KR101995302B1

KR101995302B1 - 조직 인자 경로 억제제 (ｔｆｐｉ)에 대한 모노클로날 항체

Info

Publication number: KR101995302B1
Application number: KR1020137028821A
Authority: KR
Inventors: 쯔오즈시 왕; 존 머피; 토비아스 마르쿠아르트; 디터 모스마이어
Original assignee: 바이엘 헬스케어 엘엘씨
Priority date: 2011-04-01
Filing date: 2012-03-30
Publication date: 2019-07-02
Also published as: MX2013011218A; KR20140019428A; GT201300229A; RS58633B1; EA201991704A3; NZ615969A; EP2694544A4; HK1243426A1; AU2017203105A1; TR201905101T4; JP2017113019A; IL274686A; CL2013002811A1; CA3068997A1; LT2694544T; US20180194857A1; IL228633B; WO2012135671A3; JP2014511685A; HUE042706T2

Abstract

인간 조직 인자 경로 억제제(TFPI)의 특이적 에피토프에 결합하는 단리된 모노클로날 항체와 이들을 코딩하는 단리된 핵산 분자가 제공된다. 항-TFPI 모노클로날 항체를 포함하는 약제학적 조성물과 상기 항체의 투여에 의해 응고에 있어서 결핍 또는 결함을 치료하는 방법이 또한 제공된다.

Description

조직 인자 경로 억제제 (ＴＦＰＩ)에 대한 모노클로날 항체 {MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST TISSUE FACTOR PATHWAY INHIBITOR (TFPI)}

서열 목록 제출

본 출원과 관련한 서열 목록이 EFS-Web을 통해 전자 포맷으로 제출되었고, 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된다.

실시양태의 분야

인간 조직 인자 경로 억제제 (TFPI)에 결합하는 단리된 모노클로날 항체 및 그의 단편이 제공된다.

혈액 응고는 출혈을 멈추기 위해 혈액이 안정적인 혈병을 형성하는 과정이다. 상기 과정은 혈액 내에서 순환하는 수많은 효소 전구체 및 보조인자 전구체 (또는 "응고 인자")를 수반한다. 이러한 효소 전구체 및 보조인자 전구체는 이것들이 순차적으로 또는 동시에 활성화된 형태로 전환되는 여러 경로를 통해 상호작용한다. 궁극적으로, 상기 과정은 인자 Va, 칼슘 이온 및 혈소판의 존재하에서 활성화된 인자 X (FXa)에 의해 프로트롬빈을 트롬빈으로 활성화한다. 이후, 활성화된 트롬빈은 혈소판 응집을 유도하고 피브리노겐을 피브린으로 전환시키며, 피브린은 이후에 활성화된 인자 XIII (FXIIIa)에 의해 가교되어 혈병을 형성한다.

인자 X를 활성화시키는 과정은 2가지 별개의 경로에 의해 수행될 수 있다: 접촉 활성화 경로 (이전에는, 내인성 경로라 공지됨) 및 조직 인자 경로 (이전에는, 외인성 경로라 공지됨). 예전에는 응고 캐스케이드가 공통적인 경로에 연결된, 동일한 중요성의 2가지 경로로 이루어졌다고 여겨졌다. 현재, 혈액 응고 개시를 위한 주요 경로는 조직 인자 경로임이 공지되어 있다.

인자 X는 활성화된 인자 VII (FVIIa)와 함께 조직 인자 (TF)에 의해 활성화될 수 있다. 인자 VIIa 및 그의 필수 보조인자 TF의 복합체는 혈액 응고 캐스케이드의 강력한 개시자이다.

응고의 조직 인자 경로는 조직 인자 경로 억제제 ("TFPI")에 의해 네가티브적으로 제어된다. TFPI는 FVIIa/TF 복합체의 FXa-의존적인 천연 피드백 억제제이다. 이것은 다가 쿠니츠(Kunitz)-유형 세린 프로테아제 억제제의 구성원이다. 생리적으로, TFPI는 활성화된 인자 X (FXa)에 결합하여 이종이량체(heterodimeric) 복합체를 형성하고, 이것은 이후에 FVIIa/TF 복합체와 상호작용하여 그의 활성을 억제함으로써 응고의 조직 인자 경로를 차단한다. 원칙적으로, TFPI 활성의 차단은 FXa 및 FVIIa/TF 활성을 복구시킬 수 있고, 이에 따라 조직 인자 경로의 작용 기간을 연장시키고 혈우병 A 및 B에서의 공통적인 결함인 FXa의 생성을 증폭시킨다.

실제로, 일부 예비 실험적 증거는 TFPI에 대한 항체에 의한 TFPI 활성의 차단이 연장된 응고 시간을 정상으로 만들거나 출혈 시간을 단축시킨다는 것을 나타냈다. 예를 들어, 노르드팡(Nordfang) 등은 혈우병 혈장의 연장된 희석된 프로트롬빈 시간이 상기 혈장을 TFPI에 대한 항체로 처리한 후에 정상으로 되었음을 보여주었다 (Thromb. Haemost., 1991, 66(4): 464-467). 유사하게, 에르하르트센(Erhardtsen) 등은 혈우병 A 토끼 모델에서의 출혈 시간이 항-TFPI 항체에 의해 유의적으로 단축되었음을 보여주었다 ([Blood Coagulation and Fibrinolysis, 1995, 6: 388-394]). 이러한 연구는 항-TFPI 항체에 의한 TFPI의 억제가 혈우병 A 또는 B의 치료에 유용할 수 있음을 시사한다. 이들 연구에는 오직 폴리클로날 항-TFPI 항체만이 사용되었다.

하이브리도마 기술을 이용하여, 재조합 인간 TFPI (rhTFPI)에 대한 모노클로날 항체를 제조하고 확인하였다. 문헌 [Yang et al., Chin. Med. J., 1998, 111(8): 718-721]을 참조한다. 희석된 프로트롬빈 시간 (PT) 및 활성화된 부분적 트롬보플라스틴 시간 (APTT)에 대한 모노클로날 항체의 효과를 시험하였다. 실험은 항-TFPI 모노클로날 항체가 인자 IX 결핍된 혈장의 희석된 트롬보플라스틴 응고 시간을 단축시켰음을 보여주었다. 이는, 조직 인자 경로가 생리적 응고에서만 중요한 역할을 수행하는 것이 아니라 또한 혈우병의 출혈에서도 중요한 역할을 수행한다는 것을 시사한다 (Yang et al., Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao, 1997, 22(4): 297-300).

따라서, TFPI에 대해 특이적인 항체가 혈액계 질환 및 암의 치료에 필요하다.

일반적으로, 인간 질환을 위한 치료 항체는 쥐(murine), 키메릭(chimeric), 인간화 또는 완전 인간 항체 생성을 위한 유전자 조작을 이용하여 생성되었다. 쥐의 모노클로날 항체는 짧은 혈청 반감기, 인간 효과기(effector) 기능의 촉발 불능, 및 인간 항-마우스 항체의 생성으로 인해 치료제로서는 용도가 제한된 것으로 나타난 바 있다 (Brekke and Sandlie, "Therapeutic Antibodies for Human Diseases at the Dawn of the Twenty-first Century," Nature 2, 53, 52-62 (Jan. 2003)). 키메릭 항체는 인간 항-키메릭 항체 반응을 야기하는 것으로 나타났다. 인간화 항체는 항체의 마우스 성분을 추가로 최소화한다. 그러나, 완전 인간 항체는 쥐의 요소와 관련이 있는 면역원성을 완벽하게 피한다. 따라서, 다른 형태의 유전자 조작된 모노클로날 항체와 관련이 있는 면역원성을 피하기 위해서 완전 인간 항체를 개발할 것이 요구된다. 특히, 항-TFPI 모노클로날 항체를 사용한 혈우병 치료에 필요한 것과 같은 만성 예방적 치료는, 쥐의 성분 또는 쥐의 기원을 갖는 항체가 사용되는 경우에 빈번한 투여가 필요하고 요법이 장기간 지속되기 때문에 상기 요법에 대한 면역 반응이 발생할 위험이 높다. 예를 들어, 혈우병 A에 대한 항체 요법은 환자의 생존 동안 매주 투여할 것이 필요할 수 있다. 이것은 면역계에 대한 지속적인 도전이다. 따라서, 혈우병 및 응고에 있어서의 관련 유전적 및 후천적 결핍 또는 결함에 대한 항체 요법을 위한 완전 인간 항체가 필요하다.

치료 항체는 문헌 ["Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity," Nature 256, 495-497 (1975)]에서 쾰러(Koehler) 및 밀스테인(Milstein)이 기재한 하이브리도마 기술을 통해 제조되었다. 완전 인간 항체는 원핵생물 및 진핵생물에서 재조합 방식으로 제조될 수도 있다. 하이브리도마 생산이 아니라 숙주 세포에서 항체를 재조합 생산하는 것이 치료 항체에 바람직하다. 재조합 생산은 생성물의 일관성이 더 높고 생산 수준이 더 높을 수 있으며 동물-유래의 단백질의 존재를 최소화하거나 제거하는 제어된 제조가 가능하다는 이점을 갖는다. 이러한 이유로, 재조합 방식으로 생산된 모노클로날 항-TFPI 항체를 확보하는 것이 바람직하다.

또한, TFPI가 높은 친화성을 갖고 활성화된 인자 X(FXa)에 결합하기 때문에, 효과적인 항-TFPI 항체는 이에 필적하는 친화성을 가져야 한다. 따라서, TFPI/FXa 결합과 경쟁할 수 있는 결합 친화성을 갖는 항-TFPI 항체를 갖는 것이 바람직하다.

인간 조직 인자 경로 억제제 (TFPI)의 특이적 에피토프에 대한 특이적 결합을 갖는 모노클로날 항체가 제공된다. 항-TFPI 모노클로날 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 또한 제공된다. 항-TFPI 모노클로날 항체를 포함하는 약제학적 조성물, 및 응고에 있어서의 유전적 및 후천적 결핍 또는 결함, 예컨대 혈우병 A 및 B의 치료 방법도 제공된다.

도 1은 크기 배제 분석법에 의한 Fab A와 TFPI 쿠니츠 도메인 2의 복합체 형성을 묘사한 것이다.
도 2는 인간 조직 인자 경로 억제제와 이의 항체(Fab A) 간의 상호작용의 만화 제시(cartoon representation)를 묘사한 것이다. 표시된 가변 경쇄(V_L) 및 중쇄(V_H) 도메인이 있는 Fab A가 하부 구조로 표시되어 있다. TFPI의 쿠니츠 도메인 2(KD2)가 상부 구조로 표시되어 있다.
도 3은 Fab A 표면에서 중요한 에피토프 잔기 Asp102 (D102), Ile105 (I105), Arg107 (R107), Cys106-Cys130 디술피드 가교, 및 TFPI의 결합을 묘사한 것이다.
도 4는 TFPI-Fab A 복합체와 트립신 결합된 쿠니츠 도메인 2(KD2)의 중첩을 묘사한 것으로 인자 Xa 및 Fab A로의 TFPI의 동시 결합은 제외시킨 것을 나타낸다. KD2 및 Fab A는 만화 제시로 묘사한 것이며, 트립신은 투면 표명으로 나타낸다. Fab A와 트립신의 입체적 장애도 표시되어 있다.
도 5는 크기 배제 분석법에 의한 Fab B와 TFPI 쿠니츠 도메인 1+2의 복합체 형성을 묘사한 것이다.
도 6은 첫번째 각도 및 상기 첫번째 각도에 대해 90°회전한 다른 각도에서의 인간 조직 인자 경로 억제제와 이의 항체(Fab B) 간의 상호작용을 나타내는 2개의 만화 제시(cartoon representation)를 묘사한 것이다. 표시된 가변 경쇄(V_L) 및 중쇄(V_H) 도메인이 있는 Fab B가 도면의 하부 구조에(회색으로 그늘진 것) 표시되어 있다. TFPI 쿠니츠 도메인 1(KD1)은 백색으로 나타내며 TFPI 쿠니츠 도메인 2(KD2)는 흑색으로 나타낸다.
도 7은 Fab B 표면에서 중요한 에피토프 잔기 Asp31 (D31), Asp32 (D32), Pro34 (P34), Lys36 (K36), Glu60 (E60), Cys35-Cys59 디술파이드 가교, 및 쿠니츠 도메인 1 TFPI의 결합을 표시한 것이다. 열거되지는 않지만, 쿠니츠 도메인 2도 나타나 있다.
도 8은 쿠니츠 도메인 2의 에피토프 잔기 Glu100 (E100), Glu101 (E101), Pro103 (P103), Ile105 (I105), Arg107 (R107), Tyr109 (Y109) 와 Fab B와의 결합 및 상호작용을 2개의 각도에서 본 것을 묘사한 것이다. Arg107은 쿠니츠 도메인 1의 Gly33 (G33) 및 Cys35 (C35)와 상호작용한다.
도 9는 TFPI-Fab B 복합체와 BPTI, 인자 VIIa 및 조직 인자의 복합체의 중첩을 묘사한 것으로, 인자 VIIa/조직 인자 및 Fab B로의 TFPI의 동시 결합은 제외시킨 것을 나타낸다. Fab B와 인자 VIIa, 및 Fab B와 조직 인자의 입체적 장애는 화살표로 표시되어 있다.
도 10은 TFPI-Fab B 복합체와 트립신 결합된 쿠니츠 도메인 2(KD2)의 중첩을 묘사한 것으로 인자 Xa 및 Fab B의 TFPI의 동시 결합은 제외시킨 것을 나타낸다. Fab B와 트립신, 및 Fab B 결합된 쿠니츠 도메인 1과 트립신의 입체적 장애가 표시되어 있다.
도 11은 (A) Fab A의 경쇄 및 중쇄 서열 정렬표 (SEQ ID NOs: 2 및 3)와 Fab C (SEQ ID NOs: 6 및 7) 및 (B) Fab C의 상동성 모델을 갖는 TFPI-Fab A X-선 구조의 중첩을 묘사한 것이다. (A) 파라토프 잔기는 진한 글씨체이며 하이라이트 표시되어 있다. 파라토프 잔기 hc_Asn32 (이는 Fab A와 Fab C에서 상이하다)는 별표로 표시되어 있다. (B) 쿠니츠 도메인 2(KD2)은 흑색의 만화로 표시되어 있다. Fab 구조는 회색 리본으로 표시된다. 파라토프 잔기 hc_Asn32는 막대로 표시되어 있다.
도 12는 (A) Fab B의 경쇄 및 중쇄 서열 정렬표 (SEQ ID NOs: 4 및 5)와 Fab D (SEQ ID NOs: 8 및 9) 및 (B) Fab D의 상동성 모델을 갖는 TFPI-Fab B X-선 구조의 중첩을 묘사한 것이다. (A) 파라토프 잔기는 진한 글씨체이며 하이라이트 표시되어 있다. 파라토프 잔기 hc_Asn32 (이는 Fab B와 Fab D에서 상이하다)는 별표로 표시되어 있다. (B) 쿠니츠 도메인 1(KD1)과 쿠니츠 도메인 2(KD2)는 각각 밝은 회색 및 흑색의 만화로 표시되어 있다. Fab 구조는 회색 리본으로 표시된다. Fab B 및 Fab C에서 상이한 파라토프 잔기는 막대로 표시되어 있다.

