CN104302306B - Tfpi抑制剂及其使用方法 - Google Patents

Tfpi抑制剂及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的肽，包括TFPI抑制肽，及其组合物。还提供了肽复合物。所述肽可用于抑制TFPI，增强凝血因子缺陷受试者中凝血酶的形成，增加受试者中血凝块形成，治疗受试者中凝血障碍，纯化TFPI，和鉴别TFPI结合化合物。

Description

TFPI抑制剂及其使用方法
发明的技术领域
本发明大体涉及结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的肽及其使用方法。
相关申请的交叉引用和通过引用并入
本申请主张2012年3月21日提交的美国临时专利申请号61/613,865的权益，其通过引用整体并入本文。以下申请也通过引用整体并入本文：2008年12月19日提交的美国临时专利申请号61/139,272；2009年12月21日提交的美国专利申请号12/643,818；2009年12月21日提交的国际专利申请号PCT/US2009/069060；2010年3月19日提交的美国临时专利申请号61/315,758；2011年2月11日提交的美国专利申请号13/026,070；和2011年2月11日提交的国际专利申请号PCT/US2011/024604。
通过引用整体并入的是与此同时提交并确认如下的计算机可读形式核苷酸/氨基酸序列表：2013年1月31日创建的名称为“44241E_SeqListing.txt”的ASCII文本文件，1,248,600字节。
发明背景
止血依赖于复杂的凝血级联，其中凝血因子介导的一系列事件导致凝血酶原向凝血酶转变。凝血因子X(FX)活化是凝血级联的内源和外源途经的中心事件。已经提出外源途径为凝血级联的主要激活因素(Mackman等人，Arterioscler.Thromb.Casc.Biol.，27，1687-1693(2007))。循环组织因子(TF)和活化的凝血因子VII(FVIIa)相互作用，形成介导FX活化的“外源复合物”。凝血级联被内源途径放大，在此期间凝血因子XII、XI、IX和VIII的连续活化导致形成同样介导FX活化的“内源”FIXa-FVIIIa复合物。活化的FX促进凝血酶形成，凝血酶形成是身体产生纤维蛋白和有效制止出血所需的。
严重的出血疾病，例如血友病，由凝血级联的破坏所引起。甲型血友病是最常见的血友病类型，起源于凝血因子VIII缺陷，而乙型血友病与凝血因子IX(FIX)缺陷有关。丙型血友病由凝血因子XI(FXI)缺陷引起(Cawthern等人，Blood，91(12)，4581-4592(1998))。目前对于血友病及其他凝血障碍不能治愈。凝血因子替代疗法是凝血障碍最通用的治疗。然而，凝血因子通常在施用后不久从血流清除。为了有效，患者必须频繁接受血浆衍生的或重组的凝血因子浓缩物的静脉输注，这是不舒服的，需要临床环境，并且昂贵耗时。此外，凝血因子替代疗法的疗效可在形成抑制性抗体后急剧减弱。大约30％患有严重甲型血友病的患者产生中和凝血因子VIII(FVIII)的抑制性抗体(Peerlinck和Hermans，Haemophilia，12，579-590(2006))。对于有抗凝血因子抗体的患者，存在很少的治疗选择。
因此，本领域存在对治疗凝血障碍的组合物和方法的需求。本发明提供了这样的组合物和方法。
发明概述
本发明包括例如肽复合物，包括第一肽和第二肽，其中所述肽复合物包括30-60个氨基酸。在各个实施方案中，两个或多个本文描述的肽(例如，式(I)至(XIV)任何一个涵盖的肽)连接或融合产生肽复合物(例如，包括两个肽(其可以相同或不同)的二聚体、包括三个肽(其两个或多个可以相同或不同)的三聚体等)。在各个实施方案中，所述肽复合物结合至少两个不同的TFPI表位，并任选地抑制TFPI的至少两种功能。在一些实施方案中，本发明的肽或肽复合物结合TFPI-1(例如，TFPI-1α)，并任选地提高在不存在FVIII、FIX和/或FXI下TFPI调解的凝血酶生成。还提供了包含所述肽复合物的组合物(例如，药物组合物)。
此外，本发明提供了使用本发明肽或肽复合物的方法。例如，本发明提供了抑制TFPI的方法，包括使TFPI与本文描述的肽接触。本发明还提供了增强凝血因子缺陷受试者中凝血酶形成的方法，增加受试者中血凝块形成的方法，和治疗受试者凝血障碍的方法。所述方法整体上在本文称为例如“本发明方法”。所述方法包括给受试者施用在所述受试者中有效实现所需效果的量，例如有效增强凝血酶形成的量、有效增强血凝块形成的量或有效治疗凝血障碍的量的本文提供的肽或肽复合物。本发明其他方面包括本发明肽用于制备药剂的用途，靶向展示TFPI的细胞的方法，治疗或诊断罹患疾病或处于罹患疾病风险的受试者的方法，纯化TFPI的方法，和鉴别TFPI结合化合物的方法。除非明确指明相反，本文就本发明一种肽或本发明一种方法而提供的描述分别适用于本发明每一种肽和本发明每一种方法。而且，除非另外明确指明相反，本文就本发明肽或其用途而提供的描述适用于本发明的肽复合物。
本发明还包括TFPI抑制剂，其在由氨基酸残基F28、K29、A30、D32、I46、F47和I55限定的第一结合位点和在由氨基酸残基R41、Y53、C59、E60、Q63、R65、E67、E71、K74、M75、N80、N82、R83、I84、I85、T87、F96、C106、C130、L131、N133、M134、N136、F137、E142、N145和I146限定的第二结合位点结合人TFPI。还提供了鉴别TFPI结合化合物的方法。该方法包括(a)使包含TFPI Kunitz结构域1(KD1)和Kunitz结构域2(KD2)的肽与测试化合物接触，和(b)检测所述测试化合物与对应于人TFPI残基R41、Y53、C59、E60、Q63、R65、E67、E71、K74、M75、N80、N82、R83、I84、I85、T87、F96、C106、C130、L131、N133、M134、N136、F137、E142、N145和I146的KD1-KD2氨基酸残基限定的TFPI结合位点的结合。
以下编号段落各自充分定义了本发明的一个或多个示例性变化形式：
1.一种肽复合物，包括第一肽和第二肽，其中所述肽复合物包括30-60个氨基酸，并结合至少两个不同的TFPI表位，并抑制两种或多种TFPI功能。
2.一种肽复合物，包括第一肽和第二肽，其中
(a)所述第一肽包括式(XIII)结构：
X6001-X6002-X6003-X6004-X6005-X6006-X6007-X6008-X6009-X6010-X6011-X6012-X6013-X6014-X6015-X6016-X6017-X6018-X6019-X6020(XIII)(SEQ ID NO：3153)；
其中X6001是选自由以下组成的组的氨基酸：F、L、M、Y、1Ni、Thi、Bta、Dopa、Bhf、C、D、G、H、I、K、N、Nmf、Q、R、T、V和W；其中X6002是选自由以下组成的组的氨基酸：Q、G和K；其中X6003是选自由以下组成的组的氨基酸：C、D、E、M、Q、R、S、T、Ede(O)、Cmc、A、Aib、Bhs、F、G、H、I、K、L、N、P、V、W和Y；其中X6004是选自由以下组成的组的氨基酸：Aib、E、G、I、K、L、M、P、R、W、Y、A、Bhk、C、D、F、H、k、N、Nmk、Q、S、T和V；其中X6005是选自由以下组成的组的氨基酸：a、A、Aib、C、D、d、E、G、H、K、k、M、N、Nmg、p、Q、R、N丙基G(NpropylG)、aze、pip、tic、oic、hyp、nma、Ncg、Abg、Apg、thz、dtc、Bal、F、L、S、T、V、W和Y；其中X6006是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、C(NEM)、D、E、G、H、K、M、N、Q、R、S、V、Cit、C(Acm)、Nle、I、Ede(O)、Cmc、Ecl、Eea、Eec、Eef、Nif、Eew、Aib、Btq、F、I、L、T、W和Y；其中X6007是选自由以下组成的组的氨基酸：I、V、T、Chg、Phg、Tle、A、F、G、I、K、L、Nmv、P、Q、S、W和Y；其中X6008是选自由以下组成的组的氨基酸：F、H、1Ni、2Ni、Pmy、Y和W；其中X6009是选自由以下组成的组的氨基酸：Aib、V、Chg、Phg、Abu、Cpg、Tle、L-2-氨基-4,4,4-三氟丁酸、A、f、I、K、S和T；其中X6010是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、D、d、E、F、H、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、Nmd、C(NEM)、Aib