ES2905085T3 - Anticuerpos que pueden unirse a dos epítopos en el inhibidor de la vía del factor tisular (1-161) - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo biespecífico capaz de unirse específicamente a un primer epítopo dentro de las posiciones 1-76 y dicho segundo epítopo dentro de las posiciones 77-161 del TFPI humano (SEQ ID NO: 1), en donde la cadena pesada del primer sitio de reconocimiento de antígeno comprende: · una secuencia CDR1 NYGVH (aminoácidos de 31 a 35 de la SEQ ID NO: 6) y · una secuencia de CDR2 VIWRGGSIDYNAAFMS (aminoácidos de 50 a 65 de la SEQ ID NO: 6) y · una secuencia de CDR3 NSHGNYVGYAMDY (aminoácidos de 98 a 110 de la SEQ ID NO: 6 en donde la cadena ligera del primer sitio de reconocimiento de antígeno comprende: · una secuencia de CDR1 KASQSVGPAVA (aminoácidos de 24 a 34 de la SEQ ID NO: 7 y · una secuencia de CDR2 SASNRYT (aminoácidos de 50 a 56 de la SEQ ID NO: 7) y · una secuencia de CDR3 QQYTSYPT (aminoácidos de 89 a 96 de la SEQ ID NO: )v en donde la cadena pesada del segundo sitio de reconocimiento de antígeno comprende: · una secuencia de CDR1 NYAMS (aminoácidos de 31 a 35 de la SEQ ID NO: 19) y · una secuencia de CDR2 TISRSGSYSYYADSVKG (aminoácidos de 50 a 66 de la SEQ ID NO: 25) y · una secuencia de CDR3 LGGYDEGDAMDS (aminoácidos de 99 a 110 de la SEQ ID NO: 19) y en donde la cadena ligera del segundo sitio de reconocimiento de antígeno comprende: · una secuencia de CDR1 KSSQSLLESDGKTYLN (aminoácidos de 24 a 39 de la SEQ ID NO: 20) y · una secuencia de CDR2 LVSILDS (aminoácidos de 55 a 61 de la SEQ ID NO: 20) y · una secuencia de CDR3 LQATHFPQT (aminoácidos de 94 a 102 de la SEQ ID NO: 20).

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos que pueden unirse a dos epítopos en el inhibidor de la vía del factor tisular (1-161)

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos biespecíficos y composiciones de los mismos, que son capaces de unirse simultáneamente a dos epítopos dentro de la región N-terminal (residuos 1-161) del inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI). La invención también se refiere a los usos farmacéutico y terapéutico de tales anticuerpos.

Antecedentes de la invención

En un individuo que sangra, la coagulación se inicia por el complejo Factor Tisular/Factor VIIa (TF/FVIIa) cuando el TF extravascular se expone al FVIIa en la sangre. La formación de complejos TF/FVIIa conduce a la activación del Factor X (FX) a FXa que, junto con el Factor V activado (FVa), genera una cantidad limitada de trombina. Pequeñas cantidades de trombina activan las plaquetas lo que, a su vez, resulta en la exposición superficial de los fosfolípidos de las plaquetas que soportan el ensamblaje y la unión del complejo tenasa compuesto por el Factor VIII activado (FVIIIa) y el Factor IX activado (FIXa). El complejo tenasa es un catalizador muy eficiente de la activación del FX y el FXa generado en esta segunda etapa sirve como la proteasa activa en el complejo FVa/FXa pro-trombinasa responsable de la ráfaga final de trombina. La trombina escinde el fibrinógeno para generar monómeros de fibrina, que se polimerizan para formar una red de fibrina que sella el vaso que se filtra y detiene el sangrado. La rápida y extensa ráfaga de trombina es un requisito previo para la formación de un coágulo de fibrina sólido y estable.

Una propagación inadecuada del FXa y de la generación de trombina provocada por la deficiencia del FVIII o del FIX es la razón subyacente de las diátesis hemorrágicas en pacientes con hemofilia A o B, respectivamente. En personas con hemofilia, la generación del FXa es conducida principalmente por el complejo TF/FVIIa porque la deficiencia del FVIII o del FIX solo conduce a una generación rudimentaria del FXa por parte del complejo tenasa. La activación del FX al FXa mediada por TF/FVIIa es, sin embargo, temporal porque el inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI) inhibe el Factor Xa y el complejo TF/FVIIa en un lazo autorregulador. La inhibición de la retroalimentación conduce a la formación de un complejo TF/FVIIa/FXa/TFPI. La inhibición neutralizante del TFPI prolonga la activación del FX mediada por TF/FVIIa durante el inicio de la coagulación y, de esta manera, promueve la hemostasia en personas con hemofilia con una generación inadecuada del FXa causada por una actividad alterada de la tenasa debido, por ejemplo, a una deficiencia del FVIII o del FIX.

Después del inicio de la coagulación, la generación del FXa mediada por TF/FVIIa se regula negativamente, de manera muy estricta, mediante el TFPI. El TFPI es un inhibidor competitivo de unión estrecha, lento, que regula la activación y la actividad del FX a través de la inhibición tanto de TF-FVIIa como del FXa. TF/FVIIa se inhibe mediante el TFPI en un proceso que, como una etapa limitante de velocidad, implica la inhibición del FXa mediante el TFPI, ya sea cuando el FXa se une al complejo TF/FVIIa o cuando se une en su proximidad a la (Baugh y otros, 1998, JBC, 273: 4378­ 4386). La inhibición del FXa mediante el TFPI ocurre en una reacción bifásica que inicialmente conduce a un complejo relajado TFPI-FXa, que después se reordena lentamente en un complejo TFPI-FXa de unión estrecha, donde el segundo dominio inhibidor de tipo Kunitz del TFPI (KPI-2) se une y bloquea el sitio activo del FXa. El primer dominio inhibidor de tipo Kunitz de TFPI (KPI-1) contribuye a la formación del complejo estrecho TFPI-FXa y directamente se une y bloquea el sitio activo del FVIIa unido al ^{t F .}

Los anticuerpos que son capaces de unirse al TFPI se conocen en la técnica. Por ejemplo, los documentos WO2010/072691, WO2012/001087 y WO2012/135671 describen anticuerpos monoclonales (mAb), cada uno de los cuales es capaz de unirse a un epítopo específico del TFPI. Las siguientes limitaciones pueden aplicarse a un anticuerpo de este tipo que se dirige a un solo epítopo del TFPI, por ejemplo, en un dominio de KPI, que típicamente está restringido al área del paratopo de un anticuerpo definido por una única región variable. En primer lugar, la inhibición final del complejo TF/FVNa/FXa depende de varias interacciones entre áreas complementarias dispersas sobre el TFPI y el complejo TF/FVIIa/FXa. Esto se aplica no solo a la unión directa de KPI-1 y KPI-2 del TFPI a los sitios activos del FVIIa y del FXa, respectivamente, sino también a las interacciones con exositio de TF/FVIIa/FXa que involucran regiones de las regiones N- y C-terminales del TFPI. Un anticuerpo monoclonal que se une, por ejemplo, a un único KPI puede no ser capaz de bloquear completamente todas las funciones inhibidoras del TFPI, particularmente a concentraciones fisiológicamente elevadas del TFPI. En segundo lugar, la eficacia de un anticuerpo monoespecífico puede verse obstaculizada por la afinidad del anticuerpo y/o la flexibilidad de la molécula del TPFI, las cuales requerirían que la dosificación del primero fuera alta. En tercer lugar, dirigirse al TFPI con un anticuerpo monoclonal puede causar que el TFPI se acumule en la circulación como resultado de un aclaramiento renal reducido del complejo TFPI-mAb, o como resultado de otros mecanismos de aclaramiento que se reducen debido a la formación del complejo TFPI-mAb.

Los inventores prevén que los anticuerpos biespecíficos que se describen en la presente descripción pueden abordar tales limitaciones.

Resumen

La presente invención se refiere a un anticuerpo biespecífico capaz de unirse específicamente a un primer epítopo y un segundo epítopo dentro de las posiciones 1 a 161 del TFP i humano (SEQ ID NO: 1), como se define en las reivindicaciones. La invención está definida por las reivindicaciones y cualquier otro aspecto o modalidades establecidas en la presente descripción que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones son solo para información.

En un aspecto, el primer epítopo del anticuerpo biespecífico puede estar dentro de las posiciones 1-96, tales como dentro de las posiciones 1-76, tales como dentro del dominio del inhibidor de tipo Kunitz 1 (KPI-1) (residuos 26-76) del TFPI humano. El epítopo KPI-1 puede comprender uno o más de los residuos de aminoácidos Arg 41, Arg 65 y/o Glu 67 de la SEQ ID NO: 1, y puede comprender además uno o más de los residuos de aminoácidos Leu 16, Pro 17, Leu 19, Lys 20, Leu 21, Met 22, Phe 25, Cys 35, Ala 37, Met 39, Tyr 56, Gly 57, Gly 58, Cys 59, Glu 60, Gly 61, Asn 62, Gln 63, Phe 66, Glu 71 y Met 75 de la SEQ ID NO: 1.

En un aspecto, el segundo epítopo del anticuerpo biespecífico puede estar dentro de las posiciones 77-161, tales como dentro de las posiciones 97-161, tales como dentro del dominio del inhibidor de tipo Kunitz 2 (KPI-2) (residuos 97-147) del TFPI humano. El epítopo KPI-2 puede comprender el residuo de aminoácido Arg 107 de la SEQ ID NO: 1, y puede comprender además uno o más de los residuos de aminoácidos Glu 100, Glu 101, Asp 102, Pro 103, Tyr 109, Thr 111, Tyr 113, Phe 114, Asn 116, Gln 118, Gln 121, Cys 122, Glu 123, Arg 124, Phe 125, Lys 126 y Leu 140 de la SEQ ID NO: 1.

El anticuerpo biespecífico de la presente invención puede estar en formato IgG tal como formato IgG de longitud completa, o puede ser un conjugado químico de dos fragmentos de anticuerpo, tal como un conjugado de dos fragmentos Fab o fragmentos scFv, o sus combinaciones. El anticuerpo biespecífico es, preferentemente, humano o humanizado.

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Dicho anticuerpo biespecífico o composición que lo comprende puede usarse como un medicamento. Dicho medicamento puede ser útil en el tratamiento de una coagulopatía congénita, adquirida y/o iatrogénica, tal como la hemofilia A, con o sin aloanticuerpos contra el factor VIII, y la hemofilia B, con o sin aloanticuerpos contra el factor IX.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: La generación de trombina se ve potenciada por determinados anticuerpos TFPI (1-79) y por el anticuerpo mAb 2021 de KPI-2 del TFPI en plasma humano en condiciones similares a la hemofilia A con niveles aumentados del TFPI. La curva (a) muestra el resultado obtenido en plasma humano normal sin más adiciones. La curva (b) muestra el resultado cuando se obtienen condiciones similares a la hemofilia A mediante la adición de 100 mg/ml de anticuerpo de FVIII (HTI PAHFVIII-S) y TFPIa de longitud completa 20 nM. La supresión de la generación de trombina como resultado de TFPIa 20 nM en combinación con la neutralización del FVIII no se vio afectada por la adición de 200 nM del anticuerpo mAB 1F91 del TFPI (1-79) (c). La adición de 200 nM del anticuerpo mAb 2F22 del TFPI (1-79) (d) y el anticuerpo KPI-2, mAb 2021 (e), invirtió la generación de trombina pero no a una restauración completa al nivel obtenido en humanos normales sin anticuerpos del FVIII (curva (a)).

Figura 2: La generación de trombina se ve fuertemente potenciada por la combinación de los anticuerpos TFPI (1-79) y TFPI-KPI-2 en plasma humano en condiciones similares a la hemofilia A con niveles aumentados del TFPI. La curva (a) muestra el resultado obtenido en plasma humano normal sin más adiciones. La curva (b) muestra el resultado cuando se obtienen condiciones similares a la hemofilia A mediante la adición de 100 pg/ml de anticuerpo de FVIII (HTI PAHFVIII-S), TFPIa 20 nM y el anticuerpo KPI-2 200 nM, mAb 2021. La neutralización incompleta en (b) con mAb 2021 200 nM se invirtió mediante la combinación de mAb 2021 100 nM con mAb 1F91 (c) de anticuerpo del TFPI (1-79) 100 nM o mAb 2F22 (d). Las combinaciones de anticuerpos del TFPI (1-79) y KPI-2 en (c) y (d) dieron como resultado picos de trombina más altos que el plasma humano normal (a).

Figura 3: Resultados de la unión del TFPI FL al anticuerpo biespecífico capturado mAb 0421 y BiFab 9041.

Breve descripción de las secuencias

La SEQ ID NO: 1 representa la secuencia de aminoácidos del TFPI alfa humano.

La SEQ ID NO: 2 representa la secuencia de aminoácidos del TFPI (1-161).

La SEQ ID NO: 3 representa la secuencia de aminoácidos de un fragmento del TFPI etiquetado que abarca La SEQ ID NO: 4 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable del anticuerpo monoclonal (mAb) 2F3.

La SEQ ID NO: 5 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable del anticuerpo monoclonal (mAb) 2F3.

La SEQ ID NO: 6 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable del anticuerpo monoclonal (mAb) 2F22.

La SEQ ID NO: 7 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable del anticuerpo monoclonal (mAb) 2F22.

La SEQ ID NO: 8 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable del anticuerpo monoclonal (mAb) 2F45.

La SEQ ID NO: 9 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable del anticuerpo monoclonal (mAb) 2F45.

La SEQ ID NO: 10 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable del anticuerpo monoclonal (mAb) 1F91.

La SEQ ID NO: 11 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable del anticuerpo monoclonal (mAb) 1F91.

La SEQ ID NO: 12 representa la secuencia de ácido nucleico del cebador usado para la clonación de las cadenas pesadas del anticuerpo.

La SEQ ID NO: 13 representa la secuencia de ácido nucleico del cebador usado para la clonación de las cadenas ligeras de anticuerpos.

La SEQ ID NO: 14 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada quimérica humana murina truncada de Fab 0296.

La SEQ ID NO: 15 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera quimérica murina humana del anticuerpo monoclonal mAb 0294, Fab 0296, Fab 0295 y mAb 0336.

La SEQ ID NO: 16 representa la secuencia de aminoácidos de KPI-1/N-terminal del TFPI etiquetado (TFPI (1­ 79)).

La SEQ ID NO: 17 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada quimérica murina humana del anticuerpo monoclonal mAb 0294.

La SEQ ID NO: 18 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada quimérica humana murina truncada de Fab 0295.

La SEQ ID NO: 19 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (VH) de mAb 2021.

La SEQ ID NO: 20 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (VL) de mAb 2021.

La SEQ ID NO: 21 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (HC) de Fab 0094.

La SEQ ID NO: 22 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (LC) de Fab 0094.

La SEQ ID NO: 23 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (HC) de Fab 0088.

La SEQ ID NO: 24 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (LC) de Fab 0088.

La SEQ ID NO: 25 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (HC) de Fab 0313.

La SEQ ID NO: 26 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (LC) de Fab 0313.

La SEQ ID NO: 27 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (HC) de mAb 0310.

La SEQ ID NO: 28 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (LC) de mAb 0310

La SEQ ID NO: 29 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (HC) de mAb 0336.

DESCRIPCIÓN. Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos subsecuentes de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

In vivo, el inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI) se encuentra en varios compartimentos. Una fracción importante del TFPI se asocia con el endotelio vascular y una fracción menor circula en la sangre. Dos variantes de empalme del TFPI, el TFPI alfa (TFPIa) y el TFPI beta (TFPIp), se han descrito en humanos. El TFPIp es presumiblemente la forma predominante expresada en la superficie de la célula endotelial, mientras que las reservas intracelulares del TFPIa pueden liberarse en la circulación ante determinados estímulos. El TFPIa circula en la sangre tanto como proteína de longitud completa como truncada, asociada con lipoproteínas o en plaquetas.

El TFPI humano maduro es una proteína de 276 aminoácidos (SEQ ID NO: 1) compuesta por una región N-terminal ácida, tres dominios de inhibidor de tipo Kunitz dispuestas en tándem (KPI-1, KPI-2 y KPI-3) intercalados por regiones enlazadoras y una cola C-terminal básica. Los dominios KPI-1, KPI-2 y KPI-3 se definen como los residuos 26-76, los residuos 97-147 y los residuos 189-239, respectivamente, de la SEQ ID NO: 1. El TFPIp humano maduro es una proteína de 193 aminoácidos unida covalentemente a la superficie de la célula endotelial mediante un anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI). Los primeros 161 aminoácidos del TFPIp son idénticos al TFPIa (correspondientes a los residuos 1-161 de la SEQ ID NO: 1) mientras que los 12 aminoácidos finales de la secuencia C-terminal no están relacionados con el TFPIa y tienen un anclaje de GPI unido al residuo 193.

La presente descripción se refiere a anticuerpos biespecíficos que se unen a dos epítopos distintos y/o únicos dentro de los residuos 1-161 del TFPI. Dos anticuerpos monoespecíficos, cada uno con un sitio de reconocimiento de antígeno único, forman la base de los fragmentos de unión a antígeno, o "brazos", del anticuerpo biespecífico de la presente invención. El primer fragmento de unión al antígeno (o "brazo") del anticuerpo biespecífico se dirige hacia un epítopo dentro de los residuos de aminoácidos 1-96 de la SEQ ID NO: 1; es decir, a un epítopo que está dentro de la región que abarca la región N-terminal, el dominio KPI-1 (residuos 26-76 de la SEQ ID NO: 1) y la región enlazadora entre los dominios KPI-1 y KPI-2. Preferentemente, dicho epítopo se encuentra dentro de la región que abarca los aminoácidos 1-76 del TFPI. El segundo fragmento de unión a antígeno (o "brazo") del anticuerpo biespecífico se dirige hacia un epítopo dentro de los aminoácidos 77-161 de la SEQ ID NO: 1; es decir, la región del TFPI que abarca la región enlazadora entre KPI-1 y KPI-2, el dominio KPI-2 y la región enlazadora entre los dominios KPI-2 y KPI-3. Dicho epítopo está preferentemente dentro del dominio KPI-2 del TFPI (residuos 97-147 de la SEQ ID NO: 1).

Un solo brazo del anticuerpo biespecífico, capaz de unirse dentro de los aminoácidos 77-161 de la SEQ ID NO: 1, tal como dentro del dominio KPI-2, puede por sí mismo, como un anticuerpo monoespecífico, ser incapaz de prevenir significativamente la actividad inhibidora del TFPI. Sin embargo, puede contribuir de manera más significativa al bloqueo específico de la inhibición del TFPI cuando el otro brazo del anticuerpo biespecífico se une a la región que abarca los aminoácidos 1-76 del TFPI, tal como el dominio KPI-1 del TFPI, y viceversa.

Preferentemente, el modo de unión dominante para los anticuerpos biespecíficos de unión a KPI-1/KPI-2 como se describe en la presente descripción es intramolecular, es decir, donde los dos brazos del anticuerpo biespecífico de unión a KPI-1/KPI-2 se unen a una sola molécula del TFPI en lugar de intermolecular, que es donde los dos brazos del anticuerpo biespecífico de unión a KPI-1/KPI-2 se unen a diferentes moléculas del TFPI. La unión intramolecular conduce a un complejo de anticuerpo TFPI 1:1, mientras que un modo de unión intermolecular puede conducir a la formación no deseada de conjuntos más grandes del TFPI y anticuerpo biespecífico. Puede estimularse un modo de unión intramolecular mediante la reducción de la afinidad de uno de los brazos de anticuerpos, como el brazo de unión de KPI-1.

El anticuerpo biespecífico de la invención puede tener un perfil superior cuando su efecto procoagulante se compara con el efecto aditivo anticipado de los anticuerpos monoespecíficos de los cuales se deriva. Por ejemplo, el anticuerpo biespecífico puede ser capaz de bloquear todas las funciones inhibidoras del TFPI, incluso cuando la concentración del TFPI es elevada con relación a, por ejemplo, niveles fisiológicos normales. El enlace de dos fragmentos de unión a antígeno dirigidos hacia dos epítopos separados de la invención, para obtener un anticuerpo biespecífico, como un conjugado Fab-Fab (también denominado en la presente descripción BiFab), puede, debido a un efecto de avidez, conducir a una mayor neutralización potente de la actividad TFPI que la obtenida por el efecto combinado de los dos restos de unión al antígeno separados.

Un anticuerpo biespecífico de la invención puede ser capaz de modular la actividad de todos los conjuntos del TFPI.

El término "TFPI", como se usa en la presente descripción, abarca cualquier forma de origen natural del inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI) que puede derivarse de cualquier organismo adecuado. Por ejemplo, el TFPI para usar como se describe en la presente descripción puede ser un TFPI de mamífero, tal como TFPI humano, de ratón, de rata, de primate, bovino, ovino, de conejo o porcino. Preferentemente el TFPI es TFPI humano. El TFPI puede ser una forma madura del TFPI tal como una proteína TFPI que experimentó el procesamiento postraduccional dentro de una célula adecuada. Tal proteína TFPI madura puede, por ejemplo, estar glicosilada. El TFPI puede ser una proteína TFPI de longitud completa. El término TFPI también abarca variantes, isotermas y otros homólogos de tales moléculas del TFPI. La actividad TFPI se refiere a su actividad inhibidora. Generalmente las variantes de moléculas del TFPI pueden caracterizarse por tener el mismo tipo de actividad que el TFPI de origen natural, tal como la capacidad de neutralizar la actividad catalítica del FXa, o la capacidad de inhibir un complejo de TF-FVIIa/FXa.

