MX2013011218A - Anticuerpos monoclonales frente al inhibidor de la ruta del factor tisular (tfpi). - Google Patents

Abstract

Se proporcionan anticuerpos monoclonales aislados que se unen a epítopos específicos del inhibidor de la ruta del factor tisular humano (TFPI) y las moléculas de ácido nucleico aisladas que los codifican. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos monoclonales anti-TFPI y procedimientos de tratamiento de deficiencias o defectos en la coagulación por la administración de los anticuerpos.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES FRENTE AL INHIBIDOR DE LA RUTA DEL FACTOR TISULAR (TFPI) CAMPO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan anticuerpos monoclonales aislados y sus fragmentos que se unen al inhibidor de la ruta del factor tisular humano (TFPI).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La coagulación sanguínea es un proceso mediante el cual la sangre forma coágulos estables para detener las hemorragias. El proceso implica una serie de proenzimas y procofactores (o "factores de coagulación") que circulan en la sangre. Dichas proenzimas y procofactores interaccionan a través de varias rutas a través de las cuales se convierten, bien secuencialmente o simultáneamente, en la forma activada. En último término, el proceso da como resultado la activación de la protrombina a trombina mediante el factor X activado (FXa) en presencia del factor Va, calcio iónico y plaquetas. La trombina activada induce a su vez la agregación de plaquetas y convierte el fibrinógeno en fibrina, que después se entrecruza mediante el factor XIII activado (FXIIIa) para formar un coágulo.

El proceso que conduce a la activación del factor X puede llevarse a cabo mediante dos rutas distintas: la ruta de activación por contacto (antiguamente conocida como la ruta intrínseca) y la ruta del factor tisular (antiguaménte conocida como la ruta extrínseca). Anteriormente se creía que la cascada de la coagulación constaba de dos rutas de igual importancia unidas en una ruta común. Ahora se sabe que la ruta principal para la iniciación de la coagulación sanguínea es la ruta del factor tisular.

El factor X puede activarse mediante el factor tisular (TF) en combinación con el factor VII activado (FVIIa). El complejo de factor Vlla y su cofactor esencial, el TF, es un potente iniciador de la cascada de la coagulación.

La ruta del factor tisular de coagulación está controlada negativamente por el inhibidor de la ruta del factor tisular ("TFPI"). El TFPI es un inhibidor de retroalimentación dependiente del FXa del complejo FVIIA TF. Es un miembro de los inhibidores de serina proteasas de tipo Kunitz multivalentes. Fisiológicamente, el TFPI se une al factor X activado (FXa) para formar un complejo heterodimérico, que interacciona posteriormente con el complejo de FVIIa/TF para inhibir su actividad, cerrando así la ruta del factor tisular de coagulación. En principio, el bloqueo de la actividad del TFPI puede reestablecer la actividad del FXa y FVIIa/TF, prolongando así la duración de la acción de la ruta del factor tisular y amplificando la generación del FXa, que es el defecto común en la hemofilia A y B.

De hecho, algunas pruebas experimentales preliminares han indicado que el bloqueo de la actividad del TFPI por anticuerpos frente al TFPI normaliza el tiempo de coagulación prolongado o acorta el tiempo de hemorragia. Por ejemplo, Nordfang y col. mostraron que el tiempo de protrombina diluido prolongado del plasma hemofílico se normalizaba después de tratar el plasma con anticuerpos para el TFPI (Thromb. Haemost., 1991 , 66(4): 464-467). De forma similar, Erhardtsen y col. mostraron que el tiempo de hemorragia en un modelo de conejo de hemofilia A se acortaba significativamente por anticuerpos anti-TFPI (Blood Coagulation and Fibrinolysys, 1995, 6: 388-394). Estos estudios sugieren que la inhibición del TFPI por anticuerpos anti-TFPI puede ser útil para el tratamiento de la hemofilia A o B. En estos estudios se usó solamente anticuerpo anti-TFPI policlonal.

Se prepararon e identificaron anticuerpos monoclonales frente a TFPI humano recombinante (rhTFPI) usando técnicas de hibridoma. Véase Yang y col., Chin. Med. J., 1998, 111(8): 718-721. Se sometió a prueba el efecto del anticuerpo monoclonal sobre el tiempo de protrombina diluido (PT) y el tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT). Los experimentos mostraron que el anticuerpo monoclonal anti-TFPI acortaba el tiempo de coagulación de tromboplastina diluido del plasma deficiente en factor IX. Se sugiere qüe la ruta del factor tisular desempeña un papel importante, no sólo en la coagulación fisiológica, sino también en la hemorragia de la hemofilia (Yang y col., Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao, 1997, 22(4): 297-300).

En consecuencia, se necesitan anticuerpos específicos para el TFPI para tratar enfermedades hematológicas y el cáncer.

En general, los anticuerpos terapéuticos para enfermedades humanas se han generado usando ingeniería genética para crear anticuerpos murinos, quiméricos, humanizados o totalmente humanos. Se mostró que los anticuerpos monoclonales humanos tenían un uso limitado como agentes terapéuticos debido a su corta semivida en suero, su incapacidad de desencadenar funciones efectoras humanas y la producción de anticuerpos humanos anti-ratón (Brekke y Sandlie, "Therapeutic Antibodies for Human Diseases at the Dawn of the Twenty-first Century", Nature 2, 53, 52-62, ene. 2003). Se ha mostrado que los anticuerpos quiméricos dan lugar a respuestas de anti-anticuerpo quimérico humanas. Los anticuerpos humanizados minimizan adicionalmente el componente de ratón de los anticuerpos. Sin embargo, un anticuerpo totalmente humano evita por completo la inmunogenicidad asociada con elementos murinos. Por tanto, existe una necesidad de desarrollar anticuerpos totalmente humanos para evitar la inmunogenicidad asociada con otras formas de anticuerpos monoclonales modificados por ingeniería genética. En particular, un tratamiento profiláctico crónico como el que sería necesario para el tratamiento de la hemofilia con un anticuerpo monoclonal anti-TFPI presenta un alto riesgo de desarrollo de una respuesta inmunitaria frente al tratamiento si se usa un anticuerpo con un componente murino o de origen murino, debido a la frecuente administración de dosis requerida y la larga duración del tratamiento. Por ejemplo, el tratamiento de anticuerpos para la hemofilia A puede requerir una administración de dosis semanal durante toda la vida del paciente. Esto supondría una exposición continua del sistema inmunitario. Por tanto, existe la necesidad de proporcionar un anticuerpo totalmente humano para el tratamiento de anticuerpos para la hemofilia y deficiencias genéticas y adquiridas relacionadas o defectos en la coagulación.

Se han preparado anticuerpos terapéuticos a través de tecnología de hibridomas descrita por Koehler y Milstein en "Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity", Nature 256, 495-497 (1975). Los anticuerpos totalmente humanos también pueden prepararse de manera recombinante en procariotas y eucariotas. Se prefiere la producción recombinante de un anticuerpo en una célula huésped en lugar de la producción de hibridomas para un anticuerpo terapéutico. La producción recombinante tiene las ventajas de una consistencia del producto mayor, un nivel de producción probablemente mayor y una fabricación controlada que minimiza o elimina la presencia de proteínas derivadas de animales. Por estos motivos, es deseable producir un anticuerpo anti-TFPI monoclonal de manera recombinante.

Además, debido a que el TFPI se une al factor X activado (FXa) con una alta afinidad, un anticuerpo anti-TFPI eficaz debería tener una afinidad comparable. Por tanto, es deseable obtener un anticuerpo anti-TFPI que tenga una afinidad de unión , que pueda competir con la unión de TFPI/FXa.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proporcionan anticuerpos monoclonales que tienen una unión específica a un epítopo específico del inhibidor de la ruta del factor tisular humano (TFPI). Asimismo, sé proporcionan polinucleótidos que codifican los anticuerpos monoclonales anti-TFPI. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos monoclonales anti-TFPI y procedimientos de tratamiento de deficiencias o defectos genéticos y adquiridos de la coagulación tales como la hemofilia A y B.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra la formación del complejo de Fab A y el dominio de Kunitz 2 del TFPI mediante análisis de exclusión por tamaño.

La figura 2 muestra una representación en dibujo de la interacción entre el inhibidor de la ruta del factor tisular humano y uno de sus anticuerpos (Fab A). El Fab A con los dominios variable ligero (VL) y pesado (VL) indicados se representa como la estructura inferior. El dominio de Kunitz 2 (KD2) del TFPI se representa como la estructura superior.

La figura 3 muestra los restos clave del epítopo Asp102 (D102), Ile105 (1105), Arg107 (R107), el puente disulfuro Cys106-Cys130 y la unión del TFPI y la superficie del Fab A.

La figura 4 muestra una superposición del complejo de TFPI - Fab A y un dominio de Kunitz 2 (KD2) unido a tripsina y muestra la exclusión de la unión simultánea del TFPI al factor Xa y al Fab A. El KD2 y el Fab A se muestran en un diagrama en colores, la tripsina se muestra como una superficie transparente.

También se indica el impedimento estérico del Fab A y la tripsina.

La figura 5 muestra la formación del complejo de Fab B y el dominio de Kunitz 1+2 del TFPI mediante análisis de exclusión por tamaño.

La figura 6 muestra dos representaciones en dibujos que muestran la interacción entre el inhibidor de la ruta del factor tisular humano y uno de sus anticuerpos (Fab B) en un primer ángulo y en otro ángulo rotado 90 grados con relación al primer ángulo. El Fab B con los dominios variable ligero (VL) y pesado (V[_) indicados se muestra en la parte inferior de la figura (sombreado en gris). El dominio de Kunitz 1 (KD1) del TFPI se muestra en blanco y el dominio de Kunitz 2 (KD2) del TFPI se muestra en negro.

La figura 7 muestra los restos clave del epítopo Asp3'1 (D31), Asp32 (D32), Pro34 (P34), Lys36 (K36), Glu60 (E60), el puente disulfuro Cys35-Cys59 y la unión del dominio de Kunitz 1 del TFPI en la superficie del Fab B. También se muestra, aunque no se enumera, la unión del dominio de Kunitz 2.

La figura 8 muestra dos ángulos de visión de la unión e interacción de los restos del epítopo Glu100 (E100), Glu101 (E101), Pro103 (P103), Ile105 (1105), Arg107 (R107), Tyr109 (Y109) del dominio de Kunitz 2 con el Fab B. La Arg107 interacciona con Gly33 (G33) y Cys35 (C35) del dominio de Kunitz 1.

La figura 9 muestra una superposición del complejo de TFPI - Fab B y un complejo de BPTI, factor VHa y factor tisular, y muestra la exclusión de la unión simultánea del TFPI al factor Vlla/factor tisular y al Fab B. El impedimento estérico del Fab B y el factor Vlla y del Fab B y el factor tisular se indican con flechas.

La figura 10 muestra una superposición del complejo de TFPI - Fab B y un dominio de Kunitz 2 unido a tripsina y muestra la exclusión de la unión simultánea del TFPI al factor Xa y a Fab B. Se indican el impedimento estérico del Fab B y la tripsina y del dominio de Kunitz 1 unido al Fab B y la tripsina.

La figura 11 muestra (A) una alineación de secuencias de las cadenas ligeras y pesadas del Fab A (SEC ID N°: 2 y 3) y del Fab C (SEC ID N°: 6 y 7) y (B) una superposición de la estructura de rayos X del TFPI - Fab A con modelos de homología del Fab C. (A) Los restos del parátopo están en negrita y resaltados. El resto de parátopo hc_Asn32 que difiere en el Fab A y el Fab C está marcado con un asterisco. (B) El dominio de Kunitz 2 (KD2) se muestra en negro en el dibujo. Las estructuras de Fab se muestran como cintas grises. El resto de parátopo hc_Asn32 se muestra como una varilla.

La figura 12 muestra (A) una alineación de secuencias de las cadenas ligeras y pesadas del Fab B (SEC ID N°: 4 y 5) y del Fab D (SEC ID N°: 8 y 9) y (B) una superposición de la estructura de rayos X del TFPI - Fab B con modelos de homología del Fab D. (A) Los restos del parátopo están en negrita y resaltados. Los restos del parátopo que difieren en el Fab B y el Fab D están marcados con un asterisco. (B) El dominio de Kunitz 1 (KD1) y el dominio de Kunitz 2 (KD2) se muestran en el dibujo en gris claro y negro, respectivamente. Las estructuras de Fab se muestran como cintas grises. Los restos del parátopo que difieren en Fab B y Fab C se muestran como varillas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La expresión "inhibidor de la ruta del factor tisular" o "TFPI" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier variante, isoforma y especie homologa del TFPI humano expresado de manera natural por células. En una realización preferida de la invención, la unión de un anticuerpo de la invención al TFPI reduce el tiempo de coagulación sanguínea.

Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo completo y a cualquiera de sus fragmentos de unión a antígeno (es decir, "porción de unión a antigeno") o cadenas sencillas. El término incluye una molécula de inmunoglobulina de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo de IgG) que se produce de forma natural o se forma mediante procesos de recombinación de fragmentos de genes de inmunoglobulina normales, o una porción inmunológicamente activa de una molécula de inmunoglobulina, tal como un fragmento de anticuerpo, que mantiene la actividad de unión específica. Independientementé de la estructura, un fragmento de anticuerpo se une al mismo antígeno que reconoce el anticuerpo de longitud completa. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo monoclonal anti-TFPI se une a un epítopo del TFPI. La función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión que se engloban dentro del término "porción de unión a anticuerpo" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CHi; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y Cm; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento de dAb (Ward y col., (1989) Nature 341 :544-546), que consiste en un dominio VH; (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada; (vii) minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y cuerpos kappa (véase, por ejemplo, III y col., Protein Eng, 1997, 10:949-57); (viii) IgG de camello; y (ix) IgNAR. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse, usando procedimientos de recombinación, mediante un enlazador sintético que les permite producirse como una única cadena proteica en la que las regiones V|_ y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenarios (scFv); véanse, por ejemplo, Bird y col. (1988) Science 242:423-426; y Huston y col. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). También se pretende que dichos anticuerpos monocatenarios se engloben dentro de la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica y se analiza que los fragmentos sean útiles de la misma manera que lo son los anticuerpos intactos.

