RS58633B1 - Monoklonalna antitela protiv inhibitora puta tkivnog faktora (tfpi) - Google Patents

Description

Opis

Oblast otelotvorenja

[0001] Obezbeđena su izolovana monoklonalna antitela i njihovi fragmenti koji vezuju humani inhibitor puta tkivnog faktora (TFPI).

Pozadina

[0002] Koagulacija krvi je proces u kojem krv stvara stabilne ugruške za zaustavljanje krvarenja. Proces uključuje brojne proenzime i prokofaktore (ili "faktore koagulacije") koji cirkulišu u krvi. Ti proenzimi i prokofaktori stupaju u interakciju kroz nekoliko puteva kroz koje se pretvaraju, bilo sekvencijalno ili istovremeno, u aktivirani oblik. Konačno, proces dovodi do aktivacije protrombina do trombina pomoću aktiviranog faktora X (FXa) u prisustvu faktora Va, jonskog kalcijuma i krvnih pločica. Aktivirani trombin izaziva agregaciju trombocita i pretvara fibrinogen u fibrin, koji se zatim povezuje aktiviranim Faktorom XIII (FXIIIa) da bi se formirao ugrušak.

[0003] Proces koji dovodi do aktivacije Faktora X može se izvesti pomoću dva različita puta: put aktivacije kontakta (ranije poznat kao intrinzični put) i put tkivnog faktora (ranije poznat kao spoljašnji put). Ranije se smatralo da se kaskada koagulacije sastoji od dva puta jednake važnosti koja su povezana sa zajedničkim putem. Sada je poznato da je primarni put za iniciranje koagulacije krvi put tkivnog faktora.

[0004] Faktor X se može aktivirati tkivnim faktorom (TF) u kombinaciji sa aktiviranim Faktorom VII (FVIIa). Kompleks FVIIa i njegov esencijalni kofaktor, TF, je moćan inicijator kaskade zgrušavanja.

[0005] Put koagulacije tkivnog faktora je negativno kontrolisan inhibitorom puta tkivnog faktora ("TFPI"). TFPI je prirodni, FXa-zavisni inhibitor povratne sprege FVIIa/TF kompleksa. On je član multivalentnih inhibitora serin proteaze tipa Kunitz. Fiziološki, TFPI se vezuje za aktivirani Faktor X (FXa) da bi formirao heterodimerni kompleks, koji zatim interaguje sa FVIIa/TF kompleksom da inhibira njegovu aktivnost, tako zatvarajući put koagulacije faktora tkiva. U principu, blokiranje TFPI aktivnosti može obnoviti aktivnost FXa i FVIIa/TF, čime se produžava trajanje aktivnosti tkivnog faktora i pojačava generisanje FXa, što je uobičajeni defekt u hemofiliji A i B.

[0006] Zaista, neki preliminarni eksperimentalni dokazi ukazuju da blokiranje aktivnosti TFPI od strane antitela protiv TFPI normalizuje produženo vreme koagulacije ili skraćuje vreme krvarenja. Na primer, Nordfang i dr. pokazali su da je produženo razblaženo protrombinsko vreme plazme hemofilije normalizovano nakon tretiranja plazme sa antitelima na TFPI (Thromb. Haemost., 1991, 66(4):464-467). Slično tome, Erhardtsen i dr. pokazali su da je vreme krvarenja kod hemofilije A kod modela zeca bio znatno skraćen od strane anti-TFPI antitela (Blood Coagulation and Fibrinolysis, 1995, 6:388-394). Ova ispitivanja ukazuju da inhibicija TFPI pomoću anti-TFPI antitela može biti korisna za lečenje hemofilije A ili B. U ovim ispitivanjima su korišćena samo poliklonalna anti-TFPI antitela.

[0007] Koristeći hibridomsku tehniku, pripremljena su i identifikovana monoklonalna antitela protiv rekombinantnog humanog TFPI (rhTFPI). (Videti Yang i dr., Chin. Med. J., 1998, 111(8):718-721). Testiran je efekat monoklonalnog antitela na razblaženo protrombinsko vreme (PT) i aktivirano parcijalno tromboplastinsko vreme (APTT). Eksperimenti su pokazali da anti-TFPI monoklonalno antitelo skraćuje vreme koagulacije tromboplastina u faktoru IX deficijentne plazme. Predloženo je da put faktora tkiva igra važnu ulogu ne samo u fiziološkoj koagulaciji, već i kod krvarenja hemofilije. (Yang i dr., Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao, 1997, 22(4):297-300).

[0008] WO 2010/017196 i WO 2010/0072691 takođe obelodanjuju monoklonalna antitela koja se vezuju za humani inhibitor puta faktora tkiva.

[0009] Prema tome, antitela specifična za TFPI su potrebna za lečenje hematoloških oboljenja i kancera.

[0010] Generalno, terapeutska antitela za humane bolesti su generisana korišćenjem genetičkog inženjeringa da bi se dobila mišija, himerna, humanizovana ili potpuno humana antitela. Pokazalo se da mišija monoklonalna antitela imaju ograničenu upotrebu kao terapeutska sredstva zbog kratkog poluživota u serumu, nesposobnosti da aktiviraju efektorske funkcije kod ljudi i proizvodnje humanih anti-mišjih antitela. (Brekke and Sandlie, "Therapeutic Antibodies for Human Diseases at the Dawn of the Twenty-first Century," Nature 2, 53, 52-62, Jan.2003). Pokazalo se da himerna antitela dovode do odgovora na humano anti-himerno antitelo. Humanizovana antitela dodatno umanjuju mišju komponentu antitela. Međutim, potpuno humano antitelo izbegava imunogenost koja je u potpunosti povezana sa mišjim elementima. Prema tome, postoji potreba da se razviju potpuno humana antitela kako bi se izbegla imunogenost povezana sa drugim oblicima genetički modifikovanih monoklonalnih antitela. Naročito, hronični profilaktički tretman kao što je tretman hemofilije bi bio potreban za humanizovana ili poželjno potpuno humana antitela. Anti-TFPI monoklonalno antitelo ima visok rizik razvoja imunog odgovora na terapiju ako se koristi antitelo sa mišjom komponentom ili mišjim poreklom zbog brojnih potrebnih doziranja i dugog trajanja terapije. Na primer, terapija antitelima za hemofiliju A može zahtevati nedeljno doziranje tokom života pacijenta. To bi bio neprekidan izazov za imuni sistem. Prema tome, postoji potreba za potpuno humanim antitelom za terapiju antitela za hemofiliju i srodne genetske i stečene nedostatke ili defekte u koagulaciji.

[0011] Terapeutska antitela su napravljena putem hibridomske tehnologije opisane u Koehler and Milstein u "Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity," Nature 256, 495-497 (1975). Potpuno humana antitela se takođe mogu rekombinantno napraviti u prokariotima i eukariotima. Rekombinantna proizvodnja antitela u ćeliji domaćinu pre nego proizvodnja hibridoma je poželjna za terapeutsko antitelo.

Rekombinantna proizvodnja ima prednosti veće konzistencije proizvoda, verovatno višeg nivoa proizvodnje i kontrolisane proizvodnje koja minimizira ili eliminiše prisustvo proteina iz životinjskog porekla. Iz ovih razloga, poželjno je imati rekombinantno proizvedeno monoklonalno anti-TFPI antitelo.

[0012] Pored toga, pošto se TFPI vezuje za aktivirani Faktor X (FXa) sa visokim afinitetom, efikasno anti-TFPI antitelo treba da ima uporediv afinitet. Prema tome, poželjno je da ima anti-TFPI antitelo koje ima afinitet vezivanja koji može da se takmiči sa vezivanjem TFPI/FXa.

Rezime

[0013] Obezbeđena su monoklonalna antitela koja imaju specifično vezivanje za specifični epitop humani inhibitor puta tkivnog faktora (TFPI). Takođe su obezbeđeni polinukleotidi koji kodiraju anti-TFPI monoklonalna antitela. Farmaceutski sastavi koje sadrže anti-TFPI monoklonalna antitela i metode lečenja genetskih i stečenih nedostataka ili defekata u koagulaciji kao što su hemofilija A i B su takođe date.

Kratak opis slika

[0014]

Slika 1 prikazuje kompleksno formiranje Fab B i TFPI Kunitz domena 1+2 analizom veličine isključenja.

Slika 2 prikazuje dva prikaza sa crteža koji pokazuju međudejstvo između humanog inhibitora puta faktora tkiva i njegovog antitela (Fab B) pod prvim uglom i pod drugim uglom rotiranim za 90 stepeni u odnosu na prvi ugao. Fab B sa označenim varijabilnim svetlom (VL) i teškim (VH) domenima je prikazan u donjem delu slike (osenčeno sivom). TFPI Kunitz domena 1 (KD1) je prikazana u beloj boji i TFPI Kunitz domena 2 (KD2) je prikazana crnom bojom. Slika 3 prikazuje ključne ostatke epitopa Asp31 (D31), Asp32 (D32), Pro34 (P34), Lys36 (K36), Glu60 (E60), disulfidni most Cys35-Cis59 i vezivanje Kunitz domena 1 TFPI na Fab B površini. Takođe je prikazano, ali nije nabrojano, vezivanje Kunitz domena 2.

Slika 4 prikazuje dva ugla gledanja vezivanja i interakcije ostataka epitopa Glu100 (E100), Glu101 (E101), Pro103 (P103), Ile105 (1105), Arg107 (R107), Tyr109 (Y109) Kunitz domena 2 sa Fab B. Arg107 reaguje sa Gly33 (G33) i Cys35 (C35) Kunitz domena 1.

Slika 5 prikazuje superpoziciju TFPI - Fab B kompleksa i kompleksa BPTI, faktora VIIa i tkivnog faktora i pokazuje isključivanje istovremenog vezivanja TFPI za faktor VIIa/faktor tkiva i Fab B. Prostorni sudar za Fab B i faktor VIIa, i Fab B i tkivni faktor su označeni strelicama.

Slika 6 prikazuje superpoziciju TFPI - Fab B kompleksa i Kunitz domena 2 vezanog za tripsin i pokazuje isključivanje istovremenog vezivanja TFPI za faktor Xa i Fab B. Prostorni sudar za Fab B i tripsin, i za Fab B vezana Kunitz domena 1 i tripsin su naznačeni.