El término "anticuerpo" en la presente descripción se refiere a una proteína, derivada de una secuencia de inmunoglobulina, que es capaz de unirse específicamente a un antígeno o una parte del mismo. El término anticuerpo incluye, pero no se limita a, anticuerpos de longitud completa de cualquier clase (o isotipo), es decir, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM y/o IgY. El término también puede incluir uno o más fragmentos de anticuerpos de longitud completa que se unen a antígenos. Un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno, o a una porción del mismo, puede unirse exclusivamente a ese antígeno, o a una porción del mismo, o puede unirse a un número limitado de antígenos homólogos, o porciones de los mismos.

Los anticuerpos de longitud completa de origen natural generalmente comprenden al menos cuatro cadenas polipeptídicas: dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) que se conectan mediante enlaces disulfuro. En algunos casos, los anticuerpos de origen natural comprenden menos de cuatro cadenas, como en el caso de los anticuerpos con solo una cadena pesada que se encuentran en los camélidos (fragmentos VhH) y los IgNAR encontrados en Chondrichthyes. Una clase de inmunoglobulinas de interés farmacéutico particular son las IgG. En humanos, la clase IgG puede dividirse en cuatro subclases: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, en base a la secuencia de las regiones constantes de su cadena pesada. Las cadenas ligeras pueden dividirse en dos tipos, cadenas kappa y lambda en base a diferencias en su composición de secuencias. Las moléculas de IgG están compuestas por dos cadenas pesadas, interconectadas por dos o más enlaces disulfuro, y dos cadenas ligeras, cada una unida a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro. Una cadena pesada de IgG puede comprender una región variable de cadena pesada (VH) y hasta tres regiones constantes de cadena pesada (CH): CH1, CH2 y CH3. Una cadena ligera puede comprender una región variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera (CL). Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) o regiones hipervariables (HVR), intercaladas con regiones que son más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Las regiones VH y VL están compuestos, típicamente, por tres CDR y cuatro FR, dispuestas del extremo amino terminal al extremo carboxilo terminal en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Los dominios variables con las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera forman un dominio que es capaz de interactuar con un antígeno, mientras que la región constante de un anticuerpo puede mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, que incluyen, pero no se limitan a, diversas células del sistema inmunológico (células efectoras), receptores Fc y el primer componente (C1q) del complejo C1 del sistema de complemento clásico.

El término "anticuerpo monoespecífico", como se usa en la presente descripción, se refiere a un anticuerpo que tiene un único sitio de reconocimiento de antígeno (es decir, es monovalente) o dos sitios de reconocimiento de antígeno idénticos (es decir, es bivalente), cada uno de los cuales es específico para un antígeno diana común.

Los anticuerpos de la descripción pueden ser anticuerpos monoclonales, en el sentido de que representan un conjunto de secuencias de dominio variable de cadena pesada y ligera únicas, como las que se expresan a partir de una sola célula B o por una población clonal de células B. Los anticuerpos de la invención pueden producirse y purificarse mediante el uso de diversos métodos conocidos por el experto en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden producirse a partir de células de hibridomas. Los anticuerpos pueden producirse mediante la expansión de células B. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden expresarse de manera recombinante en sistemas de expresión microbiana o de mamíferos, o mediante traducción in vitro. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos también pueden expresarse de manera recombinante como moléculas unidas a la superficie celular, por medio de, por ejemplo, la exposición en fagos, la exposición en bacterias, la exposición en levadura, la exposición en células de mamífero o la exposición en ARNm o ribosoma. Una vez producidos, los anticuerpos pueden cribarse por su capacidad para unirse a TFPI (1-161), TFPIp y TFPIp de longitud completa, tal como t Fp I (1-161) humano, TFPIp humana de longitud completa y TFPIp humano.

Los fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos también pueden ser anticuerpos monoespecíficos de acuerdo con la presente invención, ya que se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. El término "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse o reconocer específicamente un antígeno, tal como TFPIa, tal como TFPIa humano (SEQ ID NO: 1), tal como TFPI humano (1­ 161) (SEQ ID NO: 2), tal como una construcción de TFPI KPI-2 humano (SEQ ID NO: 3), u otra molécula diana, como se describe en la presente descripción. Ejemplos de los fragmentos de unión a antígeno incluyen Fab, Fab', Fab², Fab'² , FabS, Fv (típicamente, los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo), Fv de cadena única (scFv; ver por ejemplo, Bird y otros, Science (1988) 242: 42S-426; y Huston y otros, PNAS (1988) 85: 5879-5883), dsFv, Fd (típicamente, los dominios VH y CH1) y los fragmentos dAb (típicamente un dominio VH); como tal los dominios VH, VL, VhH, y V-NAR; las moléculas monovalentes que comprenden una única cadena VH y una única cadena VL; minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y cuerpos kappa (ver, por ejemplo, Ill y otros, Protein Eng (1997) 10: 949-57); IgG de camello; IgNAR; así como también una o más CDR aisladas o un paratopo funcional, donde las CDR aisladas o los residuos o polipéptidos de unión a antígeno pueden asociarse o unirse juntos para formar un fragmento de anticuerpo funcional. Diversos tipos de fragmentos de anticuerpos se han descrito o revisado en, por ejemplo, Holliger y Hudson, Nat Biotechnol (2005) 23: 1126-1136; el documento WO2005040219, y las solicitudes de patente de Estados Unidos publicadas 20050238646 y 20020161201. Estos fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse mediante el uso de técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos pueden cribarse para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

Los "fragmentos Fab" de un anticuerpo, que incluye "Fab", "Fab"', y "Fab'²", pueden derivarse de dicho anticuerpo por escisión de la cadena pesada en la región de bisagra en el extremo N-terminal o C-terminal de los residuos de cisteína de la bisagra que conectan las cadenas pesadas del anticuerpo. Un fragmento "Fab" incluye los dominios variable y constante de la cadena ligera y el dominio variable y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos "Fab'²" comprenden un par de fragmentos "Fab"' que se unen, generalmente, covalentemente por sus cisteína de la bisagra. Un Fab' se deriva formalmente de un fragmento Fab'2 mediante escisión de los enlaces disulfuro de la bisagra que conectan las cadenas pesadas en el Fab'². Además, en la técnica se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos diferentes de los enlaces disulfuro. Un fragmento Fab retiene la capacidad del anticuerpo parental para unirse a su antígeno, potencialmente con una afinidad más baja. Los fragmentos Fab'² son capaces de unirse de manera divalente, mientras que los fragmentos Fab y Fab' pueden unirse de manera monovalente. Generalmente, los fragmentos Fab carecen de los dominios constantes CH2 y CH3, es decir la parte Fc, donde ocurriría la interacción con los receptores Fc. Por lo tanto, los fragmentos Fab en general carecen de funciones efectoras. Los fragmentos Fab pueden producirse mediante métodos conocidos en la técnica, ya sea mediante escisión enzimática de un anticuerpo, por ejemplo, mediante el uso de papaína para obtener el Fab o pepsina para obtener el Fab'² , los fragmentos Fab que incluyen Fab, Fab', Fab'² pueden producirse de manera recombinante mediante el uso de técnicas que se conocen bien por los expertos en la técnica.

Un fragmento “Fv” es un fragmento de anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento y de unión al antígeno y comprende generalmente un dímero de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en una asociación que puede ser de naturaleza covalente, por ejemplo, en un fragmento del dominio variable de cadena simple (scFv). Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables o un subconjunto de las mismas confieren al anticuerpo la especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un dominio variable simple que comprende solamente tres regiones hipervariables específicas para un antígeno puede retener la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque usualmente a una afinidad más baja que la del sitio de unión completo (Cai & Garen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93: 6280-6285). Por ejemplo, los anticuerpos de camélidos de origen natural que sólo tienen un dominio variable de cadena pesada (VHH) pueden unirse al antígeno (Desmyter y otros, J. Biol. Chem. (2002) 277: 23645-23650; Bond y otros, J. Mol. Biol. (2003) 332: 643-655).

Los fragmentos de anticuerpos “Fv de cadena simple” o “scFv” comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una sola cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además, un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite al scFv formar la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de scFv, ver Pluckthun, 1994, En: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315.

El término “diacuerpos” se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión a antígenos, en los que los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH y VL). Mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios variables en la misma cadena, los dominios variables se fuerzan a aparearse con dominios complementarios de otra cadena, lo que crea dos sitios de unión a antígenos. Los diacuerpos se describen más completamente, por ejemplo, en los documentos EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger y otros, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448.

La expresión “anticuerpos lineales” se refiere a anticuerpos como se describe en Zapata y otros, 1995, Protein Eng., 8(10): 1057-1062. Brevemente, estos anticuerpos contienen un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con los polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión al antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

Los fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse mediante el uso de técnicas convencionales de ingeniería recombinante o de proteínas y los fragmentos pueden cribarse para la unión al TFPI (1-161), TFPIa y TFPIp de longitud completa u otras porciones del TFPI, como se describe en la presente descripción, de la misma manera que los anticuerpos intactos.

Los fragmentos de anticuerpos de la invención pueden realizarse mediante truncamiento, por ejemplo, mediante la eliminación de uno o más aminoácidos de los extremos N y/o C-terminal de un polipéptido. Los fragmentos pueden generarse, además, mediante una o más deleciones internas.

El término "anticuerpo biespecífico" en la presente descripción se refiere a un anticuerpo que tiene dos sitios de reconocimiento de antígenos distintos y/o únicos que le permiten acoplar dos antígenos diferentes o dos epítopos diferentes en el mismo antígeno. El término anticuerpo “multiespecífico” se refiere a un anticuerpo con la capacidad de unirse a dos o más antígenos diferentes o a dos o más epítopos diferentes en el mismo antígeno. Los anticuerpos multiespecíficos comprenden por lo tanto anticuerpos biespecíficos.

El anticuerpo biespecífico de la presente invención puede ser un anticuerpo biespecífico de longitud completa en formato IgG. Los anticuerpos biespecíficos en formato de IgG de longitud completa, que imitan los anticuerpos de origen natural, pueden generarse mediante la fusión de dos hibridomas individuales para formar un cuadroma híbrido que produce una mezcla de anticuerpos que incluyen una fracción de anticuerpos heterodimeralizantes biespecíficos (Chelius D. y otros; MAbs. 2010 Mayo-Junio; 2(3): 309-319). Los anticuerpos heterodimerizantes bioespecíficos pueden producirse alternativamente mediante el uso de tecnologías recombinantes. La heterodimerización puede lograrse, además, mediante la modificación por ingeniería genética de la interfaz de dimerización de la región Fc para promover la heterodimerización. Un ejemplo de estas son las denominadas mutaciones de botón en agujero donde las cadenas laterales estéricamente voluminosas (botones) se introducen en un Fc acoplado mediante las cadenas laterales estéricamente pequeñas (agujeros) en el Fc opuesto lo que crea la complementariedad estérica que promueve la heterodimerización. Otros métodos para la heterodimerización de las interfaces Fc modificadas por ingeniería genética son la complementariedad electrostática, la fusión a dominios de heterodimerización no IgG o el uso del fenómeno natural de intercambio de brazo Fab de IgG4 humana para controlar la heterodimerización. Los ejemplos de anticuerpos heterodimerizados biespecíficos se describen bien en la literatura, por ejemplo, (Klein C, y otros; MAbs. 2012 Noviembre-Diciembre; 4(6): 653-663). Debe prestarse especial atención a las cadenas ligeras en los anticuerpos heterodiméricos. El emparejamiento correcto de las LC y HC puede lograrse mediante el uso de una cadena ligera común. Una vez más, la modificación por ingeniería genética de la interfaz LC/HC puede usarse para promover la heterodimerización o modificación por ingeniería genética del entrecruzamiento de cadena ligera como en CrossMabs. El reensamblaje in vitro bajo condiciones de reducción suave de anticuerpos de dos IgG individuales que contienen mutaciones apropiadas puede usarse, además, para generar anticuerpos biespecíficos (por ejemplo, Labrijn y otros, PNAS, 110: 5145-5150 (2013)). Además, se informa el método de intercambio de brazo Fab natural para asegurar el emparejamiento correcto de las cadenas ligeras.

Las moléculas basadas en anticuerpos multiespecíficos pueden expresarse, además, de manera recombinante como proteínas de fusión que combinan los módulos naturales de las IgG para formar derivados de anticuerpos multiespecíficos y multivalentes como se describe en la literatura. Ejemplos de anticuerpos de fusión son DVD-Igs, IgG-scFV, diacuerpos, DART, etc. (Kontermann, MAbs. 2012 Marzo-Abril 4(2): 182-197). En las proteínas de fusión pueden incorporarse las etiquetas específicas de detección o purificación, los restos de extensión de la vida media u otros componentes. Las modalidades adicionales que no son IgG también pueden incorporarse en las proteínas de fusión. Los anticuerpos biespecíficos de longitud completa basados en la heterodimerización Fc se denominan comúnmente como IgG asimétricas, independientemente de la metodología de apareamiento LC.

Las moléculas basadas en anticuerpos multiespecíficos pueden producirse, además, mediante conjugación química o acoplamiento de IgG de longitud completa individual o acoplamiento de fragmentos de IgG para formar derivados de anticuerpos multiespecíficos y multivalentes como se describe en la literatura. Ejemplos de anticuerpos de fusión son Fab'² acoplados químicamente, dímero de IgG, etc. (Kontermann, MAbs. 2012 Mar-Abril 4(2): 182-197). En las proteínas conjugadas pueden incorporarse las etiquetas específicas de detección o purificación, las moléculas de extensión de la vida media u otros componentes. Los polipéptidos adicionales que no son IgG también pueden incorporarse en las proteínas de fusión. En los ejemplos se proporciona un ejemplo de tal anticuerpo biespecífico.

Las moléculas multiespecíficas también pueden producirse mediante la combinación de métodos recombinantes y químicos que incluyen los descritos anteriormente.

El anticuerpo biespecífico de la presente invención puede ser un conjugado químico de dos fragmentos de unión a antígeno, tal como un conjugado de dos fragmentos Fab (un BiFab) o dos fragmentos scFv. Pueden generarse anticuerpos biespecíficos o dos anticuerpos monoespecíficos que se unen a dos epítopos únicos en el TFPI mediante métodos conocidos por un experto en la técnica. Pueden prepararse formatos biespecíficos, por ejemplo, mediante conjugación química de dos fragmentos de anticuerpo, como dos fragmentos Fab o scFv, ya sea directamente o mediante un enlazador que proporcione la flexibilidad necesaria para un funcionamiento adecuado. Un método específico para acoplar fragmentos Fab es usar la funcionalidad tiol en residuos de cisteína colocados apropiadamente en los fragmentos Fab.

Los anticuerpos biespecíficos o bifuncionales de la invención pueden obtenerse por conjugación química de dos anticuerpos o fragmentos de los mismos (que se unen a diferentes epítopos del TFPI), como se describe en J Immunol 1987; 139:2367-2375 o J Immunol 2001; 166:1320-1326, o como se describe a continuación:

mAb1 (o fragmento)-mAb2 (o fragmento)

mAb1 (o fragmento)-enlazador-mAb2 (o fragmento)

El enlace puede ser un enlace covalente simple (enlace directo) o comprender un birradical descrito generalmente como:

en donde X es al menos, pero sin limitarse a, un átomo seleccionado del grupo que consiste en carbono, oxígeno, azufre, fósforo y nitrógeno. * muestra las posiciones de las conexiones de este birradical. El término “birradical” se refiere a un compuesto químico con electrones pares con dos centros radicales libres que actúan independientemente entre sí.

En una modalidad, el enlazador es una cadena compuesta por no más de 40 átomos.

En una modalidad, un resto químico usado en el enlazador comprende la estructura birradical con la estructura

En una modalidad, la parte del enlazador comprende el birradical que tiene una estructura simétrica (enlazador homobifuncionalizado).

El enlazador también puede ser un polímero de estructura similar a la descripción anterior.

En una modalidad, un resto químico usado en el enlazador comprende un polímero: una macromolécula compuesta de unidades estructurales repetidas que se conectan mediante enlaces químicos covalentes. Dicho polímero puede ser hidrófilo.

El término hidrófilo o "soluble en agua" se refiere a restos que tienen algún grado detectable de solubilidad en agua. Los métodos para detectar y/o cuantificar la solubilidad en agua se conocen bien en la técnica.

Los polímeros solubles en agua ilustrativos de acuerdo con la invención incluyen péptidos, sacáridos, (poli)éteres, (poli)aminas, ácidos (poli)carboxílicos y similares. Los péptidos pueden tener secuencias mezcladas y componerse de un único aminoácido, por ejemplo, (poli)lisina. Un polisacárido ilustrativo es el ácido (poli)siálico. Un (poli)éter ilustrativo es el (poli)etilenglicol. La (poli)etilenimina es una poliamina ilustrativa, y el ácido (poli)acrílico es un ácido (poli)carboxílico representativo.

Muchos otros polímeros también son adecuados para la invención. Las cadenas principales poliméricas que son solubles en agua son particularmente útiles en la invención. Los ejemplos de polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a, otros poli(alquilenglicoles), tales como poli(propilenglicol) ("PPG"), copolímeros de etilenglicol, propilenglicol y similares, poli(poliol oxietilado), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxipropilmetacrilamida), poli(ácido [alfa]-hidroxi ácido), poli(alcohol vinílico), polifosfaceno, polioxazolina, poli(N-acriloilmorfolina), tal como se describe en la patente de Estados Unidos Núm. 5,629,384, la cual se incorpora como referencia en su totalidad en la presente descripción, así como también, copolímeros, terpolímeros, y sus mezclas.

El enlazador polimérico es, preferentemente, lineal.

Aunque el peso molecular de cada cadena de polímero individual puede variar, el peso molecular promedio del polímero está típicamente en el intervalo de aproximadamente 1000 Da (1 kDa) a aproximadamente 40 000 Da (40 kDa), tal como aproximadamente 1000 Da a aproximadamente 12000 Da, tales como aproximadamente 2000 Da a aproximadamente 11 000 Da, tal como de aproximadamente 2000 Da a aproximadamente 3000 Da; de aproximadamente 3000 Da a aproximadamente 4000 Da; de aproximadamente 4000 a aproximadamente 5000 Da; de aproximadamente 5000 a aproximadamente 6000 Da; de aproximadamente 6000 a aproximadamente 7000 Da; de aproximadamente 7000 a aproximadamente 8000 Da; de aproximadamente 8000 a aproximadamente 9000 Da; de aproximadamente 9000 a aproximadamente 10000 Da; o de aproximadamente 10000 a aproximadamente 11 000 Da. Debe entenderse que estos tamaños representan estimaciones en lugar de medidas exactas. De acuerdo con una modalidad preferida, las moléculas de acuerdo con la invención se conjugan con una población heterogénea de polímeros hidrófilos.

En una modalidad particular, un resto químico usado en el enlazador comprende polietilenglicol (PEG).

El término “PEG”, en la presente descripción, se refiere a un birradical que comprende la estructura

en donde n’ es un número entero mayor que 1.

El PEG se prepara mediante polimerización de óxido de etileno y está disponible comercialmente en un amplio intervalo de pesos moleculares. El PEG para su uso de acuerdo con la presente invención es, preferentemente, lineal.

Además, el “PEG” puede referirse a un compuesto de polietilenglicol, o derivado del mismo, con o sin agentes de acoplamiento, restos de acoplamiento o activadores (por ejemplo, con un resto de ácido carboxílico/éster activo, ceto, alcoxiamina, tiol, triflato, tresilato, aziridina, oxirano, alquino, azida o maleimida). Los otros enlazadores mencionados en la presente descripción también pueden estar con o sin agentes de acoplamiento, restos de acoplamiento o activadores (por ejemplo, con un resto de ácido carboxílico/éster activo, ceto, alcoxiamina, tiol, triflato, tresilato, aziridina, oxirano, alquino, azida o maleimida)

En una modalidad particular, el PEG para su uso de acuerdo con la invención es monodisperso. En otra modalidad particular, el PEG para su uso de acuerdo con la invención es polidisperso.

El PEG polidisperso se compone de moléculas de PEG que tienen diversos pesos moleculares. La distribución de tamaño puede caracterizarse estadísticamente por su peso molecular (Mw) promedio y su peso molecular numérico (Mn) promedio, cuya relación se denomina índice de polidispersión (Mw/Mn) (ver por ejemplo, “Polymer Synthesis and Characterization” , J. A. Nairn, Universidad de Utah, 2003). El Mw y el Mn pueden medirse mediante espectroscopía de masa.

El índice de polidispersión puede ser un número que es mayor o igual a uno y puede estimarse a partir de los datos cromatográficos de permeación en gel. Cuando el índice de polidispersión es 1, el producto es monodisperso y por lo tanto se compone de compuestos con un peso molecular único. Cuando el índice de polidispersión es mayor que 1, el polímero es polidisperso, y el índice de polidispersión indica cuán amplia es la distribución de polímeros con diferentes pesos moleculares. El índice de polidispersión aumenta típicamente con el peso molecular del PEG. En modalidades particulares, el índice de polidispersión del PEG para su uso de acuerdo con la invención es i) menor que 1,06, ii) menor que 1,05, iii) menor que 1,04, iv) menor que 1,03 o v) entre 1,02 y 1,03.

Diferentes formas del PEG están disponibles, en dependencia del iniciador usado para el proceso de polimerización.

