BR112019005449A2 - anticorpos inovadores contra fator xi e usos dos mesmos - Google Patents

Abstract

a presente invenção se refere, em geral, a moléculas de ligação inovadoras, em particular, anticorpos e composições e kits que compreendem as mesmas. as ditas moléculas de ligação têm capacidade de se ligar a fator xi humano e, por conseguinte, são previstas para serem particularmente úteis na inibição de trombose sem comprometer a hemóstase. as moléculas de ligação, composições e kits fornecidos no presente documento são, portanto, dentre outros, destinadas ao tratamento de doenças e condições relacionadas à trombose. além disso, os polinucleotídeos que codificam as moléculas de ligação da invenção, vetores que compreendem os ditos polinucleotídeos e células hospedeiras para produzir os polinucleotídeos são fornecidos no presente documento.

Description

ANTICORPOS INOVADORES CONTRA FATOR XI E USOS DOS MESMOS

ANTECEDENTES [0001] Os transtornos tromboembólicos, incluindo tanto trombose venosa quanto arterial, são uma causa principal de morbidade e mortalidade no mundo. Os mesmos são provocados por desregulação de coagulação sanguínea normal (hemóstase) que leva à formação anormal de coágulos (trombos) de fibrina, eventualmente resultando em isquemia tecidual e, em algumas circunstâncias, embolização devido a deslocamento e migração de fragmentos de coágulo do trombo. [0002] Sob circunstâncias normais, a hemóstase é um mecanismo vital que previne a perda de sangue de sítios de lesão vascular pela indução de ativação de plaqueta e formação de fibrina. Em um nível de mecanismo, a hemóstase procede em, duas etapas. Durante a hemóstase primária, as plaquetas aderem ao sítio de trauma e se tornam ativadas, e por fim se agregam pela ligação entre si para formar um tampão de plaqueta. A formação de tampão de plaqueta é melhorada e estabilizada durante a hemóstase secundária uma série de reações enzimáticas que envolvem as proteínas de coagulação (também chamadas de sistema de coagulação sanguínea) que culminam na formação da protease trombina, que converte fibrinogênio em fibrina para formar um coágulo estável que veda uma falha em paredes do vaso sanguíneo.

[0003] Desde 1964, quando Macfarlane (Nature. 2 de maio de 1964;202:498-9) introduziu as hipóteses de cascata para o processo de coagulação sanguínea, cujo conhecimento da função de coagulação sanguínea in vivo se desenvolveu. Nos últimos anos, a teoria de duas vias distintas, as

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2/109 denominadas vias extrinseca e intrínseca, que iniciam a coagulação e convergem em uma via comum, por fim, levando à geração de trombina e à deposição de fibrina, foi revisada. [0004] No modelo atual, a iniciação de coagulação ocorre quando o fator VII ativado por protease de plasma entra em contato e, por meio disso, forma um complexo com o Fator de Tecido (TF). Esse complexo Fator de Tecido-FVIIa converte o zimogênio FX em sua forma ativa FXa, que, por sua vez, cliva a protrombina (fator de coagulação II) para formar trombina (lia) na presença do cofator FVa. A trombina, um protagonista em coagulação, por sua vez, pode catalisar a conversão de fibrinogênio em fibrina. Adicionalmente, a trombina ativa receptores específicos expressados por plaquetas, o que leva à ativação das últimas. As plaquetas ativadas em combinação com fibrina são essenciais para formação de coágulo e, portanto, são protagonistas fundamentais de hemóstase normal. 0 complexo FVIIa-TF também converte FIX na protease FIXa, que, na presença de FVIIIa, ativa FX adicional para sustentar a produção de trombina.

[0005] A via de coagulação envolve o fator de coagulação XI (FXI) . É bem confirmado que FXI é, como os outros membros da cascata de coagulação, um zimogênio de serina protease de plasma com um papel principal na conexão da fase de iniciação e da fase de amplificação de coagulação sanguínea in vivo (Davie EW et al. , Biochemistry. 29 de outubro de 1991;30(43):10363-70, Gailani D e Broze GJ Jr., Science. 23 de agosto de 19 91; 2 53 (5 022):909-12; Kravtsov DV et al. Blood. 9 de julho de 2009; 114 (2) :452-8.) .

[0006] Interessantemente, a deficiência de FXI não leva

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3/109 usualmente a sangramento espontâneo, mas está associado a risco aumentado de sangramento com estímulos hemostáticos, embora a gravidade de sangramento esteja correlacionada deficientemente com o nível de plasma de FXI. A deficiência de FXI grave em humanos foi relatada por ter certos efeitos protetores de doenças trombóticas, incluindo derrame isquêmico e trombose venosa profunda (DVT) (Salomon O et al, Thromb Haemost. fevereiro de 2011; 105 (2) :269-73; Salomon O et al, Blood. 15 de abril de 2008;111 (8) :4113-7) . Ainda, um alto nível de FXI foi associado a eventos trombóticos e foi relatado como conferindo risco mais alto de DVT, infarto do miocárdio (MI) e derrame (Meijers JC et al, N Engl J Med. 9 de março de 2000; 342 (10) :696-701) .

[0007] Juntos, estudos anteriores sugerem que FXI tem um papel de suporte menor na manutenção de hemóstase, mas é um contribuinte crucial para a patogênese de trombose, tornando por meio disso FXI um alvo promissor para terapia antitrombótica. Isso se deve ao fato de que, embora a trombose e a hemóstase não sejam processos moleculares idênticos, as mesmas são similares suficientemente de modo que os fármacos antitrombóticos atualmente usados alvejam inadvertidamente ambas. Os fármacos antitrombóticos presentemente disponíveis alvejam os blocos de construção de trombos (fibrina e plaquetas) ou inibem as moléculas (fatores de coagulação) e as células (plaquetas) da participação no processo de formação de trombo. Os agentes antiplaqueta, pró-fibrinolíticos e anticoagulantes têm sido o alicerce para o tratamento e a prevenção de doenças tromboembólicas por décadas e estão dentre os fármacos mais comumente prescritos na prática clínica. Ainda, a maioria

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4/109 desses agentes pode bloquear completamente tanto a trombose quanto a hemóstase quando administrados em doses eficazes.

[0008] Até o momento, um dos poucos exemplos para um anticorpo anti-FXI que exibe potencial terapêutico é anticorpo 1A6 murino (também chamado de aXIMab) como publicado por Tucker et al. (Prevention of vascular graft occlusion and thrombus-associated thrombin generation by inhibition of factor XI) . Erik I. Tucker, Ulla M. Marzec, Tara C. White, Sawan Hurst, Sandra Rugonyi, Owen J. T. McCarty, David Gailani, Andrés Gruber, e Stephen R. Hanson. Blood. 22 de janeiro de 2009; 113(4) :936-944) . O anticorpo 1A6 também é revelado no pedido de patente WO 2009/067660 A2, também publicado como Patente η^Ω US 9.125.895, que é incorporada no presente documento a titulo de referência em sua totalidade. Entretanto, como o anticorpo 1A6 é um anticorpo murino, o mesmo é inadequado para terapias humanas especialmente para aplicações crônicas como tal como terapia antitrombótica. Um método para converter um anticorpo murino em um anticorpo terapêutico aceitável é chamado de humanização. Técnicas padrão estão disponíveis para o elemento versado na técnica como aquelas descritas em O'Brien and Jones, Humanising Antibodies by CDR Grafting, Capítulo 40; Antibody Engineering, Part of the series Springer Lab Manuals pp 567-590; R. Kontermann et al. (eds.), Antibody Engineering; Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2001 e em Hwang, Almagro, Buss, Tan, e Foote (2005) Use of human germline genes in a CDR homology-based approach to antibody humanization. Methods, May; 36(1):3542 e nas referências nos mesmos. Para redução adicional do potencial de imunogenicidade inerente de anticorpos

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5/109 humanizados, otimização de sequência e linhagem germinativa adicionais são requeridas.

[0009] Quando os Depositantes aplicaram esses métodos padrão para humanizar e otimizar o anticorpo parenteral 1A6, alguns dos anticorpos resultantes exibiram atividade de ligação em um ensaio bioquímico comparável com ο 1A6 parenteral, entretanto, mostraram uma perda significativa de atividade em ensaios à base de plasma e foram inadequados em modelos in vivo de coagulação. Até o presente, não há explicação prontamente disponível sobre o porquê de um perfil bioquímico comparável do anticorpo parental murino 1A6 e variantes humanizadas não se transforma em atividade antitrombótica eficiente. Surpreendentemente, através da introdução de alterações de sequência adicionais, uma variante humanizada de anticorpo murino parental 1A6 foi gerada (anticorpo TPP-3583), a qual exibe tanto um perfil bioquímico comparável quanto eficácia antitrombótica in vivo.

[0010] Com os anticorpos desta invenção, moléculas terapêuticas foram geradas, as quais têm um risco de imunogenicidade reduzido e bloqueiam de modo eficaz a trombose sem debilitar a hemóstase, tornando assim a terapia antitrombótica mais segura e, assim, ampliando a faixa de indicações clínicas e cenários nos quais a terapia antitrombótica pode ser aplicada.

Sumário [0011] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ligação que compreende uma CDR1 da cadeia leve que compreende a sequência KASQSVLYSGDNYLN (SEQ ID NO: 8);

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uma	CDR2	da	cadeia	leve	que	compreende	a	sequência
AASTLES (SEQ	ID NO:	9) ;
uma	CDR3	da	cadeia	leve	que	compreende	a	sequência
QQYNGDPWT	(SEQ ID NC	10);
uma	CDR1	da	cadeia	pesada	que	compreende	a	sequência
TSGMGVG (SEQ	ID NO:	11) ;
uma	CDR2	da	cadeia	pesada	que	compreende	a	sequência
HIDWDDDKYYSPSLKS (SEQ ID NO: 12);
e
uma	CDR3	da	cadeia	pesada	que	compreende	a	sequência

IRSSVYAHYYGMDY (SEQ ID NO: 13).

[0012] A molécula de ligação pode compreender uma região VL como retratado em SEQ ID NO: 17 e/ou uma região VH como retratado em SEQ ID NO: 18.

[0013] Prevê-se que a dita molécula de ligação tem capacidade de se ligar a fator XI e/ou fator Xla, em particular, a um fator XI de primata humano ou não humano ou um fator Xla de primata humano ou não humano.

[0014] Especificamente, a molécula de ligação é prevista por se ligar dentro de uma sequência de aminoácidos que corresponde ao domínio A3 de fator XI que compreende aminoácidos 200 a 283 de SEQ ID NO: 7 e particularmente a um domínio dentro de uma sequência de aminoácidos que corresponde a a) aminoácidos 200 a 215 de SEQ ID NO: 7; b) aminoácidos 221 a 222 de SEQ ID NO: 7; c) aminoácidos 252 a 254 de SEQ ID NO: 7; d) aminoácidos 259 a 261 de SEQ ID NO: 7; e) aminoácidos 270 a 272 de SEQ ID NO: 7; e f) aminoácidos 276 a 278 de SEQ ID NO: 7. Aqui, a numeração dos aminoácidos de Fator XI humano inclui a sequência de sinal começando com metionina na posição 1. Contempla-se

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7/109 que a dita molécula de ligação pode ser um anticorpo e, especificamente, um anticorpo monoclonal humanizado ou fragmento de ligação a antigeno do mesmo, por exemplo, que é um anticorpo IgG.

[0015] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um polinucleotideo que codifica uma molécula de ligação como definido no presente documento, e um vetor, particularmente, um vetor de expressão, que compreende o dito polinucleotideo. A invenção também se refere a uma célula hospedeira que compreende o dito vetor ou polinucleotideo.

[0016] Em um aspecto adicional, é fornecido um processo para a produção de uma molécula de ligação como descrito no presente documento, em que o dito processo compreende cultivar uma célula hospedeira como definido no presente documento sob condições que permitem a expressão da dita molécula de ligação e recuperar opcionalmente a molécula de ligação produzida da cultura.

[0017] Além disso, a invenção se refere a uma composição farmacêutica que compreende uma molécula de ligação, polinucleotideo, o vetor e/ou a célula hospedeira como definido no presente documento, e opcionalmente um excipiente farmaceuticamente aceitável. A dita composição farmacêutica pode compreender agentes ativos adicionais, em particular, agentes antitrombóticos e/ou anticoagulantes ou ser administrada como parte de terapia de combinação com agentes ativos adicionais.

[0018] De acordo com a presente invenção, a molécula de ligação, polinucleotideo, vetor, célula hospedeira ou a composição farmacêutica pode ser usada em um método de

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8/109 inibição de coagulação sanguínea, agregação de plaqueta e/ou trombose em um indivíduo, e é, portanto, prevista para uso no tratamento e/ou profilaxia de transtornos, em particular, transtornos cardiovasculares, de preferência, transtornos trombóticos ou tromboembólicos e/ou complicações trombóticas ou tromboembólicas.

[0019] É adicionalmente fornecido no presente documento o uso da molécula de ligação como um ant icoagulante em amostras sanguíneas, conservações sanguíneas, produtos de plasma, amostras biológicas ou aditivos medicinais ou como um revestimento em dispositivos médicos.

[0020] Além disso, a presente invenção se refere a um kit que compreende uma molécula de ligação, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira ou a composição farmacêutica como descrito no presente documento.

Descrição das Figuras [0021] Figura 1: Sequências do anticorpo TPP-3583 antiFXI.

[0022] Figura 2: Atividades de ligação (valor de EC50) do anticorpo 1A6 anti-FXI murino ao fator de coagulação humano XI (FXI).

[0023] Figura 3: Atividades de ligação (valor de EC50) do anticorpo TPP-3583 anti-FXI humanizado e de linha germinativa que compreende SEQ ID NO: 17 para a sequência de aminoácidos para o domínio de cadeia leve variável e SEQ

ID NO: 18 para	a sequência de	aminoácidos para	a	cadeia
pesada variável.
[0024] Figura	4: Atividades	de	ligação (valor	de	EC50)
do anticorpo TPP-3577 anti-FXI	humanizado e	de	linha
germinativa que	compreende SEQ	ID	NO: 19 para a	sequência

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9/109 de aminoácidos para o domínio de cadeia leve variável e SEQ

ID NO: 20 para	a sequência de	aminoácidos para	a	cadeia
pesada variável.
[0025] Figura	5: Atividades	de	ligação (valor	de	EC50)
do anticorpo TPP-3290 anti-FXI	humanizado e	de	linha
germinativa que	compreende SEQ	ID	NO: 21 para a	sequência

de aminoácidos para o domínio de cadeia leve variável e SEQ

ID NO: 22 para	a sequência de	aminoácidos para	a	cadeia
pesada variável.
[0026] Figura	6: Atividades	de	ligação (valor	de	EC50)
do anticorpo TPP-3238 anti-FXI	humanizado e	de	linha
germinativa que	compreende SEQ	ID	NO: 23 para a	sequência

de aminoácidos para o domínio de cadeia leve variável e SEQ ID NO: 24 para a sequência de aminoácidos para a cadeia pesada variável.

[0027] Figura 7: Análise de domínio por ensaio ELISA competitivo para anticorpo TPP-3583.

[0028] Figura 8: Neutralização funcional da conversão de FXI em sua forma ativa, FXIa, por anticorpos desta invenção. Inibição da conversão induzida por FXIIa de FXI em seu FXIa de forma ativa. Atividade inibitória (valor de IC50) do anticorpo TPP-3583 anti-FXI humanizado e de linha germinativa.

[0029] Figura 9: Listagem de valores de EC50 e valores aPTT para certos anticorpos.

[0030] Figura 10: Medição in vivo de deposição de plaqueta em enxertos vasculares revestidos com colágeno após aplicação i.v. de TPP3583.

[0031] Figura 11: Medição in vivo de deposição de fibrina em enxertos vasculares revestidos com colágeno após

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10/109 aplicação i.v. de TPP3583.

Descrição Detalhada [0032] A inibição de FXI - que é atribuída a um papel crítico em desenvolvimento de formação de trombo patológica, embora tenha efeito limitado (ou nenhum efeito) em hemóstase fisiológica - é uma abordagem inovadora promissora no desenvolvimento de novos agentes antitrombóticos para alcançar uma proporção de benefíciorisco aprimorada. A presente invenção, dentre outros, fornece moléculas de ligação inovadoras que são capazes de se ligar especificamente a FXI, inibindo, por meio disso, a conversão de FXI em sua forma ativada FXIa. Além disso, as moléculas de ligação também demonstraram ligação a FXIa. As moléculas de ligação fornecidas no presente documento são, por meio disso, consideradas como bloqueadoras da ativação de protagonistas a jusante envolvidos em coagulação e trombose. Especificamente, os presentes inventores forneceram versões humanizadas do anticorpo murino anti-FXI 1A6 que, vantajosamente, se ligam a FXI e também FXIa com uma alta afinidade de ligação comparável com 1A6. Além disso, as moléculas de ligação reduzem de modo eficaz a coagulação, como indicado por sua capacidade de prolongar o tempo de tromboplastina ativada parcial (aPTT) em baixas concentrações. As moléculas de ligação da presente invenção são, portanto, novos agentes promissores para tratamento e/ou profilaxia eficaz de transtornos trombóticos ou tromboembólicos e/ou complicações trombóticas ou tromboembólicas, e são, além disso, consideradas como eficazes sem comprometer severamente a hemóstase, minimizando assim o risco de sangramento.

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Molécula de ligação [0033] As moléculas de ligação da presente invenção foram obtidas por humanização e otimização de CDR subsequente do anticorpo 1A6 anti-FXI murino como revelado no documento WO 2009/067660 A2. Para sua surpresa, os presentes inventores verificaram que as moléculas de ligação que compreendem inúmeras substituições de aminoácido em suas regiões CDR em comparação com as CDRs de 1A6 exibiram propriedades vantajosas. As moléculas de ligação da invenção são capazes de se ligarem a FXI com afinidades de ligação comparáveis com 1A6, e inibirem sua conversão em seu FXIa de forma ativa, e reduziram de modo eficaz a coagulação sanguínea. Em contrapartida, outras moléculas de ligação candidatas que têm menos ou mais substituições de aminoácido não exibiram as mesmas propriedades vantajosas.

Portanto, a presente invenção, em um primeiro aspecto, se refere a moléculas de ligação capazes de se ligarem especificamente a fator XI, cujas moléculas de ligação

compreendem	as	seguintes	regiões de determinação	de
complementaridade	(CDRs):
a)	CDR1	da cadeia	leve: KASQSVDYDGDSYLN (SEQ	ID
	NO:	D ,
b)	CDR2	da cadeia	leve: AASNLES (SEQ ID NO: 2)	r
c)	CDR3	da cadeia	leve: QQSNGDPWT (SEQ ID NO:	3) ,
d)	CDR1	da cadeia	pesada: TSGMGVG (SEQ ID NO:	4) ,
d)	CDR2	da cadeia	pesada: HIWWDDDKYYNPSLKS (	:seq
	ID NO: 5), e
e)	CDR3	da cadeia	pesada: KRSSVVAHYYAMD (SEQ	ID
	NO:	6) ,

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12/109 em que as ditas CDRs são caracterizadas por pelo menos duas CDRs que compreendem cumulativamente 10, 11, 12, 13 ou 14 substituições de aminoácido.

[0034] O termo aminoácido ou resíduo de aminoácido se refere tipicamente a um aminoácido que tem sua definição reconhecida na técnica como um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em: alanina (Ala ou A) ; arginina (Arg ou R) ; asparagina (Asn ou N) ; ácido aspártico (Asp ou D) ; cisteína (Cys ou C) ; glutamina (Gin ou Q) ; ácido glutâmico (GIu ou E) ; glicina (Gly ou G) ; histidina (His ou H) ; isoleucina (He ou I) : leucina (Leu ou L) ; lisina (Lys ou K); metionina (Met ou M); fenilalanina (Phe ou F); prolina (Pro ou P); serina (Ser ou S); treonina (Thr ou T); triptofano (Trp ou W); tirosina (Tyr ou Y); e valina (Vai ou V) , embora aminoácidos modificados, sintéticos ou raros possam ser usados como desejado. Em geral, os aminoácidos podem ser agrupados como tendo uma cadeia lateral não polar (por exemplo, Ala, Cys, He, Leu, Met, Phe, Pro, Vai); uma cadeia lateral negativamente carregada (por exemplo, Asp, GIu); uma cadeia lateral positivamente carregada (por exemplo, Arg, His, Lys); ou uma cadeia lateral polar não carregada (por exemplo, Asn, Cys, Gin, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp e Tyr).

Número e distribuição de substituições [0035] As substituições de aminoácido podem, em geral, ser distribuídas através das CDRs de qualquer modo, isto é,

uma CDR	pode,	por	exemplo,	compreender	uma troca, e	uma
segunda	CDR	pode	compreender 9, 10,	11, 12 ou	13
substituições.	Ou	duas	CDRs podem	compreender	5

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13/109 substituições de aminoácido, ou todas as seis CDRs podem compreender substituições de aminoácido, por exemplo, duas substituições por CDR. São particularmente previstas no presente documento moléculas de ligação que compreendem pelo menos 5 substituições de aminoácido na CDR1, CDR2 e/ou CDR3 da cadeia leve e pelo menos 5 substituições de aminoácido na CDR1, CDR2 e/ou CDR3 da cadeia pesada. Em geral, as substituições de aminoácido podem ser distribuídas virtualmente de qualquer maneira, desde que o número de substituições acumulativas de aminoácido em comparação com as sequências de aminoácidos de CDR de 1A6 se situe na faixa entre 10 e 14 (isto é, incluindo 10, 11, 12, 13 ou 14) e, de preferência, não exclua a capacidade da molécula de ligação em se ligar a fator XI.