Además, se contempla que un fragmento de unión a antígeno pueda englobarse en un mimético de anticuerpo. El término "mimético de anticuerpo" o "mimético" como se usa en el presente documento quiere decir una proteína que muestra unión similar a un anticuerpo pero es un anticuerpo alternativo más pequeño o una proteína que no es un anticuerpo. Tal mimético de anticuerpo puede comprenderse en un armazón. El término "armazón" se refiere a una plataforma de polipéptido para el diseño de nuevos productos con funciones y características adaptadas.

El término "epítopo" se refiere a la zona o región de un antígeno con la cual se une o interacciona específicamente un anticuerpo, que en algunas realizaciones Índica dónde está en contacto el antígeno con el anticuerpo. Por el contrario, el término "parátopo" se refiere a la zona o región del anticuerpo en la que se une específicamente el antígeno. Se dice que los epítopos caracterizados por la unión competitiva se solapan si las uniones de los anticuerpos correspondientes son mutuamente excluyentes, es decir, la unión de un anticuerpo excluye la unión simultánea de otro anticuerpo. Se dice que los epítopos son independientes (únicos) si el antígeno puede acomodar la unión de ambos anticuerpos correspondientes simultáneamente.

La expresión "anticuerpos competidores", como se usa en el presente documento, se refiere a anticuerpos que se unen a aproximadamente, sustancialmente o esencialmente al mismo, o incluso al mismo, epítopo que un anticuerpo frente al TFPI como se describe en el presente documento. "Anticuerpos competidores" incluye anticuerpos con especificidades de epítopo solapantes. Por tanto, los anticuerpos competidores pueden competir de forma eficaz con un anticuerpo como se describe en el presente documento por la unión al TFPI. Preferentemente, el anticuerpo competidor puede unirse al mismo epítopo que el anticuerpo descrito en el presente documento. Desde un punto de vista alternativo, el anticuerpo competidor tiene la misma especificidad de epítopo que el anticuerpo descrito en el presente documento.

Como se usan en el presente documento, las expresiones "que inhibe la unión" y "que bloquea la unión" (por ejemplo, en referencia a la inhibición/bloqueo de la unión del ligando de TFPI al TFPI) se usan indistintamente y engloban la inhibición o el bloqueo tanto parcial como total. También se pretende que la inhibición y el bloqueo incluyan cualquier reducción medible de la afinidad de unión del TFPI a un sustrato fisiológico cuando está en contacto con un anticuerpo anti-TFPI en comparación con el TFPI que no está en contacto con un anticuerpo anti-TFPI, por ejemplo, el bloqueo de la interacción del TFPI con el factor Xa o el bloqueo de la interacción de un complejo de TFPI-factor Xa con factor tisular, factor Vlla o el complejo de factor tisular/factor Vlla en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60.%, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 %.

Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" como se usan en el presente documento se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal presenta una única especificidad y afinidad de unión por un epítopo en particular. En consecuencia, el término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que presentan una única especificidad de unión que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humanas. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir restos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humanas (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo).

Se pretende que un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, se refiera a un anticuerpo que no tiene, sustancialmente, otros anticuerpos que tengan especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une al TFPI no tiene, sustancialmente, anticuerpos que se unen a antígenos diferentes del TFPI). Un anticuerpo aislado que se une a un epítopo, isoforma o variante del TFPI humano puede, no obstante, tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, de otras especies (por ejemplo, homólogos de especie del TFPI). Además, un anticuerpo aislado puede no tener, sustancialmente, otro material celular y/o sustancias químicas.

Como se usa en el presente documento, "unión específica" se refiere a un anticuerpo que se une a un antígeno predeterminado. Normalmente, el anticuerpo se une con una afinidad de al menos aproximadamente 105 M" y se une al antígeno predeterminado con una afinidad que es mayor, por ejemplo, al menos dos veces mayor, que su afinidad de unión por un antígeno no pertinente (por ejemplo, BSA, caseína) distinto del antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado. Las expresiones "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se usan indistintamente en el presente documento con la expresión "un anticuerpo que se una específicamente a un antígeno".

Como se usa en el presente documento, la expresión "alta afinidad" para un anticuerpo de IgG se refiere a una afinidad de unión de al menos aproximadamente 107 M"\ en algunas realizaciones de al menos aproximadamente 108 M~1, en algunas realizaciones de al menos aproximadamente 109 M"\ 1010 M"1, 1011 M'1 o mayor, por ejemplo, de hasta 1013 M"1 o mayor. Sin embargo, la unión de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpos. Por ejemplo, la unión de "alta afinidad" para un isotipo IgM se refiere a una afinidad de unión de al menos aproximadamente 1 ,0 x 107 M"1. Tal como se usa en el presente documento, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o lgG1) que está codificada por genes de la región constante de la cadena pesada.

"Región determinante de la complementariedad" o "CDR" se refiere a una de las tres regiones hipervariables dentro de la región variable de la cadena pesada o la región variable de la cadena ligera de una molécula de anticuerpo que forman la superficie de unión a antígeno en N-terminal que es complementaria a la estructura tridimensional del antígeno unido. Partiendo desde el extremo N-terminal de una cadena pesada o ligera, estas regiones determinantes de la complementariedad se denominan "CDR1", "CDR2" y "CDR3", respectivamente. Las CDR están implicadas . en la unión anticuerpo-antígeno y la CDR3 comprende una región única específica para la unión anticuerpo-antígeno. Por lo tanto, un sitio de unión a antígeno puede incluir seis CDR, comprendiendo las CDR regiones de cada una de las regiones V de la cadena pesada y la cadena ligera.

Como se usa en el presente documento, "sustituciones conservadoras" se refiere a modificaciones de un polipéptido que implican la sustitución de uno o más aminoácidos por aminoácidos que tienen propiedades bioquímicas similares que no dan como resultado la pérdida de una función biológica o bioquímica del polipéptido. Una "sustitución de aminoácido conservadora" es aquella en la que el resto de aminoácido se reemplaza con un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de restos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Se prevé que los anticuerpos de la presente invención puedan tener sustituciones de aminoácidos conservadoras y mantener aun así su actividad.

Para ácidos nucleicos y polipéptidos, la expresión "homología sustancial" indica que dos ácidos nucleicos o dos polipéptidos, o secuencias designadas de los mismos, cuando se alinean de forma óptima y se comparan, son idénticos, con inserciones o eliminaciones de nucleótidos o aminoácidos apropiadas, en al menos aproximadamente el 80 % de los nucleótidos o aminoácidos, normalmente al menos aproximadamente el 85 %, preferentemente aproximadamente el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % o 95 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 % o 99,5 % de los nucleótidos o aminoácidos. De forma alternativa, existe homología sustancial para los ácidos nucleicos cuando los segmentos hibridan bajo condiciones de hibridación selectivas para el complemento de la hebra. La invención incluye secuencias de ácidos nucleicos y polipéptidos que tienen una homología sustancial con las secuencias de ácidos nucleicos y las secuencias de aminoácidos específicas mencionadas en el presente documento.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = n° de posiciones idénticas/n0 total de posiciones x 00), teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que han de introducirse para la alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matemático, tal como, sin limitación, el módulo AlignX™ de VectorNTI™ (Invitrogen Corp., Carsbald, CA). Para AlignX™, los parámetros de alineación múltiple por defecto son: penalización por apertura de hueco: 10; penalización por extensión de hueco: 0,05; intervalo de penalización por separación de hueco: 8; % de identidad por retraso en la alineación: 40. (pueden encontrarse más detalles en http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/LINNEA-Online-Guides/LINNEA-Communities/Vector-NTI-Community/Sequence-analysis-and-data-management-software-for-PCs/AlignX-Module-for-Vector-NTI-Advañce.reg.us.html).

Otro procedimiento para determinar el mejor apareamiento general entre una secuencia de consulta (una secuencia de la presente invención) y una secuencia objeto, a lo que también se hace referencia como alineación de secuencias global, puede determinarse usando el programa de ordenador CLUSTALW (Thompson y col., Nucleic Acids Research, 1994, 2(22): 4673-4680), que se basa en el algoritmo de Higgins y col., (Computer Applications ¡n the Biosciences (CABIOS), 1992, 8(2): 189-191). En una alineación de secuencias, tanto la secuencia de consulta como la secuencia objeto son secuencias de ADN. El resultado de dicha alineación de secuencias global es en porcentaje de identidad. Los parámetros preferidos usados en una alineación de secuencias de ADN con CLUSTALW para calcular el porcentaje de identidad a través de alineaciones por apareamientos son: Matriz = IUB, k-tuple = 1 , Número de diagonales principales = 5, Penalización por hueco = 3, Penalización por apertura de hueco = 10, Penalización por extensión de hueco = 0,1. Para alineaciones múltiples, los parámetros de CLUSTALW preferidos son los siguientes: Penalización por apertura de hueco = 10; Parámetro de extensión de hueco = 0,05; Intervalo de penalización por separación de hueco = 8; % de identidad por retraso en la alineación = 40.

Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico se "aisla" o "se hace sustancialmente puro" cuando se purifica separándolo de otros componentes celulares con los que se asocia normalmente en el entorno natural. Para aislar un ácido nucleico, pueden usarse técnicas convencionales tales como las siguientes: tratamiento alcalino/SDS, bandeo con CsCI, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otras bien conocidas en la técnica.

Anticuerpos monoclonales que se unen a epítopos del TFPI específicos En el presente documento se proporcionan anticuerpos con unión específica al TFPI humano como se muestra en la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales anti-TFPI inhiben la unión de un ligando de TFPI al TFPI. Por tanto, en algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales anti-TFPI pueden inhibir la actividad del TFPI.

Se proporciona un anticuerpo monoclonal aislado que se une a un epítopo del inhibidor de la ruta del factor tisular humano (SEC ID N°: 1), en el que dicho epítopo comprende uno o más restos del dominio de Kunitz 2. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal aislado comprende la cadena ligera como se muestra en la SEC ID N°: 2 o en la SEC ID N°: 4. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal aislado comprende la cadena pesada como se muestra en la SEC ID N°: 3 o en la SEC ID N°: 5. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal aislado comprende la cadena ligera como se muestra en la SEC ID N°: 2 y la cadena pesada como se muestra en la SEC ID N°: 3. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal aislado comprende la cadena ligera como se muestra en la SEC ID N°: 4 y la cadena pesada como se muestra en la SEC ID N°: 5. En algunas realizaciones, también se contempla que el anticuerpo monoclonal aislado pueda comprender una cadena ligera o una cadena pesada con homología sustancial con las que se proporcionan. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal aislado que comprende la homología sustancial puede comprender una o más sustituciones conservadoras.

En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo monoclonal aislado que se une a un epítopo del inhibidor de la ruta del factor tisular humano (SEC ID N°: 1), en el que dicho epítopo comprende uno o más restos seleccionados de entre Glu100, Glu101, Asp102, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Lys126, Gly128, Gly129, Cys130, Leu131 , Gly132 y Asn133 de la SEC ID N°: 1 y sus combinaciones.

En algunas realizaciones, el epítopo comprende el resto Glu100 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el epítopo comprende el resto Glu101 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el epítopo comprende el resto Asp102 de la SEC ID, N°: 1. En algunas realizaciones, el epítopo comprende el resto Pro103 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el epítopo comprende el resto Gly104 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el epítopo comprende el resto Ile105 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el epítopo comprende el resto Cys106 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el epítopo comprende el resto Arg107 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el epítopo comprende el resto Gly108 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el epítopo comprende el resto Tyr109 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el epítopo comprende el resto Lys126 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el epítopo comprende el resto Gly128 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el epítopo comprende el resto Gly129 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el epítopo comprende el resto Cys130 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el epítopo comprende el resto Leu131 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el epítopo comprende el resto Gly132 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el epítopo comprende el resto Asn133 de la SEC ID N°: 1.

En algunas realizaciones, el epítopo comprende los restos Ile105 y Ásp102 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el epítopo comprende los restos Ile105 y Leu131 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones el epítopo comprende los restos Ile105, Asp102 y Leu131 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el epítopo comprende además el resto Glu100, Glu101, Pro103, Gly104, Cys106, Gly108, Tyr109, Lys126, Gly128, Gly129, Cys130, Leu131, Gly132 o Asn133 de la SEC ID N°: 1.

En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo monoclonal aislado que se une a un epítopo del inhibidor de la ruta del factor tisular humano (SEC ID N°: 1), en el que dicho epítopo comprende dos bucles de aminoácidos enlazados por un puente disulfuro entre los restos Cys106 y Cys130 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el epítopo comprende además uno o más restos seleccionados de entre Glu100, Glu101, Asp102, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Lys126, Gly128, Gly129, Cys130, Leu131 , Gly132 y Asn133 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el epítopo comprende el resto Ile105 de la SEC ID N°: 1. En otras realizaciones, el epítopo comprende el resto Asp102 de la SEC ID N°: 1. En otras realizaciones, el epítopo comprende el resto Leu131 de la SEC ID N°: 1. Y en algunas realizaciones, el epítopo comprende además uno o más restos seleccionados de entre Glu100, Glu101 , Asp102, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Lys126, Gly128, Gly129, Cys130, Leu131, Gly132 y Asn133 de la SEC ID N°: 1.

