CN105473619B - 能够引起促凝血活性的识别组织因子途径抑制剂的n-末端部分的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的N‑末端部分(残基1‑79)的表位的抗体。本发明的抗体可能够中和TF/FVIIa复合物的TFPI抑制，甚至在升高水平的TFPI存在的情况下。所述抗体可在治疗患有凝血病的受试者，例如患有血友病A或B(含或不含抑制剂)的那些受试者中找到用途。

Description

能够引起促凝血活性的识别组织因子途径抑制剂的N-末端部 分的抗体
发明领域
本发明涉及促凝血抗体和其组合物，所述抗体能够特异性结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的N-末端部分中的表位。本发明还涉及所述抗体的药学和治疗用途。
背景
在出血个体中，当血管外组织因子(TF)暴露于血液中的活化因子VII (FVIIa)时，凝血通过TF/FVIIa复合物起始。TF/FVIIa复合物形成导致因子X (FX)激活成FXa，其连同活化因子V (FVa)一起产生有限量的凝血酶。起始量的凝血酶激活血小板，其进而导致血小板磷脂的表面暴露，血小板磷脂支持了由活化因子VIII (FVIIIa)和活化因子IX (FIXa)组成的tenase复合物的装配和结合。tenase复合物是FX激活的非常有效的催化剂，和在该步骤中产生的FXa用作负责最终凝血酶突发的FVa/FXa凝血酶原酶复合物中的活性蛋白酶。凝血酶裂解纤维蛋白原以产生纤维蛋白单体，其聚合以形成纤维蛋白网络。快速和大量的凝血酶突发是形成固体和稳定纤维蛋白凝块的必要条件。
由FVIII或FIX缺乏引起的FXa和凝血酶产生的不充分增长分别是血友病A或B患者的出血素质的根本原因。在患有血友病的人中，FXa产生主要受TF/FVIIa复合物驱动：FVIII或FIX缺乏导致通过tenase复合物的初步FXa产生。然而，TF/FVIIa-介导的FX激活成FXa是暂时的，因为在自调节回路中组织因子途径抑制剂(TFPI)抑制TF/FVIIa复合物。反馈抑制导致形成TF/FVIIa/FXa/TFPI复合物。TFPI抑制的钝化在起始凝血期间延长TF/FVIIa-介导的FX激活，并促进止血。由于例如FVIII或FIX缺乏所致，血友病患者罹患受损的tenase活性。在这些患者中，TFPI抑制的阻断可补偿不充分的FXa产生和使出血素质正常化。
TFPI是缓慢的紧密-结合竞争性抑制剂，其通过抑制FXa和TF/FVIIa复合物两者调节FX激活。TFPI包含三个串联排列的Kunitz-型蛋白酶抑制剂结构域(KPI 1-3)。FXa的TFPI抑制发生在二相反应中，其最初产生松散的TFPI-FXa复合物，然后缓慢重排成紧密结合的TFPI-FXa复合物，其中KPI-2结合和阻断FXa的活性位点。开始凝血后，TF/FVIIa-介导的FXa产生被TFPI严格减量调节。TF/FVIIa在以下过程中被TFPI抑制，所述过程作为限速步骤，似乎包括当FXa结合至TF/FVIIa复合物或在TF/FVIIa复合物的附近结合到细胞膜上时FXa的TFPI抑制(Baugh等, J Biol Chem. 1998; 273(8):4378-86)。KPI-1有助于形成紧密的TFPI-FXa复合物和直接结合以及阻断TF-结合的FVIIa的活性位点(Girard等, Nature1989; 338:518-520; Peraramelli等, Thromb. Haemost. 2012; 108:266-276)。
在体内，在数个细胞区室中发现TFPI。TFPI的主要部分与血管内皮有关，次要部分在血液中循环。已描述TFPI的两种剪接变体TFPI alpha (TFPIα)和TFPI beta (TFPIβ)存在于人中。内皮细胞是TFPI产生的主要部位，并表达两种变体。内皮细胞表面上的主要形式推测是TFPIβ。TFPIα被分泌至血浆中或存在于胞内储库，其可在某种刺激时被释放。分泌的TFPIα在血液中作为全长蛋白(10%)或作为具有不同的分子质量的修饰的蛋白(90%)循环；后者可由于例如C-末端区的截短或与脂蛋白缔合导致。分泌的TFPIα还可通过与例如糖胺聚糖相互作用结合内皮细胞表面。TFPIα还通过血小板产生和贮存在血小板中。
已知TFPI在人中的半寿期为约60–120分钟，和已知总正常人血浆TFPI浓度为约1.0–2.5 nM。相比之下，已知抗体在人中的半寿期很长：多至数周，这取决于免疫球蛋白亚型、来源和具体的氨基酸组成。当某些已知的TFPI抗体，例如公开于Augustsson等, J Thromb Haemost. 2013, 11:s2, PA 4.14-2的mAb 0001抗体与TFPI在循环中形成复合物时，血浆中的总TFPI浓度(游离TFPI加TFPI/抗体复合物)可上升至高达20-40 nM的浓度(Augustsson等同上)。因此，体内给予TFPI抗体可导致TFPI/抗体复合物累积至远高于TFPI的给予前血浆浓度的浓度。在其中TFPI/抗体复合物的抑制活性未完全中和的情况下，累积可逆转否则促凝血的TFPI抗体的作用，导致净抗凝血作用。
本发明人展望，本文公开的抗体和包含所述抗体的药物组合物可解决这样的局限性。
简述
本发明涉及特异性结合组织因子途径抑制剂的N-末端部分的表位的抗体。
在一个方面，本发明涉及TFPI抗体，其结合包含以下N-末端氨基酸残基中的至少一个的TFPI表位：SEQ ID NO: 1的Leu 16、Pro 17、Leu 19、Lys 20、Leu 21、Met 22、Phe25、Cys 35、Ala 37、Met 39、Arg 41、Tyr 56、Gly 57、Gly 58、Cys 59、Glu 60、Gly 61、Asn62、Gln 63、Arg 65、Phe 66、Glu 67、Glu 71和Met 75。
在本发明的一个方面，TFPI抗体表位包含以下N-末端氨基酸残基：SEQ ID NO: 1的Arg 41、Arg 65和Glu 67。
在一个方面，本发明的抗体通过例如与TF/FVIIa竞争结合TFPI-KPI-1，中和TF/FVIIa复合物的TFPI抑制。TFPI (1-79)结合抗体结合、掩蔽或在构象上改变TFPI (SEQ IDNO: 1)上的TF/FVIIa结合表面或其部分，从而在功能上阻断TFPI-TF/FVIIa相互作用，可中和TF/FVIIa复合物的TFPI抑制。
在另一方面，本发明的抗体中和TFPI KPI-1对导致在TFPI KPI-2和FXa之间形成紧密复合物的反应的刺激作用。
在另一方面，本发明的TFPI (1-79)抗体结合和中和所有形式的TFPI。
在一个方面，本发明的抗体中和TFPI，甚至在其中循环中的总TFPI水平升高的环境下，并且此外在这些条件下使凝血酶产生正常化。
本发明还涉及包含能够特异性结合TFPI (1-79)中的表位的至少一种抗体和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物制剂。
本发明的抗体或包含所述抗体的药物制剂可用作药物 – 例如在治疗患有凝血病的受试者中用作药物。
附图简述
图1显示数种TFPI (1-79)抗体对凝血酶产生的作用(TGT测定法)，如在通过加入100 μg/ml FVIII抗体获得的血友病A-样情况下使用正常人血浆(NHP)库所测量。
图2显示数种TFPI (1-79)抗体对凝血酶产生的作用(TGT测定法)，如在通过加入5nM重组全长TFPIα至NHP获得的升高的TFPIα水平的情况下使用NHP库所测量。血友病A-样情况通过加入100 μg/ml FVIII抗体获得。
序列简述
SEQ ID NO: 1表示人TFPIα的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 2表示TFPI (1-79)的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 3表示TFPI (1-161)的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 4表示单克隆抗体(mAb) 2F3的可变重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 5表示单克隆抗体(mAb) 2F3的可变轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 6表示单克隆抗体(mAb) 2F22的可变重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 7表示单克隆抗体(mAb) 2F22的可变轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 8表示单克隆抗体(mAb) 2F45的可变重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 9表示单克隆抗体(mAb) 2F45的可变轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 10表示单克隆抗体(mAb) 1F91的可变重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 11表示单克隆抗体(mAb) 1F91的可变轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 12表示单克隆抗体(mAb) 2F35的可变重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 13表示单克隆抗体(mAb) 2F35的可变轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 14表示用于克隆抗体重链的引物的核酸序列。
SEQ ID NO: 15表示用于克隆抗体轻链的引物的核酸序列。
SEQ ID NO: 16表示Fab 0296的截短的鼠-人嵌合重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 17表示单克隆抗体mAb 0294和Fab 0296的鼠-人嵌合轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 18表示标记的TFPI KPI-1/N-末端的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 19表示单克隆抗体mAb 0294的鼠-人嵌合重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 20表示Fab 0295的截短的鼠-人嵌合重链的氨基酸序列。
描述
成熟人TFPIα是276个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO: 1)，其由酸性N-末端区、由接头区交替的三个串联的Kunitz-型蛋白酶抑制剂结构域(KPI-1、KPI-2和KPI-3)和碱性C-末端区组成。KPI-1、KPI-2和KPI-3分别定义为SEQ ID NO: 1的残基26-76、残基97-147和残基189-239。成熟TFPIβ是糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定的193个氨基酸蛋白，其中前181个氨基酸与TFPIα (对应于SEQ ID NO: 1的残基1-181)相同，但其中C-末端12个氨基酸序列与TFPIα无关，并具有添加至残基193的GPI-键合。
本发明涉及能够结合TFPI区的抗体，所述TFPI区表示TFPI的酸性N-末端区和KPI-1结构域，或其任何部分。
本文使用的术语“TFPI”包括任何天然存在形式的TFPI，其可源自任何合适的生物体。例如，按本文所述使用的TFPI可以是哺乳动物TFPI，例如人、小鼠、兔、大鼠、灵长类动物、牛、羊或猪TFPI。优选地，TFPI是人TFPI。TFPI可以是成熟形式的TFPI，例如已在合适细胞内经历翻译后加工的TFPI蛋白。这样的成熟TFPI蛋白可例如被糖基化。TFPI可以是全长TFPI蛋白。术语TFPI还包括这样的TFPI分子的变体、同工型和其它同源物。变体TFPI分子的特征可在于具有与天然存在的TFPI相同类型的活性，例如中和FXa的催化活性的能力，或抑制TF/FVIIa复合物或三元TF/FVIIa/FXa复合物的能力。
术语“抗体”在本文是指自种系免疫球蛋白序列衍生的蛋白，其能够特异性结合抗原或其部分：即TFPI (1-79)。术语抗体包括任何类型(或同种型)的全长抗体，即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和/或IgY。特异性结合抗原或其部分的抗体可专门结合抗原或其部分，或其可结合有限数量的同源抗原或其部分。
天然全长抗体通常包含至少4条多肽链：通过二硫键连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。在一些情况下，天然抗体由少于四条链组成，如在在骆驼(camelid)中发现的仅重链抗体(VHH片段)和在软骨鱼纲中发现的IgNAR的情况下。一类具有特别的药用益处的免疫球蛋白是IgG类。在人中，基于它们的重链恒定区的序列，可将IgG类分成四个亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。基于它们的序列组成差异，可将轻链分成两种类型：κ和λ链。IgG分子由通过两个或更多个二硫键互连的两条重链和各自通过二硫键与重链连接的两条轻链组成。IgG重链可包含重链可变区(VH)和至多三个重链恒定(CH)区：CH1、CH2和CH3。轻链可包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。VH和VL区可进一步细分为称为互补决定区(CDR)或高度可变区(HvR)的高变区，其交替有更保守的称为框架区(FR)的区。VH和VL区通常由三个CDR和四个FR构成，从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。具有重链和轻链的高度可变区的可变结构域形成能够与抗原相互作用的结构域，同时抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子结合，所述宿主组织或因子包括但不限于免疫系统的各种细胞(效应细胞)、Fc受体和经典补体系统的C1复合物的第一成分(C1q)。
本发明的抗体可以是分离的。术语“分离的抗体”是指已从其所产生的环境中的其它(另一)成分中分离和/或回收和/或已从其所产生的环境中存在的成分的混合物中纯化的抗体。
在本发明的抗体代表自单个B-细胞或通过B细胞的克隆群表达的一组独特的重链和轻链可变结构域序列的意义上，它们可以是单克隆抗体。本发明的抗体可使用本领域技术人员已知的各种方法产生和纯化。例如，抗体可自杂交瘤细胞产生。抗体可通过B-细胞扩增产生。抗体或其片段可在哺乳动物或微生物表达系统中重组表达，或通过体外翻译产生。抗体或其片段还可通过例如噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、哺乳动物细胞展示、核糖体或mRNA展示的方式，作为细胞表面结合分子重组表达。一旦产生，抗体可针对其结合TFPI(包括亚结构域例如TFPI (1-79) (SEQ ID NO: 2))的能力进行筛选。
抗体的各种抗原-结合片段也可以是本发明的抗体，因为已表明抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段实现。术语抗体的“抗原结合片段”是指保留特异性结合或识别抗原(例如本文所述的人TFPI (1-79)或另一靶分子)的能力的抗体的一个或多个片段。抗原结合片段的实例包括Fab、Fab’、Fab2、Fab’2、FabS、Fv (典型地，抗体单臂的VL和VH结构域)、单链Fv (scFv；参见例如Bird等, Science 1988; 242:423-426；和Huston等PNAS1988; 85:5879-5883)、dsFv、Fd (典型地，VH和CHI结构域)和dAb (典型地，VH结构域)片段；VH、VL、VhH和V-NAR结构域；包含单一VH和单一VL链的单价分子；微型抗体、双抗体、三链抗体、四链抗体和κ抗体(参见例如Ill等Protein Eng 1997;10:949-57)；骆驼IgG；IgNAR；以及一个或多个分离的CDR或功能互补位，其中分离的CDR或抗原-结合残基或多肽可缔合或连接在一起，以形成功能抗体片段。各种类型的抗体片段已描述或综述于例如，Holliger和Hudson, Nat Biotechnol 2005; 23:1126-1136；WO2005040219和美国专利申请20050238646和20020161201。这些抗体片段可使用本领域技术人员已知的常规技术获得，和这些片段可以与完整抗体相同的方式针对效用进行筛选。