Slika 7 prikazuje (A) poravnanje sekvenci lakih i teških lanaca Fab B (SEQ ID NOs:4 i 5) i Fab D (SEQ ID NOs:8 i 9) i (B) superpoziciju TFPI - Fab B rendgenske strukture sa homolognim modelima Fab D. (A) ostaci paratopa su podebljani i istaknuti. Ostaci paratopa koji se razlikuju u Fab B i Fab D označeni su zvezdicom. (B) Kunitz domen 1 (KD1) i Kunitz domen 2 (KD2) prikazani su kao svetlo siva i crna crtica. Fab strukture su prikazane kao siva traka. Ostaci paratopa koji se razlikuju u Fab B i Fab D su prikazani kao štapići.

Detaljni opis

Definicije

[0015] Termin "inhibitor puta tkivnog faktora" ili "TFPI", kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koju varijantu, izoformu i homolog humanog TFPI koji je prirodno eksprimiran od strane ćelija. U poželjnom otelotvorenju pronalaska, vezivanje antitela prema pronalasku za TFPI smanjuje vreme zgrušavanja krvi.

[0016] Kako se ovde koristi, "antitelo" se odnosi na celo antitelo i bilo koji fragment koji se vezuje za antigen (tj., "deo za vezivanje antigena") ili njegov pojedinačni lanac. Pojam uključuje molekul imunoglobulina pune dužine (npr., IgG antitelo) koji se prirodno pojavljuje ili formira rekombinantnim procesima normalnog fragmenta genskog imunoglobulina, ili imunološki aktivan deo molekula imunoglobulina, kao što je fragment antitela, koji zadržava specifičan aktivnost vezivanja. Bez obzira na strukturu, fragment antitela se vezuje sa istim antigenom koji je prepoznat od strane antitela pune dužine. Na primer, fragment anti-TFPI monoklonalnog antitela vezuje se za epitop TFPI. Antigen-vezujuća funkcija antitela može biti izvedena pomoću fragmenata antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih unutar termina "deo koji vezuje antigen" antitela obuhvataju (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji iz VL, VH, CLi CH1domena; (ii) F(ab')2fragment, bivalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta vezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (iii) Fd fragment koji se sastoji iz VHi CH1domena; (iv) Fv fragment koji se sastoji od VLi VHdomena jednog kraka antitela, (v) dAb fragment (Ward i dr., (1989) Nature 341:544-546), koji se sastoji iz VHdomena; (vi) izolovano područje koje određuje komplementarnost (CDR); (vii) minitela, diatela, triatela, tetratela i kapa tela (videti, npr. Ill i dr., Protein Eng 1997;10:949-57); (viii) camel IgG; i (ix) IgNAR . Dalje, iako su dva domena Fv fragmenta, VLi VH, kodirana za odvojene gene, oni se mogu spojiti, koristeći rekombinantne metode, pomoću sintetičkog linkera koji im omogućava da budu napravljeni kao jedan lanac proteina u kome je VLi VHregioni se spajaju da formiraju monovalentne molekule (poznate kao jednostruki lanac Fv (scFv); videti npr., Bird i dr. (1988) Science 242:423-426; i Huston i dr (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Takva jednolančana antitela su takođe obuhvaćena terminom "deo koji vezuje antigen" antitela. Ovi fragmenti antitela se dobijaju korišćenjem konvencionalnih tehnika koje su poznate stručnjacima, a fragmenti se analiziraju na korisnost na isti način kao i netaknuta antitela.

[0017] Dalje, razmatra se da fragment koji se vezuje za antigen može biti obuhvaćen u mimetičnom antitelu. Termin "antitelo mimetik" ili "mimetik" kako se ovde koristi označava protein koji pokazuje vezivanje slično antitelu, ali je manje alternativno antitelo ili protein koji nije antitelo. Takav mimetik antitela može biti sadržan u skeletu. Izraz "skelet" odnosi se na polipeptidnu platformu za inženjering novih proizvoda sa prilagođenim funkcijama i karakteristikama.

[0018] Termin "epitop" se odnosi na oblast ili region antigena na koji se antitelo specifično veže ili interakcije, što u nekim otelotvorenjima ukazuje gde je antigen u fizičkom kontaktu sa antitelom. Nasuprot tome, termin "paratope" se odnosi na oblast ili region antitela na koje se antigen specifično vezuje. Za epitope karakterisane kompetetivnim vezivanjem se kaže da se preklapaju ako se vezivanje odgovarajućih antitela međusobno isključuje, tj. vezivanje jednog antitela isključuje istovremeno vezivanje drugog antitela. Za epitope se kaže da su odvojeni (jedinstveni) ako je antigen sposoban da prihvati vezivanje oba odgovarajuća antitela istovremeno.

[0019] Termin "kompetetivna antitela", kako se ovde koristi, odnosi se na antitela koja se vezuju na oko, dosta ili suštinski isti, ili čak isti, epitop kao antitelo protiv TFPI kao što je ovde opisano. „Kompetetivna antitela" uključuju antitela sa specifičnostima epitopa koje se preklapaju. Kompetetivna antitela su tako sposobna da se efikasno takmiče sa antitelom kao što je ovde opisano za vezivanje za TFPI. Poželjno, kompetetivno antitelo se može vezati za isti epitop kao što je ovde opisano antitelo. Alternativno gledano, kompetetivno antitelo ima istu specifičnost epitopa kao ovde opisano antitelo.

[0020] Kako se ovde koristi, izrazi "inhibiraju vezivanje" i "blokira vezivanje" (npr., koji se odnose na inhibiciju/blokiranje vezivanja TFPI liganda za TFPI) koriste se naizmenično i obuhvataju i delimičnu i potpunu inhibiciju ili blokiranje. Namera je da inhibicija i blokiranje uključe bilo koje merljivo smanjenje afiniteta vezivanja TFPI za fiziološki supstrat kada je u kontaktu sa anti-TFPI antitelom u poređenju sa TFPI koji nije u kontaktu sa anti-TFPI antitelom, npr., interakcija TFPI sa faktorom Xa ili blokiranjem interakcije TFPI-faktora Xa kompleksa sa tkivnim faktorom, faktorom VIIa ili kompleksom tkivnog faktora/faktora VIIa za najmanje oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50% , 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%.

[0021] Izrazi "monoklonalno antitelo" ili "sastav monoklonalnog antitela", kako se ovde koriste, odnose se na pripremu molekula antitela jednog molekularnog sastava. Sastav monoklonalnog antitela ima jednu specifičnost vezivanja i afinitet za određeni epitop. Prema tome, termin "humano monoklonalno antitelo" odnosi se na antitela koja pokazuju jednu specifičnost vezivanja koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz humanih sekvenci imunoglobulina germinalne linije. Humana antitela prema pronalasku mogu uključivati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani humanim sekvencama imunoglobulina humane linije (npr., mutacije uvedene nasumičnom ili specifično mutagenezom in vitro ili somatskom mutacijom in vivo).

[0022] "Izolovano antitelo", kako se ovde koristi, treba da se odnosi na antitelo koje je u suštini slobodno od drugih antitela koje imaju različite antigenske specifičnosti (npr., izolovano antitelo koje se vezuje za TFPI je u suštini slobodno od antitela koja vezuju antigene osim TFPI) . Izolovano antitelo koje se vezuje za epitop, izoformu ili varijantu humanog TFPI može, međutim, imati unakrsnu reaktivnost na druge srodne antigene, npr., od drugih vrsta (npr., homolognih TFPI vrsta). Štaviše, izolovano antitelo može biti suštinski bez drugih ćelijskih materijala i/ili hemikalija.

[0023] Kako se ovde koristi, "specifično vezivanje" se odnosi na antitelo koje se vezuje za prethodno određeni antigen. Tipično, antitelo se vezuje sa afinitetom od najmanje oko 10<5>M<-1>i vezuje se za prethodno određeni antigen sa afinitetom koji je veći, na primer najmanje dvostruko veći, nego njegov afinitet za vezivanje za irelevantni antigen (npr., BSA, kazein) osim prethodno određenog antigena ili blisko srodnog antigena. Izrazi "antitelo koje prepoznaje antigen" i "antitelo specifično za antigen" ovde se koriste naizmenično sa terminom "antitelo koje se specifično vezuje za antigen.“

[0024] Kako se ovde koristi, izraz "visoki afinitet" za IgG antitelo se odnosi na afinitet vezivanja bar oko 10<7>M<-1>, u nekim otelotvorenjima bar oko 10<8>M<-1>, u nekim otelotvorenjima bar oko 10<9>M<-1>, 10<10>M<-1>, 10<11>M<-1>ili više, npr., do oko 10<13>M<-1>ili više. Međutim, vezivanje "visokog afiniteta" može varirati za druge izotipove antitela. Na primer, vezivanje "visokog afiniteta" za izotip IgM se odnosi na afinitet vezivanja od najmanje oko 1.0 x 10<7>M<-1>. Kako se ovde koristi, "izotip" se odnosi na klasu antitela (npr., IgM ili IgGl) koja je kodirana genom konstantnog regiona teškog lanca.

[0025] Oblast za određivanje komplementarnosti" ili "CDR" se odnosi na jedan od tri hipervarijabilna regiona unutar varijabilnog regiona teškog lanca ili varijabilnog regiona lakog lanca molekula antitela koji formiraju N-terminalnu površinu za vezivanje antigena koja je komplementarna na trodimenzionalnu strukturu vezanog antigena. Polazeći od N-kraja teškog ili lakog lanca, ovi regioni za određivanje komplementarnosti su označeni kao "CDR1", "CDR2" i "CDR3", respektivno. CDR su uključeni u vezivanje antigena-antitela, a CDR3 sadrži jedinstveni region specifičan za vezivanje antigena-antitela. Antigen-vezujuće mesto, prema tome, može uključivati šest CDR-a, koji sadrže CDR regione iz svake od teških i lakih lanaca V regiona.

[0026] Kako se ovde koristi, "konzervativne supstitucije" se odnose na modifikacije polipeptida koji uključuju supstituciju jedne ili više aminokiselina za aminokiseline koje imaju slična biohemijska svojstva koja ne dovode do gubitka biološke ili biohemijske funkcije polipeptida. "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak zamenjen sa aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Porodice aminokiselinskih ostataka koje imaju slične bočne lance definisane su u struci. Ove familije obuhvataju amino kiseline sa osnovnim bočnim lancima (npr., lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lancima (npr., asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisanim polarnim bočnim lancima (npr., glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarnim bočnim lancima (npr., alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-granatim bočnim lancima (npr., tireonin, valin, izoleucin) i aromatičnim bočnim lancima (npr., tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Predviđeno je da antitela iz ovog pronalaska mogu imati konzervativne aminokiselinske supstitucije i da zadrže aktivnost.

