ= 90°，并且不对称单元中有两个TFPI-Fab复合物。
结构测定和精确化(refinement)
使用PHASER(A.J. McCoy等人(2007) J. Appl. Cryst. 40, 658- 674)和公开的TFPI Kunitz结构域2(pdb编号1tfx)和Fab片段(pdb编号3mxw)的X-射线结构作为搜索模型通过分子替换解析了TFPI Kunitz结构域2和单克隆抗体Fab共结构。在分子置换之前，Fab模型序列用CHAINSAW (N. Stein, (2008) J. Appl. Cryst. 41, 641 - 643)进行修改。用COOT (P. Emsley等人(2010) Acta Cryst.D66:486-501)的模型构建和使用REFMAC5.5(G.N. Murshudov等人(1997) Acta Cryst.D53, 240-255)的最大似然精确化的迭代几轮完成了该模型。KD2的区域Phe A 31 - Asn A 35、Pro B 9、Lys M 139 - Ser M 142、和Asp140 - Phe154显示弱电子密度，并且没有包括在模型中。数据集和精确化统计总结在表1中。
表1. TFPI-Fab A复合物的数据集和精确化统计
a括号中的数值用于高分辨率壳。
b ，其中Ihkl 是反射hkl的强度，并且<Ihkl>是多次观察的平均强度。
c ，其中Fobs和Fcalc分别是观察和计算的结构因子振幅。
d 5%测试集。
e RMSD，距离理想的立体化学的参数集的均方根误差。
实施例4 . Fab A的基于X-射线结构的表位作图
TFPI-Fab A的复合物(图2)结晶为两个拷贝复合物/每个不对称单元。复合物的主链重叠，整体均方根偏差( RMSD )为0.7 Å ，各Fab结合至结合的TFPI表位。用CCP4程序AREAIMOL (P.J. Briggs (2000) CCP4 Newsletter No. 38)分析TFPI与Fab A接触的残基(表位)和相应的埋藏表面。具有最小5Å2埋藏表面或超过50％埋藏表面的残基已经被视为接触的(表2)。用AREAIMOL分析Fab A与TFPI接触的残基(互补位)和相应的埋藏表面。具有最小5 Å2埋藏表面或超过50％埋藏表面的残基已经被视为接触的(表3)。
表2：TFPI与Fab A接触的残基。链C和N对应于不对称单元中相应复合物的TFPI。
表3：Fab A与TFPI接触的残基。链A、B和链L、M代表不对称单元中各自复合物的FabA轻链和重链。
被Fab A识别的非线性表位定义为区域Glu100 - Arg109和Lys126、Gly128 -Asn133。Fab A的互补位包括轻链(lc)残基 ，和重链(hc)残基 。基于接触的数量，CDR-L3、CDR- H2和 CDR-H3似乎是主要相互作用位点。
表位由通过Cys106和Cys130之间的二硫键连接的两个环组成(图3)。二硫键针对CDR-H3的hc_Trp108堆叠，而相邻Ile105和Leu131埋藏在由 生成的疏水性裂缝中。基于接触的数量，Ile105和Leu131是与CDR-L3、CDR-H2和CDR-H3的疏水性接触中的主要表位残基。
TFPI区域Glu101 - Ile105与CDR-H2相互作用。界面的强烈特征在于hc_Tyr54、hc_Tyr60和hc_Arg62。Hc_Tyr54显示与Asp102的侧链的极性相互作用。Hc_Tyr60显示与Glu101的主链羰基氧的极性相互作用，并且hc_Arg62显示与Asp102的侧链和Gly132的主链羰基氧的极性相互作用。
Asp102是与CDR-H2 hc_Tyr54和hc_Arg62的极性相互作用中的关键表位残基。FabA的野生型hc_Asp62替换为精氨酸导致亲和力增加120倍。基于X射线结构，这可以通过从hc_Asp62和Asp102之间的排斥转换为hc_Arg62和Asp102的极性相互作用，和主链羰基氧来解释。