抗体的“Fab片段”，包括“Fab”、“Fab’”和“Fab’2”片段，通过在铰链区中在连接抗体的重链的铰链半胱氨酸残基的N-末端或C-末端侧上裂解重链而源自所述抗体。“Fab”片段包括轻链的可变和恒定结构域以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)。“Fab'2”片段包含一对“Fab'”片段，其通常通过它们的铰链半胱氨酸共价连接。Fab'在形式上通过裂解连接Fab'2中的重链的铰链二硫键而源自Fab'2片段。抗体片段的二硫键以外的其它化学偶联也是本领域已知的。Fab片段保留母体抗体结合其抗原的能力，可能具有较低的亲和力。Fab'2片段能够二价结合，而Fab和Fab’片段可单价结合。通常，Fab片段缺少恒定CH2和CH3结构域，即其中会发生与Fc受体相互作用的Fc部分。因此，Fab片段通常没有效应器功能。Fab片段可通过本领域已知的方法，通过酶裂解抗体产生，例如使用木瓜蛋白酶以获得Fab或使用胃蛋白酶以获得Fab'2。Fab片段，包括Fab、Fab'、Fab'2，也可使用本领域技术人员众所周知的技术重组产生。
“Fv”片段是包含完整抗原识别和结合位点的抗体片段，和通常包含缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体，所述缔合在性质上可为共价的；例如在单链可变结构域片段(scFv)中。在该构型中，每个可变结构域的三个高度可变区相互作用以在VH-VL二聚体表面上规定抗原结合位点。总的来说，六个高度可变区或其子集赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至包含仅三个对抗原特异性的高度可变区的单一可变结构域可保留识别和结合抗原的能力，尽管通常亲和力低于完整的结合位点(Cai & Garen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 6280-6285, 1996)。例如，仅具有重链可变结构域(VHH)的天然存在的骆驼抗体可结合抗原(Desmyter等, J. Biol. Chem., 277: 23645-23650,2002;Bond等, J. Mol. Biol. 2003; 332: 643-655)。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。通常，Fv多肽还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其使scFv能够形成抗原结合的所需结构。对于scFv的综述，参见Plückthun, 1994的The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg和Moore编辑. Springer-Verlag, NewYork, 第269-315页。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小的抗体片段，其中所述片段包含在相同多肽链(VH和VL)中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用因太短而不允许在相同链上的两个可变结构域之间配对的接头，可变结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。双抗体更全面地描述于例如，EP 404,097；WO93/11161；和Hollinger等, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448。
表述“线性抗体”是指描述于Zapata等, 1995, Protein Eng., 8(10):1057-1062中的抗体。简言之，这些抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，其连同互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区。
本文使用的术语“单抗体(monobody)”是指具有重链可变结构域和没有轻链可变结构域的抗原结合分子。单抗体可在不存在轻链时结合抗原和通常具有三个高度可变区，例如称为CDRH1、CDRH2和CDRH3的CDR。重链IgG单抗体具有通过二硫键连接的两个重链抗原结合分子。重链可变结构域包含一个或多个高度可变区，优选地CDRH3或HVL-H3区。
在本文中，术语“抗原”可指用于免疫具有免疫能力的脊椎动物以产生识别其的抗体或其片段的实体。在本发明的情况下，适合于免疫的抗原包括全长人TFPIα、人TFPI (1-79)和人TFPI (1-161)。术语抗原另外意图包括被抗体特异性识别的靶分子，因此包括用于免疫过程或用于分离/产生和表征抗体的其它方法(例如噬菌体展示、ELISA或SPR)的分子的片段或模拟物。
本发明的抗体可以能够与另一分子(例如天然存在的配体或受体或另一抗体)竞争结合TFPI，由此影响与这些相互作用有关的功能。抗体与天然配体/受体竞争的能力可通过测量对TFPI抑制的表观KI的影响的各种活性测定法评价。然后，KD值可自表观KI值推导出。
因此，抗体片段可使用常规重组或蛋白工程改造技术获得，和所述片段可针对与TFPI或其亚结构域例如人TFPI (1-79)结合以与完整抗体相同的方式进行筛选。
本发明的抗体片段可通过截短制备，例如通过自多肽的N和/或C-末端除去一个或多个氨基酸制备。片段也可通过一个或多个内部缺失产生。
本发明的抗体可以是人或人源化的抗体。本文使用的术语“人抗体”意图包括具有可变区的抗体，其中至少一部分的框架区和/或至少一部分的CDR区源自人种系免疫球蛋白序列。(例如，人抗体可具有可变区，其中框架区和CDR区两者都源自人种系免疫球蛋白序列。)此外，如果抗体包含恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包括并非通过人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。
这样的人抗体可以是人单克隆抗体。这样的人单克隆抗体可通过杂交瘤产生，所述杂交瘤包括与永生细胞融合的获自具有包含人免疫球蛋白重链和轻链基因区段库的基因组的转基因非人动物例如转基因小鼠的B细胞。
人抗体可分离自在人种系序列的选择上建立的序列库，所述序列库还用天然和合成的序列多样性多样化。
人抗体可通过体外免疫人淋巴细胞接着用Epstein-Barr病毒转化淋巴细胞制备。
术语“人抗体衍生物”是指任何修饰形式的人抗体，例如抗体和另一作用剂或抗体的缀合物。
本文使用的术语“人源化抗体”是指人/非人嵌合抗体，其包含源自非人免疫球蛋白的序列(CDR区或其部分)。因此，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中至少来自受体的高度可变区的残基被具有所需的特异性、亲和力、序列组成和功能性的来自非人物种的抗体(供体抗体)的高度可变区的残基置换，所述非人物种例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物。在一些实例中，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基置换。这样的修饰的实例是引入一个或多个所谓的回复突变，其通常是源自供体抗体的氨基酸残基。抗体的人源化可使用本领域技术人员已知的重组技术进行(参见例如Antibody Engineering,Methods in Molecular Biology, vol. 248, Benny K. C. Lo编辑)。对于轻链和重链可变结构域两者的合适的人受体框架可通过例如序列或结构同源性鉴定。或者，可使用固定的受体框架，例如基于结构、生物物理和生物化学性质的知识。受体框架可以是种系来源的，或源自成熟抗体序列。来自供体抗体的CDR区可通过CDR移植而转移。CDR移植的人源化抗体可通过鉴定关键的框架位置进一步针对例如亲和力、功能性和生物物理性质而优化，在所述框架位置中来自供体抗体的氨基酸残基的再引入(回复突变)对人源化抗体的性质具有有益影响。除了供体抗体来源的回复突变之外，人源化抗体还可通过在CDR或框架区中引入种系残基、消除免疫原性表位、定点诱变、亲和力成熟等进行工程改造。
此外，人源化抗体可包含不存在于受体抗体或供体抗体中的残基。进行这些修饰以进一步精修抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个 – 通常两个 – 可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白中的那些，和其中所有或基本上所有的FR残基为人免疫球蛋白序列中的那些。人源化抗体可任选地还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的至少一部分。
术语“人源化抗体衍生物”是指任何修饰形式的人源化抗体，例如抗体和另一作用剂或抗体的缀合物。
本文使用的术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其轻链和重链基因已自源自不同物种的免疫球蛋白可变和恒定区基因被构建(通常通过基因工程改造)。例如，来自小鼠单克隆抗体的基因的可变区段可与人恒定区连接。
抗体的片段可结晶区(“Fc区”/“Fc结构域”)是抗体的C-末端区，其包含恒定CH2和CH3结构域。Fc结构域可与称为Fc受体的细胞表面受体以及补体系统的一些蛋白相互作用。Fc区使抗体能够与免疫系统相互作用。在本发明的一个方面，抗体可经工程改造以包括Fc区内的修饰，通常改变一个或多个其功能性质，例如血清半寿期、补体固定、Fc-受体结合、蛋白稳定性和/或抗原依赖性细胞毒性，或其缺失等等。此外，本发明的抗体可经化学修饰(例如，一个或多个化学部分可与抗体连接)或经修饰以改变其糖基化，再次改变抗体的一个或多个功能性质。IgG1抗体可携带修饰的Fc结构域，其包含一个或多个、和可能所有的以下突变，其将分别导致对某些Fc受体的亲和力降低(L234A、L235E和G237A)和C1q-介导的补体固定减少(A330S和P331S) (残基编号根据EU索引)。
本发明的抗体的同种型可以是IgG，例如IgG1，例如IgG2，例如IgG4。如果需要的话，抗体的类别可通过已知技术“转换”。例如，初始作为IgM分子产生的抗体可经类别转换成IgG抗体。类别转换技术亦可用于转化一个IgG亚类至另一个亚类，例如：自IgG1至IgG2或IgG4；自IgG2至IgG1或IgG4；或自IgG4至IgG1或IgG2。亦可通过组合来自不同的IgG亚类的区，工程改造抗体以产生恒定区嵌合分子。
在一个实施方案中，CH1的铰链区经修饰使得铰链区的半胱氨酸残基的数量改变，例如增加或减少。该方法进一步描述于例如Bodmer等的美国专利号5,677,425。
恒定区可经修饰以使抗体稳定，例如降低二价抗体分离成两个单价VH-VL片段的风险。例如，在IgG4恒定区中，残基S228 (残基编号根据EU索引)可突变成脯氨酸(P)残基以使铰链处的重链间二硫桥形成稳定(参见例如Angal等, Mol. Immunol. 1993; 30:105-8)。
抗体或其片段可根据其互补决定区(CDR)来定义。术语“互补决定区”或“高度可变区”，当用于本文时，是指参与抗原结合的氨基酸残基位于其中的抗体的区。高变区或CDR可鉴定为在抗体可变结构域的氨基酸比对中具有最高可变性的区。数据库可用于CDR鉴定，例如Kabat数据库，所述CDR定义为包含轻链可变结构域的氨基酸残基24-34 (L1)、50-56(L2)和89-97 (L3)和重链可变结构域的31-35 (H1)、50-65 (H2)和95-102 (H3) (Kabat等. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, U.S.Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)。或者，CDR可定义为来自"高变环"的那些残基(轻链可变结构域的残基26-33 (L1)、50-52 (L2)和91-96 (L3)和重链可变结构域的26-32 (H1)、53-55 (H2)和96-101 (H3)；Chothia和Lesk,J. Mol. Biol. 1987; 196: 901-917)。通常，在该区中氨基酸残基的编号通过描述于Kabat等，同上的方法进行。词语例如“Kabat位置”、“Kabat残基”和"根据Kabat"在本文中是指用于重链可变结构域或轻链可变结构域的该编号系统。使用Kabat编号系统，肽的实际线性氨基酸序列可包含对应于可变结构域的框架(FR)或CDR的缩短或插入的更少或另外的氨基酸。例如，重链可变结构域可包括在CDR H2的残基52后的氨基酸插入(根据Kabat的残基52a、52b和52c)和在重链FR残基82后插入的残基(例如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。对于给定的抗体，可通过在抗体序列与"标准" Kabat编号序列的同源性区域比对确定残基的Kabat编号。
抗体的原始CDR可经工程改造以改进例如其亲和力、功能性和生物物理性质。抗体CDR可通过在任何位置上引入或加入种系残基或非种系残基进行工程改造。CDR氨基酸组成的改变可导致消除预期的免疫原性表位，优化生物物理性质例如粘性、聚集，消除修饰热点例如脱酰胺化、异天冬氨酸形成或甲硫氨酸氧化位点。除去CDR中的半胱氨酸残基也是需要的，因为这防止异常二硫键形成或改组。亦可获得抗体的生物化学特征的优化，例如通过消除潜在的糖基化位点。CDR区的优化还可导致生产特征的改进。通过互补位优化或再设计，CDR修饰还可导致抗体-抗原界面的优化。这样的优化可包括引入其中侧链化学允许与抗原新的相互作用的氨基酸。优化还可导致消除互补位-表位相互作用中的空间阻碍或导致CDR环构象、柔性或刚性的优化。
所述突变可通过使用例如定点诱变进行设计而引入至CDR区中，或通过例如易错PCR或合成多样化DNA片段或PCR引物随机引入至CDR区中。修饰亦可通过改组来自特异性结合相同抗原的其它抗体的CDR序列引入。
术语“框架区”或“FR”残基是指不在本文定义的CDR内的那些VH或VL氨基酸残基。
本发明的抗体可包含来自本文公开的一种或多种特异性抗体的CDR区，例如SEQID NO: 4-13内的CDR区，如使用Kabat或Chothia编号或按照本文公开的连续氨基酸编号所定义。
本发明的抗体可具有重链，其包含：
● 对应于SEQ ID NO: 4的氨基酸31-35 (SYGVH)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
● 对应于SEQ ID NO: 4的氨基酸50-65 (VIWRGGSTDFNAAFMS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
● 对应于SEQ ID NO: 4的氨基酸98-110 (NSHGNYVGYAMDY)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个或两个可被不同的氨基酸置换。
本发明的抗体可具有轻链，其包含：
● 对应于SEQ ID NO: 5的氨基酸24-34 (KASENVGAAVA)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个、两个或三个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
● 对应于SEQ ID NO: 5的氨基酸50-56 (SASNRYT)的CDR2序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
● 对应于SEQ ID NO: 5的氨基酸89-96 (QQYTNYPT)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换。