[0027] Za nukleinske kiseline i polipeptide, termin "suštinska homologija" označava da su dve nukleinske kiseline ili dva polipeptida, ili njihove označene sekvence, kada su optimalno poravnate i upoređene, identične, sa odgovarajućim nukleotidnim ili aminokiselinskim umetanjima ili delecijama, u najmanje oko 80 % nukleotida ili aminokiselina, obično najmanje oko 85%, poželjno oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ili 95%, poželjnije najmanje oko 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, ili 99.5% nukleotida ili aminokiselina. Alternativno, značajna homologija za nukleinske kiseline postoji kada se segmenti hibridizuju pod uslovima selektivne hibridizacije sa komplementom lanca.

Pronalazak obuhvata sekvence nukleinskih kiselina i polipeptidne sekvence koje imaju značajnu homologiju sa specifičnim sekvencama nukleinskih kiselina i sekvencama aminokiselina koje su ovde navedene.

[0028] Procenat identiteta između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje dele sekvence (tj.% homologija = #identičnih pozicija/ukupno #pozicija x 100), uzimajući u obzir broj praznina i dužinu svaku prazninu, koju treba uvesti za optimalno poravnanje dve sekvence. Poređenje sekvenci i određivanje procentualnog identiteta između dve sekvence može se postići korišćenjem matematičkog algoritma, kao što je bez ograničenja AlignX™ modul VectorNTI ™ (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Za AlignX™, podrazumevani parametri višestrukog poravnanja su: penal za otvaranje praznine:10; penal za produženje praznine:0,05; opseg penala za razdvajanje praznine:8; % identiteta za odlaganje poravnanja:40. (dodatni detalji su pronađeni na http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/LINNEA-Online-Guides/LINNEA-Communities/Vector-NTI-Community/Sequence-analysis-and-data-management-softwarefor-PCs/AlignX-Module-for-Vector-NTI-Advance.reg.us.html).

[0029] Drugi metod za određivanje najboljeg ukupnog podudaranja između sekvence upita (sekvenca predmetnog pronalaska) i predmetne sekvence, takođe označene kao globalno poravnanje sekvenci, može se odrediti korišćenjem CLUSTALW računarskog programa (Thompson i dr., Nucleic Acids Research, 1994, 2(22):4673-4680), koji se zasniva na algoritmu Higgins i dr., (Computer Applications in the Biosciences (CABIOS), 1992, 8(2):189-191). U redosledu sekvenci sekvence upita i subjekta su obe DNK sekvence.

Rezultat navedenog poravnanja globalne sekvence je u procentu identiteta. Poželjni parametri koji se koriste u CLUSTALW poravnanju DNK sekvenci za izračunavanje procenta identiteta putem poravnanja u parovima su:Matrix = IUB, k-tuple = 1, Broj gornjih dijagonala = 5, Penal praznine = 3, Penal otvaranja praznine = 10, Penal produženja praznina = 0.1. Za višestruka poravnanja preferiraju se sledeći CLUSTALW parametri: Penal otvaranja praznina = 10, parametar produženja praznine = 0.05; Raspon penala razdvajanja praznine = 8; % Identiteta za odlaganje poravnanja = 40.

[0030] Nukleinske kiseline mogu biti prisutne u celim ćelijama, u ćelijskom lizatu, ili u delimično prečišćenom ili suštinski čistom obliku. Nukleinska kiselina je "izolovana" ili "učinjena suštinski čistom" kada je pročišćena od drugih ćelijskih komponenti sa kojima je normalno povezana u prirodnom okruženju. Da bi se izolovala nukleinska kiselina, mogu se koristiti standardne tehnike kao što su sledeće: alkalni/SDS tretman, CsCl vezivanje, hromatografija na koloni, elektroforeza agaroznog gela i druge dobro poznate u tehnici.

Monoklonalna antitela koja se vezuju za specifične epitope TFPI

[0031] Ovde su obezbeđena monoklonalna antitela sa specifičnim vezivanjem za humani TFPI kao što je prikazano u SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, anti-TFPI monoklonalna antitela inhibiraju vezivanje TFPI liganda za TFPI. Prema tome, u nekim otelotvorenjima, anti-TFPI monoklonalna antitela mogu inhibirati aktivnost TFPI.

[0032] Obezbeđeno je izolovano monoklonalno antitelo koje se vezuje za epitop inhibitora putanje humanog tkivnog faktora (SEQ ID NO:1), gde pomenuti epitop sadrži jedan ili više ostataka Kunitz domena 2. Izolovani monoklon prema pronalasku sadrži laki lanac kao što je prikazano u SEQ ID NO:4 i teški lanac kao što je prikazano u SEQ ID NO:5. U nekim aspektima obelodanjivanja, takođe je predviđeno da izolovano monoklonalno antitelo može da sadrži laki lanac ili teški lanac sa značajnom homologijom u odnosu na one koji su obezbeđeni. Na primer, izolovano monoklonalno antitelo koje sadrži suštinsku homologiju može da sadrži jednu ili više konzervativnih supstitucija.

[0033] U nekim aspektima obelodanjivanja, obezbeđeno je izolovano monoklonalno antitelo koje se vezuje za epitop inhibitora putanje humanog tkivnog faktora (SEQ ID NO:1), gde navedeni epitop sadrži jedan ili više ostataka izabranih iz Glu100, Glu101, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Lys126, Gly128 SEQ ID NO:1 i kombinacije navedenog..

[0034] U nekim otelotvorenjima, epitop sadrži ostatak Glu100 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, epitop sadrži ostatak Glu101 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, epitop sadrži ostatak Gly104 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, epitop sadrži ostatak Ile105 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, epitop sadrži ostatak Cys106 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, epitop sadrži ostatak Arg107 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, epitop sadrži ostatak Gly108 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, epitop sadrži ostatak Tyr109 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, epitop sadrži ostatak Lys126 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, epitop sadrži ostatak Gly128 SEQ ID NO:1.

[0035] U nekim otelotvorenjima, ostaci Kunitz domena 2 sadrže jedan ili više ostataka izabranih iz Glu100, Glu101, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Lys126, Gly128, Gly129, Cys130, Leu131, Gly132 i Asn133 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, epitop sadrži ostatak Ile105 SEQ ID NO:1. I u nekim otelotvorenjima, epitop dalje sadrži jedan ili više ostataka izabranih iz Glu100, Glu101, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Lys126, Gly128, Gly129, Cys130, Leu131, Gly132 i Asn133 SEQ ID NO:1.

[0036] Takođe je obezbeđeno izolovano monoklonalno antitelo koje se vezuje za epitop inhibitora putanje humanog tkivnog faktora (SEQ ID NO:1), gde navedeni epitop sadrži jedan ili više ostataka Kunitz domena 1 i jedan ili više ostataka Kunitz domena 2.

[0037] U nekim otelotvorenjima, ostaci Kunitz domena 1 sadrže jedan ili više ostataka izabranih iz Asp31, Asp32, Gly33, Pro34, Cys35, Lys36, Cys59, Glu60 i Asn62 SEQ ID NO:1 i kombinacije navedenog. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 1 sadrži ostatak Asp31 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 1 sadrži ostatak Asp32 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 1 sadrži ostatak Gly33 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 1 sadrži ostatak Pro34 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 1 sadrži ostatak Cys35 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 1 sadrži ostatak Lys36 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 1 sadrži ostatak Cys59 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 1 sadrži ostatak Glu60 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 1 sadrži ostatak Asn62 SEQ ID NO:1.

[0038] U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 1 sadrži ostatak Pro34 i Glu60 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 1 sadrži ostatak Pro34 i Lys36 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 1 sadrži ostatak Pro34, Lys36 i Glu60 SEQ ID NO:1.

[0039] U nekim otelotvorenjima, ostaci Kunitz domena 2 sadrže jedan ili više ostataka izabranih iz Glu100, Glu101, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Phe114, Asn116, Glu123, Arg124, Lys126, Tyr127 i Gly128 of SEQ ID NO:1 i kombinacija navedenog. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 2 sadrži ostatak Glu100 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 2 sadrži ostatak Glu101 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 2 sadrži ostatak Pro103 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 2 sadrži ostatak Gly104 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 2 sadrži ostatak Ile105 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 2 sadrži ostatak Cys106 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 2 sadrži ostatak Arg107 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 2 sadrži ostatak Gly108 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 2 sadrži ostatak Tyr109 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 2 sadrži ostatak Phe114 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 2 sadrži ostatak Asn116 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 2 sadrži ostatak Glu123 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 2 sadrži ostatak Arg124 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 2 sadrži ostatak Lys126 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 2 sadrži ostatak Tyr127 SEQ ID NO:1.

[0040] U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 2 sadrži ostatak Arg107 i Glu101 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 2 sadrži ostatak Arg107 i Tyr109 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 2 sadrži ostatak Arg107, Glu101 i Tyr109 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostatak Kunitz domena 2 sadrži ostatak Gly128 SEQ ID NO:1.

[0041] U nekim otelotvorenjima, ostaci Kunitz domena 2 mogu dodatno da sadrže jedan ili više ostataka izabranih iz Asp102, Gly129, Cys130, Leu131, Gly132 i Asn133 of SEQ ID NO:1 i kombinacije navedenog.

[0042] U nekim aspektima otelotvorenja, izolovano monoklonalno antitelo sadrži ostatak Kunitz domen 1 koji sadrži jedan ili više ostataka izabranih od Asp3l, Asp32, Gly33, Pro34, Cys35, Lys36, Cys59, Glu60 i Asn62; i ostatak Kunitz domena 2 koji sadrži jedan ili više ostataka odabranih od Glu100, Glu101, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Phe114, Asn116, Glu123, Arg124, Lys126, Tyr127 i Gly128.

