ES2677329T3 - Anticuerpos monoclonales contra el inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI) - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une a un inhibidor de la ruta del factor tisular humano, en el que anticuerpo comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera que comprenden: (a) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID 5 NOS: 173, 216 y 259 y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 302, 345 y 388; o (b) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 174, 217 y 260 y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 303, 346 y 389; o (c) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 176, 219 y 262 y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 305, 348 y 391; o (d) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 178, 221 y 264 y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 307, 350 y 393; o (e) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 179, 222 y 265 y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 308, 351 y 394; o (f) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 184, 227 y 270 y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 313, 356 y 399; o (g) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 187, 230 y 273 y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 316, 359 y 402; o (h) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 191, 234 y 277 y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 320, 363 y 406; o (i) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 192, 235 y 278 y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 321, 364 y 407; o (j) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 194, 237 y 280 y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 323, 366 y 409; o (k) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 195, 238 y 281 y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 324, 367 y 410; o (l) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 198, 241 y 284 y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 327, 370 y 413; o (m) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 200, 243 y 286 y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 329, 372 y 415; o (n) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 201, 244 y 287 y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 330, 373 y 416; o (o) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 207, 250 y 293 y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 336, 379 y 422; o (p) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 208, 251 y 294 y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 337, 380 y 423; o (q) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 211, 254 y 297 y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 340, 383 y 426; o (r) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 212, 255 y 298 y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 341, 384 y 427; o (s) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 194, 237 y 280 y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NOS: 335, 378 y 421.

Description

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DESCRIPCION

Anticuerpos monoclonales contra el inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI)

Presentacion del listado de secuencias

El listado de secuencias asociado con esta solicitud se presenta en formato electronico mediante la pagina Web y se incorpora por tanto por referencia en la memoria descriptiva en su totalidad. El nombre del archivo de texto que contiene el listado de secuencias es MSB7329PCT_Sequence_Listing_ST25.

Campo de las realizaciones

Se proporcionan anticuerpos monoclonales aislados y fragmentos de los mismos que se unen al inhibidor de la ruta del factor tisular humano (TFPI) e invenciones relacionadas.

Antecedentes

La coagulacion de la sangre es un proceso por el cual la sangre forma coagulos estables para detener el sangrado. El proceso implica numerosas enzimas y procofactores (o "factores de coagulacion") que estan en circulacion en la sangre. Aquellas enzimas y procofactores interaction mediante diversas rutas a traves de las cuales se conviertes, tanto secuencial como simultaneamente, en la forma activada. Finalmente, el proceso da como resultado la activacion de la protrombina en trombina mediante el Factor X activado (FXa) en presencia de Factor Va, ion calcio, y plaquetas. La trombina activada induce a su vez la agregacion plaquetaria y convierte el fibrinogeno en fibrina, que a continuacion se reticula mediante el Factor XIII (FXIIIa) para formar un coagulo.

El proceso que conduce a la activacion del Factor X se puede llevar a cabo mediante dos rutas distintas: la ruta de activacion por contacto (anteriormente conocida como la ruta intrrnseca) y la ruta del factor tisular (anteriormente conocida como la ruta extrrnseca). Se pensaba anteriormente que la cascada de coagulacion consistfa en dos rutas de igual importancia vinculadas a una ruta comun. Se sabe ahora que la ruta primaria para el inicio de la cascada de coagulacion es la ruta del factor tisular.

El Factor X se puede activar mediante el factor tisular (TF) en combinacion con el Factor VII activado (FVIIa). El complejo del Factor VIIa y su cofactor esencial, TF, es un potente iniciador de la cascada de coagulacion.

La ruta de coagulacion del factor tisular esta controlada negativamente por el inhibidor de la ruta del factor tisular ("TFPI"). TFPI es un inhibidor natural de la retroalimentacion dependiente de FXa del complejo FVIIa/TF. Es un miembro de los inhibidores de la serina proteasa de tipo Kunitz multivalente. Fisiologicamente, TFPI se une el Factor X activado (FXa) para formar un complejo heterodimerico, que interactua posteriormente con el complejo FVIIa/TF para inhibir su actividad, cerrando asf la ruta del factor tisular de la coagulacion. En principio, el bloqueo de la actividad del TFPI puede restaurar la actividad de FXa y FVIIa/TF, prolongando de esta manera la duracion de la accion de la ruta del factor tisular y amplificando la generacion de FXa, que es un defecto comun en la hemofilia A y B.

De hecho, alguna evidencia experimental preliminar ha indicado que el bloqueo de la actividad de TFPI por los anticuerpos contra TFPI normaliza el tiempo de coagulacion prolongada o acorta el tiempo de sangrado. Por ejemplo, Nordfang y col. mostraron que el tiempo de protrombina diluida prolongado del plasma de hemofilia se normalizo tras el tratamiento del plasma con anticuerpos contra TFPI (Thromb. Haemost., 1991, 66(4): 464-467). De forma similar, Erhardtsen y col. mostraron que el tiempo de sangrado en el modelo de conejo con hemofilia A se acorto significativamente mediante los anticuerpos dirigidos contra TFPI (Blood Coagulation and Fibrinolysis, 1995, 6: 388-394). Estos estudios sugieren que la inhibicion de TFPI por anticuerpos dirigidos contra TFPI puede ser util para el tratamiento de la hemofilia A o B. Solo se utilizo un anticuerpo policlonal dirigido contra TFPI en estos estudios.

Utilizando tecnicas de hibridoma, Se prepararon e identificaron anticuerpos monoclonales contra TFPI humano recombinante (rhTFPI). Vease Yang y col., Chin. Med. J., 1998, 111(8): 718-721. Se ensayo el efecto del anticuerpo monoclonal sobre el tiempo de protrombina diluida (PT) y el tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT). Los experimentos mostraron que el anticuerpo monoclonal dirigido contra TFPI acorto el tiempo de coagulacion de tromboplastina diluido del plasma deficiente en factor IX. Esto sugirio que la ruta del factor tisular juega un importante papel no solo en la coagulacion fisiologica, sino tambien en la hemorragia de la hemofilia (Yang y col., Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao, 1997, 22(4): 297-300).

La patente de Estados Unidos n.° 7.015.194 de Kjalke y col. desvela composiciones que comprende FVIIa y un inhibidor de TFPI, incluyendo anticuerpos policlonales o monoclonales, o un fragmento de los mismos, para el tratamiento o la profilaxis de los episodios de sangrado o un tratamiento coagulativo. Se desvela tambien el uso de dicha composicion para reducir el tiempo de coagulacion en plasma normal de mairnfero. Se sugirio ademas que un Factor VIII o una variante del mismo puede estar incluido en la composicion desvelada de FVIIa y el inhibidor de TFPI. No se sugirio una combinacion de FVIII o Factor IX con anticuerpo monoclonal TFPI.

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Welsch, D. J. y col., "Effect of lipoprotein-associated coagulation inhibitor (LACI) on thromboplastin-induced coagulation of normal and hemophiliac plasmas", Thrombosis Res., 64(2): 213-222(1991), desvelan el efecto curativo sobre el tiempo de coagulacion de los pacientes con hemofilia tras la administracion de Ab policlonal y monoclonal unido a LACI (TFPI), pero no desvela un mAb dirigido contra TFPI completamente humano o un mAb caracterizado por (cualesquiera) CDR espedficas.

Ademas del tratamiento para la hemofilia, se ha sugerido tambien que los inhibidores de TFPI, incluyendo anticuerpos policlonales o monoclonales, se pueden usar para el tratamiento del cancer (vease la patente de Estados Unidos n.° 5.902.582 de Hung).

Por consiguiente, se necesitan anticuerpos espedficos de TFPI para tratar las enfermedades hematologicas y el cancer.

Generalmente, los anticuerpos terapeuticos para enfermedades humanas se han producido utilizando ingeniena genetica para crear anticuerpos murinos, quimericos, humanizados o completamente humanos. Se mostro que los anticuerpos monoclonales de murino teman uso limitado como agentes terapeuticos debido a una semivida en suero corta, una incapacidad para estimular funciones efectoras humanas, y la produccion de anticuerpos humanos dirigidos contra Ig de raton. Brekke y Sandlie, "Therapeutic Antibodies for Human Diseases at the Dawn of the Twenty-first Century", Nature 2, 53, 52-62 (Ene. 2003). Los anticuerpos quimericos han mostrado proporcionar un aumento de Ig humanas contra anticuerpos quimericos. Los anticuerpos humanizados minimizan ademas el componente de raton de los anticuerpos. Sin embargo, un anticuerpo completamente humano evita la inmunogenicidad asociada con elementos de murino completamente. Por tanto, existe una necesidad de desarrollar anticuerpos completamente humanos para evitar la inmunogenicidad asociada con otras formas de anticuerpos monoclonales disenados mediante ingeniena genetica. En particular, el tratamiento profilactico cronico tal como se requerina para el tratamiento de la hemofilia con un anticuerpo monoclonal dirigido contra TFPI tiene un alto riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria al tratamiento si se usa un anticuerpo con un componente de murino o de origen murino debido a la dosificacion frecuente requerida y a la larga duracion del tratamiento. Por ejemplo, el tratamiento del anticuerpo para la hemofilia A puede requerir la dosificacion semanal para el tiempo de vida de un paciente. esto sena un estfmulo continuo. Por tanto, existe la necesidad de un anticuerpo completamente humano para el tratamiento de anticuerpos para la hemofilia y las deficiencias o defectos geneticos y adquiridos en la coagulacion.