本发明的抗体可具有重链，其包含：
● 对应于SEQ ID NO: 6的氨基酸31-35 (NYGVH)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
● 对应于SEQ ID NO: 6的氨基酸50-65 (VIWRGGSIDYNAAFMS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
● 对应于SEQ ID NO: 6的氨基酸98-110 (NSHGNYVGYAMDY)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个或两个可被不同的氨基酸置换。
本发明的抗体可具有轻链，其包含：
● 对应于SEQ ID NO: 7的氨基酸24-34 (KASQSVGPAVA)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个、两个或三个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
● 对应于SEQ ID NO: 7的氨基酸50-56 (SASNRYT)的CDR2序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
● 对应于SEQ ID NO: 7的氨基酸89-96 (QQYTSYPT)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换。
本发明的抗体可具有重链，其包含：
● 对应于SEQ ID NO: 8的氨基酸31-35 (GYGVH)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
● 对应于SEQ ID NO: 8的氨基酸50-65 (VIWRGGSIDYNAAFMS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
● 对应于SEQ ID NO: 8的氨基酸98-110 (NSHGNYVGYAMDY)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个或两个可被不同的氨基酸置换。
本发明的抗体可具有轻链，其包含：
● 对应于SEQ ID NO: 9的氨基酸24-34 (KASQNVGTAVA)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个、两个或三个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
● 对应于SEQ ID NO: 9的氨基酸50-56 (SASNRYT)的CDR2序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
● 对应于SEQ ID NO: 9的氨基酸89-96 (QQYTSYPT)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换。
本发明的抗体可具有重链，其包含：
● 对应于SEQ ID NO: 10的氨基酸31-36 (SDYAWN)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
● 对应于SEQ ID NO: 10的氨基酸51-66 (YISYSGSTSYNPSLKS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
● 对应于SEQ ID NO: 10的氨基酸99-104 (WAYDGP)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸置换。
本发明的抗体可具有轻链，其包含：
● 对应于SEQ ID NO: 11的氨基酸24-33 (RASSSVSHMH)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个或两个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
● 对应于SEQ ID NO: 11的氨基酸49-55 (ATSNLAS)的CDR2序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
● 对应于SEQ ID NO: 11的氨基酸88-96 (QQWSSNPFT)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换。
本发明的抗体可具有重链，其包含：
● 对应于SEQ ID NO: 12的氨基酸31-35 (DYYIH)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
● 对应于SEQ ID NO: 12的氨基酸50-66 (WIDPENGNTIFDPKFQG)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
● 对应于SEQ ID NO: 12的氨基酸99-105 (RWYAMDY)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸置换。
本发明的抗体可具有轻链，其包含：
● 对应于SEQ ID NO: 13的氨基酸24-39 (KSSQSLLYTNGKTYLN)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个、两个或三个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
● 对应于SEQ ID NO: 13的氨基酸55-61 (LVSKLDS)的CDR2序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
● 对应于SEQ ID NO: 13的氨基酸94-102 (LQSTHFPWT)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换。
本文使用的术语“表位”在“抗原结合多肽”例如抗体和其相应的抗原之间的分子相互作用的背景下定义。一般而言，“表位”是指抗体特异性结合的在抗原上的区域或区，即与抗体物理接触的区域或区。抗体和抗原分子中的原子的物理接触可使用各种标准(例如间距截止值为2-6Å，例如3Å，例如4 Å，例如5Å；或溶剂可及性)进行定义。蛋白表位可包含抗原中直接参与结合抗体的氨基酸残基(亦称为表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其它氨基酸残基，例如被抗体有效封闭的抗原氨基酸残基，即在抗体的“溶剂排斥表面”和/或"足迹"内的氨基酸残基。
本文的术语“表位”在特异性结合TFPI抗体或本发明的另一种TFPI-特异性作用剂的TFPI的任何特定区中包含两种类型的结合区，除非另有说明。TFPI可包含大量不同的表位，其可包括但不限于，(1) 线性肽表位；(2) 由在成熟TFPI构象中位于彼此附近的一个或多个非连续氨基酸组成的构象表位；和(3) 整体或部分由与TFPI共价连接的分子结构(例如碳水化合物基团)组成的翻译后表位。
给定的抗体/抗原对的表位可以不同的细节水平使用各种实验和计算表位作图方法描述和表征。实验方法包括诱变、X-射线晶体学、核磁共振(NMR)波谱学、氢氘交换质谱(HX-MS)和各种竞争结合方法；本领域已知的方法。因为各种方法依赖于独特的原理，因此表位的描述与其所测定的方法紧密相关。因此，根据所用的表位作图方法，对于给定的抗体/抗原对的表位可不同地描述。
在其最详细的水平上，抗原和抗体之间相互作用的表位可通过定义抗原-抗体相互作用中存在的原子接触的空间坐标，以及关于其对结合热力学的相对贡献的信息来描述。在较不详细的水平上，表位可表征为定义抗原和抗体之间的原子接触的空间坐标。在甚至更不详细的水平上，表位可表征为其包含的氨基酸残基，如通过特定标准例如抗体:抗原复合物的原子之间的间距或抗体:抗原复合物的原子的溶剂可及性所定义。在进一步更不详细的水平上，表位可表征为功能，例如与其它抗体的竞争结合。表位还可更一般性定义为包含其置换为另一氨基酸将改变抗体和抗原之间相互作用的特征的氨基酸残基。
在由抗体例如Fab片段和其抗原之间的复合物的空间坐标定义的X-射线来源的晶体结构的背景下，除非另外说明或上下文有相反指示，否则在本文中术语表位明确地定义为在离抗体的重原子(即非氢原子)4 Å的间距内具有重原子的TFPI残基。
根据表位的描述和定义以不同的细节水平获得(根据所用的表位作图方法)的事实，由此可见可以不同的细节水平类似地进行相同抗原上对不同的抗体的表位比较。
在氨基酸水平上描述的表位，例如自X-射线结构测定，如果它们包含一组相同的氨基酸残基，则被认为是相同的。如果表位共有至少一个氨基酸，则表位被认为是重叠的。如果表位未共有氨基酸残基，则表位被认为是分开的(独特的)。
术语“互补位”的定义通过将视角反转而源自上述“表位”定义。因此，术语“互补位”是指在抗体上抗原特异性结合的区域或区，即与抗原物理接触的区域或区。
结合相同抗原的抗体可关于其同时结合其共同抗原的能力进行表征，和可进行“竞争结合”/“箱并法(binning)”。在本文中，术语“箱并法”是指将结合相同抗原的抗体分组的方法。抗体的“箱并法”可基于测定法中两种抗体对其共同抗原的竞争结合，所述测定法基于标准技术例如表面等离子体共振(SPR)、Biolayer干涉测定法、ELISA或流式细胞术。
抗体的“箱(bin)”可使用单一参比抗体或一组参比抗体来定义。对于给定的抗体，“箱”鉴定的分辨率将随所用的参比抗体的数量而增加。当使用单一参比抗体时，如果第二抗体不能与参比抗体同时结合抗原，则第二抗体被认为属于与参比抗体相同的“箱”。在该情况下，参比抗体和第二抗体竞争结合抗原的相同部分，被称为“竞争抗体”。如果第二抗体能够与参比抗体同时结合抗原，则第二抗体被认为属于分开的“箱”。在该情况下，参比抗体和第二抗体不竞争结合抗原的相同部分，被称为“非竞争抗体”。当使用一组参比抗体用于“箱”鉴定时，所述参比抗体组可包含可通过交叉竞争分析用于定义个体抗体“箱”的一组已知或新的抗体，其中测定在组内的各抗体与组的各成员竞争抗原结合。当抗体A与抗体B在交叉竞争分析中显示相同结合模式时，它们被认为属于相同的“箱”。当抗体A与抗体B显示针对参比组中的一种或多种个体抗体的不同的竞争结合特征时，它们被认为属于不同的“箱”。竞争结合特征是汇编的数据集，其中测定在组内的各抗体与组的另一成员同时结合抗原的能力。例如，相对于抗体1、2和3的参比组，抗体A的抗原结合特征如下：A+1= 不被A结合；A+2 = 被A结合；A+3 = 被A结合。如果：B+1= 被B结合；B+2 = 被B结合；B+3 = 被B结合，则与抗体A相比抗体B具有不同的竞争结合特征和这两种抗体被认为属于不同的“箱”。如果：C+1= 不被C结合；C+2 = 被C结合；C+3 = 被C结合，则与抗体A相比抗体C具有类似的结合特征和这两种抗体被认为属于相同的“箱”。如所述的，对于给定的抗体，“箱”鉴定的分辨率将随所用的参比抗体的数量而增加。竞争结合测定法不提供关于结合亲和力的信息和所述测定法必须以使得所测试的抗体单独能够足够充分地结合抗原以起到结合竞争剂的作用的方式设计。
测定抗体与抗原的变体(例如带有突变、截短、缺失、插入的那些)以及抗原同源物(例如物种同源物)的结合亦可用于抗体“箱并法”或用于增加抗体“箱并法”的分辨率。
抗体“箱并法”不提供关于表位的直接信息。竞争抗体，即属于相同“箱”的抗体，可具有相同的表位、重叠的表位或甚至分开的表位。后者是如果与其抗原表位结合的参比抗体占据第二抗体与其抗原表位接触所需的空间(“空间位阻”)的情况。非竞争抗体通常具有分开的表位。
术语“结合亲和力”在本文中用作两个分子(例如抗体或其片段和抗原)之间非共价相互作用的强度度量。术语“结合亲和力”用于描述单价相互作用(内在活性)。
两个分子(例如抗体或其片段和抗原)之间通过单价相互作用的结合亲和力可通过测定平衡离解常数(KD)量化。而KD可通过复合物形成和离解的动力学测量来测定，例如通过SPR方法。对应于单价复合物的缔合和离解的速率常数分别称为缔合速率常数ka (或kon)和离解速率常数kd (或koff)。KD通过等式KD = kd / ka而关联ka和kd。
按上述定义，与不同的分子相互作用有关的结合亲和力，例如不同的抗体对于给定的抗原的结合亲和力的比较，可通过比较各抗体/抗原复合物的KD值进行比较。
本发明的抗体可能够与另一分子(例如天然存在的配体或受体或另一抗体)竞争结合TFPI。因此，本发明的抗体可能够以比也能够结合TFPI的另一分子更大的亲和力结合TFPI。抗体与天然配体/受体竞争结合抗原的能力可通过测定和比较目的相互作用(例如抗体和抗原之间的特异性相互作用)的KD值与非目的相互作用的KD值进行评价。通常，抗体对于靶标的KD将是对于其它非靶分子例如不相关物质或环境中的伴随物质的KD的1/2、优选1/5、更优选1/10。更优选地，KD将是1/50，例如1/100或1/200；甚至更优选1/500，例如1/1,000或1/10,000。
该离解常数的值可通过众所周知的方法直接测定。评价配体例如抗体对靶标的结合能力的标准测定法是本领域已知的，和包括例如ELISA、蛋白质印迹、RIA和流式细胞术分析。抗体的结合动力学和结合亲和力还可通过本领域已知的标准测定法例如SPR评价。
可进行竞争结合测定法，其中将抗体与靶标的结合与靶标与靶标的另一配体(例如另一抗体)的结合进行比较。
本发明的抗体对其靶标可具有1 x 10-7M或更低、1 x 10-8M或更低、或1 x 10-9M或更低、或1 x 10-10M或更低、1 x 10-11M或更低、或1 x 10-12M或更低的KD。本发明的抗体的KD可以为小于0.8 nM、例如小于0.7 nM、例如小于0.6 nM、例如小于0.5 nM、例如小于0.4 nM、例如小于0.3 nM、例如小于0.2 nM、例如小于0.1 nM、例如小于0.05 nM、例如小于0.025nM、例如小于0.015 nM、例如在0.015 nM和0 nM之间。
在另一方面，本发明提供包含本发明的分子(例如本文所述的抗体)的组合物和制剂。例如，本发明提供药物组合物，其包含一种或多种本发明的TFPI抗体，其与至少一种药学上可接受的赋形剂一起配制。
因此，本发明的一个目标是提供包含这样的TFPI抗体的药物制剂，所述抗体以0.25 mg/ml至250 mg/ml的浓度存在，和其中所述制剂具有2.0至10.0的pH。制剂还可包含缓冲剂系统、防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂或表面活性剂的一种或多种，以及其各种组合。防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂在药物组合物中的用途是技术人员众所周知的。可参考Remington: The Science和Practice of Pharmacy, 第19版, 1995。
在一个实施方案中，药物制剂是水性制剂。这样的制剂通常是溶液或混悬液，但也可包括胶体、分散液、乳液和多相物质。术语“水性制剂”定义为包含至少50% w/w水的制剂。同样地，术语“水性溶液”定义为包含至少50% w/w水的溶液，和术语“水性混悬液”定义为包含至少50% w/w水的混悬液。
在另一实施方案中，药物制剂为冻干制剂，在使用前医生或患者向其中加入溶剂和/或稀释剂。
在另一方面，药物制剂包含这样的抗体和缓冲液的水性溶液，其中抗体以1 mg/ml或更高的浓度存在，和其中所述制剂具有约2.0至约10.0的pH。
本发明的抗体或包含所述抗体的制剂可用于治疗患有凝血病的受试者。
本文使用的术语“受试者”包括任何人患者或非人脊椎动物。
本文使用的术语“凝血病”是指增加的出血倾向，其可由正常凝血级联的任何促凝血组分的任何性质上或数量上的缺乏或纤维蛋白溶解的任何增量调节引起。这样的凝血病可以是先天性和/或后天性和/或医源性的，和通过本领域技术人员来鉴定。