Tipo de substituições [0036] Em geral, qualquer combinação de substituições de aminoácido nas CDRs em comparação com 1A6 é concebível desde que não exclua as propriedades vantajosas das moléculas de ligação da invenção. As trocas de aminoácido podem ser conservativas (isto é, a troca de um aminoácido de uma classe ou grupo por um outro aminoácido da mesma classe ou grupo como listado acima) ou não conservativas (isto é, a troca de um aminoácido de uma classe/grupo por um outro aminoácido de uma outra classe/grupo).

[0037] As substituições particulares de aminoácido que são previstas de acordo com a presente invenção incluem as seguintes:

(a) Dg—>Lg, Du—>Sn e/ou S14—>Ni4 em relação a SEQ ID NO: 1;

(b) Ne—>Te em relação a SEQ ID NO: 2;

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14/109 (c) Ss—>Ys em relação a SEQ ID NO: 3;

(d) Gi2—>Ci2 em relação a SEQ ID NO: 4;

(e) Ws—>Ds, Ni3—>Si3 em relação a SEQ ID NO: 5;

(f) K₃->I₃, V₈->Y₈, A13—>Gi3 e/ou Yle—>Vie em relação a

SEQ ID NO: 6

As substituições preferenciais produzem moléculas de ligação da presente invenção que levam a um prolongamento de 1,5 vezes do aPTT (como descrito em outra parte no presente documento) a uma concentração de 0,03 μΜ ou menos, ou 0,015 μΜ ou menos, ou 0,01 μΜ ou menos.

[0038] Em particular, as moléculas de ligação da invenção podem compreender as seguintes CDRs:

(a)	uma CDR1	da cadeia leve	que	compreende	a
	sequência	KASQSVLYSGDNYLN (	:seq	ID NO: 8)	ou
	KSSQSVLYSGDNYLN (SEQ ID NO:	14) ,	com SEQ ID NO:
	8 sendo preferencial; e/ou
(b)	uma CDR2	da cadeia leve	que	compreende	a
	sequência	AASTLES (SEQ ID NO	: 9);	e/ou
(c)	uma CDR3	da cadeia leve	que	compreende	a
	sequência	QQYNGDPWT (SEQ ID '	NO: 1	0); e/ou
(d)	uma CDR1	da cadeia pesada	que	compreende	a
	sequência	TSGMGVG (SEQ ID NO	: 11)	; e/ou
(e)	uma CDR2	da cadeia pesada	que	compreende	a

sequência HIDWDDDKYYSPSLKS (SEQ ID NO: 12) ou HIDWDDDKYYSTSLKS (SEQ ID NO: 15), com SEQ ID NO: 12 sendo preferencial; e/ou (f) uma CDR3 da cadeia pesada que compreende a sequência IRSSVYAHYYGMDY (SEQ ID NO: 13) ou IRSSVYAH YYGMDV (SEQ ID NO: 16), com SEQ ID NO:

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15/109 sendo preferencial.

[0039] Como é evidente a partir do supracitado, as moléculas de ligação de acordo com a invenção podem compreender uma ou mais das CDRs supracitadas, opcionalmente em combinação.

Uma molécula de ligação particularmente preferencial de acordo com a invenção, que pode ser um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antigeno do mesmo, compreende as seguintes CDRs: uma CDR1 da cadeia leve que compreende a sequência KASQSVLYSGDNYLN (SEQ ID NO: 8); uma CDR2 da cadeia leve que compreende a sequência AASTLES (SEQ ID NO: 9) ; uma CDR3 da cadeia leve que compreende a sequência QQYNGDPWT (SEQ ID NO: 10); uma CDR1 da cadeia pesada que compreende a sequência TSGMGVG (SEQ ID NO: 11); uma CDR2 da cadeia pesada que compreende a sequência HIDWDDDKYYSPSLKS (SEQ ID NO: 12); e uma CDR3 da cadeia pesada que compreende a sequência IRSSVYAHYYGMDY (SEQ ID NO: 13). Uma molécula de ligação particularmente preferencial adicional de acordo com a invenção, que pode ser um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antigeno do mesmo, compreende as seguintes CDRs: uma CDR1 da cadeia leve que consiste na sequência KASQSVLYSGDNYLN (SEQ ID NO: 8); uma CDR2 da cadeia leve que consiste na sequência AASTLES (SEQ ID NO: 9) ; uma CDR3 da cadeia leve que consiste na sequência QQYNGDPWT (SEQ ID NO: 10); uma CDR1 da cadeia pesada que consiste na sequência TSGMGVG (SEQ ID NO: 11); uma CDR2 da cadeia pesada que consiste na sequência HIDWDDDKYYSPSLKS (SEQ ID NO: 12); e uma CDR3 da cadeia pesada que consiste na sequência IRSSVYAHYYGMDY (SEQ ID NO: 13).

[0040] Além disso, as moléculas de ligação da invenção

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16/109 são previstas por compreenderem uma região variável da cadeia leve (região Vl ou VL) como retratado em SEQ ID NO:

ou SEQ ID NO: 19, com uma região VL como retratado em SEQ ID NO: 17 sendo preferencial, e/ou uma região variável da cadeia pesada (região Vh ou VH) como retratado em SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 20, com uma região Vh como retratado em SEQ ID NO: 18 sendo preferencial. Consequentemente, as moléculas de ligação preferenciais da invenção compreendem uma região Vl como retratado em SEQ ID NO: 17 e uma região Vh como retratado em SEQ ID NO: 18. Entretanto, outras combinações de regiões Vl e Vh reveladas no presente documento são também concebíveis. Consequentemente, uma modalidade preferencial é o anticorpo monoclonal humanizado TPP-3583 com sequências como retratado na Figura 1.

Fator XI [0041] Como apresentado anteriormente no presente documento, as moléculas de ligação da invenção são, de preferência, capazes de se ligarem ao fator XI.

[0042] Fator XI, também chamado no presente documento de fator de coagulação XI, FXI ou fXI é uma glicoproteina de duas cadeias com um peso molecular de aproximadamente 160 quiloDaltons (kD) . As duas cadeias são polipeptídeos ligados a dissulfeto idênticos com pesos moleculares de aproximadamente 80.000 daltons. FXI contém 4 domínios Apple (Al a A4 do terminal N, cadeia pesada) e um domínio catalítico do terminal C (cadeia leve). Sem a intenção de se ater à teoria específica, considera-se que os 4 domínios Apple contêm outras proteínas, como Al para fator IX (FIX), GPIb, os sítios de ligação a FXI para para trombina; A2 para HK, A3 e heparina, e A4 para FXIIa. O

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FXI pode ser convertido em sua forma ativa, o fator de coagulação Xla (FXIa) por Fator Xlla (FXIIa) . O FXIa de serina protease converte o Fator IX de coagulação em IXa,

que ativa subsequentemente o Fator	de	coagulação	X (Xa). Xa
pode, então,	mediar a ativação	de	Fator	de	coagulação
II/trombina.
[0043] Em	particular, o termo	Fator XI	’ se	refere ao

fator de coagulação humano XI com η^Ω de Acesso Uniprot P03951, versão de entrada 194 de 14 de outubro de 2015 (SEQ ID NO: 7) . Como apresentado em outra parte no presente documento, as moléculas de ligação da invenção são particularmente previstas por se ligarem a um domínio dentro de uma sequência de aminoácidos que corresponde aos aminoácidos 200 a 283 de SEQ ID NO: 7. A numeração dos aminoácidos de FXI humano inclui a sequência de sinal começando com o aminoácido metionina na posição 1.

[0044] O termo posição quando usado de acordo com a revelação significa a posição de um aminoácido dentro de uma sequência de aminoácidos retratada no presente documento ou a posição de um nucleotídeo dentro de uma sequência de ácidos nucleicos retratada no presente documento. O termo correspondente como usado no presente documento também inclui uma posição que não é apenas determinada pelo número dos nucleotídeos/aminoácidos precedentes, mas é, de preferência, visualizada no contexto da porção circundante da sequência. Consequentemente, a posição de um determinado aminoácido ou nucleotídeo de acordo com a revelação pode variar devido à deleção ou à adição de aminoácidos ou nucleotídeos em outra parte na sequência. Assim, quando uma posição é mencionada como

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18/109 posição correspondente de acordo com a revelação, entende-se que os nucleotideos/aminoácidos podem diferir em termos do numeral especificado, mas podem ainda ter nucleotideos/aminoácidos vizinhos similares. A fim de determinar se um resíduo de aminoácido (ou nucleotídeo) em uma determinada sequência corresponde a uma certa posição na sequência de aminoácidos (ou sequência de polinucleotídeos) de um aminoácido parental (ou sequência de polinucleotídeos) (por exemplo, a de FXI humano como retratado em SEQ ID NO: 7), o elemento versado pode usar meios e métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, alinhamentos de sequência, manualmente ou pelo uso de programas de computador como exemplificado no presente documento.

[0045] 0 termo epítopo, em geral, se refere a um sítio em um antígeno, tipicamente um (poli-)peptídeo, que um domínio de ligação reconhece, e também pode ser chamado de estrutura antigênica ou determinante antigênico. 0 termo domínio de ligação se refere a um sítio de ligação a antígeno, isto é caracteriza um domínio de uma molécula de ligação que se liga/interage com um determinado epítopoalvo em um antígeno ou um grupo de antígenos, por exemplo, o antígeno idêntico em diferentes espécies. Um antígenoalvo pode compreender um único epítopo, mas tipicamente compreende pelo menos dois epítopos, e pode incluir inúmeros epítopos, dependendo do tamanho, da conformação e do tipo de antígeno. Adicionalmente, deve ser observado que um epítopo em um antígeno-alvo é tipicamente um (poli)peptídeo-alvo, mas também pode ser ou incluir elementos não polipeptídeo, por exemplo, um epítopo pode incluir uma

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19/109 cadeia lateral de carboidrato. O termo epítopo em geral abrange epítopos lineares e epitopos conformacionais. Os epitopos lineares são epítopos contíguos compreendidos na sequência primária de aminoácidos e tipicamente incluem pelo menos 2 aminoácidos ou mais. Os epítopos conformacionais são formados por aminoácidos não contíguos justapostos pela dobra do antígeno-alvo, e em particular, (poli-)peptídeo-alvo.

[0046] As moléculas de ligação da presente invenção são previstas por reconhecerem epítopos localizados na cadeia pesada de fator XI que contêm uma sequência de pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10 aminoácidos contíguos ou não contíguos de fator XI (SEQ ID NO: 7) .

[0047] É, em particular, previsto que as moléculas de ligação fornecidas no presente documento se ligam ao domínio A3 de Fator XI humano que compreende aminoácidos 200 a 283 de SEQ ID NO: 7.

[0048] Entretanto, também é previsto que as moléculas de ligação podem ser capazes de se ligar a variantes de FXI humano como especificado acima. O termo variante quando usado em relação a FXI se refere a um polipeptídeo que compreende uma ou mais substituições, deleções e/ou adições de sequência de aminoácidos em comparação com uma sequência de FXI parental e exerce a mesma função biológica, isto é, pode ser convertido em seu FXIa de forma ativa que tem atividade de serina protease e catalisa a ativação de fator IX, disparando assim a via intrínseca de coagulação sanguínea. As substituições de aminoácido podem ser

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20/109 conservativas, como definido no presente documento, ou não conservativas ou qualquer combinação das mesmas. As variantes de FXI podem ter adições de resíduos de aminoácido no terminal carbóxi ou no terminal amino (onde o terminal amino pode ou não compreender uma sequência líder). Em particular, o termo variante quando usado em relação a FXI inclui isoformas, 'variantes alélicas ou de emenda, ou variantes modificadas após tradução (por exemplo, variantes de glicosilação) de polipeptídeos de FXI conhecidos, por exemplo, de um polipeptídeo de FXI que tem uma sequência como retratado em SEQ ID NO: 7. Será prontamente entendido que as moléculas de ligação da invenção podem exibir particularmente uma afinidade de ligação voltada para as variantes de FXI que compreende uma sequência de aminoácidos que corresponde aos aminoácidos 200 a 283 de SEQ ID NO: 7, ou especificamente uma sequência de aminoácidos que corresponde a a) aminoácidos 201 a 215 de SEQ ID NO: 7; b) aminoácidos 221 a 222 de SEQ ID NO: 7; c) aminoácidos 252 a 254 de SEQ ID NO: 7; d) aminoácidos 259 a 261 de SEQ ID NO: 7; e) aminoácidos 270 a 273 de SEQ ID NO: 7; e/ou f) aminoácidos 276 a 278 de SEQ ID NO: 7. De acordo com o supracitado, também é previsto que as moléculas de ligação são também capazes de se ligarem a FXIa e variantes do mesmo, desde que compreendam pelo menos um dos estiramentos de aminoácido supracitados ou posições de aminoácido correspondentes a isso.

[0049] As moléculas de ligação da invenção também podem ser capazes de se ligarem a FXI de outras espécies de mamífero, de preferência espécies de primata não humano. Esses polipeptídeos não FXI humano são, de preferência,

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21/109 codificados por um gene de FXI ou ortólogo ou parálogo do mesmo e exibem a mesma função biológica que o FXI humano. Os alvos da proteína de primata não humano potenciais das moléculas de ligação da invenção incluem polipeptídeos com η^Ω de Acesso Uniprot H2QQJ4 (Pan troglodytes, versão de entrada 26 de 11 de novembro de 2015), η^Ω de Acesso Uniprot H2PEX7 (Pongo abelii, versão de entrada 27 de 11 de novembro de 2015), η^Ω de Acesso Uniprot A0A0D9S2M6 (Chlorocebus sabaeus, versão de entrada 6 de 11 de novembro de 2015), η^Ω de Acesso Uniprot G3R2X1 (Gorilla gorilla gorilla, versão de entrada 27 de 14 de outubro de 2015), η^Ω de Acesso Uniprot A0A096NC95 (Papio anubis, versão de entrada 11 de 11 de novembro de 2015), η^Ω de Acesso Uniprot G1RLE8 (Nomascus leucogenys, versão de entrada 28 de 11 de novembro de 2015), η^Ω de Acesso Uniprot G7PKF5 (Macaca fascicularis, versão de entrada 13 de 14 de outubro de 2015), η^Ω de Acesso Uniprot G7MSF8 (Macaca mulatta, versão de entrada 12 de 14 de outubro de 2015) . As variantes dos polipeptídeos supracitados são também previstas como alvos para as moléculas de ligação da invenção. Os alvos de polipeptídeo de primata não humano reconhecidos pelas moléculas de ligação da invenção são particularmente previstos por compreenderem uma sequência que corresponde a aminoácidos 200 a 283 de SEQ ID NO: 7, e/ou uma sequência de aminoácidos que corresponde a a) aminoácidos 201 a 215 de SEQ ID NO: 7; b) aminoácidos 221 a 222 de SEQ ID NO: 7; c) aminoácidos 252 a 254 de SEQ ID NO: 7; d) aminoácidos 259 a 261 de SEQ ID NO: 7; e) aminoácidos 270 a 273 de SEQ ID NO: 7; e/ou f) aminoácidos 276 a 278 de SEQ ID NO: 7 ou uma sequência que tem pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou

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22/109 % de identidade de sequência com isso. Assim, as moléculas de ligação especificas de espécies cruzadas direcionadas contra FXI, particularmente em primatas não humanos, são também fornecidas no presente documento. O termo reconhecimento de espécie cruzada ou especificidade interespécie como usado no presente documento significa assim a ligação de uma molécula de ligação descrita no presente documento ao mesmo polipeptideo-alvo em espécies humanas e não humanas, particularmente primata não humano.

[0050] Como apresentado anteriormente, prevê-se que as moléculas de ligação descritas no presente documento são também capazes de ligação com Fator Xla de humano ou primata não humano. Assim, onde se revela no contexto das características de ligação da molécula de ligação ao Fator XI é de preferência igualmente aplicável a suas características de ligação ao Fator Xla, com as devidas alterações.

Anticorpo [0051] A molécula de ligação da invenção é, em particular, prevista como sendo um anticorpo. Como é bem conhecido na técnica, um anticorpo é uma molécula de imunoglobulina capaz de ligação específica com um epítopoalvo através de pelo menos um sítio de reconhecimento de epítopo, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. Os termos anticorpo, molécula de anticorpo e imunoglobulina são usados de modo intercambiável e em seu sentido mais amplo no presente documento e incluem anticorpos nativos, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos

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23/109 multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecificos), derivados de anticorpo (de ocorrência natural ou sintéticos), fragmentos ou variantes, proteínas de fusão que compreendem um fragmento de ligação a antígeno da especificidade requerida e qualquer outra configuração modificada do anticorpo que compreende um sítio de ligação a antígeno da especificidade requerida. Os anticorpos de acordo com a invenção são previstos como sendo capazes de ligação com FXI como descrito em outra parte no presente documento, e de preferência exibem as características vantajosas dos anticorpos TTP-3583 e TTP-3577 como apresentado nos exemplos anexos.

Anticorpo nativo [0052] Um anticorpo nativo é uma glicoproteína tetramérica. Em um anticorpo nativo de ocorrência natural, cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, em que cada par tem uma cadeia leve (cerca de 25 kDa) e uma cadeia pesada (cerca de 50-70 kDa) . A porção aminoterminal de cada cadeia inclui uma região (hiper)variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis pelo reconhecimento de antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácido de uma região determinante da complementaridade ou CDRs ou regiões CDR. Arcabouço ou resíduos de FR são aqueles resíduos de domínio variável além dos resíduos de região hipervariável.

[0053] Tanto as cadeias leves quanto as pesadas são divididas em regiões de homologia estrutural e funcional chamadas de região constante e região variável. Os termos constante e variável são usados funcionalmente.

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A esse respeito, será apreciado que as regiões variáveis tanto da cadeia leve (Vl) quanto da pesada (Vh) determinam o reconhecimento e a especificidade de antigeno. Os termos Vl, região Vl, e domínio Vl são usados de modo intercambiável por todo o relatório descritivo para se referir à região variável da cadeia leve. De modo similar, os termos Vh, região Vh e domínio Vh são usados de modo intercambiável no presente documento para se referir à região variável da cadeia pesada.

[0054] Os termos Cl, região Cl e domínio Cl são usados de modo intercambiável no presente documento para se referir à região constante da cadeia leve. Os termos Ch, região Ch e domínio Ch são usados de modo intercambiável no presente documento para se referir à região constante da cadeia pesada e compreende as regiões ou domínios Chi, Ch2 e Chs . Adversamente, os domínios constantes da cadeia leve (Cl) e da cadeia pesada (Chi, Ch2, ou Ch3 ) conferem propriedades biológicas importantes como secreção, mobilidade transplacental, ligação de receptor de Fc, ligação de complemento e similares. Por convenção, a numeração dos domínios de região constante aumentada conforme se tornam mais distais do sítio de ligação a antigeno ou do terminal amino do anticorpo. A porção Nterminal é uma região variável e a porção C-terminal é uma região constante; as regiões Ch3 e Cl compreendem de fato o terminal carbóxi das cadeias pesada e leve, respectivamente.

[0055] Como indicado acima, a região variável permite que o anticorpo reconheça seletivamente e se ligue especificamente a epítopos em antígenos. Ou seja, as

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25/109 regiões Vl e Vh, ou o subconjunto das regiões determinantes da complementaridade (CDRs) dentro desses domínios variáveis, de um anticorpo se combinam para formar a região variável que define um sítio de ligação a antígeno tridimensional. Essa estrutura de anticorpo quaternária forma o sítio de ligação a antígeno presente na extremidade de cada braço do Y. Mais especificamente, o sítio de ligação a antígeno é definido por três CDRs (CDR1, CDR2, CDR3, determinadas após o sistema de numeração de Kabat) em cada uma das regiões Vh e Vl. As três CDRs da cadeia leve são também designadas como CDR1 LC ou CDRli, CDR2 LC ou CDRlh e CDR3 LC ou CDRls no presente documento. As três CDRs da cadeia pesada são chamadas de CDR1 HC ou CDRhi, CDR2 HC ou CDRh2 e CDR3 HC ou CDRhs . Em anticorpos nativos, as seis regiões determinantes da complementaridade ou CDRs ou regiões CDR presentes em cada domínio de ligação a antígeno são tipicamente sequências de aminoácidos não contíguas curtas que são especificamente posicionadas para formar o domínio de ligação a antígeno conforme o anticorpo assume sua configuração tridimensional em um ambiente aquoso.

[0056] Como apresentado anteriormente no presente documento, as moléculas de ligação e, em particular, os anticorpos da invenção são previstos como compreendendo uma CDR1 da cadeia leve que compreende ou que consiste na sequência KASQSVLYSGDNYLN (SEQ ID NO: 8) ou KSSQSVLYSGDNYLN (SEQ ID NO: 14), com SEQ ID NO: 8 sendo preferencial; e/ou uma CDR2 da cadeia leve que compreende ou que consiste na sequência AASTLES (SEQ ID NO: 9); e/ou uma CDR3 da cadeia leve que compreende ou que consiste na sequência QQYNGDPWT

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26/109 (SEQ ID NO: 10); e/ou uma CDR1 da cadeia pesada que compreende ou que consiste na sequência TSGMGVG (SEQ ID NO:

11) ; e/ou uma CDR2 da cadeia pesada que compreende ou que consiste na sequência HIDWDDDKYYSPSLKS (SEQ ID NO: 12) ou HIWWDDDKYYNPSLKS (SEQ ID NO: 15) com SEQ ID NO: 12 sendo preferencial; e/ou uma CDR3 da cadeia pesada que compreende ou que consiste na sequência IRSSVYAHYYGMDY (SEQ ID NO: 13) ou IRSSVYAHYYGMDV (SEQ ID NO: 16), com SEQ ID NO: 13 sendo preferencial.