、G、I、L和Nmf；其中X6011是选自由以下组成的组的氨基酸：A、a、G、p、Sar、c、hcy、Aib、C、K、G和Nmg；其中X6012是选自由以下组成的组的氨基酸：Y、Tym、Pty、Dopa和Pmy；其中X6013是选自由以下组成的组的氨基酸：Aib、C、F、1Ni、Thi、Bta、A、E、G、H、K、L、M、Q、R、W和Y；其中X6014是选自由以下组成的组的氨基酸：A、Aib、C、C(NEM)、D、E、K、L、M、N、Q、R、T、V、Hcy、Bhe、F、G、H、I、P、S、W和Y；其中X6015是选自由以下组成的组的氨基酸：R、(ω-甲基)-R、D、E和K；其中X6016是选自由以下组成的组的氨基酸：L、Hcy、Hle和Aml；其中X6017是选自由以下组成的组的氨基酸：A、a、Aib、C、c、Cha、Dab、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、Nle、Nva、Opa、Orn、R、S、Deg、Ebc、Eca、Egz、Aic、Apc、Egt、(ω-甲基)-R、Bhr、Cit、D、Dap、E、F、G、N、Q、T、V、W和Y；其中X6018是选自由以下组成的组的氨基酸：A、Aib、Hcy、hcy、C、c、L、Nle、M、N、R、Bal、D、E、F、G、H、I、K、Q、S、T、V、W和Y；其中X6019是选自由以下组成的组的氨基酸：K、R、Har、Bhk和V；和其中X6020是选自由以下组成的组的氨基酸：K、L、Hcy、Aml、Aib、Bhl、C、F、G、H、I、Nml、Q、R、S、T、V、W和Y，和
(b)所述第二肽包括式(XIV)结构：
X7001-X7002-X7003-X7004-X7005-X7006-[X7007-X7008-X7009-X7010-X7011-X7012-X7013-X7014-X7015-X7016-X7017-X7018]-X7019-X7020-X7021-X7022-X7023(XIV)(SEQ ID NO：3154)，
其中X7001存在或不存在，在X7001存在的情况下，X7001是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、C(NEM)、D、E、F、G、H、I、K、L、P、R、S、T、V和W；其中X7002存在或不存在，在X7002存在的情况下，X7002是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、C(NEM)、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W和Y；其中X7003是选自由以下组成的组的氨基酸：A、F、I、K、L、R、S、T、V、W和Y；其中X7004是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V和W；其中X7005是R或W；其中X7006是选自由以下组成的组的氨基酸：F、H、I、K、L、R、V和W；其中X7007是选自由Orn、homoK、C、Hcy、Dap和K组成的组，优选选自由C和Hcy组成的组的氨基酸；其中X7008是选自由以下组成的组的氨基酸：A、G、R、S和T；其中X7009是选自由以下组成的组的氨基酸：a、A、I、K、L、M、m、Moo、Nle、p、R、Sem和V；其中X7010是选自由以下组成的组的氨基酸：A、G、I、K、L、P、R、S、T和V；其中X7011是选自由以下组成的组的氨基酸：D、E、G、S和T；其中X7012是选自由以下组成的组的氨基酸：A、a、D、d、E、e、F、f、G、I、K、k、L、l、M、m、Moo、Nle、nle、P、p、R、r、S、s、Sem、T、t、V、v、W和w；其中X7013是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、C(NEM)、Con、Con(Meox)、D、d、E、e、Eag、F、G、I、K、L、N、R、S、s、T、V和W；其中X7014是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、M、R、S、T、V和W；其中X7015是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、M、Nle、R、S、T、V和W；其中X7016是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、I、K、L、M、Moo、Nle、R、S、Sem、T、V、W和Y；其中X7017是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V、W和Y；其中X7018是选自由C和D组成的组的氨基酸，优选C；其中X7019是选自由以下组成的组的氨基酸：A、F、I、L、S、T、V和W；其中X7020是选自由以下组成的组的氨基酸：F和W；其中X7021是选自由以下组成的组的氨基酸：I、L和V；其中X7022是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、P、R、S、T、V和W；其中X7023存在或不存在，在X7023存在的情况下，X7023是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、C(NEM)、Con、Con(Meox)、D、E、Eag、F、G、I、K、L、R、S、T、V、W和Y；和其中所述肽包括通过X7007和X7018之间连接产生的环状结构。
3.如段落2所述的肽复合物，
其中X6001是选自由以下组成的组的氨基酸：1Ni、Bta、Dopa、F、L、Y和M；其中X6002是Q；其中X6003是选自由以下组成的组的氨基酸：D、E、S、M、Q、R、T和C；其中X6004是选自由以下组成的组的氨基酸：K、Aib、L、P、R、E、G、I、Y、M和W；其中X6005是选自由以下组成的组的氨基酸：p、Nmg、N丙基G、aze、pip、tic、oic、hyp、a、Aib、D、d、G、H、K、k、N、Q、R、A、E、C和M；其中X6006是选自由以下组成的组的氨基酸：C、E、K、R、S、V、C(Acm)、Nle、C(NEM)、I、Cit、A、D、G、H、N、Q和M；其中X6007是选自由以下组成的组的氨基酸：Tle、V和I；其中X6008是选自由以下组成的组的氨基酸：H、1Ni、2Ni、Pmy、F和Y；其中X6009是V、Abu或Tle；其中X6010是选自由以下组成的组的氨基酸：D、P、C、T、A、E、K、M、N、Q、R、F、H、S、V、W和Y；其中X6011是G、a、c、hcy或Sar；其中X6012是Y；其中X6013是选自由以下组成的组的氨基酸：F、1Ni、Bta和C；其中X6014是选自由以下组成的组的氨基酸：Aib、C、E、Hcy、A、D、K、L、M、N、Q、R、T、V和Aib；其中X6015是R；其中X6016是选自由以下组成的组的氨基酸：L、Aml、Hle和Hcy；其中X6017是选自由以下组成的组的氨基酸：A、Aib、C、c、Aic、Eca、Deg、Cha、Dab、Dap、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、K、Nle、Nva、Opa、Orn、R、I、L、S和M；其中X6018是选自由以下组成的组的氨基酸：A、Aib、C、c、L、Hcy、N、M和R；其中X6019是K；和其中X6020是选自由以下组成的组的氨基酸：L、Aml、Hcy和K。
4.如段落2或段落3所述的肽复合物，其中所述第一肽和/或第二肽还包括与X6001和/或X7001连接并选自由以下组成的组的N末端氨基酸和/或部分：FAM-Ttds、PE、Palm、2-苯基乙酰基、3-苯基丙酰基、2-(萘-2-基)乙酰基、己酰基、2-甲基丙酰基、3-甲基丁酰基、2-萘基磺酰基、1-萘基磺酰基、乙酰基、Con、Con(Meox)、AOA、Oxme-AOA、Meox-Lev、乙酰丙酸(Lev)和戊炔酸(Pyn)。
5.如段落2-4中任一段所述的肽复合物，其中所述第一肽和/或第二肽还分别包括与X6020连接的X6021或与X7023连接的X7024，其中X6021和/或X7024包括选自由以下组成的组的C末端氨基酸和/或部分：Hly、K、Orn、Dab、Eag、Dap、Hcy、Pen、C、c、C(NEM)、Con、Con(Meox)、K(Ttds-马来酰亚胺基丙酰基(EtSH))、K(Tdts-马来酰亚胺)、K(AOA)、K(Myr)、K(Ttds-Myr)、K(Ttds-Palm)、K(Ttds-Ac)、K(Ttds-γGlu-Myr)、K(AlbuTag)、K(4PBSA)、Cea和酰胺。
6.如段落2-5中任一段所述的肽复合物，