先天性低凝血病(hypocoagulopathy)的非限制性实例是血友病A、血友病B、因子VII缺乏、因子X缺乏、因子XI缺乏、冯维勒布兰德氏病和血小板减少例如Glanzmann氏血小板机能不全(Glanzmann’s thombasthenia)和Bernard-Soulier综合征。所述血友病A或B可以是重度、中度或轻度的。血友病的临床严重性通过血液中FIX/FVIII的功能单位的浓度来测定，和分类为轻度、中度或重度的。重度血友病定义为<0.01 U/ml的凝固因子水平，对应于<1%的正常水平，而中度和轻度患者分别具有1-5%和>5%的水平。含有“抑制剂” (即，针对因子VIII的同种异体抗体)的血友病A和含有“抑制剂” (即，针对因子IX的同种异体抗体)的血友病B是部分先天性和部分后天性的凝血病的非限制性实例。
后天性凝血病的非限制性实例是由维生素K缺乏引起的丝氨酸蛋白酶缺乏；所述维生素K缺乏可通过给予维生素K拮抗剂例如华法林引起。后天性凝血病还可在广泛创伤后产生。在该情况下，另外称为“血液恶性循环”，特征在于血稀释(稀释性血小板减少和凝固因子的稀释)、低体温、凝固因子消耗和代谢紊乱(酸中毒)。流体疗法和增加的纤维蛋白溶解可加重该情况。所述出血可来自身体的任何部分。
医源性凝血病的非限制性实例是过剂量的抗凝血药 – 例如肝素、阿司匹林、华法林和其它血小板聚集抑制剂 – 其可经处方给予以治疗血栓栓塞性疾病。医源性凝血病的另一非限制性实例是通过过度和/或不当的流体疗法诱导的凝血病，例如可通过输血诱导的凝血病。
在本发明的一个实施方案中，出血与血友病A或B有关。在另一实施方案中，出血与含有后天性抑制剂的血友病A或B有关。在另一实施方案中，出血与血小板减少有关。在另一实施方案中，出血与冯维勒布兰德氏病有关。在另一实施方案中，出血与严重组织损伤有关。在另一实施方案中，出血与严重创伤有关。在另一实施方案中，出血与手术有关。在另一实施方案中，出血与出血性胃炎和/或肠炎有关。在另一实施方案中，出血为大量子宫出血，例如在胎盘分离中。在另一实施方案中，出血发生在进行机械止血可能性受限的器官中，例如颅内、耳内或眼内。在另一实施方案中，出血与抗凝血疗法有关。
本文使用的术语“治疗”是指有需要的任何人或其它脊椎动物受试者的医学疗法。所述受试者预期已经历了由医学从业人员或兽医学从业人员的身体检查，所述从业人员已给出了试验性或确定性的诊断，其将指明所述特定治疗的使用对所述人或其它脊椎动物的健康是有益的。根据受试者健康的现状，所述治疗的时机和目的可自一个个体至另一个而改变。因此，所述治疗可以是预防性的、姑息性的、针对症状的和/或治愈性的。就本发明而言，预防性的、姑息性的、针对症状的和/或治愈性的治疗可代表本发明的单独方面。
本发明的抗体可经胃肠外给予，例如静脉内，例如肌内，例如皮下。或者，本发明的抗体可经由非胃肠外途径给予，例如口服或局部。本发明的抗体可预防性给予。本发明的抗体可治疗性给予(按需要)。
以下是本发明的实施方案的非限制性列表：
实施方案
1.抗体或其片段，其能够特异性结合在人TFPI (SEQ ID NO: 1)的氨基酸残基1-79中存在的表位。
2.实施方案1的抗体或其片段，其能够结合在人TFPI的氨基酸残基26-76 (KPI-1)中存在的表位。
3.实施方案1-2中任一项的抗体或其片段，其具有等于或小于1E-08 M的Kd，如使用表面等离子体共振测定。
4.实施方案1-3中任一项的抗体或其片段，其重链包含：
●对应于SEQ ID NO: 4的氨基酸31-35 (SYGVH)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 4的氨基酸50-65 (VIWRGGSTDFNAAFMS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 4的氨基酸98-110 (NSHGNYVGYAMDY)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个或两个可被不同的氨基酸置换。
5.实施方案1-3中任一项的抗体或其片段，其重链包含：
●对应于SEQ ID NO: 6的氨基酸31-35 (NYGVH)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 6的氨基酸50-65 (VIWRGGSIDYNAAFMS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 6的氨基酸98-110 (NSHGNYVGYAMDY)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个或两个可被不同的氨基酸置换。
6.实施方案1-3中任一项的抗体或其片段，其重链包含：
●对应于SEQ ID NO: 8的氨基酸31-35 (GYGVH)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 8的氨基酸50-65 (VIWRGGSIDYNAAFMS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 8的氨基酸98-110 (NSHGNYVGYAMDY)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个或两个可被不同的氨基酸置换。
7.实施方案4-6中任一项的抗体或其片段，其轻链包含：
●对应于SEQ ID NO: 5的氨基酸24-34 (KASENVGAAVA)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个、两个或三个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 5的氨基酸50-56 (SASNRYT)的CDR2序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 5的氨基酸89-96 (QQYTNYPT)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换。
8.实施方案4-6中任一项的抗体或其片段，其轻链包含：
●对应于SEQ ID NO: 7的氨基酸24-34 (KASQSVGPAVA)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个、两个或三个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 7的氨基酸50-56 (SASNRYT)的CDR2序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 7的氨基酸89-96 (QQYTSYPT)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换。
9.实施方案4-6中任一项的抗体或其片段，其轻链包含：
●对应于SEQ ID NO: 9的氨基酸24-34 (KASQNVGTAVA)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个、两个或三个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 9的氨基酸50-56 (SASNRYT)的CDR2序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 9的氨基酸89-96 (QQYTSYPT)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换。
10.实施方案1-3中任一项的抗体或其片段，其重链包含：
●对应于SEQ ID NO: 10的氨基酸31-36 (SDYAWN)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 10的氨基酸51-66 (YISYSGSTSYNPSLKS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 10的氨基酸99-104 (WAYDGP)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸置换。
11.实施方案10的抗体或其片段，其轻链包含：
●对应于SEQ ID NO: 11的氨基酸24-33 (RASSSVSHMH)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个或两个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 11的氨基酸49-55 (ATSNLAS)的CDR2序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 11的氨基酸88-96 (QQWSSNPFT)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换。
12.实施方案1-3中任一项的抗体或其片段，其重链包含：
●对应于SEQ ID NO: 12的氨基酸31-35 (DYYIH)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 12的氨基酸50-66 (WIDPENGNTIFDPKFQG)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 12的氨基酸99-105 (RWYAMDY)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸置换。
13.实施方案12的抗体或其片段，其轻链包含：
●对应于SEQ ID NO: 13的氨基酸24-39 (KSSQSLLYTNGKTYLN)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个、两个或三个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 13的氨基酸55-61 (LVSKLDS)的CDR2序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 13的氨基酸94-102 (LQSTHFPWT)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换。
14.实施方案1-3中任一项的抗体或其片段，其重链包含：
●对应于SEQ ID NO: 4 (SYGVH)、SEQ ID NO: 6 (NYGVH)或SEQ ID NO: 8(GYGVH)的氨基酸31-35的CDR1序列；和
●对应于SEQ ID NO: 4 (VIWRGGSTDFNAAFMS)、SEQ ID NO: 6(VIWRGGSIDYNAAFMS)或SEQ ID NO: 8 (VIWRGGSIDYNAAFMS)的氨基酸50-65的CDR2序列；和
●对应于SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 8 (NSHGNYVGYAMDY)的氨基酸98-110的CDR3序列；
和其轻链包含：
●对应于SEQ ID NO: 5 (KASENVGAAVA)、SEQ ID NO: 7 (KASQSVGPAVA)或SEQ IDNO: 9 (KASQNVGTAVA)的氨基酸24-34的CDR1序列；和
●对应于SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 9 (SASNRYT)的氨基酸50-56的CDR2序列；和
●对应于SEQ ID NO: 5 (QQYTNYPT)、SEQ ID NO: 7 (QQYTSYPT)或SEQ ID NO: 9(QQYTSYPT)的氨基酸89-96的CDR3序列。
15.实施方案10的抗体或其片段，其重链包含：
●对应于SEQ ID NO: 10的氨基酸31-36 (SDYAWN)的CDR1序列；和
●对应于SEQ ID NO: 10的氨基酸51-66 (YISYSGSTSYNPSLKS)的CDR2序列；和
●对应于SEQ ID NO: 10的氨基酸99-104 (WAYDGP)的CDR3序列；
和其轻链包含：
●对应于SEQ ID NO: 11的氨基酸24-33 (RASSSVSHMH)的CDR1序列；和
●对应于SEQ ID NO: 11的氨基酸49-55 (ATSNLAS)的CDR2序列；和
●对应于SEQ ID NO: 11的氨基酸88-96 (QQWSSNPFT)的CDR3序列。
16.实施方案12的抗体或其片段，其重链包含：
●对应于SEQ ID NO: 12的氨基酸31-35 (DYYIH)的CDR1序列；和
●对应于SEQ ID NO: 12的氨基酸50-66 (WIDPENGNTIFDPKFQG)的CDR2序列；和
●对应于SEQ ID NO: 12的氨基酸99-105 (RWYAMDY)的CDR3序列；
和其轻链包含：
●对应于SEQ ID NO: 13的氨基酸24-39 (KSSQSLLYTNGKTYLN)的CDR1序列；和
●对应于SEQ ID NO: 13的氨基酸55-61 (LVSKLDS)的CDR2序列；和
●对应于SEQ ID NO: 13的氨基酸94-102 (LQSTHFPWT)的CDR3序列。
17.抗体或其片段，其与前述实施方案中任一项的抗体竞争结合TFPI (1-79)，如使用Biolayer干涉测定法测定。
18.抗体或其片段，其属于与前述实施方案中任一项的抗体相同的箱，如使用Biolayer干涉测定法测定。
19.前述实施方案中任一项的抗体或其片段，其为单克隆抗体。
20.前述实施方案中任一项的抗体或其片段，其为人源化抗体。
21.前述实施方案中任一项的抗体片段，其选自Fab、Fab’、Fab2、Fab’2和scFv片段。
22.药物制剂，其包含实施方案1-21中任一项的抗体或其片段和至少一种药学上可接受的赋形剂。
23.实施方案1-21中任一项的抗体或其片段或实施方案22的药物制剂，其用作药物。
24.实施方案1-21中任一项的抗体或其片段或实施方案22的药物制剂，其用于治疗患有凝血病的受试者。
25.根据实施方案24的抗体或其片段，其中所述受试者患有任何先天性、后天性和/或医源性凝血病，例如含或不含抑制剂的血友病A，和含或不含抑制剂的血友病B。
26.治疗患有凝血病的受试者的方法，包括给予所述受试者实施方案1-21中任一项的抗体或其片段。
此外，本发明通过以下方面举例说明：
1.分离的抗体或其片段，其特异性结合在人TFPI (SEQ ID NO: 1)的氨基酸残基1-79中存在的表位。
2.方面1的抗体或其片段，其特异性结合在人TFPI (SEQ ID NO:1)的氨基酸残基26-76 (KPI-1)中存在的表位。
3.方面1的抗体或其片段，其特异性结合人TFPI中存在的表位，其中所述表位包含以下氨基酸残基中的至少一个：SEQ ID NO: 1的L16、P17、L19、K20、L21、M22、F25、C35、A37、M39、R41、Y56、G57、G58、C59、E60、G61、N62、Q63、R65、F66、E67、E71和M75。
4.方面3的抗体或其片段，其特异性结合人TFPI中存在的表位，其中所述表位包含以下氨基酸残基中的至少一个：SEQ ID NO: 1的R41、R65和E67。
5.方面1的抗体或其片段，其具有等于或小于1E-08 M的Kd，如使用表面等离子体共振测定。
6.分离的抗体，其特异性结合人TFPI，其中所述抗体的重链包含以下氨基酸残基
对应于SEQ ID NO: 16的位置2的位置上的V，
对应于SEQ ID NO: 16的位置27的位置上的F，
对应于SEQ ID NO: 16的位置32的位置上的Y，
对应于SEQ ID NO: 16的位置52的位置上的W，
对应于SEQ ID NO: 16的位置53的位置上的R，
对应于SEQ ID NO: 16的位置54的位置上的G，
对应于SEQ ID NO: 16的位置55的位置上的G，
对应于SEQ ID NO: 16的位置56的位置上的S，
对应于SEQ ID NO: 16的位置57的位置上的I，
对应于SEQ ID NO: 16的位置58的位置上的D，
对应于SEQ ID NO: 16的位置59的位置上的Y，
对应于SEQ ID NO: 16的位置61的位置上的A，
对应于SEQ ID NO: 16的位置64的位置上的M，
对应于SEQ ID NO: 16的位置97的位置上的K，
对应于SEQ ID NO: 16的位置99的位置上的S，
对应于SEQ ID NO: 16的位置100的位置上的H，
对应于SEQ ID NO: 16的位置102的位置上的N，