정의

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "조직 인자 경로 억제제" 또는 "TFPI"는 세포에 의해 천연적으로 발현되는, 인간 TFPI의 임의의 변이체, 이소형 및 종 상동체(species homolog)를 지칭한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, TFPI에 대한 본 발명의 항체의 결합은 혈액 응고 시간을 감소시킨다.

본원에서 사용된 바와 같이, "항체"는 온전한 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 부분") 또는 단일 쇄를 지칭한다. 상기 용어는 천연 발생이거나 정상적인 면역글로불린 유전자 단편 재조합 과정으로 형성된 전장 면역글로불린 분자 (예를 들어, IgG 항체), 또는 면역글로불린 분자에서 특이적인 결합 활성을 보유하는 면역학적 활성 부분, 예컨대 항체 단편을 포함한다. 구조에 상관없이, 항체 단편은 전장 항체에 의해 인식되는 것과 동일한 항원과 결합한다. 예를 들어, 항-TFPI 모노클로날 항체 단편은 TFPI의 에피토프에 결합한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예는 다음을 포함한다: (i) Fab 단편, V_L, V_H, C_L 및 C_H1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')₂ 단편, 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) V_H 및 C_H1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 V_L 및 V_H 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) V_H 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al. (1989) Nature 341:544-546); (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR); (vii) 미니바디(minibodies), 디아바디(diabodies), 트리아바디(triabodies), 테트라바디(tetrabodies), 및 카파 바디(kappa bodies) (Ill et al., Protein Eng 1997; 10:949-57 참조); (viii) 카멜 IgG; 및 (ix) IgNAR. 추가로, Fv 단편의 2개의 도메인, V_L 및 V_H는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이것들은 V_L 및 V_H 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성한 단일 단백질 쇄 (단일 쇄 Fv (scFv)로 공지; 예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426] 및 [Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조)로 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해서 재조합 방법으로 연결될 수도 있다. 이러한 단일 쇄 항체 역시 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 것으로 한다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상의 기술을 이용하여 수득되며, 이 단편들은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 분석된다.

또한, 항원 결합 단편이 항체 모방체(antibody mimetic)에 포함될 수 있음을 고려하여야 한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 상기 용어 "항체 모방체" 또는 "모방체"는 항체에 대해 유사한 결합을 나타내지만 더 작은 대안적 항체 또는 비-항체 단백질인 단백질을 의미한다. 그러한 항체 모방체는 스캐폴드(scaffold)에 포함될 수 있다. 상기 용어 "스캐폴드"는 맞춤형 기능과 특징을 갖는 새로운 생성물의 조작을 위한 폴리펩티드 플랫폼을 지칭한다.

용어 "에피토프(epitope)"는 항체가 특이적으로 결합하거나 상호작용하는 항원의 면적 또는 영역을 지칭하는 것으로, 일부 실시양태에서는 항원이 항체와 물리적으로 접촉하는 곳을 나타낸다. 역으로, 용어 "파라토프(paratope)"는 항원이 특이적으로 결합하는 항체 상의 면적 또는 영역을 지칭한다. 경쟁 결합으로 특징화되는 에피토프는 대응하는 항체의 결합이 상호 배타적일 경우, 즉, 어느 항체의 결합이 다른 항체의 동시 결합을 배제시키는 경우 중복되는 것으로 언급된다. 상기 에피토프는 항원이 대응하는 두 항체의 동시적인 결합을 수용할 수 있는 경우 별개(독특한)인 것이로 언급된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 상기 용어 "경쟁하는 항체"는 본 명세서에 기재된 바와 같이 TFPI에 대한 항체로서 대략적으로, 실질적으로 또는 필수적으로 동일한, 또는 심지어 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다. "경쟁하는 항체"는 중복되는 에피토프 특이성을 갖는 항체를 포함한다. 따라서, 경쟁하는 항체는 TFPI로의 결합에 있어서 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체와 효과적으로 경쟁할 수 있다. 바람직하게는, 상기 경쟁하는 항체가 본 명세서에 기재된 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 관점에서, 상기 경쟁하는 항체는 본 명세서에 기재된 항체와 동일한 에피토프 특이성을 갖는다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "결합의 억제" 및 "결합의 차단" (예를 들어, TFPI에 대한 TFPI 리간드 결합의 억제/차단을 지칭함)은 구별없이 사용되고, 부분적 및 완전한 억제 또는 차단 둘 다를 포함한다. 억제 및 차단은 또한 항-TFPI 항체와 접촉한 TFPI를 항-TFPI 항체와 접촉하지 않은 TFPI와 비교한 경우에서와 같이 생리적 기질에 대한 TFPI의 결합 친화도에 있어서의 임의의 측정가능한 감소, 예를 들어 TFPI와 인자 Xa의 상호작용 또는 TFPI-인자 Xa 복합체와 조직 인자, 인자 VIIa 또는 조직 인자/인자 VIIa의 복합체의 상호작용의 적어도 약 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％ 차단을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는, 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발, 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, TFPI 이외의 항원에 결합하는 항체가 실질적으로 없는, TFPI에 결합하는 단리된 항체). 그러나, 인간 TFPI의 에피토프, 이소형 또는 변이체에 결합하는 단리된 항체는 예를 들어 다른 종으로부터의 다른 관련 항원 (예를 들어, TFPI 종 상동체)과의 교차 반응성을 가질 수 있다. 추가로, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "특이적 결합"은 소정의 항원에 대한 항체 결합을 지칭한다. 전형적으로, 항체는 적어도 약 10⁵ M^-1의 친화도로 결합하고, 소정의 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의 무관한 항원 (예를 들어, BSA, 카제인)과의 결합에 대한 친화도보다 더 높은, 예를 들어 적어도 2배 더 높은 친화도로 상기 소정의 항원에 결합한다. 어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 대해 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 구별없이 사용된다.

본원에서 사용된 바와 같이, IgG 항체에 대한 "고친화도"라는 용어는 적어도 약 10⁷ M^-1, 일부 실시양태에서는 적어도 약 10⁸ M^-1, 일부 실시양태에서는 적어도 약 10⁹ M^-1, 10¹⁰ M^-1, 10¹¹ M^-1 또는 그보다 더 높은 값, 예를 들어 최대 10¹³ M^-1 또는 그보다 더 높은 값의 결합 친화도를 지칭한다. 그러나, "고친화도" 결합은 다른 항체 이소형마다 달라질 수 있다. 예를 들어, IgM 이소형에 대한 "고친화도" 결합은 적어도 약 1.0 ×10⁷ M^-1의 결합 친화도를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스 (예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다.

"상보성-결정 영역" 또는 "CDR"은 결합된 항원의 3차원 구조에 상보적인 N-말단 항원-결합 표면을 형성하는, 항체 분자의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역 내의 3개의 초가변 영역 중 하나를 지칭한다. 중쇄 또는 경쇄의 N-말단으로부터의 순서대로, 이들 상보성-결정 영역은 각각 "CDR1", "CDR2" 및 "CDR3"으로 표시된다. CDR은 항원-항체 결합에 관여하고, CDR3은 항원-항체 결합에 특이적인 고유 영역을 포함한다. 따라서, 항원-결합 부위는 중쇄 및 경쇄 V 영역 각각으로부터의 CDR 영역을 포함하는 6개의 CDR을 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "보존적 치환"은 1개 이상의 아미노산을 해당 폴리펩티드의 생물학적 또는 생화학적 기능의 소실을 야기하지 않는 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는 폴리펩티드의 변형을 지칭한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 부류는 당업계에 규정되어 있다. 이들 클래스는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비-극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 본 발명의 항체가 보존적 아미노산 치환을 갖고 여전히 활성을 보유할 수 있음이 예상된다.

핵산 및 폴리펩티드의 경우, 용어 "실질적 상동성"은 2종의 핵산 또는 2종의 폴리펩티드 또는 이것들의 지정된 서열이 최적으로 정렬 및 비교되는 경우에 적절한 뉴클레오티드 또는 아미노산 삽입 또는 결실을 가지면 뉴클레오티드 또는 아미노산의 적어도 약 80％, 통상적으로는 적어도 약 85％, 바람직하게는 약 90％, 91％, 92％, 93％, 94％ 또는 95％, 더욱 바람직하게는 적어도 약 96％, 97％, 98％, 99％, 99.1％, 99.2％, 99.3％, 99.4％ 또는 99.5％에서 동일한 것을 나타낸다. 대안적으로, 절편이 선택적인 혼성화 조건하에 그 가닥의 상보체와 혼성화되는 경우, 핵산에 대한 실질적 상동성이 존재한다. 본 발명은 본원에서 언급된 특정 핵산 서열 및 아미노산 서열에 대해 실질적 상동성을 갖는 핵산 서열 및 폴리펩티드 서열을 포함한다.

2종의 서열 사이의 동일성(％)는 그 서열들이 공유하는 동일한 위치의 수에 관한 함수 (즉, 상동성(％) = 동일한 위치의 수/위치의 총 수×100)로서, 2종 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한다. 2종의 서열 사이의 서열 비교 및 동일성(％)의 결정은 수학적 알고리즘, 예컨대 (이에 제한되지 않음) 벡터NTI(VectorNTI)™의 얼라인엑스(AlignX)™ 모듈 (인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corp.), 미국 캘리포니아주 칼스배드)을 이용하여 달성될 수 있다. 얼라인엑스™의 경우, 다중 정렬의 디폴트 변수는 다음과 같다: 갭 간격 패널티(gap opening penalty): 10, 갭 연장 패널티: 0.05, 갭 분리 패널티 범위: 8, 정렬 지연에 대한 동일성(％): 40. (추가의 상세사항에 대해서는 http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/LINNEA-Online-Guides/LINNEA-Communities/Vector-NTI-Community/Sequence-analysis-and-data-management-software-for-PCs/AlignX-Module-for-Vector-NTI-Advance.reg.us.html 참조).

의문(query) 서열 (본 발명의 서열) 및 대상 서열 사이의 최상의 전체 매치를 결정하는 또다른 방법은 글로벌 서열 정렬이라고도 지칭되며, 히긴스(Higgins) 등의 알고리즘 ([Computer Applications in the Biosciences (CABIOS), 1992, 8(2): 189-191])을 기초로 하는 CLUSTALW 컴퓨터 프로그램 (Thompson et al., Nucleic Acids Research, 1994, 2(22): 4673-4680)을 이용하여 결정할 수 있다. 서열 정렬시에 의문 및 대상 서열은 둘 다 DNA 서열이다. 상기 글로벌 서열 정렬의 결과는 동일성(％)로 나타낸다. 쌍별 정렬을 통한 동일성(％) 계산을 위해서 DNA 서열의 CLUSTALW 정렬에 사용되는 바람직한 변수는 다음과 같다: 매트릭스 = IUB, k-튜플(tuple) = 1, 탑 다이애거널(Top Diagonal)의 수 = 5, 갭 패널티 = 3, 갭 간격 패널티 = 10, 갭 연장 패널티 = 0.1. 다중 정렬의 경우, 하기하는 CLUSTALW 변수가 바람직하다: 갭 간격 패널티 = 10, 갭 연장 변수 = 0.05, 갭 분리 패널티 범위 = 8, 정렬 지연에 대한 동일성(％) = 40.

핵산은 온전한 세포 중에, 세포 용해물 중에, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 천연 환경에서는 통상적으로 결합된 다른 세포 성분을 정제해 낸 경우에 "단리" 또는 "실질적으로 순수"해진 것이다. 핵산을 단리하기 위해서, 하기와 같은 표준 기술을 이용할 수 있다: 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계 공지의 기타 기술.

TFPI의 특이적 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체

본 발명에서는 SEQ ID NO:1로 나타내는 바와 같은 인간 TFPI에 대한 특이적 결합성을 갖는 모노클로날 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항-TFPI 모노클로날 항체는 TFPI에 TFPI 리간드가 결합하는 것을 억제한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 항-TFPI 모노클로날 항체는 TFPI의 활성을 억제할 수 있다.