其中X7001是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、F、G、H、K、L和S；其中X7002是选自由以下组成的组的氨基酸：H、F、M和R；其中X7003是选自由以下组成的组的氨基酸：F和Y；其中X7004是K；其中X7005是W；其中X7006是选自由以下组成的组的氨基酸：F和H；其中X7007是C；其中X7008是选自由以下组成的组的氨基酸：A、G和S；其中X7009是选自由以下组成的组的氨基酸：M、Sem和V；其中X7010是选自由以下组成的组的氨基酸：K、P和R；其中X7011是D；其中X7012是选自由以下组成的组的氨基酸：F、L、l、M和Sem；其中X7013是选自由以下组成的组的氨基酸：D、G、K和S；其中X7014是G；其中X7015是选自由以下组成的组的氨基酸：I和T；其中X7016是选自由以下组成的组的氨基酸：D、F、M、Sem和Y；其中X7017是选自由以下组成的组的氨基酸：S和T；其中X7018是C；其中X7019是选自由以下组成的组的氨基酸：A和V；其中X7020是W；其中X7021是V；其中X7022是选自由以下组成的组的氨基酸：F、L、K、R、P和W；其中X7023存在或不存在，在X7023存在的情况下，X7023是选自由以下组成的组的氨基酸序列：A、D、F、M、S和Y；和其中所述肽包括通过X7007和X7018之间连接产生的环状结构。
7.如段落1-6中任一段所述的肽复合物，其中所述第一肽和所述第二肽通过长度优选约的连接体部分连接。
8.如段落7所述的肽复合物，其中所述连接体部分长度为约
9.如段落8所述的肽复合物，其中所述连接体部分长度为约
10.如段落7-9中任一段所述的肽复合物，其中所述连接体部分包括结构Z1-20，其中Z是氨基酸、羟酸、乙二醇、丙二醇、或前述任何的组合。
11.如段落10所述的肽复合物，其中Z是G、s、S、a、A、Bal、Gaba、Ahx、Ttds、或前述任何的组合。
12.如段落7-11中任一段所述的肽复合物，其中所述连接体部分通过肟、酰肼、琥珀酰亚胺、硫醚、三唑、仲胺、酰胺或二硫化物连接至所述第一肽和/或所述第二肽。
13.如段落7-12中任一段所述的肽复合物，其中所述第一肽的C末端通过所述连接体部分连接至所述第二肽的N末端。
14.如段落7-13中任一段所述的肽复合物，其中所述第一肽包括式(XIII)结构，并且连接体部分在所述N末端、所述C末端、或X6001、X6004、X6006、X6010、X6014或X6020的侧链连接至所述第一肽。
15.如段落1-14中任一段所述的肽复合物，其中所述第一肽包括与SEQ ID NO：178或SEQ ID NO：4261至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％相同的氨基酸序列。
16.如段落1-15中任一段所述的肽复合物，其中所述第二肽包括与SEQ ID NO：1044至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％相同的氨基酸序列。
17.如段落1或段落2所述的肽复合物，包括SEQ ID NO：4260所示的氨基酸序列。
18.如段落1-17中任一段所述的肽复合物，其中所述肽复合物轭合至聚乙二醇(PEG)部分、人血清白蛋白(HSA)、HSA结合结构域、抗体或其片段、羟乙基淀粉、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸多聚体(PAS化)、C12-C18脂肪酸或聚唾液酸。
19.一种TFPI抑制剂，其在以下位置结合人TFPI：由氨基酸残基F28、K29、A30、D32、I46、F47和I55限定的第一结合位点，和由氨基酸残基R41、Y53、C59、E60、Q63、R65、E67、E71、K74、M75、N80、N82、R83、I84、I85、T87、F96、C106、C130、L131、N133、M134、N136、F137、E142、N145和I146限定的第二结合位点。
20.如段落19所述的TFPI抑制剂，其中所述第一结合位点由氨基酸残基A27、F28、K29、A30、D31、D32、K36、I38、I46、F47和I55限定。
21.如段落20所述的TFPI抑制剂，其中所述第一结合位点由氨基酸残基A27、F28、K29、A30、D31、D32、K36、A37、I38、F44、I46、F47和I55限定。
22.如段落19-21中任一段所述的TFPI抑制剂，其是肽。
23.如段落19-21中任一段所述的TFPI抑制剂，包括通过连接体部分连接的第一肽和第二肽。
24.如段落23所述的TFPI抑制剂，其中所述连接体部分长度为约约或长度为约
25.如段落23或段落24所述的TFPI抑制剂，其中所述连接体部分包括结构Z1-20，其中Z是氨基酸、羟酸、乙二醇、丙二醇、或前述任何的组合。
26.如段落25所述的TFPI抑制剂，其中Z是G、s、S、a、A、Bal、Gaba、Ahx、Ttds、或前述任何的组合。
27.如段落1-18中任一段所述的肽复合物或段落19-26中任一段所述的TFPI抑制剂，用于受试者的治疗方法。
28.如段落27所述的肽复合物或TFPI抑制剂，其中所述方法用于治疗凝血障碍。
29.如段落1-18中任一段所述的肽复合物或段落19-26中任一段所述的TFPI抑制剂，用于制备药剂。
30.如段落1-18中任一段所述的肽复合物或段落19-26中任一段所述的TFPI抑制剂，用于制备用于治疗凝血障碍的药剂。
31.一种药物组合物，包含段落1-18中任一段所述的肽复合物或段落19-26中任一段所述的TFPI抑制剂和药学上可接受的载体。
32.如段落31所述的药物组合物，其中所述组合物包括另外的药用有效剂。
33.如段落31所述的药物组合物，其中所述药物组合物用于治疗凝血障碍的方法。
34.一种用于治疗罹患疾病或处于罹患疾病风险的受试者的方法，所述方法包括给所述受试者施用段落31的药物组合物。
35.如段落34所述的方法，其中所述疾病是凝血障碍。
36.一种用于鉴别TFPI结合化合物的方法，所述方法包括(a)使包含TFPI Kunitz结构域1(KD1)和Kunitz结构域2(KD2)的肽与测试化合物接触，和(b)检测所述测试化合物与对应于人TFPI残基R41、Y53、C59、E60、Q63、R65、E67、E71、K74、M75、N80、N82、R83、I84、I85、T87、F96、C106、C130、L131、N133、M134、N136、F137、E142、N145和I146的KD1-KD2氨基酸残基限定的TFPI结合位点的结合。
37.如段落36所述的方法，其中步骤(b)还包括检测所述测试化合物与对应于人TFPI残基F28、K29、A30、D32、I46、F47和I55的KD1氨基酸残基限定的TFPI结合位点的结合。
38.如段落37所述的方法，其中所述TFPI结合位点由对应于人TFPI残基F28、K29、A30、D32、I46、F47、I55A27、D31、K36、A37、I38、F44和I46的KD1氨基酸残基限定。
39.一种肽，由选自由SEQ ID NO：1337-1355和4240-4268组成的组的氨基酸序列组成。
40.一种抑制丝氨酸蛋白酶对TFPI降解的方法，所述方法包括使TFPI与包含下式(XIV)结构的肽接触：
X7001-X7002-X7003-X7004-X7005-X7006-[X7007-X7008-X7009-X7010-X7011-X7012-X7013-X7014-X7015-X7016-X7017-X7018]-X7019-X7020-X7021-X7022-X7023(XIV)(SEQ ID NO：3154)，