对应于SEQ ID NO: 16的位置103的位置上的Y，
对应于SEQ ID NO: 16的位置104的位置上的V，
对应于SEQ ID NO: 16的位置105的位置上的G，和
对应于SEQ ID NO: 16的位置106的位置上的Y，
和
其中所述抗体的轻链包含以下氨基酸残基
对应于SEQ ID NO: 17的位置31的位置上的P，
对应于SEQ ID NO: 17的位置32的位置上的A，
对应于SEQ ID NO: 17的位置49的位置上的Y，
对应于SEQ ID NO: 17的位置50的位置上的S，
对应于SEQ ID NO: 17的位置53的位置上的N，
对应于SEQ ID NO: 17的位置55的位置上的Y，
对应于SEQ ID NO: 17的位置56的位置上的T，
对应于SEQ ID NO: 17的位置91的位置上的Y，
对应于SEQ ID NO: 17的位置92的位置上的T，
对应于SEQ ID NO: 17的位置93的位置上的S，和
对应于SEQ ID NO: 17的位置94的位置上的Y。
7.方面1的抗体，其重链包含：
●对应于SEQ ID NO: 4 (SYGVH)、SEQ ID NO: 6 (NYGVH)或SEQ ID NO: 8(GYGVH)的氨基酸31-35的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 4 (VIWRGGSTDFNAAFMS)、SEQ ID NO: 6(VIWRGGSIDYNAAFMS)或SEQ ID NO: 8 (VIWRGGSIDYNAAFMS)的氨基酸50-65的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 4 (NSHGNYVGYAMDY)、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 8(NSHGNYVGYAMDY)的氨基酸98-110的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个或两个可被不同的氨基酸置换。
8.方面1或7的抗体或其片段，其轻链包含：
●对应于SEQ ID NO: 5 (KASENVGAAVA)、SEQ ID NO: 7 (KASQSVGPAVA)或SEQ IDNO: 9 (KASQNVGTAVA)的氨基酸24-34的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个、两个或三个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 9 (SASNRYT)的氨基酸50-56 (SASNRYT)的CDR2序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 5 (QQYTNYPT)、SEQ ID NO: 7 (QQYTSYPT)或SEQ ID NO: 9(QQYTSYPT)的氨基酸89-96的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换。
9.方面1的抗体或其片段，其重链包含：
●对应于SEQ ID NO: 4 (SYGVH)、SEQ ID NO: 6 (NYGVH)或SEQ ID NO: 8(GYGVH)的氨基酸31-35的CDR1序列；和
●对应于SEQ ID NO: 4 (VIWRGGSTDFNAAFMS)、SEQ ID NO: 6(VIWRGGSIDYNAAFMS)或SEQ ID NO: 8 (VIWRGGSIDYNAAFMS)的氨基酸50-65的CDR2序列；和
●对应于SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 8 (NSHGNYVGYAMDY)的氨基酸98-110的CDR3序列；
和其轻链包含：
●对应于SEQ ID NO: 5 (KASENVGAAVA)、SEQ ID NO: 7 (KASQSVGPAVA)或SEQ IDNO: 9 (KASQNVGTAVA)的氨基酸24-34的CDR1序列；和
●对应于SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 9 (SASNRYT)的氨基酸50-56的CDR2序列；和
●对应于SEQ ID NO: 5 (QQYTNYPT)、SEQ ID NO: 7 (QQYTSYPT)或SEQ ID NO: 9(QQYTSYPT)的氨基酸89-96的CDR3序列。
10.方面1的抗体或其片段，其重链包含：
●对应于SEQ ID NO: 6的氨基酸31-35 (NYGVH)的CDR1序列；和
●对应于SEQ ID NO: 6的氨基酸50-65 (VIWRGGSIDYNAAFMS)的CDR2序列；和
●对应于SEQ ID NO: 6的氨基酸98-110 (NSHGNYVGYAMDY)的CDR3序列；
和其轻链包含：
●对应于SEQ ID NO: 7的氨基酸24-34 (KASQSVGPAVA)的CDR1序列；和
●对应于SEQ ID NO: 7的氨基酸50-56 (SASNRYT)的CDR2序列；和
●对应于SEQ ID NO: 7的氨基酸89-96 (QQYTSYPT)的CDR3序列。
11.方面1的抗体或其片段，其重链包含：
●对应于SEQ ID NO: 10的氨基酸31-36 (SDYAWN)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 10的氨基酸51-66 (YISYSGSTSYNPSLKS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 10的氨基酸99-104 (WAYDGP)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸置换，
和其轻链包含：
●对应于SEQ ID NO: 11的氨基酸24-33 (RASSSVSHMH)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个或两个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 11的氨基酸49-55 (ATSNLAS)的CDR2序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 11的氨基酸88-96 (QQWSSNPFT)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换。
12.方面11的抗体或其片段，其重链包含：
●对应于SEQ ID NO: 10的氨基酸31-36 (SDYAWN)的CDR1序列；
●对应于SEQ ID NO: 10的氨基酸51-66 (YISYSGSTSYNPSLKS)的CDR2序列；和
●对应于SEQ ID NO: 10的氨基酸99-104 (WAYDGP)的CDR3序列；
和其轻链包含：
●对应于SEQ ID NO: 11的氨基酸24-33 (RASSSVSHMH)的CDR1序列；
●对应于SEQ ID NO: 11的氨基酸49-55 (ATSNLAS)的CDR2序列；和
●对应于SEQ ID NO: 11的氨基酸88-96 (QQWSSNPFT)的CDR3序列。
13.方面1的抗体或其片段，其重链包含：
●对应于SEQ ID NO: 12的氨基酸31-35 (DYYIH)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 12的氨基酸50-66 (WIDPENGNTIFDPKFQG)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 12的氨基酸99-105 (RWYAMDY)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸置换，
和其轻链包含：
●对应于SEQ ID NO: 13的氨基酸24-39 (KSSQSLLYTNGKTYLN)的CDR1序列，其中这些氨基酸残基中的一个、两个或三个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 13的氨基酸55-61 (LVSKLDS)的CDR2序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
●对应于SEQ ID NO: 13的氨基酸94-102 (LQSTHFPWT)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的一个可被不同的氨基酸残基置换。
14.方面13的抗体或其片段，其重链包含：
●对应于SEQ ID NO: 12的氨基酸31-35 (DYYIH)的CDR1序列;和
●对应于SEQ ID NO: 12的氨基酸50-66 (WIDPENGNTIFDPKFQG)的CDR2序列；和
●对应于SEQ ID NO: 12的氨基酸99-105 (RWYAMDY)的CDR3序列；
和其轻链包含：
●对应于SEQ ID NO: 13的氨基酸24-39 (KSSQSLLYTNGKTYLN)的CDR1序列；和
●对应于SEQ ID NO: 13的氨基酸55-61 (LVSKLDS)的CDR2序列；和
●对应于SEQ ID NO: 13的氨基酸94-102 (LQSTHFPWT)的CDR3序列。
15.分离的抗体或其片段，其与方面3-10中任一个的抗体竞争结合TFPI (1-79)，如使用Biolayer干涉测定法测定。
16.分离的抗体或其片段，其属于与方面1-14中任一个的抗体相同的箱，如使用Biolayer干涉测定法测定。
17.药物制剂，其包含方面1-16中任一个的至少一种抗体或其片段和至少一种药学上可接受的赋形剂。
18.方面1-16中任一个的抗体或其片段或方面17的药物制剂，其用作药物。
19.方面1-16中任一个的抗体或其片段，其用于治疗患有凝血病的受试者。
20.方面19的抗体或其片段，其中所述受试者患有先天性、后天性和/或医源性凝血病，例如含或不含抑制剂的血友病A，和含或不含抑制剂的血友病B。
21.治疗患有凝血病的受试者的方法，包括给予所述受试者方面1-16中任一个的抗体或其片段。
本发明通过以下实施例进一步说明，所述实施例不应解释为进一步限制。本申请全文引述的所有附图以及所有参考文献、专利和公布的专利申请的内容通过引用明确结合到本文中。
实施例
实施例1：免疫、融合和筛选
RBF小鼠用人TFPIα (SEQ ID NO: 1)或TFPI (1-161) (SEQ ID NO: 3)免疫。将小鼠皮下注射：将20 μg人TFPI与完全弗氏佐剂混合用于第一次注射。对于随后的免疫，不完全弗氏佐剂与相同浓度的抗原一起使用。最后免疫后10天，对于人TFPI特异性抗体，使用ELISA筛选小鼠的眼血。具有阳性血清滴度的小鼠通过静脉内注射用10 μg的人TFPIα或TFPI (1-161)加强免疫，三天后处死。将脾脏无菌摘除和分散成单细胞悬浮液。脾细胞和骨髓瘤细胞的融合通过PEG-方法或通过电融合进行。得到的杂交瘤细胞通过有限稀释至微量滴定板中进行克隆。来自单个杂交瘤的上清液通过ELISA针对能够结合全长TFPIα或TFPI(1-161)的抗体的表达进行初步筛选。为鉴定产生对TFPI (1-79)有特异性的抗体的杂交瘤，对结合全长TFPIα或TFPI (1-161)呈阳性的杂交瘤针对与TFPI-KPI-2片段(由SEQ IDNO: 1的氨基酸残基97-147表示)的结合进行逆向筛选。对结合TFPI (1-161)呈阳性和对结合TFPI-KPI-2片段呈阴性的杂交瘤经分离和扩增以产生抗体。
通过标准蛋白A亲和色谱法，抗体自上清液中纯化和用于测定与人TFPIα和TFPI(1-79)的结合和亲和力以及在血浆中的TFPI中和活性(TGT测定法)。产生目的抗体的杂交瘤，即对TFPI (1-79)有特异性的那些杂交瘤通过有限稀释进行亚克隆，和验证来自亚克隆的杂交瘤的材料的初始抗体特征。来自亚克隆的杂交瘤的细胞用于分离RNA和随后的抗体克隆和序列鉴定。
实施例2：小鼠抗人TFPI (1-79)特异性mAb的克隆和测序
本实施例描述TFPI抗体mAb 2F3、mAb 2F22、mAb 2F45、mAb 1F56、mAb 1F91和mAb2F35的鼠重链和轻链序列的克隆和测序。使用Qiagen的RNeasy-Mini Kit自杂交瘤细胞提取总RNA和用作cDNA合成的模板。cDNA在5’-RACE反应中使用Clontech的SMART™ RACEcDNA扩增试剂盒合成。HC和LC序列的随后靶扩增通过PCR使用Phusion Hot Start聚合酶(Finnzymes)和作为正向引物的在SMART™ RACE试剂盒中包括的通用引物混合物(UPM)进行。具有SEQ ID NO: 14所示的序列的反向引物用于HC (VH结构域)扩增和具有SEQ ID NO:15所示的序列的反向引物用于LC扩增。PCR产物通过凝胶电泳分离，使用GE HealthcareBio-Sciences的GFX PCR DNA & Gel Band Purification Kit提取，和使用Zero BluntTOPO PCR克隆试剂盒和化学感受态TOP10大肠杆菌(Life Technologies)克隆用于测序。使用Applied Biosystems的AmpliTaq Gold Master Mix和M13uni/M13rev引物，对选择的菌落进行菌落PCR。使用ExoSAP-IT酶混合物(USB)进行菌落PCR净化。在MWG Biotech,Martinsried Germany使用M13uni(-21)/M13rev(-29)测序引物进行测序。使用Vector NTIAdvance 11程序(Life Technologies)分析和注解序列。所有试剂盒和试剂根据制造商的说明书使用。
对各杂交瘤：mAb 2F3、mAb 2F22、mAb 2F45、mAb 1F91和mAb 2F35，鉴定单一的独特鼠κ型LC和单一的独特鼠HC，亚类mIgG1。mAb 1F56的LC和HC序列显示，该抗体在序列上与mAb 1F91相同。可变重链和可变轻链序列的氨基酸序列(不包括前导肽序列)显示在SEQ IDNO 4-13中。SEQ ID NO列在表1中。
产生抗体LC和HC表达载体
产生基于CMV启动子的表达载体(pTT载体)用于瞬时表达小鼠-人嵌合形式的mAb2F22。由Yves Durocher开发pTT载体用于瞬时蛋白表达(Durocher等. Nucleic AcidResearch, 2002)。除了CMV启动子之外，基于pTT的载体还包含pMB1起点、EBV起点和Amp抗性基因。
产生表达载体用于表达带有鼠2F22轻链可变区和人κ恒定区的嵌合mAb 2F22轻链(SEQ ID NO: 17)。产生表达载体用于表达带有鼠2F22重链可变区和全长人IgG4 (S241P)恒定区(对于mAb 0294表达(SEQ ID NO: 19))或截短的人IgG4恒定区(对于Fab 0296表达(SEQ ID NO: 16)或Fab 0295表达(SEQ ID NO: 20))的嵌合mAb 2F22重链。SEQ ID NO列于表1中。
产生基于pTT的LC表达载体用于瞬时表达嵌合mAb 2F22抗体和抗体片段。开始时，使用对N和C-末端序列特异性的引物，将对应于mAb 2F22的VL结构域的区在2-步骤反应中自原始TOPO测序克隆经PCR扩增。通过2-步骤重叠PCR将原始鼠信号肽交换成人CD33信号肽。初级有义引物带有CD33信号肽序列的C-末端部分和二级有义引物包含用于克隆目的的HindIII限制位点、紧接ATG起始密码子的上游的Kozak序列(5’-GCCGCCACC-3’)和CD33信号肽序列的N-末端部分。反义引物包含在VL/CL过渡序列中符合读框的BsiWI限制位点。将扩增的片段克隆至包含人κCL结构域的序列的线性化的基于pTT的载体，随后转化至大肠杆菌中用于选择。最终构建体的序列通过DNA测序验证。