[0057] Uma molécula de ligação particularmente preferencial de acordo com a invenção, que pode ser um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antigeno do mesmo, compreende as seguintes CDRs: uma CDR1 da cadeia leve que compreende ou que consiste na sequência KASQSVLYSGDNYLN (SEQ ID NO: 8); uma CDR2 da cadeia leve que compreende ou que consiste na sequência AASTLES (SEQ ID NO: 9) ; uma CDR3 da cadeia leve que compreende ou que consiste na sequência QQYNGDPWT (SEQ ID NO: 10); uma CDR1 da cadeia pesada que compreende ou que consiste na sequência TSGMGVG (SEQ ID NO: 11); uma CDR2 da cadeia pesada que compreende ou que consiste na sequência HIDWDDDKYYSPSLKS (SEQ ID NO:

12) ; e uma CDR3 da cadeia pesada que compreende ou que consiste na sequência IRSSVYAHYYGMDY (SEQ ID NO: 13), em que todas as quais são retratadas na Fig. 1. O elemento versado compreenderá prontamente que as CDRs estão localizadas na região variável das cadeias leve e pesada, respectivamente. Uma modalidade particularmente preferencial da invenção é um anticorpo ou fragmento de ligação a antigeno do mesmo que compreende um sitio de ligação a antigeno da cadeia leve que compreende uma CDR1

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27/109 da cadeia leve que compreende a sequência como retratado em SEQ ID NO: 8; uma CDR2 da cadeia leve que compreende a sequência como retratado em SEQ ID NO: 9; e uma CDR3 da cadeia leve que compreende a sequência como retratado em SEQ ID NO: 10; e um sitio de ligação a antigeno da cadeia pesada que compreende uma CDR1 da cadeia pesada que compreende a sequência como retratado em SEQ ID NO: 11; uma CDR2 da cadeia pesada que compreende a sequência como retratado em SEQ ID NO: 12; e uma CDR3 da cadeia pesada que compreende a sequência como retratado em SEQ ID NO: 13. Uma modalidade particularmente preferencial adicional da invenção é um anticorpo ou fragmento de ligação a antigeno do mesmo que compreende um sitio de ligação a antigeno da cadeia leve que compreende uma CDR1 da cadeia leve que consiste na sequência como retratado em SEQ ID NO: 8; uma CDR2 da cadeia leve que consiste na sequência como retratado em SEQ ID NO: 9; e uma CDR3 da cadeia leve que consiste na sequência como retratado em SEQ ID NO: 10; e um sitio de ligação a antigeno da cadeia pesada que compreende uma CDR1 da cadeia pesada que consiste na sequência como retratado em SEQ ID NO: 11; uma CDR2 da cadeia pesada que consiste na sequência como retratado em SEQ ID NO: 12; e uma CDR3 da cadeia pesada que consiste na sequência como retratado em SEQ ID NO: 13. Um anticorpo monoclonal que compreende as CDRs supracitadas é avaliado nos Exemplos anexos e designado como TTP-3583 no presente documento.

[0058] As moléculas de ligação e, em particular, os anticorpos da invenção são previstos como compreendendo uma região Vl como retratado em SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 19, com uma região Vl como retratado em SEQ ID NO: 17 sendo

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28/109 preferencial, e/ou uma região Vh como retratado em SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 20, com uma região Vh como retratado em SEQ ID NO: 18 sendo preferencial. Consequentemente, os anticorpos preferenciais da invenção compreendem uma região Vl como retratado em SEQ ID NO: 17 e uma região Vh como retratado em SEQ ID NO: 18. Entretanto, outras combinações de regiões Vl e Vh reveladas no presente documento são também concebíveis.

[0059] As moléculas de ligação e, em particular, os anticorpos da invenção são previstos por compreenderem uma cadeia leve como retratado em SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 29, com uma cadeia leve como retratado em SEQ ID NO: 27 sendo preferencial, e/ou uma cadeia pesada como retratado em SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 30, com uma cadeia pesada como retratado em SEQ ID NO: 28 sendo preferencial. Consequentemente, os anticorpos preferenciais da invenção compreendem uma cadeia leve como retratado em SEQ ID NO: 27 e uma cadeia pesada como retratado em SEQ ID NO: 28. Entretanto, outras combinações de cadeias pesadas e leves reveladas no presente documento são também concebíveis.

[0060] Uma modalidade particularmente preferencial da invenção é um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma região Vl como retratado em SEQ ID NO: 17 e uma região Vh como retratado em SEQ ID NO: 18. Uma molécula de ligação particularmente preferencial de acordo com a invenção é um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma cadeia leve sequência como retratado em SEQ ID NO: 27 e uma cadeia pesada sequência como retratado em SEQ ID NO: 28. Uma molécula de ligação particularmente

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29/109 preferencial de acordo com a invenção é um anticorpo monoclonal que consiste em uma cadeia leve sequência como retratado em SEQ ID NO: 27 e uma cadeia pesada sequência como retratado em SEQ ID NO: 28. Um anticorpo monoclonal particularmente preferencial de acordo com a invenção é o anticorpo TPP-3583.

[0061] A porção carboxiterminal de cada cadeia leve e pesada define uma região constante principalmente responsável pela função efetora. As imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas. As cadeias pesadas são classificadas como mu (μ), delta (Δ) , gama (γ) , alfa (a), e épsilon (ε) e definem o isotipo de anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Diversos desses podem ser adicionalmente divididos em subclasses ou isotipos, por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Diferentes isotipos têm diferentes funções efetoras; por exemplo, os isotipos IgGl e IgG3 muitas vezes têm atividade de ADCC. As cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda (κ, λ) . Cada classe de cadeia pesada pode ser ligada a uma cadeia leve kappa ou lambda. Em geral, as cadeias leve e pesada são covalentemente ligadas entre si, e as porções de cauda das duas cadeias pesadas são ligadas entre si por ligações de dissulfeto covalentes ou ligações não covalentes. Os anticorpos de acordo com a invenção podem ser anticorpos IgG, especificamente, IgGl.

Anticorpos monoclonais [0062] São particularmente previstos de acordo com a presente invenção os anticorpos monoclonais e os fragmentos

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30/109 de ligação a antigeno dos mesmos. O termo anticorpo monoclonal como usado no presente documento se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto pelas possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Em contraste às preparações de anticorpo convencionais (policlonais) que incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados a diferentes epitopos, os anticorpos monoclonais contêm sítios de ligação a epítopo substancialmente similares e são, portanto, tipicamente direcionados contra o mesmo epítopo em um antigeno. O termo anticorpo monoclonal inclui assim anticorpos monoclonais recombinantes, quiméricos, humanizados, humanos ou Human Engineered™.

[0063] Vários métodos de produção para gerar anticorpos monoclonais são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 116-227 (Academic Press, 1996). As técnicas adequadas incluem o método de hibridoma primeiramente descrito por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), métodos de DNA recombinante que envolvem o isolamento e o sequenciamento de DNA que codifica os anticorpos monoclonais, e suas introdução e expressão subsequentes em células hospedeiras adequadas, e o isolamento de anticorpos das bibliotecas de fago de anticorpo geradas com o uso das técnicas primeiramente descritas em McCafferty et al. , Nature, 348: 552-554 (1990).

Anticorpo quimérico [0064] Como apresentado em outra parte no presente

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31/109 documento, o termo anticorpo também inclui anticorpos quiméricos. A frase anticorpo quimérico, como usado no presente documento, se refere a uma sequência contendo anticorpo derivada de dois anticorpos diferentes que se originam tipicamente de diferentes espécies.

Especificamente, o termo se refere a um anticorpo no qual uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da cadeia (ou cadeias) é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma outra espécie ou pertencentes a uma outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos.

[0065] Em outras palavras, o termo anticorpo quimérico será considerado como significando qualquer anticorpo em que o sítio de ligação a antígeno é obtido ou derivado de uma primeira espécie e a região constante (que pode ser intacta, parcial ou modificada de acordo com a presente invenção) é obtida a partir de uma segunda espécie. Por exemplo, o sítio de ligação a antígeno pode ser de uma fonte não humana (por exemplo, camundongo ou primata) e a região constante pode ser humano.

[0066]	Tipicamente,	os anticorpos	quiméricos	podem,	por
exemplo,	compreender	fragmentos de	anticorpo	murino	e
humano,	em geral,	regiões variável e constante	de

camundongo e humano.

Anticorpo humanizado [0067] Como apresentado anteriormente no presente

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32/109 documento, a presente invenção, em particular, se refere a anticorpos humanizados (monoclonais) e fragmentos de ligação a antigeno dos mesmos derivados do 1A6 humano antiFXI de camundongo como descrito no documento WO 2009/067660 A2 .

[0068] Um anticorpo humanizado é, em geral, definido como um que é (I) derivado de uma fonte não humana (por exemplo, um camundongo transgênico que porta um sistema imune heterólogo), cujo anticorpo é baseado em uma sequência de linha germinativa humana; ou (II) enxertado em CDR, em que as CDRs da região variável são de uma origem não humana, enquanto uma ou mais regiões de arcabouço e/ou parte da sequência de CDR da região variável são de origem humana e tipicamente a região constante (se houver) é de origem humana.

[0069] O termo anticorpo humanizado inclui assim anticorpos nos quais a região variável na cadeia pesada ou cadeia leve ou ambas de um anticorpo humano é alterada por pelo menos substituição parcial de uma ou mais CDRs de um anticorpo não humano de especificidade conhecida e, se necessário, por substituição de região de arcabouço parcial e alteração de sequência. Em outras palavras, um anticorpo no qual uma ou mais CDRs doadoras de um anticorpo não humano (como anticorpo de camundongo, rato, coelho ou primata não humano) de especificidade conhecida são enxertadas em uma região de arcabouço de cadeia leve ou pesada humana é chamado no presente documento de anticorpo humanizado. Pode não ser necessário substituir todas as CDRs pelas CDRs completas do domínio variável doador para transferir a capacidade de ligação a antigeno de um domínio

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33/109 variável para outro. De preferência, pode apenas ser necessário transferir aqueles resíduos que são necessários para manter a atividade do sítio de ligação-alvo.

[0070] Os presentes inventores humanizaram o anticorpo 1A6 de camundongo pela determinação dos resíduos de CDR de 1A6 e seleção de uma base de dados de uma sequência de linha germinativa humana com a melhor homologia geral para as sequências de Vh e Vl murinas como um arcabouço de linha germinativa humana aceitante para enxerto de CDRs de Vh e Vl, respectivamente, como detalhado no Experimento 1. Subsequentemente, os anticorpos humanizados gerados foram submetidos à otimização de CDR como descrito no Experimento 2, pela troca de aminoácidos no 1A6 por aminoácidos correspondentes na sequência de linha germinativa humana mais próxima em identidade e homologia de sequência (linha germinativa). Os presentes inventores constataram, então, que os anticorpos 1A6 humanizados com linha germinativa que compreendem 10, 11, 12, 13 ou 14 substituições de aminoácido nas sequências de CDR, e em particular que compreendem as sequências de CDR reveladas em outra parte no presente documento, exibem propriedades vantajosas em termos de características de ligação e atividade biológica, enquanto que os anticorpos com mais (TTP-3283, TTP3290) ou menos substituições de aminoácido não.

[0071] Para os propósitos da presente invenção, os anticorpos humanizados que foram otimizados em CDR (linha germinativa) são compreendidos dentro do termo anticorpos humanizados.

[0072] As regiões de arcabouço (FR) dentro da região variável em uma cadeia pesada ou leve, ou ambas, de um

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34/109 anticorpo humanizado podem compreender simplesmente resíduos de origem humana, em cujo caso essas regiões de arcabouço do anticorpo humanizado são chamadas de regiões de arcabouço completamente humanas. Uma região de arcabouço humana que compreende uma mistura de resíduos de arcabouço humanos e de doador, e é chamada no presente documento de região de arcabouço parcialmente humana. Adicionalmente, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar adicionalmente o desempenho de anticorpo (por exemplo, para obter a afinidade desejada).

[0073] Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá assim substancialmente todas dentre pelo menos uma, e tipicamente duas, regiões variáveis, nos quais todas ou parte das CDRs correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana.

Anticorpo Humano [0074] Um anticorpo humano é, por meio disso, definido como um que não é quimérico ou humanizado e não de (integralmente ou em parte) uma espécie não humana. Um anticorpo humano ou fragmento de anticorpo funcional pode ser derivado de um humano ou pode ser um anticorpo humano sintético. Um anticorpo humano sintético é definido no presente documento como um anticorpo que tem uma sequência derivada, integralmente ou em parte, in silico de

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35/109 sequências sintéticas que são baseadas na análise de sequências de anticorpos humanos conhecidas. O projeto in silico de uma sequência de anticorpos humanos ou fragmento da mesma pode ser alcançado, por exemplo, pela análise de uma base de dados de anticorpo humano ou sequências de fragmento de anticorpo e elaboração de uma sequência de aminoácidos que utiliza os dados obtidos a partir disso. Um outro exemplo de um anticorpo humano ou fragmento de anticorpo funcional é um que é codificado por um ácido nucleico isolado de uma biblioteca de sequências de anticorpos de origem humana (isto é, tal biblioteca sendo baseada em anticorpos tomados de uma fonte natural humana). Fragmentos, variantes e derivados [0075] Como apresentado anteriormente no presente documento, a invenção abrange anticorpos de comprimento completo assim como fragmentos de ligação a antigeno, variantes e derivados dos mesmos.

Fragmentos [0076] 0 termo fragmento de anticorpo se refere a um polipeptideo derivado de um anticorpo parental e que retém suas estrutura e função básicas. Um fragmento de anticorpo é, por conseguinte, de preferência, capaz de ligação com seu antigeno especifico, isto é, FXI. Adicionalmente, um fragmento de anticorpo de acordo com a invenção compreende os requisitos estruturais mínimos de um anticorpo que permitem a ligação a antigeno. Esse requisito mínimo pode, por exemplo, ser definido pela presença pelo menos das três CDRs de cadeia leve (isto é, CDR1, CDR2 e CDR3 da região V_L, isto é, CDRli, CDR_L2 e CDRls) e/ou das três CDRs de cadeia pesada (isto é, CDR1, CDR2 e CDR3 da

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36/109 região V_H, isto é, CDRhi, CDR_H2 e CDRhs) . Em outras palavras, o termo fragmento de anticorpo se refere a um polipeptideo funcional ou de ligação a antigeno que retém o sitio de ligação a antigeno (isto é, as CDRs e opcionalmente (parte de) o FR) de um anticorpo parental. Os fragmentos de anticorpo da invenção podem ser derivados, por exemplo, de anticorpos monoclonais, recombinantes, quiméricos, humanizados e humanos parentais.

[0077] Os fragmentos de anticorpo de ligação a antigeno preferenciais compreendem pelo menos um dentre, de preferência todos dentre, uma CDR1 da cadeia leve que compreende a sequência KASQSVLYSGDNYLN (SEQ ID NO: 8); uma CDR2 da cadeia leve que compreende a sequência AASTLES (SEQ ID NO: 9); uma CDR3 da cadeia leve que compreende a sequência QQYNGDPWT (SEQ ID NO: 10); uma CDR1 da cadeia pesada que compreende a sequência TSGMGVG (SEQ ID NO: 11); uma CDR2 da cadeia pesada que compreende a sequência HIDWDDDKYYSPSLKS (SEQ ID NO: 12); e uma CDR3 da cadeia pesada que compreende a sequência IRSSVYAHYYGMDY (SEQ ID NO: 13).

[0078] Em relação ao supracitado, o termo fragmentos de anticorpo de ligação a antigeno particularmente se refere a fragmentos de anticorpos de comprimento completo, como (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab' , F(ab')2 ou r IgG (meio anticorpo). Os fragmentos de anticorpo de acordo com a invenção também podem ser fragmentos modificados de anticorpos como scFv, di-scFv ou bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFvzipper, scFab, Fab2, Fab3, diacorpos, diacorpos de cadeia única, diacorpos em tandem (Tandab's), di-scFv em tandem, tri-scFv em tandem, minicorpos exemplificados por uma

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37/109 estrutura que é a seguinte: (V_h-V_l-CH3) 2, (scFv-CHsH ou (scFv-CHs-scFv)2, multicorpos como triacorpos ou tetracorpos. Adicionalmente, a definição do termo fragmentos de anticorpo inclui construtos que compreendem os ditos fragmentos, isto é, construtos monovalentes, bivalentes e polivalentes/multivalentes e, assim, construtos monoespecificos, especificamente ligação a apenas um antigeno-alvo, assim como construtos biespecificos e poliespecificos/multiespecificos, que se ligam especificamente a mais que um antigenos-alvo, por exemplo, dois, três ou mais, através de sítios de ligação a antígeno distintos. Além disso, a definição do termo fragmentos de anticorpo inclui moléculas que consistem em apenas uma cadeia de polipeptídeo assim como moléculas que consistem em mais que uma cadeia de polipeptídeo, cujas cadeias podem ser idênticas (homodímeros, homotrímeros ou homo-oligômeros) ou diferentes (heterodímero, heterotrímero ou hetero-oligômero).

[0079] Os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante ou por divagem enzimática ou química de anticorpos intactos. Os métodos para produzir tais fragmentos são bem conhecidos na técnica.

Variantes [0080] 0 termo variante se refere a polipeptídeos que compreendem a sequência de aminoácidos de uma molécula de ligação parental, como um anticorpo ou fragmento de anticorpo, mas que contêm pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição, deleção ou inserção) em comparação com a sequência de aminoácidos parental, desde que o variante seja ainda capaz de

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38/109 (especificamente) ligação com FXI, em particular, FXI humano como retratado em SEQ ID NO: 7, e de preferência exibe similar ou ainda características aprimoradas em comparação com os anticorpos TTP-3583 e/ou TTP-3577 como avaliado nos Exemplos anexos. As variantes das moléculas de ligação da invenção, particularmente de anticorpos e fragmentos de anticorpo, são tipicamente preparadas pela introdução de alterações de nucleotídeo apropriadas nos ácidos nucleicos que codificam o anticorpo ou fragmento de anticorpo, ou por síntese de peptídeo. Em geral, as modificações de aminoácido supracitadas podem ser introduzidas ou estar presentes na região variável ou na região constante, sob a premissa de que duas ou mais CDRs das variantes compreendem cumulativamente 10, 11, 12, 13 ou 14 substituições de aminoácido em comparação com as CDRs de 1A6 como retratado em SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 e 6. As modificações de aminoácido podem, por exemplo, ser introduzidas a fim de modular as propriedades de anticorpo como estabilidade termodinâmica, solubilidade ou viscosidade que afetam o desenvolvimento farmacêutico (otimização de sequência).

[0081] Como apresentado anteriormente, as modificações de aminoácido incluem, por exemplo, deleções de e/ou inserções em e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos de moléculas de ligação descritas no presente documento, de preferência os anticorpos ou fragmentos de anticorpo de ligação a antígeno. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser introduzida na sequência de aminoácidos parental a fim de chegar no produto final, desde que possua as

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39/109 características desejadas como apresentado em outra parte no presente documento, as modificações de aminoácido também podem alterar processos pós-traducionais das moléculas de ligação, como alteração do número ou posição de sítios de glicosilação.

[0082] Por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 aminoácidos podem ser inseridos ou deletados em cada uma das CDRs (obviamente, dependendo de seu comprimento), embora 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 25 aminoácidos possam ser inseridos ou deletados em cada um dos FRs. As inserções de sequência de aminoácidos previstas no presente documento incluem fusões de terminal amino e/ou carboxila na faixa de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos para polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, assim como inserções intrassequência de únicos ou múltiplos resíduos de aminoácido. Uma variante de inserção de uma molécula de ligação, em particular um anticorpo ou fragmento de anticorpo, da invenção inclui um produto de fusão de um anticorpo ou fragmento de anticorpo e uma enzima ou um outro polipeptídeo funcional (por exemplo, que aumenta a meia-vida sérica da molécula de ligação, por exemplo, anticorpo ou fragmento de anticorpo).

[0083] As substituições de aminoácido podem ser introduzidas nas CDRs da cadeia pesada e/ou leve, em particular, as regiões hipervariáveis, ou as regiões de FR na cadeia pesada e/ou leve. São particularmente previstas no presente documento substituições conservativas de aminoácido que podem ser feitas, por exemplo, com base na similaridade em polaridade, carga, solubilidade,

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40/109 hidrofobicidade, hidrofilicidade, e/ou natureza antipática dos resíduos envolvidos.

[0084] De preferência, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos podem ser substituídos nas CDRs - desde que a variante de anticorpo compreenda cumulativamente 10, 11, 12, 13 ou 14 substituições de aminoácido em comparação com as CDRs de 1A6 como retratado em SEQ ID NO: 1-6-, embora 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 25 aminoácidos possam ser substituídos nas

regiões	de	arcabouço	(FRs), dependendo do	comprimento	da
CDR ou	FR.
[0085]	Em	geral, se	os aminoácidos forem	substituídos	em
uma ou	mais	ou todas as CDRs da cadeia pesada e/ou leve,	é

preferencial que a sequência de variante assim obtida seja pelo menos 80 %, ainda com mais preferência pelo menos 90 % e com máxima preferência pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica com a sequência de CDR parental. O comprimento da CDR influencia assim no número de substituições de aminoácido possíveis de modo que a sequência de variantes seja ainda abrangida pela invenção. Por exemplo, uma CDR que tem 5 aminoácidos é de preferência 80 % idêntica a sua sequência substituída a fim de ter pelo menos um aminoácido substituído. Consequentemente, as CDRs do construto de anticorpo podem ter diferentes graus de identidade com suas sequências substituídas, por exemplo, CDRli pode ter 80 %, enquanto CDR_L3 pode ter 90 %.