Se proporciona también un anticuerpo monoclonal aislado que se une a un epítopo del inhibidor de la ruta del factor tisular humano (SEC ID N°: 1), en el que dicho epítopo comprende uno o más restos del dominio de Kunitz 1 y uno o más restos del dominio de Kunitz 2. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal aislado comprende la cadena ligera como se muestra en la SEC ID N°: 6 o en la SEC ID N°: 8. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal aislado comprende la cadena pesada como se muestra en la SEC ID N°: 7 o en la SEC ID N°: 9. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal aislado comprende la cadena ligera como se muestra en la SEC ID N°: 6 y la cadena pesada como se muestra en la SEC ID N°: 7. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal aislado comprende la cadena ligera como se muestra en la SEC ID N°: 8 y la cadena pesada como se muestra en la SEC ID N°: 9. En algunas realizaciones, también se contempla que el anticuerpo monoclonal aislado pueda comprender una cadena ligera o una cadena pesada con homología sustancial con las que se proporcionan. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal aislado que comprender la homología sustancial puede comprender una o más sustituciones conservadoras.

En algunas realizaciones, los restos del dominio de Kunitz 1 comprenden uno o más restos seleccionados de entre Asp31 , Asp32, Gly33, Pro34, Cys35, Lys36, Cys59, Glu60 y Asn62 de la SEC ID N°: 1 y sus combinaciones. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 1 comprende el resto Asp31 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 1 comprende el resto Asp32 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 1 comprende el resto Gly33 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 1 comprende el resto Pro34 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 1 comprende el resto Cys35 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 1 comprende el resto Lys36 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 1 comprende el resto Cys59 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 1 comprende el resto Glu60 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 1 comprende el resto Asn62 de la SEC ID N°: 1.

En algunas realizaciones, los restos del dominio de Kunitz 1 comprenden los restos Pro34 y Glu60 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, los restos" del dominio de Kunitz 1 comprenden los restos Pro34 y Lys36 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, los restos del dominio de Kunitz 1 comprenden los restos Pro34, Lys36 y Glu60 de la SEC ID N°: 1.

En algunas realizaciones, los restos del dominio de Kunitz 2 comprenden uno o más restos seleccionados de entre GlulOO, Glu101 , Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Phe114, Asn116, Glu123, Arg124, Lys126, Tyr127 y Gly128 de la SEC ID N°: 1 y sus combinaciones. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 2 comprende el resto GlulOO de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 2 comprende el resto Glu101 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 2 comprende el resto Pro103 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 2 comprende el resto Gly104 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 2 comprende el resto Ile105 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 2 comprende el resto Cys106 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 2 comprende el resto Arg107 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 2 comprende el resto Gly108 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 2 comprende el resto Tyr109 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 2 comprende el resto Phe114 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 2 comprende el resto Asn 16 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 2 comprende el resto Glu123 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 2 comprende el resto Arg124 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 2 comprende el resto Lys126 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 2 comprende el resto Tyr127 de la SEC ID N°: 1.

En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 2 comprende los restos Arg107 y Glu101 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 2 comprende los restos Arg107 y Tyr109 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 2 comprende los restos Arg107, Glu101 y Tyr109 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 2 comprende el resto Gly128 de la SEC ID N°: 1.

En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 2 puede comprender adicionalmente uno o más restos seleccionados de entre Asp102, Gly129, Cys130, Leu131 , Gly132 y Asn133 de la SEC ID N°: 1 y sus combinaciones.

En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal aislado comprende un resto del dominio de Kunitz 1 que comprende uno o más restos seleccionados de entre Asp31 , Asp32, Gly33, Pro34, Cys35, Lys36, Cys59, Glu60 y Asn62; y un resto del dominio de Kunitz 2 que comprende uno o más restos seleccionados de entre Glu100, Glu101 , Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Phe114, Asn1 16, Glu123, Arg124, Lys126, Tyr127 y Gly128.

' También se proporciona un anticuerpo monoclonal aislado que se une a un epítopo del inhibidor de la ruta del factor tisular humano (SEC ID N°: 1 ), en el que dicho epítopo comprende dos bucles de aminoácidos enlazados por un puente disulfuro entre los restos Cys35 y Cys59 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el epítopo comprende además uno o más restos del dominio de Kunitz 1 y uno o más restos del dominio de Kunitz 2. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 1 comprende uno o más restos seleccionados de entre Asp31 , Asp32, Gly33, Pro34, Cys35, Lys36, Cys59, Glu60 y Asn62 de la SEC ID N°: 1. En algunas realizaciones, el resto del dominio de Kunitz 2 comprende uno o más restos seleccionados de entre Glu100, Glu101 , Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Phe114, Asn116, Glu123, Arg124, Lys126, Tyr127 y Gly128 de la SEC ID N°: 1.

También se proporcionan anticuerpos que pueden competir con cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento por la unión del TFPI. Por ejemplo, un anticuerpo que se une al mismo epítopo que los anticuerpos descritos en el presente documento podrá competir de forma eficaz por la unión al TFPI. En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo monoclonal aislado que se une al TFPI, en el que el anticuerpo monoclonal aislado es competitivo con cualquiera de los anticuerpos monoclonales aislados descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el anticuerpo es competitivo con un anticuerpo que tiene una cadena ligera como se muestra en la SEC ID N°: 2, SEC ID N°: 4, SEC ID N°: 6 o SEC ID N°: 8. En algunas realizaciones, el anticuerpo es competitivo con un anticuerpo que tiene una cadena pesada como se muestra en la SEC ID N°: 3, SEC ID N°: 5, SEC ID N°: 7 o SEC ID N°: 9. En algunas realizaciones, el anticuerpo es competitivo con un anticuerpo que tiene una cadena ligera como se muestra en la SEC ID N°: 2 y una cadena pesada como se muestra en la SEC ID N°: 3. En algunas realizaciones, el anticuerpo es competitivo con un anticuerpo que tiene una cadena ligera como se muestra en la SEC ID N°: 4 y una cadena pesada como se muestra en la SEC ID N°: 5. En algunas realizaciones, el anticuerpo es competitivo con un anticuerpo que tiene una cadena ligera como se muestra en la SEC ID N°: 6 y una cadena pesada como se muestra en la SEC ID N°: 7. En algunas realizaciones, el anticuerpo es competitivo con un anticuerpo que tiene una cadena ligera como se muestra en la SEC ID N°: 8 y una cadena pesada como se muestra en la SEC ID N°: 9.

También se proporcionan anticuerpos biespecíficos que pueden competir con cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento por la unión del TFPI. Por ejemplo, tales anticuerpos biespecíficos pueden unirse a uno o más epítopos descritos anteriormente.

El anticuerpo puede ser específico de especie o puede presentar reacción cruzada con varias especies. En algunas realizaciones, el anticuerpo puede reaccionar de forma específica o cruzada con el TFPI de ser humano, ratón, rata, cobaya, conejo, mono, cerdo, perro, gato o de otras especies de mamíferos.

El anticuerpo puede ser de cualquiera de las diversas clases de anticuerpos, tales como, sin limitación, un anticuerpo de lgG1 , de lgG2, de lgG3, de lgG4, de IgM, de lgA1 , de lgA2, de IgA de secreción, de IgD y de IgE. Ácidos nucleicos, vectores y células huésped Aunque se proporcionan secuencias de aminoácidos de los anticuerpos monoclonales, se contempla que las secuencias de ácidos nucleicos puedan diseñarse para codificar cualquiera de estos anticuerpos monoclonales. Tales polinucleótidos pueden codificar una cadena ligera o una cadena pesada del anticuerpo anti-TFPI. En algunas realizaciones, tales polinucleótidos pueden codificar tanto la cadena ligera como la cadena pesada del anticuerpo anti-TFPI separadas por un enlace degradable. Además, los anticuerpos mencionados anteriormente pueden producirse usando vectores de expresión que comprenden las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican los anticuerpos monoclonales y células huésped que comprenden tales vectores.

Procedimientos para preparar anticuerpos frente al TFPI El anticuerpo monoclonal puede producirse de manera recombinante expresando una secuencia de nucleótidos que codifica las regiones variables del anticuerpo monoclonal de acuerdo con las realizaciones de la invención en una célula huésped. Con la ayuda de un vector de expresión, puede transfectarse un ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos y expresarse en una célula huésped adecuada para la producción. En consecuencia, también se proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal que se une al TFPI humano que comprende: (a) transfectar una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo monoclonal de la invención en una célula huésped, (b) cultivar la célula huésped con el fin de expresar el anticuerpo monoclonal en la célula huésped y, opcionalmente (c) aislar y purificar el anticuerpo monoclonal producido, en el que la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo monoclonal de la presente invención.

En un ejemplo, para expresar los anticuerpos, o sus fragmentos de anticuerpo, se insertan ADN que codifican cadenas ligeras y pesadas parciales o de longitud completa obtenidos mediante técnicas convencionales de biología molecular en vectores de expresión de manera que los genes están enlazados de manera funcional a secuencias de control de la transcripción y la traducción. En este contexto, se pretende que la expresión "enlazado de manera funcional" signifique que el gen de un anticuerpo está ligado en un vector de manera que las secuencias de control transcripcional y traduccional dentro del vector realizan su función prevista de regular la transcripción y la traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se escogen para que sean compatibles con la célula huésped de expresión usad.a. El gen de cadena ligera del anticuerpo y el gen de cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en vectores separados o, más normalmente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante procedimientos convencionales (por ejemplo, unión de sitios de restricción complementarios del fragmento génico del anticuerpo y el vector o unión de extremos romos si no existen sitios de restricción presentes). Las regiones variables de la cadena ligera y pesada de los anticuerpos descritos en el presente documento pueden usarse para crear genes de anticuerpos de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpos insertándolas en los vectores de expresión que ya codifican regiones constantes de cadena pesada y constantes de cadena ligera del isotipo deseado de manera que el segmento VH se une de manera funcional al/a los segmento(s) CH dentro del vector y el segmento VL se une de manera funcional al segmento CL dentro del vector. De manera adicional o alternativa, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo desde una célula huésped. El gen de cadena de anticuerpo puede clonarse en el vector de manera que el péptido señal se une en fase al extremo amino del gen de cadena de anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína que no es una inmunoglobulina).

Además de los genes que codifican cadenas de anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes de la invención portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los de genes de cadena de anticuerpo en una célula huésped. Se pretende que el término "secuencia reguladora" incluya promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o la traducción de los genes de cadena de anticuerpo. Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que se quiere transformar, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los ejemplos de secuencias reguladoras para expresión en células huésped de mamíferos incluyen elementos víricos que dirigen niveles altos de expresión de proteínas en células de mamíferos, tales como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV), virus del simio 40 (SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma. De forma alternativa, pueden usarse secuencias reguladoras no víricas, tales como» el promotor de la ubiquitina o el promotor de la ß-globina.

Además de los genes de cadena de anticuerpos y las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células huésped (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionabas. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células huésped en las que se ha introducido el vector (véanse por ejemplo, las patentes de EE.UU. N° 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas por Axel y col.). Por ejemplo, normalmente, el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en la que se ha introducido el vector. Los ejemplos de genes marcadores seleccionabas incluyen ;el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células huésped dhfr- con selección/amplificación con metotrexato) y el gen neo (para selección con G418).

Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, el/los vector(es) de expresión que codifica(n) las cadenas pesada y ligera se transfecta(n) en una célula huésped mediante técnicas convencionales. Se pretende que las diversas formas del término "transfección" engloben una amplia variedad de técnicas usadas comúnmente para la introducción de ADN exógeno en una célula huésped procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano y similares. Aunque es teóricamente posible expresar los. anticuerpos de la invención en células huésped procariotas o eucariotas, la expresión de anticuerpos en células eucariotas, y más preferentemente en células huésped de mamíferos, es lo más preferido debido a que es más probable que dichas células eucariotas, y en particular las células de mamíferos, ensamblen y secreten un anticuerpo plegado de manera apropiada e inmunológicamente activo.

Los ejemplos de células huésped de mamíferos adecuadas para expresar los anticuerpos recombinantes incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO) (incluyendo células CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621 ), células de mieloma NSO, células COS, células HKB11 y células SP2. Cuando los vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpo se introducen en células huésped de mamíferos, se producen los anticuerpos cultivando las células huésped durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o la secreción del anticuerpo al medio de cultivo en el que se hacen crecer las células huésped. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo usando procedimientos de purificación de proteínas convencionales, tales como ultrafiltración, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio iónico y centrifugación.

Uso de secuencias de anticuerpo parciales para expresar anticuerpos intactos De manera predominante, los anticuerpos interaccionan con antígenos objetivo a través de restos de aminoácido que se sitúan en las seis CDR de las cadenas pesada y ligera. Por este motivo, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDR son más diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias de fuera de las CDR. Debido a que las secuencias CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de los anticuerpos naturales específicos construyendo vectores de expresión que incluyen secuencias CDR del anticuerpo natural específico insertadas en secuencias estructurales de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (véanse, por ejemplo, Riechmann, L. y col., 1998, Nature 332:323-327; Jones, P. y col., 1986, Nature 321 :522-525; and Quéen, C. y col., 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 86: 0029-10033). Tales secuencias estructurales pueden obtenerse a partir de bases de datos de ADN públicas que incluyen secuencias génicas de anticuerpos de línea germinal. Estas secuencias de línea germinal diferirán de las secuencias génicas de anticuerpo maduras debido a que no incluirán genes variables ensamblados completamente, que se forman mediante la unión de V(D)J durante la maduración de los linfocitos B. No es necesario obtener la secuencia de ADN completa de un anticuerpo en particular con el fin de recrear un anticuerpo recombinante intacto que tenga propiedades de unión similares a las del anticuerpo original (véase el documento WO 99/45962). Normalmente, la parte de cadena pesada o ligera que abarca las regiones CDR es suficiente para este propósito. La secuencia parcial se usa para determinar qué segmentos génicos de unión y variables de línea germinal contribuyeron a los genes variables del anticuerpo recombinante. La secuencia de línea germinal se usa después para rellenar las porciones que faltan de las regiones variables. Las secuencias líder de la cadena pesada y ligera se escinden durante la maduración de la proteína y no contribuyen a las propiedades del anticuerpo final. Por este motivo, es necesario el usó de la secuencia líder de línea germinal correspondiente para las construcciones de expresión. Para añadir secuencias ausentes, pueden combinarse secuencias de ADNc clonadas con oligonucleótidos sintéticos por unión o amplificación por PCR. De forma alternativa, puede sintetizarse la región variable entera como un conjunto de oligonucleótidos cortos, solapantes, y combinarse mediante amplificación por PCR para crear un clon de la región variable totalmente sintético. Este procedimiento tiene determinadas ventajas tales como la eliminación o la inclusión de sitios de restricción particulares o la optimización de codones particulares.