Se han preparado anticuerpos terapeuticos mediante la tecnologfa del hibridoma descrita por Koehler and Milstein en "Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity", Nature 256, 495-497 (1975). Pueden prepararse tambien anticuerpos completamente humanos de forma recombinante en procariotas y eucariotas. Se prefiere la produccion recombinante de un anticuerpo en una celula hospedadora mas bien que la produccion de hibridomas para un anticuerpo terapeuticos. La produccion recombinante tiene las ventajas de una mayor consistencia del producto, un nivel de produccion posiblemente mas alto, y una fabricacion controlada que minimiza o elimina la presencia de protemas obtenidas de animales. Por estos motivos, es deseable tener un anticuerpo monoclonal dirigido contra TFPI producido de manera recombinante.

Sumario

Se proporcionan anticuerpos monoclonales contra el inhibidor de la ruta del factor tisular humano (TFPI). Se proporcionan ademas moleculas de acido nucleico aislado que codifican el mismo. Se desvelan tambien composiciones farmaceuticas que comprenden los anticuerpos monoclonales dirigidos contra TFPI y su uso para el tratamiento de las deficiencias o defectos geneticos y adquiridas en la coagulacion tales como hemofilia A y B. Se desvelan tambien los usos de estos anticuerpos para el acotamiento del tiempo de sangrado administrando dicho anticuerpo monoclonal dirigido contra TFPI a un paciente que lo necesita. Se desvelan tambien los procedimientos para producir un anticuerpo monoclonal que se une a TFPI humano de acuerdo con la presente invencion.

Breve descripcion de los dibujos

Fig. 1: La actividad de union de los ejemplos representativos de los Fab, se selecciona entre la clasificacion por inmunoprecipitacion y el cribado de TFPI humano ("h-TFPI") y TFPI de raton ("m-TFPI"). Se ensayaron un Fab del control contra Estradiol-BSA ("EsB") y 12 Fab (1-4 y 6-13) seleccionados entre TFPI clasificados mediante inmunoprecipitacion. El eje Y denota los resultados de las unidades de fluorescencia de ELISA.

Fig. 2: La actividad funcional in vitro dependiente de la dosis de cuatro anticuerpos representativos dirigidos contra TFPI (4B7: TP-4B7, 2A8: TP-2A8, 2G6: TP-2G6, 2G7: TP-2G7) obtenidos a partir de la clasificacion mediante inmunoprecipitacion y cribado de una biblioteca de anticuerpos humanos como se muestra por su acortamiento dPT. El experimento implico 0,5 ug/ml de mTFPI enriquecido en plasma con TFPI agotado.

Fig. 3: La actividad funcional in vitro de Fab dirigido contra TFPI, Fab-2A8 (procedente de TP-2A8), como se analizo en el ensayo ROTEM.

Fig. 4: La actividad de union a TFPI humano y TFPI de raton de los clones TP-2G6 ("2G6") tras la conversion en IgG. A: union de IgG-2G6 a TFPI de raton; □: union de IgG-2G6 a TFPI humano; ▲ : Union de IgG del control a

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TFPI de raton; ■: union de IgG del control a IgG humana.

Fig. 5: Los anticuerpos TP-2A8 ("2A8") dirigidos contra TFPI, TP-3G1 ("3G1"), y TP-3C2 ("3C2") acortaron el tiempo de coagulacion de la sangre completa en ratones con hemofilia A como se ensayo en el ensayo ROTEM. Cada punto representa un raton individual con hemofilia A.

Fig. 6: El alineamiento de la secuencia de aminoacidos entre las cadenas ligeras variables de los anticuerpos monoclonales TP-2A10 dirigidos contra TFPI (SEQ ID NO: 18), TP-2B1 (SEQ ID NO: 22), TP-2A2 (SEQ ID NO: 2), TP-2G2 (SEQ ID NO: 66), TP-2A5.1 (SEQ ID NO: 6), TP-3A3 (SEQ ID NO: 98), TP-2A8 (SEQ ID NO: 14), TP- 2B8 (SEQ ID NO: 34), TP-2G7 (SEQ ID NO: 82), TP-4H8 (SEQ ID NO: 170), TP-2G4 (SEQ ID NO: 70), TP-3F2 (SEQ ID NO: 134), TP-2A6 (SEQ ID NO: 10), TP-3A2 (SEQ ID NO: 94), TP-2C1 (SEQ ID NO: 42), TP-3E1 (SEQ ID NO: 126), TP-3F1 (SEQ ID NO: 130), TP-3D3 (SEQ ID NO: 122), TP-4A7 (SEQ ID NO: 150), TP-4G8 (SEQ ID NO: 166), TP-2B3 (SEQ ID NO: 26), TP-2F9 (SEQ ID NO: 62), TP-2G5 (SEQ ID NO: 74), TP-2G6 (SEQ ID NO: 78), TP-2H10 (SEQ ID NO: 90), TP-2B9 (SEQ ID NO: 38), TP-2C7 (SEQ ID NO: 46), TP-3G3 (SEQ ID NO: 142), TP-3C2 (SEQ ID NO: 114), TP-3B4 (SEQ ID NO: 110), TP-2E5 (SEQ ID NO: 58), TP-3C3 (SEQ ID NO: 118), TP- 3G1 (SEQ ID NO: 138), TP-2D7 (SEQ ID NO: 50), TP-4B7 (SEQ ID NO: 158), TP-2E3 (SEQ ID NO: 54), TP-2G9 (SEQ ID NO: 86), TP-3C1 (SEQ ID NO: 86), TP-3A4 (SEQ ID NO: 102), TP-2B4 (SEQ ID NO: 30), TP-3H2 (SEQ ID NO: 146), TP-4A9 (SEQ ID NO: 154), TP-4E8 (SEQ ID NO: 162) y TP-3B3 (SEQ ID NO: 106).

Fig. 7: El alineamiento de las secuencias de aminoacidos entre las cadenas pesadas variables de anticuerpos monoclonales TP-2A10 dirigidos contra TFPI (SEQ ID NO: 20), TP-3B3 (SEQ ID NO: 108), TP-2G4 (SEQ ID NO: 72), TP-2A5.1 (SEQ ID NO: 8), TP-4A9 (SEQ ID NO: 156), TP-2A8 (SEQ ID NO: 16), TP-2B3 (SEQ ID NO: 28), TP-2B9 (SEQ ID NO: 40), TP-2H10 (SEQ ID NO: 92), TP-3B4 (SEQ ID NO: 112), TP-2C7 (SEQ ID NO: 48), TP- 2E3 (SEQ ID NO: 56), TP-3C3 (SEQ ID NO: 120), TP-2G5 (SEQ ID NO: 76), TP-4B7 (SEQ ID NO: 160), TP-2G6 (SEQ ID NO: 80), TP-3C2 (SEQ ID NO: 116), TP-2D7 (SEQ ID NO: 52), TP-3G1 (SEQ ID NO: 140), TP-2E5 (SEQ ID NO: 60), TP-2B8 (SEQ ID NO: 36), TP-3F1 (SEQ ID NO: 132), TP-3A3 (SEQ ID NO: 100), TP-4E8 (SEQ ID NO: 164), TP-4A7 (SEQ ID NO: 152), TP-4H8 (SEQ ID NO: 172), TP-2A6 (SEQ ID NO: 12), TP-2C1 (SEQ ID NO: 44), TP-3G3 (SEQ ID NO: 144), TP-2B1 (SEQ ID NO: 24), TP-2G7 (SEQ ID NO: 84), TP-3H2 (SEQ ID NO: 148), TP-2A2 (SEQ ID NO: 4), TP-3E1 (SEQ ID NO: 128), TP-2G2 (SEQ ID NO: 68), TP-3D3 (SEQ ID NO: 124), TP-2G9 (SEQ ID NO: 88), TP-2B4 (SEQ ID NO: 32), TP-3A2 (SEQ ID NO: 96), TP-2F9 (SEQ ID NO: 64), TP-3A4 (SEQ ID NO: 104), TP-3C1 (SEQ ID NO: 136), TP-3F2 (SEQ ID NO: 136) y TP-4G8 (SEQ ID NO: 168).

Fig. 8: Grafico que muestra la tasa de supervivencia en 24 horas tras un corte transversal de la vena de la cola en ratones tratados con (1) el pepticuerpo TP-2A8 ("2A8") dirigido contra TFPI, (2) 2A8 y el factor VIII recombinante, (3) IgG de raton, y (4) el factor VIII recombinante.

Fig. 9: Graficos que muestra los ensayos del tiempo de coagulacion y el tiempo de formacion de coagulos en ratones tratados con el anticuerpo TP-2A8 ("2A8") dirigido contra TFPI, el factor VIIa, y la combinacion de 2A8 y el factor VIIa.

Fig. 10: Grafico que muestra el tiempo de coagulacion de la sangre humana normal tratada con un inhibidor de FVIII con el anticuerpo TP-2A8 ("2A8") dirigido contra TFPI y el anticuerpo TP-4B7 ("4B7") dirigido contra TFPI en comparacion con el inhibidor de FVIII solo.

Descripcion detallada

Definiciones

La expresion "inhibidor de la ruta del factor tisular" o "TFPI" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier variante, isoforma y especie homologa de TFPI humano que se expresa naturalmente por las celulas. En una realizacion preferida de la invencion, la union de un anticuerpo de la invencion a TFPI reduce el tiempo de coagulacion de la sangre.

Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo entero y a cualquier fragmento de union a antfgeno (es decir, "porcion de union a antigeno") o a una unica cadena del mismo. El termino incluye una molecula de inmunoglobulina de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo de IgG) que se produce o forma de manera natural gracias a procesos de recombinacion de fragmentos genicos normales de la inmunoglobulina, o una porcion inmunitariamente activa de una molecula de inmunoglobulina, tal como un fragmento de anticuerpo, que retiene la actividad de union espedfica. Con respecto a la estructura, un fragmento de anticuerpo se une con el mismo antfgeno que es reconocido por el anticuerpo de longitud completa. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo monoclonal dirigido contra TFPI se une a un epftopo de TFPI. La funcion de union a antfgeno de un anticuerpo puede llevarse a cabo por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de union abarcados en la expresion "porcion de union a antfgeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente consistente en los dominios Vl, Vh, Cl y Cm; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la region bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y Cm; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un unico brazo de un anticuerpo, v) un fragmento dAb (Ward y col. (1989) Nature, 341:544-546), que consiste en un dominio Vh; y (vi) una region determinante de la complementariedad aislada (CDR). Ademas, aunque los dos dominios del

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fragmento Fv, Vl y Vh, estan codificados por genes separados, se pueden unir, usando procedimientos recombinantes, mediante un enlazador sintetico que les permite ser preparados como una protema monocatenaria en la que la pareja de regiones Vl y Vh forman moleculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); veanse, por ejemplo, Bird y col. (1988) Science, 242:423-426; y Huston y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883). Se pretende tambien que dichos anticuerpos monocatenarios esten abarcados en la expresion "porcion de union a antigeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen utilizando tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, y los fragmentos se criban para su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "inhibe la union" y "bloquea la union" (por ejemplo, refiriendose a la inhibicion/bloqueo de la union del ligando de TFPI al TFPI) se utilizan indistintamente e incluyen la inhibicion o bloqueo tanto parcial como completa. Se pretende tambien que la inhibicion y el bloqueo incluyan cualquier disminucion medible en la afinidad de union de TFPI a un sustrato fisiologico cuando esta en contacto con un anticuerpo dirigido contra TFPI en comparacion con TFPI que no esta en contacto con un anticuerpo dirigido contra TFPI, por ejemplo, el bloqueo de la interaccion de TFPI con el factor Xa o el bloqueo de la interaccion de un complejo TFPI-factor Xa con factor tisular, factor VIIa o el complejo de factor tisular/factor VIIa en al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100%.

Las expresiones "anticuerpo monoclonal" o "composicion de anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a una preparacion de moleculas de anticuerpo de una unica composicion molecular. Una composicion de anticuerpo monoclonal muestra una unica especifidad y afinidad de union para un epttopo concreto. Por consiguiente, la expresion "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que muestran una unica especificidad de union que tiene regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de lmea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invencion pueden incluir restos de aminoacidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de la estirpe germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagenesis in vitro aleatoria o espedfica de un sitio, o mediante mutacion somatica in vivo).

Se pretende que un "anticuerpo aislado", tal como se usa en el presente documento, se refiera a un anticuerpo que esta sustancialmente exento de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigenicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une a TFPI esta sustancialmente exento de anticuerpos que se unen a antfgenos diferentes de TFPI). Un anticuerpo aislado que se une a un epttopo, isoforma o variante de TFPI humano puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antfgenos relacionados, por ejemplo, de otras especies (por ejemplo, homologos de especies de TFPI). Por otra parte, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente exento de otros materiales celulares y/o qmmicos.

Como se usa en el presente documento, "union espedfica" se refiere a la union de un anticuerpo a un antfgeno predeterminado. Normalmente, el anticuerpo se une con una afinidad de al menos aproximadamente 105 M-1 y se une a un antfgeno predeterminado con una afinidad que es mayor, por ejemplo, al menos dos veces mayor, que su afinidad por la union a un antfgeno irrelevante (por ejemplo, BSA, casema) diferente del antfgeno predeterminado o un antfgeno estrechamente relacionado. Las frases "un anticuerpo que reconoce un antigeno" y "un anticuerpo espedfico de un antigeno" se usan de manera indistinta en el presente documento con la expresion "un anticuerpo que se une espedficamente a un antigeno".

Como se usa en el presente documento, la expresion "alta afinidad" por un anticuerpo IgG se refiere a una afinidad de union de al menos aproximadamente 107M'1, en algunas realizaciones, al menos aproximadamente 108M'1, en algunas realizaciones, al menos aproximadamente 109M'1, 1010M'1, 1011M'1 o mas, por ejemplo, hasta 1013M'1 o mas. Sin embargo, la union de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpos. Por ejemplo, union de "alta afinidad" por un isotipo de IgM se refiere a una afinidad de union de al menos aproximadamente 1,0 x 107M'1. Como se usa en el presente documento, el termino "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG1) que codifica los genes de la region constante de la cadena pesada.

"Region determinante de la complementariedad" o "CDR" se refiere a una de tres regiones hipervariables en la region variable de la cadena pesada o la region variable de la cadena ligera de una molecula de anticuerpo que forma la superficie de union a antfgeno en el extremo N que es complementaria a la estructura tridimensional del antfgeno unido. Procediendo del extremo N de una cadena pesada o ligera, estas regiones determinantes de la complementariedad se denotan como "CDR1", "CDR2", y "CDR3", respectivamente. Las CDR estan involucradas en la union de antfgeno-anticuerpo y la CDR3 comprende una region unica espedfica para la union de un antfgeno con un anticuerpo. Un sitio de union a antfgeno, por lo tanto, puede incluir seis CDR, que comprenden las regiones CDR de cada region V de una cadena pesada y una cadena ligera.

Como se usa en el presente documento, "sustituciones conservativas" se refiere a las modificaciones de un polipeptido que implican la sustitucion de uno o mas aminoacidos que tienen propiedades bioqmmicas similares que no dan resultado la perdida de una funcion biologica o bioqmmica del polipeptido. Una "sustitucion de aminoacido conservativa" es aquella donde el resto de aminoacido se sustituye por un resto de aminoacido que tiene una cadena secundaria similar. Las familias de restos de aminoacidos que tienen cadenas secundarias similares se han definido en la tecnica. Estas familias incluyen aminoacidos con cadenas secundarias basicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas secundarias acidas (por ejemplo, acido aspartico, acido glutamico), cadenas

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secundarias polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cistema), cadenas secundarias no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas secundarias beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromaticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Se preve que los anticuerpos de la presente invencion puedan tener sustituciones de aminoacidos conservativas y retener todav^a la actividad.

Para los acidos nucleicos y polipeptidos, la expresion "homologfa sustancial" indica que dos acidos nucleicos o dos polipeptidos, o las secuencias designadas de los mismos, cuando se alinean y se comparan de forma optima, son identicos, con las inserciones o deleciones de aminoacidos adecuadas, en al menos aproximadamente 80% de los nucleotidos o aminoacidos, usualmente al menos aproximadamente 85%, preferentemente aproximadamente 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, o 95%, mas preferentemente al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, o 99,5% de los nucleotidos o aminoacidos. Como alternativa, existe una homologfa sustancial de los acidos nucleicos cuando los segmentos se hibriden en condiciones de hibridacion selectivas para el complemento de la hebra. La invencion incluye secuencias de acidos nucleicos y secuencias de polipeptidos que tienen una homologfa sustancial con las secuencias de acidos nucleicos espedficas y las secuencias de acidos nucleicos enumeradas en el presente documento.

El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias (es decir, % de homologfa = n.° de posiciones identicas / n.° total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el numero de huecos, y la longitud de cada hueco, cuya necesidad se va a introducir para el alineamiento optimo de las dos secuencias. Se puede llevar a cabo la comparacion de secuencias y la determinacion del porcentaje de identidad entre dos secuencias utilizando un algoritmo matematico, tal como, sin limitacion, el modulo AlignX™ del VectorNTI™ (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Para AlignX™, los parametros por defecto del alineamiento multiple son: penalizacion por abertura de hueco: 10; penalizacion por extension de hueco: 0,05; intervalo de penalizacion por separacion de hueco: 8; % de identidad para el retraso del alineamiento: 40. (se encuentran detalles adicionales en
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/LINNEA-Online-Guides/LINNEA- Communities/Vector-NTI-Community/Sequence-analysis-and-data-management-software-for-PCs/AlignX-Module-for- Vector-NTI-Advance.reg.us.html).

Otro procedimiento para determinar la mejor correspondencia global entre una secuencia solicitada (una secuencia de la presente invencion) y una secuencia sujeto, denominado tambien alineamiento global de secuencia, puede determinarse utilizando el programa informatico CLUSTALW (Thompson y col., Nucleic Acids Research, 1994, 2(22): 4673-4680), que se basa en el algoritmo de Higgins y col., (Computer Applications in the Biosciences (CABIOS), 1992, 8(2): 189-191). En un alineamiento de secuencias las secuencias solicitada y sujeto son ambas secuencias de ADN. El resultado de dicho alineamiento de secuencias global es el porcentaje de identidad. Los parametros preferidos utilizados en un alineamiento CLUSTALW de secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad mediante alineamientos por parejas son: Matriz = IUB, k-tupla = 1, Numero de diagonales superiores = 5, Penalizacion por hueco = 3, Penalizacion por apertura de hueco = 10, Penalizacion por extension de hueco = 0,1. Para multiples alineamientos, se prefieren los siguientes parametros CLUSTALW: Penalizacion por apertura de hueco = 10, Parametro de extension de hueco = 0,05; Intervalo de penalizacion por separacion de hueco= 8; % de identidad para el retraso del alineamiento= 40.

Los acidos nucleicos pueden estar presentes en celulas completas, en un lisado celular, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un acido nucleico esta "aislado" o "se ha vuelto sustancialmente puro" cuando se purifica por separado de otros componentes celulares con los que se asocia normalmente en el entorno natural. Para aislar un acido nucleico, se pueden usar tecnicas normalizadas tales como las siguientes: tratamiento alcalino/SDS, formacion de bandas de CsCl, cromatograffa en columna, electroforesis en gel de agarosa y otros bien conocidos en la tecnica.