其中X7001存在或不存在，在X7001存在的情况下，X7001是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、C(NEM)、D、E、F、G、H、I、K、L、P、R、S、T、V和W；其中X7002存在或不存在，在X7002存在的情况下，X7002是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、C(NEM)、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W和Y；其中X7003是选自由以下组成的组的氨基酸：A、F、I、K、L、R、S、T、V、W和Y；其中X7004是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V和W；其中X7005是R或W；其中X7006是选自由以下组成的组的氨基酸：F、H、I、K、L、R、V和W；其中X7007是选自由Orn、homoK、C、Hcy、Dap和K组成的组，优选选自由C和Hcy组成的组的氨基酸；其中X7008是选自由以下组成的组的氨基酸：A、G、R、S和T；其中X7009是选自由以下组成的组的氨基酸：a、A、I、K、L、M、m、Moo、Nle、p、R、Sem和V；其中X7010是选自由以下组成的组的氨基酸：A、G、I、K、L、P、R、S、T和V；其中X7011是选自由以下组成的组的氨基酸：D、E、G、S和T；其中X7012是选自由以下组成的组的氨基酸：A、a、D、d、E、e、F、f、G、I、K、k、L、l、M、m、Moo、Nle、nle、P、p、R、r、S、s、Sem、T、t、V、v、W和w；其中X7013是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、C(NEM)、Con、Con(Meox)、D、d、E、e、Eag、F、G、I、K、L、N、R、S、s、T、V和W；其中X7014是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、M、R、S、T、V和W；其中X7015是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、M、Nle、R、S、T、V和W；其中X7016是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、I、K、L、M、Moo、Nle、R、S、Sem、T、V、W和Y；其中X7017是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V、W和Y；其中X7018是选自由C和D组成的组的氨基酸，优选C；其中X7019是选自由以下组成的组的氨基酸：A、F、I、L、S、T、V和W；其中X7020是选自由以下组成的组的氨基酸：F和W；其中X7021是选自由以下组成的组的氨基酸：I、L和V；其中X7022是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、P、R、S、T、V和W；其中X7023存在或不存在，在X7023存在的情况下，X7023是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、C(NEM)、Con、Con(Meox)、D、E、Eag、F、G、I、K、L、R、S、T、V、W和Y；和其中所述肽包括通过X7007和X7018之间连接产生的环状结构，藉此抑制所述丝氨酸蛋白酶对TFPI的降解。
41.如段落40所述的方法，其中X7001是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、F、G、H、K、L和S；其中X7002是选自由以下组成的组的氨基酸：H、F、M和R；其中X7003是选自由以下组成的组的氨基酸：F和Y；其中X7004是K；其中X7005是W；其中X7006是选自由以下组成的组的氨基酸：F和H；其中X7007是C；其中X7008是选自由以下组成的组的氨基酸：A、G和S；其中X7009是选自由以下组成的组的氨基酸：M、Sem和V；其中X7010是选自由以下组成的组的氨基酸：K、P和R；其中X7011是D；其中X7012是选自由以下组成的组的氨基酸：F、L、l、M和Sem；其中X7013是选自由以下组成的组的氨基酸：D、G、K和S；其中X7014是G；其中X7015是选自由以下组成的组的氨基酸：I和T；其中X7016是选自由以下组成的组的氨基酸：D、F、M、Sem和Y；其中X7017是选自由以下组成的组的氨基酸：S和T；其中X7018是C；其中X7019是选自由以下组成的组的氨基酸：A和V；其中X7020是W；其中X7021是V；其中X7022是选自由以下组成的组的氨基酸：F、L、K、R、P和W；其中X7023存在或不存在，在X7023存在的情况下，X7023是选自由以下组成的组的氨基酸序列：A、D、F、M、S和Y；和其中所述肽包括通过X7007和X7018之间连接产生的环状结构。
42.如段落40或段落41所述的方法，其中所述肽是肽复合物的部分，所述肽复合物还包括包含下式(XIII)结构的肽：
X6001-X6002-X6003-X6004-X6005-X6006-X6007-X6008-X6009-X6010-X6011-X6012-X6013-X6014-X6015-X6016-X6017-X6018-X6019-X6020(XIII)(SEQ ID NO：3153)；
其中X6001是选自由以下组成的组的氨基酸：F、L、M、Y、1Ni、Thi、Bta、Dopa、Bhf、C、D、G、H、I、K、N、Nmf、Q、R、T、V和W；其中X6002是选自由以下组成的组的氨基酸：Q、G和K；其中X6003是选自由以下组成的组的氨基酸：C、D、E、M、Q、R、S、T、Ede(O)、Cmc、A、Aib、Bhs、F、G、H、I、K、L、N、P、V、W和Y；其中X6004是选自由以下组成的组的氨基酸：Aib、E、G、I、K、L、M、P、R、W、Y、A、Bhk、C、D、F、H、k、N、Nmk、Q、S、T和V；其中X6005是选自由以下组成的组的氨基酸：a、A、Aib、C、D、d、E、G、H、K、k、M、N、Nmg、p、Q、R、N丙基G、aze、pip、tic、oic、hyp、nma、Ncg、Abg、Apg、thz、dtc、Bal、F、L、S、T、V、W和Y；其中X6006是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、C(NEM)、D、E、G、H、K、M、N、Q、R、S、V、Cit、C(Acm)、Nle、I、Ede(O)、Cmc、Ecl、Eea、Eec、Eef、Nif、Eew、Aib、Btq、F、I、L、T、W和Y；其中X6007是选自由以下组成的组的氨基酸：I、V、T、Chg、Phg、Tle、A、F、G、I、K、L、Nmv、P、Q、S、W和Y；其中X6008是选自由以下组成的组的氨基酸：F、H、1Ni、2Ni、Pmy、Y和W；其中X6009是选自由以下组成的组的氨基酸：Aib、V、Chg、Phg、Abu、Cpg、Tle、L-2-氨基-4,4,4-三氟丁酸、A、f、I、K、S、T和V；其中X6010是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、D、d、E、F、H、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、Nmd、C(NEM)、Aib、G、I、L和Nmf；其中X6011是选自由以下组成的组的氨基酸：A、a、G、p、Sar、c、hcy、Aib、C、K、G和Nmg；其中X6012是选自由以下组成的组的氨基酸：Y、Tym、Pty、Dopa和Pmy；其中X6013是选自由以下组成的组的氨基酸：Aib、C、F、1Ni、Thi、Bta、A、E、G、H、K、L、M、Q、R、W和Y；其中X6014是选自由以下组成的组的氨基酸：A、Aib、C、C(NEM)、D、E、K、L、M、N、Q、R、T、V、Hcy、Bhe、F、G、H、I、P、S、W和Y；其中X6015是选自由以下组成的组的氨基酸：R、(ω-甲基)-R、D、E和K；其中X6016是选自由以下组成的组的氨基酸：L、Hcy、Hle和Aml；其中X6017是选自由以下组成的组的氨基酸：A、a、Aib、C、c、Cha、Dab、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、Nle、Nva、Opa、Orn、R、S、Deg、Ebc、Eca、Egz、Aic、Apc、Egt、(ω-甲基)-R、Bhr、Cit、D、Dap、E、F、G、N、Q、T、V、W和Y；其中X6018是选自由以下组成的组的氨基酸：A、Aib、Hcy、hcy、C、c、L、Nle、M、N、R、Bal、D、E、F、G、H、I、K、Q、S、T、V、W和Y；其中X6019是选自由以下组成的组的氨基酸：K、R、Har、Bhk和V；和其中X6020是选自由以下组成的组的氨基酸：K、L、Hcy、Aml、Aib、Bhl、C、F、G、H、I、Nml、Q、R、S、T、V、W和Y。
43.如段落40-43中任一段所述的方法，其中所述蛋白酶是弹性蛋白酶、凝血酶、血纤蛋白溶酶、FXa或胃促胰酶。
附图说明
图1是凝血级联的图示。
图2是组织因子途径抑制剂-1的二级结构的图示。
图3是包含组织因子、凝血因子Xa(FXa)、凝血因子VIIa(FVIIa)和TFPI的四元复合物形成的图示。
图4是各种TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)的氨基酸序列的列表，指出了参照肽JBT0293的氨基酸取代(粗体和下划线)。
图5是TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)的mRNA展示筛选的图示。