Numerosos métodos para la conjugación de sustituyentes del PEG se describen en Advanced Drug Delivery Reviews, 2002, 54, 459-476, Nature Reviews Drug Discovery, 2003, 2, 214-221 DOI:10.1038/nrd1033, Adv Polym Sci, 2006, 192, 95-134, DOI 10.1007/12_022, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 2005, y referencias en ellas. Alternativamente, la conjugación del sustituyente polimérico hidrófilo podría llevarse a cabo mediante el uso de métodos enzimáticos. Tales métodos son, por ejemplo, el uso de transglutaminasas como se describe en el documento WO2006134148.

Para efectuar la unión covalente de la(s) molécula(s) polimérica(s) al polipéptido, los grupos terminales de la molécula polimérica se proporcionan en forma activada, es decir, con grupos funcionales reactivos. Las moléculas poliméricas activadas adecuadas se disponen comercialmente, por ejemplo, de Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, EE.UU., Rapp Polymere GmbH, Tübingen, Alemania, o de PolyMAsC Pharmaceuticals plc, Reino Unido. Alternativamente, las moléculas poliméricas pueden activarse por métodos convencionales conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en el documento WO 90/13540. Los ejemplos específicos de polímeros de PEG activados se describen en la patente de Estados Unidos Núms. 5,932,462 y 5,643,575. Además, las publicaciones siguientes describen moléculas poliméricas útiles y/o productos químicos por PEGilación: documentos WO2003/031464, WO2004/099231.

La conjugación del anticuerpo monoclonal, o fragmento del mismo con las moléculas poliméricas activadas puede realizarse mediante el uso de cualquier método convencional, por ejemplo, como se describe en las referencias siguientes (que describen, además, los métodos adecuados para la activación de moléculas poliméricas): R. F. Taylor, (1991), "Protein immobilisation. Fundamental and applications", Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson y otros, (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y., ‘Bioconjugate Techniques, Segunda Edición, Greg T. Hermanson, 2008, Amsterdam, Elsevier). El experto estará al tanto de que el método de activación y/o la química de conjugación a usarse depende del(de los) grupo(s) de unión del polipéptido (ejemplos de los cuales se proporcionaron adicionalmente anteriormente), así como también de los grupos funcionales del polímero (por ejemplo, que sean amina, hidroxilo, carboxilo, aldehído, sulfhidrilo, succinimidilo, maleimida, vinilsulfona o haloacetato). La PEGilación puede dirigirse hacia la conjugación a todos los grupos de unión disponibles en el polipéptido (es decir, dichos grupos de unión que se exponen en la superficie del polipéptido) o pueden dirigirse hacia uno o más grupos de unión específicos, por ejemplo, el grupo amino N-terminal o un tiol. Además, la conjugación puede lograrse en una etapa o de manera escalonada.

En otra modalidad, un resto químico usado como el enlazador es el almidón de hidroxietilo. El término “almidón de hidroxietilo” (HES/HAES), como se usa en la presente descripción, se refiere a un derivado de almidón no iónico. Los diferentes tipos de almidones de hidroxietilo se describen típicamente por su peso molecular promedio, típicamente alrededor de 130 a 200 kDa.

En otra modalidad, un resto químico usado en el enlazador comprende ácido polisiálico.

En otra modalidad, un resto químico usado en el enlazador comprende un polímero de heparosano que se describe, por ejemplo, en Glycobiology (2011) 21: 1331-1340.

En otra modalidad, un resto químico en el enlazador se usa para unir al menos una de las proteínas de un glicano: un polisacárido o un oligosacárido que se une a una proteína.

En otra modalidad, un resto químico en el enlazador se usa para unir al menos una de las proteínas de un glicano unido a O.

En otra modalidad, un resto químico en el enlazador se usa para unir al menos una de las proteínas de un glicano unido a N.

Tanto los N-glicanos como los O-glicanos se unen a proteínas tales como anticuerpos mediante las células que producen estas proteínas. La maquinaria de N-glicosilación celular reconoce y glicosila señales de N-glicosilación (motivos N-X-S/T) en la cadena de aminoácidos, a medida que la proteína naciente se transloca desde el ribosoma al retículo endoplásmico (Kiely y otros, J. Biol. Chem. 1976, 251: 5490; Glabe y otros, J. Biol. Chem., 1980, 255, 9236). Igualmente, los O-glicanos se unen a sitios de O-glicosilación específicos en la cadena de aminoácidos, pero los motivos que desencadenan la O-glicosilación son mucho más heterogéneos que las señales de N-glicosilación, y nuestra capacidad para predecir sitios de O-glicosilación en las secuencias de aminoácidos todavía es inadecuada (Julenius y otros, Glycobiology, 2005, 15: 153). Los métodos de conjugación de polipéptidos con varios grupos poliméricos laterales se describen, por ejemplo, en el documento WO0331464.

En otra modalidad, un resto químico usado en el enlazador comprende un resto químico, que se usa para unir dicho enlazador a al menos una de las proteínas con una estructura seleccionada de los birradicales:

Los anticuerpos biespecíficos de la presente invención pueden ser anticuerpos humanos, humanizados, quiméricos o modificados por ingeniería genética.

Se pretende que el término “anticuerpo humano”, como se usa en la presente descripción, incluya anticuerpos que tienen regiones variables en las que al menos una porción de una región marco y/o al menos una porción de una región CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana. (Por ejemplo, un anticuerpo humano puede tener regiones variables en los que tanto las regiones marco como las CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana.) Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante o una porción de la misma se deriva, además, de secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro, o por mutación somática in vivo).

Dicho anticuerpo biespecífico humano puede derivarse de dos anticuerpos monoclonales humanos. Un anticuerpo monoclonal humano puede producirse por un hibridoma que incluye una célula B que se obtiene a partir de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende segmentos génicos del repertorio de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas humana, fusionados a una célula inmortalizada.

Los anticuerpos humanos pueden aislarse a partir de bibliotecas de secuencias incorporadas en selecciones de secuencias de líneas germinales humanas, diversificadas adicionalmente con una diversidad de secuencias natural y sintética.

Los anticuerpos humanos pueden prepararse mediante la inmunización in vitro de linfocitos humanos seguido de transformación de los linfocitos con el virus Epstein-Barr.

El término “derivado de anticuerpo humano” se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, tal como un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo.

El término “anticuerpo humanizado”, como se usa en la presente descripción, se refiere a un anticuerpo humano/no humano que contiene elementos de secuencia (regiones CDR o partes de las mismas) derivadas de una inmunoglobulina no humana. Un anticuerpo humanizado es, por tanto, una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la que los residuos de al menos una región hipervariable del receptor se sustituyen por residuos de una región hipervariable de un anticuerpo de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como de un ratón, rata, conejo o primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad, composición de secuencias y funcionalidad convenientes. En algunos casos, los residuos del marco (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes residuos no humanos. Un ejemplo de tal modificación es la introducción de una o más de las denominadas mutaciones de retroceso, que típicamente son residuos de aminoácidos derivados del anticuerpo donante. La humanización de un anticuerpo puede realizarse mediante el uso de técnicas recombinantes conocidas por el experto en la técnica (ver, por ejemplo, Antibody Engineering, Methods in Molecular Biology, vol. 248, editado por Benny K. Lo). Un marco receptor humano adecuado para el dominio variable de cadena ligera y pesada puede identificarse mediante, por ejemplo, homología estructural o de secuencia. Alternativamente, pueden usarse marcos receptores fijos, por ejemplo, basados en el conocimiento de la estructura, las propiedades biofísicas y bioquímicas. Los marcos receptores pueden derivarse de la línea germinal o derivarse de una secuencia de anticuerpos maduros. Las regiones c Dr a partir del anticuerpo donante pueden transferirse mediante injerto de CDR. El anticuerpo humanizado injertado con CDR puede optimizarse adicionalmente, por ejemplo, la afinidad, la funcionalidad y las propiedades biofísicas mediante la identificación de posiciones de marco crítico donde la re-introducción (mutación de retroceso) del residuo de aminoácido del anticuerpo donante tiene un impacto beneficioso sobre las propiedades del anticuerpo humanizado. Además de las mutaciones de retroceso derivadas de anticuerpos donantes, el anticuerpo humanizado puede modificarse por ingeniería genética mediante la introducción de residuos de la línea germinal en las regiones CDR o del marco, eliminación de epítopos inmunogénicos, mutagénesis dirigida a un sitio, maduración por afinidad, etc.

Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar aún más el comportamiento del anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá al menos uno -típicamente dos -dom inios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y en la que todos o sustancialmente todos los residuos de las FR son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede, opcionalmente, comprender además al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente, la de una inmunoglobulina humana.

El término “derivado de anticuerpo humanizado” se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humanizado, tal como un conjugado del anticuerpo y otro agente químico o anticuerpo o fragmento de anticuerpo o polipéptido.

El término “anticuerpo quimérico”, como se usa en la presente descripción, se refiere a un anticuerpo cuyos genes de cadena pesada y ligera se han construido, típicamente, mediante ingeniería genética, a partir de genes de región constante y variable de inmunoglobulinas que se originan de especies diferentes. Por ejemplo, los segmentos variables de genes de un anticuerpo monoclonal de ratón pueden unirse a regiones constantes humanas.

La región cristalizable del fragmento (“región Fc”/“dominio Fc”) de un anticuerpo es la región C-terminal de un anticuerpo, que comprende los dominios constantes CH2 y CH3. El dominio Fc puede interactuar con receptores de la superficie celular denominados, receptores de Fc, así como también con algunas proteínas del sistema de complemento. La región Fc permite que los anticuerpos interactúen con el sistema inmune. En un aspecto de la invención, los anticuerpos pueden modificarse por ingeniería genética para incluir modificaciones dentro de la región Fc, típicamente, para alterar una o más de sus propiedades funcionales, tales como la vida media en suero, la fijación del complemento, la unión al receptor de Fc, la estabilidad de proteínas y/o la citotoxicidad celular dependiente del antígeno, o la carencia de estos, entre otros. Además, un anticuerpo de la invención puede modificarse químicamente (por ejemplo, una o más porciones químicas pueden unirse al anticuerpo) o modificarse para alterar su glicosilación, o nuevamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Un anticuerpo IgG1 puede portar un dominio Fc modificado que comprende una o más, y quizás todas las siguientes mutaciones que darán como resultado una menor afinidad por determinados receptores de Fc (L234A, L235E y G237A) y una disminución de la fijación del complemento mediada por C1q (A330S y P331S), respectivamente (numeración de residuos de acuerdo con el índice de la EU).

El isotipo de un anticuerpo de la invención puede ser IgG, tal como IgG1, tal como IgG2, tal como IgG4. Si se desea, la clase de un anticuerpo puede "cambiarse" mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, un anticuerpo que se produjo originalmente como una molécula IgM puede cambiarse de clase a un anticuerpo IgG. Las técnicas de cambio de clase pueden usarse, además, para convertir una subclase de IgG a otra, por ejemplo: de IgG1 a IgG2 o IgG4; de IgG2 a IgG1 o IgG4; o de IgG4 a IgG1 o IgG2. Además, puede realizarse la modificación por ingeniería genética de los anticuerpos para generar moléculas quiméricas de región constante, mediante la combinación de regiones de diferentes subclases de IgG.

En una modalidad, la región de bisagra de CH1 se modifica de manera que el número de residuos de cisteína en la región de bisagra se altera, por ejemplo, aumenta o disminuye. Este enfoque se describe además, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos núm. 5,677,425 de Bodmer y otros.

La región constante puede modificarse para estabilizar el anticuerpo, por ejemplo, para disminuir el riesgo de que un anticuerpo bivalente se separe en dos fragmentos monovalentes de VH-Vl . Por ejemplo, en una región constante lgG4, el residuo S228 (de acuerdo con el índice de numeración de la EU y S241 de acuerdo con Kabat) puede mutarse a un residuo de prolina (P) para estabilizar la formación de puente disulfuro entre las cadenas pesadas de la bisagra (ver, por ejemplo, Angal y otros. Mol Immunol. 1993; 30: 105-8).

Un anticuerpo biespecífico de la presente invención puede comprender un fragmento de unión a antígeno, o una variante del mismo, del anticuerpo mAb 2F3; el anticuerpo mAb 2F22 (tal como Fab 0295 o Fab 0296); el anticuerpo mAb 2F45; o el anticuerpo mAb 1F91.

Un anticuerpo biespecífico de la presente invención puede comprender además un fragmento de unión a antígeno, o una variante del mismo, del anticuerpo mAb 2021, un anticuerpo monoclonal humanizado que se describió por primera vez en el documento WO2010/072691.

Los ejemplos de tales fragmentos de unión a antígeno, o variantes de los mismos, incluyen Fab 0088, Fab 0094 o Fab 0313, como se describe en la presente descripción. El anticuerpo monoclonal murino del que se deriva el mAb 2021 puede producirse como se describe en el documento WO2010/072691.

Cualquiera de los anticuerpos biespecíficos mencionados anteriormente, que comprenden un fragmento de unión a antígeno, o una variante del mismo, de mAb 2F3, mAb 2F22, mAb 2F45 o mAb 1F91 y un fragmento de unión a antígeno, o variante del mismo, del mAb 2021, puede ser un anticuerpo biespecífico de longitud completa en formato IgG o una molécula biespecífica compuesta por fragmentos de anticuerpo. Los anticuerpos o fragmento de los mismos pueden definirse en términos de sus regiones determinantes de complementariedad (CDR). El término “región determinante de complementariedad” o “región hipervariable”, cuando se usa en la presente descripción, se refiere a las regiones de un anticuerpo en el que se ubican los residuos de aminoácidos implicados en la unión al antígeno. La región de hipervariabilidad o CDR puede identificarse como las regiones con la mayor variabilidad en los alineamientos de aminoácidos de dominios variables de anticuerpos. Las bases de datos pueden usarse para la identificación de las CDR tales como la base de datos de Kabat, las CDR, por ejemplo, se definen como que comprenden los residuos de aminoácidos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) del dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95­ 102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; (Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Publicación del NIH núm. 91-3242) Alternativamente, las CDR pueden definirse como los residuos de un "bucle hipervariable" (residuos 26-33 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (H3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk, J. Mol. Biol.

1987; 196: 901-917). Típicamente, la numeración de residuos de aminoácidos en esta región se realiza mediante el método descrito en Kabat y otros, anteriormente.Las frases tales como “posición Kabat”, “residuo de Kabat”, y “de acuerdo con Kabat” en la presente descripción se refieren a este sistema de numeración para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera. Mediante el uso del sistema de numeración de Kabat, la secuencia de aminoácidos lineal real de un péptido puede contener menos aminoácidos adicionales que corresponden a un acortamiento de, o inserción en, un marco (FR) o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir inserciones de aminoácidos (residuo 52a, 52b y 52c de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de CDR H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b, y 82c, etcétera de acuerdo con Kabat) después del residuo 82 de FR de cadena pesada. La numeración de Kabat de los residuos puede determinarse para un anticuerpo dado mediante alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia "estándar" numerada según Kabat.

Los términos “región marco” o residuos “FR” se refieren a los residuos de aminoácidos VH o VL que no están dentro de las CDR, como se define en la presente descripción.

Un sitio de reconocimiento de antígeno del anticuerpo biespecífico de la descripción puede comprender una región CDR de uno o más de los anticuerpos específicos o fragmentos de anticuerpos descritos en la presente descripción, tal como una región CDR dentro de las SEQ ID NO: 4 a 11, 14 a 15, 17 a 26, como se define de acuerdo con la numeración secuencial de aminoácidos descrita en la presente descripción o mediante el uso de la numeración de Kabat.

El primer sitio de reconocimiento de antígeno del anticuerpo biespecífico puede tener una cadena pesada que comprende:

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 31 a 35 de la SEQ ID NO: 4 (SYGVH), en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50 a 65 de la SEQ ID NO: 4 (VIWRGGSTDFNAAFMS), en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 98 a 110 de la SEQ ID NO: 4 (NSHGNYVGYAMDY), en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse por un residuo de aminoácido diferente.

y dicho primer sitio de reconocimiento de antígeno puede tener una cadena ligera que comprende:

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 24 a 34 (KASENVGAAVA) de la SEQ ID NO: 5, en donde uno, dos o tres de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50 a 56 (SASNRYT) de la SEQ ID NO: 5, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 89 a 96 (QQYTNYPT) de la SEQ ID NO: 5, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente.

El primer sitio de reconocimiento de antígeno del anticuerpo biespecífico puede tener una cadena pesada que comprende:

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 31 a 35 de la SEQ ID NO: 6 (NYGVH), en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50 a 65 de la SEQ ID NO: 6 (VIWRGGSIDYNAAFMS), en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 98 a 110 de la SEQ ID NO: 6 (NSHGNYVGYAMDY), en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse por un residuo de aminoácido diferente.

y dicho primer sitio de reconocimiento de antígeno puede tener una cadena ligera que comprende:

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 24 a 34 (KASQSVGPAVA) de la SEQ ID NO: 7, en donde uno, dos o tres de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50 a 56 (SASNRYT) de la SEQ ID NO: 7, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 89 a 96 (QQYTSYPT) de la SEQ ID NO: 7, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente.

El primer sitio de reconocimiento de antígeno del anticuerpo biespecífico puede tener una cadena pesada que comprende:

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 31 a 35 de la SEQ ID NO: 8 (GYGVH), en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50 a 65 de la SEQ ID NO: 8 (VIWRGGSIDYNAAFMS), en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 98 a 110 de la SEQ ID NO: 8 (NSHGNYVGYAMDY), en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse por un residuo de aminoácido diferente.

y dicho primer sitio de reconocimiento de antígeno puede tener una cadena ligera que comprende:

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 24 a 34 (KASQNVGTAVA) de la SEQ ID NO: 9, en donde uno, dos o tres de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50 a 56 (SASNRYT) de la SEQ ID NO: 9, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 89 a 96 (QQYTSYPT) de la SEQ ID NO: 9, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente.

El primer sitio de reconocimiento de antígeno del anticuerpo biespecífico puede tener una cadena pesada que comprende:

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 31 a 36 de la SEQ ID NO: 10 (SDYAWN), en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 51 a 66 de la SEQ ID NO: 10 (YISYSGSTSYNPSLKS), en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 99 a 104 de la SEQ ID NO: 10 (WAYDGP), en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente.

y dicho primer sitio de reconocimiento de antígeno puede tener una cadena ligera que comprende:

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 24 a 33 (RASSSVSHMH) de la SEQ ID NO: 11, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 49 a 55 (ATSNLAS) de la SEQ ID NO: 11, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o • una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 88 a 96 (QQWSSNPFT) de la SEQ ID NO: 11, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente.

El segundo sitio de reconocimiento de antígeno del anticuerpo biespecífico puede tener una cadena pesada que comprende:

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos de 31 a 35 (NYAMS) de la SEQ ID NO: 19, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o • una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos de 50 a 66 de la SEQ ID NO: 19 (TISRSGSYSYFPDSVQG), la SEQ ID NO: 21 TISRSGSYSYYPDSVKG o la SEQ ID NO: 25 (TISRSGSYSYYADSVKG), en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos de 99 a 110 (LGGYDEGDAMDS) de la SEQ ID NO: 19, en donde uno, dos o tres de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente.

y dicho segundo sitio de reconocimiento de antígeno puede tener una cadena ligera que comprende:

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos de 24 a 39 (KSSQSLLESDGKTYLN) de la SEQ ID NO: 20, en donde uno, dos o tres de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse con un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos de 55 a 61 (LVSILDS) de la SEQ ID NO: 20, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse con un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos de 94 a 102 (LQATHFPQT) de la SEQ ID NO: 20, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse con un residuo de aminoácido diferente.

Dichas sustituciones de aminoácidos pueden ser sustituciones conservadoras, como se describe más abajo.

Por tanto, un fragmento de anticuerpo específico del TFPI (1-79) se combina con un fragmento de anticuerpo específico del dominio KPI-2 del mismo para formar un anticuerpo biespecífico en, entre otros formato de fusión, formato de fragmento de IgG, formato de IgG de longitud completa o como conjugado Fab-Fab (BiFab).

En una de tales modalidades, un fragmento Fab que lleva las regiones VH y VL del mAb 1F91 (SEQ ID NO: 10, 11) se combina con un fragmento Fab que lleva las regiones VH, VL del mAb 2021 (SEQ ID NO: 19, 20).

En una de tales modalidades, un fragmento Fab que lleva las regiones VH y VL del mAb 1F91 (SEQ ID NO: 10, 11) se combina con un fragmento Fab 0094 (SEQ ID ^{N o :} 21, 22).

En una de tales modalidades, un fragmento Fab que lleva las regiones VH y VL del mAb 1F91 (SEQ ID NO: 10, 11) se combina con un fragmento Fab 0313 (SEQ ID ^{N o :} 25, 26).

En una de tales modalidades, un fragmento Fab que lleva las regiones VH y VL del mAb 2F3 (SEQ ID NO: 4, 5) se combina con un fragmento Fab que lleva las regiones VH, VL del mAb 2021 (SEQ ID NO: 19, 20).

En una de tales modalidades, un fragmento Fab que lleva las regiones VH y VL del mAb 2F3 (SEQ ID NO: 4, 5) se combina con un fragmento Fab 0094 (SEQ ID NO: 21, 22).

En una de tales modalidades, un fragmento Fab que lleva las regiones VH y VL del mAb 2F3 (SEQ ID NO: 4, 5) se combina con un fragmento Fab 0313 (SEQ ID NO: 25, 26).

En una de tales modalidades, un fragmento Fab que lleva las regiones VH y VL del mAb 2F22 (SEQ ID NO: 6, 7) se combina con un fragmento Fab que lleva las regiones VH, VL del mAb 2021 (SEQ ID NO: 19, 20).