[0043] Takođe je obezbeđeno izolovano monoklonalno antitelo koje se vezuje za epitop inhibitora putanje humanog tkivnog faktora (SEQ ID NO:1), gde navedeni epitop sadrži dve petlje aminokiselina povezane sa disulfidnim mostom između ostataka Cys35 i Cys59 iz SEQ ID NO:1. U nekim aspektima, epitop dalje sadrži jedan ili više ostataka Kunitz domena 1 i jedan ili više ostataka Kunitz domena 2. U nekim otelotvorenjima, ostaci Kunitz domena 1 sadrže jedan ili više ostataka izabranih iz Asp31, Asp32, Gly33, Pro34, Cys35, Lys36, Cys59, Glu60 i Asn62 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, ostaci Kunitz domena 2 sadrže jedan ili više ostataka izabranih iz Glu100, Glu101, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Phe114, Asn116, Glu123, Arg124, Lys126, Tyr127 i Gly128 SEQ ID NO:1.

[0044] Takođe su obezbeđena antitela koja mogu da se takmiče sa bilo kojim od ovde opisanih antitela za vezivanje za TFPI. Na primer, antitelo koje se vezuje za isti epitop kao ovde opisana antitela će biti u stanju da se efikasno takmiče za vezivanje TFPI. U nekim aspektima obelodanjivanja, obezbeđeno je izolovano monoklonalno antitelo koje se vezuje za TFPI, pri čemu je izolovano monoklonalno antitelo konkurentno sa bilo kojim od izolovanih monoklonalnih antitela koja su ovde opisana. U nekim aspektima obelodanjivanja, antitelo je kompetetivno sa antitelom koji ima laki lanac kao što je prikazano u SEQ ID NO:4. U nekim aspektima obelodanjivanja, antitelo je kompetetivno sa antitelom koji ima teški lanac kao što je prikazano u SEQ ID NO:5. U nekim aspektima obelodanjivanja, antitelo je konkurentno sa antitelom koji ima laki lanac kao što je prikazano u SEQ ID NO:4 i teški lanac kao što je prikazano u SEQ ID NO:5.

[0045] Takođe su obezbeđena bispecifična antitela koja mogu da se takmiče sa bilo kojim od ovde opisanih antitela za vezivanje za TFPI. Na primer, takvo bispecifično antitelo može se vezati za jedan ili više epitopa koji su opisani iznad.

[0046] Antitelo može biti specifično za vrstu ili može da reaguje sa više vrsta. U nekim otelotvorenjima, antitelo može specifično reagovati ili unakrsno reagovati sa TFPI čoveka, miša, pacova, zamorca, zeca, majmuna, svinje, pasa, mačaka ili drugih vrsta sisara.

[0047] Antitelo može biti bilo koje od različitih klasa antitela, kao što je bez ograničenja IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, sekretorni IgA, IgD i IgE antitelo.

Nukleinske kiseline, vektori i ćelije domaćina

[0048] Iako su obezbeđene aminokiselinske sekvence monoklonalnih antitela, smatra se da sekvence nukleinske kiseline mogu biti dizajnirane da kodiraju bilo koje od ovih monoklonalnih antitela. Takvi polinukleotidi mogu kodirati laki lanac ili teški lanac anti-TFPI antitela. U nekim otelotvorenjima, takvi polinukleotidi mogu kodirati i laki lanac i teški lanac anti-TFPI antitela odvojenih degradirajućom vezom. Dalje, gore pomenuta antitela se mogu proizvesti upotrebom ekspresionih vektora koji sadrže izolovane molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koje od monoklonalnih antitela i ćelija domaćina koje sadrže takve vektore.

Metode pripremanja antitela do TFPI

[0049] Monoklonalno antitelo može biti proizvedeno rekombinantno ekspresijom nukleotidne sekvence koja kodira varijabilne regione monoklonalnog antitela prema otelotvorenjima pronalaska u ćeliji domaćinu. Uz pomoć vektora ekspresije, nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu može biti transfektovana i eksprimirana u ćeliji domaćinu koja je pogodna za proizvodnju. Shodno tome, takođe je obezbeđen postupak za proizvodnju monoklonalnog antitela koje se vezuje sa humanim TFPI koji sadrži:

(a) transfekciju molekula nukleinske kiseline koji kodira monoklonalno antitelo pronalaska u ćeliju domaćina,

(b) kultivisanje ćelije domaćina tako da se eksprimira monoklonalno antitelo u ćeliji domaćinu, i opciono

(c) izolovanje i prečišćavanje proizvedenog monoklonalnog antitela, pri čemu molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira monoklonalno antitelo iz ovog pronalaska.

[0050] U jednom primeru, da se eksprimiraju antitela, ili njihovi fragmenti antitela, DNK koji kodiraju delimične ili pune dužine lakih i teških lanaca dobijenih standardnim tehnikama molekularne biologije ubacuju se u ekspresione vektore tako da su geni operativno povezani sa transkripcionom i translacionom kontrolnom sekvencom. U ovom kontekstu, termin "operativno vezan" treba da znači da se gen antitela lizira u vektor tako da transkripcione i translacione kontrolne sekvence unutar vektora služe svojoj nameni da regulišu transkripciju i translaciju gena antitela. Ekspresioni vektor i sekvence za kontrolu ekspresije su izabrane tako da budu kompatibilne sa upotrebljenom ćelijom domaćina ekspresije. Gen lakog lanca antitela i gen teškog lanca antitela mogu biti ubačeni u odvojene vektore ili, tipičnije, oba gena su ubačena u isti vektor ekspresije. Geni antitela se ubacuju u ekspresioni vektor pomoću standardnih metoda (npr., ligacija komplementarnih restrikcionih mesta na fragmentu i vektoru gena antitela, ili ligacija na tupom kraju ako nisu prisutna restrikciona mesta).

Varijabilna područja lakih i teških lanaca antitela koja su ovde opisana mogu se koristiti za kreiranje gena antitela pune dužine bilo kog izotipa antitela ubacivanjem u vektore ekspresije koji već kodiraju konstantne i lake konstantne regione teškog lanca i konstantne regione lakog lanca željenog izotipa tako da VHsegment je operativno vezan za CHsegment(e) unutar vektora i VLsegment je operativno vezan za CLsegment unutar vektora. Dodatno ili alternativno, rekombinantni vektor ekspresije može kodirati signalni peptid koji olakšava sekreciju lanca antitela iz ćelije domaćina. Gen lanca antitela može biti kloniran u vektor tako da je signalni peptid povezan u okviru sa amino terminalom gena lanca antitela. Signalni peptid može biti imunoglobulinski signalni peptid ili heterologni signalni peptid (tj., signalni peptid iz neimunoglobulinskog proteina).

[0051] Pored gena za kodiranje lanca antitela, rekombinantni ekspresioni vektori pronalaska nose regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju gena lanca antitela u ćeliji domaćinu. Termin "regulatorna sekvenca" treba da uključi promotore, pojačivače i druge elemente za kontrolu ekspresije (npr., poliadenilacioni signali) koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena lanca antitela. Takve regulacione sekvence su opisane, na primer, u Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif.

(1990). Stručnjaci u ovoj oblasti će shvatiti da dizajn vektora ekspresije, uključujući selekciju regulatornih sekvenci, može zavisiti od faktora kao što je izbor ćelije domaćina koju treba transformisati, nivo ekspresije željenog proteina, itd. Primeri regulatornih sekvenci za ekspresiju ćelija domaćina sisara uključuju viralne elemente koji usmeravaju visok nivo ekspresije proteina u ćelijama sisara, kao što su promotori i/ili pojačivači izvedeni iz citomegalovirusa (CMV), Simian Virus 40 (SV40), adenovirus, (npr., glavni kasni promotor adenovirusa (ADMLP)) i poliom. Alternativno, mogu se koristiti ne virusne regulatorne sekvence, kao što je ubikvitinski promotor ili β-globinski promotor.

[0052] Pored gena za lanac antitela i regulatornih sekvenci, rekombinantni vektori ekspresije mogu nositi dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćina (npr., poreklo replikacije) i selektabilne markere gena. Selektivni markerski gen olakšava selekciju ćelija domaćina u koje je vektor uveden (videti, npr., U.S. Pat. Nos.4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017, sve od Axel i dr.). Na primer, tipično marker selektivni gen obezbeđuje otpornost na lekove, kao što je G418, higromicin ili metotreksat, na ćeliju domaćina u koju je vektor uveden. Primeri selektabilnih markerskih gena uključuju gen dihidrofolat reduktaze (DHFR) (za upotrebu u ćelijama dhfr-domaćina sa metotreksatom selekcije/amplifikacije) i neo gena (za selekciju G418).

[0053] Za ekspresiju lakih i teških lanaca, ekspresioni vektor(i) koji kodira teške i lake lance se transfektuje u ćeliju domaćina standardnim tehnikama. Različiti oblici termina "transfekcija" obuhvataju širok spektar tehnika koje se obično koriste za uvođenje egzogene DNK u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina, npr., elektroporacija, taloženje kalcijumfosfata, DEAE-dekstran transfekcija i slično . Iako je teoretski moguće eksprimirati antitela prema pronalasku bilo u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćina, najpoželjnija je ekspresija antitela u eukariotskim ćelijama i najpoželjnije ćelijama domaćina sisara, jer su takve eukariotske ćelije, a naročito ćelije sisara, veća je verovatnoća od prokariotskih ćelija da sakupljaju i luče pravilno savijeno i imunološki aktivno antitelo.

[0054] Primeri ćelija domaćina sisara za ekspresiju rekombinantnih antitela uključuju jajnik kineskog hrčka (CHO ćelije) (uključujući dhfr-CHO ćelije, opisane u Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, koji se koristi sa DHFR selektivnim markerom, npr., kao što je opisano u R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol.

159:601-621), NSO mijeloidne ćelije, COS ćelije, HKB11 ćelije i SP2 ćelije. Kada se rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju gene antitela uvode u ćelije domaćina sisara, antitela se proizvode kultivisanjem ćelija domaćina u periodu vremena dovoljnom da omogući ekspresiju antitela u ćelijama domaćina ili izlučivanje antitela u medijum kulture u kod kojih se rastu ćelije domaćini. Antitela se mogu izolovati iz medijuma za kulturu korišćenjem standardnih metoda za prečišćavanje proteina, kao što su ultrafiltracija, hromatografija sa isključenjem po veličini, jonoizmenjivačka hromatografija i centrifugiranje.