Las secuencias de nucleótidos de transcritos de cadena pesada y ligera se usan para diseñar un conjunto solapante de oligonucleótidos sintéticos para crear secuencias V sintéticas con capacidades de codificación de aminoácidos idénticas a las de las secuencias naturales. Las secuencias de cadena pesada y ligera sintéticas pueden diferir de las secuencias naturales de tres maneras: se interrumpen las series de bases de nucleótidos repetidas para facilitar la síntesis de oligonucleótidos y la amplificación por PCR; se incorporan sitios de iniciación de la traducción óptimos de acuerdo con las reglas de Kozak (Kozak, 1991 , J. Biol. Chem. 266:19867-19870); y se modifican por introducción de sitios de restricción de endonucleasa corriente arriba de los sitios de iniciación de la traducción.

Para las regiones variables de cadena tanto pesada como ligera, las secuencias codificantes optimizadas, y las no codificantes correspondientes, se dividen en secciones de 30-50 nucleótidos aproximadamente a la mitad del oligonucleótido no codificante correspondiente. Por tanto, para cada cadena, los bligonucleótidos pueden ensamblarse en conjuntos de doble cadena solapantes que abarcan segmentos de 150-400 nucleótidos. Las combinaciones se usan después como plantillas para producir productos de amplificación por PCR de 150-400 nucleótidos. Normalmente, un conjunto de oligonucleótidos de una única región variable se dividirá en dos conjuntos que se amplifican por separado para generar dos productos de PCR solapantes. Estos productos solapantes se combinan después mediante amplificación por PCR para formar la región variable completa. También puede ser deseable incluir un fragmento solapante de la región constante de cadena pesada o ligera en la amplificación por PCR para generar fragmentos que puedan clonarse fácilmente en las construcciones de vectores de expresión.

Las regiones variables de cadena pesada y ligera reconstruidas se combinan después con secuencias clonadas de promotor, de iniciación de la traducción, de región constante, no traducidas en 3', de poliadenilación y de terminación de la transcripción para formar construcciones de vectores de expresión. Las construcciones de expresión de cadena pesada y ligera pueden combinarse en un solo vector, cotransfectarse, transfectarse en serie o transfectarse por separado en células huésped que se fusionan después para formar una célula huésped que exprese ambas cadenas.

Por tanto, en otro aspecto, las características estructurales de un anticuerpo anti-TFPI humano se usan para crear anticuerpos anti-TFPI humanos estructu raímente relacionados que mantienen la función de unión al TFPI. Más específicamente, una o más CDR de las regiones de cadena pesada y ligera identificadas específicamente de los anticuerpos monoclonales de la invención pueden combinarse de manera recombinante con regiones estructurales y CDR humanas conocidas para crear anticuerpos anti-TFPI humanos modificados de manera recombinante, adicionales, de la invención.

Composiciones farmacéuticas También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades terapéuticamente eficaces de anticuerpo monoclonal anti-TFPI y un vehículo farmacéuticamente aceptable. "Vehículo farmacéuticamente aceptable" es una sustancia que puede añadirse al principio activo para ayudar a formular o estabilizar la preparación y no provoca efectos toxicológicos adversos significativos al paciente. Los ejemplos de tales vehículos son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen agua, azúcares tales como maltosa o sacarosa, albúmina, sales tales como cloruro de sodio, etc. Otros vehículos se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences por E. W. Martin. Tales composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo monoclonal anti-TFPI. En algunas realizaciones, tales composiciones pueden comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más anticuerpos monoclonales anti-TFPI. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden comprende un anticuerpo que se une específicamente al dominio de Kunitz 1 como se describe anteriormente y un anticuerpo que se une específicamente al dominio de Kunitz 1 y 2 como se describe anteriormente.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen dispersiones o soluciones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de dispersiones o soluciones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la técnica. Preferentemente, la composición se formula para inyección parenteral. La composición puede formularse como una solución, una microemulsión, un liposoma u otra estructura ordenada adecuada para concentraciones de fármaco elevadas. El vehículo puede ser un medio disolvente o de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de ellos. En algunos casos, incluirá en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio.

Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad necesaria en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según convenga, seguido de microfiltración esterilizante. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y el resto de ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, algunos procedimientos de preparación son el secado al vacío y el secado por congelación (liofilización) que proporcionan un polvo del principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una de sus soluciones previamente filtrada de forma estéril.

Usos farmacéuticos El anticuerpo monoclonal puede usarse con fines terapéuticos para tratar deficiencias o defectos genéticos y adquiridos en la coagulación. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales de las realizaciones descritas anteriormente pueden usarse para bloquear la interacción del TFPI con el FXa, o para evitar la inhibición dependiente del TFPI de la actividad del TF/FVIIa. Adicionalmente, el anticuerpo monoclonal puede usarse también para reestablecer la generación del FXa dirigida por el TF/Vlla para sortear la insuficiencia de la amplificación del FXa dependiente del FVIII o del FIX.

Los anticuerpos monoclonales tienen un uso terapéutico en el tratamiento de trastornos de la hemostasis tales como la trombocitopenia, los trastornos plaquetarios y los trastornos de hemorragia (por ejemplo, la hemofilia a, la hemofilia B y la hemofilia C). Tales trastornos pueden tratarse mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal anti-TFPI a un paciente que lo necesita. Los anticuerpos monoclonales también tienen un uso terapéutico en el tratamiento de hemorragias incontroladas en indicaciones tales como el ictus traumático o hemorrágico. Por tanto, también se proporciona un procedimiento para acortar el tiempo de hemorragia que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal anti-TFPI de la invención a un paciente que lo necesita.

Los anticuerpos pueden usarse como tratamiento único o en combinación con otros tratamientos para tratar un trastorno hemostático. Por ejemplo, se cree que la coadministración de uno o más anticuerpos de la invención con un factor de coagulación tal como el factor VI la, el factor VIII o el factor IX es útil para trata la hemofilia. En una realización, se proporciona un procedimiento para tratar deficiencias o defectos genéticos y adquiridos en la coagulación que comprende administrar (a) una primera cantidad de un anticuerpo monoclonal que se une al inhibidor de la ruta del factor tisular humano y (b) una segunda cantidad del factor VIII o del factor IX, en el que dichas primera y segunda cantidades juntas son eficaces para tratar dichas deficiencias o defectos. En otra realización, se proporciona un procedimiento para tratar deficiencias o defectos genéticos y adquiridos en la coagulación que comprende administrar (a) una primera cantidad de un anticuerpo monoclonal qué se une al inhibidor de la ruta del factor tisular humano y (b) una segunda cantidad del factor VIII o del factor IX, en el que dichas primera y segunda cantidades juntas son eficaces para tratar dichas deficiencias o defectos y, además, en el que no se coadministra el factor VII. La invención también incluye una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la combinación de un anticuerpo monoclonal de la invención y factor VIII o factor IX, en la que la composición no contiene factor VII. "Factor Vil" incluye el factor VII y el factor Vlla. Es probable que estos tratamientos combinados reduzcan la frecuencia de infusión del factor de coagulación necesaria. Por coadministración o tratamiento combinado se entiende administración de dos fármacos terapéuticos formulados cada uno por separado o formulados juntos en una composición y, cuando se formulan por separado, administrados aproximadamente al mismo tiempo o en momentos diferentes, pero a lo largo del mismo periodo de tratamiento.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por vía parenteral a sujetos que padecen hemofilia A o B a una dosificación o frecuencia que pueden variar con la gravedad del episodio de hemorragia o, en el caso de un tratamiento profiláctico, pueden variar con la gravedad de la deficiencia de coagulación del paciente.

Las composiciones pueden administrarse a pacientes que lo necesiten* como una embolada o mediante infusión continua. Por ejemplo, una administración de embolada de un anticuerpo de la invención presente como un fragmento Fab puede ser en una cantidad de desde 0,0025 hasta 100 mg/kg de peso corporal, 0,025 a 0,25 mg/kg, 0,010 a 0,10 mg/kg o 0,10-0,50 mg/kg. Para la infusión continua, un anticuerpo de la invención presente como fragmento Fab puede administrarse a de 0,001 a 100 mg/kg de peso corporal/minuto, 0,0125 a 1 ,25 mg/kg/min, 0,010 a 0,75 mg/kg/min, 0,010 a 1 ,0 mg/kg/min o 0,10-0,50 mg/kg/min, durante un periodo de 1-24 horas, 1-12 horas, 2-12 horas, 6-12 horas, 2-8 horas o 1-2 horas. Para la administración de un anticuerpo de la invención presente como un anticuerpo de longitud completa (con regiones constantes completas), las cantidades de dosificación pueden ser de aproximadamente 1-10 mg/kg de peso corporal, 2-8 mg/kg o 5-6 mg/kg. Normalmente, tales anticuerpos de longitud completa se administrarían por infusión prolongada durante un periodo de treinta minutos a tres horas. La frecuencia de la administración dependería de la gravedad de la afección. La frecuencia podría variar desde tres veces por semana hasta una vez cada dos o tres semanas.

Adicionalmente, las composiciones pueden administrarse a los pacientes por inyección subcutánea. Por ejemplo, puede administrarse una dosis de 10 a 100 mg de anticuerpo anti-TFPI a pacientes por inyección subcutánea semanalmente, bisemanalmente, o mensualmente.

Tal como se usa en el presente documento, "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un anticuerpo monoclonal anti-TFPI o de una combinación de tal anticuerpo y factor VIII o factor IX que se necesita para incrementar efectivamente el tiempo de coagulación in vivo o, de otro modo, provocar un beneficio medible in vivo a un paciente que lo necesita. La cantidad exacta dependerá de numerosos factores, incluyendo, pero sin limitarse a, los componentes y las características físicas de la composición terapéutica, la población de pacientes a la que se destina, las consideraciones del paciente individual y similares, y puede determinarse fácilmente por un experto en la técnica.

Ejemplos Ejemplo 1. Expresión y purificación de TFPI recombinante (dominio de Kunitz 2) de E. coli.

Sistema de expresión Se utilizó el vector de destino (de acuerdo con la nomenclatura Gateway), denominado pD Eco5 N. pD Eco5 N se basa en el pET-16 b (Novagen), y adicionalmente codifica una marca de Hisio y NusA así como un cásete de clonación Gateway para expresión de la proteína de fusión que consiste en HiSi0/NusA y la proteína de interés.

Se clonó una construcción de TFPI que codifica un sitio de escisión de trombina fusionado al extremo N terminal del dominio de Kunitz 2 (Lys93 a Phe154, referencia Uniprot 10646) y los sitios de unión de Gateway (n° attB1-5, n° attB2-3, Invitrogen) en el vector pD Eco5 N dando como resultado el vector de expresión denominado pD Eco5 N TFPI KD2. Se utilizó la cepa de expresión BL21 DE3 (Novagen).