Anticuerpos monoclonales

Se identificaron cuarenta y cuatro anticuerpos de union a TFPI y se cribaron mediante inmunoprecipitacion y se cribaron de bibliotecas de anticuerpos humanos contra TFPI humano. La region variable de la cadena pesada y la region variable de la cadena ligera de cada anticuerpo monoclonal se secuenciaron y se identificaron sus regiones CDR. Los numeros identificadores de secuencias ("SEQ ID NO") que corresponden a estas regiones de cada anticuerpo monoclonal se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1. Sumario de los numeros identificadores de secuencias ("SEQ ID NO") de la region variable de la cadena pesada ("VH") y la region variable de la cadena ligera ("VL") de cada uno de los anticuerpos monoclonales de union a TFPI. Se proporcionan tambien los numeros identificadores de secuencias de las regiones CDR ("CDR1," "CDR2," y "CDR3") de cada cadena pesada y ligera. N.A.: secuencia de acido nucleico; A.A.: secuencia de aminoacidos.

Clon

VL VH VL VH

N.A.

A.A. N.A. A.A. CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3

TP-2A2

1 2 3 4 173 216 259 302 345 388

(continuacion)

Clon

VL VH VL VH

N.A.

A.A. N.A. A.A. CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3

TP-2A5.1

5 6 7 8 174 217 260 303 346 389

TP-2A6

9 10 11 12 175 218 261 304 347 390

TP-2A8

13 14 15 16 176 219 262 305 348 391

TP-2A10

17 18 19 20 177 220 263 306 349 392

TP-2B1

21 22 23 24 178 221 264 307 350 393

TP-2B3

25 26 27 28 179 222 265 308 351 394

TP-2B4

29 30 31 32 180 223 266 309 352 395

TP-2B8

33 34 35 36 181 224 267 310 353 396

TP-2B9

37 38 39 40 182 225 268 311 354 397

TP-2C1

41 42 43 44 183 226 269 312 355 398

TP-2C7

45 46 47 48 184 227 270 313 356 399

TP-2D7

49 50 51 52 185 228 271 314 357 400

TP-2E3

53 54 55 56 186 229 272 315 358 401

TP-2E5

57 58 59 60 187 230 273 316 359 402

TP-2F9

61 62 63 64 188 231 274 317 360 403

TP-2G2

65 66 67 68 189 232 275 318 361 404

TP-2G4

69 70 71 72 190 233 276 319 362 405

TP-2G5

73 74 75 76 191 234 277 320 363 406

TP-2G6

77 78 79 80 192 235 278 321 364 407

TP-2G7

81 82 83 84 193 236 279 322 365 408

TP-2G9

85 86 87 88 194 237 280 323 366 409

TP-2H10

89 90 91 92 195 238 281 324 367 410

TP-3A2

93 94 95 96 196 239 282 325 368 411

TP-3A3

97 98 99 100 197 240 283 326 369 412

TP-3A4

101 102 103 104 198 241 284 327 370 413

TP-3B3

105 106 107 108 199 242 285 328 371 414

TP-3B4

109 110 111 112 200 243 286 329 372 415

TP-3C2

113 114 115 116 201 244 287 330 373 416

TP-3C3

117 118 119 120 202 245 288 331 374 417

TP-3D3

121 122 123 124 203 246 289 332 375 418

TP-3E1

125 126 127 128 204 247 290 333 376 419

TP-3F1

129 130 131 132 205 248 291 334 377 420

TP-3F2

133 134 135 136 206 249 292 335 378 421

TP-3G1

137 138 139 140 207 250 293 336 379 422

TP-3G3

141 142 143 144 208 251 294 337 380 423

5

10

15

20

25

30

35

40

(continuacion)

Clon

VL VH VL VH

N.A.

A.A. N.A. A.A. CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3

TP-3H2

145 146 147 148 209 252 295 338 381 424

TP-4A7

149 150 151 152 210 253 296 339 382 425

TP-4A9

153 154 155 156 211 254 297 340 383 426

TP-4B7

157 158 159 160 212 255 298 341 384 427

TP-4E8

161 162 163 164 213 256 299 342 385 428

TP-4G8

165 166 167 168 214 257 300 343 386 429

TP-4H8

169 170 171 172 215 258 301 344 387 430

TP-3C1

85 86 135 136 194 237 280 335 378 421

Se desvelan anticuerpos monoclonales aislados que se unen a un inhibidor de la ruta del factor tisular humano, en el que los anticuerpos comprenden una CDR3 de una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 388-430. Estas CDR3 se identifican a partir de las cadenas pesadas de los anticuerpos identificados durante el cribado por inmunoprecipitacion y el cribado. se desvelan ademas anticuerpos que comprenden adicionalmente (a) una CDR1 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 302-344, (b) una CDR2 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 345-387, o (c) ambas de una CDR1 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 302-344 y una CDR2 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 345387.

Se desvelan ademas anticuerpos que comparten una CDR3 de una de las cadenas ligeras de los anticuerpos identificado durante el cribado por inmunoprecipitacion y el cribado. Por tanto, la presente desvelacion se dirige a un anticuerpo monoclonal aislado que se une a un inhibidor de la ruta del factor tisular humano, en el que el anticuerpo comprende una CDR3 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 259-301. se desvelan ademas anticuerpos que comprenden adicionalmente (a) una CDR1 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 173-215,

(b) una CDR2 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 216-258, o (c) ambas de una CDR1 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 173-215 y una CDR2 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 216-258.

Se desvelan ademas anticuerpos que comprenden una CDR3 procedente de una cadena pesada y una CDR3 procedente de una cadena ligera de los anticuerpos identificados a partir del cribado y del cribado por inmunoprecipitacion. Por tanto, se desvela un anticuerpo que se una a un inhibidor de la ruta del factor tisular humano, en el que el anticuerpo comprende una CDR3 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 388-430 y una CDR3 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 259-301. El anticuerpo desvelado comprende ademas (a) una CDR1 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 302-344, (b) una CDR2 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 345-387, (c) una CDR1 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 173-215, y/o (d) una CDR2 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 216-258.

El anticuerpo desvelado comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera que comprenden:

(a) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 173, 216 y 259 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 302, 345 y 388;

(b) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 174, 217 y 260 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 303, 346 y 389;

(c) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 175, 218 y 261 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 304, 347 y 390;

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(d) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 176, 219 y 262 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 305, 348 y 391;

(e) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 177, 220 y 263 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 306, 349 y 392;

(f) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 178, 221 y 264 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 307, 350 y 393;

(g) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 179, 222 y 265 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 308, 351 y 394;

(h) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 180, 223 y 266 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 309, 352 y 395;

(i) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 181, 224 y 267 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 310, 353 y 396;

(j) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 182, 225 y 268 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 311, 354 y 397;

(k) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 183, 226 y 269 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 312, 355 y 398;

(l) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 184, 227 y 270 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 313, 356 y 399;

(m) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las

SEQ ID NOS: 185, 228 y 271 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de

aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 314, 357 y 400;

(n) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 186, 229 y 272 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 315, 358 y 401;

(o) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 187, 230 y 273 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 316, 359 y 402;

(p) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las

SEQ ID NOS: 188, 231 y 274 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de

aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 317, 360 y 403;

(q) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 189, 232 y 275 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 318, 361 y 404;

(r) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 190, 233 y 276 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 319, 362 y 405;

(s) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 191, 234 y 277 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 320, 363 y 406;

(t) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 192, 235 y 278 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 321, 364 y 407;

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(u) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 193, 236 y 279 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 322, 365 y 408;

(v) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 194, 237 y 280 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 323, 366 y 409;

(w) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 195, 238 y 281 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 324, 367 y 410;

(x) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 196, 239 y 282 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 325, 368 y 411;

(y) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 197, 240 y 283 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 326, 369 y 412;

(z) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 198, 241 y 284 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 327, 370 y 413;

(aa) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 199, 242 y 285 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 328, 371 y 414;

(bb) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 200, 243 y 286 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 329, 372 y 415;

(cc) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 201, 244 y 287 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 330, 373 y;

(dd) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 202, 245 y 288 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 331, 374 y 417;

(ee) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 203, 246 y 289 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 332, 375 y 418;

(ff) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 204, 247 y 290 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 333, 376 y 419;

(gg) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 205, 248 y 291 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 334, 377 y 420;

(hh) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 206, 249 y 292 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 335, 378 y 421;

(ii) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 207, 250 y 293 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 336, 379 y 422;

(jj) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 208, 251 y 294 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 337, 380 y 423;

(kk) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 209, 252 y 295 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 338, 381 y 424;

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(11) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 210, 253 y 296 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 339, 382 y 425;

(mm) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 211, 254 y 297 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 340, 383 y 426;

(nn) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 212, 255 y 298 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 341, 384 y 427;

(00) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 213, 256 y 299 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 342, 385 y 428;

(pp) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEq ID NOS: 214, 257 y 300 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 343, 386 y 429;

(qq) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 215, 258 y 301 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 344, 387 y 430; o

(rr) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 194, 237 y 280 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 335, 378 y 421.