Upotreba parcijalnih sekvenci antitela za ekspresiju netaknutih antitela

[0055] Antitela interaguju sa ciljnim antigenima pretežno kroz aminokiselinske ostatke koji se nalaze u šest CDR-a teškog i lakog lanca. Iz tog razloga, aminokiselinske sekvence unutar CDR-a su raznovrsnije između pojedinačnih antitela nego sekvence izvan CDR-a. Zbog toga što su CDR sekvence odgovorne za većinu interakcija antitela i antigena, moguće je eksprimirati rekombinantna antitela koja oponašaju osobine specifičnih prirodnih antitela konstrukcijom ekspresionih vektora koji uključuju CDR sekvence iz specifičnog prirodnog antitela koje je naneseno na okvirne sekvence iz različitih antitela. sa različitim svojstvima (videti npr., Riechmann, L. i dr., 1998, Nature 332:323-327; Jones, P. i dr., 1986, Nature 321:522-525; and Queen, C. i dr., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 86:10029-10033). Takve okvirne sekvence se mogu dobiti iz javnih DNK baza podataka koje uključuju sekvence gena za germinaciju antitela. Ove sekvence germinativne linije će se razlikovati od zrelih sekvenci gena antitela, jer one neće uključivati potpuno sklopljene varijabilne gene, koji se formiraju pomoću V(D)J spajanja tokom sazrevanja B ćelija. Nije neophodno da se dobije celokupna DNK sekvenca određenog antitela da bi se stvorio netaknuto rekombinantno antitelo koje ima svojstva vezivanja slična onima originalnog antitela (videti WO 99/45962). Delimična sekvenca teškog i lakog lanca koja obuhvata CDR regione je tipično dovoljna za ovu svrhu. Delimična sekvenca se koristi da bi se odredilo koji segmenti germinalne varijable i spajanje gena doprinose rekombinovanim genima promenljivih gena. Sekvenca germinalne linije se zatim koristi za popunjavanje nedostajućih delova varijabilnih regiona. Vodeće sekvence teškog i lakog lanca se cepaju tokom sazrevanja proteina i ne doprinose svojstvima konačnog antitela. Iz tog razloga, neophodno je koristiti odgovarajuću sekvencu lidera germinalne linije za ekspresione konstrukte. Da bi se dodale sekvence koje nedostaju, klonirane sekvence cDNK se mogu kombinovati sa sintetskim oligonukleotidima ligacijom ili PCR amplifikacijom. Alternativno, čitavo varijabilno područje može biti sintetizovano kao skup kratkih, preklapajućih, oligonukleotida i kombinovano pomoću PCR amplifikacije da bi se stvorio potpuno sintetski klon varijabilnog regiona. Ovaj proces ima određene prednosti kao što su eliminacija ili uključivanje ili određena restrikciona mesta ili optimizacija određenih kodona.

[0056] Nukleotidne sekvence transkripata teškog i lakog lanca se koriste za dizajniranje preklapajućeg skupa sintetskih oligonukleotida da bi se dobile sintetske V sekvence sa identičnim kapacitetima kodiranja aminokiselina kao prirodne sekvence. Sintetičke sekvence teškog i lakog lanca mogu se razlikovati od prirodnih sekvenci na tri načina: nizovi ponovljenih nukleotidnih baza su prekinuti kako bi se olakšala sinteza oligonukleotida i PCR amplifikacija; optimalna mesta za iniciranje prevođenja su inkorporirana u skladu sa Kozakovim pravilima (Kozak, 1991, J. Biol. Chem.266:19867-19870); i mesta sa ograničenom endonukleazom su projektovana uzvodno od mesta inicijacije translacije.

[0057] Za varijabilne regione teškog i lakog lanca, optimizovano je kodiranje i odgovarajuće ne-kodirajuće sekvence lanaca se raščlanjuju na 30-50 nukleotidnih sekcija na približno srednjoj tački odgovarajućeg nekodirajućeg oligonukleotida. Prema tome, za svaki lanac, oligonukleotidi se mogu sklopiti u preklapajuće dvolančane skupove koji obuhvataju segmente od 150-400 nukleotida. Bazeni se zatim koriste kao šabloni za proizvodnju proizvoda PCR amplifikacije od 150-400 nukleotida. Tipično, jedan set varijabilnog regiona oligonukleotida će biti podeljen na dva skupa koji su odvojeno amplifikovani da bi se dobila dva preklapajuća PCR proizvoda. Ovi proizvodi koji se preklapaju se zatim kombinuju pomoću PCR amplifikacije da bi se formirao kompletan varijabilni region. Takođe može biti poželjno da se uključi preklapajući fragment konstantnog regiona teškog ili lakog lanca u PCR amplifikaciji da bi se generisali fragmenti koji se lako mogu klonirati u ekspresijske vektorske konstrukcije.

[0058] Rekonstruisane varijabilne regione teškog i lakog lanca se zatim kombinuju sa kloniranim promotorom, inicijacijom translacije, konstantnim regionom, 3’ netranslatovanim, poliadenilacionim i transkripcionim terminalnim sekvencama da se formiraju ekspresioni vektorski konstrukti. Konstrukti ekspresije teškog i lakog lanca mogu biti kombinovani u jedan vektor, ko-transfektovani, serijski transfektovani ili odvojeno transfektovani u ćelije domaćina koje su zatim fuzionisane da formiraju ćelije domaćina koje eksprimiraju oba lanca.

[0059] Prema tome, u drugom aspektu, strukturna svojstva humanog anti-TFPI antitela se koriste za stvaranje strukturno srodnih humanih anti-TFPI antitela koja zadržavaju funkciju vezivanja za TFPI. Specifičnije, jedan ili više CDR-ova iz specifično identifikovanih regiona teškog i lakog lanca monoklonskih antitela pronalaska mogu se kombinovati rekombinantno sa poznatim humanim okvirnim regionima i CDR-ovima da se stvore dodatna, rekombinantno-inženjerska, humana anti-TFPI antitela prema pronalasku.

Farmaceutski sastavi

[0060] Takođe su obezbeđeni farmaceutski sastavi koje sadrže terapeutski efikasne količine anti-TFPI monoklonskog antitela i farmaceutski prihvatljiv nosač. "Farmaceutski prihvatljiv nosač" je supstanca koja se može dodati aktivnom sastojku da pomogne u formulaciji ili stabilizaciji preparata i ne izaziva značajne štetne toksikološke efekte na pacijenta. Primeri takvih nosača su dobro poznati stručnjacima i obuhvataju vodu, šećere kao maltozu ili saharozu, albumin, soli kao što su natrijum hlorid, itd. Drugi nosači su opisani na primer u Remington's Pharmaceutical Sciences od E.V. Martin. Takvi sastavi će sadržati terapeutski efikasnu količinu najmanje jednog anti-TFPI monoklonskog antitela. U nekim otelotvorenjima, takvi sastavi mogu da sadrže terapeutski efikasnu količinu jednog ili više anti-TFPI monoklonskih antitela. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastavi mogu sadržati antitelo koje se specifično vezuje za Kunitz domen 1 kao što je gore opisano i antitelo koje se specifično vezuje za Kunitz domen 1 i 2 kao što je iznad opisano.

[0061] Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praške za improvizovanu pripremu sterilnih injektibilnih rastvora ili disperzija.

Upotreba takvih podloga i sredstava za farmaceutski aktivne supstance je poznata u tehnici. Sastav je poželjno formulisan za parenteralnu injekciju. Sastavi mogu biti formulisani kao rastvori, mikroemulzije, lipozom, ili druga uređena struktura pogodna za visoku koncentraciju leka. Nosač može biti rastvarač ili disperziona podloga koja sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, i tečni polietilen glikol i slično) i pogodne mešavine navedenog. U nekim slučajevima, on će uključivati izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole kao što su manitol, sorbitol ili natrijum hlorid u sastavu.

[0062] Sterilni sastavi za ubrizgavanje mogu biti pripremljeni uključivanjem aktivnog jedinjenja u željenoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka navedenih iznad, po potrebi, što je praćeno sterilizacionom mikrofiltracijom. Uopšteno, disperzije su pripremljene uključivanjem aktivnog sastojka u sterilno sredstvo za prenošenje koje sadrži osnovnu disperzionu podlogu i zahteva druge sastojke pored onih navedenih iznad. U slučaju sterilnih praškova za pripremanje sterilnih rastvora za ubrizgavanje, neki postupci za pripremanje uključuju vakuumsko sušenje i sušenje zamrzavanjem (liofilizovanje) kako bi se dobio prašak aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni sastojak iz prethodnog sterilno-filtriranog rastvora navedenog.

Farmaceutske primene

[0063] Monoklonalno antitelo može da se koristi u terapeutske svrhe za lečenje genetskih i stečenih nedostataka ili defekata u koagulaciji. Na primer, monoklonalna antitela u gore opisanim izvođenjima mogu da se koriste za blokiranje interakcije TFPI sa FXa, ili da se spreči inhibicija TF/FVIIa aktivnosti zavisna od TFPI. Dodatno, monoklonalno antitelo može takođe da se koristi za obnavljanje stvaranja FXa pokrenutog sa TF/FVIIa da bi se zaobišla insuficijencija FVIII- ili FIX-zavisnog pojačavanja FXa.

[0064] Monoklonalna antitela imaju terapeutsku upotrebu u lečenju poremećaja hemostaze kao što su trombocitopenija, poremećaji trombocita i poremećaji krvarenja (npr., hemofilija A, hemofilija B i hemofilija C). Takvi poremećaji mogu se lečiti davanjem terapeutski efikasne količine anti-TFPI monoklonskog antitela pacijentu kome je to potrebno.

Monoklonalna antitela takođe imaju terapeutsku upotrebu u lečenju nekontrolisanih krvarenja u indikacijama kao što su trauma i hemoragični moždani udar. Tako, takođe, obezbeđen je postupak za skraćivanje vremena krvarenja, koji se sastoji od davanja terapeutski efikasne količine anti-TFPI monoklonskog antitela pronalaska pacijentu kome je to potrebno.