En una de tales modalidades, un fragmento Fab que lleva las regiones VH y VL del mAb 2F22 (SEQ ID NO: 6, 7) se combina con un fragmento Fab 0094 (SEQ ID NO: 21, 22).

En una de tales modalidades, un fragmento Fab que lleva las regiones VH y VL del mAb 2F22 (SEQ ID NO: 6, 7) se combina con un fragmento Fab 0313 (SEQ ID NO: 25, 26).

En una de tales modalidades, un fragmento Fab que lleva las regiones VH y VL del mAb 2F45 (SEQ ID NO: 8, 9) se combina con un fragmento Fab del mAb 2021 (SEQ ID NO: 19, 20).

En una de tales modalidades, un fragmento Fab que lleva las regiones VH y VL del mAb 2F45 (SEQ ID NO: 8, 9) se combina con un fragmento Fab 0094 (SEQ ID NO: 21, 22).

En una de tales modalidades, un fragmento Fab que lleva las regiones VH y VL del mAb 2F45 (SEQ ID NO: 8, 9) se combina con un fragmento Fab 0313 (SEQ ID NO: 25, 26).

Un conjugado Fab-Fab (BiFab) de acuerdo con la presente invención puede ser BiFab 9041 (Fab 0088 (SEQ ID NO: 23, 24) conjugado con Fab 0295 (SEQ ID NO: 15, 18).

Otro conjugado Fab-Fab (BiFab) de acuerdo con la presente invención puede ser BiFab 9042, que es Fab 0313 (SEQ ID NO: 25, 26) conjugado con Fab 0295 (SEQ ID NO: 15, 18).

En una modalidad, un anticuerpo biespecífico en formato de longitud completa (mAb 0421) que consiste de brazos individuales de mAb 0310 (SEQ ID NO: 27, 28) y mAb 0336 (SEQ ID n O: 15, 29). Un anticuerpo variante puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, hasta 10 o más sustituciones y/o deleciones y/o inserciones de aminoácidos de las secuencias y fragmentos específicos discutidos anteriormente. Las variantes de "deleción" pueden comprender la deleción de aminoácidos individuales, la deleción de pequeños grupos de aminoácidos tales como 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, o la deleción de regiones de aminoácidos más grandes, tales como la deleción de un dominio de aminoácido específico u otras características. Las variantes de "inserción" pueden comprender la inserción de aminoácidos individuales, la inserción de pequeños grupos de aminoácidos tales como 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, o la inserción de regiones de aminoácidos más grandes, tales como la inserción de un dominio de aminoácido específico u otras características. Las variantes de "sustitución", preferentemente, implican la sustitución de uno o más aminoácidos con el mismo número de aminoácidos y la realización de sustituciones de aminoácidos conservadoras. Por ejemplo, un aminoácido puede sustituirse con un aminoácido alternativo que tiene propiedades similares, por ejemplo, otro aminoácido básico, otro aminoácido ácido, otro aminoácido neutro, otro aminoácido cargado, otro aminoácido hidrófilo, otro aminoácido hidrófobo, otro aminoácido polar, otro aminoácido aromático u otro aminoácido alifático. Algunas propiedades de los 20 aminoácidos principales que pueden usarse para seleccionar sustituyentes adecuados son las siguientes:

Las “variantes” o “derivados” preferentes incluyen aquellas en las que en lugar del aminoácido de origen natural que aparece en la secuencia comprende un análogo estructural del mismo. Los aminoácidos usados en las secuencias también pueden derivatizarse o modificarse, por ejemplo, marcarse, lo que proporciona que la función del anticuerpo no se vea afectada adversamente de manera significativa.

Las sustituciones pueden ser, pero no se limitan a, sustituciones conservadoras.

Los derivados y variantes como se describió anteriormente pueden prepararse durante la síntesis del anticuerpo o por modificación posterior a la producción, o cuando el anticuerpo está en forma recombinante mediante el uso de las técnicas conocidas de mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis aleatoria o escisión enzimática y/o ligadura de ácidos nucleicos.

La invención también se refiere a polinucleótidos que codifican anticuerpos de la invención. Por tanto, un polinucleótido de la invención puede codificar cualquier anticuerpo como se describe en la presente descripción. Los términos “molécula de ácido nucleico” y “polinucleótido” se usan indistintamente en la presente descripción y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Los ejemplos no limitantes de polinucleótidos incluyen un gen, un fragmento génico, ARN mensajero (ARNm), ADNc, polinucleótidos recombinantes, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Un polinucleótido de la invención puede proporcionar, en una forma aislada o purificada. Una secuencia de ácido nucleico que “codifica” un polipéptido seleccionado es una molécula de ácido nucleico que se transcribe (en el caso del ADN) y se traduce (en el caso del ARNm) en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan por un codón de iniciación en el extremo 5' (amino) y un codón de detención de la traducción en el extremo 3' (carboxi). Para los propósitos de la invención, tales secuencias de ácido nucleico pueden incluir, pero no se limitan a, ADNc a partir de ARNm viral, procariota o eucariota, secuencias genómicas de ADN o ARN viral o procariota, e incluso secuencias de ADN sintéticas. Una secuencia de terminación de la transcripción puede ubicarse en dirección 3' a la secuencia codificante.

En una modalidad, un polinucleótido de la descripción comprende una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos de VH o VL como se describió anteriormente. Por ejemplo, un polinucleótido de la descripción puede codificar un polipéptido que comprende la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 4-11, 14-15 o 17-26, como se describió anteriormente. Una secuencia de polinucleótidos adecuada puede ser alternativamente una variante de una de estas secuencias de polinucleótidos específicas. Por ejemplo, una variante puede ser una variante de sustitución, deleción o adición de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico anteriores. Un polinucleótido variante puede comprender 1,2, 3, 4, 5, hasta 10, hasta 20, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 75 o más sustituciones y/o deleciones de ácidos nucleicos de las secuencias dadas en el listado de secuencias.

Las variantes adecuadas pueden ser al menos 70 % homólogas a un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente descripción, preferentemente al menos 80 o 90 % y con mayor preferencia al menos 95 %, 97 % o 99 % homólogas al mismo. Los métodos para medir la homología se conocen bien en la técnica y los expertos en la técnica entenderán que en el presente contexto, la homología se calcula sobre la base de la identidad del ácido nucleico. Tal homología puede existir en una región de al menos 15, preferentemente al menos 30, por ejemplo, al menos 40, 60, 100, 200 o más nucleótidos contiguos. Tal homología puede existir en toda la longitud de la secuencia de polinucleótidos no modificada.

En la técnica se conocen métodos para medir la homología o identidad de polinucleótidos. Por ejemplo, el paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que puede usarse para calcular la homología (por ejemplo, usado en su configuración predeterminada) (Devereux y otros (1984) Nucleic Acids Research 12: 387-395).

Los algoritmos PILEUP y BLAST también pueden usarse para calcular la homología o alinear secuencias (típicamente en su configuración predeterminada), por ejemplo, como se describe en Altschul S.F. (1993) J Mol Evol 36: 290-300; Altschul, S.F. y otros (1990) J Mol Biol 215: 403-10.

El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero un par de secuencias de alta puntuación (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta que coinciden o satisfacen alguna puntuación umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se conoce como el umbral de puntuación de palabras de vecindario (Altschul y otros, supra). Estos aciertos de palabras vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP que las contengan. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde pueda aumentarse la puntuación de alineación acumulativa. Las extensiones de los aciertos de palabras en cada dirección se detienen cuando: la puntuación de alineación acumulativa llega a cero o por debajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se llega al final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLAST usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10 915-10 919) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4 y una comparación de ambas hebras.

El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias; ver, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787.

El término “antígeno” (Ag) en la presente descripción se refiere a la entidad usada para la inmunización de un vertebrado inmunocompetente para producir el anticuerpo (Ac) que reconoce el Ag. En el contexto de la presente invención, los antígenos adecuados incluyen TFPI humano (1-161) y TFPIa humano de longitud completa. En la presente descripción, el Ag se denomina más ampliamente y generalmente pretende incluir moléculas diana que se reconocen específicamente por el Ac, por tanto, incluye fragmentos o miméticos de la molécula usada en el proceso de inmunización, u otro proceso, por ejemplo, la exposición en fagos, usado para generar el Ac.

El término “epítopo”, como se usa en la presente, se define en el contexto de una interacción molecular entre un “polipéptido de unión a antígeno”, tal como un anticuerpo (Ac), y su antígeno correspondiente (Ag). Generalmente, “epítopo” se refiere al área o región en un Ag a la que se une específicamente un Ac, es decir, el área o región en contacto físico con el Ab. El contacto físico puede definirse mediante el uso de varios criterios (por ejemplo, un límite de distancia de 2-6 A, tal como 3 A, tal como 4 A, tal como 5 A; o la accesibilidad a solventes) para átomos en las moléculas de Ac y Ag. Un epítopo de proteína puede comprender residuos de aminoácidos en el Ag que se involucran directamente en la unión a un Ac (también llamado el componente inmunodominante del epítopo) y otros residuos de aminoácidos, que no se involucran directamente en la unión, tal como los residuos de aminoácido del Ag que se bloquean efectivamente por el Ac, es decir, residuos de aminoácidos dentro de la "superficie excluida al solvente" y/o la "huella" del Ac.

El término “epítopo” en la presente descripción comprende ambos tipos de región de unión en cualquier región particular del TFPI que se une específicamente a un anticuerpo del TFPI mono o biespecífico, u otro agente específico del TFPI de acuerdo con la invención, a menos que se indique de cualquier otra manera. El TFPI puede comprender un número de epítopos diferentes, que pueden incluir, sin limitación, (1) epítopos peptídicos lineales (2) epítopos conformacionales que consisten en uno o más aminoácidos no contiguos ubicados cerca entre sí en la conformación del TFPI maduro; y (3) epítopos postraduccionales que consisten, ya sea en su totalidad o en parte, en estructuras moleculares unidas covalentemente al TFPI, tales como grupos de carbohidratos.

El epítopo para un par anticuerpo (Ac)/antígeno (Ag) dado puede describirse y caracterizarse a niveles diferentes de detalle mediante el uso de una variedad de métodos experimentales y computacionales de mapeo de epítopos. Los métodos experimentales incluyen mutagénesis, cristalografía de rayos X, espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (r Mn ), Espectrometría de Masa de Intercambio de Deuterio de Hidrógeno (HX-MS) y diversos métodos de unión por competencia; métodos que se conocen en la técnica. Como cada método depende de un principio único, la descripción de un epítopo se relaciona íntimamente con el método mediante el cual se ha determinado. Por lo tanto, en dependencia del método de mapeo de epítopos empleado, el epítopo para un par Ac/Ag dado puede describirse de manera diferente.

A su nivel más detallado, el epítopo para la interacción entre el Ag y el Ac puede describirse mediante las coordenadas espaciales que definen los contactos atómicos presentes en la interacción Ag-Ac, así como también la información acerca de sus contribuciones relativas a las termodinámicas de unión. A un nivel menos detallado, el epítopo puede caracterizarse mediante las coordenadas espaciales que definen los contactos atómicos entre el Ag y el Ac. A un nivel incluso menos detallado el epítopo puede caracterizarse por los residuos de aminoácidos que comprende cómo se define por criterios específicos tales como la distancia entre, o la accesibilidad a solventes de, los átomos en el complejo Ac:Ag. A un nivel aún menos detallado, el epítopo puede caracterizarse a través de la función, por ejemplo, mediante la unión por competencia con otros Ac. Además, el epítopo puede definirse más genéricamente como que comprende residuos de aminoácidos cuya sustitución por otro aminoácido alterará las características de la interacción entre el Ac y el Ag.

En el contexto de una estructura cristalina derivada por rayos X definida por coordenadas espaciales de un complejo entre un Ac, por ejemplo, un fragmento Fab, y su Ag, el término epítopo en la presente descripción, a menos que se especifique de cualquier otra manera o se contradiga por el contexto, se define específicamente, como residuos del TFPI que tiene un átomo pesado (es decir, un átomo que no es hidrógeno) dentro de una distancia de 4 A a partir de un átomo pesado en el Ac.

A partir del hecho de que las descripciones y definiciones de epítopos, en dependencia del método de mapeo de epítopos usado, se obtienen a niveles diferentes de detalle, se deduce que la comparación de epítopos para Ac diferentes en el mismo Ag puede conducirse de manera similar en niveles diferentes de detalle.

Se dice que los epítopos descritos a nivel de los aminoácidos, por ejemplo, determinados a partir de una estructura de rayos X, son idénticos si contienen el mismo conjunto de residuos de aminoácidos. Se dice que los epítopos se solapan si los epítopos comparten al menos un aminoácido. Se dice que los epítopos están separados (son únicos) si los epítopos no comparten ningún residuo de aminoácido.

La definición del término “paratopo” deriva de la definición anterior de “epítopo” al invertir la perspectiva. Por lo tanto, el término “paratopo” se refiere al área o región en el Ac al que se une específicamente un Ag, es decir, con lo que hace contacto físico con el Ag.

En el contexto de una estructura cristalina, derivada por rayos X definida por coordenadas espaciales de un complejo entre un Ac, tal como un fragmento Fab, y su Ag, el término paratopo en la presente descripción, a menos que se especifique de cualquier otra manera o se contradiga por el contexto, se define específicamente, como residuos del Ag que se caracteriza por tener un átomo pesado (es decir, un átomo que no es hidrógeno) dentro de una distancia de 4 A a partir de un átomo pesado en el TFPI.

El epítopo y el paratopo para un par anticuerpo (Ac)/antígeno (Ag) dado pueden identificarse mediante métodos de rutina. Por ejemplo, la ubicación general de un epítopo puede determinarse mediante la evaluación de la capacidad de un anticuerpo para unirse a fragmentos o variantes diferentes de polipéptidos del TFPI. Los aminoácidos específicos dentro del TFPI que hacen contacto con un anticuerpo (epítopo) y los aminoácidos específicos en un anticuerpo que hacen contacto con el TFPI (paratopo) también pueden determinarse mediante el uso de métodos de rutina. Por ejemplo, el anticuerpo y la molécula diana pueden combinarse y el complejo Ac:Ag puede cristalizarse. La estructura cristalina del complejo puede determinarse y usarse para identificar sitios específicos de interacción entre el anticuerpo y su diana.

Los anticuerpos que se unen al mismo antígeno pueden caracterizarse con respecto a su capacidad de unirse simultáneamente a su antígeno común y pueden someterse a “unión por competencia”/“unión”. En el presente contexto, el término “unión” se refiere a un método para agrupar anticuerpos que se unen al mismo antígeno. La “unión” de anticuerpos puede basarse en la unión por competencia de dos anticuerpos a su antígeno común en ensayos basados en técnicas estándar tales como resonancia de plasmones superficiales (SPR), ELISA o citometría de flujo.

Una “unión” del anticuerpo se define mediante el uso de un anticuerpo de referencia. Si un segundo anticuerpo es incapaz de unirse a un antígeno al mismo tiempo que el anticuerpo de referencia, se dice que el segundo anticuerpo pertenece a la misma “unión” que el anticuerpo de referencia. En este caso, el anticuerpo de referencia y el segundo anticuerpo se unen competitivamente a la misma parte de un antígeno y se denominan “anticuerpos competitivos”. Si un segundo anticuerpo es capaz de unirse a un antígeno al mismo tiempo que el anticuerpo de referencia, se dice que el segundo anticuerpo pertenece a una “unión” separada. En este caso, el anticuerpo de referencia y el segundo anticuerpo no se unen competitivamente a la misma parte de un antígeno y se denominan “anticuerpos no competitivos”.

La “unión” del anticuerpo no proporciona información directa acerca del epítopo. Los anticuerpos competitivos, es decir, anticuerpos que pertenecen a la misma “unión” pueden tener epítopos idénticos, epítopos superpuestos o incluso epítopos separados. Este último es el caso si el anticuerpo de referencia unido a su epítopo en el antígeno toma el espacio requerido para que el segundo anticuerpo entre en contacto con su epítopo en el antígeno (“ impedimento estérico”). Los anticuerpos no competitivos generalmente tienen epítopos separados.

El término “afinidad de unión” se usa en la presente descripción como una medida de la fuerza de una interacción no covalente entre dos moléculas, por ejemplo, un anticuerpo, o fragmento del mismo y un antígeno. El término "afinidad de unión" se usa en la presente descripción para describir tanto interacciones monovalentes como bivalentes (actividad intrínseca).

La afinidad de unión entre dos moléculas, por ejemplo, un anticuerpo, o el fragmento del mismo, y un antígeno, a través de una interacción monovalente puede cuantificarse mediante la determinación de la constante de disociación de equilibrio (Kd). A su vez, la Kd puede determinarse mediante la medición de la cinética de la formación y disociación de complejos, por ejemplo, mediante el método SPR. Las constantes de velocidad correspondientes a la asociación y la disociación de un complejo monovalente se denominan como la constante de la tasa de asociación ka (o kon) y constante de la tasa de disociación kd (o koff), respectivamente. Kd se relaciona con ka y kd a través de la ecuación Kd _ kd/ka.

Después de la definición anterior, las afinidades de unión asociadas con diferentes interacciones moleculares, tales como la comparación de la afinidad de unión de diferentes anticuerpos para un antígeno dado, pueden compararse mediante la comparación de los valores de Kd para los complejos individuales anticuerpo/antígeno.

Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede competir con otra molécula, tal como un ligando o receptor u otro anticuerpo de origen natural, para unirse al TFPI y de esta manera afectar las funciones asociadas con estas interacciones. La capacidad de un anticuerpo para competir con un ligando/receptor natural puede evaluarse mediante diversos ensayos de actividad que miden el efecto en la K aparente, para la inhibición del TFPI. Los valores Kd pueden deducirse entonces a partir de los valores aparentes de Ki. Típicamente, el valor de interés de la Kd para el anticuerpo con respecto a la diana (TFPI) será 2 veces, preferentemente 5 veces, con mayor preferencia 10 veces menor que el valor de la Kd de otros ligandos del TFPI. Con mayor preferencia, la Kd será 50 veces menor, tal como 100 veces menor, o 200 veces menor; incluso aún con mayor preferencia 500 veces menor, tal como 1000 veces menor o 10 000 veces menor.

El valor de esta constante de disociación puede determinarse directamente mediante métodos bien conocidos. Los ensayos estándar para evaluar la capacidad de unión de ligandos tales como anticuerpos hacia las dianas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, ELISA, transferencias Western, RIA, calorimetría isotérmica de titulación y análisis de citometría de flujo. La cinética de unión y la afinidad de unión del anticuerpo pueden evaluarse, además, mediante ensayos estándar conocidos en la técnica, tales como SPR.

Puede realizarse un ensayo de unión competitiva en el que la unión del anticuerpo a la diana se compara con la unión de la diana por otro ligando de esa diana, tal como otro anticuerpo.

Un anticuerpo biespecífico como se describe en la presente descripción puede unirse al TFPI o TFPI (1-161) de longitud completa con una mayor afinidad y/o avidez que la afinidad combinada de sus respectivos "brazos".

Un anticuerpo biespecífico como se describe en la presente descripción puede unirse al TFPI de longitud completa con una mayor afinidad y/o avidez de la que se une al TFPI (1-96), TFPI (1-76), TFPI (26-76), TFPI (77-161), TFPI (97-147) y/o cualquier otro fragmento del TFPI, como se describe en la presente descripción.

Un anticuerpo biespecífico como se describe en la presente descripción puede tener una Kd para el TFPI de longitud completa o TFPI (1-161) de 1 * 10'11 M o menos, o 1 * 10'12 M o menos, o 1 * 10'13 M o menos, o 1 * 10'14 M o menos, o 1 * 10'15 M o menos.

Cualquier "brazo" de un anticuerpo biespecífico de la invención, puede tener una Kd por su objetivo de 1 * 10‘5 M o menos, 1 * 10‘6 M o menos, 1 * 10'7 M o menos, 1 * 10'8 M o menos, o 1 * 10‘9 M o menos, o 1 * 10'1° M o menos, 1 * 1°'11 M o menos, o 1 * 1°'12 M o menos, o 1 * 1°'13 M o menos, o 1 * 1°'14 M o menos, o 1 * 1°'15 M o menos. La Kd de un anticuerpo de la presente invención puede ser menor que 0,8 nM, tal como menor que 0,7 nM, tal como menor que 0,6 nM, tal como menor que 0,5 nM, tal como menor que 0,4 nM, tal como menor que 0,3 nM, tal como menor que 0,2 nM, tal como menor que 0,1 nM, tal como menor que 0,05 nM, tal como menor que 0,025 nM, tal como menor que 0,015 nM, tal como entre 0,015 nM y 0 nM.

En un aspecto, un conjugado biespecífico de dos anticuerpos (de longitud completa) o fragmentos Fab como se describe en la presente descripción comprende un aglutinante TFPI (1-79) y un aglutinante TFPI KPI-2, en donde la Kd del aglutinante TFPI (1-79) es 2 * 10‘9 M o menos, 3 * 10‘9 M o menos, 4 * 10‘9 M o menos, 5 * 10‘9 M o menos, 6 * 10'9 M o menos, 7 * 10‘9 M o menos, 8 * 10‘9 M o menos, 9 * 10‘9 M o menos, 1 * 10'8 M o menos, 2 * 10'8 M o menos, 3 * 10'8 M o menos, 4 * 10'8 M o menos, 5 * 10'8 M o menos, 6 * 10'8 M o menos, 7 * 10'8 M o menos, 8 * 10 8 M o menos, 9 * 108 M o menos, 1 * 107 M o menos, 2 * 107 M o menos, 3 * 107 M o menos, 4 * 107 M o menos, 5 * 107 M o menos, 6 * 107 M o menos, 7 * 107 M o menos, 8 * 107 M o menos, 9 * 107 M o menos, 1 * 106 M o menos, 2 * 106 M o menos, 3 * 106 M o menos, 4 * 106 M o menos, 5 * 106 M o menos, 6 * 106 M o menos, 7 * 10 6 M o menos, 8 * 106 M o menos, 9 * 106 M o menos, 1 * 105 M o menos, 2 * 105 M o menos, 3 * 105 M o menos, 4 * 105 M o menos, 5 * 105 M o menos, 6 * 105 M o menos, 7 * 105 M o menos, 8 * 105 M o menos, 9 * 105 M o menos.