Se desvelan ademas anticuerpos que comprenden:

(a) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 2 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptidica de SEQ ID NO: 4;

(b) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 6 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptidica de SEQ ID NO: 8;

(c) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 10 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 12;

(d) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 14 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 16;

(e) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 18 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 20;

(f) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 22 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 24;

(g) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 26 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 28;

(h) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 30 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 32;

(1) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 34 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 36;

(j) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 38 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 40;

(k) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 42 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 44;

(l) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 46 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 48;

(m) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 50 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de sEq ID NO: 52;

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(n) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 54 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 56;

(o) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 58 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptidica de SEQ ID NO: 60;

(p) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 62 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptidica de SEQ ID NO: 64;

(q) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 66 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 68;

(r) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 70 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 72;

(s) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 74 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 76;

(t) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 78 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptidica de SEQ ID NO: 80;

(u) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 82 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 84;

(v) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 86 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 88;

(w) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptidica de SEQ ID NO: 90 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de sEq ID NO: 92;

(x) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 94 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 96;

(y) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 98 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 100;

(z) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 102 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 104;

(aa) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 106 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 108;

(bb) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 110 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 112;

(cc) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 114 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 116;

(dd) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 118 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 120;

(ee) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 122 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 124;

(ff) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 126 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 128;

(gg) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 130 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 132;

(hh) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 134 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 136;

(ii) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 138 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 140;

(jj) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 142 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SeQ ID NO: 144;

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(kk) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptidica de SEQ ID NO: 146 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptidica de SEQ ID NO: 148;

(11) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 150 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 152;

(mm) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 154 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de sEq ID NO: 156;

(nn) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 158 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 160;

(oo) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 162 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptidica de SEQ ID NO: 164;

(pp) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 166 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptidica de SEQ ID NO: 168;

(qq) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 170 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 172; o

(rr) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptidica de SEQ ID NO: 86 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de sEq ID NO: 136.

Se desvela tambien un anticuerpo monoclonal aislado que se une a un inhibidor de la ruta del factor tisular humano, en el que el anticuerpo comprende una region variable de la cadena pesada humana que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 99,5% de identidad con una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos que se muestran en la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 48,

SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 76,

SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 100, SEQ ID

NO:104 SEQ ID NO:108 SEQ ID NO:112, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128,

SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 168 y SEQ ID NO: 172.

Se desvela tambien un anticuerpo monoclonal aislado que se une a un inhibidor de la ruta del factor tisular humano, en el que el anticuerpo comprende una region variable de la cadena ligera humana que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 99,5 % de identidad con una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos que se muestran en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54,

SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 82,

SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO:106 SEQ ID

NO:110, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 134,

SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO:166, y SEQ ID NO: 170.

Ademas de confiar en las descripciones de anticuerpos que utilizan los identificadores de secuencias descritos anteriormente, algunos pueden tambien describirse por referencia a los clones Fab aislados en los experimentos descritos en el presente documento. En algunos casos, los anticuerpos recombinantes comprenden las CDR3 de la cadena pesada y/o ligera de los siguientes clones: TP-2A2, TP-2A5.1, TP-2A6, TP-2A8, TP-2A10, TP-2B1, TP-2B3, TP-2B4, TP-2B8, TP-2B9, TP-2C1, TP-2C7, TP-2D7, TP-2E3, TP-2E5, TP-2F9, TP-2G2, TP-2G4, TP-2G5, TP-2G6, TP-2G7, TP-2G9, TP-2H10, TP-3A2, TP-3A3, TP-3A4, TP-3B3, TP-3B4, TP-3C1, TP-3C2, TP-3C3, TP-3D3, TP- 3E1, TP-3F1, TP-3F2, TP-3G1, TP-3G3, TP-3H2, TP-4A7, TP-4A9, TP-4B7, TP-4E8, TP-4G8 o TP-4H8. En algunos casos, los anticuerpos pueden comprender ademas las CDR2 de estos anticuerpos y comprender ademas adicionalmente las CDR1 de estos anticuerpos. En otros casos, los anticuerpos pueden comprender ademas algunas combinaciones de las CDR.

Por consiguiente, se desvelan anticuerpos dirigidos contra TFPI que comprenden: (1) regiones marco de la cadena pesada humana, una region CDR1 de la cadena pesada humana, y una region CDR2 de la cadena pesada humana, una region CDR3 de la cadena pesada humana, en la que la region CDR3 de la cadena pesada humana es la CDR3 de la cadena pesada de TP-2A2, TP-2A5.1, TP-2A6, TP-2A8, TP-2A10, TP-2B1, TP-2B3, TP-2B4, TP-2B8, TP-2B9, TP-2C1, TP-2C7, TP-2D7, TP-2E3, TP-2E5, TP-2F9, TP-2G2, TP-2G4, TP-2G5, TP-2G6, TP-2G7, TP-2G9, TP- 2H10, TP-3A2, TP-3A3, TP-3A4, TP-3B3, TP-3B4, TP-3C1, TP-3C2, TP-3C3, TP-3D3, TP-3E1, TP-3F1, TP-3F2, TP-3G1, TP-3G3, TP-3H2, TP-4A7, TP-4A9, TP-4B7, TP-4E8, TP-4G8 o TP-4H8; y (2) regiones marco de la cadena ligera humana, una region CDR1 de la cadena ligera humana, una region CDR2 de la cadena ligera humana, y una region CDR3 de la cadena ligera humana, en la que la region CDR3 de la cadena ligera humana es la CDR3 de la

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cadena ligera de TP-2A2, TP-2A5.1, TP-2A6, TP-2A8, TP-2A10, TP-2B1, TP-2B3, TP-2B4, TP-2B8, TP-2B9, TP- 2C1, TP-2C7, TP-2D7, TP-2E3, TP-2E5, TP-2F9, TP-2G2, TP-2G4, TP-2G5, TP-2G6, TP-2G7, TP-2G9, TP-2H10, TP-3A2, TP-3A3, TP-3A4, TP-3B3, TP-3B4, TP-3C1, TP-3C2, TP-3C3, TP-3D3, TP-3E1, TP-3F1, TP-3F2, TP-3G1, TP-3G3, TP-3H2, TP-4A7, TP-4A9, TP-4B7, TP-4E8, TP-4G8, o TP-4H8, en la que el anticuerpo se une a TFPI. El anticuerpo puede comprender ademas la CDR2 de la cadena pesada y/o la CDR2 de la cadena ligera de TP-2A2, TP-2A5.1, TP-2A6, TP-2A8, TP-2A10, TP-2B1, TP-2B3, TP-2B4, TP-2B8, TP-2B9, TP-2C1, TP-2C7, TP-2D7, TP- 2E3, TP-2E5, TP-2F9, TP-2G2, TP-2G4, TP-2G5, TP-2G6, TP-2G7, TP-2G9, TP-2H10, TP-3A2, TP-3A3, TP-3A4, TP-3B3, TP-3B4, TP-3C1, TP-3C2, TP-3C3, TP-3D3, TP-3E1, TP-3F1, TP-3F2, TP-3G1, TP-3G3, TP-3H2, TP-4A7, TP-4A9, TP-4B7, TP-4E8, TP-4G8 o TP-4H8. El anticuerpo puede comprender ademas la CDR1 de la cadena pesada y/o la CDR1 de la cadena ligera de TP-2A2, TP-2A5.1, TP-2A6, TP-2A8, TP-2A10, TP-2B1, TP-2B3, TP- 2B4, TP-2B8, TP-2B9, TP-2C1, TP-2C7, TP-2D7, TP-2E3, TP-2E5, TP-2F9, TP-2G2, TP-2G4, TP-2G5, TP-2G6, TP- 2G7, TP-2G9, TP-2H10, TP-3A2, TP-3A3, TP-3A4, TP-3B3, TP-3B4, TP-3C1, TP-3C2, TP-3C3, TP-3D3, TP-3E1, TP-3F1, TP-3F2, TP-3G1, TP-3G3, TP-3H2, TP-4A7, TP-4A9, TP-4B7, TP-4E8, TP-4G8 o TP-4H8.

Las regiones CDR1, 2, y/o 3 de los anticuerpos disenados mediante ingeniena genetica descritos anteriormente pueden comprender la(s) secuencia(s) de aminoacidos exactas de TP-2A2, TP-2A5.1, TP-2A6, TP-2A8, TP-2A10, TP-2B1, TP-2B3, TP-2B4, TP-2B8, TP-2B9, TP-2C1, TP-2C7, TP-2D7, TP-2E3, TP-2E5, TP-2F9, TP-2G2, TP-2G4, TP-2G5, TP-2G6, TP-2G7, TP-2G9, TP-2H10, TP-3A2, TP-3A3, TP-3A4, TP-3B3, TP-3B4, TP-3C1, TP-3C2, TP- 3C3, TP-3D3, TP-3E1, TP-3F1, TP-3F2, TP-3G1, TP-3G3, TP-3H2, TP-4A7, TP-4A9, TP-4B7, TP-4E8, TP-4G8, o TP-4H8 desveladas en el presente documento.

Sin embargo, la persona normalmente experta en la materia apreciara que alguna desviacion de las secuencias exactas de la CDR de TP-2A2, TP-2A5.1, TP-2A6, TP-2A8, TP-2A10, TP-2B1, TP-2B3, TP-2B4, TP-2B8, TP-2B9, TP-2C1, TP-2C7, TP-2D7, TP-2E3, TP-2E5, TP-2F9, TP-2G2, TP-2G4, TP-2G5, TP-2G6, TP-2G7, TP-2G9, TP- 2H10, TP-3A2, TP-3A3, TP-3A4, TP-3B3, TP-3B4, TP-3C1, TP-3C2, TP-3C3, TP-3D3, TP-3E1, TP-3F1, TP-3F2, TP-3G1, TP-3G3, TP-3H2, TP-4A7, TP-4A9, TP-4B7, TP-4E8, TP-4G8, o TP-4H8 puede ser posible reteniendo aun a la vez la capacidad del anticuerpo de unirse eficazmente a TFPI. Por consiguiente, el anticuerpo disenado mediante ingeniena genetica puede estar compuesto de una o mas CDR que son, por ejemplo, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 99,5% identicas a una o mas CDR de TP-2A2, TP-2A5.1, TP-2A6, TP-2A8, TP-2A10, TP-2B1, TP-2B3, TP-2B4, TP-2B8, TP-2B9, TP-2C1, TP-2C7, TP-2D7, TP-2E3, TP-2E5, TP-2F9, TP-2G2, TP-2G4, TP-2G5, TP-2G6, TP-2G7, TP-2G9, TP-2H10, TP-3A2, TP-3A3, TP-3A4, TP-3B3, TP-3B4, TP- 3C1, TP-3C2, TP-3C3, TP-3D3, TP-3E1, TP-3F1, TP-3F2, TP-3G1, TP-3G3, TP-3H2, TP-4A7, TP-4A9, TP-4B7, TP- 4E8, TP-4G8 o TP-4H8.