Secuencia de aminoácidos de proteína de fusión expresada usando pD Eco5 N TFPI KD2, 600 AA MGHHHHHHHH HHSSGHIEGR HMN EILAVV EAVSNEKALP REKIFEALES ALATATKKKY EQEIDVRVQI DRKSGDFDTF RRWLWDEVT QPTKEITLEA ARYEDESLNL GDYVEDQIES VTFDRITTQT A QVIVQKVR EAERA WDQ FREHEGEIIT GWK VNRDN ISLDLGNNAE AVILREDMLP RENFRPGDRV RGVLYSVRPE ARGAQLFVTR SKPEMLIELF RIEVPEIGEE VIEIKAAARD PGSRAKIAV TNDKRIDPVG ACVGMRGARV- QAVSTELGGE RIDIVLWDDN PAQFVINAMA PADVASIWD EDKHTMDIAV EAGNLAQAIG RNGQNVRLAS QLSGWELNVM TVDDLQAKHQ AEAHAAIDTF TKYLDIDEDF ATVLVEEGFS TLEELAYVPM KELLEIEGLD EPTVEALRER AKNALATIAQ AQEESLGDNK PADDLLNLEG VDRDLAFKLA ARGVCTLEDL AEQGIDDLAD IEGLTDE AG ALIMAARNIC WFGDEATSGS GLETSLYKKA GSLVPRGSKP DFCFLEEDPG ICRGYITRYF YNNQT QCER FKYGGCLGNM NNFETLEECK NICEDGPNGF Componentes de secuencia Marca de His 10 : MGHHHHHHHH HH Marca de NusA: SSGHIEGR HMNKEILAVV EAVSNEKALP REKIFEALES ALATATKKKY EQEIDVRVQI DRKSGDFDTF RRWLWDEVT QPTKEITLEA ARYEDESLNL GDYVEDQIES VTFDRITTQT AKQVIVQKVR EAERAMVVDQ FREHEGEIIT GWKKVNRDN ISLDLGNNAE AVILREDMLP RENFRPGDRV RGVLYSVRPE ARGAQLFVTR SKPEMLIELF RIEVPEIGEE VIEIKAAARD PGSRAKIAVK TNDKRIDPVG ACVGMRGARV QAVSTELGGE RIDIVLWDDN PAQFVINAMA PADVASI D EDKHTMDIAV EAGNLAQAIG RNGQNVRLAS QLSGWELNVM TVDDLQAKHQ AEAHAAIDTF TKYLDIDEDF ATVLVEEGFS TLEELAYVPM KELLEIEGLD , EPTVEALRER AKNALATIAQ AQEESLGDNK PADDLLNLEG VDRDLAFKLA ARGVCTLEDL AEQGIDDLAD IEGLTDEKAG ALI AARNIC FGDEA Engarce/sitios de restricción de endonuleasa traducidos: TSGS GLE Sitio att traducido: TSLYKKA GS Sitio de trombina:- LVPRGS TFPI Kunitz 2 GSLVPRGSKP DFCFLEEDPG ICRGYITRYF YNNQTKQCER FKYGGCLGNM NNFETLEECK NICEDGPNGF Expresión Se hizo crecer una cepa de Bí_21 DE3 transformada con pD Eco5 N N° 209 como un precultivo en 2x 50 mi de medio LB con 200 g/ml de ampicilina durante 14 h a 37 °C con una velocidad de agitación de 180 rpm. A continuación, se inocularon ocho matraces agitadores con 400 mi de medio Circlegrow (Q-Biogene), cada uno con 8 mi de precultivo y se incubaron a 37 °C, con una velocidad de agitación de 180 rpm. A una densidad de cultivo de DO600, se añadió IPTG (concentración final 100 mM) para inducción génica y adicionalmente se cultivó a 17 °C durante 24 h con 180 rpm. Se sedimentó E. coli por centrifugación (3000 g, 10 min) y se almacenó a -80 °C. Purificación Se resuspendió la masa de E. coli sedimentada a partir de 3,2 I de cultivo en 200 mi de tampón de lisis (Tris-HCI 50 mM pH 8,0, NaCI 300 mM, 10% (p/p) de glicerol, imidazol 40 mM, cóctel de inhibidor de proteasas Complete libre de EDTA (Roche)), homogeneizado en un dispositivo de alta presión (Microfluidics) y después se centrifugó el lisado (100.000 g, 60 min, 4 °C). Se realizaron varias etapas de purificación usando un sistema Ákta Explorer. Se aplicó la muestra concentrada en una etapa de cromatografía IMAC inicial a dos unidades de 5 mi enlazadas de matriz Hi-Trap-Sepharose HP (GE). Se realizó el equilibrado, la unión a proteína de fusión y el lavado de la matriz Hi-Trap-Sepharose HP usando el tampón A (Tris-HCI 50 mM pH 8,0, NaCI 300 mM, imidazol 40 mM). Para la elución de la proteína de fusión NusA-TFPI, se usó un gradiente lineal de imidazol de desde 40 hasta 500 mM en un tampón B (Tris-HCI 50 mM pH 8,0, NaCI 150 mM). Se combinaron y se concentraron las fracciones de elución (en un factor de 6-7 usando un dispositivo de ultrafiltración Amicon) y se intercambió el tampón a Tris HCI pH 8,0. A la muestra concentrada (6-7 mi) se le aplicó adicionalmente cromatografía de exclusión por tamaño usando Sephacryl-100 (XK26/74) en Tris HCI pH 8,0. Se combinaron las fracciones del pico principal que contenían la proteína de fusión, se concentraron por ultrafiltración (Amicon) hasta un volumen de 5 mi. Se añadió trombina (HTI) a la muestra (proporción enzima: proteína de fusión, 1 :50 p/p), se incubó durante 5 h a 21 °C y finalmente se detuvo la reacción por PMSF (concentración final 1 mM). Posteriormente, se realizó una segunda etapa de cromatografía de exclusión por tamaño (Sephacryl-100 (XK26/74) en Tris HCI pH 8.0) y se monitorizaron las fracciones de pico por PAGE. Se recogieron las fracciones que contenían el dominio de Kunitz 2 del TFPI monomérico libre y se concentraron (Amicon), proporcionando aproximadamente 4 mg de producto a partir de 3,2 I de cultivo de E. coli.

Ejemplo 2. Producción de un anticuerpo monoclonal recombinante Fab A a TFPI, expresión en E. coli y su purificación Expresión Se coexpresó el Fab A usando el vector de expresión pET28a y la cepa de E. coli BL21 Star DE3. Se fusionaron las regiones de cadena ligera y pesada codificadas en el vector de expresión cada una en su extremo N terminal a una secuencia señal periplásmica. La región de cadena pesada también codificó en su extremo C terminal una marca de His6 para la purificación del Fab. Se usó la cepa de E. coli transformada crecida en el medio de expresión durante la noche TB-Instant para la autoinducción de la expresión de proteína recombinante (N° 71491 , Novagen). En resumen, se hicieron crecer 10 mi de cultivo de E. coli transformado (en un tubo Falcon de 50 mi) como un precultivo en medio LB con 30 pg/ml de kanamicina durante 14 h a 37 °C agitado con 180 rpm. Posteriormente, se inocularon cuatro matraces Erlenmeyer con 500 mi de medio de expresión durante la noche de TB-Instant cada uno con 2 mi del precultivo y se incubaron durante 24 h a 30 °C a 180 rpm. Se centrifugaron los cultivos a 10.000 g a 10 °C durante 30 min y el sobrenadante que contenía el Fab se usó inmediatamente para la purificación de producto adicional o se almacenó a -20 o -80 °C.

De forma alternativa, se expresó un Fab usando el vector de expresión pET28a y la cepa de E. coli BL21 Star DE3 en un biorreactor de 10 I (Sartorius). Se hizo crecer un cultivo de E. coli transformado de 500 mi en medio LB con 30 g/ml de kanamicina durante 17 h a 37 °C, se agitó a 165 rpm y a continuación se usó para inocular un biorreactor agitado con 10 I de medio de autoinducción. El medio de autoinducción contenía los siguientes componentes, por litro: 12 g de triptona, 24 g de extracto de levadura, 9,9 g de glicerol (87 %), 12,54 g de K2HP04, 2.31 g de KH2P04, 0.25 g de MgS04 x 7 H20, 1 g de glucosa, 2,5 g de lactosa, 30 mg de kanamicina. Se realizó el cultivo con el biorreactor durante 24 h (a 30 °C con 350 -máx. 800 rpm) y posteriormente se cultivó el sobrenadante del cultivo retirando la biomasa por centrifugación en una centrífuga (Heraeus).

Purificación Se purificó el Fab usando un procedimiento de cromatografía en dos etapas con un dispositivo Ákta Explorer 10s. Se aplicó un módulo de fibra hueca (umbral de corte de 10 kDa) para concentrar 1 I del sobrenadante hasta un volumen final de 100 mi y para equilibrar la composición del tampón con el tampón A (Na-fosfato 50 mM pH 8,0, NaCI 300 mM, Imidazol 10 mM). En una etapa de cromatografía de IMAC inicial con un sistema Ákta Explorer, se aplicó la muestra concentrada a 5 mi de matriz de superflujo Ni-NTA (Qiagen). Se realizó el equilibrado, la unión de muestra y el lavado de la matriz Ni-NTA usando el tampón A (se realizó la unión a 21 °C, las demás etapas de cromatografía a 4 °C). Para elución del Fab, se usó un gradiente lineal de imidazol de desde 10 hasta 250 mM en el tampón A. Se combinaron las fracciones del único pico de elución (volumen total de 60 mi) y se concentró a 10 mi por ultrafiltración y se ajustó el tampón a PBS pH 7,4 usando una columna de desalación Hi-Prep26/10. Posteriormente, se incubaron 2 mi de una matriz de anticuerpo de cadena ligera anti-kappa (medio de afinidad seleccionado Kappa, 0833.10 de BAC), equilibrado con PBS, con el eluato IMAC concentrado durante 1 h a temperatura ambiente bajo agitación. Se transfirió la matriz con la muestra unida a una columna de cromatografía y se lavó con PBS. Se eluyó la muestra de Fab con 2 mi de glicina pH 2,0, se neutralizó con HEPES 1 M pH 7,5 y se ajustó con tampón PBS con una columna de desalación PD10 (GE, 17-0851-01).

Cuando se expresó el Fab en E. coli usando un biorreactor de 10 I (Sartorius) se usó el siguiente procedimiento de purificación. Se filtró secuencialmente el sobrenadante del cultivo centrifugado a través de dos módulos de filtro desechables (GE, KMP-HC-9204TT; KGF-A-0504TT) con un tamaño de poro de 5 y 0,2 pm. Se aplicó un módulo de fibra hueca (umbral de corte de 10 kDa) para concentrar el sobrenadante del cultivo aclarado hasta un volumen final de 1500 mi y para ajustar la composición del tampón al tampón A. Se añadieron 25 mi de matriz de superflujo Ni-NTA (Qiagen, equilibrado en tampón A) a la muestra concentrada y se incubó durante 1 ,5 h a 21 °C. Se transfirió la matriz con la muestra unida a una columna de cromatografía vacía (25 x 125 mm), conectada a un dispositivo de cromatografía Ákta Explorer y se lavó con el tampón A (aprox. 250 mi). Para elución del Fab, se aplicaron dos gradientes de etapa posteriores con un 5% (30 mi) y un 10 % (35 mi) del tampón B, seguido de un gradiente de elución lineal de hasta un 100% de tampón B. Posteriormente, se trataron las fracciones de elución combinadas (72 mi) como sigue: se concentraron con un dispositivo de ultrafiltración de centrifugación (corte de 10 kDa, Amicon) hasta un volumen final de 20 mi, aplicación en tres porciones a una columna de desalación (GE HiPrep, 26/10) hasta que se ajustó el tampón a PBS pH 7,4, y concentración adicional en un dispositivo de ultrafiltración de centrifugación (Amicon) hasta un volumen final de 40 mi. Se incubó la muestra concentrada con 5 mi de matriz de anticuerpo de cadena ligera anti-kappa (medio de afinidad seleccionado Kappa, BAC, equilibrado con PBS) durante 1 h a temperatura ambiente bajo agitación. Se transfirió la matriz de Sepharose con la muestra unida a una columna de cromatografía y se trató con la siguiente secuencia de etapas de lavado, 4 veces con 15 mi de PBS; dos veces con 5 mi de tampón de lavado (Na-fosfato 100 mM pH 6,0, 100 mi de NaCI, arginina 500 mM). La etapa de elución consistió en la aplicación 3 veces de 5 mi de tampón de glicina HCI 100 mM pH 3,0. Se neutralizó inmediatamente el eluato con Tris-HCI 1 M pH 8,0 y se retiraron los precipitados formados por centrifugación (10 min, 3,200 g). Se concentró la muestra por ultrafiltración (Amicon) y se aplicó a una columna 16/60 de grado prep Superdex-75 en un sistema de cromatografía Ákta Explorer con tampón TBS. Se analizaron las fracciones de pico por PAGE y se combinaron las fracciones que representaban una cadena pesada y ligera de Fab en una proporción molar 1.1 y se concentró de nuevo por ultrafiltración (Amicon) hasta un volumen final de 1 mi. Se aislaron aproximadamente 4 mg de Fab A de 10 I de sobrenadante del cultivo de £ coli.

Se usó una cromatografía de exclusión por tamaño analítica (sistema Ákta Micro, columna S75 5/150, Tris-HC1 100 mM, pH 7,5) para demostrar la formación del complejo Fab A TFPI KD2. Por lo tanto, se analizaron por separado Fab A, TFPI KD2 y la mezcla de Fab A más TFPI KD2 (figura 1).

Ejemplo 3. Cristalización y determinación de estructura por rayos X del complejo TFPI-Fab A Cristalización Se hicieron crecer cocristales de dominio de Kunitz 2 del TFPI y del anticuerpo monoclonal Fab A a 20 °C usando el procedimiento de gota pesada. Se concentró el complejo de proteína hasta 9 mg/ml y se cristalizó mezclando volúmenes iguales de solución de proteína y solución de pocilio (.15% de PEG8000, Tris HCI pH 7,5) como precipitante. Los cristales aparecieron después de un día.

Recogida y procesado de datos Se ultracongelaron los cristales en nitrógeno líquido en un 30% de glicerol en tampón de cristalización para su crioprotección. Se recogieron los datos en línea de haz BL14.1 , sincrotrón BESSY (Berlín) en un detector MAR CCD. Se indéxaron e integraron los datos con XDS (W. Kabsch (2010) Acta Cryst. D66, 125-132) o IMOSFLM (The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography (1994) Acta Cryst. D50, 760-763; A.G.W. Leslie, (1992), Joint CCP4 + ESF-EAMCB. Boletín en Protein Crystallography, N° 26), se prepararon para su escalado con POINTLESS (P.R. Evans, (2005) Acta Cryst. D62, 72-82), y se escalaron con SCALA (P.R. Evans, (2005) Acta Cryst. D62, 72-82). El cristal presentó difracción de hasta 2,6 A y poseía un grupo espacial ?2t2!2? con constantes celulares a=65,7, 5=114,7, c=151 ,9; a=ß=?=90°, y dos complejos TFPI-Fab en la unidad asimétrica.