인간 조직 인자 경로 억제제의 에피토프에 결합하는 단리된 모노클로날 항체(SEQ ID NO:1)가 제공되며, 여기서 상기 에피토프는 쿠니츠 도메인 2의 잔기 1개 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 단리된 모노클로날 항체가 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:6에 나타낸 바와 같은 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 단리된 모노클로날 항체가 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:7에 나타낸 바와 같은 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 단리된 모노클로날 항체가 SEQ ID NO:2에 나타낸 바와 같은 경쇄와 SEQ ID NO:3에 나타낸 바와 같은 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 단리된 모노클로날 항체가 SEQ ID NO:6에 나타낸 바와 같은 경쇄와 SEQ ID NO:7에 나타낸 바와 같은 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 단리된 모노클로날 항체가 제공되는 것들과 실질적인 상동성을 갖는 경쇄 또는 중쇄를 포함할 수 있음도 고려된다. 예를 들어, 실질적인 상동성을 포함하는 단리된 모노클로날 항체가 1개 이상의 보존적 치환을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 인간 조직 인자 경로 억제제의 에피토프에 결합하는 단리된 모노클로날 항체(SEQ ID NO:1)가 제공되는데, 여기서 상기 에피토프는 SEQ ID NO:1의 Glu100, Glu101, Asp102, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Lys126, Gly128, Gly129, Cys130, Leu131, Gly132, 및 Asn133으로부터 선택되는 잔기를 1개 이상 및 이들의 조합물을 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Glu100를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Glu101를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Asp102를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Pro103를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Gly104를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Ile105를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Cys106를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Arg107을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Gly108를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Tyr109를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Lys126를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Gly128를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Gly129를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Cys130를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Leu131를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Gly132를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Asn133를 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Ile105 및 Asp102를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Ile105 및 Leu131를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Ile105, Asp102 및 Leu131를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 에피토프가 추가로 SEQ ID NO:1의 잔기 Glu100, Glu101, Pro103, Gly104, Cys106, Gly108, Tyr109, Lys126, Gly128, Gly129, Cys130, Leu131, Gly132, 또는 Asn133를 포함한다.

일부 실시양태에서, 인간 조직 인자 경로 억제제의 에피토프에 결합하는 단리된 모노클로날 항체(SEQ ID NO:1)가 제공되는데, 여기서 상기 에피토프는 SEQ ID NO:1의 Cys106과 Cys130 사이에 디술피드 가교에 의해 연결되는 2개의 아미노산 루프(loops)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 Glu100, Glu101, Asp102, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Lys126, Gly128, Gly129, Cys130, Leu131, Gly132, 및 Asn133으로 부터 선택되는 잔기를 1개 이상 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Ile105를 포함한다. 다른 실시양태로, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Asp102를 포함한다. 다른 실시 형태로, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Leu131를 포함한다. 그리고, 일부 실시양태에서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 Glu100, Glu101, Asp102, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Lys126, Gly128, Gly129, Cys130, Leu131, Gly132, 및 Asn133으로 부터 선택되는 잔기를 1개 이상 추가로 포함한다.

인간 조직 인자 경로 억제제의 에피토프에 결합하는 단리된 모노클로날 항체(SEQ ID NO:1)가 제공되는데, 여기서 상기 에피토프는 쿠니츠(Kunitz) 도메인 1의 잔기 1개 이상과 쿠니츠 도메인 2의 잔기 1개 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 단리된 모노클로날 항체가 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:8에 나타낸 바와 같은 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 단리된 모노클로날 항체가 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:9에 나타낸 바와 같은 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 단리된 모노클로날 항체가 SEQ ID NO:4에 나타낸 바와 같은 경쇄와 SEQ ID NO:5에 나타낸 바와 같은 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 단리된 모노클로날 항체가 SEQ ID NO:8에 나타낸 바와 같은 경쇄와 SEQ ID NO:9에 나타낸 바와 같은 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 단리된 모노클로날 항체가 제공되는 것들과 실질적인 상동성을 갖는 경쇄 또는 중쇄를 포함할 수 있음도 고려된다. 예를 들어, 실질적인 상동성을 포함하는 단리된 모노클로날 항체가 1개 이상의 보존적 치환을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 1의 잔기가 SEQ ID NO:1의 Asp31, Asp32, Gly33, Pro34, Cys35, Lys36, Cys59, Glu60 및 Asn62로부터 선택되는 잔기 1개 이상 및 이들의 조합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 1의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Asp31을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 1의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Asp32을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 1의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Gly33을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 1의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Pro34을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 1의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Cys35을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 1의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Lys36을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 1의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Cys59을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 1의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Glu60을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 1의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Asn62을 포함한다.

일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 1의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Pro34 및 Glu60을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 1의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Pro34 및 Lys36을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 1의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Pro34, Lys36 및 Glu60을 포함한다.

일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 SEQ ID NO:1의 Glu100, Glu101, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Phe114, Asn116, Glu123, Arg124, Lys126, Tyr127 및 Gly128 로부터 선택되는 잔기 1개 이상 및 이들의 조합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Glu100을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Glu101을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Pro103을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Gly104을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Ile105을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Cys106을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Arg107을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Gly108을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Tyr109을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Phe114을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Asn116을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Glu123을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Arg124을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Lys126을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Tyr127을 포함한다.

일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Arg107 및 Glu101을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Arg107 및 Tyr109을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Arg107, Glu101 및 Tyr109을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 SEQ ID NO:1의 잔기 Gly128을 포함한다.

일부 실시양태에서, 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 SEQ ID NO:1의 Asp102, Gly129, Cys130, Leu131, Gly132, 및 Asn133로부터 선택되는 잔기 1개 이상 및 이들의 조합물을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 단리된 모노클로날 항체가 Asp31, Asp32, Gly33, Pro34, Cys35, Lys36, Cys59, Glu60 및 Asn62로부터 선택된 잔기를 1개 이상 포함하는 쿠니츠 도메인 1의 잔기 및 Glu100, Glu101, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Phe114, Asn116, Glu123, Arg124, Lys126, Tyr127 및 Gly128로부터 선택된 잔기 1개 이상을 포함하는 쿠니츠 도메인 2의 잔기를 포함한다.

인간 조직 인자 경로 억제제의 에피토프에 결합하는 단리된 모노클로날 항체(SEQ ID NO:1)가 또한 제공되는데, 여기서 상기 에피토프는 SEQ ID NO:1의 Cys35와 Cys59 사이에 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 아미노산 루프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 에피토프가 쿠니츠 도메인 1의 잔기 1개 이상과 쿠니츠 도메인 2의 잔기 1개 이상을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 쿠니츠 도메인 1의 잔기가 SEQ ID NO:1의 Asp31, Asp32, Gly33, Pro34, Cys35, Lys36, Cys59, Glu60, 및 Asn62로부터 선택된 잔기를 1개 이상 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 SEQ ID NO:1의 Glu100, Glu101, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Phe114, Asn116, Glu123, Arg124, Lys126, Tyr127 및 Gly128 로부터 선택된 잔기를 1개 이상 포함한다.

또한, TFPI에 결합하기 위하여 본 명세서에 기재된 항체들 중 하나와 경쟁할 수 있는 항체가 제공된다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 항체들과 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 TFPI의 결합을 위하여 효과적으로 경쟁할 수 있다. 일부 실시양태에서, TFPI에 결합하는 단리된 모노클로날 항체로, 본 명세서에 기재된 단리된 모노클로날 항체들 중 하나와 경쟁적인 단리된 모노클로날 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 항체가 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:8에 나타낸 바와 같은 경쇄를 갖는 항체와 경쟁적이다. 일부 실시양태에서, 상기 항체가 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:9에 나타낸 바와 같은 중쇄를 갖는 항체와 경쟁적이다. 일부 실시양태에서, 상기 항체가 SEQ ID NO:2에 나타낸 바와 같은 경쇄 및 SEQ ID NO:3에 나타낸 바와 같은 중쇄를 갖는 항체와 경쟁적이다. 일부 실시양태에서, 상기 항체가 SEQ ID NO:4에 나타낸 바와 같은 경쇄 및 SEQ ID NO:5에 나타낸 바와 같은 중쇄를 갖는 항체와 경쟁적이다. 일부 실시양태에서, 상기 항체가 SEQ ID NO:6에 나타낸 바와 같은 경쇄 및 SEQ ID NO:7에 나타낸 바와 같은 중쇄를 갖는 항체와 경쟁적이다. 일부 실시양태에서, 상기 항체가 SEQ ID NO:8에 나타낸 바와 같은 경쇄; 및 SEQ ID NO:9에 나타낸 바와 같은 중쇄를 갖는 항체와 경쟁적이다.

또한, TFPI에 결합하기 위하여 본 명세서에 기재된 항체들 중 하나와 경쟁할 수 있는 이중특이적(bispecific) 항체가 제공된다. 예를 들어, 그러한 이중특이적 항체는 상기한 에피토프 1개 이상에 결합할 수 있다.

상기 항체는 종 특이적일 수 있거나 다중 종과 교차결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 항체가 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 개, 고양이 또는 기타 포유동물 종의 TFPI와 특이적으로 반응하거나 교차 반응할 수 있다.

상기 항체는 다양한 부류의 항체, 예로서 제한없이, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, 분비형 IgA, IgD, 및 IgE 항체, 중 어느 하나일 수 있다.

핵산, 벡터 및 숙주 세포

모노클로날 항체의 아미노산 서열이 제공되지만, 핵산 서열이 이들 모노클로날 항체 중 어느 하나를 코딩하도록 디자인될 수 있음이 고려된다. 그러한 폴리뉴클레오티드는 항-TFPI 항체의 경쇄 또는 중쇄를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 그러한 폴리뉴클레오티드가 분해성 연결기에 의해 분리되는 항-TFPI 항체의 경쇄와 중쇄를 둘 다 코딩할 수 있다. 또한, 상기 언급된 항체는 상기 모노클로날 항체 중 어느 하나를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터 및 그러한 벡터를 포함하는 숙주 세포를 사용하여 생산될 수 있다.

TFPI에 대한 항체의 제조 방법

모노클로날 항체는 숙주 세포에서 본 발명의 실시양태에 따른 모노클로날 항체의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현시켜 재조합 방식으로 생산될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 함유하는 핵산은 발현 벡터의 도움을 받아 이러한 생산에 적합한 숙주 세포로 형질감염되고 발현될 수 있다. 따라서, 인간 TFPI와 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 방법이 또한 제공되며, 이 방법은

(a) 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 핵산 분자를 숙주 세포에 형질감염시키는 단계,

(b) 숙주 세포를 배양하여 숙주 세포에서 모노클로날 항체가 발현되도록 하는 단계, 및 임의로

(c) 생성된 모노클로날 항체를 단리 및 정제하는 단계

를 포함하고, 여기서의 핵산 분자는 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

한 예에서, 항체 또는 그의 항체 단편을 발현시키기 위해, 표준 분자 생물학 기술로 수득된, 부분적 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 발현 벡터 내로 삽입하여 상기 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되게 한다. 이와 관련하여, 용어 "작동가능하게 연결된"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 이것들의 의도된 기능을 수행하도록, 항체 유전자가 벡터 내로 결찰되는 것(ligation)을 의미한다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 호환가능한 것을 선택한다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자를 별개의 벡터 내로 삽입할 수도 있고, 또는 보다 전형적으로는 이들 유전자 둘 다를 동일 발현 벡터 내로 삽입한다. 항체 유전자를 표준 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터상의 상보적 제한 부위의 결찰, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우에는 평활 말단 결찰)에 의해 발현 벡터 내로 삽입한다. 본원에 기재된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 사용하여, 이것들을 원하는 이소형의 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 이미 코딩하는 발현 벡터로 삽입하여 V_H 절편이 벡터 내 C_H 절편(들)에 작동가능하게 연결되게 하고 V_L 절편이 벡터 내 C_L 절편(들)에 작동가능하게 연결되게 함으로써 임의의 항체 이소형의 전장 항체 유전자를 생성할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 항체 쇄 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 쇄 유전자를 벡터 내로 클로닝하여 신호 펩티드가 항체 쇄 유전자의 아미노 말단에 프레임에 맞게(in-frame) 연결되도록 할 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.

항체 쇄 코딩 유전자에 추가하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 항체 쇄 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 보유한다. 용어 "조절 서열"은 항체 쇄 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함한다. 이러한 조절 서열은, 예를 들어 문헌 [Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)]에 기재되어 있다. 당업자는 조절 서열의 선택을 비롯한 발현 벡터의 디자인이 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있음을 인지할 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 조절 서열의 예는 포유동물 세포에서의 고수준 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 사이토메갈로바이러스 (CMV), 원숭이(Simian) 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 대안적으로, 비-바이러스 조절 서열, 예를 들어 유비퀴틴 프로모터 또는 ß-글로빈 프로모터를 사용할 수 있다.

항체 쇄 유전자 및 조절 서열에 추가하여, 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예를 들어 숙주 세포에서의 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기점) 및 선택가능한 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다 (예를 들어 미국 특허 제4,399,216호, 동 제4,634,665호 및 동 제5,179,017호 (모두가 악셀(Axel) 등) 참조). 예를 들어, 전형적으로, 선택가능한 마커 유전자는 벡터를 도입시킨 숙주 세포에 약물, 예컨대 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 선택가능한 마커 유전자의 예는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선택/증폭을 이용하여 dhfr- 숙주 세포에서 사용하기 위함) 및 neo 유전자 (G418 선택을 위함)를 포함한다.