[0086] As substituições preferenciais são substituições conservativas. Entretanto, qualquer substituição (incluindo substituição não conservativa ou um ou mais das substituições exemplificativas) é prevista desde que o

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41/109 construto de anticorpo retenha sua capacidade de se ligar a FXI e/ou suas CDRs tenham uma identidade com a sequência assim substituída de pelo menos 80 %, ainda com mais preferência pelo menos 90 % e com máxima preferência pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 %.

[0087] Como usado no presente documento, o termo identidade de sequência indica a proporção na qual duas sequências (nucleotídeo ou aminoácido) têm resíduos idênticos nas mesmas posições em um alinhamento, e é muitas expressa como uma porcentagem. De preferência, a identidade é determinada por todo o comprimento das sequências que são comparadas. Assim, duas cópias exatamente da mesma sequência têm 100 % de identidade, mas as sequências que são menos altamente conservadas, e têm deleções, adições ou substituições podem ter um grau inferior de identidade. Os elementos versados na técnica reconhecerão que diversos algoritmos estão disponíveis para determinar a identidade de sequência com o uso de parâmetros padrão, por exemplo, Blast (Altschul, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:33893402), Blast2 (Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410), Smith-Waterman (Smith, et al. (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197) e ClustalW. Consequentemente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID Nos: 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 31 ou 32 pode servir como sequência em questão ou sequência de referência, enquanto a sequência de aminoácidos ou sequência de ácidos nucleicos de um polipeptídeo diferente da mesma pode servir como sequência de consulta.

[0088] O termo homologia de sequência indica a similaridade de duas sequências (nucleotídeo ou aminoácido)

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42/109 atribuídas à descendência de um antecessor comum. Os componentes biológicos homólogos (genes, proteínas, estruturas) são chamados de homólogos e incluem ortólogos e parálogos.

[0089] As variantes de molécula de ligação preferenciais da invenção têm uma identidade ou homologia de sequência nas regiões CDR de pelo menos 80 %, ainda com mais preferência pelo menos 90 % e com máxima preferência pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou quase 100 % e exibem uma afinidade de ligação comparável ou aprimorada com FXI e/ou um atividade biológica comparável ou aprimorada em comparação com as moléculas de ligação que compreendem as CDRs parentais, em particular, SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12 e 13.

[0090] Além disso, a homologia ou similaridade de sequência de ácidos nucleicos entre as sequências de nucleotídeos que codificam CDRs variantes individuais e as sequências de nucleotídeos retratadas no presente documento são pelo menos 80 %, e mais tipicamente com de preferência homologias ou identidades crescentes de pelo menos 81 %, 82

o, Q Q Q, o r O J o r	84 %,	85 %,	86 %,	87 %, 88 %,	89 %	, 90 %, 91 %,	92
%, 93 %,	94 %,	95 %,	96 %,	97 %, 98 %,	ou	99 % e quase	100
o 0 ·
[0091]	Além	disso,	nas	CDRs e FRs,	as	modificações	de

aminoácido também podem ser introduzidas na parte de Fc de uma molécula de ligação, que é de preferência um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Tais modificações podem ser usadas a fim de modular as propriedades funcionais do anticorpo, por exemplo, interações com as proteínas complementares como Clq e/ou

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43/109 receptores de Fc em outras células imunes, ou para modular a meia-vida sérica ou citotoxicidade celular dependente de antígeno (ADCC). Assim, as mutações para modificação de funções efetoras podem ser introduzidas nos domínios de Fc com o uso de métodos de rotina conhecidos na técnica. As modificações exemplificativas incluem Asn297—>Ala297 e Asn297—>Gln297 resultando em aglicosilação de IgGl, ou Lys322—>Ala322 e opcionalmente Leu234—>Ala234 e Leu235—>Ala234 que relatadas como redutoras ou anuladoras de citotoxicidade mediada por célula derivada de anticorpo (ADCC) e/ou citotoxicidade derivada de complemento (CDC).

Derivados [0092] O termo molécula de ligação também abrange derivados. São particularmente previstos no presente documento derivados de anticorpos ou fragmentos de anticorpo como revelado em outra parte no presente documento. O termo derivado se refere, em geral, a uma molécula de ligação que foi covalentemente modificada para introduzir uma funcionalidade adicional. As modificações covalentes das moléculas de ligação são, em geral, mas nem sempre, feitas pós-traducionalmente, e podem ser introduzidas na molécula de ligação pela reação de resíduos de aminoácido específicos da molécula com um agente de derivatização orgânico que tem capacidade de reagir com cadeias laterais selecionadas ou os resíduos de terminal N ou C. A derivatização de moléculas de ligação pode ser usada para fixar agentes terapêuticos ou diagnósticos, identificações, grupos que estendem a meia-vida sérica da molécula, ou inserção de aminoácidos não naturais. As

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44/109 modificações químicas possíveis das moléculas de ligação da invenção incluem acilação ou acetilação da extremidade de terminal N ou amidação ou esterificação da extremidade de terminal C ou, alternativamente, ambos. As modificações químicas como alquilação (por exemplo, metilação, propilação, butilação), arilação e eterificação são também previstas.

Extensão de meia-vida sérica [0093] Os exemplos para meios para estender a meia-vida sérica das moléculas de ligação e, em particular, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da invenção incluem a fixação de ligação de domínios de peptídeos ou proteína a outras proteínas no corpo humano (como albumina sérica, a região Fc de imunoglobulina ou o receptor de Fc neonatal (FcRn). As modificações concebíveis adicionais para estender a meia-vida sérica compreendem a extensão de um grupo amino com cadeias de polipeptídeo de comprimento variado (por exemplo, tecnologia XTEN ou PASylation®), a conjugação de polímeros não proteáceos, incluindo, mas sem limitação a, vários polióis como polietileno glicol (PEGilação), polipropileno glicol, polioxialquilenos, ou copolímeros de polietileno glicol e polipropileno glicol, ou de carboidratos, como amido de hidroxietila (por exemplo, HESylation®) ou ácido polisiálico (por exemplo, tecnologia poliXen®). Além disso, como é conhecido na técnica, as substituições de aminoácido podem ser feitas em várias posições dentro da molécula de ligação a fim de facilitar a adição dos ditos polímeros.

Glicosilação [0094] Um outro tipo de modificação covalente das

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45/109 moléculas de ligação e, em particular, de anticorpos e fragmentos de ligação a antigeno dos mesmos da invenção compreende alterar seu padrão de glicosilação. Como é conhecido na técnica, os padrões de glicosilação podem depender tanto da sequência de aminoácidos da dita molécula (por exemplo, da presença ou ausência de resíduos de glicosilação particulares de aminoácido, discutidos abaixo), ou da célula hospedeira ou organismo no qual a proteína é produzida. A glicosilação de polipeptídeos é tipicamente ligada a N ou ligada a O. Ligada a N se refere à fixação da fração de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. A adição de sítios de glicosilação ligados a N à molécula de ligação é convenientemente realizada pela alteração da sequência de aminoácidos de modo que contenha uma ou mais sequências de tri-peptídeo selecionadas a partir de asparagina-X-serina e asparaginaX-treonina (onde X é qualquer aminoácido exceto prolina). Os sítios de glicosilação ligados a O podem ser introduzidos pela adição de ou substituição por um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência inicial.

[0095] Um outro meio de glicosilação da molécula de ligação é por acoplamento químico ou enzimático de glicosídeos à proteína. Esses procedimentos são vantajosos, pois não requerem a produção da proteína em uma célula hospedeira que tem capacidades de glicosilação para glicosilação ligada a N e O. Dependendo do modo de acoplamento usado, o açúcar (ou açúcares) pode ser fixado a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxila livres, (c) grupos sulfo-hidrila livres como aqueles de cisteína, (d) grupos hidroxila livres como aqueles de serina, treonina ou

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46/109 hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos como aqueles de fenilalanina, tirosina ou triptofano, ou (f) o grupo amida de glutamina.

[0096] De modo similar, a deglicosilação (isto é, remoção de frações de carboidrato presentes na molécula de ligação) pode ser realizada quimicamente, por exemplo, pela exposição da molécula de ligação a ácido trifluorometanossulfônico ou enzimaticamente pelo emprego de endo e exoglicosidases.

Identificação [0097] As modificações covalentes potenciais adicionais das moléculas de ligação da invenção compreendem s adição de uma ou mais identificações. 0 grupo de identificação pode ser acoplado à molécula de ligação através de espaçadores de vários comprimentos para reduzir impedimento estérico potencial. Vários métodos para identificação de proteínas são conhecidos na técnica e podem ser usados na realização da presente invenção. 0 termo identificação ou grupo de identificação se refere a qualquer identificação detectável. Em geral, as identificações se enquadram em uma variedade de classes, dependendo do ensaio no qual devem ser detectadas - as seguintes identificações exemplificativas incluem, mas não são limitadas a: identificações isotópicas, que podem ser isótopos radioativos ou pesados, como radioisótopos ou radionuclideos (por exemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 89Zr, 90Y, 99Tc, lllln, 1251, 1311); identificações magnéticas (por exemplo, partículas magnéticas); frações ativas de redox; corantes ópticos (incluindo, mas sem limitação a, cromóforos, fósforos e fluoróforos) como grupos

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47/109 fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforos lantanídeos), grupos quimioluminescentes, e fluoróforos que podem ser fluoróforos de molécula pequena ou fluoróforos proteáceos; grupos enzimáticos (por exemplo, peroxidase de rábano, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina; grupos biotinilados; ou epítopos de polipeptídeo predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de par de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação metálicos, etiquetas de epítopo, etc.)

ADCs [0098] Também é concebível adicionar um fármaco, como um composto de molécula pequena, às moléculas de ligação e em particular anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos. Conjugados de fármaco de anticorpo, abreviados como ADC são anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos ligados a fármaco ou agente. A ligação pode ser estabelecida através de ligações covalentes, ou interações não covalentes como através de forças eletrostáticas. Vários ligantes, conhecidos na técnica, podem ser empregados a fim de formar o ADC como é conhecido na técnica e descrito no presente documento.

Etiquetas de afinidade [0099] A molécula de ligação, e em particular o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, da invenção também pode compreender domínios adicionais, que auxiliam na purificação e no isolamento da molécula (etiquetas de afinidade). Os exemplos não limitantes de tais domínios adicionais compreendem motivos de peptídeo conhecidos como Myc-tag, HAT-tag, HA-tag, TAP-tag, GST-tag,

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48/109 domínio de ligação de quitina (CBD-tag), proteína de ligação de maltose (MBP-tag), Flag-tag, Strep-tag e variantes do mesmo (por exemplo, Strep II-tag) e His-tag.

[0100] Os fragmentos, variantes e derivados supracitados podem ser adicionalmente adaptados a fim de aprimorar, por exemplo, suas propriedades de ligação a antígeno. Por exemplo, F(ab')2 ou Fab podem ser manipulados para minimizar ou remover completamente as interações de dissulfeto intermoleculares que ocorrem entre os domínios Chi e Cl. Os polipeptídeos Fv podem compreender adicionalmente um ligante de polipeptídeo entre os domínios Vh e Vl que permite que o Fv forme a estrutura desejada para ligação a antígeno. O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e a primeira região constante (CHi) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab diferem dos fragmentos Fab pela adição de poucos resíduos na terminação carbóxi da região CHi de cadeia pesada que inclui uma ou mais cisteínas da região de articulação de anticorpo. Fab'-SH é a designação no presente documento para Fab' no qual o resíduo (ou resíduos) de cisteína da região constante porta um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que possuem resíduos de cisteína de articulação entre os mesmos.

[0101] As moléculas de ligação da invenção podem ser fornecidas em forma isolada ou substancialmente pura. Isolado ou substancialmente puro quando usado no presente documento significa que a molécula de ligação foi identificada, separada e/ou recuperada de um componente de seu ambiente de produção, de modo que a molécula de ligação

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49/109 isolada seja livre ou substancialmente livre de outros componentes contaminantes de seu ambiente de produção que podem interferir em seu uso terapêutico ou diagnóstico. Os componentes contaminantes podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteáceos ou não proteáceos. As moléculas de ligação isoladas, serão, assim, preparadas por pelo menos uma etapa de purificação que remove ou remove substancialmente esses componentes contaminantes. A definição supracitada é igualmente aplicável a polinucleotídeos isolados, com as devidas alterações.

Ligação específica [0102] As moléculas de ligação da invenção, em particular, os anticorpos e os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, têm vantajosamente capacidade de ligação com fator XI, em particular Fator XI humano que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos como retratado em SEQ ID NO: 7. Os termos ligação a e que reconhece em todas as formas gramaticais são usados de modo intercambiável no presente documento. De preferência, as ditas moléculas de ligação se ligam especificamente ao fator XI. O termo se liga especificamente indica em geral que uma molécula de ligação, em particular um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo como descrito no presente documento, se liga através de seu sítio de ligação a antígeno mais prontamente a seu epítopo-alvo que a um epítopo-não alvo não relacionado aleatório. Particularmente, o termo se liga especificamente indica que a afinidade da molécula de ligação será pelo menos cerca de 5 vezes, de preferência 10 vezes, com mais preferência 25 vezes, ainda com mais preferência 50 vezes,

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50/109 e com máxima preferência 100 vezes ou mais, maior para seu epitopo-alvo do que sua afinidade para um epitopo-não alvo. [0103] Assim, uma molécula de ligação, e em particular um anticorpo ou fragmento de ligação a antigeno do mesmo, pode ser considerada como se ligando especificamente a seu epitopo-alvo se ligar ao dito epitopo a uma constante de dissociação (Kd) que é menor que a Kd do anticorpo para um epitopo-não alvo. As moléculas de ligação da invenção também podem ser descritas em termos de sua afinidade de ligação ao fator XI, em particular ao Fator XI humano. O termo afinidade ou afinidade de ligação se refere à intensidade da ligação de um epitopo individual a um domínio de ligação a antigeno (e em particular as CDRs da molécula de ligação). A afinidade da ligação de uma determinada molécula de ligação a seu epitopo específico é muitas determinada pela medição da constante de associação de equilíbrio (ka) e constante de dissociação de equilíbrio (kd) e pelo cálculo do quociente de kd por ka (Kd = kd/ka).

As afinidades de ligação podem ser prontamente determinadas usando técnicas convencionais, como por diálise de equilíbrio; pelo uso do instrumento BIAcore 2000; por radioimunoensaio usando antígeno-alvo radioidentifiçado; ou por um outro método conhecido pelo elemento versado na técnica. Os dados de afinidade podem ser analisados, por exemplo, pelo método descrito em Kaufman RJ e Sharp PA. (1982) J Mol Biol.159:601-621. As afinidades de ligação preferenciais das moléculas de ligação inventivas incluem aquelas com uma constante de dissociação ou Kd menos que 5 x ΙΟ-⁶ Μ, IO-⁶ M, 5 x 10~⁷ Μ, 10~⁷ M, 5 x 10~⁸ Μ, 10~⁸ M, 5 x 10~⁹ Μ, 10~⁹ M, 5 x 10~¹⁰ M, 10~¹⁰ M, 5 x 10~¹⁷ Μ, 10~¹⁷ M, 5 x

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10-¹² Μ, 10-¹² Μ, 5 χ 10~¹³ Μ, 10~¹³ Μ, 5 χ 10~¹⁴ Μ, 10~¹⁴ Μ, 5 χ 10~¹⁵ Μ ou 10~¹⁵ Μ.

Reatividade Cruzada [0104] Ο termo se liga especificamente, entretanto, não exclui que as moléculas de ligação (especificamente) que se ligam ao Fator XI humano reagem de forma cruzada com uma proteína de fator XI de uma espécie diferente. Consequentemente, as moléculas de ligação da invenção também podem ter capacidade de ligação a FXI de outras espécies de mamífero, de preferência espécies de primata não humano como exemplificado em outra parte no presente documento.

[0105] Ligação ou reconhecimento de espécie cruzada significa ligação de um domínio de ligação descrito no presente documento ao mesmo antígeno-alvo em humanos e espécie não humana. Assim, especificidade de espécie cruzada deve ser entendido como uma reatividade interespécie com o Fator XI expressado em diferentes espécies, mas não com um antigeno além do Fator XI. Por exemplo, um domínio de ligação que se liga a Fator XI humano, em particular ao domínio A3 que compreende aminoácidos 200 a 283 da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:7 também pode se ligar a Fator XI de primata não humano, e em particular a uma região que corresponde aos aminoácidos 200 a 283 da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 7.

Atividade biológica [0106] As moléculas de ligação fornecidas no presente documento são previstas como sendo biologicamente ativas, isto é, se ligam a Fator XI e/ou Fator Xla e bloqueiam suas

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52/109 respectivas funções biológicas. Especificamente, moléculas de ligação biologicamente ativas de acordo com a invenção bloqueiam a conversão de Fator XI para sua forma ativa (Fator Xla) e/ou bloqueiam a ligação de Fator IX de coagulação a jusante com Fator Xla, de preferência resultando em uma inibição completa ou parcial de atividade de Fator XI e/ou Fator Xla. A ligação das moléculas de ligação biologicamente ativas a seu Fator XI e/ou Fator Xla-alvo é assim prevista como resultante em uma atividade anticoagulatória. Em outras palavras, prevê-se que as moléculas de ligação de acordo com a invenção exerçam sua função benéfica através de a) ligação a Fator XI, bloqueando por meio disso sua conversão em seu Fator Xla de forma ativa, e/ou b) ligação a Fator Xla, bloqueando por meio disso sua ligação a e ativação de Fator IX de coagulação a jusante. As moléculas de ligação da invenção de preferência interrompem, por meio disso, o ramal de FXI da cascata de coagulação e, por meio disso, prevenir a trombose, vantajosamente sem prejudicar a hemóstase normal. [0107] A atividade anticoagulatória de uma molécula de ligação pode ser determinada in vitro como descrito nos Experimentos anexos. Brevemente, o tempo de tromboplastina parcial ativado (aPTT) é determinado na presença de concentrações variáveis da dita molécula de ligação ou o solvente correspondente usando um kit de teste comercial (reagente de PIT da Roche) . Os compostos de teste são incubados com o plasma e o reagente de PTT (cefalina, caolina) a 37° C por 3 minutos. Desse modo, a coagulação é iniciada pela adição de cloreto de cálcio a 25 mM e o tempo quando a coagulação ocorre é determinado. A concentração da

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53/109 substância de teste que produz um prolongamento de 1,5 vezes do aPTT é determinada.

[0108] Prevê-se que as concentrações das moléculas de ligação da presente invenção levam a um prolongamento de 1,5 vezes do aPTT em uma concentração de 0,03 μΜ ou menos, ou 0,015 μΜ ou menos, ou 0,01 μΜ ou menos.

[0109] Vantajosamente, as moléculas de ligação e, em particular, anticorpos monoclonais e fragmentos de ligação a antigeno dos mesmos de acordo com a invenção exibem as propriedades biológicas e são, portanto, agentes inovadores promissores para inibição de trombose. Devido ao fato de que as moléculas de ligação são particularmente previstas por se ligarem especificamente ao Fator XI, prevê-se que as mesmas não comprometem ou não comprometem severamente a hemóstase e, através disso, de preferência, não aumentam o risco de sangramento.

Polinucleotídeo [0110] A invenção fornece adicionalmente uma molécula de polinucleotideo/ácido nucleico que codifica uma molécula de ligação ou um domínio de Vh ou Vl da invenção.

[0111] O termo polinucleotídeo como usado no presente documento compreende polirribonucleotídeos e polidesoxirribonucleotídeos, por exemplo, RNA ou DNA modificado ou não modificado, cada um na forma de fita dupla e/ou fita simples, linear ou circular ou misturas dos mesmos, incluindo moléculas híbridas. Um polinucleotídeo pode compreender uma ligação convencional de fosfodiéster ou uma ligação não convencional (por exemplo, uma ligação amida, como encontrado em ácidos nucleicos de peptídeo (RNA)). Os polinucleotídeos da invenção também podem conter

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54/109 uma ou mais bases modificadas, como, por exemplo, bases tritiladas e bases incomuns, como inosina. Outras modificações, incluindo modificações químicas, enzimáticas ou metabólicas, também são concebíveis, enquanto uma molécula de ligação da invenção pode ser expressa a partir do polinucleotideo. O polinucleotideo pode ser fornecido na forma isolada como definido em outra parte no presente documento. Um polinucleotideo pode incluir sequências regulatórias, como elementos de controle de transcrição (incluindo promotores, intensificadores, operadores, repressores e sinais de terminação de transcrição), sítio de ligação de ribossomo, introns ou similares.