En un aspecto, la Kd del aglutinante TFPI (1-79) está en el intervalo de 5 * 107 M hasta 1 * 105 M. En uno de esos aspectos, el Kd del aglutinante TFPI (1-79) está en el intervalo 1 * 107 M hasta 1 * 105 M. En uno de esos aspectos, el Kd del aglutinante TFPI (1-79) está en el intervalo 1 * 107 M hasta 1 * 106 M.

En un aspecto, la Kd del aglutinante TFPI (1-79) está en el intervalo de 5 * 107 M hasta 1 * 107 M.

En un aspecto, la Kd del aglutinante TFPI (1-79) está en el intervalo de 1 * 107 M hasta 5 * 105 M.

En un aspecto, el aglutinante TFPI (1-79) es una variante de mAb 2F22, Fab 0295 o Fab 0296 que comprende una o más sustituciones.

En un aspecto, el aglutinante KPI-2 es una variante de mAb 2021, mAb 0310, Fab 0088 o Fab 0313 que comprende una o más sustituciones.

En un aspecto, un conjugado biespecífico de dos anticuerpos (de longitud completa) o fragmentos Fab como se describe en la presente descripción comprende un aglutinante TFPI (1-79) y un aglutinante TFPI KPI-2, en donde la Kd del aglutinante KPI-2 es 2 * 109 M o menos, 3 * 109 M o menos, 4 * 109 M o menos, 5 * 109 M o menos, 6 * 10 9 M o menos, 7 * 109 M o menos, 8 * 109 M o menos, 9 * 109 M o menos, 1 * 108 M o menos, 2 * 108 M o menos, 3 * 108 M o menos, 4 * 108 M o menos, 5 * 108 M o menos, 6 * 108 M o menos, 7 * 108 M o menos, 8 * 108 M o menos, 9 * 108 M o menos, 1 * 107 M o menos, 2 * 107 M o menos, 3 * 107 M o menos, 4 * 107 M o menos, 5 * 10 7 M o menos, 6 * 107 M o menos, 7 * 107 M o menos, 8 * 107 M o menos, 9 * 107 M o menos, 1 * 106 M o menos, 2 * 106 M o menos, 3 * 106 M o menos, 4 * 106 M o menos, 5 * 106 M o menos, 6 * 106 M o menos, 7 * 106 M o menos, 8 * 106 M o menos, 9 * 106 M o menos, 1 * 105 M o menos, 2 * 105 M o menos, 3 * 105 M o menos, 4 * 10 5 M o menos, 5 * 105 M o menos, 6 * 105 M o menos, 7 * 105 M o menos, 6 * 105 M o menos, 5 * 105 M o menos, 4 * 105 M o menos, 3 * 105 M o menos, 2 * 105 M o menos, 1 * 105 M o menos.

En un aspecto, la Kd del aglutinante KPI-2 está en el intervalo de 5 * 10‘7 M hasta 1 * 10‘5 M. En uno de esos aspectos, el Kd del aglutinante KPI-2 está en el intervalo 1 * 10‘7 M hasta 1 * 10‘5 M. En uno de esos aspectos, el Kd del aglutinante KPI-2 está en el intervalo 1 * 10‘7 M hasta 1 * 10‘6 M.

En un aspecto, la Kd del aglutinante KPI-2 está en el intervalo de 5 * 10‘7 M hasta 1 * 10‘7 M.

En un aspecto, la Kd del aglutinante KPI-2 está en el intervalo de 1 * 10-7 M hasta 5 * 10-5 M.

En un aspecto, un anticuerpo biespecífico como se describe en la presente descripción comprende un aglutinante TFPI (1-79) que tiene una Kd en el intervalo 1 * 10-9 M hasta 1 * 10-6 M y un aglutinante KPI-2 que tiene una Kd en el intervalo 1 * 10-14 M hasta 1 * 10-10 M. En uno de esos aspectos, la Kd del aglutinante TFPI (1-79) está en el intervalo de 1 * 10'8 M hasta 1 * 10'6 M y la Kd del aglutinante KPI-2 está en el intervalo de 1 * 10'14 hasta 1 * 10'11 M.

En un aspecto, un anticuerpo biespecífico como se describe en la presente descripción comprende un aglutinante TFPI (1-79) que tiene una Kd en el intervalo 1 * 10'14 M hasta 1 * 10'1° M y un aglutinante KPI-2 que tiene una Kd en el intervalo 1 * 10'12 M hasta 1 * 10'11 M.

En un aspecto, un anticuerpo biespecífico como se describe en la presente descripción comprende un aglutinante TFPI (1-79) que tiene una Kd en el intervalo 1 * 10'12 M hasta 1 * 10'1° M y un aglutinante KPI-2 que tiene una Kd en el intervalo 1 * 10'12 M hasta 1 * 10'8 M. En uno de esos aspectos, la Kd del aglutinante TFPI (1-79) está en el intervalo de 1 * 10'11 M hasta 5 * 10'10 M y la Kd del aglutinante Kp I-2 está en el intervalo de 1 * 10'10 hasta 1 * 10'8 M.

En un aspecto, el aglutinante TFPI (1-79) es mAb 0336 y el aglutinante KPI-2 es mAb 0310.

En un aspecto, el aglutinante KPI-2 es Fab 0088. En un aspecto alternativo, el aglutinante KPI-2 es Fab 0094. En otro aspecto alternativo, el aglutinante KPI-2 es Fab 0313.

En un aspecto, Fab 0094, Fab 0313, Fab 0094 o Fab 0088 se combinan con un aglutinante KPI-1 el cual es una variante de Fab 0295 que comprende una o más sustituciones.

En un aspecto, se obtiene un efecto sinérgico sobre la generación de trombina al combinar dos fragmentos de anticuerpo que se unen al TFPI (1-79) y TFPI KPI-2, respectivamente, en un anticuerpo biespecífico.

En un aspecto, se obtiene un efecto sinérgico sobre la generación de trombina al combinar dos fragmentos Fab que se unen al TFPI (1-79) y TFPI KPI-2, respectivamente, en un Fab biespecífico (BiFab).

En un aspecto, el efecto sinérgico mencionado anteriormente puede estar presente incluso cuando se reduce la afinidad de uno de los brazos de un anticuerpo biespecífico o Fab contra su diana.

En un aspecto, los anticuerpos biespecíficos de la presente invención pueden competir con FXa, TF/FVIIa y/o TF/FVI-Ia/FXa por la unión al TFPI.

En un aspecto, la presente invención proporciona composiciones y formulaciones que comprenden moléculas de la invención, tales como los anticuerpos biespecíficos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos TFPI biespecíficos de la invención, formulada junto con un portador aceptable farmacéuticamente.

En consecuencia, un objeto de la invención es proporcionar una formulación farmacéutica que comprende tal anticuerpo TFPI biespecífico que está presente en una concentración de 0,25 mg/ml a 250 mg/ml, y en donde dicha formulación tiene un pH de 2,0 a 10,0. La formulación puede comprender además, uno o más de un sistema tampón, un conservante, un agente de tonicidad, un agente quelante, un estabilizador o un surfactante, así como también diversas de sus combinaciones. El uso de conservantes, agentes isotónicos, agentes quelantes, estabilizadores y surfactantes en la composiciones farmacéuticas es bien conocido por los expertos en la técnica. Puede hacerse referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edición, 1995.

En una modalidad, la formulación farmacéutica es una formulación acuosa. Tal formulación es, típicamente, una solución o una suspensión pero puede incluir además coloides, dispersiones, emulsiones, y materiales multifase. El término “formulación acuosa” se define como una formulación que comprende al menos 50 % p/p de agua. Igualmente, el término “solución acuosa” se define como una solución que comprende al menos 50 % p/p de agua y el término “suspensión acuosa” se define como una suspensión que comprende al menos 50 % p/p de agua.

En otra modalidad, la composición farmacéutica es una formulación liofilizada, a la que el médico o el paciente añaden solventes y/o diluyentes antes de usar.

En un aspecto adicional, la formulación farmacéutica comprende una solución acuosa de tal anticuerpo y un tampón, en donde el anticuerpo se presenta en una concentración de 1 mg/ml o más, y en donde dicha formulación tiene un pH de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10,0.

Puede usarse un anticuerpo biespecífico o una formulación farmacéutica que lo comprenda para tratar a un sujeto con una coagulopatía.

El término “sujeto”, como se usa en la presente descripción, incluye cualquier paciente humano, o vertebrado no humano.

El término “coagulopatía”, como se usa en la presente descripción, se refiere a una mayor tendencia hemorrágica que puede originarse por cualquier deficiencia cualitativa o cuantitativa de cualquier componente procoagulativo de la cascada de coagulación normal, o por cualquier regulación positiva de la fibrinólisis. Tales coagulopatías pueden ser congénitas y/o adquiridas y/o iatrogénicas y se identifican por un experto en la técnica.

Los ejemplos no limitantes de hipocoagulopatías congénitas son la hemofilia A, la hemofilia B, la deficiencia del Factor VII, la deficiencia del Factor X, la deficiencia del Factor XI, la enfermedad de von Willebrand y las trombocitopenias tales como la trombobastenia de Glanzmann y el síndrome de Bernard-Soulier. Dicha hemofilia A o B puede ser grave, moderada o leve. La gravedad clínica de la hemofilia se determina por la concentración de unidades funcionales de FIX/FVIII en la sangre y se clasifica como leve, moderada o grave. La hemofilia grave se define por un nivel del factor de coagulación de < 0,01 U/ml correspondiente a < 1 % del nivel normal, mientras que los pacientes moderados y leves tienen niveles de 1-5 % y > 5 %, respectivamente. La hemofilia A con "inhibidores" (es decir, los aloanticuerpos contra el factor VIII) y la hemofilia B con "inhibidores" (es decir, los aloanticuerpos contra el factor IX) son ejemplos no limitantes de coagulopatías que son parcialmente congénitas y parcialmente adquiridas.

Un ejemplo no limitante de una coagulopatía adquirida es la deficiencia de serina proteasa causada por la deficiencia de la vitamina K; tal deficiencia de la vitamina K puede provocarse por la administración de un antagonista de vitamina K, tal como la warfarina. La coagulopatía adquirida puede producirse, además, después de un trauma extenso. En este caso, conocido de cualquier otra manera como el “ciclo vicioso de sangramiento”, se caracteriza por hemodilución (trombocitopenia por dilución y dilución de factores de coagulación), hipotermia, consumo de factores de coagulación y trastornos metabólicos (acidosis). La terapia con fluidos y el aumento de la fibrinólisis pueden exacerbar esta situación. Dicha hemorragia puede ser de cualquier parte del cuerpo.

Un ejemplo no limitante de una coagulopatía iatrogénica es una sobredosificación de medicamentos anticoagulantes, tales como heparina, aspirina, warfarina y otros inhibidores de la agregación plaquetaria, que pueden prescribirse para tratar una enfermedad tromboembólica. Un segundo ejemplo no limitante de coagulopatía iatrogénica es la que se induce por una terapia de líquidos excesiva y/o inapropiada, tal como la que puede inducirse mediante una transfusión de sangre.

En una modalidad de la presente invención, la hemorragia se asocia con la hemofilia A o B. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con la hemofilia A o B con inhibidores adquiridos. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con trombocitopenia. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con la enfermedad de von Willebrand. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con graves daños tisulares. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con trauma grave. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con cirugía. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con gastritis y/o enteritis hemorrágica. En otra modalidad, la hemorragia es un sangrado uterino profuso, tal como en el desprendimiento de la placenta. En otra modalidad, la hemorragia se produce en órganos con una posibilidad limitada de hemostasia mecánica, tal como intracraneal, intraauricular o intraocular. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con terapia anticoagulante.

El término “tratamiento”, como se usa en la presente descripción, se refiere a la terapia médica de cualquier sujeto humano u otro vertebrado que lo necesite. Se espera que dicho sujeto se haya sometido a un examen físico por parte de un profesional médico, o un profesional médico veterinario, que haya dado un diagnóstico tentativo o definitivo que indicaría que el uso de dicho tratamiento específico es beneficioso para la salud de dicho humano u otro vertebrado. El momento y el propósito de dicho tratamiento pueden variar de una persona a otra, de acuerdo con el status quo de la salud del sujeto. Por lo tanto, dicho tratamiento puede ser profiláctico, paliativo, sintomático y/o curativo. En términos de la presente invención, los tratamientos profilácticos, paliativos, sintomáticos y/o curativos pueden representar aspectos separados de la invención.

Un anticuerpo de la invención puede administrarse por vía parenteral, tal como por vía intravenosa, tal como por vía intramuscular, tal como por vía subcutánea. Es preferente la administración subcutánea. Alternativamente, un anticuerpo de la invención puede administrarse por medio de una vía no parenteral, tal como por vía perioral o tópica. Un anticuerpo de la invención puede administrarse profilácticamente. Un anticuerpo de la invención puede administrarse terapéuticamente (a demanda).

En una modalidad, los anticuerpos biespecíficos de la presente invención se usan para medir los niveles de TFPIa in vitro.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitantes adicionales.

Ejemplos

Ejemplo 1: Inmunización, fusión y cribado

Los ratones RBF se inmunizaron con el TFPI humanoa (SEQ ID NO: 1) o TFPI (1-161) (SEQ ID NO: 2). Los ratones se inyectaron por vía subcutánea: 20 |jg del TFPI humano se mezcló con adyuvante completo de Freund para la primera inyección. Para las inmunizaciones subsecuentes, se usó adyuvante incompleto de Freund con la misma concentración del antígeno. Diez días después de la inmunización final, se cribó la sangre ocular de los ratones, mediante el uso de ELISA, para anticuerpos específicos del TFPI humano. Los ratones con títulos positivos de suero recibieron una dosis de refuerzo de 10 jg del TFPI humanoa o TFPI (1-161) mediante inyección intravenosa y se sacrificaron después de tres días. Los bazos se retiraron asépticamente y se dispersaron en una suspensión de célula única. La fusión de las células del bazo y las células de mieloma se realizó por medio del método PEG o mediante electrofusión. Las células de hibridomas resultantes se clonaron mediante dilución limitante en placas de microtitulación. Los sobrenadantes de los hibridomas individuales se cribaron inicialmente mediante ELISA para determinar la expresión de anticuerpos capaces de unirse al TFPI de longitud completaa o TFPI (1-161). Para identificar hibridomas que producen anticuerpos específicos para TFPI (1-79), los hibridomas positivos para unirse al TFPI de longitud completaa o TFPI (1-161) se cribaron nuevamente para determinar la unión al fragmento TFPI KPI-2 (representado por los residuos de aminoácidos 97-147 de la SEQ ID NO: 1). Los hibridomas positivos para la unión al TFPI (1-161) y negativos para la unión al fragmento TFPI KPI-2 se aislaron y expandieron para la producción de anticuerpos.

Los anticuerpos se purificaron a partir de sobrenadantes mediante cromatografía de afinidad de proteína A estándar y se usaron para determinar la unión y afinidad al TFPI humanoa y al TFPI (1-79) y la actividad de neutralización del TFPI en plasma (ensayo TGT). Los hibridomas que producen anticuerpos de interés, es decir, aquellos específicos para el TFPI (1-79) se subclonaron mediante dilución limitante y el perfil de anticuerpo original se verificó para el material de los hibridomas subclonados. Las células de los hibridomas subclonados se usaron para el aislamiento de ARN y la subsecuente clonación de anticuerpos e identificación de secuencias.

Ejemplo 2: Clonación y secuenciación de anticuerpos específicos de ratón específicos anti TFPI (1-79) humano

Este ejemplo describe la clonación y la secuenciación de las secuencias de cadena pesada y cadena ligera murina de los anticuerpos del TFPI mAb 2F3, mAb 2F22, mAb 2F45, mAb 1F56 y mAb 1F91. El ARN total se extrajo de células de hibridoma mediante el uso del kit RNeasy-Mini de Qiagen y se usó como molde para la síntesis de ADNc. El ADNc se sintetizó en una reacción 5'-RACE mediante el uso del kit de amplificación SMARt ™ RACE ADNc de Clontech. La amplificación subsecuente dirigida de las secuencias HC y LC se realizó por PCR mediante el uso de polimerasa Phusion Hot Start (Finnzymes) y la mezcla de cebadores universales (UPM) incluida en el kit SMART™ RACE como cebador directo. El cebador inverso con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 12 se usó para la amplificación de la HC (dominio VH) y el cebador inverso con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 13 se usó para la amplificación de la LC. Los productos de PCR se separaron mediante electroforesis en gel, se extrajeron mediante el uso del kit GFX PCR DNA & Gel Band Purification de GE Healthcare Bio-Sciences y se clonaron para la secuenciación mediante el uso de un kit de clonación Zero Blunt TOPO PCR y un TOP10 químicamente competente E. coli (Life Technologies). La PCR de colonia se realizó en colonias seleccionadas mediante el uso de una mezcla AmpliTaq Gold Master de Applied Biosystems y cebadores M13uni/M13rev. La limpieza del PCR de colonias se realizó mediante el uso de la mezcla de enzimas ExoSAP-IT (USB). La secuenciación se realizó en MWG Biotech, Martinsried Alemania mediante el uso de cebadores de secuenciación M13uni(-21)/M13rev(-29). Las secuencias se analizaron y anotaron mediante el uso del programa Vector NTI Advance 11 (Life Technologies). Todos los kits y reactivos se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Una sola subclase única de LC kappa murina y una sola subclase única de HC murina, subclase IgG1 se identificaron para cada uno de los hibridomas: mAb 2F3, mAb 2F22, mAb 2F45 y mAb 1F91. Las secuencias de LC y de HC del mAb 1F56 mostraron que este anticuerpo es idéntico en secuencia al mAb 1F91. Las secuencias de aminoácidos para las secuencias de cadena pesada variables y cadena ligera variable (excluyendo las secuencias de péptidos líderes) se muestran en las SEQ ID NO: 4-11.

Generación de vectores de expresión para LC y HC de anticuerpos

Los vectores de expresión basados en el promotor de CMV (vectores pTT) se generaron para la expresión transitoria de las versiones quiméricas humanas-murina del mAb 2F22. Los vectores pTT se desarrollaron para la expresión transitoria de proteínas por Yves Durocher (Durocher y otros Nucleic Acid Research, 2002). Además del promotor de CMV, los vectores basados en pTT contienen un origen pMB1, un origen EBV y el gen de resistencia a Amp.

Se generó un vector de expresión para una cadena ligera del mAb quimérico 2F22, que porta la región variable de cadena ligera 2F22 murina y una región constante kappa humana para la expresión de mAb 0294, Fab 0296 y Fab 0295 (SEQ ID NO: 15). Se generaron vectores de expresión para una cadena pesada del mAB quimérico 2F22 que porta la región variable de cadena pesada 2F22 murina y una región constante de IgG4 humana (S241P) de longitud completa para la expresión del mAb 0294 (SEQ ID NO: 17) o las regiones constantes de IgG4 humanas truncadas para la expresión de Fab 0296 (SEQ ID NO: 14) o la expresión de Fab 0295 (SEQ ID NO: 18).

El vector de expresión LC basado en pTT se generó para la expresión transitoria de un anticuerpo mAb 2F22 quimérico y un fragmento de anticuerpo. Inicialmente, la región correspondiente a los dominios VL del mAb 2F22 se amplificó por PCR en una reacción de 2 etapas a partir de un clon de secuenciación TOPO original, mediante el uso de cebadores específicos para las secuencias de los extremos N y C terminales. El péptido señal murino original se intercambió por el péptido señal de CD33 humano mediante PCR superpuesta en 2 etapas. Los cebadores sentido primarios portan la parte C-terminal de la secuencia del péptido señal de CD33 y el cebador sentido secundario contenía un sitio de restricción HindIII para propósitos de clonación, una secuencia de Kozak (5'-GCCGCCACC-3') inmediatamente aguas arriba del codón de inicio ATG y la parte N-terminal de las secuencias del péptido señal de CD33. El cebador antisentido contiene un sitio de restricción BsiWI en el marco en la secuencia de transición VL/CL. El fragmento amplificado se clonó en un vector basado en pTT linealizado que contenía la secuencia para un dominio CL kappa humano y subsecuentemente se transformó en E. coli para la selección. La secuencia de la construcción final se verificó mediante secuenciación de ADN.