Determinación y refinado de la estructura Se resolvió la coestructura del dominio de Kunitz 2 del TFPI y del anticuerpo monoclonal Fab por reemplazo molecular usando PHASER (A.J. McCoy y col. (2007) J. Appl. Cryst. 40, 658-674) y estructuras de rayos X publicadas del dominio de Kunitz 2 del TFPI (código PDB 1tfx) y un fragmento Fab (código PDB 3mxw) como modelos de búsqueda. Antes del reemplazo molecular, se modificó la secuencia del modelo de Fab con CHAINSAW (N. Stein, (2008) J. Appl. Cryst. 41 , 641 - 643). Las rondas iterativas de la construcción del modelo con COOT (P. Emsiey y col. (2010) Acta Cryst. D66:486-501) y el refinado de probabilidad máximo usando REFMAC5.5 (G.N. Murshudov y col. (1997) Acta Cryst. D53, 240-255) completaron el modelo. Las regiones Phe A 31 - Asn A 35, Pro B 9, Lys M 139 - Ser M 142 y Asp140 - Phe154 of KD2 mostraron una densidad de electrones débil y no se incluyeron en el modelo. El conjunto de datos y las estadísticas de refinado se resumen en la tabla 1.

Tabla 1. Conjunto de datos y estadísticas de refinado para el complejo TFPI- Fab A.

Longitud de onda 0,9184 A Resolución (estructura más alta) 46-2,6 (2,7-2,6) A Reflexiones (observada/única) 176619 / 36076 Compleción8 99,9% (100,0%) ?/sß 9,8 (2,5) R a.O reunión 0,115 (0,70) Grupo espacial P2i2,2, Parámetros de celda unidad a 65,7 A b 114,7 A c 151 ,9 A Rcrist C 0,25 R r^libre 0 0,32 Factor de temperatura de Wilson 23,87 A2 Longitud de enlace de RMSD 0,009 A Ángulos de enlace de RMSD 1 ,4° Átomos de proteína 7580 Moléculas de agua 108 a Los valores entre paréntesis son para la estructura de resolución alta.

" Runion =?hk1 |lhk1 - <lhki>| /?hk1 <lhki> donde lhk1 es la intensidad de reflexión hk1 y <lhki> es la intensidad promedio de observaciones múltiples. c Rcnst = ? |Fo s- oaiol / ? Fobs donde Fobs y Fcaic son las amplitudes del factor de estructura observada y calculada, respectivamente. 0 5% de conjunto de prueba e RMSD, desviación de la raíz cuadrática media del conjunto de parámetros para estereoquímica ideal Ejemplo 4. Mapeo de epítopos basado en la estructura de rayos X de un Fab A El complejo de TFPI-Fab A (figura 2) cristalizó como dos copias del complejo por unidad asimétrica. Las cadenas principales de los compuestos se superponen con una desviación de la raíz cuadrática media (root mean square deviation, RMSD) de 0,7 A con cada Fab unido al epitopo de TFPI asociado. Se analizaron los restos de TFPI en contacto con Fab A (el epitopo) y la superficie oculta respectiva con el programa CCP4 AREAIMOL (P.J. Briggs (2000) CCP4 boletín N° 38). Los restos con una superficie oculta de 5 A2 de mínimo o con una superficie oculta de más del 50 % se han considerado en contacto (tabla 2). ' Se analizaron los restos de Fab A en contacto con TFPI (el parátopo) y la superficie oculta respectiva con AREAIMOL. Los restos con una superficie oculta de 5 A2 de mínimo o con una superficie oculta de más del 50 % se han considerado en contacto (tabla 3).

Tabla 2: Restos de TFPI en contacto con Fab A. Las cadenas C y D corresponden al TFPI del complejo respectivo en la unidad asimétrica.

Tabla 3: restos de Fab A en contacto con TFPI. Las cadenas A, B y las cadenas L, M representan las cadenas ligera y pesada de Fab A del complejo respectivo en la unidad asimétrica.

El epítopo no lineal reconocido por el Fab A se define por las regiones GlulOO - Arg109 y Lys126, Gly128 - Asn133. El parátopo en el Fab A incluye los restos de cadena ligera (le) lc_Tyr37, lc_Tyr96, lc_Asp97, lc_Ser98, lc_Tyr99, y lc_Leu101 y restos de cadena pesada (he) hc_Asn32, hc_Ser33, hc_Ala35, he Ile52, hc_Tyr54, hc_Arg56, hc_Lys58, hc_Tyr60, hc_Arg62, hc_Trp102, hc_Ser104, hc_Asp105 y hc_Trp108. Parece que CDR-L3, CDR-H2 y CDR-H3 son los principales sitios de interacción, basándose en el número de contactos.

El epítopo consiste en dos bucles enlazados por un puente disulfuro entre Cys106 y Cys130 (figura 3). El puente disulfuro se coloca frente a hc_Trp108 of CDR-H3, mientras que Ile105 y Leu131 adyacentes se ocultan en una hendidura hidrófoba creada por hc_Ala35, hc_lle52, hc_Tyr54 (CDR-H2), hc_Trp102 (CDR-H3) y lc_Tyr96, lc_Ser98, lc_Tyr99, lc_Leu101 (CDR-L3). Basándose en el número de contactos, Ile105 y Leu131 son restos de epítopos clave en el contacto hidrófobo con CDR-L3, CDR-H2 y CDR-H3.

La región de TFPI Glu101 - Ile105 interacciona con CDR-H2. La interfase se caracteriza fuertemente por hc_Tyr54, hc_Tyr60 y hc_Arg62. Hc_Tyr54 muestra interacciones polares con la cadena lateral de Asp102. Hc_Tyr60 muestra interacciones polares con el oxígeno del carbonilo de la cadena principal de Glu101 y hc_Arg62 con la cadena lateral de Asp102 y el oxígeno del carbonilo de la cadena principal de Gly132.

Asp102 es un resto de epítopo clave en la interacción polar con CDR-H2 hc_Tyr54 y hc_Arg62. El reemplazo de hc_Asp62 natural con arginina en Fab A da como resultado un incremento en la afinidad de 120 veces. Basándose en la estructura de rayos X, esto se puede explicar por el cambio de la repulsión entre hc_Asp62 y Asp102 a la interacción polar de hc_Arg62 y Asp102, y los oxígenos del carbonilo de la cadena principal.

El grupo guanidinio de Arg107 interacciona directamente con las cadenas laterales de hc_Asn32 y hc_Asp105 de CDR-H1 y CDR-H3, respectivamente. Se ha demostrado que Arg107 es esencial para la inhibición del factor Xa (M.S. Bajaj y col. (2001) Thromb Haemost 86(4):959-72.). Fab A ocupa este resto crítico y compite con la función Arg107 en la inhibición del factor Xa.

Ejemplo 5. Comparación de parátopos de Fab A y su variante optimizada Fab C Para evaluar la consistencia de la unión al epítopo del TFPI por la variante optimizada de Fab A, Fab C, se analizaron alineamientos de secuencias de las cadenas ligera y pesada (figura 11 A) y modelos de homología de Fab C (figura 1 1 B) para determinar la conservación de restos de parátopos de Fab A en Fab C. Se calcularon los modelos de homología con DS MODELER (ACCELRYS, Inc; Fiser, A. y Sali A. (2003) Methods in Enzymology, 374:463-493) usando la estructura de rayos X de TFPI - Fab A de la invención como estructura de plantilla de entrada. Los modelos de homología muestran conformaciones de esqueleto casi idénticas en comparación con Fab A con R SD < 0,5 A. De 20 restos de parátopos observados en el complejo TFPI-Fab A, hc_Asn32 es el único resto de parátopo que difiere en Fab C, en el que un resto aspartato se encuentra en la posición respectiva (figura 1 1). Hc_Asn32 interacciona con Arg107 de TFPI. Asp32 de Fab C debería interaccionar más estrechamente con TFPI dado su grupo carboxilato e interacción prospectiva con el grupo guanidinio de Arg107. Basándose en la conservación de secuencia alta entre los restos de parátopos de Fab A y Fab C y la conformación de esqueleto idéntica esperada, Fab C reconoce probablemente el mismo epítopo del TFPI que Fab A.

Ejemplo 6. Razones basadas en la estructura de rayos X para la inhibición de la interacción de TFPI-factor Xa Fab A anticipa la interacción y la inhibición de TFPI-factor Xa. La superposición del complejo TFPI-Fab A con la estructura de TFPI-tripsina (M.J. Burgering y col (1997) J Mol Biol. 269(3):395-407) muestra que la región de TFPI que contiene el epítopo de Fab A es crucial para la interacción con tripsina, que es un sustituto para el factor Xa. Basándose en la estructura de rayos X, la unión del Fab A con el epítopo observado en el dominio de Kunitz 2 debe excluir la unión del factor Xa por impedimento esférico (figura 4).

Ejemplo 7. Producción de un TFPI recombinante (dominio de Kunitz 1 + 2), expresión en E. coli y su purificación Sistema de expresión El vector de destino (de acuerdo con la nomenclatura Gateway), denominado pD Eco5 N se basa en ET-16 b (Novagen). El vector también codifica una marca Hisio y NusA, así como el cásete de clonación Gateway para la expresión de la proteína de fusión que consiste en Hisi0/NusA y la proteína de interés.

Se clonó una construcción de ADN que codifica un sitio de escisión de proteasa TEV fusionado al extremo N terminal de los dominios de Kunitz 1 + 2 (Asp1 a Phe154, referencia Uniprot 10646, TFPI alfa maduro) y los sitios dé unión de Gateway (n° attB1-5, n° attB2-3, Invitrogen) en el vector pD Eco5 N dando como resultado el vector de expresión denominado pD Eco5 N TFPI KD1+2. La cepa de expresión usada fue BL21 DE3 (Novagen).

Secuencia de aminoácidos de proteína de fusión expresada usando pD Eco5 N TFPI KD1+2, 600 AA SECUENCIA 699 AA; 78579 PM; 4D2932FF7C1E3F7E CRC64; MGHHHHHHHH HHSSGHIEGR HMNKEILAVV EAVSNEKALP REKIFEALES ALATATKKKY EQEIDVRVQI DRKSGDFDTF RRWLVVDEVT QPTKEITLEA ARYEDESLNL GDYVEDQIES VTFDRITTQT AKQVIVQKVR EAERAMWDQ FREHEGEIIT GVVKKVNRDN ISLDLGNNAE AVILREDMLP RENFRPGDRV RGVLYSVRPE ARGAQLFVTR SKPEMLIELF RIEVPEIGEE VIEIKAAARD PGSRAKIAVK TNDKRIDPVG ACVGMRGARV QAVSTELGGE RIDIVL DDN PAQFVINA A PADVASIVVD EDKHT DIAV EAGNLAQAIG RNGQNVRLAS QLSGWELNVM TVDDLQAKHQ AEAHAAIDTF T YLDIDEDF ATVLVEEGFS TLEELAYVPM ELLEIEGLD EPTVEALRER AKNALATIAQ AQEESLGDNK PADDLLNLEG VDRDLAFKLA ARGVCTLEDL AEQGIDDLAD IEGLTDEKAG ALI AARNIC FGDEATSGS GLETSLYKKA GSDYDIPTTE NLYFQDSEED EEHTIITDTE LPPLKLMHSF CAFKADDGPC KAIMKRFFFN IFTRQCEEFI YGGCEGNQNR FESLEECKKM CTRDNANRII KTTLQQEKPD FCFLEEDPGI CRGYITRYFY NQQTKQCERF KYGGCLGNMN NFETLEECKN ICEDGPNGF Componentes de secuencia Marca de His 10 : GHHHHHHHH HH Marca de ÑusA: SSGHIEGR HMNKEILAVV EAVSNEKALP REKIFEALES ALATATKKKY EQEIDVRVQI DRKSGDFDTF RRWLVVDEVT QPTKEITLEA ARYEDESLNL GDYVEDQIES VTFDRITTQT AKQVIVQKVR EAERAMVVDQ FREHEGEIIT GVVKKVNRDN ISLDLGNNAE AVILREDMLP RENFRPGDRV RGVLYSVRPE ARGAQLFVTR SKPEMLIELF RIEVPEIGEE VIEIKAAARD PGSRAKIAVK TNDKRIDPVG ACVGMRGARV QAVSTELGGE RIDIVLWDDN PAQFVINAMA PADVASIVVD EDKHTMDIAV EAGNLAQAIG RNGQNVRLAS QLSGWELNVM TVDDLQAKHQ AEAHAAIDTF TKYLDIDEDF ATVLVEEGFS TLEELAYVPM KELLEIEGLD EPTVEALRER AKNALATIAQ AQEESLGDNK PADDLLNLEG VDRDLAFKLA ARGVCTLEDL AEQGIDDLAD IEGLTDEKAG ALIMAARNIC WFGDE Engarce/sitios de restricción de endonuleasa traducidos : TSGS GLE Sitio att traducido: TSLYKKA GS Sitio TEV: DYDIPTTENLYFQ TFPI Kunitz 1+2 DSEED EEHTIITDTE LPPLKLMHSF CAFKADDGPC KAIMKRFFFN IFTRQCEEFI YGGCEGNQNR FESLEECKKM CTRDNANRII KTTLQQEKPD FCFLEEDPGI CRGYITRYFY NQQTKQCERF KYGGCLGNMN NFETLEECKN ICEDGPNGF Expresión Se hizo crecer una cepa de BL21 DE3 transformada con pD Eco5 N TFPI KD1+2 como un precultivo en 2x 100 mi de medio LB con 200 pg/ml de ampicilina durante 14 h a 37 °C con agitación de 180 rpm. Se inoculó un biorreactor (Sartorius Stedim Biotech) con un volumen de cultivo de 10 I (medio LB, 200 µg/ml de ampicilina) con 200 mi de precultivo y se incubó a 37 °C, con agitación de 150 rpm. A una densidad de cultivo de DO600, se añadió IPTG hasta una concentración final de 100 mM para la inducción génica y se cultivó adicionalmente a 17 °C durante 24 h con un nivel mínimo del 50 % y una velocidad de agitación de 180 - 800 rpm. Se sedimentó E. coli por centrifugación (3000 g, 10 min) y se almacenó a -80 °C.