Arg107的胍基分别与CDR-H1和CDR-H3的hc_Asn32和hc_Asp105的侧链直接相互作用。已经显示Arg107对于因子Xa的抑制是必不可少的(M.S. Bajaj等人(2001) ThrombHaemost 86(4):959- 72.)。Fab A占据该关键残基，并且在抑制因子Xa中竞争Arg107功能。
实施例5. Fab A和其优化变体Fab C的互补位比较
为了评估Fab A的优化变体Fab C对TFPI表位结合的一致性，分析轻链和重链的序列比对(图11A)和Fab C的同源性模型(图11B)的Fab C中Fab A互补位残基的保守性。使用我们的TFPI - Fab A X射线结构作为输入模板结构用DS MODELER (ACCELRYS, Inc;Fiser, A.和Sali A. (2003) Methods in Enzymology, 374:463-493)计算同源性模型。同源性模型显示与Fab A相比几乎相同的骨架构型，其中RMSD < 0.5 Å。在TFPI-Fab A复合物中观察的20个互补位残基中，hc_Asn32是Fab C中不同的唯一互补位残基，其中天冬氨酸残基在各自的位置(图11)。Hc_Asn32与TFPI Arg107相互作用。考虑到其羧酸酯基和预期与Arg107的胍基的相互作用，FabC的Asp32应当与TFPI更紧密地相互作用。基于Fab A和Fab C互补位残基之间的高序列保守性和预期相同的骨架构型，Fab C很可能与Fab A识别相同的TFPI表位。
实施例6. TFPI-因子Xa相互作用的抑制的基于X-射线结构的基本原理
Fab A预期TFPI- 因子Xa相互作用和抑制。TFPI-Fab A复合物与TFPI-胰蛋白酶的结构(M.J. Burgering等人(1997) J Mol Biol.269(3):395-407)的叠加显示，含有Fab A表位的TFPI区域对于与胰蛋白酶(其是因子Xa的替代物)的相互作用是至关重要的。基于X-射线结构，Fab A与Kunitz结构域2上观察到的表位的结合应当通过空间位阻排除因子Xa的结合(图4)。
实施例7. 产生重组TFPI(Kunitz结构域1 + 2)、在大肠杆菌中表达并纯化
表达系统
命名为pD Eco5 N的目标载体(根据Gateway命名法)是基于ET-16 b (Novagen)。该载体还编码His10和NusA标签以及用于表达融合蛋白的Gateway克隆盒，所述融合蛋白由His10/NusA和目标蛋白组成。
将编码融合至Kunitz结构域1+2的N-末端(Asp1至Phe154，参考Uniprot 10646，成熟TFPIα)的TEV蛋白酶切割位点和Gateway结合位点(attBl-5#, attB2-3#, Invitrogen)的DNA构建体克隆到pD Eco5 N载体中，导致产生命名为pD Eco5 N TFPI KD1+2的表达载体。使用的表达菌株是BL21 DE3 (Novagen)。
使用pD Eco5 N TFPI KD1+2表达的融合蛋白的氨基酸序列, 600 AA。
序列组分
表达
用pD Eco5 N TFPI KD1+2转化的BL21 DE3菌株作为具有200 μg/mL氨苄青霉素的2x 100 mL LB培养基中的预培养物在37℃下生长14 h，搅动速率为180 rpm。用200 mL预培养物接种具有10 L培养体积(LB培养基, 200 μg/mL氨苄青霉素)的生物培养器(SartoriusStedim Biotech)，并在在37℃下孵育，搅动速率为150 rpm。在OD600的培养密度，添加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至100 mM的终浓度用于诱导基因，并在17℃下以50%的pO2最低水平和180 - 800 rpm的搅拌速度进一步培养24 h。大肠杆菌通过离心(3000 g, 10min)沉淀，储存在-80℃。