[0065] Antitela se mogu koristiti kao monoterapija ili u kombinaciji sa drugim terapijama za rešavanje hemostatskog poremećaja. Na primer, zajedničko davanje jednog ili više antitela prema pronalasku sa faktorom zgrušavanja kao što je faktor VIIa, faktor VIII ili faktor IX se smatra korisnim za lečenje hemofilije. U jednom otelotvorenju, obezbeđen je postupak za lečenje genetskih i stečenih nedostataka ili defekata u koagulaciji koji se sastoji od davanja (a) prve količine monoklonskog antitela koje se vezuje za inhibitor putanje humanog tkivnog faktora i (b) drugu količinu faktora VIII ili faktora IX, pri čemu su navedene prve i druge količine zajedno efikasne za tretiranje navedenih nedostataka ili defekata. U još jednom otelotvorenju, obezbeđen je postupak za lečenje genetskih i stečenih nedostataka ili defekata u koagulaciji koji se sastoji od davanja (a) prve količine monoklonskog antitela koje se vezuje za inhibitor putanje humanog tkivnog faktora i (b) drugu količinu faktora VIII ili faktora IX, pri čemu su navedene prve i druge količine zajedno efikasne za tretiranje navedenih nedostataka ili defekata, i dalje gde faktor VII nije primenjen zajedno. Pronalazak takođe obuhvata farmaceutski sastav koji sadrži terapeutski efikasnu količinu kombinacije monoklonskog antitela prema pronalasku i faktora VIII ili faktora IX, pri čemu sastav sadrži faktor VII. "Faktor VII" uključuje faktor VII i faktor VIIa. Ove kombinovane terapije verovatno će smanjiti potrebnu frekvenciju infuzije faktora zgrušavanja. Pod istovremenom primenom ili kombinovanom terapijom podrazumeva se davanje dva terapeutska leka koji su formulisani odvojeno ili formulisani zajedno u jednom sastavu, i kada se formulišu odvojeno, primenjuju se ili približno u isto vreme ili u različito vreme, ali tokom istog terapijskog perioda.

[0066] Farmaceutski sastavi mogu se davati parenteralno subjektima koji pate od hemofilije A ili B u dozi i učestalosti koja može da varira u zavisnosti od težine epizode krvarenja ili, u slučaju profilaktičke terapije, može da varira u zavisnosti od težine pacijentovog nedostatka zgrušavanja.

[0067] Sastavi se mogu davati pacijentima kojima je potrebna bolus ili kontinuirana infuzija. Na primer, bolusno davanje inventivnog antitela prisutnog kao Fab fragment može biti u količini od 0.0025 do 100 mg/kg telesne težine, 0.025 do 0.25 mg/kg, 0.010 do 0.10 mg/kg ili 0.10-0.50 mg/kg. Za kontinualnu infuziju, antitelo koje se predlaže kao Fab fragment može se dati u količini od 0.001 do 100 mg/kg telesne težine/minuti, 0.0125 do 1.25 mg/kg/min, 0.010 do 0.75 mg/kg/min, 0.010 do 1.0 mg/kg/min. ili 0.10-0.50 mg/kg/min. u periodu od 1-24 sata, 1-12 sati, 2-12 sati, 6-12 sati, 2-8 sati, ili 1-2 sata. Za primenu antitela koje se pronalazi kao antitelo pune dužine (sa potpunim konstantnim regionima), količine doziranja mogu biti oko 1-10 mg/kg telesne težine, 2-8 mg/kg, ili 5-6 mg/kg. Ovakva antitela pune dužine obično se daju infuzijom koja se produžava za period od trideset minuta do tri sata. Učestalost primene zavisila bi od ozbiljnosti stanja. Učestalost može da se kreće od tri puta nedeljno do jednom svaka dva ili tri nedelje.

[0068] Dodatno, sastavi se mogu davati pacijentima putem subkutane injekcije. Na primer, doza od 10 do 100 mg anti-TFPI antitela može se primeniti kod pacijenata putem subkutane injekcije nedeljno, dva puta nedeljno ili mesečno.

[0069] Kako se ovde koristi, "terapeutski efikasna količina" označava količinu anti-TFPI monoklonskog antitela ili kombinacije takvog antitela i faktora VIII ili faktora IX koji je potreban da efektivno poveća vreme zgrušavanja in vivo ili na drugi način izazove merljivu korist u vivo pacijentu u potrebi. Precizna količina će zavisiti od brojnih faktora, uključujući, ali ne ograničavajući se na komponente i fizičke karakteristike terapeutskog sastava, nameravane populacije pacijenata, individualna razmatranja pacijenata, i slično, i može se lako odrediti od strane stručnjaka.

Primeri

Primer 1. Ekspresija i prečišćavanje rekombinantnog TFPI (Kunitz domena 2) iz E. coli. Ekspresioni sistem

[0070] Korišćen je odredišni vektor (prema Gateway nomenklaturi), označen kao pD Eco5 N. pD Eco5N zasniva se na pET-16b (Novagen), i dodatno kodira His10i NusA oznaku kao i Gateway klonirajuću kasetu za ekspresiju fuzionog proteina koji se sastoji iz His10/NusA i proteina od interesa.

[0071] TFPI konstrukt koji kodira mesto cepanja trombina fuzionisan na N-kraj Kunitz-ove domene 2 (Lys93 do Phe154, referentni Uniprot 10646) i Gateway vezna mesta (attB1-5 #, attB2-3 #, Invitrogen) je kloniran u pD Eco5 N vektor koji rezultira ekspresionim vektorom označenim kao pD Eco5 N TFPI KD2. Korišćen je BL21 DE3 (Novagen) soj ekspresije.

Aminokiselinska sekvenca eksprimiranog fuzionog proteina primenom pD Eco5N TFPI KD2, 600 AA

[0072]

Komponente sekvence

[0073]

Ekspresija

[0074] BL21 DE3 soj transformisan sa pD Eco5N #209 je uzgajan kao pre-kultura u 2x 50 mL LB podlozi sa 200 µg/mL ampicilina tokom 14 h na 37°C uz brzinu mešanja od 180 rpm. Sledeće, osam flašica za mućkanje sa 400 mL Circlegrov podloge (Q-Biogen), su svaka inokulisana sa 8 mL pre-kulture i inkubirana na 37°C, sa brzinom mešanja od 180 rpm. Pri gustini kulture OD600, dodan je IPTG (100 mM krajnja koncentracija) za indukciju gena i dalje kultivisan na 17°C tokom 24 h sa 180 rpm. E. coli se peletira centrifugiranjem (3000 g, 10 minuta) i čuva na -80 °C.

Prečišćavanje

[0075] Masa peletirane E. coli od 3,2 L kulture je resuspendovana u 200 mL pufera za lizu (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 10% (w/w) glicerol, 40 mM imidazol, koktel proteaze inhibitor Kompletna EDTA - slobodni (Roche)), homogenizovani u uređaju pod visokim pritiskom (Microfluidics) i nakon toga je lizat centrifugiran (100.000 g, 60 min, 4 °C). Nekoliko koraka prečišćavanja je izvedeno korišćenjem sistema Äkta Explorer.

Koncentrovani uzorak je primenjen u inicijalnom koraku IMAC hromatografije na dve povezane 5 mL jedinice Hi-Trap-Sepharose HP matrice (GE). Ekvilibracija, vezivanje fuzionog proteina i ispiranje matriksa Hi-Trap-Sepharose HP je izvršeno korišćenjem pufera A (50 mM Tris HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 40 mM imidazola). Za eluiranje fuzionog proteina NusA-TFPI, korišćen je linearni gradijent imidazola od 40 do 500 mM u puferu B (50 mM Tris HCl pH 8,0, 150 mM NaCl). Frakcije eluiranja su sakupljene i koncentrovane (za faktor 6-7 upotrebom Amicon uređaja za ultrafiltraciju) i pufer je zamenjen sa Tris HCl pH 8.0. Koncentrovani uzorak (6-7 mL) je dalje primenjen na hromatografiju isključivanja veličine korišćenjem Sephacryl-100 (XK26/74) u Tris HCl pH 8.0. Frakcije glavnog vrha koje sadrže fuzioni protein su sakupljene, koncentrovane ultrafiltracijom (Amicon) do zapremine od 5 mL. U uzorak je dodat trombin (HTI) (odnos enzima :fuzionog proteina, 1:50 w/w), inkubiran 5 h na 21 °C i reakcija je konačno zaustavljena pomoću PMSF (1 mM konačna koncentracija). Zatim je izvršen drugi korak isključenja za veličinu (Sephacryl-100 (XK26/74) u Tris HCl pH 8,0) i vršne frakcije su praćene pomoću PAGE. Frakcije koje sadrže slobodni monomerni TFPI Kunitz domen 2 su sakupljene i koncentrovane (Amicon), dajući oko 4 mg proizvoda iz 3.2 L kulture E. coli.

Primer 2. Proizvodnja rekombinantnog TFPI (Kunitz domena 1 2), ekspresija u E. coli i njeno prečišćavanje

Ekspresioni sistem

[0076] Vektor odredišta (prema Gateway nomenklaturi), označen kao pD Eco5 N, bazira se na ET-16 b (Novagen). Vektor takođe kodira oznaku His10i NusA, kao i Gateway klonirajuću kasetu za ekspresiju fuzionog proteina koji se sastoji od His10/NusA i proteina od interesa.

[0077] DNK konstrukt koji kodira mesto cepanja TEV proteaze fuzionisan na N-kraj Kunitzove domene 1+2 (Asp1 do Phe154, referentni Uniprot 10646) i Gateway vezna mesta (attB1-5 #, attB2-3 #, Invitrogen) je kloniran u pD Eco5 N vektor koji rezultira ekspresionim vektorom označenim kao pD Eco5 N TFPI KD1+2. Korišćeni soj ekspresije je BL21 DE3 (Novagen).

Aminokiselinska sekvenca eksprimiranog fuzionog proteina upotrebom pD Eco5N TFPI KD1+2, 600 AA

[0078]

Komponente sekvence

[0079]

Ekspresija

[0080] BL21 DE3 soj transformisan sa pD Eco5N TFPI KD1+2 je uzgajan kao pre-kultura u 2x 100 mL LB podlozi sa 200 µg/mL ampicilina tokom 14 h na 37°C uz brzinu mešanja od 180 rpm. Bioreaktor (Sartorius Stedim Biotech) sa zapreminom kulture 10 L (medijum LB, 200 ug/mL ampicilina) inokuliran je sa 200 mL pre-kulture i inkubiran na 37 °C, uz mešanje od 150 rpm. Pri gustini kulture OD600, dodan je IPTG (izopropil β-D-tiogalaktozid) do konačne koncentracije od 100 mM za indukciju gena i dalje kultivisan na 17 °C tokom 24 h sa pO2 minimalnim nivoom od 50% i brzinom mešanja od 180 - 800 rpm. E. coli se peletira centrifugiranjem (3000 g, 10 minuta) i čuva na -80 °C.