경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)를 표준 기술에 의해 숙주 세포로 형질감염시킨다. 다양한 형태의 용어 "형질감염"은 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 외인성 DNA를 도입하는데 일반적으로 사용되는 다양한 기술, 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함한다. 본 발명의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키는 것이 이론상 가능하긴 하지만, 항체를 진핵 세포, 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에서 발현시키는 것이 가장 바람직한데, 이는 이러한 진핵 세포, 특히 포유동물 세포가 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 조립하고 분비하는데 있어서 원핵 세포보다 더 적합하기 때문이다.

재조합 항체를 발현시키는데 적합한 포유동물 숙주 세포의 예는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포) (예를 들어 문헌 [R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같이 DHFR 선택가능한 마커와 함께 사용되는, 문헌 [Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr- CHO 세포를 포함함), NSO 골수종 세포, COS 세포, HKB11 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 항체는 숙주 세포에서의 항체 발현 또는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지로의 항체 분비를 허용하기에 충분한 시간의 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생성된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법, 예컨대 한외여과, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 원심분리를 이용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.

무손상 항체를 발현시키기 위한 부분적 항체 서열의 사용

항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 CDR에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 밖의 서열보다 개개의 항체 사이에서 더 다양하다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열로 이식된 특정 천연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 작제함으로써 특정 천연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Riechmann, L. et al., 1998, Nature 332:323-327], [Jones, P. et al., 1986, Nature 321:522-525] 및 [Queen, C. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033] 참조). 이러한 프레임워크 서열은 생식세포계열(germline) 항체 유전자 서열을 포함하는 공개된 DNA 데이터베이스로부터 수득될 수 있다. 이들 생식세포계열 서열은, 이것들이 B 세포 성숙 동안의 V(D)J 연결에 의해 형성되는 완전하게 조립된 가변 유전자를 포함하지 않을 것이기 때문에 성숙 항체 유전자 서열과는 상이할 것이다. 원래의 항체와 유사한 결합 특성을 갖는 무손상 재조합 항체를 재생성하기 위해서 특정 항체의 전체 DNA 서열을 수득할 필요는 없다 (WO 99/45962 참조). 전형적으로, CDR 영역에 걸쳐 있는 부분적 중쇄 및 경쇄 서열이 이러한 목적에 충분하다. 부분적 서열을 사용하여 재조합된 항체 가변 유전자에 기여하는 생식세포계열 가변 및 연결 유전자 절편을 결정한다. 이후, 생식세포계열 서열을 사용하여 가변 영역의 손실 부분을 채운다. 중쇄 및 경쇄 리더 서열은 단백질 성숙 동안에 절단되고, 최종 항체의 특성에 기여하지 않는다. 이러한 이유로, 발현 작제물을 위한 상응하는 생식세포계열 리더 서열을 이용하는 것이 필요하다. 손실된 서열을 부가하기 위해, 클로닝된 cDNA 서열을 결찰 또는 PCR 증폭에 의해 합성 올리고뉴클레오티드와 조합시킬 수 있다. 대안적으로, 전체 가변 영역은 짧고 중복되는 올리고뉴클레오티드 세트로 합성되고 PCR 증폭으로 조합되어 전체적으로 합성 가변 영역 클론을 생성할 수 있다. 이러한 공정은 특정 제한 부위의 제거 또는 포함, 또는 특정 코돈의 최적화와 같은 특정의 장점을 갖는다.

중쇄 및 경쇄 전사체의 뉴클레오티드 서열은 합성 올리고뉴클레오티드의 중복되는 세트를 디자인하여 천연 서열과 동일한 아미노산 코딩 능력을 갖는 합성 V 서열을 생성하는데 사용된다. 합성 중쇄 및 경쇄 서열은 3가지 방식에서 천연 서열과 상이할 수 있다: 올리고뉴클레오티드 합성 및 PCR 증폭을 용이하게 하기 위해서 반복된 뉴클레오티드 염기의 스트링이 개재됨, 코작(Kozak) 규칙 ([Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870])에 따라 최적의 번역 개시 부위가 혼입됨, 및 제한된 엔도뉴클레아제 부위가 번역 개시 부위의 상류로 조작됨.

중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 다의 경우에, 최적화된 코딩 및 상응하는 비-코딩 가닥 서열은 상응하는 비-코딩 올리고뉴클레오티드의 중간 정도에서 30개 내지 50개 뉴클레오티드 분절로 절단된다. 따라서, 각 쇄마다 올리고뉴클레오티드는 150개 내지 400개 뉴클레오티드의 절편에 걸쳐 있는 중복된 이중 가닥 세트로 조립될 수 있다. 이후, 상기 풀(pools)을 주형으로 사용하여 150개 내지 400개 뉴클레오티드의 PCR 증폭 생성물을 생산한다. 전형적으로, 단일 가변 영역 올리고뉴클레오티드 세트는, 별도로 증폭되어 2종의 중첩된 PCR 생성물을 생산하는 2종의 풀로 나뉠 것이다. 이후, 이들 중복 생성물은 PCR 증폭으로 조합되어 완전 가변 영역을 형성한다. 또한, PCR 증폭시에 중쇄 또는 경쇄 불변 영역의 중복된 단편을 포함시켜서 발현 벡터 작제물로 쉽게 클로닝될 수 있는 단편을 생성시키는 것이 바람직할 수 있다.

이후, 다시 작제된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 클로닝된 프로모터, 번역 개시, 불변 영역, 3' 비-번역, 폴리아데닐화, 및 전사 종결 서열과 조합하여 발현 벡터 작제물을 형성한다. 중쇄 및 경쇄 발현 작제물을 단일 벡터 내로 조합하여 숙주 세포로 동시에 형질감염시키거나 연속 형질감염시키거나 별도로 형질감염시킬 수 있고, 이것은 이후에 융합되어 2종의 쇄 모두를 발현시키는 숙주 세포를 형성한다.

따라서, 또다른 양태로, 인간 항-TFPI 항체의 구조적 특징을 이용하여 TFPI에 대한 결합 기능을 보유하는, 구조적으로 관련이 있는 인간 항-TFPI 항체를 생성한다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 모노클로날 항체의 구체적으로 확인된 중쇄 및 경쇄 영역의 1개 이상의 CDR은 공지의 인간 프레임워크 영역 및 CDR과 재조합 방식으로 조합되어 재조합 방식으로 조작된 본 발명의 추가의 인간 항-TFPI 항체를 생성할 수 있다.

약제학적 조성물

또한, 치료 유효량의 항-TFPI 모노클로날 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. "약제학적으로 허용되는 담체"는 제제를 제제화하거나 또는 안정화시키는 것을 돕기 위해서 활성 성분에 추가될 수 있는 물질이고, 환자에게 유의한 해로운 독성 효과를 야기하지 않는다. 이러한 담체의 예는 당업자에게 공지되어 있으며, 물, 당, 예컨대 말토스 또는 수크로스, 알부민, 염, 예컨대 염화나트륨 등을 포함한다. 다른 담체는 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin)]에 기재되어 있다. 이러한 조성물은 치료 유효량의 1종 이상의 항-TFPI 모노클로날 항체를 함유할 것이다. 일부 실시양태에서, 그러한 조성물이 치료 유효량의 항-TFPI 모노클로날 항체 1종 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물이 상기 기재된 바와 같은 쿠니츠 도메인 1에 특이적으로 결합하는 항체와 상기 기재된 바와 같은 쿠니츠 도메인 1 및 2에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.

약제학적으로 허용되는 담체는 멸균 주사가능한 용액제 또는 분산액제를 즉각 투여용(extemporaneous)으로 제조하기 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 조성물은 바람직하게는 비경구 주사용으로 제제화된다. 조성물은 용액제, 마이크로에멀젼제, 리포좀제, 또는 높은 약물 농도에 적합한 기타 주문된 구조물로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이것들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 일부 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시킬 것이다.

멸균 주사가능한 용액제는 필요한 양의 활성 화합물을 필요에 따라 상기 기재된 성분들 중 1종 또는 이것들의 조합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후에 멸균 마이크로여과를 수행하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액제는 활성 화합물을 기본적인 분산 매질 및 상기 기재된 것들로부터의 기타 필요한 성분을 함유하는 멸균 비히클로 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사가능한 용액제를 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 일부 제조 방법은 활성 성분 및 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 이것의 미리 멸균-여과시킨 용액으로부터 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)이다.

약제학적 용도

모노클로날 항체는 응고에 있어서의 유전적 및 후천적 결핍 또는 결함을 치료하기 위한 치료 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 기재된 실시양태에서의 모노클로날 항체는 TFPI와 FXa의 상호작용을 차단하거나 TF/FVIIa 활성의 TFPI-의존적 억제를 방지하는데 사용될 수 있다. 추가로, 모노클로날 항체는 또한 TF/FVIIa-구동된 FXa의 생성을 복구시켜서 FXa의 FVIII- 또는 FIX-의존적 증폭의 부족을 우회시키는데 사용될 수도 있다.

모노클로날 항체는 지혈 장애, 예컨대 혈소판감소증, 혈소판 장애 및 출혈 장애 (예를 들어, 혈우병 A 및 혈우병 B)의 치료에서 치료 용도를 갖는다. 이러한 장애는 치료 유효량의 항-TFPI 모노클로날 항체를 이러한 장애의 치료가 필요한 환자에게 투여함으로써 치료될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 외상 및 출혈성 졸증(stroke)과 같은 적응증에서의 제어되지 않는 출혈의 치료에서 치료 용도를 갖는다. 따라서, 또한, 치료 유효량의 본 발명의 항-TFPI 모노클로날 항체를 출혈 시간을 단축시킬 필요가 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 출혈 시간을 단축시키는 방법이 제공된다.

항체는 지혈 장애를 해결하기 위해 단일요법으로서 또는 다른 요법과 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 1종 이상의 항체 및 혈액 응고 인자, 예컨대 인자 VIIa, 인자 VIII 또는 인자 IX의 공동 투여는 혈우병 치료에 유용하다고 여겨진다. 한 실시양태에서, (a) 인간 조직 인자 경로 억제제에 결합하는, 제1 양의 모노클로날 항체, 및 (b) 제2 양의 인자 VIII 또는 인자 IX를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 제1 및 제2 양은 함께 응고에 있어서의 유전적 및 후천적 결핍 또는 결함의 치료에 효과적인, 응고에 있어서의 유전적 및 후천적 결핍 또는 결함을 치료하는 방법이 제공된다. 또다른 실시양태에서, (a) 인간 조직 인자 경로 억제제에 결합하는, 제1 양의 모노클로날 항체, 및 (b) 제2 양의 인자 VIII 또는 인자 IX를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 제1 및 제2 양은 함께 응고에 있어서의 유전적 및 후천적 결핍 또는 결함의 치료에 효과적이고, 추가로 여기서 인자 VII은 공동 투여되지 않는, 응고에 있어서의 유전적 및 후천적 결핍 또는 결함을 치료하는 방법이 제공된다. 본 발명은 또한 본 발명의 모노클로날 항체 및 인자 VIII 또는 인자 IX의 치료 유효량의 조합물을 포함하고 인자 VII은 함유하지 않는 약제학적 조성물을 포함한다. "인자 VII"는 인자 VII 및 인자 VIIa를 포함한다. 이러한 조합 요법은 혈액 응고 인자의 필요한 주입 빈도를 감소시킬 수 있다. 동시 투여 또는 조합 요법은, 각각 별도로 제제화되거나 하나의 조성물 중에 함께 제제화된 2종의 치료 약물의 투여를 의미하고, 별도로 제제화된 경우에는 대략 동일한 시간에 또는 상이한 시간이지만 동일한 치료 기간에 걸쳐서 투여된다.

약제학적 조성물은 혈우병 A 또는 B로 고통받는 대상체에게 출혈 에피소드의 중증도에 따라 달라질 수 있거나 예방 요법의 경우에는 환자의 혈액 응고 결핍의 중증도에 따라 달라질 수 있는 투여량 및 빈도로 비경구 투여될 수 있다.

상기 조성물은 필요에 따라 볼루스로서 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, Fab 단편으로 제시되는 본 발명의 항체의 볼루스 투여는 0.0025 내지 100 mg/kg 체중, 0.025 내지 0.25 mg/kg, 0.010 내지 0.10 mg/kg 또는 0.10 내지 0.50 mg/kg의 양일 수 있다. 연속 주입의 경우, Fab 단편으로 제시되는 본 발명의 항체는 0.001 내지 100 mg/kg 체중/분, 0.0125 내지 1.25 mg/kg/분, 0.010 내지 0.75 mg/kg/분, 0.010 내지 1.0 mg/kg/분 또는 0.10 내지 0.50 mg/kg/분으로 1시간 내지 24시간, 1시간 내지 12시간, 2시간 내지 12시간, 6시간 내지 12시간, 2시간 내지 8시간, 또는 1시간 내지 2시간의 기간 동안 투여될 수 있다. 전장 항체 (완전 불변 영역을 가짐)로 제시되는 본 발명의 항체를 투여하는 경우, 투여량은 약 1 내지 10 mg/kg 체중, 2 내지 8 mg/kg, 또는 5 내지 6 mg/kg일 수 있다. 이러한 전장 항체는 전형적으로 30분 내지 3시간의 기간 동안 지속되는 주입을 통해 투여된다. 투여 빈도는 상태의 중증도에 따라 달라진다. 빈도는 1주 당 3회 내지 매 2주 또는 3주 마다 1회의 범위일 수 있다.