产生基于pTT的HC表达载体用于瞬时表达嵌合mAb 2F22和Fab 2F22片段。嵌合mAb和Fab片段分别被称为mAb 0294、Fab 0296和Fab 0295。开始时，使用对N-和C-末端序列特异性的引物，将对应于mAb 2F22的VH结构域的区在2-步骤反应中自原始TOPO测序克隆经PCR扩增。通过2-步骤重叠PCR将原始鼠信号肽交换成人CD33信号肽。初级有义引物带有CD33信号肽序列的C-末端部分和第二有义引物包含用于克隆目的的HindIII限制位点、紧接ATG起始密码子的上游的Kozak序列(5’-GCCGCCACC-3’)和CD33信号肽序列的N-末端部分。反义引物包含在VH/CH过渡中的符合读框的NheI限制位点。对于产生全长HC表达载体(mAb 0294的HC)，产生的VH结构域PCR片段经限制性消化和克隆至线性化的基于pTT的载体，其包含人IgG4 (S241P)恒定区的序列。包括IgG4铰链的丝氨酸241至脯氨酸突变以通过消除半抗体的形成来稳定IgG4抗体。当根据Kabat编号时突变的铰链位置被称为S241P，或者当根据EU索引编号时突变的铰链位置被称为S228P。
对于产生用于Fab 0296表达的截短的HC表达载体，产生的VH结构域PCR片段经限制性消化和克隆至线性化的基于pTT的载体，其包含截短的人IgG4恒定区的序列。基于IgG4的HC在铰链区中在人IgG4铰链赖氨酸后被截短，如在Fab 0296 HC (SEQ ID NO: 16)的序列中所见的。克隆反应物随后被转化至大肠杆菌用于选择。最终构建体的序列通过DNA测序验证。
对于产生用于Fab 0295表达的截短的HC表达载体，产生的VH结构域PCR片段经限制性消化和克隆至线性化的基于pTT的载体，其包含第二个截短的人IgG4恒定区的序列。Fab 0295的基于IgG4的HC在铰链区中在人IgG4铰链的第一个半胱氨酸后被截短，如在Fab0295 HC (SEQ ID NO: 20)的序列中所见的。克隆反应物随后被转化至大肠杆菌用于选择。最终构建体的序列通过DNA测序验证。
mAb和Fab片段的表达和纯化
通过基于pTT的LC和HC表达载体的共转染，抗-TFPI抗体和Fab片段在EXPI293F细胞(Life Technologies)的悬浮培养物中瞬时表达。以下程序描述用于悬浮液适应的EXPI293F细胞的通用转染方案。
EXPI293F转染
1）初始制备DNA和转染试剂的单独的稀释液。
a）每ml细胞培养物使用总共1µg的载体DNA (0.5ug LC载体和0.5ug HC载体)。在Opti-MEM培养基(Gibco)中稀释DNA (50µl培养基/µg DNA)，混合和在室温下(23-25℃)孵育5分钟。
b）使用Expifectamin™ 293 (Life Technologies)作为转染试剂，浓度为2.7μl/µg DNA。在Opti-MEM培养基(Gibco)中按18.5X稀释Expifectamin™溶液，混合和在室温下(23-25℃)孵育5分钟。
2）混合DNA和Expifectamin™ 293稀释液，和使之在室温下(23-25℃)孵育10分钟。
3）直接将DNA-Expifectamin™ 293混合物加入EXPI293F细胞培养物中。
a）在转染时，EXPI293F培养物的细胞密度应为2.8-3.2 x 106个细胞/ml。
4）在36.5℃ 8 % CO2和85-125rpm下将转染的细胞培养物转移至定轨摇床孵育器中。
5）转染后18小时，加入5 ul Expifectamin™ 293 Transfection Enhancer1/ml培养物和50 ul Expifectamin™ 293 Transfection Enhancer2/ml培养物，和在36.5℃ 8% CO2和85-125rpm下将培养物放回定轨摇床孵育器中。
6）转染后5天，通过离心收获细胞培养上清液，接着通过0.22 μm PES过滤装置(Corning)过滤。
通用纯化方案
使用GE Healthcare的MabSelectSuRe树脂按照制造商的说明书，通过标准亲和色谱法纯化mAb变体。纯化的抗体经缓冲液交换为PBS缓冲液pH 7.2。
使用GE Healthcare开发的KappaSelect树脂，通过标准亲和色谱法纯化Fab片段。纯化的Fab片段经缓冲液交换为PBS缓冲液pH 7.2。通过SEC-HPLC进行品质评价和浓度测定。
表1. 鉴定的抗体和抗体片段的序列概述
Figure 794301DEST_PATH_IMAGE001
VH：重链可变结构域；VL：轻链可变结构域；HC：重链；LC：轻链。
实施例3：结合相互作用分析
结合相互作用数据通过表面等离子体共振在Biacore T200仪器中获得。使用随Biacore T-200控制软件版本2.0 (GE Healthcare)获得的胺偶联方案和随AmineCoupling Kit (GE Healthcare)提供的试剂，将多克隆兔抗小鼠免疫球蛋白(MouseAntibody Capture Kit, GE Healthcare)固定至在流动池1-4中的系列S CM4传感器芯片(GE Healthcare)。将相关的小鼠单克隆抗体以固定的浓度捕获在流动池2、3或4中。不同浓度的人TFPIα或TFPI (1-79)通过在运行缓冲液(10 mM HEPES, pH 7.4, 300 mM NaCl, 5mM CaCl2, 0.05% Surfactant P20, 1 mg/ml BSA)中稀释样品而测试。各样品使用300秒的接触时间接着420-600秒的离解时间以30 µl/min流动速度测定。还测定缓冲液空白。传感器表面以30 μl/min流动速度达180秒或以30 μl/min流动速度达各30秒的两个周期用10mM甘氨酸pH 1.7再生。
使用随Biacore T-200控制软件(GE Healthcare)获得的胺偶联方案和随AmineCoupling Kit (GE Healthcare)提供的试剂，将单克隆小鼠抗人IgG (Fc)抗体(HumanAntibody Capture Kit, GE Healthcare)固定至在流动池1-2中的系列S CM4传感器芯片(GE Healthcare)。将相关的抗体Bay 2A8、Bay 2A8-K95L或mAb 0294 (SEQ ID NO: 19和17)以固定的浓度捕获在流动池2上。不同浓度的人TFPIα或TFPI (1-79)按上文所述测试。传感器表面以30 μl/min流动速度达180秒或以30 μl/min流动速速达各30秒的两个周期用3M MgCl2再生。
使用在Biacore T-200控制软件(GE Healthcare)内获得的胺偶联方案和随AmineCoupling Kit (GE Healthcare)提供的试剂，以9000-10000个应答单位(RU)将人Fab结合剂(Human Fab Capture Kit, GE Healthcare)固定至在流动池1-4中的系列S CM4传感器芯片(GE Healthcare)。将相关的Fab片段Fab 0295 (SEQ ID NO: 20和17)或Fab 0296(SEQ ID NO: 16和17)在流动池2、3或4中以10 μl/min流动速速以固定浓度(0.2 μg/ml)注射180秒，这应产生大约70-80 RU的应答。不同浓度的人TFPIα通过在运行缓冲液(10 mMHEPES, pH 7.4, 300 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.05% Surfactant P20, 1 mg/ml BSA)中稀释样品而测试。各样品使用300秒的接触时间接着600秒的离解时间以50 µl/min流动速度测定。还测定了缓冲液空白。传感器表面以50 μl/min流动速度各30秒的两个周期用10mM甘氨酸pH 2.1再生。分析温度为25℃和样品室温度为10℃。
使用Biacore T200评价软件(版本2.0)分析数据。假定TFPI和目标单克隆抗体的1:1相互作用，确定结合常数(ka、kd、KD)。
表2的数据证实，所测试的本发明的抗体(mAb 1F56、1F91、2F3、2F17、2F22、2F35、2F37、2F39、2F45、2F48)以高亲和力与包括酸性N-末端肽和TFPI-KPI-1结构域的人TFPI(1-79)内的表位结合。
表3的数据证实，作为嵌合抗体mAb 0294: (SEQ ID NO: 17和19)和嵌合Fab片段Fab 0296 (SEQ ID 17和16)和Fab 0295 (SEQ ID 17和20)表达的mAb 2F22保留与TFPI结合的高的亲和力。
表2：结合常数
假定人TFPIα或TFPI (1-79)和目标抗体的1:1相互作用，获得结合常数(ka、kd、KD)。Bay 2A8是公开于WO2010/017196的2A8 Fab的人IgG4 (S241P)抗体变体。Bay 2A8-K95L是带有在HC CDR3中的K95L置换(Kabat编号)的Bay 2A8的人IgG4 (S241P)抗体变体，所述置换与公开于WO2012/135671的“Fab B”相对于2A8所存在的置换相同。
Figure 479229DEST_PATH_IMAGE002
表3：结合常数
假定人TFPIα或TFPI (1-79)和目标抗体或Fab片段的1:1相互作用，获得结合常数(ka、kd、KD)。n.d.：未测定。
Figure 250876DEST_PATH_IMAGE003
实施例4：抗体箱并法
使用Biolayer干涉测定法(Fortebio Octet RED384仪器, PALL LifeSciences)，测量在TFPI抗体1F91、2F3、2F22、2F35、2F45、Bay 2A8-K95L、MBS532510(MyBioSource.com)和10R-T141A (Fitzgerald Industries International)之间对结合全长TFPIα的竞争。mAb 1F91、mAb 2F3、mAb 2F22、mAb 2F35、mAb 2F45和Bay 2A8-K95L在赖氨酸残基上使用1:1.2 mol mAb:mol生物素试剂(Thermo Scientific cat # 21335)比率和另外按制造商的说明书用生物素随机标记。将生物素标记的抗体捕获在链霉抗生物素Fortebio sensortips (PALL Life Sciences)上，接着结合人TFPIα，接着结合mAb 1F91、mAb 2F3、mAb 2F22、mAb 2F35、mAb 2F45、Bay 2A8-K95L、MBS532510或10R-T141A。结果显示在表4中(黑色表示mAb竞争结合TFPI。灰色表示mAb不竞争结合TFPI)。这些数据显示，抗体落入4个不同的箱，表明它们具有不同的结合表位。箱1：mAb 1F91、MBS532510和10R-T141A。箱2：mAb 2F3、2F22和2F45。箱3：mAb 2F35。箱4：Bay2A8 K95L。
表4：在指定的TFPI抗体之间对结合TFPI的竞争
Figure 201515DEST_PATH_IMAGE004
实施例5：对TFPI (1-79)特异性的TFPI抗体对在人FVIII-中和血浆中TF-诱导的凝血酶产生的作用
在正常人血浆(NHP, CryoCheck Normal Plasma)中研究抗体对凝血酶产生的作用。凝血起始通过再钙化和加入1 pM TF以及4 µM磷脂囊泡(低PPP试剂, Thrombinoscope)诱导。血友病A样血浆通过加入100 µg/ml绵羊抗人FVIII抗体(HaematologicTechnologies Inc., PAHFVIII-S)获得。在转化来自Bachem (Bubendorf, 瑞士)的生荧光底物Z-Gly-Gly-Arg-AMC.HCl (I-1140)后持续评价凝血酶活性。以分别设定在368和460nm的激发和发射波长在微量滴定板FluorskanAscent荧光计(Thermo Labsystems, 赫尔辛基, 芬兰)中测量荧光。使用校准器以允许计算形成的凝血酶的量和针对内滤效应和生荧光底物消耗校正获得的相对荧光单位。此外，减去凝血酶–α2-巨球蛋白复合物对底物转化的贡献。通过Thrombinoscope BV (马斯特里希特, 荷兰)提供的校正的自动化血栓图(thrombogram) (CAT)计算机软件(版本5.0.0.745)自动进行这些校正。获得数据的一阶导数，得到凝血酶产生曲线，允许计算i) 滞后时间，ii) 总曲线下面积、内源凝血酶潜能(ETP)，iii) 凝血酶峰高(Peak)，iv) 峰的时间(ttPeak)和v) 凝血酶产生的最大速率(Rate)。
图1 (曲线(a))显示用NHP进行的凝血酶产生曲线。加入100 µg/ml绵羊抗人FVIII抗体至NHP以模拟血友病A样情况，强烈减少凝血酶产生(曲线(b))。因为FVIII中和导致的凝血酶产生的抑制通过加入10 nM的TFPI-KPI-1 mAb 1F91 (曲线(c))、mAb 2F3 (曲线(d))或mAb 2F22 (曲线(e))被有效逆转。源自图1的曲线和对于另外的TFPI (1-79)抗体的凝血酶峰高(Peak)和峰的时间(ttPeak)的参数列于表5。图1和表5显示的数据表明：1) 数种TFPI (1-79)抗体抑制TFPI活性，和2) 各个抑制性TFPI (1-79)抗体增加凝血酶峰高和减少峰的时间至不同的程度。
图2 (曲线(a))显示用NHP进行的凝血酶产生曲线。NHP包含约1.6 nM TFPI，其中仅约0.2 nM作为全长人TFPIα存在。图2显示加入5 nM全长重组人TFPIα至FVIII-中和血浆中，完全阻止可测量的凝血酶产生(曲线(b))。加入10 nM的针对KPI-1的高亲和力抗体(mAb1F91)完全能够在存在5 nM TFPIα时确立显著的凝血酶产生(曲线(e))。然而令人惊讶的是，在这些抗体浓度下，mAb 2F22 (曲线(d))和在较小程度上mAb 2F3 (曲线(c))可确立稳健的凝血酶产生，其与正常人血浆中的凝血酶产生相当。
源自图2的曲线和另外的TFPI (1-79) mAb的凝血酶峰高(Peak)和峰的时间(ttPeak)的参数列于表5中。数据表明，一些但不是所有的TFPI抗体在升高的TFPI水平的情况下有效地中和TFPI抑制，和重建凝血酶产生至与NHP相当的水平。当选择的抗体(200 nM)在20 nM的升高的TFPIα浓度下测试时发现类似的结果(表6)。对于其在升高的TFPI水平(20nM)下中和TFPI抑制的能力，将TFPI抗体2F22与不同的之前描述的TFPI抗体(10R-T141A(Fitzgerald)、MBS532510 (MyBioSource)、ADG4903 (American Diagnostica GmbH)、2H8(Mast等, Arterioscler Thromb Vasc Biol. (2002) 22: 2099-2104))比较。凝血酶产生的参数列于表7中，和数据显示TFPI抗体mAb 2F22在升高的TFPI水平下有效地中和TFPI抑制，而之前描述的TFPI KPI-1抗体在这些条件下不能中和TFPI抑制。mAb 2F22作为嵌合抗体mAb 0294和嵌合抗体片段Fab 0295和Fab 0296表达。表8的数据显示，在FVIII中和的血浆中在正常或升高的TFPI水平中，作为mAb 0294/ mAb 2F22 (Fab 0295: SEQ ID: 17和20)的代表的Fab片段0295保留了高的对TFPI抑制的中和能力。
表5：源自在含或不含5 nM TFPIα的FVIII-中和的血浆中获得的凝血酶产生曲线的凝血酶峰高(Peak)和峰的时间(ttPeak)
Figure 262182DEST_PATH_IMAGE005
表6：源自在含20 nM TFPIα的FVIII-中和的血浆中获得的凝血酶产生曲线的凝血酶峰高(Peak)和峰的时间(ttPeak)
Figure 801616DEST_PATH_IMAGE006
表7：源自在含20 nM TFPIα的FVIII-中和的血浆中获得的凝血酶产生曲线的凝血酶峰高(Peak)和峰的时间(ttPeak)
Figure 744165DEST_PATH_IMAGE007
表8：源自在含和不含20 nM TFPIα的FVIII-中和的血浆中获得的凝血酶产生曲线的凝血酶峰高(Peak)和峰的时间(ttPeak)
Figure 182099DEST_PATH_IMAGE008
实施例6：在与mAb 2F22的Fab片段的复合物中TFPI Kunitz蛋白酶抑制剂结构域1的晶体结构