Los vectores de expresión del HC basados en pTT se generaron para la expresión transitoria de un mAb 2F22 y fragmentos Fab 2F22 quiméricos. El mAb y los fragmentos quiméricos se denominan mAb 0294, Fab 0296 y Fab 0295, respectivamente. Inicialmente, la región correspondiente al dominio VH del mAb 2F22 se amplificó por PCR en una reacción de 2 etapas a partir de un clon de secuenciación TOPO original, mediante el uso de cebadores específicos para las secuencias de los extremos N y C terminales. El péptido señal murino original se intercambió por el péptido señal de CD33 humano mediante PCR superpuesta en 2 etapas. Los cebadores sentido primarios portan la parte C-terminal de la secuencia del péptido señal de CD33 y el cebador sentido secundario contenía un sitio de restricción HindIII para propósitos de clonación, una secuencia de Kozak (5'-GCCGCCACC-3') inmediatamente aguas arriba del codón de inicio ATG y la parte N-terminal de las secuencias del péptido señal de CD33. El cebador antisentido contiene un sitio de restricción NheI en marco en la transición VH/CH. Para la generación del vector de expresión de1HC de longitud completa (HC del mAb 0294), el fragmento de PCR del dominio VH generado se digirió mediante enzimas de restricción y se clonó en un vector basado en pTT linealizado que contiene la secuencia para una región constante de IgG4 (S241P) humana. La mutación de la Serina 241 a Prolina en la región bisagra de IgG4 se incluye para estabilizar el anticuerpo IgG4 mediante la eliminación de la formación de mitades de anticuerpos. La posición mutada en la bisagra se refiere como S241P cuando se numera de acuerdo con Kabat o alternativamente S228P, cuando se numera de acuerdo con el índice de la EU.

Para la generación del vector de expresión de HC truncado para la expresión de Fab 0296, el fragmento de PCR del dominio VH generado se digirió mediante enzimas de restricción y se clonó en un vector linealizado basado en pTT que contiene la secuencia para una región constante de IgG4 humana truncada. La HC basada en IgG4 se truncó en la región de bisagra después del residuo de lisina en la bisagra de IgG4 humana como se observó en la secuencia de la HC de Fab 0296 (SEQ ID NO: 14). La reacción de clonación se transformó subsecuentemente en E. coli para la selección. La secuencia de la construcción final se verificó mediante secuenciación de ADN.

Para la generación del vector de expresión de HC truncado para la expresión de Fab 0295, el fragmento de PCR del dominio VH generado se digirió mediante enzimas de restricción y se clonó en un vector linealizado basado en pTT que contiene la secuencia para una segunda región constante de IgG4 humana truncada. La HC basada en IgG4 para Fab 0295 se truncó en la región de bisagra después del primer residuo de cisteína de la bisagra de IgG4 humana como se observó en la secuencia de la HC de Fab 0295 (SEQ ID NO: 18). La reacción de clonación se transformó subsecuentemente en E. coli para la selección. La secuencia de la construcción final se verificó mediante secuenciación de ADN.

Expresión y purificación del mAb y los fragmentos Fab

Los anticuerpos anti-TFPI y fragmentos Fab se expresaron transitoriamente en cultivos en suspensión de células EXPI293F (Life Technologies), mediante la cotransfección de los vectores de expresión de LC y ^{H c} basado en pTT. El siguiente procedimiento describe el protocolo de transfección genérico utilizado para las células EXPI293F adaptadas a la suspensión.

Transfección EXPI293F

1) Inicialmente se preparan diluciones separadas de ADN y reactivo de transfección.

a) Usar un total de 1 |jg del vector de ADN (vector LC 0,5 ug y vector HC 0,5 ug) por ml de cultivo celular. Diluir el ADN en medio Opti-MEM (Gibco) 50 j l medio/jg ADN, mezclar e incubar a temperatura ambiente (23-25 °C) durante 5 min.

b) Usar Expifectamin™ 293 (Life Technologies) como reactivo de transfección a una concentración de 2,7 |jl por jg de ADN. Diluir la solución Expifectamin™ 18,5X en medio Opti-MEM (Gibco), mezclar e incubar a temperatura ambiente (23-25 °C) durante 5 min.

2) Mezclar ADN y las diluciones de Expifectamin™ 293 y dejar incubar a temperatura ambiente (23-25 °C) durante 10 min.

3) Añadir la mezcla ADN-Expifectamin™ 293 directamente al cultivo celular EXPI293F.

a) En el momento de la transfección la densidad celular del cultivo EXPI293F debe ser 2,8-3,2 x 106 células/ml.

4) Transferir el cultivo celular transfectado a una incubadora de agitación orbital a 36,5 °C, CO2 al 8 % y 85-125 rpm.

5) 18 horas después de la transfección, añadir 5 ul de Expifectamin™ 293 Transfection Enhancer1/ml de cultivo y 50 ul de Expifectamin™ 293 Transfection Enhancer2/ml de cultivo y se retorna el cultivo a una incubadora de agitación orbital a 36,5 °C, 8 % CO2 y 85-125 rpm.

6) 5 días después de la transfección, los sobrenadantes del cultivo celular se recolectaron mediante centrifugación, seguido de filtración a través de una unidad de filtro PES de 0,22 pm (Corning).

Protocolo de purificación general

Las variantes de mAb se purificaron por cromatografía de afinidad estándar mediante el uso de resina MabSelect SuRe de GE Health-care de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos purificados se intercambiaron al tampón PBS pH 7,2.

Los fragmentos Fab se purificaron mediante cromatografía de afinidad estándar mediante el uso de resina KappaSelect desarrollada por GE Healthcare. Los fragmentos Fab purificados se intercambiaron al tampón PBS pH 7,2. La evaluación de la calidad y la determinación de la concentración se realizaron mediante SEC-HPLC.

Ejemplo 3: Unión de anticuerpos

Competencia entre los anticuerpos TFPI 1F91, 2F3, 2F22, 2F45, MBS532510 (MyBioSource.com), 10R-T141A (Fitzgerald Industries International) y Bay 2A8-K95L para unirse al TFPI de longitud completaa se midió mediante el uso de interferometría de biocapa (instrumento Fortebio Octet RED384, PALL Life Sciences). (Bay 2A8 es una variante de anticuerpo IgG4 (S241P) humano del 2A8 Fab, descrito en el documento WO2010/017196. Bay 2A8-K95L es una variante de anticuerpo IgG4 (S241P) humano de Bay 2A8 que lleva la sustitución K95L (numeración de Kabat) en HC CDR3 (idéntica a la sustitución encontrada en "Fab B" con relación a 2A8 como se describe en el documento WO2012/135671).) mAb 1F91, mAb 2F3, mAb 2F22, mAb 2F45 y Bay 2A8-K95L se marcaron aleatoriamente con biotina en residuos de lisina mediante el uso de una relación 1:1,2 mol de mAb:mol de biotina-reactivo (Thermo Scientific núm. de cat. 21335) y de cualquier otra manera siguiendo las especificaciones del fabricante. El anticuerpo marcado con biotina se capturó en los sensores de estreptavidina Fortebio (PALL Life Sciences) seguido de la unión de TFPI humanoa seguido de la unión de los mAb 1F91, mAb 2F3, mAb 2F22, mAb 2F45, Bay 2A8-K95L, MBS532510 o 10R-T141A. Los resultados se muestran en la Tabla 1 (Negro significa que los mAb compiten por la unión al TFPI. Gris significa que los mAb no compiten por la unión al TFPI).

Estos datos muestran que los anticuerpos se encuentran en 3 epítopos diferentes, lo que indica que tienen diferentes epítopos de unión. Unión 1: mAb 1F91, MBS532510 y 10R-T141A. Unión 2: mAb 2F3, 2F22 y 2f45. Unión 3: Bay2A8 K95L.

Tabla 1: Competencia entre los anticuerpos del TFPI indicados para unirse al TFPI

Ejemplo 4: Estructura cristalina del TFPI (1-79) en complejo con un fragmento Fab del mAb 2F22

La estructura 3D de la parte N-terminal del TFPI humano (1-79), que consiste en una región N-terminal ácida y un dominio inhibidor de proteasa tipo Kunitz 1 (KPI-1) (SEQ ID NO: 16), en complejo con un fragmento Fab, Fab 0296 (SEQ ID NO: 14 y 15) del mAb 2F22 se determinó a alta resolución mediante el uso de la cristalografía de rayos X. Los resultados demuestran que el anticuerpo es capaz de unirse al KPI-1 del TFPI y parte del N-terminal anterior. Los residuos resultantes del epítopo del TFPI humano comprenden Leu 16, Pro 17, Leu 19, Lys 20, Leu 21, Met 22, Phe 25, Cys 35, Ala 37, Met 39, Arg 41, Tyr 56, Gly 57, Gly 58, Cys 59, Glu 60, Gly 61, Asn 62, Gln 63, Arg 65, Phe 66, Glu 67, Glu 71 y Met 75 (SEQ ID NO: 2).

Materiales y Métodos

Para fines cristalográficos se generaron los vectores de expresión basados en promotores de CMV (vectores pTT) para la expresión transitoria del fragmento Fab correspondiente al fragmento de anticuerpo mAb 2F22 para la cristalografía como se describió en el Ejemplo 2.

El fragmento Fab del mAb 2F22 se expresó en una forma quimérica murina-humana del Fab 0296 (SEQ ID NO: 14 y 15) en células EXPI293F y se purificó mediante cromatografía de afinidad estándar mediante el uso de resina KappaSelect como se describió en el Ejemplo 2.

El TFPI KPI-1 humano, que incluye la parte N-terminal del TFPI humano, y, adicionalmente, una etiqueta GSSGSSG unida en el extremo N terminal (SEQ ID NO: 16) y Fab 0296 que consiste en una cadena ligera correspondiente a la SEQ ID NO: 15 y un fragmento de cadena pesada que corresponde a la SEQ ID NO: 14, ambos en un tampón de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (4 tabletas en 2 litros de agua, GIBCO núm. de cat. 18912-014, Invitrogen Corporation), se mezclaron con un exceso molar ligero (1,1:1) de las especies del TFPI. Después, el complejo se concentró a aproximadamente 10,0 mg/ml mediante el uso de un filtro de centrífuga Amicon Ultra-4 con corte de peso molecular de 10000 Da. Los cristales se crecieron con la técnica de gota sentada mediante el uso de una placa TTP IQ de 96 pocillos de TTP Lab Tech núm.: 4150-05800 y 100 pl de solución de precipitante por pocillo. La solución precipitante contenía PEG 335020 % p/v, formato de potasio 200 mM y se mezcló con la solución de proteína en una relación de 3:1. El tamaño de la gota total inicial fue de 200 nl y los cristales aparecieron después de unos pocos días. Se preparó un cristal para criocongelar mediante la transferencia de 1 |jl de una mezcla de solución de congelación que contiene 75 % de la solución precipitante y 25 % de glicerol a la gota que contiene el cristal. El remojo se dejó durante aproximadamente 2 minutos. Después se tomó el cristal, se congeló inmediatamente en N2 líquido y se mantuvo a una temperatura de 100 K mediante una corriente de gas N2 criogénico durante la recogida de datos. Se recogieron los datos cristalográficos, a una resolución de 1,65 A en la línea del haz BL911-3 en MAX-lab, Lund, Suecia. La determinación, la integración y el escalado de los datos del grupo espaciador se realizaron mediante el paquete del programa informático XDS [Kabsch, W., J.Appl.Crystallogr., (1993), Vol. 26, páginas 795-800]. Se determinó que el grupo espaciador es C2 y los parámetros de celda para los datos de sincrotrón se determinaron como 89,010, 66,660, 106,110 A, respectivamente, y con un p ángulo de 111,18°. El R-sym a la resolución de 1,65 A fue de 8,4 % y la totalidad de 99,5 %. La media de intensidad/sigma (intensidad) de reflexiones únicas fue igual a 2,0 a aproximadamente 1,8 A de resolución.

El método de sustitución molecular (MR) se usó para la determinación de la estructura mediante el uso de las coordenadas de una molécula Fab con el código de acceso 1NGZ [Yin, J. y otros, Proc Natl Acad Sci USA. 4 de febrero de 2003 (100), vol. 100, páginas 856-861] del Protein Data Bank (PDB) [Berman, HM y otros, Nucleic Acids Res., (2000), vol. 28, páginas 235-242]. La molécula Fab se dividió en dos dominios, los dominios variable y constante, que cada uno se usó como modelo de búsqueda en los cálculos de MR. El programa informático Molrep [Vagin, A. y otros, J. Appl. Crystallogr., (1997), Vol. 30, páginas 1022-1025] del paquete Cc P4 [Collaborative Computational Project, N., Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography, (1994), Vol. 50, páginas 760-763] se usó para encontrar las posiciones de los dominios Fab constante y variable. El dominio KPI-1 no se encontró en la etapa de MR, sin embargo, el mapa de la diferencia de densidad de electrones indicó las posiciones aproximadas de las moléculas del dominio KPI-1 en esta etapa. Las mejoras de la densidad de electrones mediante el programa informático DM del paquete de programa informático CCP4, seguido de mejoras de modelos y fases automatizadas mediante el uso del programa informático ARP-wARP [Langer, G. y otros, Nat Protoc, (2008), Vol. 3, páginas 1171-1179] [Murshudov, G. N. y otros, Acta Crystallographica, Section D, Biological Crystallography, (2011), Vol. 67, páginas 355-367] proporcionaron una estructura casi completa tanto de la molécula Fab 0296 como de la estructura del dominio KPI-1, y parte del extremo N-terminal que antecede el dominio KPI-1. Para el TFPI (SEQ ID NO: 2) los residuos del 15 al 77 se incluyeron en el modelo de rayos X que, además del dominio KPI-1 también incluye algunos residuos del extremo N-terminal de KPI-1 (residuos 26-76). Para el fragmento Fab 0296, se observan los residuos de la cadena ligera 1 a 212 y los residuos de la cadena pesada 1 a 221. Se registró un procedimiento de inspección de gráficos por computadora de los mapas de densidad de electrones, correcciones de modelos y creación mediante el uso del programa informático Coot [Emsley, P. y otros, Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr., (2004), Vol. 60, páginas 2126-2132] seguido de mejoras cristalográficas, mediante el uso de los programas informáticos Refmac5 [Murshudov, G. N. y otros, Acta Crystallographica, Section D, Biological Crystallography, (2011), Vol. 67, páginas 355-367] del paquete de programas informático CCP4. El procedimiento se sometió a ciclos hasta que no se pudieron hacer mejoras significativas adicionales al modelo. La R final y la R libre para todos los datos a una resolución de 1,65 A fueron O, 192 y 0,220, respectivamente.

Resultados

El cálculo de las áreas promedio excluidas en interacciones por pares mediante el programa informático Areaimol [Lee, B. y otros, J Mol Biol, (1971), Vol. 55, páginas 379-400] [Saff, E. B. y otros, Math Intell, (1997), Vol. 19, páginas 5-11] del paquete de programas de CCP4 [Collaborative Computational Project, N., Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography, (1994), Vol. 50, páginas 760-763] proporcionó para el complejo molecular fragmento de TFPI humano/fragmento Fab mAb 2F22 anti-TFPI de la estructura cristalina 1195 A2.

Los contactos directos entre el TFPI KPI-1, que incluye la parte N-terminal del TFPI observada en la estructura cristalina, (SEQ ID NO: 2) y el Fab 0296 (SEQ ID NO: 14 y 15), se identificaron mediante la ejecución del programa informático Contacts del paquete de programas CCP4 [Bailey, S., Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr., (1994), Vol. 50, páginas 760-763] mediante el uso de una distancia de corte de 4,0 A entre el Fab 0296 y las moléculas de fragmentos del TFPI. Los resultados de la estructura cristalina del complejo fragmento TFPI soluble/Fab 0296 se muestran en la Tabla 2.

Se encontró que el epítopo resultante de TFPI KPI-1, que incluye la región N-terminal de TFPI, para Fab 0296 comprende los siguientes residuos del TFPI (mediante el uso de la numeración de secuencias de la SEQ ID NO: 2): Leu 16, Pro 17, Leu 19, Lys 20, Leu 21, Met 22, Phe 25, Cys 35, Ala 37, Met 39, Arg 41, Tyr 56, Gly 57, Gly 58, Cys 59, Glu 60, Gly 61, Asn 62, Gln 63, Arg 65, Phe 66, Glu 67, Glu 71 y Met 75. Evaluados a partir de distancias, interacciones carga-carga, enlaces de hidrógeno, interacciones polares e hidrófobas y baja accesibilidad a los disolventes, los siguientes residuos parecen ser residuos particularmente importantes del epítopo: Arg 41, Arg 65 y Glu 67 (SEQ ID NO: 2).

Por tanto, el epítopo de TFPI del mAb 2F22 (representado por Fab 0296) comprende residuos que anteceden al dominio KPI-1, que incluye una a -hélice corta en el extremo N-terminal, residuos en el bucle antes de las p-cadenas 1 del dominio KPI-1 y residuos al inicio de la p-cadena 1. Además, incluye residuos en el extremo de la p-cadena 2 y residuos en el bucle entre la p-cadena 2 y la a -hélice del extremo C-terminal de KPI-1 y los residuos dentro de la a -hélice del extremo C-terminal de KPI-1.

Por lo tanto, los resultados muestran que Fab 0296, y por lo tanto el mAb 2F22 se unen específicamente a TFPI KPI-1 y parte de la región N-terminal anterior.

El paratopo de Fab 0296 para TFPI KPI-1, incluye los residuos Val 2, Phe 27, Tyr 32, Trp 52, Arg 53, Gly 54, Gly 55, Ser 56, Ile 57, Asp 58, Tyr 59, Ala 61, Met 64, Lys 97, Ser 99, His 100, Asn 102, Tyr 103, Val 104, Gly 105 y Tyr 106 de la cadena pesada (H) (SEQ ID NO: 14, Tabla 4), y los residuos Pro 31, Ala 32, Tyr 49, Ser 50, Asn 53, Tyr 55, Thr 56, Tyr 91, Thr 92, Ser 93 y Tyr 94 de la cadena ligera (L) (SEQ ID NO: 15, Tabla 2).

Tabla 2: Datos de la estructura cristalina del complejo TFPI (1-79)/Fab 0296 de las interacciones de TFPI KPI-1, cadena K, (SEQ ID NO: 2) con la cadena pesada (cadena H) de Fab 0296 (SEQ ID NO: 14) y la cadena ligera (cadena L) de Fab 0296 (SEQ ID NO: 15) para el complejo cristalográfico. Se usó una distancia de corte de 4,0 A. Los contactos se identificaron mediante el programa informático de computadoras CONTACT del paquete de CCP4 /Collaborative Computational Project, N., Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography, (1994), Vol. 50, páginas 760­ 763]. En la última columna "***" indica una posibilidad grande para un enlace de hidrógeno en este contacto (distancia < 3,3 A) como se calculó mediante CONTACT, "*" indica una posibilidad baja (distancia > 3,3 A). El blanco indica que el programa consideró que no existe posibilidad de un enlace de hidrógeno. Los enlaces de hidrógeno son específicos entre un donante y un aceptor, son típicamente fuertes y se identifican fácilmente.

Estos resultados muestran que Fab 0296 anti-TFPI se une específicamente a TFPI KPI-1 y parte del extremo N-terminal anterior.

Ejemplo 5: Clonación y modificación por ingeniería genética de mAb 2021 y de variantes de mAb 2021

Este ejemplo describe la clonación y la modificación por ingeniería genética del anticuerpo anti-TFPI: mAb 2021 y variantes del mismo.

El ARN total se extrajo de células de hibridoma M-hTFPI 4F36A1 B2 mediante el uso del kit RNeasy-Mini de Qiagen y se usó como molde para la síntesis de ADNc. El ADNc se sintetizó en una reacción 5'-RACE mediante el uso del kit de amplificación SMART™ RACE ADNc de Clontech. La amplificación subsecuente dirigida de las secuencias HC y LC se realizó por PCR mediante el uso de polimerasa Phusion Hot Start (Finnzymes) y la mezcla de cebadores universales (UPM) incluida en el kit SMART™ RACE como cebador directo. Se usó un cebador inverso con la siguiente secuencia para la amplificación de HC (dominio VH):

5'-CCCTTGACCAGGCATCCCAG-3' (SEQ ID NO: 12)

Se usó un cebador inverso con la siguiente secuencia para la amplificación de LC:

5'-GCTCTAGACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG-3' (SEQ ID NO: 13)

Los productos de PCR se separaron mediante electroforesis en gel, se extrajeron mediante el uso del kit GFX PCR DNA & Gel Band Purification de GE Healthcare Bio-Sciences y se clonaron para la secuenciación mediante el uso de un kit de clonación Zero Blunt TOPO PCR y un TOP10 químicamente competente E.coli (Invitrogen). La PCR de colonia se realizó en colonias seleccionadas mediante el uso de una mezcla AmpliTaq Gold Master de Applied Biosystems y cebadores M13uni/M13rev. La limpieza del PCR de colonias se realizó mediante el uso de la mezcla de enzimas ExoSAP-IT (USB). La secuenciación se realizó en Eurofins MWG Operon, Alemania, mediante el uso de cebadores de secuenciación M13uni (-21)/M13rev (-29) o T3/T7. Las secuencias se analizaron y anotaron mediante el uso del programa VectorNTI. Todos los kits y reactivos se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se identificó una sola subclase única de LC kappa murina y una sola subclase única de HC murina, subclase IgG1.

Generación de vectores de expresión para el anti-HzTFPI4F36A1B2 injertado

Se generó una serie de vectores de expresión basados en el promotor de CMV (vectores pTT) para la expresión transitoria de anticuerpo/fragmento de anticuerpo anti-TFPI en el sistema de expresión HEK293-6E basado en EBNA desarrollado por Yves Durocher (Durocher y otros, Nucleic Acid Research, 2002). Además del promotor de CMV, los vectores basados en pTT contienen un origen pMB1, un origen EBV y el gen de resistencia a Amp.