추가로, 조성물은 피하 주사를 통해 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 10 내지 100 mg 투여량의 항-TFPI 항체가 매주, 격주 또는 매달 피하 주사를 통해 환자에게 투여될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "치료 유효량"은 생체내 혈액 응고 시간을 효과적으로 증가시키거나 또는 필요한 환자에게 생체내 측정가능한 이점을 야기하는데 요구되는, 항-TFPI 모노클로날 항체 또는 이러한 항체 및 인자 VIII 또는 인자 IX의 조합물의 양을 의미한다. 정확한 양은 치료 조성물의 성분 및 물리적 특징, 의도된 환자 집단, 개개의 환자의 고려사항 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 수많은 인자에 따라 달라질 것이고 당업자가 쉽게 결정할 수 있다.

실시예

실시예 1. 이. 콜라이(E. coli)로부터 재조합 TFPI(쿠니츠 도메인 2)의 발현 및 정제.

발현 시스템

pD Eco5 N으로 표시되는 데스티네이션 벡터 (destination vector; Gateway 명명법에 따름)를 이용하였다. pD Eco5 N은 pET-16b (Novagen)를 기본으로 하며, 추가로 His₁₀ 및 NusA tag 뿐만 아니라 His₁₀/NusA 및 당해 단백질로 이루어진 융합 단백질의 발현용 Gateway 클로닝 카세트를 코딩한다.

쿠니츠 도메인 2의 N-말단에 융합되어 있는 트롬빈 절단 부위 (Lys93 내지 Phe154, Uniprot 10646 참조)와 Gateway 부착 부위 (attB1-5#, attB2-3#, Invitrogen)를 코딩하는 TFPI 작제물을 pD Eco5 N 벡터중으로 클로닝시켜 pD Eco5 N TFPI KD2로 표시되는 발현 벡터를 생성시켰다. BL21 DE3 (Novagen) 발현 균주를 사용하였다.

pD Eco5 N TFPI KD2, 600AA를 사용하여 발현시킨 융합 단백질의 아미노산 서열

서열 성분

링커/번역된 엔도뉴클레아제 제한 부위:

TSGS GLE

번역된 att-부위:

TSLYKKA GS

트롬빈 부위: LVPRGS

발현

pD Eco5 N #209로 형질전환시킨 BL21 DE3 균주를 200 ㎍/㎖ 암피실린이 있는 2x50 ㎖ LB 배지에서 프리컬쳐(pre-culture)로서 14시간 동안 37℃에서 180 rpm의 교반 속도로 성장시켰다. 다음, 400 ㎖의 Circlegrow 배지 (Q-Biogene)가 들어있는, 8개의 진탕 플라스크 각각을 상기 프리컬쳐 8 ㎖로 접종시키고 37℃에서, 180 rpm의 교반 속도로 배양시켰다. 컬쳐 밀도가 OD600일 때, IPTG (100 mM 최종 농도)를 유전자 도입을 위하여 가하고 17℃에서 24시간 동안 180 rpm으로 추가로 배양시켰다. 원심분리(3000 g, 10분)시켜 상기 이. 콜라이를 펠릿화하여 -80℃에 보관하였다.

정제

3.2ℓ의 컬쳐로부터 펠릿화된 이. 콜라이 매스를 200 ㎖의 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 10%(w/w) 글리세롤, 40 mM 이미다졸, 프로테아제 억제제 칵테일 완전 EDTA-유리(Roche))에 다시 현탁시키고, 고압 장치(Microfluidics)에서 균질화시켜 이후 용해물을 원심분리시켰다 (100,000g, 60분, 4℃). Akta Explorer 시스템을 사용하여 여러 개의 정제 단계를 수행하였다. 농축된 샘플을 Hi-Trap-Sepharose HP 매트릭스(GE)의 2개의 연결된 5 ㎖ 유니트로 초기 IMAC 크로마토그래피 단계에 인가하였다. 평형, 융합 단백질 결합 및 Hi-Trap-Sepharose HP 매트릭스의 세척을 완충액 A (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 40 mM 이미다졸)을 사용하여 수행하였다. NusA-TFPI 융합 단백질을 용출시키기 위하여, 완충액 B(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl)중, 40 mM에서 부터 500 mM 까지의 선형 구배의 이미다졸을 사용하였다. 용출 분획을 모아(pooled) 농축시키고 (Amicon 한외여과 장치를 사용하여 6-7의 팩터로) 상기 완충액을 Tris HCl pH 8.0으로 교체시켰다. 상기 농축된 샘플 (6-7 ㎖)을 Tris HCl pH 8.0중의 Sephacryl-100 (XK26/74)을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피에 추가로 인가하였다. 융합 단백질을 함유하는 주 피크의 분획을 모으고, 한외여과(Amicon)에 의해 5 ㎖ 용적으로 농축시켰다. 트롬빈(HTI)을 상기 샘플에 가하고 (효소:융합 단백질 비율, 1:50 w/w), 5시간 동안 21℃에서 배양시킨 다음 PMSF (1 mM 최종 농도)로 반응을 최종적으로 중단시켰다. 이어서, 2차 크기 배제 크로마토그래피 단계 (Tris HCl pH 8.0 중 Sephacryl-100 (XK26/74))를 수행하고 PAGE로 피크 분획을 모니터하였다. 유리 단량체 TFPI 쿠니츠 도메인 2를 함유하는 분획을 수거하고 농축시켜 (Amicon), 3.2ℓ의 이. 콜라이 컬쳐로부터 약 4 ㎎의 생성물을 수득하였다.

실시예 2. TFPI에 대한 재조합 모노클로날 항체 Fab A의 생산, 이. 콜라이중에서의 발현 및 이의 정제

발현

발현 벡터 pET28a 및 이. 콜라이 균주 BL21 Star DE3을 사용하여 Fab A를 동시에 발현시켰다. 발현 벡터상에 코딩되는 경쇄 및 중쇄 영역을 각각 주변세포질 신호 서열로 이의 N-말단에서 융합시켰다. 상기 중쇄 영역은 또한 Fab의 정제를 위하여 이의 C-말단 His6 tag에서 코딩시켰다. TB-Instant 일야 발현 배지에서 성장시킨 형질전환된 이. 콜라이 균주를 재조합 단백질 발현의 자기유도를 위하여 사용하였다 (#71491, Novagen). 간략해서 설명하면, 10 ㎖의 형질전환된 이. 콜라이 컬쳐 (50 ㎖ Falcon 시험관)를 가나마이신 30 ㎍/㎖가 들어 있는 LB 배지에서 프리컬쳐로 14시간 동안 37℃에서 180 rpm으로 교반시키며 성장시켰다. 이어서, 500 ㎖ TB-Instant 일야 발현 배지가 있는 에를렌마이어 플라스크 4개를 각각 상기 프리컬쳐 2 ㎖로 접종시키고 30℃, 180 rpm에서 24시간 동안 배양시켰다. 컬쳐를 10℃의 10,000g에서 30분간 원심분리시키고 Fab를 함유하는 상등액은 추가 단백질 정제를 위하여 즉시 사용하거나 -20 내지 -80℃에서 보관하였다.

대안적으로, 10ℓ의 생물반응기(Sartorius)에서 발현 벡터 pET28a 및 이. 콜라이 균주 BL21 Star DE3을 사용하여 Fab를 발현시켰다. 500 ㎖의 형질전환된 이. 콜라이 컬쳐를 가나마이신 30 ㎍/㎖가 들어 있는 LB 배지에서 17시간 동안 37℃에서 165 rpm으로 교반시키며 성장시킨 후, 10ℓ의 자기유도 배지가 들어 있는 교반되는 생물반응기를 접종시키는데 사용하였다. 상기 자기유도 배지는 리터당 다음과 같은 성분을 함유하고 있다: 12 g의 트립톤, 24 g의 효모 추출물, 9.9 g의 글리세롤(87%), 12.54 g의 K2HPO4, 2.31 g의 KH2PO4, 0.25 g의 MgSO4 x 7H2O, 1 g의 글루코오스, 2.5 g의 락토오스, 30 ㎎의 가나마이신. 생물반응기를 사용한 배양을 24시간 동안 수행(30℃에서, 350-최대 800 rpm으로)한 다음, 원심분리기(Heraeus)에서 원심분리에 의해 바이오매스를 제거함으로써 상기 컬쳐 상등액을 하베스트하였다.

정제

상기 Fab를 Akta Explorer 10s 장치를 사용하여 2단계 크로마토그래피 공법을 사용하여 정제하였다. 중공 섬유 모듈 (10 kDa 컷-오프 역치)를 인가하여 1ℓ의 등명한 컬쳐 상등액을 최종 용적 100 ㎖로 농축시키고 완충액 A (50 mM Na-인산염 pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸)를 사용하여 완충액 조성물로 평형화시켰다. Akta Explorer 시스템을 사용한 초기 IMAC 크로마토그래피 단계에서는, 상기 농축된 샘플을 5 ㎖ Ni-NTA 슈퍼플로우 매트릭스(Qiagen)에 인가하였다. 평형화, 샘플 결합 및 Ni-NTA 매트릭스의 세척을 완충액 A를 사용하여 수행하였다 (결합은 21℃에서 수행하였으며, 다른 모든 크로마토그래피 단계는 4℃에서 수행한다). Fab 용출을 위하여, 완충액 A 중 10mM로부터 250mM까지의 선형 구배의 이미다졸을 사용하였다. 단일 용출 피크로부터의 분획을 모으고 (60 ㎖, 전체 용적) 한외여과에 의해 10 ㎖로 농축시켜 Hi-Prep26/10 탈염 컬럼을 사용하여 상기 완충액을 PBS pH 7.4로 조절하였다. 이어서, PBS로 평형화시킨, 2 ㎖의 항 카파 경쇄 항체 매트릭스 (Kappa Selet Affinity Media, 0833.10 BAC로부터)를 상기 농축된 IMAC 용출액과 실온의 교반하에서 1시간 동안 배양시켰다. 결합된 샘플이 있는 매트릭스를 크로마토그래피 컬럼으로 옮기고 PBS로 세척하였다. Fab 샘플을 2 ㎖의 글리신 pH 2.0으로 용출시키고, 1M HEPES pH 7.5로 중화시킨 다음 PD10 탈염 컬럼 (GE, 17-0851-01)으로 완충액을 PBS로 조절하였다.

10ℓ의 생물반응기(Sartorius)를 사용하여 이. 콜라이에서 Fab를 발현시켰을 때 다음과 같은 정제 공정을 사용하였다. 원심분리시킨 컬쳐 상등액을 연속해서 기공 크기가 5 및 0.2 ㎛인 2개의 1회용 필터 모듈(GE, KMP-HC-9204TT; KGF-A-0504TT)을 통하여 여과시켰다. 중공 섬유 모듈 (10 kDa 컷-오프 역치)를 인가하여 등명한 컬쳐 상등액을 최종 용적 1500 ㎖로 농축시키고 완충액 A를 사용하여 완충액 조성으로 조절하였다. 25 ㎖ Ni-NTA 슈퍼플로우 매트릭스(Qiagen, 완충액 A중에 평형화시킨 것)를 상기 농축된 샘플에 가하고 1.5시간 동안 21℃에서 배양시켰다. 결합된 샘플이 있는 매트릭스를 비어있는 크로마토그래피 컬럼(25x125 mm)으로 옮겨, Akta Explorer 크로마토그래피 장치에 연결하고 완충액 A (대략 250 ㎖)로 세척하였다. Fab를 용출시키기 위하여, 5%(30 ㎖) 및 10%(35 ㎖) 완충액 B인 2개의 연속 단계 구배, 이어서 100% 완충액 B까지의 선형 용출 구배를 인가하였다. 모은 용출 분획(72 ㎖)을 다음과 같이 연속해서 처리하였다: 원심분리 한외여과 장치(컷-오프 10 kDa, Amicon)을 사용하여 최종 용적 20 ㎖로 농축시킴, 탈염 컬럼 (GE HiPrep, 26/10)에 3회로 나누어 인가하여 완충액을 PBS pH 7.4로 조절, 및 원심분리 한외여과 장치(Amicon)에서 최종 용적 40 ㎖로 추가 농축시킴. 상기 농축된 샘플을 5 ㎖의 항 카파 경쇄 항체 매트릭스 (Kappa Select Affinity Media, BAC, PBS로 평형화시킨 것)와 함께 1시간 동안 실온의 교반하에서 배양시켰다. 결합된 샘플이 있는 세파로오스 매트릭스를 크로마토그래피 컬럼으로 옮기고 다음 순서의 세척 단계로 처리하였다: 15 ㎖의 PBS로 4회; 5 ㎖의 세척용 완충액 (100 mM Na-인산염 pH 6.0, 100 ㎖ NaCl, 500 mM 아르기닌)으로 2회. 용출 단계는 완충액 100 mM 글리신 HCl pH 3.0을 5 ㎖ 인가하는 것 3회로 이루어져 있다. 용출액은 1M Tris HCl pH 8.0으로 즉시 중화시키고 형성된 침전물은 원심분리(10분, 3,200g)로 제거하였다. 샘플은 한외여과(Amicon)로 농축시키고 TBS 완충액을 사용하는 Akta Explorer 크로마토그래피 시스템상의 Superdex-75 prep 등급 16/60 컬럼에 인가하였다. 피크 분획을 PAGE로 분석하였고 1.1 몰비로 Fab 의 중쇄와 경쇄를 나타내는 분획을 모아 한외여과(Amicon)에 의해 최종 용적 1 ㎖로 다시 농축시켰다. 약 4 ㎎의 Fab A가 10ℓ의 이. 콜라이 컬쳐 상등액으로부터 단리되었다.