纯化
将从10 L培养物沉淀的大肠杆菌质量重新悬浮于500 mL裂解缓冲液[50 mM TrisHCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 10% (w/w)甘油, 40 mM咪唑, 蛋白酶抑制物混合物，完全无EDTA (Roche)]，在高压设备(Microfluidics)中均质化，并且随后离心裂解物(100.000 g,60 min, 4℃)。使用Äkta纯化系统进行几个纯化步骤。在初始IMAC层析步骤中将离心的可溶裂解物级分上样至含有50 mL Ni-琼脂糖HP基质(GE)的柱。使用缓冲液A (50 mM TrisHCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 40 mM咪唑)平衡、融合蛋白结合和洗涤Hi-Trap-琼脂糖HP基质。对于NusA-TFPI融合蛋白的洗脱，使用在缓冲液B (50 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mMNaCl)中40至500 mM的咪唑线性梯度。将洗脱级分合并(总体积140 mL)，并且分份上样至脱盐柱Hi Prep 26/10 (GE)(两个连接的柱单元)，用于交换至具有50 mM Tris HCl pH 8.0,150 mM NaCl, 5 mM CaCl2)的缓冲液。为了去除Nus A标签，在4℃下以1:66 w/w的酶与融合蛋白比例进行用His6-标签的TEV的蛋白水解消化，持续16小时。将样品再次上样至含有50 mL Ni-琼脂糖HP基质(GE)的柱上，以将游离TFPI与未切割的融合蛋白和His-TEV分离。然后将IMAC步骤的洗脱物应用至大小排阻层析，所述大小排阻层析(SEC, 柱S100, GE)用来分离单体TFPI级分，所述单体TFPI级分通过超滤(Amicon, 具有3 kDa-截止范围的单元)浓缩至约1.5 mg/mL。纯化的最终TFPI Kunitz结构域1 + 2样品在PAGE中作为双条带迁移，表观分子量约为18 kDa。进一步分析(SEC, western印迹)揭示，对应于上面条带的唯一蛋白与Fab B免疫反应。
实施例8. 人IgG1的蛋白水解处理并从其纯化Fab B。
表达
从其人IgG1形式蛋白水解处理Fab B。Fab B_IgG1在哺乳动物细胞(HEK 293)中作为分泌蛋白表达。为了分离 IgG1，将1.6 L培养上清液上样至HiTrap MabSelectSuRE的两个连接柱(来自GE, 5 mL床体积, 流速1.5 mL/min, 4℃, 持续16 h)。对于柱洗涤和平衡，使用由PBS和500 mM NaCl组成的缓冲液。将结合的IgG1洗脱(50 mM乙酸钠, 500 mM NaClpH 3.5和随后具有pH 3.0的相同缓冲液)，中和(2.5 M Tris >11)，并且通过超滤浓缩至约13 mg/mL。
使用在1.5 mL Eppendorf反应管中的22个级分用固定的木瓜蛋白酶(Pierce, 20mL浆料)用于消化约270 mg (在12.5 mL中)的IgG1(孵育16 h，37℃，搅动1400 rpm)。处理之后，离心样品，收集上清液，用PBS洗涤沉淀，并且合并上清液和清洗的洗涤液两者。
再次将消化的样品上样至两个连接的HiTrap MabSelectSuRe柱(2x5 mL)，使Fc和Fab材料分离。通过超滤将合并的分离的Fab B级分浓缩至约8 mg/mL (总得率120 mg)。此外，使用具有Superdex75的大小排阻层析(柱26/60, 流速2.5 mL/min，使用PBS)，用于进一步纯化。进一步浓缩和无菌过滤之后，Fab B的总得率为115 mg，浓度为8.5 mg/mL。