Purificación Se resuspendió la masa de E. coli sedimentada a partir de 10 I de cultivo en 500 mi de tampón de lisis [Tris-HCI 50 mM pH 8,0, NaCI 300 mM, 10% (p/p) de glicerol, imidazol 40 mM, cóctel de inhibidor de proteasas Complete libre de EDTA (Roche)], homogeneizado en un dispositivo de alta presión (Microfluidics) y después se centrifugó el lisado (100.000 g, 60 min, 4 °C). Se realizaron varias etapas de purificación usando un sistema de purificación Ákta. Se aplicó la fracción de lisado soluble centrifugada en una etapa de cromatografía IMAC inicial a una columna que contenía 50 mi de matriz Ni-Sepharose HP (GE). Se realizó el equilibrado, la unión a proteína de fusión y el lavado de la matriz Hi-Trap-Sepharose HP usando el tampón A (Tris-HCI 50 mM pH 8,0, NaCI 300 mM, imidazol 40 mM). Para la elución de la proteína de fusión NusA-TFPI, se usó un gradiente lineal de imidazol de desde 40 hasta 500 mM en un tampón B (Tris-HCI 50 mM pH 8,0, NaCI 150 mM). Se combinaron las fracciones de elución (volumen total de 140 mi) y se aplicaron en fracciones a una columna de desalado Hi Prep 26/10 (GE) (dos unidades de columna enlazadas) para el intercambio a un tampón con Tris-HCI 50 mM pH 8,0, NaCI 150 mM, CaCI2 5 mM). Para retirar la marca de Ñus A, se realizó un digestión proteolítica con TEV marcado con His6, con una proporción de enzima con respecto a proteína de fusión de 1 :66 p/p, durante 16 h a 4 °C. Se aplicó de nuevo la muestra a una columna que contenía 50 mi de matriz Ni-Sepharose HP (GE) para separar el TFPI libre de la proteína de fusión no escindida y de His-TEV. Después, se aplicó el eluato de la etapa de IMAC a cromatografía de exclusión por tamaño, SEC (S100, GE) para aislar una fracción de TFPI monomérica que se concentró por ultrafiltración (Amicon, unidad con intervalo de corte de 3 kDa) hasta aproximadamente 1 ,5 mg/ml. La muestra de dominio de Kunitz 1 + 2 del TFPI final purificada funcionó como una banda doble en PAGE con un peso molecular aparente de aproximadamente 18 kDa. Un análisis adicional (SEC, transferencia Western) reveló que sólo la proteina correspondiente a la banda superior era inmunorreactiva con el Fab B.

Ejemplo 8. Procesado proteolítico y purificación de Fab B a partir de lgG1 humana.

Expresión Se procesó de forma proteolítica el Fab B a partir de su forma lgG1 humana.

Se expresó el Fab B_lgG1 en células de mamífero (HEK 293) como una proteína de secreción. Para el aislamiento de lgG1 , se aplicaron 1 ,6 I de sobrenadante del cultivo a dos columnas enlazadas de HiTrap MabSelectSuRE (de GE, 5 mi de volumen de lecho, caudal 1 ,5 ml/min, 4 °C, durante 16 h). Para el lavado y el equilibrado de la columna, se usó un tampón que consistía en PBS y NaCI 500 mM. Se eluyó la lgG1 unida (Na-acetato 50 mM, NaCI 500 mM pH 3,5 seguido del mismo tampón con pH 3,0), se neutralizó (Tris 2,5 M > 11) y se concentró por ultrafiltración hasta aproximadamente 13 mg/ml.

Se usó papaína inmovilizada (Pierce, 20 mi de suspensión) para digerir aproximadamente 270 mg (en 12,5 mi) de lgG1 usando 22 fracciones en tubos de reacción Eppendorf de 1 ,5 mi (incubación 16 h, 37 °C, agitación 1400 rpm). Después del procesado, se centrifugaron las muestras, se recogió el sobrenadante, se lavó el sedimento con PBS y se combinaron los sobrenadantes y el lavado aclarado.

Se aplicó de nuevo la muestra digerida a dos columnas HiTrap MabSelectSuRe enlazadas (2 x 5 mi) permitiendo una separación de Fe y Fab. Se concentraron las fracciones de Fab B aisladas combinadas por ultrafiltración hasta aproximadamente 8 mg/ml (rendimiento total de 120 mg). Adicionalmente, se usó cromatografía de exclusión por tamaño con Superdex75 (columna 26/60, caudal 2,5 ml/min con PBS) para purificación adicional. Después de concentración y filtración estéril adicionales, el rendimiento final, del Fab B fue de 115 mg a una concentración de 8,5 mg/ml.

Se usó una cromatografía de exclusión por tamaño analítica (sistema Ákta Micro, columna S75 5/150, Tris-HC1 100 mM, pH 7,5) para demostrar la formación del complejo Fab B/TFPI KD1+2 (figura 5). Para Fab B, se observó un tiempo de retención inesperadamente largo en la columna SEC correspondiente a un peso molecular aparente de 20 kDa, que es muy similar al peso molecular detectado para TFPI KD1 +2.

Ejemplo 9. Producción del complejo dominio de Kunitz 1 + 2 del TFPI con Fab B Para formar el complejo inmunitario, se combinaron el dominio de Kunitz 1 + 2 del TFPI y Fab B en una proporción de aproximadamente 1 :1 ,5 (p/p). Por lo tanto, se mezclaron 3,85 mg de la proteína de dominio de Kunitz 1 + 2 del TFPI monomérica concentrada (a partir de fracciones combinadas S100) con 7,4 mg de Fáb B (a partir de SEC Superdex75) y se incubó durante 16 h a 21 °C. Se demostró la formación del complejo por medio de SEC (S200/150) analítico y transferencia de Western. Se purificó adicionalmente el complejo SEC (S200 26/26) en Tris-HCI 10 mM pH 7,4 con NaCI 150 mM, se concentró por ultrafiltración (Amicon, unidad con intervalo de corte de 5 kDa) hasta 10,3 mg/ml, que se usó para cristalización.

Ejemplo 10. Cristalización y determinación de estructura por rayos X del complejo TFPI-Fab B Cristalización Se hicieron crecer cocristales de una construcción de proteína que comprendía dominio de Kunitz 1 (KD1) y dominio de Kunitz 2 (KD2) del TFPI y el anticuerpo de TFPI monoclonal Fab B a 4 °C usando el procedimiento de gota pesada. Se concentró el complejo de proteína hasta 10 mg/ml y se cristalizó mezclando volúmenes iguales de solución de proteína y solución de pocilio (20% de PEG8000) como precipitante. Los cristales aparecieron después de tres días.

Recogida y procesado de datos Se ultracongelaron los cristales en nitrógeno líquido en un 30% de glicerol en tampón de cristalización para su crioprotección. Se recogieron los datos de un cristal en línea de haz BL14.1 , sincrotrón BESSY (Berlín) en un detector MAR CCD. Se indexaron y se integraron los datos con IMOSFLM (A.G.W. Leslie, (1992), Joint CCP4 + ESF-EAMCB. Boletín en Prótein Crystallography, N° 26), se prepararon para su escalado con POINTLESS (P.R. Evans, (2005) Acta Cryst. D62, 72-82), y se escalaron con SCALA (P.R. Evans, (2005) Acta Cryst. D62, 72-82). El cristal presentó difracción de hasta 2,3 A y poseía un grupo espacial P2i con constantes celulares a=80,3, 6=71 ,9, c=108.8; j8=92,5°, y dos complejos TFPIKD1 , -KD2 - Fab en la unidad asimétrica.

Determinación y refinado de la estructura Se resolvió la coestructura de TFPI-KD1 , -KD2 y el anticuerpo monoclonal Fab por reemplazo molecular usando PHASER (A.J. McCoy y col (2007) J. Appl. Cryst. 40, 658-674), MOLREP (A. Vagin y A. Tepiyakov (1997) J. Appl. Cryst. 30, 1022-10) y estructuras de rayos X internas y publicadas de TFPI-KD2 (código PDB 1tfx) y un fragmento Fab (código PDB 1w72) como modelos de búsqueda. Antes del reemplazo molecular, se procesaron los modelos de Fab y KD1 con CHAINSAW (N. Stein, (2008) J. Appl. Cryst. 41 , 641 - 643). Las rondas iterativas de la construcción del modelo con COOT (P. Emsley y col. (2010) Acta Cryst. D66:486-501) y el refinado de probabilidad máximo usando REFMAC5.5 (G.N. Murshudov y col. (1997) Acta Cryst. D53, 240-255) completaron el modelo. La región hc_Ser131 - hc_Serl36 tanto de Fab, restos de TFPI Asp1 - Leu21 , Asp149 - Phe154, como de los restos enlazadores de KD1 - KD2 Arg78 - Glu92 mostró una densidad de electrones débil y no se incluyó en el modelo. El conjunto de datos y las estadísticas de refinado se resumen en la tabla 4.

Tabla 4. Conjunto de datos y estadísticas de refinado para el complejo TFPI-Fab B.

Longitud de onda 0,9184 A Resolución (estructura más alta) 47-2,3 (2,4-2,3) A Reflexiones (observada/única) - 165457 (56223) Compleción8 97,8% (97,8%) ?/s8 5,8 (2,0) .

R reunión a b 0,13 (0,52) Grupo espacial P2i Parámetros de celda unidad a 80,3 A b . 71 ,9 A c 108,8 A ß 92,5° Rcrist 0,20 Rlibre ° 0,27 Factor de temperatura de Wilson 16,7 A2 Longitud de enlace de RMSD 0,008 A Ángulos de enlace de RMSD 1 ,3° Átomos de proteína 8205 Moléculas de agua 599 Los valores entre paréntesis son para la estructura de resolución alta. 0 Runión =?hk1 |lhk1 - <lhki>| /?hk1 <'hki> donde hM es la intensidad de reflexión hk1 y <lhki> es la intensidad promedio de observaciones múltiples. c Rcr¡st =? |Fobs- Fcaid /? Fobs donde Fobs y Fcaic son las amplitudes del factor de estructura observada y calculada, respectivamente. ° 5% de conjunto de prueba ß RMSD, desviación de la raíz cuadrática media del conjunto de parámetros para estereoquímica ideal Ejemplo 11. Mapeo de epítopos basado en la estructura de rayos X El complejo de TFPI-KD1 , -KD2 y Fab B (figura 6) cristalizó como dos copias del complejo por unidad asimétrica. Las cadenas principales de los complejos se superponen con una RMSD total de 1 ,0 Á con cada Fab B unido a epítopo del TFPI-KD1 y -KD2 asociado. Ambos dominios de Kunitz interaccionan directamente o a través de interacciones mediadas por agua con Fab B. KD1 y KD2 también interaccionan entre sí. Se analizaron los restos de TFPI en contacto con Fab B (el epítopo) y la superficie oculta respectiva con el programa CCP4 AREAIMOL (P.J. Briggs (2000) CCP4 boletín N° 38). Los restos con una superficie oculta de 5 A2 de mínimo o con una superficie oculta de más del 50 % se han considerado en contacto (Tabla 5). Se analizaron los restos de Fab B en contacto con TFPI (el parátopo) y la superficie oculta respectiva con AREAIMOL. Los restos con una superficie oculta de 5 A2 de mínimo o con una superficie oculta de más del 50 % se han considerado en contacto (tabla 6).

Tabla 5: Restos de TFPI en contacto con Fab B. Las cadenas C, D y las cadenas N, O corresponden al dominio de Kunitz 1 y dominio de Kunitz 2 del TFPI del complejo respectivo en la unidad asimétrica.

Tabla 6: Restos de Fab B en contacto con TFPI. Las cadenas A, B y las cadenas L, M representan las cadenas ligera y pesada de Fab B del complejo respectivo en la unidad asimétrica.

El Fab B reconoció un epítopo no lineal de KD1 y KD2 que se define por los restos Asp31 - Lys36, Cys59 (que forma un puente disulfuro con Cys35), Glu60, y Asn62 de TFPI-KD1 y Glu100, Glu101 , región Pro103 - Cys106 (que forma un puente disulfuro con Cys130), restos Arg107- Tyr109, Phe114, Asn116, Glu123, Arg124 y restos Lys126 - Gly128 de TFPI-KD2. El parátopo Fab B que interacciona con TFPI-KD1 incluye lc_Leu27 - lc_Tyr31, lc_Asp50, lc_Asn65, lc_Trp90, lc_Asp92, lc_Gly93 y hc_Arg101 y hc_Tyr102. El parátopo Fab B que interacciona con TFPI-KD2 incluye lc_Tyr31 , lc_Tyr48 and lc_Tyr49, and hc_Thr28, hc_Arg30 - hc_Tyr32, hc_Tyr100, hc_Arg101 , hc_Trp103, y hc_Asp105. Parece que las CDR de cadena ligera son los principales sitios de interacción para TFPI-KD1 , parece que las CDR de cadena pesada son los principales sitios de interacción para TFPI-KD2, Basándose en el número de contactos.

El epítopo no lineal en TFPI-KD1 consiste en dos regiones de bucle enlazadas por un puente disulfuro entre Cys35 y Cys59. El epítopo se caracteriza por una interacción hidrófoba central de Pro34 rodeada por un triángulo de interacciones polares de Asp31 , Asp32, Glu60 y Lys36 con Fab B (figura 7).