분석적 크기 배제 크로마토그래피 (Akta Micro system, S75 5/150 컬럼, 100 mM Tris, HCl, pH 7.5)를 사용하여 Fab A/TFPI KD2 복합체 형성을 증명하였다. 따라서, Fab A, TFPI KD2 및 Fab A+TFPI KD2의 혼합물을 따로 분석하였다 (도 1).

실시예 3. TFPI-Fab A 복합체의 결정화 및 X-선 구조 결정

결정화

TFPI 쿠니츠 도메인 2와 모노클로날 항체 Fab A의 공결정(co-crystal)을 씨팅-드롭 방법(sitting-drop method)을 사용하여 20℃에서 성장시켰다. 상기 단백질 복합체를 9 ㎎/㎖로 농축시키고 등용적의 단백질 용액과 침전제로서 숙성 용액(15% PEG8000, Tris HCl pH 7.5)을 혼합시켜 결정화시켰다. 1일 후 결정이 출현하였다.

데이타 수집 및 가공

결정을 한랭-보호를 위하여 결정화 완충액중 30% 글리세롤중에서 액체 질소로 플래쉬-동결시켰다. 데이타는 MAR CCD 검출기상의 빔라인 BL14.1, BESSY 싱크로트론 (Berlin)에서 수집하였다. 데이타를 지수화하여 XDS (W. Dabsch(2010) Acta Cryst. D66, 125-132) 또는 IMOSFLM (The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography(1994) Acta Cryst. D50, 760-763; A.G.W. Leslie, (1992), Joint CCP4+ESF-EAMCB Newsletter on Protein Crystallography, No.26)로 통합하고, POINTLESS (P.R. Evans, (2005) Acta Crys. D62, 72-82)로 스케일화를 위하여 준비시킨 다음, SCALA (P.R. Evans, (2005) Acta Cryst. D62, 72-82)로 스케일화하였다. 결정이 2.6Å까지 회절되어 셀 상수 a=65.7, b=114.7, c=151.9; α=β=γ=90°인, 공간 그룹 P2₁2₁2₁, 및 2개의 TFPI-Fab 복합체를 비대칭 유니트에 갖게 되었다.

구조 결정 및 정화(refinement)

TFPI 쿠니츠 도메인 2와 모노클로날 항체 Fab 공동-구조(co-structure)를 PHASER (A.J. McCoy et al. (2007) J. Appl. Cryst. 40, 658-674)와 서치 모델로서 TFPI 쿠니츠 도메인 2(pdb code 1tfx) 및 Fab 단편(pdb code 3mxw)의 공개된 X-선 구조를 사용하여 분자 치환에 의해 풀었다. 분자 치환전에, 상기 Fab 모델 서열은 CHAINSAW (N. Stein, (2008) J. Appl. Cryst. 41, 641 - 643)로 변형시켰다. COOT (P. Emsley et al. (2010) Acta Cryst. D66:486-501)를 사용한 반복적인 라운드로 모델을 빌딩하고 REFMAC5.5 (G.N. Murshudov et al. (1997) Acta Cryst. D53, 240-255) 를 사용하여 최대 우도 정화시킴으로써 모델을 완성하였다. KD2의 영역 Phe A 31 - Asn A 35, Pro B 9, Lys M 139 - Ser M 142, 및 Asp140 - Phe154는 약한 전자 밀도를 나타냈으며 모델에 포함되지 않았다. 데이타 세트와 정화 통계치가 표 1에 요약되어 있다.

표 1. TFPI-Fab A 복합체에 대한 데이타 세트 및 정화 통계치.

실시예 4. Fab A의 X-선 구조-기본의 에피토프 맵화

TFPI-Fab A의 복합체 (도 2)를 비대칭 유니트당 상기 복합체의 카피 2개로 결정화하였다. 상기 복합체의 주쇄는 관련 TFPI 에피토프에 결합되어 있는 각각의 Fab와 0.7Å의 전체적인 평균평방근편차(RMSD)를 갖고 중첩된다. Fab A와 접하고 있는 TFPI의 잔기(에피토프)와 각각의 묻혀있는 표면을 CCP4 프로그램 AREAIMOL (P.J. Briggs (2000) CCP4 Newsletter No. 38)으로 분석하였다. 최소 5Å² 묻혀있는 표면 또는 50% 이상 묻혀있는 표면을 갖는 잔기는 접하고 있는 것으로 판단되었다 (표 2). TFPI와 접하고 있는 Fab A의 잔기(파라토프)와 각각의 묻혀있는 표면을 AREAIMOL로 분석하였다. 최소 5Å² 묻혀있는 표면 또는 50% 이상 묻혀있는 표면을 갖는 잔기는 접하고 있는 것으로 판단되었다 (표 3).

표 2: Fab A와 접하고 있는 TFPI의 잔기. C 및 D 쇄는 비대칭 유니트중 각 복합체의 TFPI에 대응한다.

표 3: TFPI와 접하고 있는 Fab A의 잔기. A, B 쇄 및 L, M 쇄는 비대칭 유니트중 각 복합체의 Fab A경쇄 및 중쇄를 나타낸다.

Fab A에 의해 인식되는 비-선형 에피토프는 영역 Glu100 - Arg109 및 Lys126, Gly128 - Asn133로 정의된다. Fab A 중의 파라토프는 경쇄(lc) 잔기 lc_Tyr37, lc_Tyr96, lc_Asp97, lc_Ser98, lc_Tyr99, 및 lc_Leu101 와 중쇄(hc) 잔기 hc_Asn32, hc_Ser33, hc_Ala35, hc_Ile52, hc_Tyr54, hc_Arg56, hc_Lys58, hc_Tyr60, hc_Arg62, hc_Trp102, hc_Ser104, hc_Asp105, 및 hc_Trp108 를 포함한다. CDR-L3, CDR-H2, 및 CDR-H3은 접촉수를 기준으로 할 때, 주요 상호작용 부위인 것으로 나타난다.

상기 에피토프는 Cys106과 Cys130 사이에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 루프로 이루어져 있다 (도 3). 상기 디술피드 가교는 CDR-H3의 hc_Trp108에 대해 스택되는 반면, 인접한 Ile105와 Leu131은 hc_Ala35, hc_Ile52, hc_Tyr54 (CDR-H2), hc_Trp102 (CDR-H3), 및 lc_Tyr96, lc_Ser98, lc_Tyr99, lc_Leu101 (CDR-L3)에 의해 생성된 소수성 클레프트(cleft)에 묻혀있다. 접촉수를 기준으로 할 때, Ile105와 Leu131이 CDR-L3, CDR-H2, 및 CDR-H3과의 소수성 접촉에 있어서 중요한 에피토프 잔기이다.

TFPI 영역 Glu101-Ile105는 CDR-H2와 상호작용한다. 계면은 hc_Tyr54, hc_Tyr60, 및 hc_Arg62에 의해 강하게 특징화된다. Hc_Tyr54는 Asp102의 측쇄와의 극성 상호작용을 나타낸다. Hc_Tyr60은 Glu101의 주쇄 카르보닐 산소와 극성 상호작용을 나타내고 hc_Arg62는 Asp102의 측쇄 및 Gly132의 주쇄 카르보닐 산소와 상호작용을 나타낸다.

Asp102는 CDR-H2 hc_Tyr54 및 hc_Arg62와의 극성 상호작용에 있어서 중요한 에피토프 잔기이다. Fab A 중의 야생형 hc_Asp62를 아르기닌으로 치환시키면 친화도가 120배 증가한다. X-선 구조를 기준으로 할 때, 이는 ha_Asp62와 Asp102 사이의 반발로부터 hc_Arg62와 Asp102, 및 주쇄 카르보닐 산소의 극성 상호작용으로의 스위치에 의해 설명될 수 있다.

Arg107의 구아니디늄기는 각각 CDR-H1 및 CDR-H3의 hc_Asn32와 hc_Asp105의 측쇄와 직접 상호작용한다. Arg107은 인자 Xa의 억제에 있어서 필수적인 것으로 밝혀졌다(M.S. Bajaj et al. (2001) Thromb Haemost 86(4):959-72.). Fab A는 이런 중요한 잔기를 차지하고 있으며 인자 Xa를 억제하는데 있어서 Arg107과 경쟁한다.

실시예 5. Fab A와 이의 최적화된 변이체 Fab C의 파라토프 비교

Fab A의 최적화된 변이체인 Fab C에 의한 TFPI 에피토프 결합의 일관성을 평가하기 위하여, Fab C의 경쇄 및 중쇄 (도 11A) 및 상동성 모델의 서열 정렬을 Fab C중 Fab A 파라토프 잔기의 보존에 대해 분석하였다. 상동성 모델은 입력 주형 구조로서 우리의 TFPI-Fab A X-선 구조를 사용하여 DS MODELER (ACCELRYS, Inc; Fiser, A. and Sali A. (2003) Methods in Enzymology, 374:463-493)로 계산하였다. 상동성 모델은 RMSD < 0.5 Å인 Fab A와 비교하여 거의 동일한 골격 구조(backbone conformation)를 나타낸다. TFPI-Fab A 복합체에서 관찰된 20개의 파라토프 잔기중에서, hc_Asn32가 유일한 파라토프 잔기로서 아스파르테이트 잔기가 각 위치에 있는 Fab C와 구별된다 (도 11). Hc_Asn32는 TFPI Arg107과 상호작용한다. Fab C의 Asp32는 이의 카르복실레이트기와 장래의 Arg107의 구아니디늄기와의 상호작용을 고려할 때 TFPI와 더욱 강하게 상호작용해야 한다. Fab A와 Fab C 파라토프 잔기간의 높은 서열 보존 및 기대되는 동일한 골격 구조를 기준으로 할 때, Fab C는 Fab A와 동일한 TFPI 에피토프를 인식하는 것 같다.

실시예 6. TFPI-인자 Xa 상호작용의 억제에 대한 X-선 구조-기본 이유

Fab A는 TFPI-인자 Xa 상호작용 및 억제를 처리한다. TFPI-Fab A 복합체와 TFPI-트립신 구조의 중첩(M.J. Burgering et al(1997) J Mol Biol.269(3):395-407)은 Fab A 에피토프를 함유하는 TFPI 영역이 트립신과의 상호작용에 있어서 중요하며, 이는 인자 Xa에 대한 대용체임을 나타낸다. X-선 구조를 기준으로 할 때, 쿠니츠 도메인 2상에서 관측된 에피토프로의 Fab A의 결합은 입체 장애에 의해 인자 Xa의 결합을 배제시켜야 한다 (도 4).

실시예 7. 재조합 TFPI(쿠니츠 도메인 1+2)의 생산, 이. 콜라이(E. coli)에서의 발현 및 이의 정제

발현 시스템

pD Eco5 N으로 표시되는 데스티네이션 벡터 (destination vector; Gateway 명명법에 따름)는 pET-16b (Novagen)를 기본으로 한다. 상기 벡터는 또한 His₁₀ 및 NusA tag 뿐만 아니라 His₁₀/NusA 및 당해 단백질로 이루어진 융합 단백질의 발현용 Gateway 클로닝 카세트를 코딩한다.

쿠니츠 도메인 1+2의 N-말단에 융합되어 있는 TEV 프로테아제 절단 부위 (Asp1 내지 Phe154, Uniprot 10646 참조, 성숙 TFPI 알파)와 Gateway 부착 부위 (attB1-5#, attB2-3#, Invitrogen)를 코딩하는 DNA 작제물을 pD Eco5 N 벡터중으로 클로닝시켜 pD Eco5 N TFPI KD1+2로 표시되는 발현 벡터를 생성시켰다. BL21 DE3 (Novagen)을 발현 균주로 사용하였다.

pD Eco5 N TFPI KD1+2, 600AA를 사용하여 발현시킨 융합 단백질의 아미노산 서열

서열 699 AA; 78579 MW; 4D2932FF7C1E3F7E CRC64;

서열 성분

링커/번역된 엔도뉴클레아제 제한 부위: TSGS GLE

번역된 att-부위: TSLYKKA GS

TEV 부위: DYDIPTTENLYFQ

발현

pD Eco5 N TFPI KD1+2로 형질전환시킨 BL21 DE3 균주를 200 ㎍/㎖ 암피실린이 있는 2x100 ㎖ LB 배지에서 프리컬쳐(pre-culture)로서 14시간 동안 37℃에서 180 rpm의 교반 속도로 성장시켰다. 10ℓ컬쳐 용적(LB 배지, 200 ㎍/㎖ 암피실린)의 생물반응기(Sartorius Stedim Biotech)를 상기 프리컬쳐 200 ㎖로 접종시키고 37℃에서, 150 rpm으로 교반시키면서 배양시켰다. 컬쳐 밀도가 OD600일 때, IPTG를 100 mM의 최종 농도로 유전자 도입을 위하여 가하고 17℃에서 24시간 동안 50%의 pO2 최소 농도와 180-800 rpm의 교반 속도로 추가로 배양시켰다. 원심분리(3000 g, 10분)시켜 상기 이. 콜라이를 펠릿화하여 -80℃에 보관하였다.