分析大小排阻层析(Äkta Micro system, S75 5/150柱, 100 mM Tris HCl, pH7.5)用来证明Fab B/TFPI KD1+2复合物的形成(图5)。对于Fab B，在SEC柱上观察到对应于20 kDa的表观分子量的意料之外的长保留时间，其非常类似于对于TFPI KD1+2检测到的分子量。
实施例9. 产生TFPI Kunitz结构域1 + 2与Fab B的复合物
为了形成免疫复合物，将TFPI Kunitz结构域1 + 2和Fab B以约1:1.5 (w/w)的比例组合。因此，将3.85 mg的浓缩的单体TFPI Kunitz结构域1+2蛋白(来自S100合并的级分)与7.4 mg Fab B (来自SEC Superdex75)混合，并且在21℃孵育16 h。经由分析SEC (S200/150)和Western印迹证明复合物形成。该复合物通过SEC (S200 26/26)在具有150 mM NaCl的10 mM Tris HCl pH 7.4中进一步纯化，通过超滤(Amicon, 具有5 kDa截止范围的单元)浓缩至10.3 mg/mL，其用于结晶。
实施例10 . TFPI-Fab B复合物的结晶和X-射线结构测定
结晶
使用座滴法使包含TFPI–Kunitz结构域1(KD1)和Kunitz结构域2 (KD2)的蛋白构建体和单克隆TFPI抗体Fab B的共晶体在4℃下生长。将蛋白复合物浓缩至10 mg/mL，并通过混合等体积的蛋白溶液和作为沉淀剂的孔溶液(20% PEG8000)进行结晶。三天后出现晶体。
数据采集与处理
在液氮中将晶体在结晶缓冲液中的30％甘油中快速冷冻而用于冷冻保护。在MARCCD检测器上以束线BL14.1, BESSY同步加速器(Berlin)收集一种晶体的数据。将数据编入索引并与IMOSFLM (A.G.W. Leslie, (1992), Joint CCP4 + ESF-EAMCB Newsletter onProtein Crystallography, No. 26)整合，用POINTLESS (P.R. Evans, (2005) ActaCryst. D62, 72-82)准备用于放大(scale)，并且用SCALA (P.R. Evans, (2005) ActaCryst. D62, 72-82)放大。晶体衍射高达2.3 Å，并且具有空间群P21，晶胞常数(cellconstants) a=80.3, b=71.9, c=108.8; β=92.5°，并且不对称单元中有两个TFPI-KD1, -KD2 - Fab复合物。
结构测定和精确化
使用PHASER (A.J. McCoy等人(2007) J. Appl. Cryst. 40, 658-674)、MOLREP(A.Vagin和A.Teplyakov (1997) J. Appl. Cryst. 30, 1022-10)和内部和公开的TFPI-KD2 (pdb编号1tfx)和Fab片段(pdb编号1w72)的X-射线结构作为搜索模型通过分子替换解析了TFPI-KD1、-KD2和单克隆抗体Fab的共结构。在分子置换之前，Fab和KD1模型用CHAINSAW (N. Stein, (2008) J. Appl. Cryst. 41, 641 - 643)进行处理。用COOT (P.Emsley等人(2010) Acta Cryst.D66:486- 501)的模型构建和使用REFMAC5.5 (G.N.Murshudov等人(1997) Acta Cryst.D53, 240-255)的最大似然精确化的迭代几轮完成了该模型。两种Fab的区域hc_Ser131 - hc_Ser136、TFPI残基Asp1 - Leu21, Asp149 -Phe154和KD1 - KD2接头残基Arg78 - Glu92显示弱电子密度，并且没有包括在模型中。数据集和精确化统计总结在表4中。
表4. TFPI-Fab B复合物的数据集和精确化统计
a括号中的数值用于高分辨率壳。
b ，其中Ihkl 是反射hkl的强度，并且<Ihkl>是多次观察的平均强度。