[0112] Em conformidade, a presente invenção fornece um polinucleotideo que compreende ou que consiste em um ácido nucleico que codifica uma região de cadeia pesada de imunoglobulina (região Vh) , em que pelo menos uma das CDRs da região Vh tem uma sequência de aminoácidos que é pelo

menos

cerca de

80

O 0 r

cerca

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85

O 0 r

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95 %,

cerca de

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cerca

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de

99 %,

ou idêntico

a

qualquer

um

dentre SEQ

ID

NO :

11,

12,

13, 15 ou 16, com SEQ ID NO: 11-13 sendo preferencial. Além disso, a presente invenção inclui um polinucleotideo que compreende ou que consiste em um ácido nucleico que

codifica	uma	região Vh <	que	tem uma sequência	de	aminoácidos
que é pelo menos cerca	de	80 %, cerca	de	85	O 0 r	cerca	de	90
%, cerca	de	91 %, cerca	de	92 %, cerca	de	93	o 0 r	cerca	de	94
%, cerca	de	95 %, cerca	de	96 %, cerca	de	97	o 0 r	cerca	de	98
%, cerca	de	99 %, ou	100	% idêntico	a	uma sequência	de

aminoácidos de região Vh de referência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:18 e 20, com SEQ ID NO:

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55/109 sendo preferencial. Uma molécula de ligação que compreende as CDRs codificadas ou domínios de Vh é prevista como capaz de se ligar a FXI e, de preferência, exibir as atividades biológicas desejadas como descrito em outra parte no presente documento.

[0113] Além disso, a presente invenção fornece um polinucleotideo que compreende ou que consiste em um ácido nucleico que codifica um domínio de cadeia leve de imunoglobulina (região Vl) , em que pelo menos uma das CDRs da região Vl tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80 %, cerca de 85 %, cerca de 90 %, cerca de 95 %, cerca de 96 %, cerca de 97 %, cerca de 98 %, cerca de 99 %, ou idêntico a qualquer um dentre SEQ ID NOS: 8, 9, 10 ou 14, com SEQ ID n^os 8-10 sendo preferencial. Ademais, a presente invenção inclui um polinucleotideo que compreende ou que consiste em um ácido nucleico que codifica uma região Vl que tem uma sequência de aminoácidos que é pelo

menos

cerca

de

80

O 0 r

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85

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o 0 r

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97

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cerca

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98

o 0 r

cerca

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%, ou 100 % idêntico a uma sequência de aminoácidos de região Vl de referência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 17 ou 19, com SEQ ID NO: 17 sendo preferencial. Uma molécula de ligação que compreende as CDRs codificadas ou regiões Vl é prevista como capaz de se ligar a FXI e, de preferência, exibir as atividades biológicas desejadas como descrito em outra parte no presente documento.

[0114] Além disso, a presente invenção fornece um polinucleotideo isolado que compreende ou que consiste em

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56/109 um ácido nucleico que é pelo menos cerca de 80 %, cerca de

85

O 0 r

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99

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ou 10 0

o 0

idêntico a

uma

sequência de polinucleotideos de referência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 31, 32, 33 e 34. [0115] Os polinucleotideos descritos acima podem compreender ou não sequências de nucleotideos adicionais, que codificam, por exemplo, um peptídeo de sinal para direcionar a secreção do polipeptideo codificado, regiões constantes de anticorpo como descrito no presente documento ou outros polipeptideos heterólogos como descrito no presente documento. Tais polinucleotideos podem, então, codificar os polipeptideos de fusão, fragmentos, variantes e outros derivados das moléculas de ligação descritas no presente documento.

[0116] Também, a presente invenção inclui composições que compreendem um ou mais dos polinucleotideos descritos acima. Também são fornecidas no presente documento composições que compreendem um primeiro polinucleotideo e segundo polinucleotideo em que o dito primeiro polinucleotideo codifica uma região Vh como descrito no presente documento e em que o dito segundo polinucleotideo codifica uma região Vl como descrito no presente documento, especificamente uma composição que compreende, ou consiste em uma região Vh selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 18 e 20 (com SEQ ID NO: 18 sendo preferencial), e/ou uma região Vl selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:17 e 19 (com SEQ ID NO: 17 sendo preferencial).

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Produção de polinucleotídeos [0117] Os polinucleotídeos da invenção podem ser produzidos por métodos de rotina conhecidos na técnica. Por exemplo, se a sequência de nucleotideos da molécula de ligação for conhecida, um polinucleotideo que codifica a molécula de ligação pode ser montado a partir de oligonucleotideos quimicamente sinterizados, recozimento e ligação daqueles oligonucleotideos e, então, amplificação dos oligonucleotideos ligados por PCR. Um polinucleotideo que codifica uma molécula de ligação pode ser obtido a partir de uma fonte adequada (por exemplo, uma biblioteca de cDNA ou um ácido nucleico, como um poli (a)+ mRNA isolado a partir de qualquer tecido ou células que expressam a molécula de ligação, como células de hibridoma) por amplificação de PCR usando iniciadores sintéticos hibridizáveis para as extremidades 3' e 5' da sequência ou pela clonagem usando uma sonda de oligonucleotideo específica para a sequência de genes particular para identificar, por exemplo, um clone de cDNA de uma biblioteca de cDNA que codifica a molécula de ligação.

[0118] Uma vez que tenham sido determinadas a sequência de nucleotideos e a sequência de aminoácidos correspondente da molécula de ligação, sua sequência de nucleotideos pode ser modificada usando métodos bem conhecido na técnica para a manipulação de sequências de nucleotideos, por exemplo, técnicas de DNA recombinante, mutagênese de sítio-dirigida, PCR, etc., introduzindo, através disso, uma ou mais substituições, adições ou deleções de nucleotídeo na sequência de polinucleotídeos (consulte, por exemplo, as técnicas descritas em J. Sambrook et al., Molecular

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Cloning: A Laboratory Manual (4^a Edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York (2012)) para gerar fragmentos de ocorrência não natural, variantes ou derivados da molécula de ligação e, em particular, o anticorpo anti-FXI monoclonal descrito no presente documento (por exemplo, uma região de cadeia leve ou região de cadeia pesada de imunoglobulina).

Vetores [0119] Um vetor que compreende o polinucleotideo como descrito no presente documento é adicionalmente fornecido no presente documento. O dito polinucleotideo codifica uma molécula de ligação da invenção, em particular, um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antigeno do mesmo. Um vetor é uma molécula de ácido nucleico usada como um veiculo para transferir material genético (estranho) em uma célula hospedeira em que o mesmo pode, por exemplo, ser replicado e/ou expresso.

[0120] O termo vetor abrange, sem limitação, plasmideos, vetores virais (incluindo vetores retrovirais, vetores lentivirais, vetores adenovirais, vetores de virus de vacina, vetores de virus de polioma e vetores de adenovirus associado (AAV)), fagos, fagemideos, cosmideos e cromossomos artificiais (incluindo BACs e YACs). O próprio vetor é geralmente uma sequência de nucleotideos, comumente uma sequência de DNA que compreende um inserto (transgene) e uma sequência maior que serve como a cadeia principal do vetor. Os vetores manipulados compreendem tipicamente uma origem para replicação autônoma nas células hospedeiras (se a expressão estável do polinucleotideo for desejada), marcadores de seleção e sítios de divagem de enzima de

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59/109 restrição (por exemplo, um sítio de clonagem múltipla, MCS) . O vetor pode compreender adicionalmente promotores, marcadores genéticos, genes-repórter, sequências de alvejamento e/ou etiquetas de purificação de proteína. Os vetores chamados de vetores de expressão (construtos de expressão) são especificamente projetados para a expressão do transgene na célula-alvo e têm geralmente sequências de controle.

[0121] Um grande número de vetores adequados é conhecido àquele versado na técnica e é comercialmente disponível. Os exemplos de vetores adequados são fornecidos em J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4^a Edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York (2012) .

Vetores de alvejamento [0122] Os vetores de alvejamento podem ser usados para integrar um polinucleotideo no cromossomo da célula hospedeira (como descrito por J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4^a Edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York (2012)). Brevemente, meios adequados incluem recombinação homóloga ou uso de uma recombinase híbrida que alveja especificamente as sequências nos sítios de integração. Os vetores de alvejamento são tipicamente circulares e linearizados antes de serem usados para recombinação homóloga. Como uma alternativa, os polinucleotídeos estranhos podem ser fragmentos de DNA unidos por PCR de fusão ou fragmentos de DNA sinteticamente construídos que são, então, recombinados na célula hospedeira. Também é possível usar recombinação heteróloga

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que resulta em interação	aleatória ou não	alvejada.
Produção
Vetores de	expressão
[0123]	‘Vetores de	expressão ou	construtos	de
expressão	podem ser	usados para a	transcrição	de

sequências de polinucleotideos heterólogos, por exemplo, aqueles que codificam as moléculas de ligação da invenção e translação de seu mRNA em uma célula hospedeira adequada. Esse processo também é denominado como expressão das moléculas de ligação da invenção no presente documento. Além de uma origem de replicação, marcadores de seleção, e sítios de divagem de enzima de restrição, os vetores de expressão incluem tipicamente uma ou mais sequências regulatórias ligadas operativamente ao polinucleotideo heterólogo a ser expresso.

[0124] O termo sequência regulatória se refere a uma sequência de ácidos nucleicos necessária para a expressão de uma sequência de codificação operativamente ligada de um polinucleotideo (heterólogo) em um organismo hospedeiro particular e, então, incluir sequências regulatórias transcricionais e translacionais. Tipicamente, as sequências regulatórias exigidas para expressão de sequências de polinucleotideos heterólogos em procariotas incluem um promotor (ou promotores), opcionalmente sequência (ou sequências) de operador e sítio (ou sítios) de ligação de ribossomo. Em eucariotas, promotores, sinais de poliadenilação, intensificadores e, opcionalmente, os sinais de emenda são tipicamente exigidos. Ademais, os sinais secretores e de iniciação específicos também podem ser introduzidos no vetor a fim de permitir a secreção do

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61/109 polipeptídeo de interesse no meio de cultura.

[0125] Um ácido nucleico está operacionalmente ligado quando está posicionado em uma relação funcional com outra sequência de ácidos nucleicos, em particular na mesma molécula de polinucleotideo. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado com uma sequência de codificação de um gene heterólogo quando tem capacidade para efetuar a expressão daquela sequência de codificação. O promotor é tipicamente colocado a montante do gene que codifica o polipeptídeo de interesse e regula a expressão do gene.

[0126] As sequências regulatórias exemplificativas para expressão de célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais que direcionam altos níveis de expressão de proteína em célula de mamífero, como promotores e/ou intensificadores derivados de citomegalovírus (CMV) (como o promotor/intensificador de CMV), Vírus Simiano 40 (SV40) (como o promotor/intensificador de SV40), adenovirus, (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovirus (AdMLP)) e polioma. Para descrição adicional de elementos reguladores virais e sequências dos mesmos (consulte os documentos US 5.168.062 por Stinski; US 4.510.245 por Bell et al. ; US 4.968.615 por Schaffner et al. ) . Como apresentado anteriormente, os vetores de expressão também podem incluir origens de replicação e marcadores selecionáveis.

[0127] Como mencionado anteriormente, os vetores da invenção podem compreender adicionalmente um ou mais marcadores de seleção. Os marcadores de seleção adequados para uso com células hospedeiras eucarióticas incluem, sem limitação, os genes timidina quinase no virus herpes

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62/109 simples (tk), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (hgprt) e adenina fosforibosiltransferase (aprt). Outros genes incluem dhfr (resistência ao metotrexato) , gpt (resistência ao ácido micofenólico) neo (resistência a G418) e higro (resistência à higromicina). A amplificação de vetor pode ser usada para aumentar os níveis de expressão. Em geral, o gene de marcador de seleção pode ser diretamente ligado às sequências de polinucleotídeos a serem expressas ou introduzidas na mesma célula hospedeira por cotransformação.

[0128] Tendo em vista o mencionado acima, a presente invenção fornece, então, adicionalmente uma ou mais das sequências de polinucleotídeos descritas no presente documento inseridas em um vetor. Assim, a invenção fornece, particularmente, vetores replicáveis que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de ligação da invenção ou uma cadeia pesada ou leve da mesma ou um domínio variável de cadeia pesada ou leve, ligados operativamente a um promotor. Tais vetores podem incluir a sequência de nucleotídeos que codifica a região constante da molécula de ligação e o domínio variável da molécula de ligação pode ser clonado em tal vetor para expressão de toda a cadeia pesada ou leve.

Célula hospedeira [0129] Em geral, uma variedade de células hospedeiras pode ser empregada para expressar a molécula de ligação da invenção a partir de um vetor de expressão. Como usado no presente documento, uma célula hospedeira se refere a uma célula que pode ser ou ter sido receptora de polinucleotídeos ou vetores ou que codifica a molécula de

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63/109 ligação da presente invenção. Especificamente, uma célula hospedeira pode ter adicionalmente capacidade para expressar e opcionalmente secretar a dita molécula de ligação. Nas descrições de processos para obter moléculas de ligação das células hospedeiras, os termos célula e cultura de célula são usados de modo intercambiável para denotar a fonte de uma molécula de ligação a menos que claramente especificado o contrário. O termo célula hospedeira também inclui linhagens de célula hospedeira. [0130] Em geral, o termo inclui células procarióticas ou eucarióticas e também inclui, sem limitação, bactérias, células de levedura, células de fungo, células de planta e células de animal, como células de inseto e célula de mamífero, por exemplo, células de camundongo, rato, macaco ou humano.

[0131] Os polinucleotídeos e/ou vetores da invenção podem ser introduzidos nas células hospedeiras usando métodos de rotina conhecidos na técnica, por exemplo, por transfecção, transformação ou similares.

[0132] Transfecção é o processo de introdução de modo deliberado de polinucleotídeos ou moléculas (incluindo vetores) de ácido nucleico em células-alvo. 0 termo é principalmente usado para métodos não virais em células eucarióticas. A transdução é frequentemente usada para descrever transferência mediada por vírus de moléculas ou polinucleotídeos de ácido nucleico. A transfecção de células de animal envolve tipicamente abrir orifícios ou poros transientes na membrana celular, para permitir a absorção de material. A transfecção pode ser executada usando fosfato de cálcio, por eletroporação, por

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64/109 compreensão de célula ou pela mistura de um lipidio catiônico com o material para produzir lipossomos, que se fundem com a membrana celular e depositam sua carga no interior. As técnicas exemplificativas para transfectar as células hospedeiras eucarióticas incluem absorção mediada por vesícula de lipidio, absorção mediada por choque de calor, transfecção mediada por fosfato de cálcio (fosfato de cálcio/coprecipitação de DNA), microinjeção e eletroporação.

[0133] 0 termo transformação é usado para descrever transferência não viral de moléculas ou polinucleotídeos (incluindo vetores) de ácido nucleico em bactérias e também em células eucarióticas não animais, incluindo células de planta. A transformação é, por conseguinte, a alteração genética de uma célula eucariótica não animal ou bacteriana que resulta da absorção direta através da membrana (ou membranas) celular de seu entorno e incorporação subsequente de material genético exógeno (moléculas de ácido nucleico) . A transformação pode ser efetuada por meios artificiais. Para a transformação acontecer, as células ou bactérias devem estar em um estado de competência, que deve ocorrer como uma resposta de tempo limitado para condições ambientais, como inanição e densidade de célula. Para transformação procariótica, as técnicas podem incluir absorção mediada por choque de calor, fusão de protoplasto bacteriano com células intactas, microinjeção e eletroporação. As técnicas para transformação de planta incluem transferência mediada por Agrobacterium, como por A. tumefaciens, tungstênio rapidamente propelido ou microprojéteis de ouro,

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65/109 eletroporação, microinjeção e absorção mediada por polietileno glicol.

[0134] Tendo em vista o mencionado acima, a presente invenção fornece, então, adicionalmente células hospedeiras que compreendem pelo menos uma sequência de polinucleotideos e/ou vetor como descrito no presente documento.

[0135] Para expressão da molécula de ligação da invenção, pode ser escolhida uma célula hospedeira modula a expressão das sequências de polinucleotideos inseridos e/ou modifica e processa o produto de gene (isto é, RNA e/ou proteína) como desejado. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, divagem) de produtos de gene podem ser importantes para a função da molécula de ligação. Diferentes células hospedeiras têm mecanismos específicos e característicos para a modificação e processamento pós-translacional de produtos de gene. Os sistemas hospedeiros ou linhagens celulares apropriadas podem ser escolhidos para garantir o processamento e a modificação correta do produto. Para essa finalidade, as células hospedeiras eucarióticas que possuem a maquinaria celular para processamento apropriado da transcrição primária, glicosilação e fosforilação do produto de gene podem ser usadas.

[0136] As células hospedeiras de mamífero exemplificativas que podem ser usadas para expressar as moléculas de ligação fornecidas no presente documento incluem Ovário de Hamster Chinês (células de CHO) incluindo células DHFR-CHO, como DG44 e DUXB1 1 e como descrito no documento US 4.634.665 (por exemplo, usado com um marcador

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66/109 selecionável por DHFR, por exemplo, como descrito no documento US 5.179.017), células de NSO, COS (um derivado de CVI com antígeno SV40 T) , HEK293 (rim humano) e SP2 (mieloma de camundongo). Outras linhagens de célula hospedeira exemplificativas incluem, porém sem limitação, HELA (carcinoma cervical humano), CVI (linhagem de rim de macaco), VERY, BHK (rim de hamster bebê), MDCK, 293, WI38, R1610 (fibroblasto de hamster chinês) BALBC/3T3 (fibroblasto de camundongo), HAK (linhagem de rim de hamster), P3x63-Ag3.653 (mieloma de camundongo), BFA-IcIBPT (células endoteliais bovinas) e RAJI (linfócito humano). As linhagens de célula hospedeira são tipicamente disponíveis a partir de serviços comerciais, The American Tissue Culture Collection ou a partir da literatura publicada.

[0137] As células de não mamífero, como células bacterianas, de levedura, de inseto ou de planta são também prontamente disponíveis e podem, em princípio, ser usadas para expressão das moléculas de ligação da invenção. As células hospedeiras bacterianas exemplificativas incluem enterobacteriaceae, como Escherichia coli, Salmonella; Bacillaceae, como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus e Haemophilus influenza.

[0138] Outras células hospedeiras incluem células de levedura, como Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris. As células de inseto incluem, sem limitação, células Spodoptera frugiperda.

[0139] De acordo com o supracitado, os sistemas de expressão concebíveis (isto é, células hospedeiras que compreendem um vetor de expressão como descrito acima) incluem microrganismos, como bactérias (por exemplo, E.

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67/109 coli, B. subtilis) transformados com vetores de expressão de DNA de bacteriófago recombinante, DNA de plasmideo ou DNA de cosmideo; levedura (por exemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada com vetores de expressão de levedura recombinante; sistemas de célula de inseto infectados com vetores de expressão de virus recombinante (por exemplo, baculovírus); sistemas de célula de planta infectados com vetores de expressão de virus recombinante (por exemplo, virus do mosaico da couve-flor, CaMV; virus do mosaico de tabaco, TMV) ou transformados com vetores de expressão de plasmideo recombinante (por exemplo, plasmideo Ti) ; ou sistemas de célula de mamífero (por exemplo, células de COS, CHO, BLK, 293, 3T3) que abrigam construtos de expressão recombinante que contêm promotores derivados do genoma de célula de mamífero (por exemplo, promotor da metalotioneína) ou de vírus de mamífero (por exemplo, ο promotor tardio de adenovirus; o promotor de vírus de vaccinia 7.5K).

[0140] Para expressão das moléculas de ligação da invenção, as células eucarióticas são particularmente previstas. Consequentemente, as células de CHO que compreendem um vetor eucariótico com uma sequência de polinucleotídeos que codifica a molécula de ligação da invenção (que pode, por exemplo, ser ligada operativamente ao promotor precoce imediato principal (MIEP) de citomegalovírus humano (CMV)) são sistemas de expressão úteis para produzir as moléculas de ligação da invenção.

Cultivo [0141] As células hospedeiras que o abrigam o vetor de expressão são cultivadas sob condições apropriadas para a

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68/109 produção das moléculas de ligação descritas no presente documento, em particular, cadeias leves e cadeias pesadas, como descrito em outra parte no presente documento, e testadas para síntese de cadeia pesada e/ou leve proteína. Assim, a invenção inclui células hospedeiras que contêm um polinucleotideo que codifica uma molécula de ligação da invenção ou uma cadeia pesada ou leve da mesma, ligada operativamente a um promotor. Para a expressão de anticorpos de cadeia dupla, os vetores que codificam tanto a cadeia pesada quanto a cadeia leve podem ser coexpressos na célula hospedeira para expressão de toda a molécula.

Purificação [0142] Uma vez que uma molécula de ligação da invenção foi expressa de modo recombinante, a mesma pode ser purificada por qualquer método de purificação conhecido na técnica, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, cromatografia de troca iônica (por exemplo, cromatografia de hidroxilapatita) , cromatografia por afinidade, particularmente, cromatografia por afinidade de Proteína A, Proteína G ou lecitina, cromatografia em coluna de dimensionamento), centrifugação, solubilidade diferencial, cromatografia por interação hidrofóbica ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. O elemento versado será prontamente capaz de selecionar um método de purificação adequado com base nas características individuais da molécula de ligação a ser recuperada.

[0143] Tendo em vista o mencionado acima, a presente invenção também fornece, então, um processo para a produção de uma molécula de ligação da invenção, que compreende cultivar uma célula hospedeira como definido no presente

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69/109 documento sob condições que permitem a expressão da molécula de ligação e opcionalmente que recuperam a molécula de ligação produzida da cultura.

Composição farmacêutica [0144] A presente invenção fornece adicionalmente uma composição farmacêutica que compreende uma molécula de ligação, ácido nucleico, vetor e/ou célula hospedeira da invenção e opcionalmente um ou mais excipientes (ou excipiente) farmaceuticamente aceitáveis. Uma composição farmacêutica preferencial compreende um anticorpo da invenção e opcionalmente um ou mais excipientes (ou excipiente) farmaceuticamente aceitáveis.