En base a las secuencias de VH y VL anti-TFPI4F36A1B2 murinas clonadas, se diseñó una versión humanizada de anti-TFPI4F36 mediante injerto de CDR en secuencias de la línea germinal humana. Las secuencias de ADN para las regiones VH y VL de HzTFPI4F36 injertadas se sintetizaron (GENEART AG) de acuerdo con el diseño de humanización del anticuerpo descrito anteriormente. Las secuencias se obtuvieron con el injerto de CDR mínimo básico y sin mutaciones inversas adicionales. Las respectivas secuencias del péptido líder de la línea germinal LC y HC se incluyeron en las construcciones así como también una secuencia Kozak (5'-GCCGCCACC-3') inmediatamente aguas arriba del codón de inicio ATG.

Se generaron vectores de expresión basados en pTT para la expresión transitoria del anticuerpo HzTFPI4F36 injertado como un isotipo kappa/IgG4 humano (S241P). La mutación de prolina en la posición 241 (numeración de acuerdo con Kabat, correspondiente al residuo 228 según el sistema de numeración de la UE (Edelman G.M. y otros, Proc. Natl. Acad. USA 63, 78-85 (1969)) se introdujo en la bisagra IgG4 región para la formación eliminada de fragmentos de anticuerpos monoméricos, es decir, "semianticuerpos" compuestos por una LC y una HC.

Para el vector de expresión de HC, el fragmento VH se escindió mediante digestión con enzima de restricción del vector de clonación GENEART y se clonó en un vector basado en pTT linealizado que contenía la secuencia para un dominio CH de IgG4 (S241P) humana y posteriormente se transformó en E. coli para la selección. La secuencia de la construcción final se verificó mediante secuenciación de ADN. Para el vector de expresión de LC, el fragmento VL se escindió mediante digestión con enzima de restricción del vector de clonación GENEART y se clonó en un vector basado en pTT linealizado que contenía la secuencia para un dominio CL humano y posteriormente se transformó en E. coli para la selección. La secuencia de las construcciones finales se verificó mediante secuenciación de ADN.

Mutagénesis dirigida al sitio para aislar mAb 2021

Se generó una serie de mutaciones inversas de humano a ratón (denominadas mutaciones inversas) en la cadena ligera (LC) y la cadena pesada (HC) del HzTFPI4F36 injertado.

Se realizó la mutagénesis dirigida al sitio para introducir mutaciones inversas de humano a ratón (en lo sucesivo denominadas mutaciones inversas) en los residuos específicos en las construcciones HzTFPI4F36 LC/HC injertadas para optimizar las construcciones injertadas. Las mutaciones se introdujeron mediante dos métodos diferentes:

1. Los kits de mutagénesis dirigida al sitio o al sitio múltiple QuikChange® de Stratagene se usaron para introducir mutaciones puntuales y mutaciones combinadas. Los kits se usaron de acuerdo con el protocolo del fabricante.

2. También se usaron métodos estándar de la PCR superpuesta de 2 etapas para introducir mutaciones puntuales y generar mutaciones de combinación.

Los plásmidos de expresión LC y HC para HzTFPI4F36 injertado se usaron como plantillas para la mutagénesis. Las secuencias de todas las construcciones finales se verificaron mediante secuenciación de ADN.

Las secuencias finales para mAb 2021 HC llevan una región FR2 con 4 mutaciones inversas que hacen que la secuencia marco sea idéntica a la FR2 original de ratón y 3 mutantes CDR2, es decir, un total de 7 mutaciones inversas de HC (A40T, G42E, G44R, S49A, Y59F, A60P, K64Q) en comparación con la secuencia injertada original (numeración de acuerdo con Kabat). La secuencia LC es la secuencia LC injertada HzTFPI4F36. Las CDR y los marcos se definen de acuerdo con Kabat.

Las secuencias de aminoácidos para las regiones VH y VL del mAb 2021 final se enumeran como SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20, respectivamente.

Con el fin de mejorar el rendimiento de expresión, las secuencias del péptido señal original (secuencia de la línea germinal humana) tanto para HC como para LC, se intercambiaron por el péptido señal (SP) CD33 humano. Las secuencias del péptido señal se intercambiaron mediante amplificación por PCR estándar del fragmento de HC o LC con cebadores que contenían un elemento Kozak (GCCGCCACC), el codón de inicio y la secuencia señal CD33 (cebador con sentido) y el codón de terminación y sitio de restricción EcoRI (cebador antisentido). Los fragmentos amplificados se clonaron en vectores basados en pTT linealizados y se transformaron en E. coli para la selección. La secuencia de la construcción final se verificó mediante secuenciación de ADN.

Generación de variantes de menor afinidad de mAb 2021

Durante la humanización de anti-TFPI4F36A1B2 para obtener mAb 2021, se identificaron varias variantes de menor afinidad. Las variantes se generaron como se describió anteriormente mediante mutagénesis dirigida al sitio. El mAb 2007 representa variantes de afinidad baja. El mAb 2007 porta una sola retromutación de A60P en el dominio VH en comparación con la secuencia para el HzTFPI4F36 injertado (numeración de acuerdo con Kabat). La variante tiene afinidades de unión a TFPI que son menores en al menos un orden de magnitud, respectivamente, en comparación con mAb 2021. La variante HzTFPI4F36 injertada inicial (mAb 2000) exhibió afinidades de unión al TFPI aproximadamente tres órdenes de magnitud más bajas en comparación con mAb 2021.

Los vectores de expresión para la expresión de fragmentos Fab de mAb 2021 y variantes de mAb 2021 se generaron como se describe en el ejemplo 6.

Ejemplo 6: Componentes Fab para moléculas biespecíficas

Para los conjugados químicos Fab-Fab, se generó el vector de expresión para la expresión de HC truncada de mAb 2021. La clonación, humanización y expresión de mAb 2021 se describe en el documento WO2010/072691.

La HC basada en IgG4 de mAb 2021 se truncó en la región de bisagra después del primer residuo de cisteína de la bisagra en la región constante de la IgG4 humana de mAb 2021 como se observó en la SEQ ID NO: 23. El truncamiento deja la cisteína en el extremo C-terminal disponible para la conjugación química. La secuencia truncada se generó mediante el uso de clonación estándar basada en enzimas de restricción para introducir el fragmento VH de mAb 2021 HC en un vector de caja de herramientas basado en pTT linealizado que contenía la secuencia del dominio CH de IgG4 humana truncada. Las secuencias de todas las construcciones finales se verificaron mediante secuenciación de ADN. El fragmento Fab de mAb 2021 se expresó como Fab 0088, mediante el uso del vector LC mAb 2021 y el vector HC truncado descritos anteriormente (SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 23). El vector de expresión LC para Fab 0088 fue idéntico a la expresión LC para mAb 2021 que se generó como se describió anteriormente, es decir, el fragmento VL se cortó mediante digestión con enzima de restricción del vector de clonación GENEART y se clonó en un vector basado en pTT linealizado que contenía la secuencia para un dominio CL kappa humano. También se generaron vectores de expresión de cadena pesada para la expresión de variantes de menor afinidad de mAb 2021. Las variantes de mAb 2021 se originan a partir de la humanización de mAb 2021 y se describen en el documento WO2010/072691 y el Ejemplo 5. Para ensamblar los vectores de expresión, la región correspondiente al dominio VH de las HC de mAb 2007 y mAb 2000 descritos en el Ejemplo 5 se clonaron mediante el uso de clonación estándar basada en enzimas de restricción, en un vector de caja de herramientas basado en pTT linealizado que contenía la secuencia del dominio CH de la IgG4 humana truncada. Las HC basadas en IgG4 se truncaron después de la primera cisteína en la bisagra de IgG4, dejando la cisteína C-terminal disponible para la conjugación química. Las secuencias de las construcciones finales se verificaron mediante secuenciación de ADN. Los fragmentos Fab de menor afinidad de mAb 2007 y mAb 2000 se expresaron como Fab 0094 (SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22) y Fab 0313 (SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26), respectivamente. Fab 0094 y Fab 0313 tienen el mismo LC que Fab 0088.

Ejemplo 7a: Síntesis de 1,16-bis(2,5-pirrolediona-1-il)-4,13-diaza-7,10-dioxa-3,14-dioxohexadecano

Se disolvió ácido 3-(2,5-pirrolediona-1-il)propanoico (3,0 g, 18 mmol) en diclorometano (20 ml). La solución se añadió a resina de diciclohexilcarbodiimida inmovilizada prelavada (Novabiochem, núm. de producto 8.55029.0025, lote: S5092229036, 2,3 mmol/g, 10 g), volumen total de 100 ml. La mezcla se agitó durante 30 minutos.

Se añadió gota a gota una solución de 1,8-diamino-3,6-dioxaoctano (1,3 g, 8,9 mmol) en diclorometano (50 ml) a la solución en agitación durante un período de 60 minutos. La mezcla se agitó durante 2 h. La solución se filtró y se concentró al vacío hasta la sequedad. Rendimiento: 3,4 g de un sólido pardusco pálido.

El producto se caracterizó por LCMS ([M H]+: 451) y RMN (1H y 13C).

Una fracción del material preparado se calentó a 90 grados Celsius en anhídrido acético durante 3 h. La solución se enfrió, se mezcló con agua, se congeló y se liofilizó.

El producto se caracterizó por LCMS ([M Na]+: 473). Este material se usó para la conjugación descrita en los dos ejemplos siguientes.

Ejemplo 7b: Conjugación de Fab 0088 y Fab 0295 con 1,16-bis(2,5-pirrolediona-1-il)-4,13-diaza-7,10-dioxa-3,14-dioxohexadecano para producir BiFab 9041

Las soluciones de moléculas de Fab (4 mg de cada Fab) se ajustaron a 2,5 mg/ml (50 micromolar) en solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Una solución de sal dihidrato dipotásico de bis(sulfonatofenil)fenilfosfina (CAS: 151888-20-9, Sigma-Aldrich) disuelta en PBS se añadió a la solución de Fab en PBS hasta una concentración resultante de Fab 50 micromolar y 200 micromolar del reactivo de fosfina. Las soluciones se incubaron a temperatura ambiente durante la noche.

El Fab 0088 se cambió de tampón a tampón de acetato de sodio 15 mM, NaCl 1,0 M, pH 5,0 (volumen final de 1 ml mediante el uso de un filtro centrífugo Amicon Ultracel (MWCO 10 kDa, Millipore A/S, Hellerup, Dinamarca).

El Fab 0295 se cambió de tampón a tampón de acetato de sodio 15 mM, pH 4,5 mediante el uso de un filtro centrífugo Amicon Ultracel (MWCO 10 kDa, Millipore A/S, Hellerup, Dinamarca). Volumen final: 300 microlitros.

Se añadió 1,16-bis(2,5-pirrolediona-1-il)-4,13-diaza-7,10-dioxa-3,14-dioxohexadecano (5 mg) a la proteína Fab reducida. La mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante 50 minutos.

La muestra se cargó en una columna HiTrap SP HP (1 ml, preacondicionada en tampón de acetato de sodio 15 mM, pH 4,5, GE Healthcare Europe GmbH, DK-2605, Dinamarca). La proteína inmovilizada se lavó con tampón de acetato de sodio 15 mM, pH 4,5 (15 volúmenes de columna) y se eluyó con tampón de acetato de sodio 15 mM, NaCl 1 M, pH 5,0. Las dos soluciones de proteínas se mezclaron y concentraron mediante el uso de un filtro centrífugo Amicon Ultracel (MWCO 10 kDa, m W c O 10 kDa, Millipore A/S, Hellerup, Dinamarca). Volumen final: 100 microlitros.

La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 20 horas. La solución se cargó en una columna Superdex200 16/60 (GE Healthcare Europe GmbH, DK-2605, Dinamarca) que se había preacondicionado en HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,3. El compuesto BiFab 9041 se eluyó mediante el uso de dicho tampón. Las fracciones seleccionadas se agruparon, concentraron y analizaron mediante el uso de análisis SDS-PAGE, SEC-MALS, LCMS y determinación de secuencia de Edman.

Ejemplo 7c: Conjugación de Fab 0313 y Fab 0295 con 1,16-bis(2,5-pirrolediona-1-il)-4,13-diaza-7,10-dioxa-3,14-dioxohexadecano para producir BiFab 9042

Las soluciones de moléculas de Fab (5 mg de Fab 0313 y 7 mg de Fab 0295) se ajustaron a 2,5 mg/ml (50 micromolar) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Una solución de sal dihidrato dipotásico de bis (sulfonatofenil) fenilfosfina (núm. de CAS: 151888-20-9, Sigma-Aldrich) disuelta en PBS se añadió a la solución de Fab en PBS hasta una concentración resultante de Fab 50 micromolar y 200 micromolar del reactivo de fosfina. Las soluciones se incubaron a temperatura ambiente durante la noche.

El Fab 0313 se cambió de tampón a tampón de acetato de sodio 15 mM, NaCl 1,0 M, pH 5,0 (volumen final de 1 ml mediante el uso de un filtro centrífugo Amicon Ultracel (MWCO 10 kDa, Millipore A/S, Hellerup, Dinamarca).

El Fab 0295 se cambió de tampón a tampón de acetato de sodio 15 mM, pH 4,5 mediante el uso de un filtro centrífugo Amicon Ultracel (MWCO 10 kDa, Millipore A/S, Hellerup, Dinamarca). Volumen final: 300 microlitros.

Se añadió 1,16-bis(2,5-pirrolediona-1-il)-4,13-diaza-7,10-dioxa-3,14-dioxohexadecano (5 mg) a la proteína Fab reducida. La mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante 50 minutos.

La muestra se cargó en una columna HiTrap SP HP (1 ml, preacondicionada en tampón de acetato de sodio 15 mM, pH 4,5, GE Healthcare Europe GmbH, DK-2605, Dinamarca). La proteína inmovilizada se lavó con tampón de acetato de sodio 15 mM, pH 4,5 (15 volúmenes de columna) y se eluyó con tampón de acetato de sodio 15 mM, NaCl 1 M, pH 5,0.

Las dos soluciones de proteínas se mezclaron y concentraron mediante el uso de un filtro centrífugo Amicon Ultracel (MWCO 10 kDa, MWCO 10 kDa, Millipore A/S, Hellerup, Dinamarca). Volumen final: 100 microlitros.

La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 20 horas. La solución se cargó en una columna Superdex200 16/60 (GE Healthcare Europe GmbH, DK-2605, Dinamarca) que se había preacondicionado en HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,3. El compuesto BiFab 9042 se eluyó mediante el uso de dicho tampón. Las fracciones seleccionadas se agruparon, concentraron y analizaron mediante el uso de análisis SDS-PAGE, SEC-MALS, y LCMS.

Ejemplo 8: Análisis de la interacción de unión

Los estudios de unión se realizaron en un Biacore T200 (GEHealthcare) que mide las interacciones moleculares en tiempo real a través de la resonancia de plasmón de superficie. Los experimentos se realizaron a 25 °C y las muestras se almacenaron a 15 °C en el compartimento de muestras. La señal (RU, unidades de respuesta) informada por el analizador ProteOn se correlaciona directamente con la masa en los puntos de la superficie del chip del sensor individual en cuatro células de flujo seriado. Se inmovilizó el anticuerpo de cabra anti cadena ligera Fab Kappa (Nordic Biosite) en las cuatro células de flujo de un chip sensor CM4 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La captura de moléculas biespecíficas purificadas se llevó a cabo al diluir las proteínas en tampón de ejecución (Hepes 10 mM, NaCl 0,3 M, CaCl 5 mM2, 0,05% de surfactante P20, 10 mg/ml de BsA, pH 7,4) y se inyectó sobre la célula de flujo 2, 3 o 4, lo que crea una superficie de referencia en la célula de flujo 1 con solo anticuerpo anti-Fab inmovilizado. Las moléculas biespecíficas fueron mAb biespecífico 0421 (SEQ ID NO: 27, 28 y 15, 29) o BiFab 9041 (SEQ ID NO: 15, 18, 23, 24). La unión de las proteínas Tf P i FL (SEQ ID NO: 1), TFPI (1-79) y TFPI KPI-2 se realizó inyectando analito (antígeno) en todas las células de flujo para permitir análisis comparativos de la unión a moléculas biespecíficos capturados diferentes con relación a la unión a la superficie de referencia. El fragmento TFPI (1-79) abarca el dominio N-terminal y KPI-1 de TFPI con una etiqueta GSSGSSG unida en el extremo N (SEQ ID NO: 16). El fragmento TFPI KPI-2 abarca el dominio KPI-2 de TFPI con una etiqueta HIS6 en el extremo C terminal (SEQ ID NO: 3). Los antígenos se diluyeron en serie en tampón de ejecución, se inyectaron a 30 ml/min durante 240 segundos y se deja disociar durante 600 o 14 000 segundos. La prolongación del seguimiento de la fase de disociación de antígenos que se disocian lentamente con una kD de aproximadamente 1E- 5 s-1 es crucial para obtener un valor robusto para la tasa de disociación. La superficie de CM4 se regeneró después de cada ciclo de inyección de analito mediante inyección de glicina 10 mM, pH 2,1. Esta etapa de regeneración eliminó la molécula biespecífica anti-TFPI y cualquier antígeno unido de la superficie del anticuerpo de captura inmovilizado, y permitió la unión posterior del siguiente par de muestras de interacción. El procedimiento de regeneración no eliminó el anticuerpo de captura anti-Fab humano, inmovilizado directamente, de la superficie del chip.

La afinidad de unión entre un BiFab o un mAb biespecífico y el antígeno se cuantificó mediante la determinación de la constante de disociación en equilibrio (Kd) determinada por la medición de la cinética de formación y disociación de complejos. Las constantes de velocidad correspondientes a la asociación y la disociación de un complejo monovalente como ka (tasa de asociación) y kd (tasa de disociación) se recuperaron mediante datos de ajuste global al modelo de Langmuir 1:1 con Rmax local mediante el uso del software de evaluación Biacore para el análisis de datos. La Kd se relaciona con ka y kd a través de la ecuación Kd = kd/ka.

Las curvas de unión se procesaron por referencia doble (sustracción de señales de superficie de referencia así como también inyecciones de tampón en blanco sobre moléculas biespecíficas capturadas antes del análisis de datos). Esto permitió corregir el ruido del instrumento, el cambio de volumen y la deriva durante las inyecciones de muestra.

Tabla 3: Cinética de interacción para las proteínas TFPI que se unen a moléculas biespecíficas

Resultados de las mediciones de las constantes de unión ka (tasa de asociación), kd (tasa de disociación) y Kd (constante de disociación de equilibrio) para la interacción de TFPI (1-79) o KPI-2 humano con diferentes moléculas biespecíficas.

No se encontraron grandes diferencias en BiFab 9041 y mAb 0421 en la unión de TFPI (1-79) y la unión de TFPI KPI-2 (Tabla 3). La unión de TFPI FL muestra un perfil de unión diferente, en comparación con los dominios de TFPI individuales, a ambas moléculas biespecíficas en que la unión parece estar influenciada por la unión multivalente o por avidez incluso a bajas densidades de ligando dando lugar a una mayor afinidad aparente. La unión de TFPI FL a mAb 0421 y BiFab 9041 tiene formas de curvas de unión similares que demuestran que al introducir la unión biespecífica mediante la conjugación química de dos fragmentos de anticuerpo como en el BiFab usado en este ejemplo, se logra el mismo efecto sobre el perfil de unión que para un anticuerpo biespecífico (cf. Figura 3).

Ejemplo 9: Ensayo de generación de trombina

El efecto de los anticuerpos sobre la generación de trombina se estudió en plasma humano normal (CryoCheck Normal Plasma). El inicio de la coagulación se indujo mediante la recalcificación y adición de factor tisular 1 pM con vesículas de fosfolípidos 4 |jM (PPP-Reactivo bajo). El plasma similar a hemofilia A se obtuvo mediante la adición de 100 jg/m l de anticuerpo generado en oveja anti-FVIII humano (Haematologic Technologies Inc., PAHFVIII-S). Cuando se indicó se añadió TFPI humano recombinante exógeno 10-20 nMa (SEQ ID NO: 1) al plasma. La actividad de trombina se evaluó continuamente después de la conversión del sustrato fluorogénico Z-Gly-Gly-Arg-AMC.HCl (I-1140) de Bachem (Bubendorf, Suiza). La fluorescencia se midió en una placa de microtitulación de fluorómetro Fluorskan Ascent (Thermo Labsystems, Helsinki, Finlandia) con longitudes de onda de excitación y emisión en 368 y 460 nm, respectivamente. Se usó un calibrador para permitir el cálculo de la cantidad de trombina formada y la corrección de las unidades de fluorescencia relativa obtenida para los efectos del filtro interno y el consumo del sustrato fluorogénico. Además, se restó la contribución a la conversión del sustrato mediante el complejo trombina-a 2-macroglobulina. Estas correcciones se realizaron automáticamente por medio del programa informático de trombograma automatizado (CAT) calibrado proporcionado por Thrombinoscope BV (Maaestricht, Holanda). Los primeros derivados de los datos que se obtuvieron del rendimiento de la generación de la curva de trombina, permitieron el cálculo de i) tiempo de retraso, ii) área total bajo la curva, el potencial endógeno de trombina (ETP), iii) altura máxima de la trombina (máximo), iv) tiempo hasta el máximo (ttmáximo) y v) velocidad máxima de generación de la trombina (Tasa).

Ejemplo 10: Efecto de los anticuerpos anti-TFPI específicos para TFPI (1-161) sobre la generación de trombina inducida por factor tisular en plasma humano neutralizado con FVIII con TPPI elevadoa niveles

El efecto de los anticuerpos anti-TFPI (1-79) mAb 1F91, mAb 2F22, mAb 2F45 y mAb 2F3 y el anticuerpo TFPI KPI-2 mAb 2021 sobre la generación de trombina se estudió en un ensayo de generación de trombina de acuerdo con el ejemplo 9 (Figura 1). Los parámetros de la generación de trombina en la Figura 1 pueden verse en la Tabla 4. El tiempo hasta el pico (ttmáximo, min) y el pico de trombina (nM) son todos la media de n = 3. Se agregaron 200 nM de anticuerpos al plasma neutralizado con FVIII suplementado con TFPI 20 nMa .