图6A是EC50结合ELISA的图示，图6B是实施例1描述的IC50ELISA的图示。
图7是生物素化肽JBT0132的比较％OD(y轴)和浓度[nM](x轴)的结合ELISA曲线。
图8A-8D是本发明示例性肽的比较％OD(y轴)和浓度[nM](x轴)的竞争ELISA曲线。
图9Α和9Β是绘出肽JBT0120和JBT0132的RU(y轴)对以秒计的时间(x轴)的感应图。
图10A和10B是绘出肽JBT0120与组织因子途径抑制剂-1和组织因子途径抑制剂-2相互作用的RU(y轴)对以秒计的时间(x轴)的感应图。
图11A和11B是在基于血浆的分析中，肽JBT0120和肽JBT0132的凝血酶生成量(nM)(y轴)对比以分钟计的时间(x轴)的图。
图12-18是列出以下的表：各种TFPI结合肽的氨基酸序列；在FXa抑制检定中观察到的TFPI的EC50和百分比抑制；在外源性tenase抑制检定中观察到的TFPI的EC50和百分比抑制；和在基于血浆的检定中，FEIBA、凝血因子VIII(FVIII)Immunate、或凝血因子IX(FIX)的当量活性(mU/mL)。“*”表示阴性对照。
图19-21是列出了几个TFPI结合肽的BIAcore分析结果的表。“*”表示阴性对照。
图22-30是列出以下的表：各种TFPI结合肽的氨基酸序列；在FXa抑制检定中观察到的TFPI的EC50和百分比抑制；在外源性tenase抑制检定中观察到的TFPI的EC50和百分比抑制；和在基于血浆的检定中，FEIBA、FVIII Immunate或FIX的当量活性(mU/mL)。“*”表示阴性对照。
图31是比较聚乙二醇化的TFPI结合肽的药代动力学特征(肽浓度(y轴)比对施用后时间(x轴))与缺乏PEG的相同肽的药代动力学特征的图。所述肽以10mg/kg的剂量静脉内施用于C57B16小鼠。每个时点分析三个生物样品中肽的存在。
图32-39是列出各种本发明肽的氨基酸序列和IC50或EC50值。“*”表示阴性对照。
图40是说明在以10mg/kg的剂量给小鼠皮下施用之后，聚乙二醇化TFPI结合肽的药物动力学特性(肽的浓度(nM)(y轴)比对施用后的时间(分钟)(x轴))的图。
图41为使肽JBT1855在甲型血友病患者血浆的基于血浆的检定中凝血酶生成量(nM)(y轴)与时间(分钟)(x轴)关联的图。
图42为说明经JBT-1855(静脉内或皮下施用)、抗TFPI抗体(静脉内施用)或媒介物(静脉内施用)(x轴)治疗的小鼠中在趾甲夹住之后观察到的失血量(μl；y轴)的图。
图43为描绘TFPI160氨基酸残基(x轴)与游离TFPI160和与JBT0303结合的TFPI160的HSQC信号的化学位移差异(y轴)的图。
图44为TFPI的二级结构的带状模型，说明相较于未复合(游离)的TFPI160，当TFPI160与JBT0303复合时，HSQC信号的化学位移变化的区域。
图45为描绘TFPI160氨基酸残基(x轴)与游离TFPI160和与JBT0122结合的TFPI160的HSQC信号的化学位移差异(y轴)的图。
图46为TFPI蛋白的二级结构的带状模型，说明相较于未复合(游离)的TFPI160，当TFPI160与JBT0122复合时，HSQC信号的化学位移变化的区域。
图47为列出JBT0788的羰基碳(C)、α碳(CA)、β碳(CB)、酰胺质子(H)及酰胺氮(N)基于HSQC、HNCACB、HNCA、HNCO和HNN光谱的归属的表。
图48为游离JBT0788的二级结构的带状模型。
图49为列出与TFPI160复合的JBT0788的羰基碳(C)、α碳(CA)、β碳(CB)、酰胺质子(H)及酰胺氮(N)基于HSQC、HNCACB、HNCA、HCCOCA和HNCO光谱的归属的表。
图50为JBT0788当与TFPI160复合时的二级结构的带状模型。
图51为列出JBT0616的羰基碳(C)、α碳(CA)、β碳(CB)、酰胺质子(H)及酰胺氮(N)基于HSQC、HNCACB和HNN光谱的归属的表。
图52为游离JBT0616的二级结构的带状模型。
图53为列出与TFPI复合的JBT0616的羰基碳(C)、α碳(CA)、β碳(CB)、酰胺质子(H)及酰胺氮(N)基于HSQC、HNCO、HNCA和HNCOCA光谱的归属的表。
图54为JBT0616当与TFPI160复合时的二级结构的带状模型。
图55为与JBT0303复合的KD1(残基22-79)的能量最小化最佳模型的带状结构，其中提出驱动蛋白质-蛋白质相互作用的残基以棒显示。斜体且加下划线的残基属于JBT0303；其余残基属于TFPI的KD1。
图56为使JBT2317的样品弹性(mm)与以秒计的时间(s)相关联的旋转血栓弹性描记图。
图57为使JBT2329的样品弹性(mm)与以秒计的时间(s)相关联的旋转血栓弹性描记图。
图58为计算装置的图示。
图59为KD1蛋白的三维(3D)模型的图示。
图60为TFPI结合肽的3D模型的图示。
图61为模拟蛋白质与肽的相互作用的方法的图示。
图62为列出各种本发明肽的氨基酸序列和IC50或EC50值的表。符号“n.a.”为“未分析”。使用实施例3中所描述的FXa抑制检定以及重组人全长TFPI获得进程曲线数据。进程曲线检定的检定浓度为0.0025％(于肽稀释缓冲液中使用的0.1％Tween80)。
图63为使肽JBT2325-JBT2329的浓度(nM)(y轴)与静脉内施用后的时间(小时)(x轴)关联的图。包含较高重量PEG部分的肽在小鼠中展现延长的体内半衰期。每个时间点都有ELISA定量的3个独立样品的平均值表示。
图64A-64C为使肽JBT2401、JBT2404及JBT2410的浓度(nM)(y轴)与静脉内施用后的时间(小时)(x轴)关联的图。每个时间点都由ELISA定量的3个独立样品的平均值表示。实心圆形表示静脉内数据，实心三角形表示皮下数据。
图65为列出各种本发明肽的氨基酸序列的表。
图66A和66B描绘了TFPI结合肽JBT1837(SEQ ID NO：1044)和JBT1857(SEQ ID NO：178)以及肽复合物JBT2547(SEQ ID NO：4260)的IC50曲线，使用两种示踪剂：JBT1857的生物素化衍生物JBT2271(SEQ ID NO：4033)(图66A)和JBT1837的生物素化衍生物JBT2316(SEQID NO：1313)(图66B)。
图67是说明使用JBT2547(SEQ ID NO：4260)和JBT1857(SEQ ID NO：178)(X轴)的K解离检定结果的条形图，表示为示踪肽JBT2271(SEQ ID NO：4033)对TFPI结合抑制的％(Y轴)。
图68A-F说明使用TFPI结合肽复合物的FXa抑制检定的结果。图68A-68D是使JBT1837(三角形；SEQ ID NO：1044)、JBT1857(圆形；SEQ ID NO：178)、JBT2547(菱形；SEQID NO：4260)和JBT1837+JBT1857(正方形)的浓度(μM)(X轴)与用0.5nM全长人TFPI(图68A)、0.5nM人TFPI 1-160(图68B)、0.5nM鼠TFPI 1-160(图68C)或0.5nM短尾猴TFPI 1-160(图68D)进行的FXa抑制检定中TFPI的百分比抑制相关联的图。图68E说明JBT2547以递增的TFPI浓度(从左到右，0.1至10nM)在FXa抑制检定中对TFPI的抑制。通过S形剂量响应方程拟合数据点，得到EC50(nM)和最大抑制(％)。图68F是关联在递增的全长人TFPI浓度存在下通过JBT2547(菱形)、JBT2548(圆形)、JBT1837(三角形)和JBT1837与JBT1857的组合(正方形)(1μM肽)的TFPI抑制(％)的图。
图69说明使用TFPI结合肽复合物的外源性tenase抑制检定的结果。图69A是在用0.063nM全长人TFPI进行的外源性tenase抑制检定中使JBT1837(三角形；SEQ ID NO：1044)、JBT1857(圆形；SEQ ID NO：178)、JBT2547(菱形；SEQ ID NO：4260)和JBT1837+JBT1857(正方形)的浓度(μM)(X轴)与TFPI的百分比抑制相关联的图。图69B说明JBT2547以递增的TFPI浓度(从左到右，0.031至10nM)在外源性tenase抑制检定中对TFPI的抑制。通过S形剂量响应方程拟合数据点，得到EC50(nM)和最大抑制(％)。图69C是关联JBT1837(三角形；SEQ ID NO：1044)、JBT2548(圆形；SEQ ID NO：4261)、JBT2547(菱形；SEQ ID NO：4260)和JBT1837+JBT1857(正方形)(1μM)介导的TFPI的百分比最大抑制(Y轴)与外源性tenase抑制检定中使用的全长人TFPI的浓度相关联的图。图69D是使JBT1837(三角形；SEQ ID NO：1044)、JBT2548(圆形；SEQ ID NO：4261)、JBT2547(菱形)；SEQ ID NO：4260、和JBT1837+JBT1857(正方形)(1μM)的EC50与外源性tenase抑制检定中使用的全长人TFPI的浓度(nM)相关联的图。通过拟合递增的TFPI浓度下的肽浓度响应与全长TFPI浓度来计算EC50。