Prečišćavanje

[0081] Masa peletirane E. coli od 10 L kulture je ponovo suspendovana u 500 mL pufera za lizu (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 10% (w/w) glicerol, 40 mM imidazol, koktel proteaze inhibitor Kompletna EDTA - slobodni (Roche)), homogenizovani u uređaju pod visokim pritiskom (Microfluidics) i nakon toga je lizat centrifugiran (100.000 g, 60 min, 4 °C). Nekoliko koraka prečišćavanja je izvedeno korišćenjem sistema za prečišćavanje Äkta. Centrifugirana frakcija rastvornog lizata je primenjena u početnom IMAC hromatografskom koraku u kolonu koja sadrži 50 mL Ni-Sepharose HP matrice (GE). Ekvilibracija, vezivanje fuzionog proteina i ispiranje matriksa Hi-Trap-Sepharose HP je izvršeno korišćenjem pufera A (50 mM Tris HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 40 mM imidazola). Za eluiranje fuzionog proteina NusA-TFPI, korišćen je linearni gradijent imidazola od 40 do 500 mM u puferu B (50 mM Tris HCl pH 8,0, 150 mM NaCl). Frakcije eluacije su sakupljene (ukupna zapremina 140 mL) i primenjene u frakcijama u koloni za desalinizaciju Hi Prep 26/10 (GE) (dve povezane kolone) za razmenu u pufer sa 50 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2). Za uklanjanje Nus A oznake, proteolitičko varenje sa His6-označenim TEV, u odnosu enzima do fuzionih proteina od 1:66 w/w, izveden je 16 h na 4 °C. Uzorak je ponovo nanet na kolonu koja sadrži 50 mL Ni-Sepharose HP matrice (GE) da se odvoji slobodni TFPI od nečišćenog fuzionog proteina i His-TEV. Eluat koraka IMAC je zatim primenjen na hromatografiju isključivanja veličine, hromatografija isključivanja veličine (SEC, kolona S100, GE) da bi se izolovala monomerna TFPI frakcija koja je koncentrisana ultrafiltracijom (Amicon, jedinica sa 3 kDa-odsečenim opsegom) do oko 1.5 mg/mL. Prečišćeni konačni TFPI Kunitz domen 1 2 uzorak je tekao kao dvostruka traka u PAGE sa prividnom molekulskom masom od oko 18 kDa. Dalja analiza (SEC, zapadno blotovanje) otkrila je da je samo protein koji odgovara gornjoj liniji imunoreaktivan sa Fab B.

Primer 3. Proteolitička obrada i prečišćavanje Fab B iz humanog IgGl.

Ekspresija

[0082] Fab B je bio proteolitički obrađen iz svog humanog IgG1 oblika. Fab B_IgG1 je eksprimiran u ćelijama sisara (HEK 293) kao protein za sekreciju. Za izolaciju IgGl, supernatant kulture 1.6 L je primenjen na dve povezane kolone HiTrap MabSelectSuRE (od GE, 5 mL zapremine sloja, brzina protoka 1,5 mL/min, 4 °C, 16 h). Za ispiranje kolona i ekvilibraciju, korišćen je pufer koji se sastoji od PBS i 500 mM NaCl. Vezani IgGl je eluiran (50 mM Na-acetat, 500 mM NaCl pH 3.5 praćeno istim puferom sa pH 3.0), neutralisan (2.5 M Tris > 11) i koncentrovan ultrafiltracijom do oko 13 mg/mL.

[0083] Imobilisani papain (Pierce, 20 mL suspenzija) je korišćen za digestiju od oko 270 mg (u 12.5 mL) IgG1 koristeći 22 frakcije u 1.5 mL Eppendorf reakcionih epruveta (inkubacija 16 h, 37 °C, mešanje 1400 rpm). Posle obrade uzorci su centrifugirani, supernatant je sakupljen, pelet ispran sa PBS i oba supernatanta i očišćena isprana su sakupljena.

[0084] Digestirani uzorak je ponovo nanet na dve povezane HiTrap MabSelectSuRe kolone (2 x 5 mL) koje omogućavaju odvajanje Fc i Fab materijala. Sakupljene izolovane Fab B frakcije su koncentrovane ultra filtracijom do oko 8 mg/mL (ukupni prinos 120 mg). Dodatno, za daljnje prečišćavanje je korišćena hromatografija isključivanja veličine sa Superdex75 (kolona 26/60, protok 2,5 mL/min sa PBS). Posle dalje koncentracije i sterilne filtracije konačni prinos Fab B je bio 115 mg u koncentraciji od 8.5 mg/mL.

[0085] Za demonstraciju formiranja kompleksa Fab B/TFPI KD1 2 (Slika 1) korišćena je analitička hromatografija veličine (Äkta Micro sistem, S755/150 kolona, 100 mM Tris HCl, pH 7.5). Za Fab B je primećeno neočekivano dugo retenciono vreme na SEC koloni koje odgovara očiglednoj molekulskoj masi od 20 kDa, koja je veoma slična molekulskoj masi detektovanoj za TFPI KD1+2.

Primer 4. Proizvodnja kompleksa TFPI Kunitz domena 1 2 sa Fab B

[0086] U cilju formiranja imunog kompleksa, TFPI Kunitz domen 1+2 i Fab B su kombinovani u odnosu od približno 1:1.5 (w/w). Prema tome, 3.85 mg koncentrovanog, monomernog TFPI Kunitz domena 1 2 proteina (iz S100 objedinjenih frakcija) je pomešano sa 7.4 mg Fab B (iz SEC Superdex75) i inkubirano 16 h na 21 °C. Formiranje kompleksa je demonstrirano pomoću analitičkog SEC (S200/150) i zapadnog blotovanja. Kompleks je dalje prečišćen sa SEC (S20026/26) u 10 mM Tris HCl pH 7,4 sa 150 mM NaCl, koncentrovan ultrafiltracijom (Amicon, jedinica sa 5 kDa-odsečenim opsegom) do 10,3 mg/mL, koji je korišćen za kristalizacija.

Primer 4. Određivanje kristalizacije i rendgenske strukture kompleksa TFPI-Fab B Kristalizacija

[0087] Ko-kristali proteinskog konstrukta koji sadrži TFPI - Kunitz domen 1 (KD1) i Kunitz domen 2 (KD2) i monoklonalno TFPI antitelo Fab B su gajeni na 4 °C koristeći metodu sedećeg ispuštanja. Proteinski kompleks je koncentrovan do 10 mg/mL i kristalizovan mešanjem jednakih zapremina rastvora proteina i rastvora otvora (20% PEG8000) kao taloga. Kristali su se pojavili nakon tri dana.

Prikupljanje i obrada podataka

[0088] Kristali su zamrznuti u tečnom azotu u 30% glicerolu u puferu za kristalizaciju za kriozaštitu. Podaci jednog kristala sakupljeni su na zračnoj liniji BL14.1, sinhrotronu BESSY (Berlin) na MAR CCD detektoru. Podaci su indeksirani i integrisani sa IMOSFLM (A.G.W. Leslie, (1992), Joint CCP4 ESF-EAMCB Newsletter on Protein Crystallography, No.26), pripremljen za skaliranje POINTLESS (P.R. Evans, (2005) Acta Cryst. D62, 72-82) i skalirano sa SCALA (P.R. Evans, (2005) Acta Cryst. D62, 72-82). Kristal je difrakcionisan do 2.3 Å i poseduje prostornu grupu P21sa ćelijskim konstantama a=80.3, b=71.9, c=108.8; β=92.5° i dva TFPI-KD1, -KD2 - Fab kompleksa u asimetričnoj jedinici.

Određivanje strukture i poboljšanje

[0089] Ko-struktura TFPI-KD1, -KD2 i Fab monoklonskog antitela rešena je molekularnom zamenom upotrebom PHASER (A.J. McCoy i dr (2007) J. Appl. Cryst. 40, 658-674), MOLREP (A.Vagin and A.Teplyakov (1997) J. Appl. Cryst.30, 1022-10) i kod kuće i objavljene rendgenske strukture TFPI-KD2 (pdb kod 1tfx) i Fab fragment (pdb kod 1w72) kao modeli pretraživanja. Pre molekularne zamene Fab i KD1 modeli su obrađeni sa CHAINSAW (N. Stein, (2008) J. Appl. Cryst.41, 641 - 643). Iterativne runde izrade modela sa COOT (P. Emsley i dr. (2010) Acta Cryst. D66:486-501) i maksimalna preciznost upotrebe REFMAC5.5 (G.N. Murshudov i dr. (1997) Acta Cryst. D53, 240-255) završio model. Region hc_Ser131 - hc_Ser136 i Fabs, TFPI ostaci Asp1 - Leu21, Asp149 - Phe154 i KD1 - KD2 vezni ostaci Arg78 - Glu92 pokazali su slabu elektronsku gustinu i nisu bili uključeni u model. Statistike skupa podataka i preciziranja sumirane su u Tabeli 1.

Tabela 1. Statistike i statistički podaci za kompleks TFPI-Fab B.

<a>Vrednosti u zagradama su za ljusku visoke rezolucije.

<b>Rspajanje= ∑hkl |Ihkl- <Ihkl>|/∑hkl <Ihkl> gde je Ihklintenzitet refleksije hkl i <Ihkl> je prosečni intenzitet višestrukih opservacija.

<c>Rkrist= ∑ |Fobs- Fcalc|/∑ Fobsgde su Fobsi Fcalcposmatrani i izračunate amplitude faktora strukture, respektivno.<d>5% komplet test

<e>RMSD, srednja kvadratna devijacija od skupa parametara za idealnu stereohemiju

Primer 5. Mapiranje epitopa na bazi rendgenske strukture

[0090] Kompleks TFPI-KD1, -KD2 i Fab B (Slika 2) kristalizovao je kao dve kopije kompleksa po asimetričnoj jedinici. Glavni lanci kompleksa superponiraju sa ukupnim RMSD od 1.0 Å sa svakim Fab B vezanim za epitop povezanih TFPI-KD1 i -KD2. Oba Kunitz-ova domena interaguju direktno ili kroz interakcije posredovane vodom sa Fab B. KD1 i KD2 takođe interaguju jedan sa drugim. Ostaci TFPI u kontaktu sa Fab B (epitopom) i odgovarajućom ukopanom površinom analizirani su pomoću CCP4 programa AREAIMOL (P.J. Briggs (2000) CCP4 Newsletter No.38). Smatra se da su ostaci sa najmanje 5 Å<2>ukopanih površina ili više od 50% zakopane površine (Tabela 2). Ostaci Fab B u kontaktu sa TFPI (paratope) i odgovarajućom pokopanom površinom su analizirani sa AREAIMOL-om. Smatra se da su ostaci sa najmanje 5 Å<2>ukopanih površina ili više od 50% zakopane površine (Tabela 3).