El anticuerpo puede ser de cualquiera de las diversas clases de anticuerpos, tales como, sin limitacion, una IgG1, una IgG2, una IgG3, una IgG4, una IgM, una IgA1, una IgA2, una IgA secretoria, una IgD, y un anticuerpo IgE.

En una realizacion, se proporciona un anticuerpo monoclonal humano completamente aislado que se une a un inhibidor de la ruta del factor tisular humano.

Se desvela tambien un anticuerpo monoclonal humano completamente aislado que se une al dominio 2 de Kunitz de un inhibidor de la ruta del factor tisular humano.

Acidos nucleicos

Se proporcionan tambien moleculas de acidos nucleicos aislados que codifican algunos de los anticuerpos monoclonales descritos anteriormente. Procedimientos de preparar anticuerpos contra TFPI

El anticuerpo monoclonal puede producirse de manera recombinante expresando una secuencia de nucleotidos que codifica las regiones variables del anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invencion en una celula hospedadora. Con la ayuda de un vector de expresion, se puede transfectar un acido nucleico que contiene la secuencia de nucleotidos y expresarse en una celula hospedadora adecuada para la produccion. Por consiguiente, se desvela tambien un procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal que se una a un TFPI humano que comprende:

(a) transfectar una molecula de acido nucleico que codifica un anticuerpo monoclonal de la invencion en una celula hospedadora,

(b) cultivar la celula hospedadora con el fin de expresar el anticuerpo monoclonal en la celula hospedadora, y opcionalmente

(c) aislar y purificar el anticuerpo monoclonal producido,

en el que la molecula de acido nucleico comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo monoclonal de la presente invencion.

En un ejemplo, para expresar los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos de los mismos, los ADN que codifican las cadenas ligera y pesada parciales o de longitud completa obtenidos mediante tecnicas de biologfa molecular se insertan en vectores de expresion de tal manera que los genes estan unidos operativamente a secuencias de control

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de la transcripcion y la traduccion. En este contexto, se pretende que la expresion "unido operativamente" signifique que un gen de un anticuerpo esta ligado en un vector de tal manera que las secuencias de control de la transcripcion y la traduccion en el vector sirven a su funcion prevista de regular la transcripcion y la traduccion del gen del anticuerpo. El vector de expresion y las secuencias de control de la expresion se seleccionan para ser compatibles con la expresion de la celula hospedadora utilizada. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo se pueden insertar en vectores separados o, de forma mas tfpica, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresion. Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresion mediante procedimientos normalizados (por ejemplo, ligadura de sitios de restriccion complementarios en el fragmento del gen del anticuerpo y el vector, o ligadura del extremo enromado si no estan presentes sitios de restriccion). Las regiones variables de la cadena ligera y pesada de los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden usar para crear los genes de un anticuerpo de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpo insertandolos en los vectores de expresion que codifican ya las regiones constantes de la cadena pesada y las regiones constantes de la cadena ligera del isotipo deseado de tal manera que el segmento Vh esta unido operativamente al(a los) segmento(s) Ch en el vector y el segmento Vl esta unido operativamente al segmento Cl en el vector. De manera adicional o como alternativa, el vector de expresion recombinante puede codificar un peptido de senalizacion que facilita la secrecion de la cadena de anticuerpo a partir de una celula hospedadora. El gen de la cadena del anticuerpo puede clonarse en el vector de tal manera que el peptido de senalizacion esta unido en marco al extremo amino del gen de la cadena del anticuerpo. El peptido de senalizacion puede ser un peptido de senalizacion de la inmunoglobulina o un peptido de senalizacion heterologo (es decir, un peptido de senalizacion procedente de una protema no de inmunoglobulina).

Ademas de los genes que codifican la cadena del anticuerpo, Los vectores de expresion recombinantes de la invencion transportan secuencias reguladoras que controlan la expresion de los genes de la cadena del anticuerpo en una celula hospedadora. Se pretende que la expresion "secuencia reguladora" incluya promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresion (por ejemplo, senales de poliadenilacion) que controlan la transcripcion o la traduccion de los genes de la cadena del anticuerpo. Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Se apreciara por los expertos en la materia que el diseno del vector de expresion, incluyendo la seleccion de las secuencias reguladoras puede depender de dichos factores como la eleccion de la celula hospedadora que se va a transformar, el nivel de expresion de la protema deseada, etc. Los ejemplos de secuencias reguladoras de la expresion de celulas hospedadoras de mairnferos incluyen elementos vmicos que dirigen altos niveles de expresion de protemas en celulas de mamfferos, tales como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV), virus 40 de simio (SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardm mayor de adenovirus (AdMLP)) y polioma. Como alternativa, se pueden usar secuencias reguladoras no vmcas, tales como el promotor de la ubiquitina o el promotor de la p-globina.

Ademas de los genes de la cadena del anticuerpo y las secuencias reguladoras, los vectores de expresion recombinantes pueden transportar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicacion del vector en las celulas hospedadoras (por ejemplo, ongenes de replicacion) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la seleccion de celulas hospedadoras en las que se ha introducido el vector (vease, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos numeros 4.399.216, 4.634.665, y 5.179.017, todas de Axel y col.). Por ejemplo, normalmente, el gen marcador seleccionable confiere resistencia a los farmacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una celula hospedadora en la que se ha introducido dicho vector. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en celulas hospedadoras dhfr- con seleccion/amplificacion de metotrexato) y el gen neo (para la seleccion de G418).

Para la expresion de las cadenas ligera y pesada, el(los) vector(es) de expresion que codifican las cadenas pesada y ligera se transfecta(n) en una celula hospedadora mediante tecnicas normalizadas. Se pretende que las diversas formas del termino "transfeccion" abarquen una amplia variedad de tecnicas comunmente utilizadas para la introduccion de ADN exogeno en una celula hospedadora procariota o eucariota, por ejemplo, electroporacion, precipitacion con fosfato de calcio, transfeccion con DEAE-dextrano y similares. aunque es teoricamente posible expresar los anticuerpos de la invencion tanto en celulas hospedadoras procariotas como en celulas hospedadoras eucariotas, expresion de anticuerpos en celulas eucariotas, y lo mas preferente, celulas hospedadoras de mamfferos, es lo mas preferido debido a que dichas celulas eucariotas, y en particular las celulas de mamfferos, son mas propensas que las celulas eucariotas para ensamblar y secretar un anticuerpo inmunologicamente activo y plegado adecuadamente.

Los ejemplos de celulas hospedadoras de mamfferos para expresar los anticuerpos recombinantes incluyen celulas de ovario de hamster chino (celulas CHO) (incluyendo celulas CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, utilizadas con un marcador DHFR seleccionable, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), celulas NSO de mieloma, celulas COS, celulas HKB11 y celulas SP2. Cuando los vectores de expresion recombinantes que codifican genes de anticuerpos se introducen en celulas hospedadoras de mamfferos, los anticuerpos se producen cultivando las celulas hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresion del anticuerpo en las celulas hospedadoras o la secrecion del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual se hacen crecer las celulas hospedadoras. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo utilizando procedimientos de purificacion de protemas normalizados, tales como ultrafiltracion, cromatograffa de exclusion molecular, cromatograffa de intercambio ionico y centrifugacion.

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Uso de secuencias de anticuerpos parciales para expresar anticuerpos intactos

Los anticuerpos interaction con antigenos diana predominantemente a traves de restos de aminoacidos que se localizan en las seis CDR de la cadena pesada y la cadena ligera. Por este motivo, las secuencias de aminoacidos en las CDR son mas diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Veanse, por ejemplo, las Figs. 6 y 7, en las que se identifican las regiones CDR en las cadenas variables ligera y pesada, respectivamente, del anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente invencion. Debido a que las secuencias de las CDR son responsables de la mayona de interacciones antigeno-anticuerpo, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de los anticuerpos espedficos que se producen naturalmente mediante la construccion de vectores de expresion que incluyen secuencias de la cDr procedentes del anticuerpo espedfico que se produce naturalmente injertado sobre secuencias marco procedentes de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (vease, por ejemplo, Riechmann, L. y col., 1998, Nature 332:323-327; Jones, P. y col., 1986, Nature 321:522-525; y Queen, C. y col., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033). Dichas secuencias marco se pueden obtener de bases de datos de ADN publicas que incluyen secuencias genicas del anticuerpo de la lrnea germinal. Estas secuencias genicas de la lrnea germinal diferiran de las secuencias genicas del anticuerpo maduro debido a que no incluiran genes variables completamente ensamblados, que se forman mediante la union V(D)J durante la maduracion de los linfocitos B. No es necesario obtener la secuencia de ADN completa de un anticuerpo concreto a fin de recrear un anticuerpo recombinante intacto que tiene propiedades de union similares a las del anticuerpo original (vease, documento WO 99/45962). La de la cadena pesada y ligera parcial que abarca las regiones de la CDR es normalmente suficiente para este fin. La secuencia parcial se usa para determinar que segmentos genicos variables y de union de la lrnea germinal contribuyeron a los genes variables del anticuerpo recombinado. La secuencia de la lrnea germinal se usa a continuacion para rellenar las porciones desaparecidas de las regiones variables. Las secuencias lfder de la cadena pesada y ligera se escinden durante la maduracion de la proterna y no contribuyen a las propiedades del anticuerpo final. Por este motivo, es necesario utilizar la secuencia ifder de la lrnea germinal correspondiente para las construcciones de expresion. Para anadir secuencias desaparecidas, las secuencias de ADNc clonadas pueden combinarse con oligonucleotidos sinteticos mediante ligadura o amplificacion de la PCR. Como alternativa, la region variable completa puede sintetizarse como un conjunto de oligonucleotidos cortos, solapantes, y combinarse mediante amplificacion de la PCR para crear un clon de la region variable enteramente sintetico. Este proceso tiene determinadas ventajas tales como la eliminacion o la inclusion o sitios de restriccion concretos, o la optimizacion de codones concretos.