Pro34 está en una hendidura hidrófoba creada por lc_Tyr30 y lc_Tyr31 de CDR-L1 , lc_Trp90 de CDR-L3 y hc_Tyr102 de CDR-H3. Asp31 y Asp32 poseen interacción polar con CDR-H3 y una red de enlaces de hidrógeno con hc_Arg101 , hc_Tyr102, y una molécula de agua. La cadena lateral de Hc_Tyr102 está bien orientada para poseer interacción hidrófoba con Pro34, interacción polar con Asn31, e interacción tt-p aromática con lc_Trp90 de CDR-L3.

La interacción de Asp31 y Asp32 con CDR-H3 es una característica de epítopo clave y las orientaciones e interacciones de hc_Tyr102 y hc_Arg101 parecen cruciales. La mutación del resto natural hc_Lys99 a leucina dio como resultado un incremento en la afinidad de 20 veces. Hc_Leu99 está situado en la interfase hidrófoba entre la cadena ligera y pesada y seguido del bucle CDR-H3, Una cadena lateral de lisina polar y flexible es una desventaja en esta posición e interfiere con la conformación de CDR-H3 óptima y las interacciones con antígeno.

Glu60, que forma la segunda esquina del triángulo polar, interacciona con las cadenas laterales de lc_Tyr30 (CDR-L1), lc_Trp90 y el nitrógeno de la cadena principal de lc_Gly93 (CDR-L3).

La tercera esquina del triángulo está formada por Lys36. Lys36 es un resto esencial para la inhibición del complejo factor Vlla/factor tisular por TFPI (M.S. Bajaj y col. (2001) Thromb Haemost 86(4):959-72.). En el complejo con Fab B, Lys36 está en contacto significativo y ocultado por CDR-L1 lc_Leu27, lc_Arg28, lc_Asn29, lc_Tyr31 , CDR-L2 lc_Asp50 y una molécula de agua. La interacción de Lys36 con el complejo factor Vlla/factor tisular mientras está unido a Fab B y su inhibición aparecen excluidas.

El epítopo no linear en TFPI-KD2 consiste en tres secciones que comprenden restos GlulOO, Glu101, Pro103 - Tyr109, Phe114; Asn116 y Glu123; Arg124, Lys126 - Gly128. El epítopo de KD2 forma interacciones polares e hidrófobas con Fab B CDR-L1 , -L2, -H1 y -H3 (figura 8).

GlulOO, Glu101 , Arg107 y Tyr109 son restos de epítopos clave que proporcionan puntos de anclaje polares o hidrófobos en contacto con tres regiones de superficie separadas de Fab B creadas por CDR-H1 (interacción con GlulOO y Glu101) CDR-L1 , -L2, -H3 (interacción con Arg107), y CDR-L2, -H3 (interacción con Tyr109).

Arg107 está en contacto significativo por lc_Tyr31 , lc_Tyr49, hc_Arg101 y hc_Tyr102 de CDR-L1 , -L2, -H3, respectivamente, e interacciona adicionalmente con Gly33 y Cys35 de KD1. Se ha demostrado que Arg107 es esencial para la inhibición del factor Xa (M.S. Bajaj y col. (2001) Thromb Haemost 86(4):959-72.). Fab A ocupa este resto crítico y excluye la función Arg107 en la inhibición del factor Xa.

GlulOO y Glu101 forman enlaces de hidrógeno con los restos de CDR-H1 hc_Arg30, hc_Ser31 y hc_Thr28 y hc_Tyr32.

Tyr109 está en un hueco hidrófobo creado por los restos de CDR-L2 lc_Tyr48, y CDR-H3 hc_Tyr100, y hc_Trp103, y forma un enlace de hidrógeno con hc_Asp105.

Ejemplo 12. Comparación de parátopos de Fab B y su variante optimizada Fab D Para evaluar la consistencia de la unión al epítopo del TFPI por la variante optimizada de Fab B, Fab D, se analizaron alineamientos de secuencias de las cadenas ligera y pesada (figura 12A) y modelos de homología de Fab D (figura 12B) para determinar la conservación de restos de parátopos de Fab B en Fab D. Se calcularon los modelos de homología con DS MODELER (ACCELRYS, Inc; Fiser, A. y Salí A. (2003) Methods in Enzymology, 374:463-493) usando la estructura de rayos X de TFPI .- Fab B de la invención como estructura de plantilla de entrada. Los modelos de homología muestran conformaciones de esqueleto casi idénticas en comparación con Fab B con RMSD < 0,5 A. De 29 restos de parátopos observados en el complejo TFPI-Fab B, siete restos (cinco restos de cadena ligera, dos restos de cadena pesada) difieren en Fab D (figura 12). Lc_Arg28; lc_Asn29, lc_Asp92, y lc_Gly93 muestran interacciones de cadena principal con los restos de epítopo de TFPI. No se espera que los intercambios de estos restos en Fab D reduzcan la unión con un epítopo de TFPI diferente. El reemplazo de lc_Tyr48 y hc_Gln1 por una fenilalanina y glutamato en Fab D es insignificante ya que no se observan interacciones de cadena lateral polares en la estructura de rayos X. Hc_Arg30 muestra una interacción polar con Glu100 de TFPI y se intercambia a una serina en Fab D. En esta posición, una arginina debe ser favorable sobre una serina para interaccionar con TFPI. Basándose en el impacto esperado de los intercambios analizados entre los restos de parátopos de Fab B y Fab D, la conservación de la secuencia total y la RMSD baja del modelo de homología de D, se contempla que Fab D reconoce el mismo epítopo de TFPI que Fab B.

Ejemplo 13 Razones basadas en la estructura de rayos X para la inhibición de la interacción TFPI con el factor Xa y el complejo de factor Vlla/factor tisular Fab B se une tanto a KD1 como a KD2 de TFPI. KD2 se une e inhibe el factor Xa. KD1 se une e inhibe el complejo factor Vlla/factor tisular. Se han notificado las estructuras de rayos X de KD2 en el complejo con tripsina (M.J. Burgering y col (1997) J Mol Biol. 269(3): 395-407) y de BPTI en el complejo con una porción extracelular de TF y factor Vlla (E. Zhang y col (1999) J Mol Biol 285(5):2089-104.). Tripsina es un sustituto para el factor Xa, BPTI es un homólogo de TFPI-KD1. La superposición del complejo TFPI-Fab B con KD2-tripsina o bien BPTI-factor VI la/factor tisular revela que la unión a anticuerpo excluye la unión de KD1 y KD2 a sus ligandos naturales factor Vlla/factor tisular y factor Xa, respectivamente (figura 9, figura 10).

Aunque se ha descrito la presente invención con referencia a las realizaciones y ejemplos específicos, debe entenderse que se pueden realizar diversas modificaciones y cambios y se pueden sustituir equivalentes sin apartarse del espíritu y alcance verdaderos de la invención. Por consiguiente, la memoria descriptiva y los ejemplos deben considerarse en un sentido ilustrativo en lugar de restrictivo. Además, todos los artículos, libros, solicitudes de patente y patentes mencionados en el presente documento, se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad.

Claims (37)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal aislado que se une a un epítopo del inhibidor de la ruta del factor tisular humano (SEC ID N°: 1), caracterizado porque dicho epítopo comprende uno o más restos seleccionados del grupo que consiste en GlulOO, Glu101, Asp102, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Lys126, Gly128, Gly129, Cys130, Leu131 , Gly132 y Asn133 de la SEC ID N°: 1.

2. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho epítopo comprende el resto Ile105 de SEC ID N°: 1.

3. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho epítopo comprende el resto Ile105 y Asp102 de SEC ID N°: 1.

4. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho epítopo comprende el resto Ile105, Asp102 y Leu131 de SEC ID N°: 1.

5. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con las reivindicaciones 2-4, caracterizado porque el epítopo comprende además uno o más restos seleccionados del grupo que consiste en GlulOO, Glu101, Asp102, Pro103, Gly104, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Lys126, Gly128, Gly129, Cys130, Leu131 , Gly132 y Asn133 de la SEC ID N°: 1.

6. Un anticuerpo monoclonal aislado que se une a un epítopo del inhibidor de la ruta del factor tisular humano (SEC ID N°: 1), caracterizado porque dicho epítopo comprende dos bucles de aminoácidos enlazados por un puente disulfuro entre los restos Cys106 y Cys130 de SEC ID N°: 1.

7. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque dicho epítopo comprende además uno o más restos seleccionados del grupo que consiste en GlulOO, Glu101 , Asp102, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Lys126, Gly128, Gly129, Cys130, Leu131 , Gly132 y Asn133 de la SEC ID N°: 1.

8. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque dicho epítopo comprende el resto He105 de SEC ID N°: 1.

9. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el epítopo comprende el resto Asp102 de SEC ID N°: 1.

10. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el epítopo comprende el resto Leu131 de SEC ID N°: 1.

11. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 8-10, caracterizado porque el epítopo comprende además uno o más restos seleccionados del grupo que consiste en GlulOO, Glu101 , Asp102, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Lys126, Gly128, Gly129, Cys130, Leu131 , Gly132 y Asn133 de la SEC ID N°: 1.

12. Un anticuerpo monoclonal aislado que se une a un epítopo del inhibidor de la ruta del factor tisular humano (SEC ID N°: 1), caracterizado porque dicho epítopo comprende uno o más restos de dominio de Kunitz 1 y uno o más restos de dominio de Kunitz 2.

13. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el resto del dominio de Kunitz 1 comprende uno o más restos seleccionados del grupo que consiste en Asp31 , Asp32, Gly33, Pro34, Cys35, Lys36, Cys59, Glu60 y Asn62.

14. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el resto del dominio de Kunitz 1 comprende el resto Pro34.

15. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque los restos del dominio de Kunitz 1 comprenden los restos Pro34 y Glu60.

16. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque los restos del dominio de Kunitz 1 comprenden los restos Pro34, Lys36 y Glu60.

17. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14-16, caracterizado porque los restos del dominio de Kunitz 1 comprenden uno o más restos seleccjonados del grupo que consiste en Asp31 , Asp32, Gly33, Cys35, Lys36, Cys59, Glu60 y Asn62.

18. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el resto del dominio de Kunitz 2 comprendé uno o más restos seleccionados del grupo que consiste en Glu100, Glu101, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Phe114, Asn116, Glu123, Arg124, Lys126, Tyr127 y Gly128.

19. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el resto del dominio de Kunitz 2 comprende el resto Arg107.

20. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el resto del dominio de Kunitz 2 comprende el resto Glu101.

21. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el resto del dominio de Kunitz 2 comprende el resto Tyr109.

22. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-21, caracterizado porque los restos del dominio de Kunitz 2 comprenden además uno o más restos seleccionados del grupo que consiste en GlulOO, Glu101, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Phe114, Asn116, Glu123, Arg124, Lys126, Tyr127 y Gly128.

23. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el resto del dominio de Kunitz 1 comprende uno o más restos seleccionados del grupo que consiste en Asp31 , Asp32, Gly33, Pro34, Cys35, Lys36, Cys59, Glu60 y Asn62; y en el que el resto del dominio de Kunitz 2 comprende uno o más restos seleccionados del grupo que consiste en GlulOO, Glu101 , Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Phe114, Asn116, Glu123, Arg124, Lys126, Tyr127 y Gly128.

24. Un anticuerpo monoclonal aislado que se une a un epítopo del inhibidor de la ruta del factor tisular humano (SEC ID N°: 1), caracterizado porque dicho epítopo comprende dos bucles de aminoácidos enlazados por un puente disulfuro entre los restos Cys35 y Cys59 de SEC ID N°: 1.

25. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque dicho epítopo comprende además uno o más restos del dominio de Kunitz 1 y uno o más restos del dominio de Kunitz 2.

26. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el resto del dominio de Kunitz 1 comprende uno o más restos seleccionados del grupo que consiste en Asp31 , Asp32, Gly33, Pro34, Cys35, Lys36, Cys59, Glu60 y Asn62.

27. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el resto del dominio de Kunitz 2 comprende uno o más restos seleccionados del grupo que consiste en GlulOO, Glu101 , Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Phe114, Asn116, Glu123, Arg124, Lys126, Tyr127 y Gly128.

28. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el resto del dominio de Kunitz 1 comprende un o más restos seleccionados del grupo que consiste en Asp31 , Asp32, Gly33, Pro34, Cys35, Lys36, Cys59, Glu60 y Asn62; y en el que el resto del dominio de Kunitz 2 comprende uno o más restos seleccionados del grupo que consiste en GlulOO, Glu101, Pro103, Gly104, Ile105, Cys106, Arg107, Gly108, Tyr109, Phe114, Asn116, Glu123, Arg124, Lys126, Tyr127 y Gly128.

29. Un anticuerpo monoclonal aislado que se une a TFPI, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal aislado es competitivo con cualquiera de los anticuerpos monoclonales aislados de conformidad con las reivindicaciones 1 a 28 para la unión a TFPI.

30. Un anticuerpo biespecífico aislado que se une a TFPI, caracterizado porque el anticuerpo biespecífico es competitivo con cualquiera de los anticuerpos monoclonales aislados de conformidad con las reivindicaciones 1 a 28, para la unión a TFPI.

31. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal de conformidad, con cualquiera de las reivindicaciones 1-30, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

32. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos dos anticuerpos monoclonales de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-30, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

33. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque el primer anticuerpo monoclonal comprende el anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 1 , y un segundo anticuerpo monoclonal comprende el anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 12.

34. Un procedimiento para tratar deficiencias o defectos genéticos o adquiridos en la coagulación, caracterizado porque comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de conformdiad con cualquiera de las reivindicaciones 30-32 a un paciente.

35. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el procedimiento trata hemofilia A, B o C.

36. Un procedimiento para acortar el tiempo de hemorragia, caracterizado porque comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-33 a un paciente.

37. Una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo que se une a un epítopo del inhibidor de la ruta del factor tisular humano (SEC ID N°: 1) que codifica dicho anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-29.