정제

10ℓ의 컬쳐로부터 펠릿화된 이. 콜라이 매스를 500 ㎖의 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 10%(w/w) 글리세롤, 40 mM 이미다졸, 프로테아제 억제제 칵테일 완전 EDTA-유리(Roche))에 다시 현탁시키고, 고압 장치(Microfluidics)에서 균질화시켜 이후 용해물을 원심분리시켰다 (100,000g, 60분, 4℃). Akta 정제 시스템을 사용하여 여러 개의 정제 단계를 수행하였다. 원심분리된 가용성 용해물을 초기 IMAC 크로마토그래피 단계에서 Ni-Sepharose HP 매트릭스(GE) 50 ㎖를 함유하는 컬럼에 인가하였다. 평형, 융합 단백질 결합 및 Hi-Trap-Sepharose HP 매트릭스의 세척을 완충액 A (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 40 mM 이미다졸)을 사용하여 수행하였다. NusA-TFPI 융합 단백질을 용출시키기 위하여, 완충액 B(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl) 중 40 내지 500 mM 이미다졸의 선형 구배를 사용하였다. 용출 분획을 모아(전체 용적 140 ㎖), 50 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂인 완충액으로 교체시키기 위하여 탈염 컬럼 Hi Prep 26/10(GE)(2개의 연결된 컬럼 유니트)로 분획물을 인가하였다. Nus A tag를 제거하기 위하여, 1:66 w/w의 효소 대 융합 단백질 비율로, His₆-태그된 TEV에 의한 단백분해적 소화(digest)를 16시간 동안 4℃에서 수행하였다. 샘플을 Ni-Sepharose HP 매트릭스(GE) 50 ㎖를 함유하는 컬럼에 다시 인가하여 절단되지 않은 융합 단백질과 His-TEV로부터 유리 TFPI를 분리시켰다. 이어서, 상기 IMAC 단계의 용출물을 크기 배제 크로마토그래피, SEC(S100, GE)에 인가하여 단량체 TFPI 분획을 단리시키는데, 이는 한외여과(Amicon, 3 kDa-컷 오프 범위를 갖는 유니트)에 의해 약 1.5 ㎎/㎖로 농축시켰다. 상기 정제된 최종 TFPI 쿠니츠 도메인 1+2 샘플은 겉보기 분자량이 약 18 kDa인 PAGE에서 이중 밴드로 나타났다. 추가적인 분석(SEC, 웨스턴 블롯)으로 상부 밴드에 대응하는 단백질만이 Fab B와 면역반응성인 것으로 밝혀졌다.

실시예 8. 인간 IgG1으로부터 Fab B의 단백분해적 가공 및 정제

발현

Fab B는 이의 인간 IgG1 형태로부터 단백분해적으로 가공되었다. Fab B_IgG1은 포유동물 세포(HEK 293)에서 분비 단백질로 발현되었다. IgG1 단리를 위하여, 1.6ℓ의 컬쳐 상등액을 HiTrapMabSelectSuRE (GE로부터, 5 ㎖ 상(bed) 용적, 유속 1.5 ㎖/분, 4℃, 16시간)의 2개의 연결된 컬럼에 인가하였다. 컬럼 세척 및 평형화를 위하여, PBS 및 500 mM NaCl로 이루어진 완충액을 사용하였다. 결합된 IgG1을 용출시켰으며 (50 mM Na-아세테이트, 500 mM NaCl pH 3.5, 이어서 pH가 3.0인 동일한 완충액), 중화시키고(2.5M Tris > 11), 한외여과에 의해 약 13 ㎎/㎖로 농축시켰다.

1,5 ㎖ 에펜도르프 반응 시험관중의 분획 22개를 사용하여 IgG1 약 270 ㎎을 소화(배양시간 16 시간, 37℃, 1400 rpm에서 교반)시키기 위하여 고정화된 파파인(Pierce, 20 ㎖ 슬러리)을 사용하였다. 가공 후 샘플을 원심분리시키고, 상등액을 수집하여, 펠릿을 PBS로 세척한 다음 상등액과 등명한 세척액을 둘 다 모았다.

상기 소화된 샘플을 2개의 연결된 HiTrap MabSeletSuRe 컬럼(2 x 5 ㎖)에 인가하여 Fc와 Fab 물질을 분리시켰다. 상기 모은 단리된 Fab B 분획을 한외여과에 의해 약 8 ㎎/㎖로 농축시켰다(전체 수율 120 ㎎). 추가로, Superdex75 (컬럼 26/60, PBS로 유속 2.5 ㎖/분)이 있는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제하였다. 추가로 농축시키고 멸균 여과한 후 Fab B의 최종 수율은 8.5 ㎎/㎖의 농도로 115 ㎎이었다.

분석적 크기 배제 크로마토그래피 (Akta Micro system, S75 5/150 컬럼, 100 mM Tris, HCl, pH 7.5)를 사용하여 Fab B/TFPI KD1+2 복합체 형성을 증명하였다(도 5). Fab B의 경우 SEC 컬럼상에서 기대하지 못했던 긴 체류 시간이 관측되었는데 이는 20 kDa의 겉보기 분자량에 대응하는 것으로, TFPI KD1+2에 대해 검출된 분자량과 매우 유사한 것이다.

실시예 9. TFPI 쿠니츠 도메인 1+2와 Fab B의 복합체의 생산

면역 복합체를 형성시키기 위하여, TFPI 쿠니츠 도메인 1+2와 Fab B를 대략 1:1.5(w/w)의 비율로 합하였다. 따라서, 3.85 ㎎의 농축되고, 단량체인 TFPI 쿠니츠 1+2 단백질 (S100 모은 분획으로부터)을 7.4 ㎎의 Fab B(SEC Superdex75로부터)와 혼합하여 16시간 동안 21℃에서 배양시켰다. 복합체 형성은 분석적 SEC (S200/150) 및 웨스턴 블롯을 통하여 증명되었다. 상기 복합체는 10 mM Tris-HCl pH 7.4에서 150 mM NaCl로 SEC(S200 26/26)으로 추가로 정제하고, 한외여과 (Amicon, 5 kDa-컷 오프 범위를 갖는 유니트)에 의해 10.3 ㎎/㎖로 농축시켜, 이를 결정화에 사용하였다.

실시예 10. TFPI-Fab B 복합체의 결정화 및 X-선 구조 결정

결정화

TFPI-쿠니츠 도메인 1(KD1) 및 쿠니츠 도메인 2(KD2)를 포함하는 단백질 구조와 모노클로날 TFPI 항체 Fab B의 공결정(co-crystal)을 씨팅-드롭 방법(sitting-drop method)을 사용하여 4℃에서 성장시켰다. 상기 단백질 복합체를 10 ㎎/㎖로 농축시키고 등용적의 단백질 용액과 침전제로서 숙성 용액(20% PEG8000)을 혼합시켜 결정화시켰다. 1일 후 결정이 출현하였다.

데이타 수집 및 가공

결정을 한랭-보호를 위하여 결정화 완충액중 30% 글리세롤중에서 액체 질소로 플래쉬-동결시켰다. 데이타는 MAR CCD 검출기상의 빔라인 BL14.1, BESSY 싱크로트론 (Berlin)에서 수집하였다. 데이타를 지수화하여 IMOSFLM (A.G.W. Leslie, (1992), Joint CCP4+ESF-EAMCB Newsletter on Protein Crystallography, No.26)로 통합하고, POINTLESS (P.R. Evans, (2005) Acta Crys. D62, 72-82)로 스케일화를 위하여 준비시킨 다음, SCALA (P.R. Evans, (2005) Acta Cryst. D62, 72-82)로 스케일화하였다. 결정이 2.3Å까지 회절되어 셀 상수 a=80.3, b=71.9, c=108.8; β=92.5°인, 공간 그룹 P2₁, 및 2개의 TFPI-KD1, -KD2-Fab 복합체를 비대칭 유니트에 갖게 되었다.

구조 결정 및 정화(refinement)

TFPI-KD1, -KD2와 모노클로날 항체 Fab 공동-구조(co-structure)를 PHASER (A.J. McCoy et al. (2007) J. Appl. Cryst. 40, 658-674), MOLREP(A.Vagin and A.Teplyakov (1997) J. Appl. Cryst. 30, 1022-10)와 서치 모델로서 TFPI-KD2(pdb code 1tfx) 및 Fab 단편(pdb code 1w72)의 사내 공개된 X-선 구조를 사용하여 분자 치환에 의해 풀었다. 분자 치환전에, 상기 Fab 및 KD1 모델은 CHAINSAW (N. Stein, (2008) J. Appl. Cryst. 41, 641 - 643)로 가공하였다. COOT (P. Emsley et al. (2010) Acta Cryst. D66:486-501)를 사용한 반복적인 라운드로 모델을 빌딩하고 REFMAC5.5 (G.N. Murshudov et al. (1997) Acta Cryst. D53, 240-255)를 사용하여 최대 우도 정화시킴으로써 모델을 완성하였다. 두 Fab들의 영역 hc_Ser131 - hc_Ser136, TFPI 잔기 Asp1-Leu21, Asp149-Phe154, 및 KD1-KD2 링커 잔기 Arg78 - Glu92는 약한 전자 밀도를 나타냈으며 모델에 포함되지 않았다. 데이타 세트와 정화 통계치가 표 4에 요약되어 있다.

표 4. TFPI-Fab B 복합체에 대한 데이타 세트 및 정화 통계치.

실시예 11. X-선 구조-기본의 에피토프 맵화

TFPI-KD1, -KD2와 Fab B의 복합체 (도 6)를 비대칭 유니트당 상기 복합체의 카피 2개로 결정화하였다. 상기 복합체의 주쇄는 관련 TFPI-KD1 및 -KD2의 에피토프에 결합되어 있는 각각의 Fab B와 1.0Å의 전체적인 RMSD를 갖고 중첩된다. 쿠니츠 도메인 둘 다 Fab B와 직접적으로 또는 물-매개된 상호작용을 통하여 상호작용한다. KD1 및 KD2도 서로 상호작용한다. Fab B와 접하고 있는 TFPI의 잔기(에피토프)와 각각의 묻혀있는 표면을 CCP4 프로그램 AREAIMOL (P.J. Briggs (2000) CCP4 Newsletter No. 38)으로 분석하였다. 최소 5Å² 묻혀있는 표면 또는 50% 이상 묻혀있는 표면을 갖는 잔기는 접하고 있는 것으로 판단되었다 (표 5). TFPI와 접하고 있는 Fab B의 잔기(파라토프)와 각각의 묻혀있는 표면을 AREAIMOL로 분석하였다. 최소 5Å² 묻혀있는 표면 또는 50% 이상 묻혀있는 표면을 갖는 잔기는 접하고 있는 것으로 판단되었다 (표 6).

표 5: Fab B와 접하고 있는 TFPI의 잔기. C , D 쇄 및 N, O 쇄는 비대칭 유니트중 각 복합체의 TFPI 쿠니츠 도메인 1 및 쿠니츠 도메인 2에 대응한다.

표 6: TFPI와 접하고 있는 Fab B의 잔기. A, B 쇄 및 L, M 쇄는 비대칭 유니트중 각 복합체의 Fab B 경쇄 및 중쇄를 나타낸다.

Fab B는 KD1 및 KD2의 비-선형 에피토프를 인식하였으며, 이는 TFPI-KD1의 잔기 Asp31 - Lys36, Cys59 (이는 Cys35와 디술피드 가교를 형성한다), Glu60, 및 Asn62와 TFPI-KD2의 잔기 Glu100, Glu101, 영역 Pro101-Cys106 (이는 Cys130과 디술피드 가교를 형성한다), 잔기 Arg107-Tyr109, Phe114, Asn116, Glu123, Arg124 및 잔기 Lys126-Gly128로 정의된다. TFPI-KD1과 상호작용하는 Fab B중의 파라토프는 lc_Leu27 - lc_Tyr31, lc_Asp50, lc_Asn65, lc_Trp90, lc_Asp92, lc_Gly93, 와 hc_Arg101 및 hc_Tyr102 를 포함한다. TFPI-KD2와 상호작용하는 Fab B중의 파라토프는 lc_Tyr31, lc_Tyr48 및 lc_Tyr49, 와 hc_Thr28, hc_Arg30 - hc_Tyr32, hc_Tyr100, hc_Arg101, hc_Trp103, 및 hc_Asp105를 포함한다. 접촉수를 기본으로 할 때, 경쇄 CDRs는 TFPI-KD1에 대한 주요 상호작용 부위인 것으로 나타냈으며, 중쇄 CDRs는 TFPI-KD2에 대한 주요 상호작용 부위인 것으로 나타났다.

TFPI-KD1 상의 비-선형 에피토프는 Cys35와 Cys59 사이의 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 루프 영역으로 이루어져 있다. 상기 에피토프는 Fab B와 Asp31, Asp32, Glu60, 및 Lys36의 극성 상호작용의 삼각형으로 둘러싸인 Pro34의 중앙 소수성 상호작용으로 특징된다 (도 7).

Pro34는 CDR-L1의 lc_Tyr30과 lc_Tyr31, CDR-L3의 lc_Trp90 및 CDR-H3의 hc_Tyr102에 의해 생성된 소수성 클레프트에 놓여 있다. Asp31과 Asp32는 CDR-H3과의 극성 상호작용과 hc_Arg101, hc_Tyr102, 및 물 분자와의 수소 결합 네트워크를 갖는다. Hc_Tyr102 측쇄는 Pro34와의 소수성 상호작용, Asn31과의 극성 상호작용, 및 CDR-L3의 lc_Trp90과의 방향족 π-π 상호작용을 갖도록 잘 배향되어 있다.

CDR-H3과의 Asp31과 Asp32의 상호작용이 중요한 에피토프 특징이며 hc_Tyr102와 hc_Arg101의 배향 및 상호작용이 중요한 것으로 나타났다. 야생형 잔기 hc_Lys99가 류신으로 돌연변이되면 친화도가 20배 상승하였다. Hc_Leu99는 경쇄와 중쇄 사이의 소수성 계면에 위치하며 이어서 CDR-H3 루프가 존재한다. 극성 및 유연한 리신 측쇄는 상기 위치에서 불이익하며 최적의 CDR-H3 구조와 항원 상호작용을 간섭한다.