Las secuencias de nucleotidos de los transcritos de la cadena pesada y ligera se usan para disenar un conjunto de oligonucleotidos sinteticos solapantes para crear secuencias V sinteticas con capacidades de codificacion de aminoacidos identicas como las secuencias naturales. Las secuencias de la cadena pesada y kappa sinteticas pueden diferir de las secuencias naturales de tres maneras: anillos de bases nucleotfdicas repetidas estan interrumpidos para facilitar la srntesis de oligonucleotidos y la amplificacion de la PCR; se incorporan sitios de inicio de la traduccion optimos de acuerdo con las reglas de Kozak (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870); y se disenan sitios HindIII en la direccion 5' de los sitios de inicio de la traduccion.

Para las regiones variables de la cadena pesada y ligera, las secuencias de las hebras con codificacion optimizada y sin la codificacion correspondiente se rompen en secciones de 30-50 nucleotidos en aproximadamente el punto medio del oligonucleotido sin codificacion. Por tanto, para cada cadena, los oligonucleotidos pueden ensamblarse en conjuntos bicatenarios solapantes que abarcan segmentos de 150-400 nucleotidos. Los combinados se usan a continuacion como moldes para producir los productos de amplificacion de la PCR de 150-400 nucleotidos. Normalmente, un unico conjunto de oligonucleotidos de la region variable se rompera en dos combinados que se amplifican por separado para generar dos productos de la PCR solapantes. Estos productos solapantes se combinan a continuacion mediante la amplificacion de la PCR para formar la region variable completa. Puede ser tambien deseable incluir un fragmento solapante de la region constante de la cadena pesada o ligera en la amplificacion de la PCR para generar fragmentos que pueden clonarse facilmente en las construcciones del vector de expresion.

Las regiones variables de la cadena pesada y ligera reconstruidas se combinan a continuacion con el promotor clonado, el inicio de la traduccion, la region constante, las secuencias de poliadenilacion y terminacion de la transcripcion 3' no traducidas para formar las construcciones de vector de expresion. Las construcciones de expresion de la cadena pesada y ligera pueden combinarse en un unico vector, cotransfectarse, transfectarse en serie, o transfectarse por separado en celulas hospedadoras que a continuacion se fusionan para formar una celula hospedadora que expresa ambas cadenas.

Por tanto, en otro aspecto, las caractensticas estructurales de un anticuerpo humano dirigido contra TFPI, por ejemplo, TP2A8, TP2G6, TP2G7, TP4B7, etc., se utilizan para crear anticuerpos humanos dirigidos contra TFPI relacionados estructuralmente que retienen la funcion de union a TFPI. De manera mas espedfica, una o mas CDR de las regiones de la cadena pesad y ligera identificadas espedficamente de los anticuerpos monoclonales de la invencion se pueden combinar de forma recombinante con regiones marco humanas conocidas y CDR para crear anticuerpos humanos dirigidos contra TFPI adicionales disenados mediante ingeniena genetica recombinante de la invencion.

Por consiguiente, en otro aspecto, se desvela un procedimiento para preparar un anticuerpo dirigido contra TFPI que comprende: preparar un anticuerpo que comprende (1) regiones marco de la cadena pesada humana y CDR de la

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cadena pesada humana, en el que el la CDR3 de la cadena pesada humana comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NOS: 388-430 y/o (2) las regiones marco de la cadena ligera humana y las CDR de la cadena ligera humana, en el que la CDR3 de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NOS: 259301; en el que el anticuerpo retiene la capacidad de unirse a TFPI. En otras realizaciones, el procedimiento se practica usando otras CDR de la invencion.

Composiciones farmaceuticas

Se proporcionan tambien composiciones farmaceuticas que comprenden cantidades terapeuticamente eficaces de anticuerpos monoclonales dirigidos contra TFPI y un transportador farmaceuticamente aceptable. "transportador farmaceuticamente aceptable" es una sustancia que se puede anadir al principio activo para ayudar a formular o estabilizar la preparacion y no produce efectos toxicologicos adversos significativos al paciente. Los ejemplos de dichos transportadores son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen agua, azucares tales como maltosa o sacarosa, albumina, sales tales como cloruro de sodio, etc. Se describen otros transportadores por ejemplo en Remington's Pharmaceutical Sciences por E. W. Martin. Dichas composiciones contendran una cantidad terapeuticamente eficaz de al menos un anticuerpo monoclonal dirigido contra TFPI.

Los transportadores farmaceuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para las preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas es bien conocido en la tecnica. La composicion se formula preferentemente para inyeccion parenteral. La composicion puede formularse como una solucion, microemulsion, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para proporcionar una alta concentracion de farmaco. El transportador puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. En algunos casos, incluira agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sodico en la composicion.

Se pueden preparar soluciones inyectables esteriles incorporando el compuesto activo en la cantidad necesaria en un disolvente adecuado con uno o una combinacion de ingredientes enumerados anteriormente, segun sea necesario, seguido por esterilizacion mediante microfiltracion. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vetuculo esteril, que contiene un medio de dispersion basico, y los otros principios requeridos que se han enumerado anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, algunos procedimientos de preparacion son el secado a vacfo y la criodesecacion (liofilizacion) que da como resultado un polvo del principio activo mas cualquier ingrediente deseado adicional de una de sus soluciones anteriormente filtrada en esteril.

Usos farmaceuticos

El anticuerpo monoclonal puede utilizarse para fines terapeuticos para tratar deficiencias o defectos geneticos y adquiridos en la coagulacion. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales descritos anteriormente se pueden utilizar para bloquear la interaccion de TFPI con FXa, o para prevenir la inhibicion dependiente de TFPI de la actividad TF/FVIIa. Adicionalmente, el anticuerpo monoclonal puede utilizarse tambien para restaurar la generacion de FXa impulsada por TF/FVIIa para derivar la insuficiencia de FVIII o la amplificacion de FXa dependiente de FIX.

Los anticuerpos monoclonales tienen uso terapeutico en el tratamiento de trastornos de la hemostasia tales como trombocitopenia, trastornos plaquetarios y trastornos de sangrado (por ejemplo, hemofilia A y hemofilia B). Dichos trastornos pueden tratarse administrando una cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal dirigido contra TFPI a un paciente que lo necesita. Los anticuerpos monoclonales tienen tambien uso terapeutico en el tratamiento de sangrados incontrolados en indicaciones tales como trauma e ictus hemorragico. Por tanto, se proporciona tambien un procedimiento para acortar el tiempo de sangrado que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal dirigido contra TFPI de la invencion a un paciente que lo necesita.

Los anticuerpos se pueden usar como monoterapia o en combinacion con otras terapias para abordar un trastorno hemostatico. Por ejemplo, la administracion simultanea de uno o mas anticuerpos de la invencion con un factor de coagulacion tal como el factor VIIa, factor VIII o factor IX se cree que es util para tratar la hemofilia. Los anticuerpos pueden utilizarse en el tratamiento de deficiencias o defectos geneticos y adquiridos en la coagulacion administrando

(a) una primera cantidad de un anticuerpo monoclonal que se une al inhibidor de la ruta del factor tisular humano y

(b) una segunda cantidad de factor VIII o factor IX, en el que dicha primera y segunda cantidades juntas son eficaces para tratar dichas deficiencias o defectos. Los anticuerpos pueden utilizarse tambien en el tratamiento de deficiencias o defectos geneticos y adquiridos en la coagulacion administrando (a) una primera cantidad de un anticuerpo monoclonal que se une a un inhibidor de la ruta del factor tisular humano y (b) una segunda cantidad de factor VIII o factor IX, en el que dichas primera y segunda cantidades combinadas son eficaces para tratar dichas deficiencias o defectos, y en el que ademas el factor VII no se administra de manera conjunta. Se desvela tambien una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de la combinacion de un anticuerpo monoclonal de la invencion y factor VIII o factor IX, en el que la composicion no contiene factor VII.

"Factor VII" incluye factor VII y factor Vila. Estas terapias combinadas es probable que reduzcan la frecuencia de infusion necesaria del factor de coagulacion. Por administracion simultanea o terapia combinada se entiende la administracion de los dos farmacos terapeuticos formulados cada uno por separado o formulados juntos en una composicion, y, cuando se formulan por separado, administrados ya sea en aproximadamente el mismo momento o 5 en diferentes momentos, pero durante el mismo periodo terapeutico.

Las composiciones farmaceuticas pueden administrarse por via parenteral a sujetos que padecen de hemofilia A o B a una dosificacion y frecuencia que pueden variar con la gravedad del episodio de sangrado, o, en el caso de terapia profilactica, pueden variar con la gravedad de la deficiencia de coagulacion del paciente.