c ，其中Fobs和Fcalc分别是观察和计算的结构因子振幅。
d 5%测试集。
e RMSD，距离理想的立体化学的参数集的均方根误差。
实施例11 . 基于X-射线结构的表位作图
TFPI-KD1、-KD2和Fab B的复合物(图6)结晶为两个拷贝复合物/每个不对称单元。复合物的主链重叠，整体RMSD为1.0 Å ，各Fab B结合至结合的TFPI-KD1和- KD2的表位。两个Kunitz结构域直接相互作用或通过水介导的与Fab B的相互作用而相互作用。KD1和KD2也彼此相互作用。用CCP4程序AREAIMOL (P.J. Briggs (2000) CCP4 Newsletter No. 38)分析TFPI与Fab B接触的残基(表位)和相应的埋藏表面。具有最小5Å2埋藏表面或超过50％埋藏表面的残基已经被视为接触的(表5)。用AREAIMOL分析Fab B与TFPI接触的残基(互补位)和相应的埋藏表面。具有最小5Å2埋藏表面或超过50％埋藏表面的残基已经被视为接触的(表6)。
表5：TFPI与Fab B接触的残基。链C、D和链N、O对应于不对称单元中相应复合物的TFPI Kunitz结构域1和Kunitz结构域2。
表6：Fab B与TFPI接触的残基。链A、B和链L、M代表不对称单元中各自复合物的FabB轻链和重链。
Fab B识别KD1和KD2的非线性表位，所述非线性表位由以下定义：TFPI-KD1的残基Asp31 - Lys36、Cys59 (其与Cys35形成二硫键)、Glu60和Asn62，和TFPI-KD2的Glu100、Glu101、区域Pro103 - Cys106 (其与Cys130形成二硫键)、残基Arg107- Tyr109、Phe114、Asn116、Glu123、Arg124和残基Lys126 - Gly128。Fab B中与TFPI- KD1相互作用的互补位包括 。Fab B中与TFPI- KD2相互作用的互补位包括 。基于接触的数量，轻链CDR似乎是对于TFPI-KD1的主要相互作用位点，重链CDR似乎是对于TFPI-KD2的主要相互作用位点。
TFPI-KD1上的非线性表位由通过Cys35和Cys59之间的二硫键连接的两个环区域组成。该表位的特征在于被Asp31、Asp32、Glu60和Lys36与Fab B的极性相互作用的三角包围的Pro34的中央疏水性相互作用(图7)。
Pro34处在CDR-L1的lc_Tyr30和lc_Tyr31、CDR-L3的lc_Trp90和CDR-H3的hc_Tyr102生成的疏水性裂缝中。Asp31和Asp32具有与CDR-H3的极性相互作用和与hc_Arg101、hc_Tyr102和水分子的氢键网络。Hc_Tyr102侧链处于良好朝向以具有与Pro34的疏水性相互作用，与Asn31的极性相互作用和与CDR-L3的lc_Trp90的芳香相互作用。
Asp31和Asp32与CDR-H3的相互作用是关键的表位特征，并且hc_Tyr102和hc_Arg101的朝向和相互作用似乎是至关重要的。野生型残基hc_Lys99突变为亮氨酸导致亲和力增加20倍。Hc_Leu99位于轻链和重链之间的疏水性界面，随后是CDR-H3环。在该位置上的极性和柔性赖氨酸侧链是不利的，并且干扰了最佳CDR-H3构型和抗原相互作用。
形成极性三角的第二个角的Glu60与lc_Tyr30 (CDR-L1)、lc_Trp90的侧链和lc_Gly93 (CDR-L3)的主链氮相互作用。
该三角的第三个角由Lys36形成。Lys36对于TFPI对因子VIIa/组织因子复合物的抑制是必要的残基(M.S. Bajaj 等人(2001) Thromb Haemost 86(4):959-72.)。在与FabB的复合物中，Lys36显著接触，并且被CDR-L1 lc_Leu27、lc_Arg28、lc_Asn29、lc_Tyr31、CDR-L2 lc_Asp50和水分子所埋藏。Lys36与因子VIIa/组织因子复合物的相互作用同时结合至Fab B，并且其抑制似乎被排除。