[0145] Em um aspecto, a invenção se refere, então, a uma composição farmacêutica que compreende, como um agente ativo, uma molécula de ligação como descrito no presente documento, em particular um anticorpo anti-FXI ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Consequentemente, o uso das ditas moléculas de ligação para a fabricação de uma composição farmacêutica também é previsto no presente documento. 0 termo composição farmacêutica particularmente se refere a uma composição adequada para administrar a um humano. Entretanto, as composições adequadas para administração a animais não humanos também são abrangidas pelo termo.

[0146] A composição farmacêutica e seus componentes (isto é, agentes ativos e, opcionalmente, excipientes) são, de preferência, farmaceuticamente aceitáveis, isto é, capazes de surtir o efeito terapêutico desejado sem causar quaisquer efeitos sistêmicos ou locais indesejados no recipiente. As composições farmaceuticamente aceitáveis da

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70/109 invenção podem, em particular, ser estéreis e/ou farmaceuticamente inertes. Especificamente, o termo farmaceuticamente aceitável pode significar aprovado por uma agência reguladora ou outra farmacopeia geralmente conhecida para uso em animais e, mais particularmente, em humanos.

[0147] A molécula de ligação descrita no presente documento é, de preferência, presente na composição farmacêutica em uma quantidade terapeuticamente eficaz. O termo quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade da molécula de ligação que surti o efeito terapêutico desejado. A toxicidade e a eficácia terapêutica podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em animais experimentais ou culturas de célula, por exemplo, EDso (a dose terapeut icamente eficaz em 50 % da população) e LDso (a dose letal para 50 % da população) . A razão de dose entre efeitos terapêuticos e tóxicos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a razão, ED50/ID50. As composições farmacêuticas que exibem altos índices terapêuticos são preferenciais.

[0148] Como apresentado anteriormente, a composição farmacêutica pode compreender opcionalmente um ou mais excipientes e/ou agentes ativos adicionais.

[0149] Os anticorpos e os fragmentos dos mesmos são geralmente administrados por via parental e, particularmente, por via intravenosa (injeção ou infusão) ou por via subcutânea. As composições para administração parenteral incluem soluções não aquosas ou aquosas estéreis, suspensões e emulsões. Os solventes não aquosos incluem, sem limitação, propileno glicol, polietileno

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71/109 glicol, óleo vegetal, como óleo de oliva e ésteres orgânicos injetáveis, como oleato de etila. Os solventes aquosos podem ser escolhidos a partir do grupo que consiste em água, soluções aquosas/álcool, emulsões ou suspensões incluindo solução salina e meio tamponado, como, sem limitação, solução salina de fosfato tamponado. Os veículos parenterais incluem adicionalmente solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer com lactato ou óleos fixos. Outros carreadores farmacêuticos adequados, diluentes e/ou excipientes são bem conhecidos na técnica. A molécula de ligação, como um anticorpo ou fragmento de anticorpo da mesma, de acordo com a presente invenção pode ser combinada com um carreador farmaceuticamente aceitável, diluente e/ou excipiente como aquele discutido acima para formar uma composição farmacêutica. As composições farmacêuticas podem compreender a molécula de ligação da presente invenção em um carreador aquoso que compreende um agente de tamponamento selecionado a partir do grupo que consiste em um tampão de histidina, tampão de ácido acético, tampão de ácido cítrico e um tampão de histidina/HCl. As informações de formulação e tampões adicionais são disponíveis para um elemento versado na técnica, por exemplo, em Wang W et al., J. Pharmaceutical Sei. 2007 Jan(l):1-26. Preservativos também podem estar presentes como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes, etc.

[0150] A composição farmacêutica pode compreender adicionalmente carreadores proteáceos como, por exemplo, albumina sérica ou imunoglobulina, particularmente de

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72/109 origem humana. Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreenda molécula de ligação na forma liofilizada e, de preferência, é reconstituída em solução ou suspensão antes da administração. Em uma outra modalidade, a composição farmacêutica compreenda molécula de ligação e está na forma líquida.

[0151] Após as composições farmacêuticas da invenção e opcionalmente um excipiente adequado terem sido preparados, as mesmas podem ser colocadas em um recipiente apropriado e identificadas para tratamento de uma afecção indicada. Tal identificação incluiría, por exemplo, quantidade, frequência e método de administração.

Agentes ativos adicionais [0152] A presente invenção fornece adicionalmente medicamentos ou composições farmacêuticas que compreendem um composto inventivo e um ou mais ingredientes ativos adicionais, especialmente para tratamento e/ou profilaxia dos transtornos mencionados no presente documento. Os exemplos preferenciais de ingredientes ativos adequados para combinações incluem:

• substâncias de redução de lipídio, especialmente inibidores de redutase HMG-CoA (3-hidroxi-3-metilglutarilcoenzima A) , incluindo, sem limitação, lovastatina (Mevacor) , sinvastatina (Zocor), pravastatina (Pravachol), fluvastatina (Lescol) e atorvastatina (Lipitor);

• agentes terapêuticos coronários/vasodilatadores, especialmente inibidores de AGE (enzima de conversão de angiotensina), incluindo, sem limitação, captopril, lisinopril, enalapril, ramipril, cilazapril, benazepril, fosinopril, quinapril e perindopril, ou antagonistas de

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73/109 receptor de All (angiotensina II), incluindo, sem limitação, embusartana, losartana, valsartana, irbesartana, candesartana, eprosartana e temisartana, ou antagonistas de adrenoceptor, incluindo, sem limitação, carvedilol, alprenolol, bisoprolol, acebutolol, atenolol, betaxolol, carteolol, metoprolol, nadolol, penbutolol, pindolol, propanolol e timolol, ou antagonistas de alfa-1adrenoceptor, incluindo, sem limitação, prazosina, bunazosina, doxazosina e terazosina, ou diuréticos, incluindo, sem limitação, hidroclorotiazida, furosemida, bumetanida, piretanida, torasemida, amilorida e dihidralazina, ou bloqueadores do canal de cálcio, incluindo, sem limitação, verapamil e diltiazem ou derivados de dihidropiridina, incluindo, sem limitação, nifedipina (Adalat) e nitrendipina (Baiotensina), ou preparações de nitro, incluindo, sem limitação, 5-mononitrato de isosorbida, dinitrato de isosorbida e trinitrato de glicerol ou substâncias causando um aumento em monofosfato de guanosina cíclica (cGMP), incluindo, sem limitação, estimuladores de guanilato ciclase solúvel, incluindo, sem limitação, riociguat;

• ativadores de plasminogênio (tromobolíticos/fibrinolíticos) e compostos que promovem trombólise/fibrinólise incluindo, sem limitação, inibidores do inibidor de ativador de plasminogênio (inibidores de PAI) ou inibidores do inibidor de fibrinólise de trombina ativada (inibidores de TAFI) incluindo, sem limitação, ativador de plasminogênio de tecido (t-PA), estreptoquinase, reteplase e uroquinase;

• substâncias anticoagulatórias (anticoagulantes),

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74/109 incluindo, sem limitação, heparina (UFH), heparinas de baixo peso molecular (LMW) incluindo, sem limitação, tinzaparina, certoparina, parnaparina, nadroparina, ardeparina, enoxaparina, reviparina, dalteparina, danaparóide, semuloparina (AVE 5026), adomiparina (M118) e EP-42675/ORG42675;

• inibidores diretos de trombina (DTI) incluindo, sem limitação, Pradaxa (dabigatran), atecegatran (AZD-0837), DP-4088, SSR-182289A, argatroban, bivalirudina e tanogitran (BIBT-986 e pró-fármaco BIBT-1011), hirudina;

• inibidores de fator Xa direto incluindo, sem limitação, rivaroxaban, apixaban, edoxaban (DU-176b), betrixaban (PRT54021), R-1663, darexaban (YM-150), otamixaban (FXV673/RPR-130673), letaxaban (TAK-442), razaxaban (DPC-906), DX-9065a, LY-517717, tanogitran (BIBT-986, pró-fármaco: BIBT-1011), idraparinux e fondaparinux, • substâncias de inibição de agregação de plaqueta (inibidores de agregação de plaqueta, inibidores de agregação de trombócito) incluindo, sem limitação, ácido acetilssalicílico (por exemplo, Aspirina), ticlopidina (Ticlid) , clopidogrel (Plavix), prasugrel, ticagrelor, cangrelor, elinogrel, vorapaxar;

• antagonistas de receptor de fibrinogênio (antagonistas de glicoproteina-Ilb/IIIa) incluindo, sem limitação, abciximabe, eptifibatide, tirofibana, lamifibana, lefradafibana e fradafibana;

• antiarritmicos;

• vários medicamentos antifúngicos ou antibióticos, como terapia calculada (antes da presença de diagnóstico microbiano) ou como terapia especifica;

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75/109 • vasopressores incluindo, sem limitação, norepinedrina, dopamina e vasopressina;

• terapia inotrópica incluindo, sem limitação, dobutamina;

• proteína C ativada de humano recombinante, por exemplo, Xigris;

• produtos sanguíneos incluindo, sem limitação, concentrados de eritrócito, concentrados de trombócito, eritropietina e plasma congelado fresco;.

• inibidores de adesão de plaqueta como antagonistas de GPVI e/ou GPIb incluindo, sem limitação, Revacept ou Caplacizumabe;

• inibidores das trajetórias de transdução de sinal dependente de VEGF e/ou PDGF incluindo, sem limitação, Aflibercept, Ranibizumabe, Bevacizumabe, KH-902, Pegaptanibe, Ramucirumabe, Squalamin oder Bevasiranib, Apatinib, Axitinib, Brivanib, Cediranib, Dovitinib,

Lenvatinib, Linifanib, Motesanib, Pazopanib, Regorafenib,

Sorafenib, Sunitinib, Tivozanib, Vandetanib, Vatalanib,

Vargatef ou E-10030;

• inibidores da trajetória de transdução de sinal de Angiopoietin-Tie incluindo, sem limitação, AMG386;

• inibidores da atividade de tirosina quinase de receptor de Tie2;

• inibidores das trajetórias de transdução de sinal dependente de Integrina incluindo, sem limitação, Volociximabe, Cilengitid ou ALG1001;

• inibidores da transdução de sinal dependente de Pl3quinase-AKT-mTor incluindo, sem limitação, XL-147, Perifosina, MK2206, Sirolimus, Temsirolimus ou Everolimus;

• Corticosteróides incluindo, sem limitação,

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76/109 hidrocortisona, fludrocortisona, Anecortave, Betametasona, Dexametasona, Triamcinolona, Fluocinolona ou Fluocinolonacetonida;

• inibidores da trajetória de transdução de sinal dependente de ALKl-Smadl/5 incluindo, sem limitação, ACE041;

• inibidores de Ciclo-oxigenease incluindo, sem limitação, Bromfenac ou Nepafenac;

• inibidores do sistema de Kallikrein-Kinin incluindo, sem limitação, Safotibant ou Ecallantid;

• inibidores das trajetórias de transdução de sinal dependente de Esfingosin-l-fosfato incluindo, sem limitação, Sonepcizumabe;

• inibidores do receptor de C5a Complementar incluindo, sem limitação, Eculizumabe;

• inibidores do receptor de 5HTla incluindo, sem limitação, Tandospirona;

• inibidores da trajetória de transdução de sinal dependente de Raf-Mek-Erk, inibidores da trajetória de transdução de sinal de MAPK; inibidores da trajetória de transdução de sinal de FGF, inibidores de proliferação celular endotelial; e compostos que têm capacidade para induzirem apoptose; ou • Terapias fotodinâmicas, que consistem em uma substância ativa e a exposição à luz, enquanto a substância ativa é, por exemplo, Verteporfina.

Combinações, para o propósito da invenção, significam não apenas formas de dosagem que contêm todos os componentes (denominados combinações fixas) e pacotes de combinação que contêm os componentes separados um do outro, mas também

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77/109 componentes que são administrados simultânea ou sequencialmente, visto que são usados para profilaxia e/ou tratamento da mesma doença. Também é possível combinar dois ou mais ingredientes ativos entre si, o que significa que estão, então, cada um, em combinações de dois componentes ou múltiplos componentes.

Administração [0153] Uma variedade de vias é aplicável para administração da composição farmacêutica de acordo com a presente invenção. Tipicamente, a administração será realizada por via parental. Os métodos de aplicação parenteral incluem administração tópica, intra-arterial, intramuscular, subcutânea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, intrauterina, intravaginal, sublingual ou intranasal.

[0154] As formulações farmacêuticas para administração parenteral incluem soluções aquosas de compostos ativos. Para injeção, as composições farmacêuticas da invenção podem ser formuladas em soluções aquosas, de preferência, em tampões fisiologicamente compatíveis, como solução de Hank, solução de Ringer ou solução salina fisiologicamente tamponada. As suspensões de injeção aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextrano. Adicionalmente, as suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosa apropriadas. Os solventes ou veículos lipofílicos exemplificativos incluem óleos graxos, como óleo de gergelim, ou ésteres de ácido graxo sintético, como oleato de etila ou triglicerídeos, ou lipossomas. Opcionalmente, a

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78/109 suspensão também pode conter estabilizadores adequados ou agentes que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas. Para a administração tópica ou nasal, são utilizados na formulação os penetrantes adequados à barreira particular a ser permeada. Tais penetrantes são geralmente conhecido na técnica. Mais detalhes sobre as técnicas de formulação e administração podem ser encontrados na 22^a Edição de Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed., Maack Publishing Co, Easton, Pa., 2012).

Tratamento [0155] O termo tratamento em todas as suas formas gramaticais inclui tratamento terapêutico ou profilático das doenças descritas no presente documento. Um tratamento terapêutico ou profilático compreende tratamentos profiláticos voltado para a prevenção completa de manifestações clinicas e/ou patológicas ou tratamento terapêutico voltado para a melhora ou remissão de manifestações clinicas e/ou patológicas. Desse modo, o termo tratamento também inclui a melhora ou prevenção das doenças descritas.

[0156] Os termos indivíduo ou individual ou animal ou paciente são usados de modo intercambiável no presente documento para se referir a qualquer indivíduo, particularmente um indivíduo de mamífero, para quem a terapia é desejada. Os indivíduos de mamífero incluem humanos, primatas não humanos, cachorros, gatos, porquinhos-da-índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, gado, vacas e similares.

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Dosagem [0157] A dosagem exata da molécula de ligação, polinucleotideo, vetor ou célula hospedeira será determinável por um elemento versado na técnica usando técnicas conhecidas. As dosagens adequadas fornecem quantidades suficientes da molécula de ligação e são, de preferência, terapeuticamente eficazes, isto é, surtem o efeito terapêutico desejado.

[0158] Como é conhecido na técnica, os ajustes para o propósito do tratamento (por exemplo, manutenção de remissão vs. surto agudo de doença), via, tempo e frequência de administração, tempo e frequência de formulação de administração, idade, peso corporal, saúde geral, sexo, dieta, gravidade do estado da doença, combinação (ou combinações) de fármaco, sensibilidades de reação e tolerância/resposta à terapia podem ser necessários. Faixas de dosagem adequadas podem ser determinadas usando dados obtidos a partir dos ensaios de cultura de célula e estudos de animal e, de preferência, incluem o EDso. Tipicamente, as quantidades de dosagem podem variar de 0,1 a 100000 microgramas, até uma dose total de cerca de 2 g, dependendo da via de administração. As dosagens exemplificativas da molécula de ligação estão na faixa de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, de cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, de cerca de 1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 1 mg/kg, ou de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 1 mg/kg. A guiagem como para dosagens particulares e métodos de aplicação é fornecida na literatura. Reconhece-se que o tratamento pode exigir uma

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80/109 única administração de uma dose terapeuticamente eficaz ou múltiplas administrações de uma dose terapeuticamente eficaz da molécula de ligação, polinucleotideo, vetor ou célula hospedeira da invenção. Por exemplo, algumas

composições	farmacêuticas devem	ser administradas a cada	3
a 4	dias, a	cada semana ou uma	vez a cada sua	s semanas	ou
uma	vez	em	um mês dependendo	da formulação,	meia-vida	e
taxa	de	liberação da formulação	particular.
Kit
[0159]	A	invenção se refere	adicionalmente	a pacotes	e

kits farmacêuticos que compreendem um ou mais recipientes ou frascos preenchidos com um ou mais dos agentes ativos das composições farmacêuticas anteriormente mencionadas da invenção. Assim, também é fornecido no presente documento um kit que compreende uma molécula de ligação, um polinucleotideo, um vetor, uma célula hospedeira e/ou a composição farmacêutica como descrito no presente documento. Os kits anteriormente mencionados descritos no presente documento podem ser usados para tratamento das doenças apresentadas em outra parte no presente documento ou para outros propósitos.

[0160] Associado ao recipiente (ou recipientes) anteriormente mencionado pode estar um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, o uso ou a venda de produtos biológicos ou farmacêuticos, que refletem a aprovação pela agência da fabricação, do uso ou da venda do produto para administração humana.

[0161] O kit pode compreender um ou mais agentes ativos (opcionalmente formulados como composições farmacêuticas

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81/109 com um ou mais excipientes). Os agentes ativos adequados foram anteriormente listados no contexto da composição farmacêutica e também são concebíveis como partes do kit inventivo. O agente ativo adicional pode ser administrado simultânea ou sequencialmente em relação uma molécula de ligação, sequência de ácidos nucleicos, vetor, célula hospedeira e/ou composição farmacêutica ao paciente. A presente invenção abrange adicionalmente a administração dos agentes ativos através de diferentes vias, por exemplo, por via oral e intravenosa.

[0162] Os kits que compreendem sequências de polinucleotideos que codificam as moléculas de ligação da invenção também são adicionalmente previstos no presente documento. Os ditos polinucleotideos são tipicamente fornecidos em um vetor, como um plasmídeo, adequado para transfecção em e expressão por uma célula hospedeira. Tais vetores e células hospedeiras são descritos em outra parte no presente documento.

Uso terapêutico [0163] A presente invenção fornece adicionalmente moléculas de ligação dessa invenção, de preferência, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, para uso como medicamentos para o tratamento e/ou profilaxia de doenças em humanos e/ou animais.

[0164] A presente invenção fornece adicionalmente moléculas de ligação da invenção, de preferência, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, para uso no tratamento e/ou profilaxia de transtornos, em particular transtornos cardiovasculares, de preferência, transtornos trombóticos ou tromboembólicos e/ou

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82/109 complicações trombóticas ou tromboembólicas.

[0165] Fator Xla (FXIa) é uma enzima importante no contexto de coagulação, que pode ser ativada tanto por trombina quanto por fator Xlla (FXIIa) e está, portanto, envolvida em dois processos essenciais de coagulação: É um componente central da transição de iniciação para amplificação e propagação de coagulação: em circuitos de retroalimentação positiva, trombina ativa, além do fator V e fator VIII, também o fator XI a fator Xla, através disso, o fator IX é convertido em fator IXa e, através do complexo de fator IXa/fator Villa gerado dessa maneira, o fator X é

ativado e	a formação	de	trombina	é, por sua	vez,	portanto,
altamente	estimulada	r	que leva	ao forte	crescimento do
trombo e	que estabiliza	o trombo.
[0166]	Ademais, o	fator Xla é	um componente	importante

para a iniciação intrínseca de coagulação: Além do estímulo através do fator de tecido (TF), o sistema de coagulação pode ser ativado também particularmente em superfícies negativamente carregadas, que incluem não apenas estruturas de superfície de células estranhas (por exemplo, bactérias), mas também superfícies artificiais, como prótese vascular, stents e circulação extracorporal. Na superfície, inicialmente o fator XII (FXII) é ativado para o fator Xlla (FXIIA) que ativa subsequentemente FXI, unido às superfícies de célula, para FXIa. Isso leva à ativação adicional da cascata de coagulação como descrito acima.

[0167] Ao contrário, a geração de trombina na fase de iniciação permanece não influenciada através da ativação de TF/fator Vila e fator X e, finalmente, formação de trombina, a reação fisiológica nas lesões vasculares. Isso

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83/109 explicaria o porquê de nenhuma prolongação de tempos de sangramento foi encontrada em camundongos de inativação de FXIa, como em coelhos e outras espécies, com administração de inibidor de FXIa. Essa baixa tendência de sangramento causada pela substância é de grande vantagem para uso em humanos, particularmente em pacientes com risco aumentado de sangramento.

[0168] Consequentemente, as moléculas de ligação da invenção, de preferência, anticorpos e fragmentos de ligação a antigeno dos mesmos, são para uso no tratamento e/ou profilaxia de transtornos ou complicações que podem surgir da formação de coágulos.

[0169] Para o propósito da presente invenção, os transtornos trombóticos ou tromboembólicos incluem transtornos que ocorrem tanto nas artérias quanto na vasculatura venosa e que podem ser tratados com as moléculas de ligação da invenção, de preferência, anticorpos e fragmentos de ligação a antigeno dos mesmos, em particular, transtornos nas artérias coronárias do coração, como sindrome coronária aguda (ACS), infarto do miocárdio com elevação de segmento de ST (STEMI) e sem elevação de segmento de ST (não STEMI), angina pectoris estável, angina pectoris instável, reoclusões e restenose após intervenções coronárias, como angioplastia, implantação de stent ou desvio aortocoronário, mas também transtornos trombóticos ou tromboembólicos em mais vasos que levam a transtornos oclusivos arteriais periféricos, embolismos pulmonários, tromboembolismos venosos, tromboses venosas, em particular em veias profundas da perna e veias renais, ataques isquêmicos transitórios e também derrame

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84/109 trombótico e derrame tromboembólico.