극성 삼각형의 두번째 코너를 형성하는 Glu60은 lc_Tyr30(CDR-L1), lc_Trp90의 측쇄 및 lc_Gly93(CDR-L3)의 주쇄 질소와 상호작용한다.

상기 삼각형의 세번째 코너는 Lys36에 의해 형성된다. Lys36은 인자 VIIa/조직 인자 복합체의 TFPI에 의한 억제에 있어서 필수적인 잔기이다 (M.S. Bajaj et al.(2001) Thromb Haemost 86(4):959-72). Fab B와의 복합체에서, Lys36은 확실하게 접촉하며 CDR-L1 lc_Leu27, lc_Arg28, lc_Asn29, lc_Tyr31, CDR-L2 lc_Asp50, 및 물 분자에 의해 묻힌다. Lys36의 Fab B에 결합된 상태의 인자 VIIa/조직 인자 복합체와의 상호작용 및 이의 억제는 배제된 것으로 나타났다.

TFPI-KD2 상의 비-선형 에피토프는 Glu100, Glu101, Pro103 - Tyr109, Phe114; Asn116 및 Glu123; Arg124, Lys126 - Gly128를 포함하는 3개의 분절로 이루어져 있다. KD2-에피토프는 Fab B CDR-L1, -L2, -H1, 및 -H3과의 극성 및 소수성 상호작용을 형성한다 (도 8).

Glu100, Glu101, Arg107, 및 Tyr109 는 CDR-H1 (Glu100와 Glu101과의 상호작용), CDR-L1, -L2, -H3(Arg107과의 상호작용), 및 CDR-L2, -H3 (Tyr109과의 상호작용)에 의해 생성된 Fab B의 3개의 분리된 표면 영역과 접하는 강력한 극성 또는 소수성 앵커(anchor) 포인트를 제공하는 중요한 에피토프 잔기이다.

Arg107은 각각 lc_Tyr31, lc_Tyr49, hc_Arg101, 및 hc_Tyr102 of CDR-L1, -L2, -H3에 의해 확실하게 접촉되며, 추가로 KD1의 Gly33 및 Cys35와 상호작용한다. Arg107은 인자 Xa의 억제에 있어서 필수적인 것으로 밝혀졌다 (M.S. Bajaj et al.(2001) Thromb Haemost 86(4):959-72). Fab B는 상기 중요한 잔기를 점유하며 인자 Xa를 억제하는데 있어서 Arg107은 배제한다.

Glu100 및 Glu101은 CDR-H1 잔기 hc_Arg30, hc_Ser31, 및 hc_Thr28 및 hc_Tyr32와 결합한다.

Tyr109는 CDR-L2 lc_Tyr48, 및 CDR-H3 잔기 hc_Tyr100, 와 hc_Trp103에 의해 생성된 소수성 틈새에 놓여 있으며, hc_Asp105와 수소 결합을 형성한다.

실시예 12. Fab B와 이의 최적화된 변이체 Fab D의 파라토프 비교

Fab B의 최적화된 변이체인 Fab D에 의한 TFPI 에피토프 결합의 일관성을 평가하기 위하여, Fab D의 경쇄 및 중쇄 (도 12A) 및 상동성 모델의 서열 정렬을 Fab D중 Fab B 파라토프 잔기의 보존에 대해 분석하였다. 상동성 모델은 입력 주형 구조로서 우리의 TFPI-Fab B X-선 구조를 사용하여 DS MODELER (ACCELRYS, Inc; Fiser, A. and Sali A. (2003) Methods in Enzymology, 374:463-493)로 계산하였다. 상동성 모델은 RMSD < 0.5 Å인 Fab B와 비교하여 거의 동일한 골격 구조(backbone conformation)를 나타낸다. TFPI-Fab B 복합체에서 관찰된 29개의 파라토프 잔기중에서, 7개의 잔기 (5개의 경쇄 잔기, 2개의 중쇄 잔기)가 Fab D와 구별된다 (도 12). Lc_Arg28; lc_Asn29, lc_Asp92, 및 lc_Gly93는 TFPI 에피토프 잔기와의 주쇄 상호작용을 나타낸다. Fab D에서 이들 잔기의 교체는 상이한 TFPI 에피토프로의 결합을 유도할 것으로 기대되지 않는다. Fab D에서 lc_Tyr48 및 hc_Gln1을 페닐알라닌과 글루타메이트로 대체시키는 것은 극성 측쇄 상호작용이 X-선 구조에서 관측되지 않는 한 무시할 수 있다. Hc_Arg30은 TFPI의 Glu100과의 극성 상호작용을 나타내며 Fab D에서 세린으로 교체된다. 이 위치에서, 아르기닌은 TFPI와의 상호반응에 있어서 세린보다 유리해야 한다. Fab B와 Fab D 사이의 분석적 교환의 예측되는 충격, 전체적인 서열 보존 및 Fab D 상동성 모델의 낮은 RMSD를 기준으로 할 때, Fab D는 Fab B와 동일한 TFPI 에피토프를 인식하는 것으로 고려된다.

실시예 13. 인자 Xa 및 인자 VIIa/조직 인자 복합체와 TFPI 상호작용의 억제에 대한 X-선 구조-기본 이유

Fab B는 TFPI의 KD1 및 KD2 둘 다와 결합한다. KD2는 결합하여 인자 Xa를 억제한다. KD1은 결합하여 인자 VIIa/조직 인자 복합체를 억제한다. 트립신과의 복합체 중 KD2의 X-선 구조 (M.J. Burgering et al(1997) J Mol Biol.269(3):395-407) 및 TF와 인자 VIIa의 세포외 영역과의 복합체 중 BPTI (E. Zhang et al (1999) J Mol Biol 285(5):2089-104.)이 보고되어 있다. 트립신은 인자 Xa에 대한 대용체이며, BPTI는 TFPI-KD1의 상동체이다. KD2-트립신 또는 BPTI-인자 VIIa/조직 인자와의 TFPI-Fab B 복합체의 중첩은 항체 결합이 KD1 및 KD2가 각각 이들의 천연 리간드 인자 VIIa/조직 인자와 인자 Xa에 결합하는 것을 배제시키는 것으로 밝혀졌다 (도 9, 도 10).

본 발명을 구체적 실시양태 및 실시예를 언급하며 기재하였지만, 본 발명의 실질적인 사상 및 범위에서 벗어나지 않고도 다양한 변형 및 변화가 가해질 수 있고 등가물이 대체될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 명세서 및 실시예는 제한적인 의미가 아니라 예시적인 것으로서 간주되어야 한다. 추가로, 본원에서 언급된 모든 논문, 서적, 특허 출원 및 특허는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Bayer HealthCare LLC Wang, Zhuozhi Murphy, John Marquardt, Tobias Moosmayer, Dieter <120> Monoclonal Antibodies against Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI) <130> BHC 11 5 001 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 276 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp 20 25 30 Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr 35 40 45 Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn 50 55 60 Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn 65 70 75 80 Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe 85 90 95 Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg 100 105 110 Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly 115 120 125 Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys 130 135 140 Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe 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Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser 165 170 175 Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser 180 185 190 Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro 195 200 205 Thr Glu Cys Ser 210 <210> 9 <211> 219 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Arg Gly Ser Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Tyr Arg Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn 180 185 190 Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys 210 215

Claims

인간 조직 인자 경로 억제제(SEQ ID NO:1)의 에피토프에 결합하는 단리된 모노클로날 항체로서,
상기 단리된 모노클로날 항체가 (ⅰ) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 및 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 포함하거나, 또는 (ⅱ) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 및 SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 포함하고,
상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 Glu100, Glu101, Asp102, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Lys126, Gly128, Gly129, Cys130, Leu131, Gly132, 및 Asn133로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기 1개 이상을 포함하는 것인, 단리된 모노클로날 항체.
제1항에 있어서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Ile105를 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
제1항에 있어서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Ile105와 Asp102를 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
제1항에 있어서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Ile105, Asp102 및 Leu131를 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
제2항에 있어서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 Glu100, Glu101, Asp102, Pro103, Gly104, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Lys126, Gly128, Gly129, Cys130, Leu131, Gly132, 및 Asn133로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기 1개 이상을 추가로 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
제1항에 있어서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Cys106과 Cys130 사이에 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 아미노산 루프를 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
제6항에 있어서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 Glu100, Glu101, Asp102, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Lys126, Gly128, Gly129, Cys130, Leu131, Gly132, 및 Asn133로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기 1개 이상을 추가로 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
제7항에 있어서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Ile105를 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
제7항에 있어서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Asp102를 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
제7항에 있어서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Leu131을 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
제8항에 있어서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 Glu100, Glu101, Asp102, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Lys126, Gly128, Gly129, Cys130, Leu131, Gly132, 및 Asn133로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기 1개 이상을 추가로 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
인간 조직 인자 경로 억제제(SEQ ID NO:1)의 에피토프에 결합하는 단리된 모노클로날 항체로서,
상기 단리된 모노클로날 항체가 (ⅰ) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 및 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 포함하거나, 또는 (ⅱ) SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 및 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 포함하고,
상기 에피토프가 쿠니츠(Kunitz) 도메인 1의 잔기 1개 이상 및 쿠니츠 도메인 2의 잔기 1개 이상을 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
제12항에 있어서, 상기 쿠니츠 도메인 1의 잔기가 Asp31, Asp32, Gly33, Pro34, Cys35, Lys36, Cys59, Glu60 및 Asn62로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기 1개 이상을 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
제13항에 있어서, 상기 쿠니츠 도메인 1의 잔기가 잔기 Pro34를 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
제13항에 있어서, 상기 쿠니츠 도메인 1의 잔기가 잔기 Pro34 및 Glu60을 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
제13항에 있어서, 상기 쿠니츠 도메인 1의 잔기가 잔기 Pro34, Lys36 및 Glu60을 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
제14항에 있어서, 상기 쿠니츠 도메인 1의 잔기가 Asp31, Asp32, Gly33, Cys35, Lys36, Cys59, Glu60 및 Asn62로 이루어진 군으로부터 선택된 잔기 1개 이상을 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
제12항에 있어서, 상기 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 Glu100, Glu101, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Phe114, Asn116, Glu123, Arg124, Lys126, Tyr127 및 Gly128로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기 1개 이상을 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
제18항에 있어서, 상기 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 잔기 Arg107을 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
제18항에 있어서, 상기 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 잔기 Glu101을 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
제18항에 있어서, 상기 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 잔기 Tyr109를 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
제19항에 있어서, 상기 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 Glu100, Glu101, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Phe114, Asn116, Glu123, Arg124, Lys126, Tyr127 및 Gly128로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기 1개 이상을 추가로 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
제12항에 있어서, 쿠니츠 도메인 1의 잔기가 Asp31, Asp32, Gly33, Pro34, Cys35, Lys36, Cys59, Glu60 및 Asn62 로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기 1개 이상을 포함하고 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 Glu100, Glu101, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Phe114, Asn116, Glu123, Arg124, Lys126, Tyr127 및 Gly128로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기 1개 이상을 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
제12항에 있어서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO:1의 잔기 Cys35와 Cys59 사이에 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 아미노산 루프를 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
제24항에 있어서, 상기 에피토프가 쿠니츠 도메인 1의 잔기 1개 이상과 쿠니츠 도메인 2의 잔기 1개 이상을 추가로 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
제25항에 있어서, 상기 쿠니츠 도메인 1의 잔기가 Asp31, Asp32, Gly33, Pro34, Cys35, Lys36, Cys59, Glu60 및 Asn62로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기 1개 이상을 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
제25항에 있어서, 상기 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 Glu100, Glu101, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Phe114, Asn116, Glu123, Arg124, Lys126, Tyr127 및 Gly128로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기 1개 이상을 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
제25항에 있어서, 상기 쿠니츠 도메인 1의 잔기가 Asp31, Asp32, Gly33, Pro34, Cys35, Lys36, Cys59, Glu60 및 Asn62로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기 1개 이상을 포함하며 상기 쿠니츠 도메인 2의 잔기가 Glu100, Glu101, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Phe114, Asn116, Glu123, Arg124, Lys126, Tyr127 및 Gly128로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기 1개 이상을 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체.
치료학적 유효량의 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 모노클로날 항체와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 응고에 있어서 유전적 또는 후천적 결핍 또는 결함 치료용 또는 출혈 시간 단축용 약제학적 조성물.
제29항에 있어서, 혈우병 A, B 또는 C 치료용인 약제학적 조성물.
치료학적 유효량의 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 적어도 2종의 모노클로날 항체와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 응고에 있어서 유전적 또는 후천적 결핍 또는 결함 치료용 또는 출혈 시간 단축용 약제학적 조성물.
제31항에 있어서, 혈우병 A, B 또는 C 치료용인 약제학적 조성물.
치료학적 유효량의 적어도 2종의 모노클로날 항체와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하되, 제1 모노클로날 항체는 제1항의 단리된 모노클로날 항체를 포함하고, 제2 모노클로날 항체는 제12항의 단리된 모노클로날 항체를 포함하는 것인, 응고에 있어서 유전적 또는 후천적 결핍 또는 결함 치료용 또는 출혈 시간 단축용 약제학적 조성물.
치료학적 유효량의 치료 유효량의 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 모노클로날 항체를 포함하는, 응고에 있어서 유전적 또는 후천적 결핍 또는 결함 치료용 약제.
제34항에 있어서, 혈우병 A, B 또는 C 치료용인 약제.
치료학적 유효량의 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 모노클로날 항체를 포함하는, 출혈 시간 단축용 약제.
제1항 내지 28항 중 어느 한 항의 단리된 모노클로날 항체로서, 인간 조직 인자 경로 억제제(SEQ ID NO:1)의 에피토프에 결합하는 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자.