在与mAb 2F22的Fab片段Fab 0296 (SEQ ID NO: 16和17)的复合物中，由酸性N-末端区和Kunitz-型蛋白酶抑制剂结构域1 (KPI-1) (SEQ ID NO: 2)组成的人TFPI (1-79)的N-末端部分的3D结构以高的分辨率使用X-射线晶体学测定。结果证实，抗体能够结合TFPI的KPI-1和前面的N-末端部分。得到的人TFPI表位残基包含Leu 16、Pro 17、Leu 19、Lys 20、Leu 21、Met 22、Phe 25、Cys 35、Ala 37、Met 39、Arg 41、Tyr 56、Gly 57、Gly 58、Cys 59、Glu 60、Gly 61、Asn 62、Gln 63、Arg 65、Phe 66、Glu 67、Glu 71和Met 75 (SEQID NO: 2)。
材料和方法
为结晶学目的，如实施例2中所述产生基于CMV启动子的表达载体(pTT载体)以瞬时表达对应于mAb 2F22抗体片段的Fab片段用于结晶学。
mAb 2F22的Fab片段以鼠-人嵌合体形式Fab 0296 (SEQ ID NO: 16和17)在EXPI293F细胞中表达，和使用实施例2中描述的KappaSelect树脂通过标准亲和色谱纯化。
都在磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液(4片/2升水，GIBCO目录号18912-014Invitrogen Corporation)中的包括人TFPI的N-末端部分和另外包括N-末端连接的GSSGSSG标签(SEQ ID NO: 18)的人TFPI KPI-1和由对应于SEQ ID NO: 17的轻链和对应于SEQ ID NO: 16的重链片段组成的Fab 0296，与略微摩尔过量(1.1:1)的TFPI物类混合。然后使用Amicon Ultra-4离心过滤器以10,000 Da分子量截止值将复合物浓缩至约10.0 mg/ml。通过坐滴技术(sitting drop-technique)使用TTP Lab Tech号: 4150-05800的96孔TTP IQ板和100 µl沉淀剂溶液/孔生长结晶。沉淀剂溶液包含20% w/v PEG 3350、200 mM甲酸钾，和以3:1的比率与蛋白溶液混合。初始总液滴大小为200 nl，几天后出现结晶。通过转移1 μl的含75%的沉淀剂溶液和25%甘油的冷冻溶液混合物至包含结晶的液滴，准备结晶用于冷冻。允许浸泡约2分钟。然后取出结晶，在液体N2中快速冷冻和在数据收集期间通过低温N2气流保持在100 K的温度下。在MAX-lab, 兰德, 瑞典中在射线BL911-3下收集结晶学数据至1.65 Å分辨率。数据的空间群测定、积分和定标通过XDS软件包[Kabsch, W.,J.Appl.Crystallogr., (1993), Vol. 26, 第795-800页]进行。测定空间群为C2，和测定同步加速器数据的晶胞参数分别为89.010、66.660、106.110 Å，β角为111.18°。1.65 Å分辨率的R-sym为8.4 %和完全性为99.5%。在约1.8 Å分辨率下单值反射的强度/σ(强度)的均值等于2.0。
使用Fab分子的坐标与Protein Data Bank (PDB)的登记代码1NGZ [Yin, J.等,Proc Natl Acad Sci U S A.2003年2月4日, (100), Vol. 100 第856-861页]将分子置换(MR)方法用于结构测定[Berman, H. M.等, Nucleic Acids Res., (2000), Vol. 28, 第235-242页]。将Fab分子分成两个结构域——可变和恒定结构域，其各自用作MR计算中的搜索模型。CCP4包CCP4[Collaborative Computational Project, N., Actacrystallographica.Section D, Biological crystallography, (1994), Vol. 50, 第760-763页]的Molrep软件[Vagin, A.等, J.Appl.Crystallogr., (1997), Vol. 30, 第1022-1025页]用于发现恒定和可变Fab结构域的位置。KPI-1结构域未在MR步骤中发现，然而差别电子密度图在该阶段中显示KPI-1结构域分子的大致位置。通过CCP4软件包的DM软件改进电子密度，接着使用ARP-wARP软件[Langer, G.等, Nat Protoc, (2008), Vol. 3,第1171-1179页][Murshudov, G. N.等, Acta Crystallographica Section DBiological Crystallography, (2011), Vol. 67, 第355-367页]进行自动化模型建立和相位改进，产生Fab 0296分子和KPI-1结构域结构两者的几乎完整的结构以及KPI-1结构域前面的N-末端的部分结构。对于TFPI (SEQ ID NO: 2)，从15至77的残基包括在X-射线模型中，除了KPI-1结构域之外，所述模型还包括KPI-1(残基26-76) N-末端的一些残基。对于Fab 0296片段，观察到轻链残基1-212和重链残基1-221。使用Coot软件程序进行计算机制图检查电子密度图、模型校正和建立的程序[Emsley, P.等, Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr., (2004), Vol. 60, 第2126-2132页]，接着使用CCP4软件包的软件程序Refmac5 [Murshudov, G. N.等, Acta Crystallographica Section D BiologicalCrystallography, (2011), Vol. 67, 第355-367页]进行结晶学精修。将程序循环，直至不能对模型进行进一步显著改进。对于所有数据至1.65 Å分辨率的最终的R和无R分别为0.192和0.220。
结果
通过CCP4程序套件[Collaborative Computational Project, N., Actacrystallographica.Section D, Biological crystallography, (1994), Vol. 50, 第760-763页]的软件程序Areaimol [Lee, B.等, J Mol Biol, (1971), Vol. 55, 第379-400页][Saff, E. B.等, Math Intell, (1997), Vol. 19, 第5-11页]对在配对相互作用中排除的平均面积的计算对晶体结构的人TFPI片段/抗-TFPI2F22 Fab分子复合物得出1195 Å2。
包括晶体结构中观察到的TFPI的N-末端部分的TFPI KPI-1 (SEQ ID NO: 2)和Fab 0296 (SEQ ID NOs: 16和17)之间的直接接触，通过运行CCP4程序套件的Contacts软件[Bailey, S., Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr., (1994), Vol. 50, 第760-763页]使用Fab 0296和TFPI片段分子之间4.0 Å的截止间距进行鉴定。可溶性TFPI片段/Fab 0296复合物晶体结构的结果显示在表9中。
Fab 0296的包括TFPI N-末端区的所得TFPI KPI-1(表位，经发现包含以下TFPI残基(使用SEQ ID NO: 2的序列编号)：Leu 16、Pro 17、Leu 19、Lys 20、Leu 21、Met 22、Phe25、Cys 35、Ala 37、Met 39、Arg 41、Tyr 56、Gly 57、Gly 58、Cys 59、Glu 60、Gly 61、Asn62、Gln 63、Arg 65、Phe 66、Glu 67、Glu 71和Met 75。自间距、电荷-电荷相互作用、氢键、极性和疏水相互作用以及低的溶剂可及性评价，以下残基看似是特别重要的表位残基：Arg41、Arg 65和Glu 67 (SEQ ID NO. 2)。
因此，mAb 2F22 (由Fab 0296表示)的TFPI表位包含包括短的N-末端α-螺旋的KPI-1结构域前面的残基、KPI-1结构域的β-链1之前的环中的残基和在β-链1起始中的残基。其还包括β-链2末端的残基和在β-链2与KPI-1的C-末端α-螺旋之间的环中的残基和KPI-1的C-末端α-螺旋内的残基。
因此，结果表明Fab 0296和因此mAb 2F22特异性结合TFPI KPI-1和前面的N-末端区的部分。
TFPI KPI-1的Fab 0296互补位，包括重(H)链(SEQ ID NO: 16、表9)的残基Val 2、Phe 27、Tyr 32、Trp 52、Arg 53、Gly 54、Gly 55、Ser 56、Ile 57、Asp 58、Tyr 59、Ala 61、Met 64、Lys 97、Ser 99、His 100、Asn 102、Tyr 103、Val 104、Gly 105和Tyr 106，和轻(L)链(SEQ ID NO: 17、表9)的残基Pro 31、Ala 32、Tyr 49、Ser 50、Asn 53、Tyr 55、Thr 56、Tyr 91、Thr 92、Ser 93和Tyr 94。
表9：来自TFPI片段/Fab 0296复合物晶体结构的数据
结晶学复合物的TFPI KPI-1,链K, (SEQ ID NO: 2)与Fab 0296的重链(链H) (SEQ ID NO: 16)和 Fab 0296的轻链(链L) (SEQ ID NO: 17)的相互作用。使用4.0 Å的间 距截止值。接触通过CCP4套件的CONTACT计算机软件程序[Collaborative Computational Project, N., Acta crystallographica.Section D, Biological crystallography, (1994), Vol. 50, 第760-763页]鉴定。在最后一栏中，"***"表示在该接触中氢键的强的 可能性(间距 < 3.3 Å)，如通过CONTACT计算的；"*"表示弱的可能性(间距 > 3.3 Å)。空白 表示该程序认为不存在氢键的可能性。氢键在供体和受体之间是特异性的，通常是强的和 是容易鉴定的。
Figure 602716DEST_PATH_IMAGE009
Figure 12969DEST_PATH_IMAGE010
Figure 126418DEST_PATH_IMAGE011
Figure 51649DEST_PATH_IMAGE012
实施例7：通过表面等离子体共振测量的对TFPI (1-79)特异性的TFPI抗体对TFPI与FXa的亲和力和对TFPI与FVIIa/可溶性TF的亲和力的作用
TFPI抗体抑制TFPI和FXa或TFPI和FVIIa/可溶性TF (FVIIa/sTF)之间的相互作用的能力使用SPR测定法用Biacore T200仪器评价。将FXa或FVIIa/sTF对结合至TFPI KPI-1抗体的TFPI的亲和力与FXa或FVIIa/sTF对结合至TFPI KPI-3 mAb 4F110(WO2012/001087)的TFPI的亲和力相比较。作为对照，FXa或FVIIa/sTF对结合至TFPI KPI-2 mAb 4F36(WO2010/072691)的TFPI的亲和力包括在测定法中。
将多克隆兔抗小鼠免疫球蛋白(Mouse Antibody Capture Kit, GE Healthcare)固定至在流动池1-4中的系列S CM4传感器芯片(GE Healthcare)，如实施例3所述。对每个实验，将相关的抗-TFPI N-末端抗体(2F22、2F3、2F45、2F48、1F91、2F35、10R-T141A(Fitzgerald)、MBS532510 (MyBioSource)、ADG4903 (American Diagnostica GmbH)、2H8(Mast等, Arterioscler Thromb Vasc Biol. (2002) 22: 2099-2104))、抗-TFPI KPI-2抗体(4F36，WO2010/072691)或抗-TFPI KPI-3抗体(4F110，公开于WO2012/001087) mAb在流动池2、3或4中以10 μl/min流动速度注入180秒，接着随后在所有流动池(1-4)中以10 μl/min流动速度注入20 nM人TFPIα (SEQ ID NO: 1) 180秒。不同浓度(25 nM、12.5 nM、6.25 nM和0 nM)的FXa (Haematologic Technologies)通过在运行缓冲液(10 mM HEPES,pH 7.4, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.05% Surfactant P20, 1 mg/ml BSA)中稀释样品进行测试。各样品使用120秒的接触时间接着180秒的离解时间以30 µl/min流动速度进行测定。传感器表面用10 mM甘氨酸pH 1.7以各30秒的两个循环以30 μl/min流动速度再生。各FVIIa样品以终浓度320 nM、160 nM、80 nM或0 nM在包含620 nM sTF的运行缓冲液中制备。可溶性组织因子1-219 (sTF)按照公开的程序(Freskgard等, 1996)制备。重组FVIIa的表达和纯化按之前所述进行(Thim等, 1988; Persson和Nielsen, 1996)。将FVIIa/sTF复合物在室温下孵育10-15分钟，然后开始第一次样品注射。各样品使用120秒的接触时间接着180秒的离解时间以30 µl/min流动速度进行测定。传感器表面用10 mM甘氨酸pH 1.7以各30秒的两个循环以30 μl/min流动速度再生。Biacore T200 Evaluation软件(版本2.0)用于分析数据。假定TFPI和FXa或TFPI和FVIIa/sTF的1:1相互作用，确定结合常数(ka、kd、KD)。
与FXa对结合至抗-TFPI KPI-3 mAb 4F110的TFPI的亲和力相比，一些对TFPI (1-79)特异性的抗-TFPI抗体(mAb 2F22、2F3和2F45)降低TFPI对FXa的亲和力超过30倍，而所有其它的测试抗体对FXa对TFPI的亲和力没有或仅有较小(低于10倍)作用(表10)。亲和力降低主要是由于较快的离解速率(kd)导致。
对TFPI (1-79)特异性的所有抗-TFPI抗体阻断TFPI与FVIIa/sTF的结合(表11)。
表10：FXa对结合至指定的抗体的人TFPIα的亲和力通过SPR分析测量。假定人TFPIα和FXa的1:1相互作用，确定结合常数(ka、kd、KD)
样品 化合物 TFPI表位 k<sub>a</sub> (1/Ms) k<sub>d</sub> (1/s) K<sub>D</sub> (M)
FXa 4F110 KPI-3 5.67E+05 1.67E-04 2.95E-10
FXa 4F36 KPI-2 1.85E+06 5.52E-02 无结合
FXa 2F22 1-79 1.95E+05 1.31E-02 6.74E-08
FXa 2F3 1-79 1.79E+05 2.33E-02 1.30E-07
FXa 2F45 1-79 2.76E+06 3.21E-02 1.16E-08
FXa 2F48 1-79 6.99E+05 1.67E-03 2.39E-09
FXa 1F91 1-79 6.62E+05 1.20E-03 1.81E-09
FXa 2F35 1-79 6.17E+05 1.34E-03 2.16E-09
FXa 10R-T141A 1-79 8.10E+05 1.18E-03 1.46E-09
FXa MBS532510 1-79 1.09E+06 1.19E-03 1.09E-09
FXa ADG4903 1-79 9.34E+05 1.06E-03 1.14E-09
FXa 2H8 1-79 7.77E+05 9.53E-04 1.23E-09
表11：FVIIa/sTF对结合至指定的抗体的人TFPIα的亲和力通过SPR分析测量。假定人TFPIα和FVIIa/sTF复合物的1:1相互作用，确定结合常数(ka、kd、KD)。n.b.：不可检出的结合
样品 化合物 TFPI表位 k<sub>a</sub> (1/Ms) k<sub>d</sub> (1/s) K<sub>D</sub> (M)
FVIIa/sTF (640 nM) 4F110 KPI-3 2.31E+04 4.61E-03 1.99E-07
FVIIa/sTF (640 nM) 4F36 KPI-2 1.09E+04 2.79E-03 2.56E-07
FVIIa/sTF (640 nM) 2F22 1-79 n.b. n.b n.b.