TFPI-KD2上的非线性表位由三个部分组成，所述部分包含残基Glu100、Glu101、Pro103 - Tyr109、Phe114；Asn116和Glu123；Arg124、Lys126 - Gly128。KD2-表位形成与Fab B CDR-L1、- L2、-H1和-H3的极性和疏水性相互作用(图8)。
Glu100、Glu101、Arg107和Tyr109是提供与由CDR-Hl (与Glu100和Glu101相互作用) CDR-L1、-L2、-H3 (与Arg107相互作用)和CDR-L2、-H3 (与Tyr109相互作用)生成的FabB的三个分离表面区域接触的强烈极性或疏水性锚定点的关键表位残基。
Arg107分别被CDR-L1、-L2、-H3的lc_Tyr31、lc_Tyr49、hc_Arg101、和hc_Tyr102显著接触，并且额外与KD1 的Gly33和Cys35相互作用。已经显示Arg107对于因子Xa的抑制是必不可少的(M.S. Bajaj等人(2001) Thromb Haemost 86(4):959-72.)。Fab B占据该关键残基，并且在抑制因子Xa中排斥Arg107功能。
Glu100 和Glu101与CDR-Hl残基hc_Arg30、hc_Ser31、和hc_Thr28 和hc_Tyr32形成氢键。
Tyr109处在由CDR-L2 lc_Tyr48、和CDR-H3残基hc_Tyr100、和hc_Trp103生成的疏水性利基(niche)中，并且与hc_Asp105形成氢键。
实施例12. Fab B和其优化变体Fab D的互补位比较
为了评估Fab B的优化变体Fab D对TFPI表位结合的一致性，分析轻链和重链的序列比对(图12A)和Fab D的同源性模型(图12B)的Fab D中Fab B互补位残基的保守性。使用我们的TFPI - Fab B X射线结构作为输入模板结构用DS MODELER (ACCELRYS, Inc;Fiser, A.和Sali A. (2003) Methods in Enzymology, 374:463-493)计算同源性模型。同源性模型显示与Fab B相比几乎相同的骨架构型，其中RMSD < 0.5 Å。在TFPI-Fab B复合物中观察的29个互补位残基中，七个残基(五个轻链残基，两个重链残基)在Fab D中不同(图12)。Lc_Arg28; lc_Asn29、lc_Asp92、和lc_Gly93显示与TFPI表位残基的主链相互作用。预期Fab D中这些残基的替换不会诱导与不同TFPI表位的结合。Fab D中的lc_Tyr48和hc_Gln1替换为苯丙氨酸和谷氨酸是忽略不计的，因为在X射线结构中没有观察到极性侧链相互作用。Hc_Arg30显示与TFPI的Glu100的极性相互作用，并且在Fab D 中被替换为丝氨酸。在该位置上，对于与TFPI相互作用，精氨酸应该是比丝氨酸有利的。基于Fab B和Fab D互补位残基之间分析的替换的预期影响、整体序列保守性和Fab D同源性模型的低RMSD，考虑Fab D与Fab B识别相同的TFPI表位。
实施例13 TFPI与因子Xa和因子VIIa/组织因子复合物的相互作用的抑制的基于X-射线结构的基本原理
Fab B结合TFPI的KD1和KD2两者。KD2结合并抑制因子Xa。KD1结合并抑制因子VIIa/组织因子复合物。已经报道了KD2与胰蛋白酶的复合物的X-射线结构(M.J.Burgering等人(1997) J Mol Biol.269(3):395-407)和BPTI与TF和因子VIIa的胞外部分的复合物的X-射线结构(E. Zhang等人(1999) J Mol Biol 285(5):2089-104.)。胰蛋白酶是因子Xa的替代物，BPTI是TFPI-KD1的同源物。TFPI-Fab B复合物与KD2-胰蛋白酶或BPTI-因子VIIa/组织因子的叠加揭示，抗体结合分别排除KD1和KD2与其天然配体因子VIIa/组织因子和因子Xa的结合(图9 ，图10)。