Las composiciones pueden administrarse a pacientes que lo necesitan como un bolo o mediante infusion continua. 10 Por ejemplo, una administracion en bolo de un anticuerpo inventivo presente como un fragmento Fab puede ser en una cantidad de entre 0,0025 a 100 mg/kg de peso corporal, 0,025-a 0,25 mg/kg, 0,010 a 0,10 mg/kg o 0,10-0,50 mg/kg. para la infusion continua, un anticuerpo inventivo presente como un fragmento Fab puede administrarse de 0,001 a 100 mg/kg de peso corporal/minuto, 0,0125 a 1,25 mg/kg/min., 0,010 a 0,75 mg/kg/min., de 0,010 a 1,0 mg/kg/min, o de 0,10-0,50 mg/kg/min durante un penodo de 1-24 horas, 1-12 horas, 2-12 horas, 6-12 horas, 2-8 15 horas o 1-2 horas. Para la administracion de un anticuerpo inventivo presente como un anticuerpo de longitud completa (con regiones constantes completas), las cantidades de la dosificacion pueden ser de aproximadamente 110 mg/kg de peso corporal, 2-8 mg/kg o de 5-6 mg/kg. Dichos anticuerpos de longitud completa se administranan normalmente mediante infusion extendiendose durante un periodo de treinta minutos a tres horas. La frecuencia de la administracion dependera de la gravedad de la dolencia. La frecuencia podna variar desde las tres veces por 20 semana a una vez cada dos o tres semanas.

Adicionalmente, las composiciones pueden administrarse a pacientes mediante inyeccion subcutanea. Por ejemplo, se puede administrar una dosis de 10 a 100 mg de anticuerpo dirigido contra TFPi a pacientes mediante inyeccion subcutanea semanalmente, quincenalmente o mensualmente.

Como se usa en el presente documento, "cantidad terapeuticamente eficaz" significa una cantidad de un anticuerpo 25 monoclonal dirigido contra TFPI o de una combinacion de dicho anticuerpo y factor VIII o factor IX que es necesaria para aumentar eficazmente el tiempo de coagulacion in vivo o producir de otra forma un beneficio medible in vivo a un paciente que lo necesita. La cantidad precisa dependera de numerosos factores, incluyendo, aunque no de forma limitativa, los componentes y caractensticas ffsicas de la composicion terapeutica, la poblacion de pacientes prevista, de las consideraciones individuales de cada paciente, y similares, y un experto en la materia puede 30 determinarla facilmente.

Ejemplos

Materiales y Procedimientos generales

Ejemplo 1 Cribado por inmunoproteccion y cribado de una biblioteca de anticuerpos humanos contra TFPI humano Cribado por inmunoproteccion de biblioteca de anticuerpos humanos contra TFPI

35 Se seleccionaron anticuerpos dirigidos contra TFPI mediante cribado por inmunoproteccion de una biblioteca combinatoria de anticuerpos humanos expresada en fagos HuCal Gold (Rothe y col., J. Mol. Biol., 2008, 376:11821200) contra TFPI humano (American Diagnostica). En resumen, 200 pl de TFPi (5 pg/ml) se revistieron en placas Maxisorp de 96 pocillos durante la noche a 4°C y las placas se bloquearon a continuacion con un tampon PBS que contiene leche al 5%. Despues, las placas se lavaron con PBS que contema Tween-20 al 0,01% (PBST), se anadio 40 una alfcuota de una biblioteca combinatoria de anticuerpos humanos a los pocillos revestidos de TFPI y se incubo durante 2 horas. El fago no unido se lavo por separado con PBST, y el fago unido a antfgeno se eluyo con ditiotreitol, se infecto y se amplifico en la cepa TG1 de E. coli. El fago se rescato mediante el fago auxiliar para el siguiente ciclo de cribado por inmunoprecipitacion. Se llevaron a cabo un total de tres ciclos de cribado por inmunoprecipitacion y los clones de los dos ultimos ciclos se cribaron contra TFPI humano en un ensayo ELISA.

45 Cribado de clones de anticuerpos mediante union a antigeno en un ELISA

Para seleccionar los clones de anticuerpos que se unen a TFPI humano, Los genes Fab de los clones de fagos del segundo y tercer ciclo de cribado por inmunoprecipitacion se subclonaron en un vector de expresion bacteriano y se expresaron en E. coli, cepa TG1. Se anadio el lisado bacteriano a los pocillos de las placas Maxisorp revestidas de TFPI. Tras el lavado, Se uso un anticuerpo de cabra conjugado con HRP dirigido contra Fab humano como un 50 anticuerpo de deteccion y se desarrollaron las placas anadiendo AmplexRed (Invitrogen) con peroxido de hidrogeno. Una senal de al menos cinco veces mayor que el fondo se considero como positiva. Se determino la reactividad cruzada de los anticuerpos dirigidos contra TFPi humano para TFPI de raton mediante un ELISA de union a TFPI de raton similar. Las placas se revistieron con TFPI de raton (R&D System), BSA y lisozima. Los ultimos dos antfgenos se usaron como controles negativos. En la Fig 1 se muestra un conjunto de datos representativos.

55 Secuencias de anticuerpos humanos dirigidos contra TFPI

Tras el cribado por inmunoproteccion y la seleccion de la biblioteca de anticuerpos humanos HuCal Gold contra TFPI, se llevo a cabo la secuenciacion del ADN sobre los clones de anticuerpos positivos, dando como resultado 44 secuencias de anticuerpos unicas (Tabla 2). Entre estas secuencias de anticuerpos, 29 eran cadenas ligeras lambda y 15 eran cadenas ligeras kappa. El analisis de las cadenas pesadas de la region variable desvela 28 de VH3, 14 de 5 VH6, 1 de VH1 y 1 de VH5.

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   1. Un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une a un inhibidor de la ruta del factor tisular humano, en el que anticuerpo comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera que comprenden:

   (a) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 173, 216 y 259 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 302, 345 y 388; o

   (b) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 174, 217 y 260 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 303, 346 y 389; o

   (c) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 176, 219 y 262 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 305, 348 y 391; o

   (d) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 178, 221 y 264 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 307, 350 y 393; o

   (e) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 179, 222 y 265 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 308, 351 y 394; o

   (f) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 184, 227 y 270 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 313, 356 y 399; o

   (g) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 187, 230 y 273 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 316, 359 y 402; o

   (h) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 191, 234 y 277 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 320, 363 y 406; o

   (i) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 192, 235 y 278 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 321, 364 y 407; o

   (j) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 194, 237 y 280 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 323, 366 y 409; o

   (k) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 195, 238 y 281 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 324, 367 y 410; o

   (l) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 198, 241 y 284 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 327, 370 y 413; o

   (m) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 200, 243 y 286 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 329, 372 y 415; o

   (n) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 201, 244 y 287 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 330, 373 y 416; o

   (o) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 207, 250 y 293 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 336, 379 y 422; o

   (p) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 208, 251 y 294 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 337, 380 y 423; o

   (q) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 211, 254 y 297 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 340, 383 y 426; o

   (r) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 212, 255 y 298 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 341, 384 y 427; o

   (s) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 194, 237 y 280 y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las SEQ ID NOS: 335, 378 y 421.

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2. 2. El anticuerpo monoclonal humano de la reivindicacion 1, que comprende:

   (a) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 2 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptidica de SEQ ID NO: 4; o

   (b) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 6 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de sEq ID NO: 8; o

   (c) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 16; o

   (d) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 24; o

   (e) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptidica de SEQ ID NO: 28; o

   (f) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptidica de SEQ ID NO: 48; o

   (g) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 60; o

   (h) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 76; o

   (i) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 80; o

   (j) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 88; o

   (k) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 92; o

   (l) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 102 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 104; o

   (m) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 110 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 112; o

   (n) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 114 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 116; o

   (o) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 138 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 140; o

   (p) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 142 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 144; o

   (q) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 154 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 156; o

   (r) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 158 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 160; o

   (s) una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 86 y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 136.
3. 3. Una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal de la reivindicacion 1 o 2 y un transportador farmaceuticamente aceptable.
4. 4. Una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de la combinacion de (a) un anticuerpo monoclonal de la reivindicacion 1 o 2 y (b), factor VIII o factor IX, en el que la composicion no contiene factor VII.
5. 5. Una molecula de acido nucleico aislado que codifica un anticuerpo monoclonal de la reivindicacion 1.

   NO: 14 y una region NO: 22 y una region NO: 26 y una region NO: 46 y una region NO: 58 y una region NO: 74 y una region NO: 78 y una region NO: 86 y una region NO: 90 y una region

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   ..--439 CfF0LVE3GG3LVCPXSli2SC**S3--rTFSIYSK*r2Ii4.^43Ul(V'SIIS3-YGiFTYYA3SVraF71SPiiiSJSTlY.i(?i5iEA££IA\TYC43.’4GE..........KK-OQK&LVIVSS

   imagen7

   100

   2A8 40 ug/raton)

   2A8 40 ug/raton) + FVIII recombinante (0,1 Ul/raton)

   IgG de raton (40 ug/raton)

   FVIII recombinante (0,1 Ul/raton)

   Horasdespuesdela transeccionde la venade la cola(TVT)

   1600-1

   imagen8

   IgG de raton 2A8 FVIIa 2A8 + FVIla

   Control (2,5 |ig/ml) (100 ng/ml)

   imagen9

   imagen10

   IgG de raton 2A8 FVtla 2A8 + FVIla

   Control (2,5 jt.g/ml) (100 ng/ml)

   imagen11