FVIIa/sTF (640 nM) 2F3 1-79 n.b. n.b n.b.
FVIIa/sTF (640 nM) 2F45 1-79 n.b. n.b n.b.
FVIIa/sTF (640 nM) 2F48 1-79 n.b. n.b n.b.
FVIIa/sTF (640 nM) 1F91 1-79 n.b. n.b n.b.
FVIIa/sTF (640 nM) 2F35 1-79 n.b. n.b n.b.
FVIIa/sTF (640 nM) 10R-T141A 1-79 n.b. n.b n.b.
FVIIa/sTF (640 nM) MBS532510 1-79 n.b. n.b n.b.
FVIIa/sTF (640 nM) ADG4903 1-79 n.b. n.b n.b.
FVIIa/sTF (640 nM) 2H8 1-79 n.b. n.b n.b.
实施例8：对TFPI (1-79)特异性的抗-TFPI抗体对FXa酰胺裂解(amidolytic)活性TFPIα抑制的作用
抗体对FXa (Enzyme Research Laboratories Ltd.)对生色底物S-2765(Chromogenix)的酰胺裂解活性的TFPIα抑制的作用在包含50 mM HEPES, pH 7.4, 100 mMNaCl, 5 mM CaCl2, 0.1 mg/ml BSA的缓冲液中测定。抗-TFPI mAb (32 nM)与8 nM TFPIα(SEQ ID NO: 1)在室温下一起孵育30分钟。加入S-2765 (0.5 mM)和孵育5分钟。通过加入FXa至终浓度0.1 nM，开始反应。在40分钟孵育后在Spectramax 340 Microplate分光光度计中以405 nM测量产物形成。在缺少TFPIα时的活性设定为100 %和在存在TFPIα但缺少抗体时的活性设定为0%。结果显示在表12中。如所预期的，TFPIα与KPI-2 mAb2021 (公开于WO2010/072691)的预孵育完全中和TFPIα对FXa的活性。TFPI KPI-1抗体的作用可被分成两组，一组(2F3、2F22、2F45)部分中和FXa的TFPIα抑制(> 20%)和另一组不明显影响FXa的TFPIα抑制(< 20%)。
表12：抗体对FXa的TFPIα抑制的作用
在与TFPIα一起孵育40分钟后测量的剩余的FXa活性。在缺少TFPIα时的活性设定 为100 %和在存在TFPIα但缺少抗体时的活性设定为0 %
化合物 FXa活性(%)
2021 103.8 ± 6.6
1F56 5.5 ± 1.1
1F91 5.8 ± 2.1
2F3 48.9 ± 1.3
2F22 50.4 ± 1.4
2F35 13.4 ± 8.0
2F45 28.2 ± 1.8
2F48 8.2 ± 1.9
2H8 3.4
ADG4903 4.9
10R-T141A 6.8
MBS532510 6.8
实施例9：通过sTF/FVIIa-和FXa酰胺裂解活性测量的TFPIα抑制被对TFPI (1-79)特异性的抗-TFPI抗体的逆转
抗体对FVIIa/sTF活性的TFPIα抑制的作用在20 mM HEPES, pH 7.5, 150 mMNaCl 5 mM CaCl2 0.1 % BSA中研究。反应混合物包含5 nM FVIIa、10 nM可溶性TF (sTF)和0.5 mM的生色底物S-2288 (H-D-Ile-Pro-Arg-pNa, Chromogenix)。可溶性组织因子1-219 (sTF)按照公开的程序(Freskgard等, 1996)制备。重组FVIIa的表达和纯化按之前所述进行(Thim等, 1988; Persson和Nielsen, 1996)。在室温下通过OD405nm的变化测量活性，和在缺少TFPI时的活性设定为100 %。FVIIa/sTF活性通过加入150 nM TFPIα(SEQ ID NO:1)受到抑制，和抑制被200 nM的针对TFPI (1-79)的各种抗体逆转，如表13所示。在这些条件下，一些针对TFPI (1-79)的抗体(1F91、2F3、2F22、2F45)逆转FVIIa/sTF的TFPIα抑制。一种TFPI (1-79)抗体(2F35)和KPI-2抗体(2021，公开于WO2010/072691)没有明显作用。
接下来研究KPI-1抗体对逆转FXa活性的TFPIα抑制的作用。反应混合物包含在20mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1 % BSA中的1 nM FXa和0.5 mM的生色底物S-2765 (Z-D-Arg-Gly-Arg-pNa, Chromogenix)。FXa与4 nM TFPIα(SEQ ID NO: 1)一起孵育15分钟，接着加入0.5 mM S-2765。然后在室温下通过OD405nm变化测量活性。在15分钟后通过加入20 nM TFPI (1-79) (1F91、2F3、2F22、2F35、2F45)或KPI-2 (2021，公开于WO2010/072691)抗体诱导抑制的逆转。随后得到进展曲线，加入抗体后100分钟测量斜率。在缺少TFPI时的活性设定为100 %。结果显示在表13中。因为KPI-2结合FXa，因此令人惊讶的是，许多对TFPI (1-79)特异性的抗-TFPI抗体(2F3、2F22、2F45)比结合KPI-2 (其与FXa活性位点相互作用)上的表位的mAb 2021更有效地逆转FXa活性的TFPIα抑制。该结果表明，TFPI (1-79)上的区域而非KPI-2上的主要接触区域对于TFPIα与FXa的结合是关键的。
表13：FVIIa/sTF和FXa酰胺裂解活性的TFPIα抑制的逆转
化合物 FVIIa/sTF活性(%) 100分钟孵育后FXa活性(%)
FVIIa/sTF或FXa (A) 100 ± 0.7 100 ± 1.7
(A) + TFPI (B) 59.0 ± 0.2 0.5 ± 0.06
(B) + 1F91 82.2 ± 0.4 5.1 ± 0.06
(B) + 2F3 88.6 ± 0.5 58.1 ± 1.0
(B) + 2F22 88.3 ± 0.5 60.8 ± 1.5
(B) + 2F35 61.4 ± 0.2 4.2 ± 0.1
(B) + 2F45 87.5 ± 0.4 38.3 ± 1.9
(B) + 2021 66.5 ± 0.3 18.6 ± 0.4
实施例10：对TFPI (1-79)特异性的抗体对FXa产生的作用
抗-TFPI抗体对FXa产生的TFPIα抑制的作用在包含50 mM HEPES, pH 7.4, 100mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA, 0.1% PEG8000 (w/v)的缓冲液中进行测定。抗体(64 nM)与4 nM TFPIα一起在室温下孵育10分钟，然后加入FVIIa (0.5 nM)和30 pM DadeInnovin (Dade Behring)的预孵育混合物(5分钟)。重组FVIIa的表达和纯化按之前所述进行(Thim等, 1988; Persson和Nielsen, 1996)。在加入160 nM FX (Enzyme ResearchLaboratories Ltd)后，以总体积100 ml孵育反应物30分钟。通过加入50 ml终止缓冲液(50mM HEPES, pH 7.4, 100 mM NaCl, 80 mM EDTA)将反应淬灭和通过加入50 ml的2 mM生色底物S-2765 (Chromogenix)测定产生的FXa的量。使用Spectramax 340 Microplate分光光度计在405 nm监测S-2765裂解。在缺少TFPIα时的活性设定为100 %和在存在TFPIα但缺少抗体时的活性设定为0%。结果表明抗-TFPI (1-79)抗体2F22和2F3最有效地中和FXa产生的TFPIα抑制(表14)。如所预期的，TFPI KPI-2抗体(mAb 2021，公开于WO2010/072691)完全中和TFPI抑制。
表14：FXa活性
FVIIa、Innovin、FX和TFPI与和不与抗体孵育30分钟后产生的FXa活性。在缺少 TFPIα时的活性设定为100 %和在存在TFPIα但缺少抗体时的活性设定为0%
化合物 FXa活性(%)
2F22 40.5
2F3 36.6
2F45 21.0
2F48 2.9
1F56 18.4
1F91 13.9
2F35 18.3
mAb 2021 103.1
实施例11：对TFPI (1-79)特异性的TFPI抗体对FVIII-中和的全血的凝血弹性描记法(TEG)的作用
将柠檬酸盐稳定的全血补充(终浓度)：100 µg/ml绵羊抗人FVIII抗体(Haematologic Technologies Inc., PAHFVIII-S)和0.3 pM TF (Innovin®, 1:20,000)。在缺少或存在100 nM TFPI抗体时当将320 uL的该预混物转移至包含20 uL 0.2 M CaCl2的凝血弹性描记杯时开始凝血。连续跟踪TEG迹线多达120分钟(5000系列TEG分析仪,Haemoscope Corporation, Niles, IL, US)。记录以下TEG变量：R时间(凝血时间，即自开始凝血直到获得2 mm幅度的时间)、MTG (凝血酶产生的最大速率)、角(作为R值和TEG迹线的拐点之间的角度测量的凝块发展)和MA (TEG迹线的最大幅度，反映了凝块的最大机械强度)。结果表明，一些TFPI抗体，但不是所有的抗体，缩短凝血时间(R值)和提高凝血酶产生的最大速率(MTG)、角和最大幅度(MA)至与参比TFPI KPI-2抗体(mAb 2021，公开于WO2010/072691)类似的程度(表15)。
表15：TEG结果
源自在FVIII-中和的血液中获得的凝血弹性描记法曲线的R时间(凝血时间)、 MTG (凝血酶产生的最大速率)、角和MA (最大幅度)
Figure 462908DEST_PATH_IMAGE013
尽管本文已经举例说明和描述了本发明的某些特征，但现在本领域普通技术人员将想到许多修饰、置换、改变和等同方案。因此，应理解随附权利要求意欲涵盖所有这样的修饰和改变，正如落入本发明的真实精神内一样。
Figure IDA0000909657920000011
Figure IDA0000909657920000021
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Figure IDA0000909657920000171
Figure IDA0000909657920000181
Figure IDA0000909657920000191

Claims (10)

1. 抗体或其抗原结合片段，其特异性结合如SEQ ID NO: 1所示的人TFPI的氨基酸残基1-79中存在的表位，其重链包含：
●SEQ ID NO: 4的氨基酸31-35 (SYGVH)所示的CDR1序列；和
●SEQ ID NO: 4的氨基酸50-65 (VIWRGGSTDFNAAFMS)所示的CDR2序列；和
●SEQ ID NO: 4的氨基酸98-110 (NSHGNYVGYAMDY)所示的CDR3序列；
其轻链包含：
●SEQ ID NO: 5的氨基酸24-34 (KASENVGAAVA)所示的CDR1序列；和
●SEQ ID NO: 5的氨基酸50-56 (SASNRYT)所示的CDR2序列；和
●SEQ ID NO: 5的氨基酸89-96 (QQYTNYPT)所示的CDR3序列。
2. 抗体或其抗原结合片段，其特异性结合如SEQ ID NO: 1所示的人TFPI 的氨基酸残基1-79中存在的表位，其重链包含：
●SEQ ID NO: 6的氨基酸31-35 (NYGVH)所示的CDR1序列；和
●SEQ ID NO: 6的氨基酸50-65 (VIWRGGSIDYNAAFMS)所示的CDR2序列；和
●SEQ ID NO: 6的氨基酸98-110 (NSHGNYVGYAMDY)所示的CDR3序列；
其轻链包含：
●SEQ ID NO: 7的氨基酸24-34 (KASQSVGPAVA)所示的CDR1序列；和
●SEQ ID NO: 7的氨基酸50-56 (SASNRYT)所示的CDR2序列；和
●SEQ ID NO: 7的氨基酸89-96 (QQYTSYPT)所示的CDR3序列。
3. 抗体或其抗原结合片段，其特异性结合如SEQ ID NO: 1所示的人TFPI的氨基酸残基1-79中存在的表位，其重链包含：
●SEQ ID NO: 8的氨基酸31-35 (GYGVH)所示的CDR1序列；和
●SEQ ID NO: 8的氨基酸50-65 (VIWRGGSIDYNAAFMS)所示的CDR2序列；和
●SEQ ID NO: 8的氨基酸98-110 (NSHGNYVGYAMDY)所示的CDR3序列；
其轻链包含：
●SEQ ID NO: 9的氨基酸24-34 (KASQNVGTAVA)所示的CDR1序列；和
●SEQ ID NO: 9的氨基酸50-56 (SASNRYT)所示的CDR2序列；和
●SEQ ID NO: 9的氨基酸89-96 (QQYTSYPT)所示的CDR3序列。
4.权利要求1-3中任一项的抗体或其抗原结合片段，其为单克隆抗体。
5.权利要求1-3中任一项的抗体或其抗原结合片段，其为人源化抗体。
6.权利要求1-3中任一项的抗体或其抗原结合片段，其选自Fab、Fab’、Fab2、Fab’2和scFv片段。
7.药物制剂，其包含至少一种权利要求1-6中任一项的抗体或其抗原结合片段和至少一种药学上可接受的赋形剂。
8.权利要求1-6中任一项的抗体或其抗原结合片段或权利要求7的药物制剂用于制备治疗凝血病的药物的用途。
9.根据权利要求8的用途，其中所述的凝血病为先天性、后天性和/或医源性凝血病。
10.根据权利要求8的用途，其中所述的凝血病为含或不含抑制剂的血友病A，或含或不含抑制剂的血友病B。
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