图70A-70C说明了在FVIII抑制血浆中进行的凝血酶生成检定的结果。这些图使1.25nM flTFPI(图70A)、3.75nM flTFPI(图70B)和10nMflTFPI(图70C)存在下的峰值凝血因子IIa(凝血酶)生成(nM)(Y轴)与JBT1837(三角形)、JBT1857(圆形)、JBT1837+JBT1857的组合(正方形)和JBT2547(菱形)(X轴)的浓度(nM)相关联。虚线-汇集的正常血浆(PNP)；实线-FVIII抑制的血浆(PNP+aFVIII)。
图71A-71B是关联在基于细胞的外源性tenase检定中以各种浓度(X轴)的JBT2547、JBT1837和1857(图71A)或JBT2547(菱形)、JBT1837(三角形)、JBT1837+JBT1857(正方形)和JBT2548(圆形)(图71B)实现的TFPI的百分比抑制(Y轴)的图。
图72A-72C说明在不存在额外的外部人全长TFPI(空心圆形)和存在递增量的外部全长TFPI(2nM，实心三角形；10nM，实心正方形)下在FVIII抑制的全血中递增浓度的(10、100、1000nM)JBT2547(图72A)、JBT1837(图72B)或JBT1857(图72C)的促凝血作用。给出FVIII抑制的全血和正常全血的凝结时间作为参比。+＝没有获得凝结时间。
图73是列出用于肽连接的亲核或亲电反应基团的非限制性实例的图表。
图74是来自不同物种的TFPI KD1-KD2的序列比对。具有的接触表面的残基＝41、56、59、60、67、71、74、96、106、130、132、133、136、137、142；具有的接触表面的残基＝75、80、82、84、85、87、145；具有的接触表面的残基＝63、65、131、146；具有大于的接触表面的残基＝83、134。
图75是与JBT1857和JBT1837复合的KD1-KD2的模型的带状结构。
图76A-76D是列出各种本发明肽的氨基酸序列的表。
图77是列出各种本发明肽的氨基酸序列的表。
图78A-78AA是列出各种本发明肽的氨基酸序列的表。
发明详述
本发明提供了肽和肽复合物。在各个实施方案中，所述肽或肽复合物结合组织因子途径抑制剂-1，并且在一些情况下，阻断凝血级联中的组织因子途径抑制剂-1(本文称为TFPI)的抑制活性。血管损伤后，组织因子(TF)与凝血因子VIIa复合形成“外源复合物”或“外源性tenase复合物”，其激活凝血因子IX和X(图1)。TFPI是TF/FVIIa外源复合物活性的主要天然调节物，并通过扩展，在控制凝血酶生成中发挥作用(Panteleev等人，Eur.J.Biochem.，249，2016-2031(2002))。TFPI是43kDa的丝氨酸蛋白酶抑制剂，包含三个Kunitz型抑制结构域(图2)。TFPI的Kunitz结构域1结合FVIIa并且Kunitz结构域2结合FXa，使所述抑制剂能够形成阻断TF/FVIIa外源复合物活性的四元FXa-TFPI-FVIIa-TF复合物(图3)。TFPI结合FXa还下调凝血级联的共同途径，在这期间，FXa将凝血酶原转化成凝血酶(Audu等人，Anesth.Analg.，103(4)，841-845(2006))。例如，本发明提供了TFPI抑制肽，其阻断TFPI对凝血级联的抑制作用，从而增强凝血酶形成。在本公开上下文中，本文描述的式(I)至(XIV)任何一个涵盖的任何肽和本文描述的任何TFPI结合肽还被称为“本发明肽”和“本文描述的肽”。
本文提供了几种TFPI结合肽的氨基酸序列。根据如表1提供的其标准的单字母或三字母代码确认常规氨基酸。
表1
非常规氨基酸和其他肽结构单元的实例根据表2所示三字母代码(除了Ttds和Dopa是常见的四字母缩写)确认。三、四或七个数字/字母名称或缩写命名的其他结构单元也列于表2。一些结构单元的结构用将所述结构单元引入肽的示例性试剂描述(例如，为2-萘基磺酰基提供的结构包括氯化物)。
表2
本文提供的肽的氨基酸序列以普通技术人员所了解的典型肽序列形式描述。例如，常规氨基酸的三字母代码或单字母代码或者三、四或七个数字/字母代码的其他结构单元指示肽序列内指定位置中存在所述氨基酸或结构单元。每个非常规氨基酸或结构单元的代码与序列中下一个和/或前一个氨基酸或结构单元的代码通过连字符连接。相邻的氨基酸通过化学键(通常是酰胺键)连接。化学键的形成在氨基酸位于相邻氨基酸左侧(例如Hle-相邻氨基酸)时从所述氨基酸的1-羧基除去一个羟基，和在氨基酸位于相邻氨基酸的右侧(例如相邻氨基酸-Hle)时从所述氨基酸的氨基除去一个氢。要理解，这两种修饰都可应用于同一氨基酸和应用于没有明确示出连字符的氨基酸序列中存在的相邻常规氨基酸。在氨基酸在氨基酸侧链中包含多于一个氨基和/或羧基的情况下，2-或3-氨基和/或1-羧基一般用于形成肽键。对于非常规氨基酸而言，使用三字母代码，其中首字母指示C-α-原子的立体化学。例如，大写的首字母指示肽序列中存在L-形式的氨基酸，而小写的首字母指示肽序列中存在D-形式的相应氨基酸。当使用单字母代码时，小写字母表示D-氨基酸，而大写字母表示L-氨基酸。除非有相反指示，本文以N至C末端方向呈现氨基酸序列。
本文描述的几个TFPI结合肽序列的C末端通过包含OH、NH2、或通过连字符与C末端氨基酸代码连接的具体末端胺的缩写而明确表明。本文描述的几个肽的N末端通过包含氢(用于游离N末端)、或通过连字符与N末端氨基酸代码连接的具体末端羧酸或其他化学基团的缩写而明确表明。
本发明提供包含氨基酸序列X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21(SEQ ID NO：3109)的肽，其中(使用氨基酸的单字母代码)X7选自由以下组成的组：L、P、K、S、W、V、N和Q；X8选自由以下组成的组：L、R、N、F和I；X9选自由以下组成的组：Y、V、P和C；X10选自由以下组成的组：F、L和G；X11选自由以下组成的组：L、W、V、A、M、T和S；X12选自由以下组成的组：T、F、V、R、A、D、L、E、S和Y；X13选自由以下组成的组：I、M、G、Q、D和R；X14选自由以下组成的组：G、W、Y、L、M和H；X15选自由以下组成的组：N、P、F、H、K和Y；X16选自由以下组成的组：M、D、E、V、G和K；X17选自由以下组成的组：G、I、R、S、T和L；X18选自由以下组成的组：M、K、L和I；X19选自由以下组成的组：Y、G、R和S；X20选自由以下组成的组：A、E、S、C和Y；和X21选自由以下组成的组：A、V、K和E。
除了上面显示的核心结构X7-X21之外，特别考虑的其他结构是其中ー个或多个额外氨基酸与所述核心结构连接(例如，与氨基酸序列X7-X21的N末端或C末端连接)的结构。因此，本发明包括包含所述核心结构和进ー步包含ー个或多个N末端氨基酸的肽，所述N末端氨基酸包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
X6，
X5X6，
X4X5X6，
X3X4X5X6(SEQ ID NO：3110)，
X2X3X4X5X6(SEQ ID NO：3111)，和
X1X2X3X4X5X6(SEQ ID NO：3112)；
其中X6与所述核心结构氨基酸序列的X7直接连接，并且X1选自由以下组成的组：T和G；X2选自由以下组成的组：F和V；X3选自由以下组成的组：V、W、Y和F；X4选自由以下组成的组：D、Q和S；X5选自由以下组成的组：E、T、N和S；和X6选自由以下组成的组：R、H、K和A。一方面，本发明的肽包含氨基酸序列QSKKNVFVFGYFERLRAK(SEQ ID NO：1)或由其组成。
在另一实施方案中，包含核心结构的本发明肽包含ー个或多个C末端氨基酸，所述C末端氨基酸包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
X22，
X22X23，
X22X23X24，
X22X23X24X25(SEQ ID NO：3113)，
X22X23X24X25X26(SEQ ID NO：3114)，和
X22X23X24X25X26X27(SEQ ID NO：3115)，
其中X22与所述核心结构氨基酸序列的X21直接连接，并且X22选自由以下组成的组：Q、I、E、W、R、L和N；X23选自由以下组成的组：L、V、M和R；X24选自由以下组成的组：K、L、A和Y；X25是F；X26是G；并且X27是T。