[0170] Estímulo do sistema de coagulação pode ocorrer por várias causas ou transtornos associados. No contexto de intervenções cirúrgicas, imobilidade, confinamento na cama, infeções, inflamação ou câncer ou terapia de câncer, dentre outros, o sistema de coagulação pode ser altamente ativado e pode haver complicações trombóticas, em particular, trombose venosa. As moléculas de ligação da invenção, de preferência, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, são, portanto, para uso na profilaxia de trombose no contexto de intervenções cirúrgicas, por exemplo, em pacientes que sofrem de câncer ou pacientes que recebem uma cirurgia ortopédica, como substituição de quadril ou joelho. As moléculas de ligação da invenção, de preferência, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, são, portanto, também para uso na profilaxia de

trombose	em	paciente que	têm um sistema	de	coagulação
ativada,	por	exemplo, nas	situações de estimulo	descritas.
[0171]	As	moléculas	de ligação	da	invenção, de
preferência,	anticorpos e	fragmentos de	ligação	a antígeno
dos mesmos,	são, portanto	, também para	uso	no	tratamento

e/ou profilaxia de tromboembolismos cardiogênicos, por exemplo, isquemias de cérebro, derrame e tromboembolismos sistêmicos e isquemias, em pacientes com arritmia cardíaca persistente, intermitente ou aguda, por exemplo, fibrilação atrial e em pacientes que sofrem de cardioversão e também em pacientes com transtornos de válvula do coração ou com válvulas do coração artificiais.

[0172] Além disso, as moléculas de ligação da invenção, de preferência, anticorpos e fragmentos de ligação a

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85/109 antigeno dos mesmos, são para uso no tratamento e/ou profilaxia de coagulação intravascular disseminada (DIC) que podem ocorrer em conexão com sepse, dentre outros, mas também devido a intervenções cirúrgicas, transtornos neoplásticos, queimaduras ou outras lesões e podem levar a graves danos de órgão através de microtrombose.

[0173] As complicações tromboembólicas ocorrem adicionalmente em anemias hemoliticas microangiopáticas e pelo sangue que entra em contato com superfícies estranhas no contexto de circulação extracorporal como, por exemplo, hemodiálise, ECMO (oxigenação de membrana extracorporal), LVAD (dispositivo de auxílio ventricular esquerdo) e métodos similares, fistulas de AV, prótese de válvula do coração e vascular.

[0174] Ademais, as moléculas de ligação da invenção, de preferência, anticorpos e fragmentos de ligação a antigeno dos mesmos, são para uso no tratamento e/ou profilaxia de transtornos que envolvem formação de microcoágulo ou depósitos de fibrina em vasos sanguíneos cerebrais que podem levar a transtornos de demência, como demência vascular ou doença de Alzheimer. Aqui, o coágulo pode contribuir para o transtorno tanto através de oclusões quanto por ligação adicional de fatores relevantes de doença.

[0175] Ademais, as moléculas de ligação da invenção, de preferência, anticorpos e fragmentos de ligação a antigeno dos mesmos, podem ser usadas para a profilaxia e/ou tratamento de complicações trombóticas e/ou tromboembólicas, como, por exemplo, tromboembolismo venoso em pacientes com câncer, em particular, aqueles que são

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86/109 submetidos a intervenções cirúrgicas principais ou quimioou radioterapia.

[0176] No contexto da presente invenção, o termo hipertensão pulmonar inclui hipertensão arterial pulmonar, hipertensão pulmonar associada aos transtornos da parte esquerda do coração, hipertensão pulmonar associada aos transtornos pulmonares e/ou hipóxia e hipertensão pulmonar devido a tromboembolismos crônicos (CTEPH).

[0177] Além disso, as moléculas de ligação da invenção, de preferência, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, são também para uso no tratamento e/ou profilaxia de coagulação intravascular disseminada no contexto de uma doença infecciosa e/ou de síndrome inflamatória sistêmica (SIRS), disfunção de órgão séptica, falha de órgão séptica e falha de múltiplos órgãos, síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS), lesão pulmonar aguda (ALI), choque séptico e/ou falha de órgão séptica. No curso de uma infeção, pode haver uma ativação generalizada do sistema de coagulação (coagulação intravascular disseminada ou coagulopatia de consumo, no presente documento abaixo denominado como DIG) com microtrombose em vários órgãos e complicações hemorrágicas secundárias. Ademais, pode haver danos endoteliais com permeabilidade aumentada dos vasos e difusão de fluido e proteínas no espaço extravasai. À medida que a infeção progride, pode haver falha de um órgão (por exemplo, falha de rim, falha de fígado, falha respiratória, déficits do sistema nervoso central e falha cardiovascular) ou falha de múltiplos órgãos. No caso de DIC, há uma ativação massiva do sistema de coagulação na superfície de células

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87/109 endoteliais danificadas, nas superficies de corpos estranhos ou no tecido extravascular reticulado. Como uma consequência, há coagulação em pequenos vasos de vários órgãos com hipóxia e disfunção de órgão subsequente. Um efeito secundário é o consumo de fatores de coagulação (por exemplo, fator X, protrombina e fibrinogênio) e plaquetas, que reduz a capacidade de coagulação do sangue e pode resultar em um sangramento intenso.

[0178] As moléculas de ligação da invenção, de preferência, anticorpos e fragmentos de ligação a antigeno dos mesmos, são também para uso na profilaxia primária de transtornos trombóticos ou tromboembólicos e/ou transtornos inflamatórios e/ou transtornos com permeabilidade vascular aumentada em pacientes em que as mutações de gene levam a atividade melhorada das enzimas ou níveis aumentados dos zimogênios e são estabelecidas por testes/medidas relevantes das concentrações de zimogênio ou atividade enzimática.

[0179] Além disso, as moléculas de ligação da invenção, de preferência, anticorpos e fragmentos de ligação a antigeno dos mesmos, também podem ser usadas para prevenir a coagulação ex vivo, por exemplo, para a proteção de órgãos a serem transplantados contra danos aos órgãos causados pela formação de coágulos e para proteger o recipiente de órgão contra tromboembolia do órgão transplantado, para preservar produtos de plasma e de sangue, para limpar/pré-tratar cateteres e outros instrumentos e auxiliares médicos, para revestir superfícies sintéticas de instrumentos e auxiliares médicos usados in vivo ou ex vivo ou para amostras biológicas que

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88/109 podem compreender o fator Xla.

[0180] A presente invenção fornece adicionalmente o uso das moléculas de ligação da invenção, de preferência, anticorpos e fragmentos de ligação a antigeno dos mesmos, para o tratamento e/ou profilaxia de transtornos, especialmente os transtornos mencionados acima.

[0181] A presente invenção fornece adicionalmente o uso das moléculas de ligação da invenção, de preferência, anticorpos e fragmentos de ligação a antigeno dos mesmos, para produção de um medicamento para o tratamento e/ou profilaxia de transtornos, especialmente os transtornos mencionados acima, de preferência, para produzir um medicamento para o tratamento e/ou profilaxia de transtornos trombóticos ou tromboembólicos.

[0182] A presente invenção fornece adicionalmente um método para o tratamento e/ou profilaxia de transtornos, especialmente os transtornos mencionados acima, usando uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação da invenção, de preferência, um anticorpo e fragmento de ligação a antigeno do mesmo.

[0183] A presente invenção fornece adicionalmente as moléculas de ligação da invenção, de preferência, anticorpos e fragmentos de ligação a antigeno dos mesmos, para uso em um método para o tratamento e/ou profilaxia de transtornos, especialmente os transtornos mencionados acima, usando uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação da invenção, de preferência, anticorpo e fragmento de ligação a antigeno do mesmo.

[0184] A presente invenção fornece adicionalmente métodos de tratamento de transtornos trombóticos ou

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89/109 tromboembólicos em homens e/ou animais por administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos uma molécula de ligação da invenção, de preferência, anticorpo e fragmento de ligação a antigeno do mesmo ou uma composição farmacêutica da invenção. A presente invenção fornece adicionalmente um método de inibir coagulação sanguínea, agregação de plaqueta e/ou trombose em um indivíduo por administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos uma molécula de ligação da invenção, de preferência, anticorpo e fragmento de ligação a antigeno do mesmo ou uma composição farmacêutica da invenção.

Terapia de Gene [0185] É adicionalmente fornecido no presente documento um vetor de transferência para uso em terapia de gene de mamífero que compreende um polinucleotideo como revelado no presente documento, e métodos de tratar ou prevenir a doença que compreendem incorporar o ácido nucleico exógeno como descrito no presente documento na célula de um paciente mamífero com necessidade do mesmo, de modo que o ácido nucleico exógeno seja expresso e a doença seja prevenida ou tratada.

[0186] Em uma modalidade, as moléculas de ácido nucleico que codificam tanto uma cadeia pesada quanto uma cadeia leve são administradas a um paciente. Em uma modalidade preferencial, as moléculas de ácido nucleico são administradas de modo que sejam estavelmente integradas nos cromossomos de células B devido ao fato de que essas células são especializadas para produzir os anticorpos. Em uma modalidade, as células B de precursor são transfectadas

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90/109 ou infectadas ex vivo e retransplantadas em um paciente com necessidade do mesmo. Em uma outra modalidade, as células B de precursor ou outras células são infectadas in vivo usando um virus recombinante conhecido para infectar a célula do tipo de interesse.

[0187] Em uma modalidade preferencial, o método de terapia de gene compreende administrar uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligação de antigeno da mesma de um anticorpo anti-FXI como revelado no presente documento e que expressa a molécula de ácido nucleico. Em uma outra preferencial modalidade, o método de terapia de gene compreende administrar uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica a cadeia leve ou uma porção de ligação de antigeno da mesma de um anticorpo anti-FXI como revelado no presente documento e que expressa a molécula de ácido nucleico. Em uma outra modalidade, o método de terapia de gene compreende administrar uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligação de antigeno da mesma e uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica a cadeia leve ou a porção de ligação de antigeno da mesma de um anticorpo anti-FXI como revelado no presente documento e que expressa a molécula de ácido nucleico.

[0188] Condições especificas para a absorção de ácido nucleico exógeno são bem conhecidas na técnica. As mesmas incluem, porém sem limitação, infeção retroviral, infeção adenoviral, transformação com plasmideos, transformação com lipossomos que contêm ácido nucleico exógeno, aplicação de ácido nucleico biolistico (isto é, carregamento do ácido

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91/109 nucleico em ouro ou outras partículas de metal e ataque ou injeção nas células), infecção de vírus adeno-associado e infecção de vírus de Epstein-Barr. Esses todos podem ser considerados vetores de expressão para os propósitos da invenção.

[0189] Os vetores de expressão podem ser vetores extracromossomais ou vetores que se integram em um genoma hospedeiro. Em geral, esses vetores de expressão incluem ácido nucleico regulador transcricional ou translacional ligado operativamente ao ácido nucleico exógeno. Em geral, as sequências regulatórias transcricionais ou translacionais podem incluir, porém sem limitação, sequências promotoras, sítios de ligação ribossomal, sequências de parada e início transcricional, sequências de parada e início translacional e sequências intensificadoras ou ativadoras. Em uma modalidade preferencial, as sequências regulatórias incluem um promotor e sequências de parada ou início transcricional.

[0190] Além disso, o vetor de expressão pode compreender elementos adicionais. Por exemplo, para integrar os vetores de expressão, o vetor de expressão contém pelo menos uma sequência homólogo ao genoma de célula hospedeira e, de preferência, duas sequências homólogas que flanqueiam o construto de expressão. 0 vetor de integração pode ser direcionado a um local específico na célula hospedeira pela

seleção da	sequência	homóloga apropriada	para inclusão	no
vetor. Os	construtos	para integrar os	vetores	são	bem
conhecidos	na técnica.
Experimentos
[0191] Começando a	partir do anticorpo	murino	anti-	FXI

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1A6, anticorpos humanizados inovadores (consulte o Experimento 1) foram gerados. A fim de reduzir adicionalmente o potencial de imunogenicidade inerente, esses anticorpos foram submetidos à otimização de sequência nas regiões CDR como descrito abaixo (experimento 2) . Os anticorpos de candidato foram testados para sua atividade de ligação de FXI determinada por Ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA) e por sua capacidade de inibir a conversão de FXI em sua forma ativa, FXIa (Experimentos 4 e 5) . Para dois anticorpos exemplificativos, a saber, TPP3290 e TPP-3238, os valores de EC50 para ELISA e ensaios de conversão são mostrados na Figura 9. Obviamente, os valores EC50 são comparáveis a 1A6, assim, esses dois anticorpos podem ser candidatos valiosos para exploração adicional. Portanto, para confirmar a capacidade de comparação a 1A6, os anticorpos TPP-3290 e TPP-3238 foram testados no modelo de trombose de babuíno in vivo descrito no Experimento 10. Surpreendentemente, usando regimes de dosagem farmacológicos razoáveis, esses dois anticorpos não mostraram qualquer atividade antitrombótica. Para ambas as moléculas, nenhuma redução na formação de trombo induzida por colágeno pode ser detectada. No seguimento desse experimento in vivo, esses anticorpos foram analisados no sistema de teste de Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (aPTT) com base em plasma. Esse tipo de análise reconfirma os dados in vivo de modo que, para ambos os anticorpos, apenas um efeito de bloqueio muito baixo ou quase nenhum fosse observado (Experimento 6 e Figura 8) . Assim, apesar de os anticorpos TPP-3290 e TPP-3238 terem valores de EC50 quase idênticos no ensaio de conversão e ELISA em

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93/109 comparação ao anticorpo 1A6 (consulte a figura 9), os mesmos não exibem um efeito antitrombótico in vivo. Não há explicação prontamente disponível em relação ao porquê de os valores de ensaio de conversão e ELIS comparáveis 1A6 não transladarem em atividade antitrombótica in vivo ou prolongamento de aPTT.

[0192] Entretanto, alterações de sequência adicionais levam a anticorpos TTP-3583 e TTP-3577. Esses dois anticorpos exibiram afinidades de ligação excelentes ao FXI-alvo (Experimento 3, Figuras 3 e 4, Figura 9) . Além disso, os anticorpos TTP-3583 e TTP-3577 bloqueiam de modo eficaz a conversão de FXI a seu FXIa de forma ativa (Experimento 5 e Figuras 7 e 8) . De modo surpreendente, os anticorpos TTP-3583 e TTP-3577 prolongam o Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (aPTT) em concentrações comparáveis a 1A6 ou, no caso de TPP-3583, em concentrações ainda menores (Experimento 6 e Figura 9) . Assim, foram gerados dois anticorpos em que os ensaios bioquímicos em relação a sua atividade de ligação são comparáveis à variante de partida de camundongo 1A6. TPP-3583 exibiu atividade ainda levemente superior no ensaio de aPTT com base em plasma.

[0193] Isso também foi confirmado pela atividade antitrombótica de TPP-3583 no modelo in vivo (consulte o Experimento 9) . Assim, com a previsão de anticorpos TPP3583 e TPP-3577, a invenção fornece anticorpos de linha germinativa e humanizados que são tanto eficazes quanto seguros para tratamento, ambos em termos de uma imunogenicidade reduzida e uma minimização de risco de sangramento. Os anticorpos avaliados no presente documento

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94/109 são, portanto, agentes inovadores promissores para tratamento eficaz e/ou profilaxia de transtornos trombóticos ou tromboembólicos e/ou complicações trombóticas ou tromboembólicas.

Experimento 1: Humanização de anticorpos murinos [0194] A humanização do anticorpo murino 1A6 foi realizada pelo uso de técnicas padrão.

[0195] Em detalhes, para a seleção de subconjuntos de família aceitante de linha germinativa, os resíduos de CDR do anticorpo murino foram determinados e anotados seguindo o sistema de numeração Kabat (para detalhes consulte http://www.bioinf.org.Uk/abs/#kabatna). As estruturas canônicas das CDRs de cadeia leve e pesada foram determinadas com base nas seguintes publicações:

O'Brien e Jones, Humanising Antibodies by CDR Grafting, Capitulo 40; Antibody Engineering, Part of the series Springer Lab Manuals pp 567-590; R. Kontermann et al. (eds.), Antibody Engineering; Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2001.

Hwang, Almagro, Buss, Tan and Foote (2005) Use of human germline genes in a CDR homology-based approach to antibody humanization. Methods, May; 36(1):35-42.

[0196] Com base nessas publicações, os aceitantes de arcabouço de linha germinativa humana com as mesmas estruturas canônicas foram selecionados.

[0197] Em uma próxima etapa, os resíduos foram identificados sustentando estruturas de alça e as interfaces VH assim como VL com base no sistema de numeração Kabat (para detalhes consulte http://www.bioinf.org.Uk/abs/#kabatna). Quando necessário,

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95/109 os aminoácidos que são importantes para conformação de alça e para as interfaces Vh e Vl foram retromutados.

[0198] As identidades e as similaridades com cada uma das sequências de arcabouço de linha germinativa humana dentro dos mesmos subconjuntos canônicos foram analisadas e a sequência de linha germinativa com a melhor homologia geral para as sequências Vh e Vl murinas foram identificadas pelo uso do programa Align X do pacote Vector NTI. Essas sequências foram selecionadas como arcabouço de linha germinativa humana aceitante para enxerto de CDRs de V_H e V_L, respectivamente.

[0199]	A	região de junção	de	cadeia	pesada humana
(região	Jh)	assim como a região	VL	humana	foi	selecionada
com base	na	melhor homologia de	sequência.
[0200]	A	fim de analisar essas	variantes	humanizadas

projetadas in silico em relação à atividade de ligação a FXI, os cDNAs correspondentes foram sintetizados e usados para a expressão dos anticorpos humanizados. Para isso, as células HEK293 foram transfectadas com os cDNAs, e após 5 dias de cultivação, os anticorpos foram purificados a partir do sobrenadante dessas células. Cada anticorpo humanizado purificado foi caracterizado para atividade de ligação pelo uso de um protocolo ELISA padrão e para propriedades fisico-quimicas pela análise das moléculas por cromatografia de exclusão de tamanho.

Experimento 2: Otimização de linha germinativa e sequência de CDRs [0201] Para redução adicional do risco de imunogenicidade intrínseco, em uma próxima etapa, a otimização de linha germinativa e sequência das CDRs do

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96/109 anticorpo humanizado foi realizada.

[0202] Portanto, os aminoácidos que diferem da sequência de linha germinativa mais próxima foram trocados, os cDNAs correspondentes foram sintetizados, as células HEK293 foram transientemente transfectadas, os anticorpos expressados desta invenção foram quantificados e testados em relação a sua capacidade de se ligar a FXI humano (Haematologic Technologies Inc.; FXI humano; η^Ω de Catálogo HCXI-0150).

Experimento 3: Expressão e quantificação de variantes de anticorpo.

[0203] As IgGs mencionadas acima foram transientemente expressas em célula de mamífero como descrito em Tom et al. , Capítulo 12 em Methods Express: Expression Systems editado por Micheál R. Dyson e Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007. Em suma, um plasmídeo de expressão à base de Promotor de CMV foi transfectado em células HEK2936E e incubado em Bolsas Onduladas ou Frascos Fernbach. As células transfectadas foram cultivadas a 37 °C por 5 a 6 dias em Meio F17 (Invitrogen). 1 % de FCS de IgG Ultrabaixo (Invitrogen) e 0,5 mM de ácido valproico (Sigma) foi suplementado 24 h após-transfecção. Os anticorpos foram purificados por cromatografia de Proteína A e adicionalmente caracterizados por sua afinidade de ligação com o uso de um ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA). Consulte as Tabelas 1 e 2 acima para as sequências dos anticorpos da invenção. A Tabela 3 acima lista as sequências de anticorpos adicionais.

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Experimento 4: Ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA):

ELISA [0204] Um formato de ELISA padrão foi usado para analisar a afinidade de ligação de anticorpos de desta invenção a FXI . 0 FXI humano foi obtido junto à Haematologic Technologies Inc. (FXI humano; η^Ω de Catálogo HCXI-0150), o FXI de babuíno foi gerado como descrito abaixo. Esses antígenos foram revestidos para placas de microtitulação Maxisorp pretas de 384 poços (Nunc; η^Ω de Catálogo: 460518), diluídos para uma concentração de 1 pg/ml em IX de Tampão de Revestimento (Candor Bioscience; η^Ω de Catálogo 121125) . As placas foram incubadas durante a noite a 4 °C. Após incubação durante a noite, as placas foram lavadas 2 X com 50 μΐ/poço com o uso de Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS, SigmaAldrich, η^Ω de Catálogo: D8662) + 0,05 % de Tween 20 (SigmaAldrich, η^Ω de Catálogo P9416). Após isso, 50 μΐ/poço de tampão de bloqueio (Smart Block; Candor Bioscience; η^Ω de Catálogo 113500) foi adicionado e as placas incubadas por 1 hora à

temperatura	ambiente.	Posteriormente,	as	placas	foram
lavadas por	3 X com o	uso de 50 μΐ/poço	de	um tampão	PBS +
0,0 5 % de	Tween 2 0 .	Os anticorpos desta	invenção	foram
adicionados	em diferentes concentrações	em	um volume	final

de 30 μΐ/poço. As placas foram incubadas por 1 hora à temperatura ambiente. Após essa etapa de incubação, as placas foram lavadas por 3 X com o uso de 50 μΐ/poço de um tampão PBS+ 0,05 % de Tween 20. Para a detecção de anticorpos candidatos aderidos, o anticorpo anti-h-Fc-POD (Sigma; η^Ω de Catálogo A0170) foi diluído pelo fator de

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1:10000 em 10 % de tampão de bloqueio. 30 μΐ/poço desse anticorpo de detecção diluído foram adicionados e as placas foram incubadas por 1 hora à temperatura ambiente. Após essa etapa de incubação, as placas foram lavadas por 3 X com o uso de 50 μΐ/poço de um tampão PBS+ 0,05 % de Tween 20. Como substrato, uma mistura de 30 μΐ/poço de 1:1000 de vermelho Amplex diluído (Invitrogen; η^Ω de Catálogo 12222; solução estoque 10 mM em DMSO) e 1:10000 de peróxido de hidrogênio (Merck; η^Ω de Catálogo 107209; 30 % de solução estoque) foi adicionado e as placas foram incubadas por 20 minutos no escuro.