Tabela 2:Ostaci TFPI u kontaktu sa Fab B. Lanci C, D i lanci N, O odgovaraju TFPI Kunitz domenima 1 i Kunitz domenu 2 dotičnog kompleksa u asimetričnoj jedinici.

Tabela 3:Ostaci Fab B u kontaktu sa TFPI. Lanci A, B i lanci L, M predstavljaju Fab B lake i teške lance odgovarajućeg kompleksa u asimetričnoj jedinici.

[0091] Fab B je prepoznao nelinearni epitop KD1 i KD2 koji je definisan ostacima Asp31-Lys36, Cys59 (koji formira disulfidni most sa Cys35), Glu60, i Asn62 of TFPI-KD1 i Glu100, Glu101, region Pro103 - Cys106 (koji formira disulfidni most sa Cys130), ostaci Arg107-Tyr109, Phe114, Asn116, Glu123, Arg124, i ostaci Lys126 - Gly128 TFPI-KD2. Paratope u Fab B koje su u interakciji sa TFPI-KD1 uključuju lc_Leu27 - lc_Tyr31, lc_Asp50, lc_Asn65, lc_Trp90, lc_Asp92, lc_Gly93, i hc_Arg101 i hc_Tyr102. Paratope u Fab B koji interaguje sa TFPI-KD2 uključuje lc_Tyr31, lc_Tyr48 i lc_Tyr49, i hc_Thr28, hc_Arg30 - hc_Tyr32, hc_Tyr100, hc_Arg101, hc_Trp103, i hc_Asp105. CDRs lakog lanca izgleda da su glavna mesta interakcije za TFPI-KD1, CDR-ovi teškog lanca su glavni sajtovi interakcije za TFPI-KD2, na osnovu broja kontakata.

[0092] Nelinearni epitop na TFPI-KD1 se sastoji od dva regiona petlje koji su povezani disulfidnim mostom između Cys35 i Cys59. Epitop je karakterisan centralnom hidrofobnom interakcijom Pro34 okružen trouglom polarnih interakcija Asp31, Asp32, Glu60 i Lys36 sa Fab B (Slika 3).

[0093] Pro34 leži u hidrofobnom rascepu koji je stvorio lc_Tyr30 i lc_Tyr31 CDR-L1, lc_Trp90 CDR-L3 i hc_Tyr102 CDR-H3. Asp31 i Asp32 poseduju polarnu interakciju sa CDR-H3 i mrežu vodonične veze sa hc_Arg101, hc_Tyr102 i molekulom vode. Hc_Tyr102 bočni lanac je dobro orijentisan da poseduje hidrofobnu interakciju sa Pro34, polarnu interakciju sa Asn31, i aromatičnu π-π interakciju sa lc_Trp90 CDR-L3.

[0094] Interakcija Asp31 i Asp32 sa CDR-H3 je ključna karakteristika epitopa i orijentacije i interakcije hc_Tyr102 i hc_Arg101 su ključne. Mutacija divljeg tipa ostatka hc_Lys99 do leucina rezultirala je 20-strukim povećanjem afiniteta. Hc_Leu99 se nalazi u hidrofobnom interfejsu između lakog i teškog lanca i sledi ga petlja CDR-H3. Polarni i fleksibilni lizinski bočni lanac predstavlja nedostatak na ovom položaju i ometa optimalne CDR-H3 konformacije i interakcije antigena.

[0095] Glu60, koji formira drugi ugao polarnog trougla, stupa u interakciju sa bočnim lancima lc_Tyr30 (CDR-L1), lc_Trp90 i azotom glavnog lanca lc_Gly93 (CDR-L3).

[0096] Treći ugao trougla je formiran od strane Lys36. Lys36 je esencijalni ostatak za inhibiciju kompleksa faktora VIIa/tkivnog faktora TFPI (M.S. Bajaj i dr. (2001) Thromb Haemost 86(4):959-72.). U kompleksu sa Fab B, Lis36 je značajno kontaktiran i zakopan sa CDR-Ll lc_Leu27, lc_Arg28, lc_Asn29, lc_Tyr31, CDR-L2 lc_Asp50 i molekulom vode. Interakcija Lys36 sa kompleksom faktora VIIa/tkivnog faktora dok je vezana za Fab B i njegova inhibicija su isključeni.

[0097] Nelinearni epitop na TFPI-KD2 se sastoji od tri sekcije koje sadrže ostatke Glu100, Glu101, Pro103 - Tyr109, Phe114; Asn116 i Glu123; Arg124, Lys126 - Gly128. KD2-epitop formira polarne i hidrofobne interakcije sa Fab B CDR-L1, - L2, -H1 i -H3 (Slika 4).

[0098] Glu100, Glu101, Arg107 i Tir109 su ključni ostaci epitopa koji obezbeđuju jake polarne ili hidrofobne tačke sidrenja u kontaktu sa tri odvojena površinska područja Fab B stvorena od CDR-H1 (interakcija sa Glu100 i Glu101) CDR-L1, -L2, -H3 (interakcija sa Arg107), i CDR-L2, -H3 (interakcija sa Tyr109).

[0099] Arg107 je značajno kontaktiran sa lc_Tyr31, lc_Tyr49, hc_Arg101, i hc_Tyr102 CDR-L1, -L2, -H3, respektivno, i dodatno stupa u interakciju sa Gly33 i Cys35 KD1. Arg107 pokazalo se da je neophodno za inhibiciju faktora Xa (M.S. Bajaj i dr. (2001) Thromb Haemost 86(4):959-72.). Fab B zauzima ovaj kritični ostatak i isključuje Arg107 funkciju u inhibirajućem faktoru Xa.

[0100] Glu100 i Glu101 formiraju vodonične veze sa CDR-H1 ostacima hc_Arg30, hc_Ser31, i hc_Thr28 i hc_Tyr32.

[0101] Tyr109 leži u hidrofobnoj niši stvorenoj od CDR-L2 lc_Tyr48, i CDR-H3 ostataka hc_Tyr100, i hc_Trp103, i formira vodoničnu vezu sa hc_Asp105.

Primer 6. Paratope poređenje Fab B i njegove optimizovane varijante Fab D

[0102] Da bi se procenila konzistentnost vezivanja epitopa TFPI optimizovanom varijantom Fab B, Fab D, analizirane su poravnanje sekvenci lakog i teškog lanca (slika 7A) i homolognih modela Fab D (slika 7B) radi očuvanja ostataka Fab B paratope u Fab D.

Homološki modeli su izračunati sa DS MODELER (ACCELRIS, Inc; Fiser, A. i Sali A.

(2003) Methods in Enzymology, 374:463-493) koristeći našu TFPI - Fab B rendgensku strukturu kao strukturu ulaznog šablona. Modeli homologije pokazuju skoro identične konformacije kičme u poređenju sa Fab B sa RMSD < 0,5 Å. Od 29 ostataka paratope posmatranih u kompleksu TFPI-Fab B, sedam ostataka (pet ostataka lakog lanca, dva ostatka teškog lanca) se razlikuju u Fab D (Slika 7). Lc_Arg28; lc_Asn29, lc_Asp92 i lc_Gly93 pokazuju interakcije glavnog lanca sa ostacima epitopa TFPI. Ne očekuje se da će razmena ovih ostataka u Fab D izazvati vezivanje za različiti TFPI epitop. Zamena lc_Tir48 i hc_Gln1 sa fenilalaninom i glutamatom u Fab D je zanemarljiva, jer se ne vide interakcije polarnog lanca u rendgenskoj strukturi. Hc Arg30 pokazuje polarnu interakciju sa Glu100 od TFPI i razmenjuje se u serin u Fab D. Na osnovu očekivanog uticaja analiziranih razmena između Fab B i Fab D paratope ostataka, ukupne konzervacije sekvence i niskog RMSD od Fab D homolognog modela, Fab D se smatra da prepoznaje isti TFPI epitop kao Fab B.

Primer 7 Obrazloženje zasnovano na rendgenskoj strukturi za inhibiciju interakcije TFPI sa faktorom Xa i kompleksom faktora VIIa/faktor tkiva

[0103] Fab B se vezuje za KD1 i KD2 od TFPI. KD2 vezuje i inhibira faktor Xa. KD1 vezuje i inhibira kompleks faktora VIIa/tkivnog faktora. Rendgenske strukture KD2 u kompleksu sa tripsinom (M.J. Burgering i dr (1997) J Mol Biol.269(3):395-407) i BPTI u kompleksu sa vanćelijskim delom TF i faktora VIIa(E. Zhang i dr (1999) J Mol Biol 285(5):2089-104.) su prijavljene. Tripsin je surogat za faktor Xa, BPTI je homolog TFPI-KD1. Superpozicija TFPI-Fab B kompleksa sa KD2-tripsinom ili BPTI-faktorom VIIa/tkivnim faktorom otkriva da vezivanje antitela isključuje vezivanje KD1 i KD2 za njihove prirodne ligande faktor VIIa/faktor tkiva i faktor Xa, respektivno (Slika 5, Slika 6).

Claims (2)

Patentni zahtevi

1. Izolovano monoklonalno antitelo koje se vezuje za epitop humanog inhibitora puta tkivnog faktora (SEQ ID NO:1),

gde navedeni epitop sadrži jedan ili više ostataka Kunitz domena 1, izabranih iz grupe koju čine Asp31, Asp32, Gly33, Pro34, Cys35, Lys36, Cys59, Glu60 i Asn62, i gde navedeni epitop sadrži jedan ili više ostataka Kunitz domena 2, izabranih iz grupe koja se sastoji iz Glu100, Glu101, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Phe114, Asn116, Glu123, Arg124, Lys126, Tyr127 i Gly128 i gde izolovano monoklonalno antitelo sadrži varijabilni laki lanac (VL) SEQ ID NO:4 i varijabilni teški lanac (VH) SEQ ID NO:5.

2. Farmaceutski sastav koji sadrži terapeutski efikasnu količinu monoklonskog antitela iz patentnog zahteva 1 i farmaceutski prihvatljiv nosač.