Tabla 4: Altura del pico de trombina (pico) y tiempo hasta el pico (ttPeak)

Altura del pico de la trombina (pico) y tiempo hasta el pico (ttPeak) derivado de las curvas de generación de trombina que se obtuvieron en el plasma neutralizado para el FVIII con 20 nM de TFPIa

Algunos, pero no todos, los anticuerpos TFPI (1-79) de alta afinidad fueron capaces de restaurar parcialmente la generación de trombina en plasma similar a la hemofilia A con TFPI 20 nMa . Los datos de la Tabla 4 sugieren que se necesita un bloqueo más eficiente de la inhibición de TFPI cuando la presencia de anticuerpos de TFPI en la circulación da como resultado la acumulación y un aumento de la concentración de TFPI en plasma.

El efecto de la combinación de cada uno de los anticuerpos anti-TFPI (1-79) con TFPI KPI-2 mAb 2021 sobre la generación de trombina se estudió en un ensayo de generación de trombina de acuerdo con el ejemplo 9y se ilustró en la Figura 2. Los parámetros de la generación de trombina en la Figura 2 pueden verse en la Tabla 5. El tiempo hasta el pico (ttPeak, min) y el pico de trombina (nM) son todos la media de n = 3. Se agregaron 100 nM de anticuerpos al plasma neutralizado con FVIII suplementado con TFPI 20 nMa y mAb 2021 100 nM.

Tabla 5: Altura del pico de trombina (pico) y tiempo hasta el pico (ttPeak)

Altura del pico de la trombina (pico) y tiempo hasta el pico (ttPeak) derivado de las curvas de generación de trombina que se obtuvieron en el plasma neutralizado para el FVIII con 20 nM de TFPIa . Se añadieron 100 nM de cada anticuerpo al plasma.

Los datos de la Tabla 5 sugieren que se obtiene un bloqueo más eficiente de la inhibición de TFPI mediante la neutralización de más de un epítopo implicado en la estabilización del complejo TF/FVIIa/FXa/TFPI.

Ejemplo 11: Efecto sinérgico de anti-TFPI BiFabs sobre la generación de trombina inducida por factor tisular en plasma de hemofilia A humana

Se prepararon fragmentos Fab contra TFPI (1-79), el dominio KPI-2 de TFPI y BiFabs de acuerdo con los ejemplos 2 y 5-7. El efecto sobre la generación de trombina de BiFab dirigida a TFPI (1-79) y el dominio KPI-2 se comparó con el efecto de los correspondientes fragmentos Fab no conjugados solos o en combinación. El efecto sobre la generación de trombina en plasma neutralizado con FVIII y en plasma neutralizado con FVIII suplementado con TFPI 10 nMa se midió de acuerdo con el Ejemplo 9 y los datos se enumeran en la Tabla 6. Los parámetros se derivaron de las curvas de generación de trombina. El tiempo hasta el pico (ttPeak, min) y el pico de trombina (nM) son todos la media de n = 2.

Tabla 6: Altura del pico de trombina (pico) y tiempo hasta el pico (ttPeak)

Altura del pico de la trombina (pico) y tiempo hasta el pico (ttPeak) derivado de las curvas de generación de trombina que se obtuvieron en el plasma neutralizado para el FVIII con niveles de TFPI endógenos o suplementados con 10 nM de TFPI a . Cuando se usó una combinación de fragmentos FAb, cada uno se añadió a una concentración de 100 nM.

Los datos de la Tabla 6 sugieren que se obtiene un bloqueo más eficiente de la inhibición de TFPI mediante la neutralización de más de un epítopo en el TFPI. De ello se deduce claramente que la alta afinidad obtenida debido a un efecto de avidez (Ejemplo 8) por la unión de BiFab 9042 al TFPI, da como resultado un efecto sinérgico sobre la generación de trombina que es mayor que el efecto obtenido al combinar los dos fragmentos Fab no conjugados correspondientes.

Ejemplo 12: Efecto de anticuerpos biespecíficos anti-TFPI sobre la generación de trombina inducida por factor tisular en plasma de hemofilia A humana

Puede obtenerse un efecto procoagulante sobre la generación de trombina inducida por factor tisular en plasma de hemofilia A humana mediante el uso de un anticuerpo biespecífico asimétrico, ensamblado mediante la heterodimerización Fc de anticuerpos dirigidos a epítopos en las regiones TFPI (1-79) y KPI-2 de TFPI.

Generación de anticuerpos biespecíficos asimétricos

Se generó un anticuerpo de unión a TFPI (1-79)/KPI-2 biespecífico sobre un formato de IgG asimétrico, es decir, mediante heterodimerización de Fc. Con el fin de lograr la heterodimerización de FC, se diseñó un conjunto de mutaciones compatibles en la región Fc de las variantes de hIgG1 de mAb 2021 (unión de KPI-2) y mAb 2F22 (unión de TFPI (1-79)).

Los fragmentos VH se escindieron del vector de expresión de HC para mAb 2021 humanizado descrito en el Ejemplo 5 y los vectores de expresión de mAb 2F22 del vector de expresión de HC mediante digestión con enzimas de restricción y se clonaron en un vector de caja de herramientas basado en pTT linealizado que contenía la secuencia para una región constante de IgG1 humana. La reacción de clonación se transformó subsecuentemente en E. coli para la selección. La secuencia de la construcción final se verificó mediante secuenciación de ADN.

Para apoyar la heterodimerización de FC mediante el intercambio controlado de Fab-brazo, se introdujo una única mutación de lisina a arginina en el dominio CH3 de la IgG1 HC del mAb 2021, correspondiente a la posición 413 en SEQ ID NO: 27. La mutación se introdujo mediante mutagénesis dirigida al sitio mediante el uso de un QuikChange® Kit de mutagénesis dirigida al sitio de Stratagene. Las secuencias de la construcción final se verificaron mediante secuenciación de ADN. La versión de IgG1 diseñada del mAb 2021 se expresó como mAb 0310 (SEQ ID NO 27 y 28) en células EXPI293F como se describió en el Ejemplo 2. El vector de expresión de LC corresponde al vector usado para la expresión de mAb 2021 como se describió en el Ejemplo 5. La purificación se realizó por cromatografía de afinidad estándar mediante el uso de resina MabSelectSuRe de GE Healthcare de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos purificados se intercambiaron al tampón PBS pH 7,2.

Se introdujo una mutación coincidente de fenilalanina con leucina en el dominio CH3 de la IgG1 HC del mAb 2F22, correspondiente a la posición 409 en la SEQ ID NO: 29. La mutación se introdujo mediante mutagénesis dirigida al sitio mediante el uso de un QuikChange® Kit de mutagénesis dirigida al sitio de Stratagene. Las secuencias de la construcción final se verificaron mediante secuenciación de ADN. La versión de IgG1 diseñada del mAb 2F22 se expresó como mAb 0336 (SEQ ID NO: 15 y 29) en células EXPI293F como se describió en el Ejemplo 2. El vector de expresión de LC corresponde al vector usado para la expresión de mAb 2F22 como se describió en el Ejemplo 2. La purificación se realizó por cromatografía de afinidad estándar mediante el uso de resina MabSelectSuRe de GE Healthcare de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos purificados se intercambiaron al tampón PBS pH 7,2.

Se preparó un anticuerpo de unión a TFPI (1-79)/KPI-2 biespecífico mediante intercambio controlado de brazo Fab entre la variante IgG1 diseñada de mAb2021 (unión KPI-2), mAb 0310 y la variante IgG1 diseñada de mAb 2F22 (TFPI (1 -79) unión), mAb 0336. El anticuerpo biespecífico se preparó esencialmente de acuerdo con métodos publicados (Labrijn y otros, PNAS, 110, 5145-5150 (2013)). En resumen, se mezcló mAb 0310 (variante mAb 2021 IgG1 Lys-to-Arg, Se Q ID NO: 27) con mAb 0336 (variante mAb 2F22 IgG1 Phe-to-Leu, SEQ ID NO: 29) en una relación molar 1:1 (1 mg ml por anticuerpo) en tampón PBS. Los anticuerpos se redujeron selectivamente mediante la incubación de la mezcla 1:1 durante 90 minutos a 37 °C en presencia de 2-mercaptoetilamina (MEA) 25 mM para formar medios anticuerpos y permitir el intercambio Fab-brazo. Finalmente, se obtuvo el reensamblaje y la reoxidación espontáneos después de la eliminación del agente reductor (diafiltración en tampón PBS sin m Ea ) y almacenamiento a 5 °C durante al menos 16 horas. La heterodimerización, promovida por las mutaciones del dominio CH3, se observó con una eficiencia superior al 90 %. El anticuerpo biespecífico final derivado de mAb 0310 y 0336 se denominó mAb 0421 (SEQ ID NO: 27, 28 y 15, 29).

Efecto de anticuerpos biespecíficos anti-TFPI sobre la generación de trombina inducida por factor tisular en plasma de hemofilia A humana

Puede obtenerse un efecto procoagulante sobre la generación de trombina inducida por factor tisular en plasma de hemofilia A humana mediante el uso de un anticuerpo biespecífico asimétrico, ensamblado mediante la heterodimerización Fc de anticuerpos dirigidos a epítopos en las regiones TFPI (1-79) y KPI-2 de TFPI. El efecto sobre la generación de trombina en plasma neutralizado con FVIII y en plasma neutralizado con FVIII suplementado con TFPI alfa 10 nM se estudió en un ensayo de generación de trombina de acuerdo con el Ejemplo 9 y los datos se enumeran en la Tabla 7. Los parámetros se derivaron de las curvas de generación de trombina.

Tabla 7: Altura del pico de trombina (pico) y tiempo hasta el pico (ttPeak)

La Tabla 7 muestra que la adición del anticuerpo anti-FVIII humano al plasma normal para simular una afección similar a la hemofilia A disminuyó fuertemente la generación de trombina. Tanto el pico de trombina (pico) como el tiempo hasta el pico (ttPeak) se vieron afectados. La adición de varios anticuerpos anti-TFPI, que incluye mAb 0310 (una versión de mAb 2021 diseñada con Fc), mAb 0336 (una versión de mAb 2F22 anti-TFPI diseñada con Fc) y mAb 0421 (el anticuerpo biespecífico asimétrico derivado del mAb 0310 y mAb 0336) a plasma neutralizado con FVIII restablece eficientemente tanto el pico de trombina (pico) como el tiempo hasta el pico (ttPeak). Se estimó que la concentración de mAb 0421 requerida para dar la respuesta semimáxima (CE50) era de 1,1 nM (los datos, el promedio de 2 experimentos, que se dan en la tabla 7, se ajustaron a una curva de dosis-respuesta de cuatro parámetros mediante el uso del software GraphPad PrismR).

Además, la tabla 7 muestra que la adición de 10 nM de TFPI alfa de longitud completa al plasma neutralizado con FVIII evitó por completo una generación de trombina medible y que la adición de 100 nM de un anticuerpo de alta afinidad contra TFPI (1-79) (mAb 0336) o KPI -2 (mAb 0310) no pudo anular completamente la inhibición de TFPI en estas condiciones. Por el contrario, el anticuerpo biespecífico asimétrico mAb 0421 estableció de forma dependiente un pico de trombina robusto y redujo el tiempo hasta el pico (ttPeak) con una CE50 estimada de 9,5 nM (experimento único).

Los datos de la Tabla 7 sugieren que se obtiene un bloqueo más eficiente de la inhibición de TFPI mediante la neutralización de más de un epítopo en el TFPI.

Ejemplo 13: Moléculas biespecíficas que se unen con alta afinidad a TFPI KPI-2 y con baja afinidad a TFPI K P I-1

Para determinadas aplicaciones de moléculas de unión de TFPI (1-79)/KPI-2 biespecíficas, puede ser ventajoso tener una unión de alta afinidad a TFPI KPI-2 con un brazo y una unión de TFPI TFPI (1-79) de baja afinidad con el otro.

El Fab 0296 (SEQ ID NO: 14 (cadena pesada) y 15 (cadena ligera)), correspondiente al mAb 2F22, se une con alta afinidad a TFPI (1-79), y puede servir como plantilla para diseñar variantes con afinidad reducida para TFPI (1-79), en comparación con Fab 0296.

Como se describió en el Ejemplo 4 se determinó el paratopo de Fab 0296 e incluye los residuos Val 2, Phe 27, Tyr 32, Trp 52, Arg 53, Gly 54, Gly 55, Ser 56, Ile 57, Asp 58, Tyr 59, Ala 61, Met 64, Lys 97, Ser 99, His 100, Asn 102, Tyr 103, Val 104, Gly 105 y Tyr 106 de la cadena pesada (SEQ ID NO: 14), y los residuos Pro 31, Ala 32, Tyr 49, Ser 50, Asn 53, Tyr 55, Thr 56, Tyr 91, Thr 92, Ser 93 y Tyr 94 de la cadena ligera (SEQ ID NO: 15).

La alta afinidad de Fab 0296 resulta de una combinación de varias interacciones, por ejemplo, interacciones electrostáticas, polares, hidrófobas y de enlace de hidrógeno, entre sus restos paratopos, mencionados anteriormente, y los restos epítopos en TFPI (1-79). Por tanto, la afinidad de unión de Fab 0296 por TFPI (1-79) se modula al sustituir uno o más de los residuos de paratopo con un residuo de aminoácido diferente, lo que debilita o refuerza de esta manera las interacciones paratopo-epítopo.

La afinidad de Fab 0296 por TFPI (1-79) se atenúa en diferentes grados, por ejemplo, mediante una sustitución conservadora en una sola posición, una sustitución conservadora en varias posiciones o sustituciones menos conservadoras en una o más posiciones.

Fab 0295 (SEQ ID NO: 18 (cadena pesada) y 15 (cadena ligera)), es idéntico al Fab 0296 salvo por una cisteína adicional en el extremo C-terminal de la cadena pesada, y tiene el mismo paratopo que Fab 0296. Por lo tanto, se prepara una molécula de unión de TFPI (1-79)/k PI-2 biespecífica con baja afinidad por TFPI (1-79) mediante el uso de una variante de Fab 0295, donde se han sustituido uno o más residuos de paratopo, y conjugándolo a un Fab de unión a KPI-2, como se describió en el Ejemplo 7. El Fab de unión a KPI-2 puede ser, por ejemplo, Fab 0088 pero también pueden ser otros fragmentos Fab de unión a KPI-2.

Mediante el uso de los anticuerpos de longitud completa correspondientes a los fragmentos Fab descritos en este ejemplo, es posible obtener anticuerpos biespecíficos correspondientes de acuerdo con los métodos descritos en el ejemplo 12.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Novo Nordisk A/S

<120> Anticuerpos capaces de unir dos epítopos en el inhibidor de la ruta del factor tisular (1-161) <130> 140072

<160> 29

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 276

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys 165 170 175

<210>2

<211> 161

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> TFPI (1-161)

^<400>2

Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp

20 25 30

Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn 50 55 60

Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe 85 90 95

Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg

100 105 110

Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly

115 120 125

Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly

145 150 155 160

Thr

<210> 3

<211> 66

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Construcción TFPI KPI-2

<400> 3

Arg Gly Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys

20 25 30

Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly His His His His 50 55 60

His His

65

<210>4

<211> 121

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

<210>5

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus musculus

< 400 > 5

<210>6

<211> 121

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

<210>7

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus musculus

< 400 > 7

<210>8

<211> 121

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8

<210>9

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus musculus

< 400 > 9

<210> 10

<211> 115

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 10

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213>Mus musculus

<400> 11

<210> 12

<211> 20

<212>ADN

<213>Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 12

cccttgacca ggcatcccag 20

<210> 13

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 13

gctctagact aacactcatt cctgttgaag ctcttg 36

<210> 14

<211> 222

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cadena pesada quimérica murino-humana truncada de Fab 0296

<400> 14

<210> 15

<211> 213

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cadena ligera quimérica murino-humana de mAb 0294, Fab 0296 y Fab 0295 y mAb 0336

<400> 15

Gly Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Thr Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Pro Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu His Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Thr Ser Tyr Pro Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 16

<211> 86

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> TFPI KPI-1/N-terminal etiquetado (TFPI (1-79))

<400> 16

<210> 17

<211> 448

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cadena pesada quimérica murino-humana del anticuerpo monoclonal mAb 0294

<400> 17

Ala Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Ile Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met 50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Sisr Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys Asn Ser His Gly Asn Tyr Val Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 12'0 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro'Cyss Serr Arg Ser Thr Ser Glu Sesr Thr Ala 130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Ly:s Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala.Leu Thrr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly'Leu Tyrr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 18 5 1950

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn ValAsp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser LysTyr Gly

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly GlyPro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met IleSer Arg 245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln GluAsp Pro

260 265 270

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val HisAsn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr ArgVal Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly LysGlu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile GluLys Thr 325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val TyrThr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser LeuThr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu TrpGlu Ser

370 375 380

^{Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro ValLeu Asp}

_{385 390 395 400}

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val AspLys Ser 405 410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met HisGlu Ala ^{420 425 430}

_{Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser LeuGly Lys}

435 440 445

<210> 18

<211> 227

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cadena pesada quimérica murino-humana truncada de Fab 0295

<400> 18

<210> 19

<211> 121

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> dominio variable de cadena pesada (VH) de mAb 2021

<400> 19

<210> 20

<211> 113

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> dominio variable de cadena ligera (VL) de mAb 2021

<400> 20

<210> 21

<211> 227

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cadena pesada (HC) de Fab 0094

<400> 21

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 210 215 220

Pro Pro Cys

225

<210> 22

<211> 219

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cadena ligera (LC) de Fab 0094

<400> 22

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Ile Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala 85 90 95

Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 23

<211> 227

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cadena pesada (HC) de Fab 0088

<400> 23

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Thr Ile Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Phe Pro Asp Ser Val 50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 210 215 220

Pro Pro Cys

225

<210> 24

<211> 219

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cadena ligera (LC) de Fab 0088

<400> 24

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Ile Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala 85 90 95

Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 25

<211> 227

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cadena pesada (HC) de Fab 0313

<400> 25

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Ala Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135 140

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly

210 215 220

Pro Pro Cys

225

<210> 26

<211> 219

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cadena ligera (LC) de Fab 0313

<400> 26

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 27

<211> 451

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cadena pesada (HC) de mAb 0310

<400> 27

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 28

<211> 219

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cadena ligera (LC) de mAb 0310

<400> 28

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Ile Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala 85 90 95

Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 29

<211> 451

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cadena pesada (HC) de mAb 0336

<400> 29

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Ala Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Ile Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Lys Asn Ser His Gly Asn Tyr Val Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   i . Un anticuerpo biespecífico capaz de unirse específicamente a un primer epítopo dentro de las posiciones 1-76 y dicho segundo epítopo dentro de las posiciones 77-161 del TFPI humano (SEQ ID NO: 1), en donde la cadena pesada del primer sitio de reconocimiento de antígeno comprende:

   • una secuencia CDR1 NYGVH (aminoácidos de 31 a 35 de la SEQ ID NO: 6) y

   • una secuencia de CDR2 VIWRGGSIDYNAAFMS (aminoácidos de 50 a 65 de la SEQ ID NO: 6) y • una secuencia de CDR3 NSHGNYVGYAMDY (aminoácidos de 98 a 110 de la SEQ ID NO: 6 en donde la cadena ligera del primer sitio de reconocimiento de antígeno comprende:

   • una secuencia de CDR1 KASQSVGPAVA (aminoácidos de 24 a 34 de la SEQ ID NO: 7 y

   • una secuencia de CDR2 SASNRYT (aminoácidos de 50 a 56 de la SEQ ID NO: 7) y

   • una secuencia de CDR3 QQYTSYPT (aminoácidos de 89 a 96 de la SEQ ID NO: )

   en donde la cadena pesada del segundo sitio de reconocimiento de antígeno comprende:

   • una secuencia de CDR1 NYAMS (aminoácidos de 31 a 35 de la SEQ ID NO: 19) y

   • una secuencia de CDR2 TISRSGSYSYYADSVKG (aminoácidos de 50 a 66 de la SEQ ID NO: 25) y • una secuencia de CDR3 LGGYDEGDAMDS (aminoácidos de 99 a 110 de la SEQ ID NO: 19) y en donde la cadena ligera del segundo sitio de reconocimiento de antígeno comprende:

   • una secuencia de CDR1 KSSQSLLESDGKTYLN (aminoácidos de 24 a 39 de la SEQ ID NO: 20) y • una secuencia de CDR2 LVSILDS (aminoácidos de 55 a 61 de la SEQ ID NO: 20) y

   • una secuencia de CDR3 LQATHFPQT (aminoácidos de 94 a 102 de la SEQ ID NO: 20).
2. 2. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con la reivindicación 1, que es un anticuerpo biespecífico de formato IgG de longitud completa o un conjugado químico de dos fragmentos de unión a antígeno.
3. 3. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el anticuerpo biespecífico es un conjugado Fab-Fab biespecífico.
4. 4. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que es humanizado o humano.
5. 5. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para usar como un medicamento.
6. 6. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en el tratamiento de una coagulopatía.
7. 7. El anticuerpo biespecífico para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicha coagulopatía es hemofilia A con o sin aloanticuerpos contra el factor VIII o hemofilia B, con o sin aloanticuerpos contra el factor IX.