[0205] Para medição, o leitor Infinite f500 (Tecan) foi usado.

Modo de medição:

• Fluorescência • Leitura de Topo • Ex 535 nm • Em 590 nm [0206] Os dados foram analisados com o uso do software GraphPadPrism, a atividade de ligação desta invenção foi calculada como valores de EC50. Todos os experimentos foram realizados em quadruplicata, os dados são dados como média ± SEM. Os dados para ELISA de FXI humano para os anticorpos 1A6, TPP-3583, TPP-3577, TPP-3290 e TPP-3238 são mostrados nas Figuras 2-6 e dados numéricos na Figura 9. O formato das curvas assim como os valores de EC50 são comparáveis com 1A6 e, portanto, classificados para análise adicional.

[0207] Análise de domínio de ligação através de ELISA competitivo

A fim de mostrar que as variantes humanizadas e otimizadas

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99/109 estão ainda se ligando ao mesmo domínio como a variante inicial 1A6, o ELISA competitivo foi usado. Para isso, 1A6 foi biotinilado pelo uso do Kit de Biotinilação EZ-Link™ NHS-PEG4 (ThermoFischer Scientific, η^Ω de Catálogo 21455) de acordo com as instruções do fabricante. Como descrito acima, FXI foi revestido e uma concentração fixa de 1A6 biotinilado misturado com diferentes concentrações dos anticorpos desta invenção foi adicionada. A ligação de 1A6 biotinilado foi detectada pelo uso de Estreptavidina Conjugada com HRP (SigmaAldrich, η^Ω de Catálogo S5512) . Como substrato, uma mistura de 30 μΐ/poço de 1:1000 de vermelho Amplex diluído (Invitrogen; η^Ω de Catálogo 12222; solução estoque 10 mM em DMSO) e 1:10000 de peróxido de hidrogênio (Merck; η^Ω de Catálogo 107209; 30 % de solução estoque) foi adicionado e as placas foram incubadas por 20 minutos no escuro. A ligação dos anticorpos da invenção ao mesmo domínio que 1A6 leva ao deslocamento do último por concentrações crescentes das variantes humanizadas e otimizadas. Esse efeito tem sido demonstrado para todos os anticorpos descritos nesta invenção. Como exemplo, os dados do ensaio de ligação competitivo de TPP-3583 e 1A6 são mostrados na Figura 7 indicando que esses dois anticorpos

se ligam ao mesmo	domínio na molécula de	FXI.
[0208] Geração	de FXI de babuíno
0 cDNA para FXI	de Papio	anubis (ηΩ	de Acesso	Uniprot
A0A096NC95) foi	sintetizado	e clonado	formando	vetor de

expressão de mamífero pcDNA3.1(+) (ThermoFisher Scientific, η^Ω de Catálogo V790-20). Para expressão e purificação, as células HEK293 foram transientemente transfectadas pelo uso do Reagente Lipofectamina LTX com Reagente PLUS

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100/109 (Invitrogen, η^Ω de Catálogo A12621) seguindo as instruções dos fabricantes. A expressão recombinante de FXI de babuíno foi analisada por SDS-PAGE. As atividades de ligação de anticorpos descritos nesta invenção para ligação de FXI de babuíno são mostradas na Figura 9.

Experimento 5: Neutralização funcional da conversão de FXI em sua forma ativa, FXIa, por anticorpos desta invenção.

[0209] Para testar a inibição da conversão de FXI (Haematologic Technologies, Inc., número de catálogo HCXIA0150) em seu FXIa de forma ativa por FXIIa, 10 nM de FXI humano foram incubados em 50 mM de Tris/HCl, 100 mM de NaCl, 5 mM de CaC12 e 0,1 % de BSA com diferentes concentrações dos anticorpos por 1 hora a 37 °C. Em uma próxima etapa, FXIIa humano (Enzyme Research, número de catálogo HFXIIa 1212a) a uma concentração final de 1 unidade/mg foi adicionado e incubado por 24 horas a 37 °C. A seguir, Inibidor de Tripsina de Milho (Enzyme Research, CTI) a uma concentração final de 200 nM e o substrato identificado fluorogenicamente (1-1575, Bachem, concentração final 25 μΜ) foram adicionados. A fluorescência foi monitorada continuamente a 360/465 nm com o uso de um Leitor SpectraFluorplus (Tecan). Os dados foram analisados com o uso do software GraphPadPrism. Os dados são dados como média ± SEM, n= 4 (consulte o gráfico para TPP-3583 na Figura 8, os valores numéricos para outros anticorpos são listados na Figura 9) .

Experimento 6: Tempo de Tromboplastina Parcial Ativado (aPTT):

[0210] Cotas de plasma humano foram incubadas com concentrações crescentes dos anticorpos desta invenção por

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101/109 min a 37 °C. Para iniciar a via de coagulação intrínseca, 0,05 ml de plasma foi incubado com 0,05 ml de reagente de aPTT (Diagnostica Stago, K.C Prest 5) por exatamente 3 min. A coagulação foi iniciada pela recalcificação das amostras com 0,05 ml de 0,025 M de solução de cloreto de cálcio préaquecida. Um coagulômetro automatizado (AMAX 200, Trinity Biotech, Lemgo, Alemanha) misturou o plasma a 37 °C e registro mecanicamente tempo até coagulação. A concentração de fármaco de teste que prolonga aPTT por um fator de 1,5 foi calculada e relatada. (Figura 9).

Experimento 9: Modelo de trombose de babuíno in vivo.

Em um modelo de derivação AV de babuíno, a formação de trombo foi iniciada por implantação temporal de um dispositivo trombogênico na derivação AV crônica hipotrombogênica. O dispositivo trombogênico que foi usado para avaliar o efeito de anticorpos em iniciação e propagação de trombo consistiu em um diâmetro interno de 4 mm (i.d.), enxerto de ePTFE revestido com colágeno de 20 mm de comprimento que foi seguido por uma câmara de expansão de borracha de silicone com i.d. de 9 mm e 20 mm de comprimento. A taxa de cisalhamento no enxerto foi destinada a imitar a coagulação sanguínea do tipo arterial e a taxa de cisalhamento na câmara de expansão foi destinada a imitar a coagulação sanguínea do tipo venosa. A formação de trombo foi avaliada em tempo real durante os experimentos por imageamento de câmera gama quantitativo de acúmulo de plaqueta radioidentifiçado dentro do segmento de enxerto, e por determinações de ponto final de deposição de fibrinogênio/fibrina radioidentifiçada (para detalhes adicionais consulte Tucker et al. Blood. 22 de janeiro de

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2009;113(4):936-944, página 937, coluna esquerda, capítulo precedido por Thrombosis model). Como mostrado na Figura 10, a aplicação intravenosa de 1 mg/kg em solução salina tamponada com fosfato (PBS) de TPP-3583 levou a uma redução de deposição de plaqueta de aproximadamente 80 %. Esses dados são comparáveis com a atividade antitrombótica do anticorpo 1A6 murino como publicado por Tucker et al. (Blood. 22 de janeiro de 2009; 113 (4) : 936-944) .

Abaixo da inibição de deposição de plaqueta, a administração de TPP-3583 também levou a uma redução significativa de acúmulo de fibrina no enxerto revestido com colágeno em aproximadamente 80 % (Figura 11).

Tabela 1: sequências de polipeptídeos de anticorpos TPP3583 e TPP-3577

Anticorpo	SEQ ID	NO:
	CDRL1	CDRL2	CDRL3	CDRH1	CDRH2	CDRH3	VL	VH	Cadeia Leve	Cadeia Pesada
TPP-3583	8	9	10	11	12	13	17	18	27	28
TPP-3577	14	9	10	11	15	16	19	20	29	30

Tabela 2: sequências de polinucleotídeos de anticorpos TPP3583 e TPP-3577

Anticorpo	SEQ ID	NO:
	CDRL1	CDRL2	CDRL3	CDRH1	CDRH2	CDRH3	VL	VH	Cadeia Leve	Cadeia Pesada
TPP-3583	-	-	-	-	-	-	31	32	-	-
TPP-3577	-	-	-	-	-	-	33	34	-	-

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Tabela 3: sequências de polipeptideos de anticorpos adicionais

Anticorpo	SEQ ID	NO:
	CDRL1	CDRL2	CDRL3	CDRH1	CDRH2	CDRH3	VL	VH	Cadeia Leve	Cadeia Pesada
1A6	1	2	3	4	5	6	25	26	-	-
TPP-3290	-	-	-	-	-	-	21	22	35	36
TPP-3238	-	-	-	-	-	-	23	24	37	38

As modalidades preferenciais adicionais são

1. Uma molécula de ligação que compreende

(a)	uma	CDR1	da	cadeia	leve	que	compreende	a	sequência
	KASQSVLYSGDNYLN (SEQ ID	NO:	8) ;
(b)	uma	CDR2	da	cadeia	leve	que	compreende	a	sequência
	AASTLES	(SEQ	ID NO:	9) ;
(c)	uma	CDR3	da	cadeia	leve	que	compreende	a	sequência

QQYNGDPWT (SEQ ID NO: 10);

(d) uma CDR1 da cadeia pesada que compreende a sequência TSGMGVG (SEQ ID NO: 11);

(e) uma CDR2 da cadeia pesada que compreende a sequência HIDWDDDKYYSPSLKS (SEQ ID NO: 12); e (f) uma CDR3 da cadeia pesada que compreende a sequência IRSSVYAHYYGMDY (SEQ ID NO: 13)

De preferência, a molécula de ligação é um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antigeno do mesmo que compreende um sitio de ligação a antigeno da cadeia leve que compreende

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(a)	uma	CDR1	da	cadeia leve	que	compreende	a
	sequência	como	retratado em	SEQ ID	NO: 8;
(b)	uma	CDR2	da	cadeia leve	que	compreende	a
	sequência	como	retratado em	SEQ ID	NO: 9; e
(c)	uma	CDR3	da	cadeia leve	que	compreende	a
	sequência	como	retratado em	SEQ ID	NO: 10;
e um	sítio de	ligação a antígeno	da cadeia pesada	que

compreende

(d)	uma	CDR1	da	cadeia pesada que	compreende	a
	sequência	como	retratado em SEQ ID	NO: 11;
(e)	uma	CDR2	da	cadeia pesada que	compreende	a
	sequência	como	retratado em SEQ ID	NO: 12; e
(f)	uma	CDR3	da	cadeia pesada que	compreende	a
	sequência	como	retratado em SEQ ID	NO: 13.
molécula	de ligação, de acordo com a	modalidade	1,

que tem capacidade de se ligar a Fator XI e/ou Fator Xla. De preferência, A molécula de ligação, de acordo com a modalidade 1, se liga especificamente a Fator XI e/ou Fator Xla.

3. A molécula de ligação, de acordo com a modalidade 1 ou 2, em que o dito Fator XI ou Fator Xla é um Fator XI de primata ou Fator Xla de primata.

4. A molécula de ligação, de acordo com a modalidade 3, em que o dito primata é um primata humano ou não humano.

5. A molécula de ligação, de acordo com a modalidade 4, em que o dito primata não humano é um babuíno, chimpanzé, gorila, orangotango, macaco cinomolgo ou macaco-rhesus.

6. A molécula de ligação, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a dita molécula de ligação se liga dentro de uma sequência de aminoácidos

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105/109 que corresponde ao domínio A3 de Fator XI que compreende os aminoácidos 200 a 283 de SEQ ID NO: 7

7. A molécula de ligação, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a dita molécula de ligação se liga a um epitopo dentro de uma sequência de aminoácidos que corresponde a a) aminoácidos 201 a 215 de SEQ ID NO:7; b) aminoácidos 221 a 222 de SEQ ID NO:7; c) aminoácidos 252 a 254 de SEQ ID NO:7; d) aminoácidos 259 a 261 de SEQ ID NO:7; e) aminoácidos 270 a 272 de SEQ ID NO:7; e/ou f) aminoácidos 276 a 278 de SEQ ID NO:7.

8. A molécula de ligação, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, que compreende uma região Vl como retratado em SEQ ID NO: 17.

9. A molécula de ligação, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a molécula de ligação compreende uma região Vh como retratado em SEQ ID NO: 18.

10. A molécula de ligação, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, que compreende uma região Vl como retratado em SEQ ID NO: 17 e uma região Vh como retratado em SEQ ID NO: 18.

11. A molécula de ligação, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a molécula de ligação compreende uma cadeia leve como retratado em SEQ ID NO: 27 .

12. A molécula de ligação, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a dita molécula de ligação compreende uma cadeia pesada como retratado em SEQ ID NO: 28.

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106/109

13. A molécula de ligação, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a molécula de ligação compreende uma cadeia leve como retratado em SEQ ID NO: 27 e uma cadeia pesada como retratado em SEQ ID NO :28.

14. A molécula de ligação, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a dita molécula de ligação é um anticorpo.

15. A molécula de ligação, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o dito anticorpo é um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antigeno do mesmo.

16. A molécula de ligação, de acordo com a modalidade 15, em que o dito anticorpo monoclonal é um anticorpo monoclonal humanizado ou um anticorpo monoclonal quimérico. De preferência, o anticorpo monoclonal humanizado é um anticorpo com todas as regiões de arcabouço de domínio variável e todas as regiões de arcabouço de domínio constante de origem humana.

17. A molécula de ligação, de acordo com qualquer uma das modalidades 14 a 16, em que o dito anticorpo é uma IgG, de preferência, uma IgGl ou IgG4.

18. Um polinucleotideo que codifica uma molécula de ligação, conforme definido em qualquer das modalidades 1 a 17.

19. Um vetor que compreende um polinucleotídeo, conforme definido na modalidade 18.

20. O vetor, de acordo com a modalidade 19, em que o dito vetor compreende adicionalmente pelo menos uma sequência regulatória que é ligada operativamente ao dito polinucleotídeo definido na modalidade 18.

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107/109

21. O vetor, de acordo com a modalidade 19 ou 20, em que o dito vetor é um vetor de expressão.

22. Uma célula hospedeira que compreende um vetor, de acordo com qualquer uma das modalidades 19 a 21, e/ou um ácido nucleico, de acordo com a modalidade 18.

23. Um processo para a produção de uma molécula de ligação de acordo com qualquer das modalidades 1 a 17, em que o dito processo compreende cultivar uma célula hospedeira, definida na modalidade 22, sob condições que permitem a expressão da molécula de ligação, conforme definido em qualquer das modalidades 1 a 17, e recuperar opcionalmente a molécula de ligação produzida da cultura.

24. Uma composição farmacêutica que compreende uma molécula de ligação, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 17, ou produzida de acordo com o processo da modalidade 23, o polinucleotideo da reivindicação 18, o vetor da modalidade 19 a 21, e/ou a célula hospedeira da modalidade 22, e opcionalmente um excipiente farmaceuticamente aceitável.

25. A composição farmacêutica, de acordo com a modalidade

24, que compreende adicionalmente um ou mais agentes ativos adicionais.

26. A composição farmacêutica, de acordo com a modalidade

25, em que ainda o agente ativo adicional é selecionado a partir de ativadores de plasminogênio (tromoboliticos/fibrinoliticos); inibidores de ativadores de plasminogênio; inibidores de inibidores de fibrinólise ativados por trombina (TAFI) incluindo ativador de plasminogênio de tecido (t-PA),

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108/109 estreptoquinase, reteplase e uroquinase; heparinas não fracionadas; Heparinas de baixo peso molecular; Heparinoide; Hirudina; Bivalirudina e/ou Argatrobana.

27. A molécula de ligação, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 17, ou produzida de acordo com o processo da modalidade 23, o polinucleotideo de acordo com a modalidade 18, o vetor, de acordo com qualquer uma das modalidades 19 a 21, a célula hospedeira, de acordo com a modalidade 22, ou a composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades 24 a 26, para uso como um medicamento.

28. A molécula de ligação, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 17, ou produzida de acordo com o processo da modalidade 23, o polinucleotideo, de acordo com a modalidade 18, o vetor, de acordo com qualquer uma das modalidades 19 a 21, a célula hospedeira, de acordo com a modalidade 22, ou a composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades 24 a 26, para uso no tratamento e/ou profilaxia de transtornos trombóticos ou tromboembólicos e/ou complicações trombóticas ou tromboembólicas.

29. A molécula de ligação, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 17, ou produzida de acordo com o processo da modalidade 23, o polinucleotideo, de acordo com a modalidade 18, o vetor, de acordo com qualquer uma das modalidades 19 a 21, a célula hospedeira, de acordo com a modalidade 22, ou a composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades 24 a 26, para uso em um método de inibição

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109/109 de coagulação sanguínea, agregação de plaqueta e/ou trombose em um indivíduo.

30. Uso da molécula de ligação, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 17, ou produzida de acordo com a modalidade 23 como um anticoagulante em amostras

sanguíneas,	conservações	sanguíneas,		produtos	de
plasma,	amostras biológicas	ou aditivos	ou	dispositivos
medicinais.
31. Um kit	que	compreende uma	molécula	de	ligação,	de
acordo	com	qualquer uma das modalidades	1 a 17,	ou

produzida de acordo com o processo da modalidade 23, um polinucleotídeo, de acordo com a modalidade 18, um vetor, de acordo com qualquer uma das modalidades 19 a

21, uma célula hospedeira, de acordo com a modalidade

22, ou a composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades 24 a 26.

Claims (18)

1. Anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação a antigeno do mesmo caracterizado pelo fato de que se liga especificamente a Fator XI humano e/ou Fator Xla humano compreendendo (a) uma CDR1 da cadeia leve que compreende a sequência KASQSVLYSGDNYLN (SEQ ID NO: 8);

(b) uma CDR2 da cadeia leve que compreende a sequência AASTLES (SEQ ID NO: 9); e (c) uma CDR3 da cadeia leve que compreende a sequência QQYNGDPWT (SEQ ID NO: 10);

(d) uma CDR1 da cadeia pesada que compreende a sequência TSGMGVG (SEQ ID NO: 11);

(e) uma CDR2 da cadeia pesada que compreende a sequência HIDWDDDKYYSPSLKS (SEQ ID NO: 12); e (f) uma CDR3 da cadeia pesada que compreende a sequência IRSSVYAHYYGMDY (SEQ ID NO: 13).

2. Anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação a antigeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma região Vl como retratado em SEQ ID NO: 17.

3. Anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação a antigeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal compreende uma região Vh como retratado em SEQ ID NO: 18.

4. Anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação a antigeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal compreende uma região Vl como retratado

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2/4 em SEQ ID NO: 17 e uma região Vh como retratado em SEQ ID NO: 18.

5. Anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação a antigeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal compreende uma cadeia leve como retratado em SEQ ID NO: 27.

6. Anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação a antigeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal compreende uma cadeia pesada como retratado em SEQ ID NO: 28.

7. Anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação a antigeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal compreende uma cadeia leve como retratado em SEQ ID NO: 27 e uma cadeia pesada como retratado em SEQ ID NO: 28.

8. Anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação a antigeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal é um anticorpo monoclonal humanizado ou um anticorpo monoclonal quimérico.

9. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antigeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal é uma IgG, de preferência, uma IgGl ou IgG4 .

10. Polinucleotideo caracterizado por codificar um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antigeno do

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3/4 mesmo, conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 9.

11. Vetor caracterizado por compreender um polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 10.

12. Célula hospedeira caracterizada por compreender um vetor, conforme definido na reivindicação 11, e/ou ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 10.

13. Processo para a produção de um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 9, em que o dito processo é caracterizado por compreender cultivar uma célula hospedeira, conforme definido na reivindicação 12, sob condições que permitem a expressão do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 9, e recuperar opcionalmente o anticorpo produzido ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da cultura.

14. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou produzido de acordo com o processo, conforme definido na reivindicação 13, o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 10, o vetor, conforme definido na reivindicação 11, e/ou a célula hospedeira, conforme definido na reivindicação 12, e opcionalmente um excipiente farmaceuticamente aceitável.

15. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e opcionalmente um excipiente

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4/4 farmaceuticamente aceitável.

16. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizada por compreender adicionalmente um ou mais agentes ativos adicionais.

17. Uso de anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou produzido conforme o processo, conforme definido na reivindicação 13, o polinucleotideo, conforme definido na reivindicação 10, o vetor, conforme definido na reivindicação 11, a célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 12, ou a composição farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou profilaxia de transtornos trombóticos ou tromboembólicos e/ou complicações trombóticas ou tromboembólicas.

18. Kit caracterizado por compreender um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou produzido conforme o processo, conforme definido na reivindicação 13, o polinucleotideo, conforme definido na reivindicação 10, o vetor, conforme definido na reivindicação 11, a célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 12, ou a composição farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 14 a 16.