一方面，本发明的肽包含氨基酸序列VIVFTFRHNKLIGYERRY(SEQ ID NO：4)或由其组成。还设想了本发明的肽在核心结构的N末端和C末端均包含另外的氨基酸。在这方面，所述肽包含下列氨基酸序列或由其组成：TFVDERLLYFLTIGNMGMYAAQLKF(SEQ ID NO：3)、GVWQTHPRYFWTMWPDIKGEVIVLFGT(SEQ ID NO：5)、KWFCGMRDMKGTMSCVWVKF(SEQ ID NO：6)或ASFPLAVQLHVSKRSKEMA(SEQ ID NO：7)。
本发明还包括包含以下氨基酸序列的肽：X3X4X5-F-X7-NVF-X11X12-GY-X15X16-RLRAK-X22(SEQ ID NO：2)，其中X3是Y或F；X4是Q或S；X5是N或S；X7是K、N或Q；X11是V、A、S或T；X12是F、A、D、L、Q、S或Y；X15是F、K或Y；X16是E或D；并且X22是L或N。
另外，本发明提供结合TFPI的肽，其中所述肽包含式(I)结构：X1001-X1002-X1003-X1004-X1005-X1006-X1007-X1008-X1009-X1010-X1011-X1012-X1013-X1014-X1015-X1016-X1017-X1018-X1019-X1020(SEQ ID NO：3116)。在式(I)中，X1001是选自由以下组成的组的氨基酸：Bhf、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Nmf、Q、R、T、V、W和Y；X1002是选自由以下组成的组的氨基酸：G、K和Q；X1003是选自由以下组成的组的氨基酸：A、Aib、Bhs、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y；X1004是选自由以下组成的组的氨基酸：A、Aib、Bhk、C、D、E、F、G、H、I、K、k、L、M、N、Nmk、P、Q、R、S、T、V、W和Y；X1005是选自由以下组成的组的氨基酸：a、A、Aib、Bal、C、D、d、E、F、G、H、K、k、L、M、N、Nmg、p、Q、R、S、T、V、W和Y；X1006是选自由以下组成的组的氨基酸：A、Aib、Btq、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S T、V、W和Y；X1007是选自由以下组成的组的氨基酸：A、F、G、I、K、L、Nmv、P、Q、S、V、W和Y；X1008是选自由以下组成的组的氨基酸：F、H、K、W和Y；X1009是选自由以下组成的组的氨基酸：A、Aib、f、I、K、S、T和V；X1010是选自由以下组成的组的氨基酸：A、Aib、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Nmf、P、Q、R、S、T、V、W和Y；X1011是选自由以下组成的组的氨基酸：Aib、C、K、G和Nmg；X1012是Y；X1013是选自由以下组成的组的氨基酸：A、Aib、C、E、F、G、H、K、L、M、Q、R、W和Y；X1014是选自由以下组成的组的氨基酸：A、Aib、Bhe、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y；X1015是选自由以下组成的组的氨基酸：(ω-甲基)-R、D、E、K和R；X1016是L；X1017是选自由以下组成的组的氨基酸：(ω-甲基)-R、A、Aib、Bhr、C、Cha、Cit、D、Dab、Dap、E、Eag、Eew、F、G、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、N、Nle、Nva、Opa、Orn、Q、R、S、T、V、W和Y；X1018是选自由以下组成的组的氨基酸：A、Bal、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y；和X1019是选自由以下组成的组的氨基酸：Bhk、K、R和V。X1020在式(I)中存在或不存在(即，在一些情况下，本发明的肽包含结构X1001-X1002-X1003-X1004-X1005-X1006-X1007-X1008-X1010-X1011-X1012-X1013-X1014-X1015-X1016-X1017-X1018-X1019(SEQ ID NO：3116))。当X1020存在时，它是选自由以下组成的组的氨基酸：Aib、Bhl、C、F、G、H、I、K、L、Nml、Q、R、S、T、V、W和Y。
例如，本发明的肽包含式(I)结构，其中X1001是选自由以下组成的组的氨基酸：C、F、I、K、L、Nmf、V、M、W和Y；X1002是Q；X1003是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、D、E、H、K、M、I、N、Q、R、S、T和V；X1004是选自由以下组成的组的氨基酸：A、Aib、C、D、E、G、H、F、I、K、k、L、M、N、Nmk、P、Q、R、S、V、W和Y；X1005是选自由以下组成的组的氨基酸：a、A、Aib、Bal、C、d、E、D、F、G、H、K、k、L、M、N、Nmg、p、Q、R、S、T和Y；X1006是选自由以下组成的组的氨基酸：A、Btq、C、D、G、I、K、H、L、M、N、Q、R、S、V和Y；X1007是选自由以下组成的组的氨基酸：I、K、L、Q、V和Y；X1008是选自由以下组成的组的氨基酸：F、H和Y；X1009是选自由以下组成的组的氨基酸：f、I和V；X1010是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y；X1011是选自由以下组成的组的氨基酸：G和Nmg；X1012是Y；X1013是选自由以下组成的组的氨基酸：Aib、C、F、H、L、W和Y；X1014是选自由以下组成的组的氨基酸：A、Aib、Bhe、C、D、E、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y；X1015是选自由以下组成的组的氨基酸：E和R；X1016是L；X1017是选自由以下组成的组的氨基酸：(ω-甲基)-R、A、Aib、Bhr、C、Cha、Cit、Dab、Dap、Eag、Eew、F、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、N、Nle、Nva、Opa、Orn、R、S、T、V和Y；X1018是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、D、E、F、I、K、L、M、N、Q、R、V和W；X1019是选自由以下组成的组的氨基酸：K和R；和X1020是选自由以下组成的组的氨基酸：Aib、Bhl、F、K、L、R和W(当X1020存在于所述肽中时)。
一方面，本发明的肽包含式(I)结构，其中X1001是选自由以下组成的组的氨基酸：F、L、Y和M；X1002是Q；X1003是选自由以下组成的组的氨基酸：M、Q、R、S、T和C；X1004是选自由以下组成的组的氨基酸：Aib、K、L、P、R、E、G、I、Y、M和W；X1005是选自由以下组成的组的氨基酸：a、Aib、D、d、G、H、K、k、N、Nmg、p、Q、R、A、E、C和M；X1006是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、D、G、H、K、N、Q、R、S和M；X1007是选自由以下组成的组的氨基酸：I和V；X1008是选自由以下组成的组的氨基酸：F、H和Y；X1009是V；X1010是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、K、M、N、Q、R、F、H、P、S、V、W和Y；X1011是G；X1012是Y；X1013是C或F；X1014是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、D、E、K、L、M、N、Q、R、T、V和Aib；X1015是R；X1016是L；X1017是选自由以下组成的组的氨基酸：A、Aib、C、Cha、Dab、Dap、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、K、Nle、Nva、Opa、Orn、R、I、L、S和M；X1018是选自由以下组成的组的氨基酸：A、L、N、M和R；X1019是K；和X1020是K或L。
当式(I)不存在氨基酸Χ1020时，本发明的肽在一个方面还包含在式(I)N末端的氨基酸Χ1000，使得所述肽包含式(II)结构或由其组成：X1000-X1001-X1002-X1003-X1004-X1005-X1006-X1007-X1008-X1009-X1010-X1011-X1012-X1013-X1014-X1015-X1016-X1017-X1018-X1019(II)(SEQ ID NO：3122)。当肽中存在X1000时，X1000是选自由以下组成的组的氨基酸：A、E和P，而X1001-X1019的氨基酸如上文定义。