实施例14 . Fab C和Fab D阻断TFPI与FXa和FVII/TF的结合
为了证实Fab C和Fab D可以阻断TFPI上的FVIIa/TF-复合物或FXa-结合，我们进行了表面等离子体共振(Biacore)研究。使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)用170 RU的人TFPI固定CM5芯片。注射60 μL体积的Fab C、Fab D或阴性对照Fab，然后在芯片上注射60 μL的5 μg/mL FVIIa/TF复合物或FXa。注射凝血因子后，注射30至45 μL的10 mM甘氨酸(pH1.5)以再生芯片。将阴性对照Fab后生成的凝血因子的相对单位(RU)指定为100％，并且计算注射的Fab C或Fab D后生成的凝血因子的RU。如图13A中显示，在0.3 μg/mL和1 μg/mL浓度，TFPI上的Fab C结合分别引起FXa结合显著降低至42.6 ％和5.2 ％。同样，0.3和1 μg/mL浓度的Fab D分别将FXa结合降低至20.8 ％和7.6％。FVIIa/TF结合的结果显示在图13B中。在0.3和1 μg/mL浓度，Fab C分别将FVIIa/TF结合降低至25.1%和10.0%，而Fab D完全阻断FVIIa/TF结合，这可能是由于Fab D与TFPI的KD1的直接结合。
虽然本发明已经参照具体的实施方案和实施例进行了描述，但是应当理解可以进行各种修饰和变化，而且可以在不背离本发明的真实精神和范围的前提下替换等同方案。因而，说明书和实施例应以说明性而非限制性意义看待。此外，本文中所提及的所有文章、书籍、专利申请和专利通过引用完整地并入本文。

Claims (8)

1.分离的单克隆抗体，其结合SEQ ID NO:1中所示的人组织因子途径抑制物的表位，其中所述表位包含来自Kunitz结构域1的多个残基以及来自Kunitz结构域2的多个残基，所述来自Kunitz结构域1的多个残基是：SEQ ID NO:1的Asp31、Asp32、G1y33、Pro34、Cys35、Lys36、Cys59、G1u60和Asn62，所述来自Kunitz结构域2的多个残基是：SEQ ID NO:1的Glu100、Glu101、Asp102、Pro103、Gly104、Ile105、Cys106、Arg107、Gly108、Tyr109、Lys126、Gly128、Gly129、Cys130、Leu131、Gly132、和Asn133，
其中，所述抗体由SEQ ID NO:6中所示的轻链和SEQ ID NO:7中所示的重链组成，或由SEQ ID NO:8中所示的轻链和SEQ ID NO:9中所示的重链组成。
2.权利要求1的分离的单克隆抗体，其中所述表位包含由SEQ ID NO:1 的残基Cys106和Cys130之间的二硫键连接的两个氨基酸环。
3.权利要求1的分离的单克隆抗体，其中所述表位包含由SEQ ID NO:1 的残基Cys35和Cys59之间的二硫键连接的两个氨基酸环。
4.药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1-3中任一项的单克隆抗体和药学可接受的载体。
5.权利要求4的药物组合物在制备用于治疗患者中的遗传性或获得性凝血缺乏或缺陷的药物中的用途。
6.权利要求4的药物组合物在制备用于治疗患者中的血友病A 、B或C的药物中的用途。
7.权利要求4的药物组合物在制备用于缩短患者中出血时间的药物中的用途。
8.编码结合SEQ ID NO:1中所示的人组织因子途径抑制物的表位的抗体的分离的核酸分子，其编码权利要求1-3中任一项的所述分离的单克隆抗体。
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