在另一个方面，本发明的TFPI结合肽包含式(III)结构：X1001-Q-X1003-X1004-X1005-X1006-I/V-X1008-V-X1010-G-Y-C/F-X1014-R-L-X1017-X1018-K-K/L(III)(SEQ IDNO：3117)。如本文使用的，通过“/”分隔的氨基酸名称指在所示位置可替代的氨基酸残基。例如，就式(III)而言，位置7的氨基酸残基是异亮氨酸或缬氨酸。式(III)中的X1001、X1003、X1004、X1005、X1006、X1008、X1010、X1014、X1017和X1018各自独立选自任何氨基酸。例如，在式(III)中，X1001任选是选自由Bhf、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Nmf、Q、R、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由C、F、I、K、L、Nmf、V、M、W和Y组成的组的氨基酸(例如，选自由F、L、Y和M组成的组的氨基酸)；X1003任选是选自由A、Aib、Bhs、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由A、C、D、E、H、K、M、I、N、Q、R、S、T和V组成的组的氨基酸(例如，所述氨基酸是M、Q、R、S、T或C)；X1004任选是选自由A、Aib、Bhk、C、D、E、F、G、H、I、K、k、L、M、N、Nmk、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由A、Aib、C、D、E、G、H、F、I、K、k、L、M、N、Nmk、P、Q、R、S、V、W和Y组成的组的氨基酸(例如，选自由Aib、K、L、P、R、E、G、I、Y、M和W组成的组的氨基酸)；X1005任选是选自由A、Aib、Bal、C、D、d、E、F、G、H、K、k、L、M、N、Nmg、p、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由a、A、Aib、Bal、C、d、E、D、F、G、H、K、k、L、M、N、Nmg、p、Q、R、S、T和Y组成的组的氨基酸(例如，所述氨基酸是a、Aib、D、d、G、H、K、k、N、Nmg、p、Q、R、A、E、C或M)；X1006任选是选自由A、Aib、Btq、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由A、Btq、C、D、G、I、K、H、L、M、N、Q、R、S、V和Y组成的组的氨基酸(例如，选自由A、C、D、G、H、K、N、Q、R、S和M组成的组的氨基酸)；X1008任选是选自由F、H、K、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由F、H和Y组成的组的氨基酸；X1010任选是选自由A、Aib、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Nmf、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由A、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸(例如，选自由A、D、E、K、M、N、Q、R、F、H、P、S、V、W和Y组成的组的氨基酸)；X1014任选是选自由A、Aib、Bhe、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由A、Aib、Bhe、C、D、E、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸(例如，A、C、D、E、K、L、M、N、Q、R、T、V或Aib)；X1017任选是选自由(ω-甲基)-R、A、Aib、Bhr、C、Cha、Cit、D、Dab、Dap、E、Eag、Eew、F、G、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、N、Nle、Nva、Opa、Orn、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由(ω-甲基)-R、A、Aib、Bhr、C、Cha、Cit、Dab、Dap、Eag、Eew、F、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、N、Nle、Nva、Opa、Orn、R、S、T、V和Y组成的组的氨基酸(例如，选自由A、Aib、C、Cha、Dab、Dap、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、K、Nle、Nva、Opa、Orn、R、I、L、S和M组成的组的氨基酸)；和/或X1018任选是选自由A、Bal、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由A、C、D、E、F、I、K、L、M、N、Q、R、V和W组成的组的氨基酸(例如，选自由A、L、N、M和R组成的组的氨基酸)。
在一些实施方案中，本发明的肽包含与氨基酸序列的N或C末端连接的一个或多个另外的氨基酸残基。例如，在一些实施方案中，包含式(I)-(III)的任一个结构的肽还包含与X1001直接连接的一个或多个N末端氨基酸，其中所述N末端氨基酸包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：X1000、X999-X1000、X998-X999-X1000、X997-X998-X999-X1000(SEQ IDNO：3123)、X996-X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO：3124)、X995-X996-X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO：3125)、X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO：3126)、X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO：3127)、X992-X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO：3128)、X991-X992-X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO：3129)和X990-X991-X992-X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO：3130)。当所述肽包含一个或多个N末端氨基酸时，X1000是A或K；X999是V或K；X998是Q或K；X997是L或K；X996是R或K；X995是G或K；X994是V或K；X993是G或K；X992是S或K；X991是K；和X990是K。
除了式(I)-(III)显示的核心结构之外，特别考虑的其他结构是其中一个或多个另外的氨基酸与核心结构的C末端相连的那些结构，所述C末端与X1020直接连接。例如，C末端附加物任选包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：X1021、X1021-X1022、X1021-X1022-X1023和X1021-X1022-X1023-X1024(SEQ ID NO：3131)，其中X1021是T或K；X1022是S或K；并且X1023和X1024是K。
本发明还包括TFPI结合肽，该结合肽包含与氨基酸序列Ac-FQSK-Nmg-NVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2(式IV)(SEQ ID NO：164)具有至少60％同一性(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些情况下，所述肽包含本文所述式(I)-(III)任一个的氨基酸序列或由其组成。本发明还包括含有选自由SEQ ID NO：8-978组成的组的氨基酸序列或由其组成的肽(例如，包含选自由SEQ ID NO：8-741和962-972(例如SEQ ID NO：8-741、962-968、971或972)组成的组和/或选自由742-961(例如SEQ ID NO：744-961)组成的组和/或选自由SEQID NO：973-978组成的组的氨基酸序列或由其组成的肽)。
本发明包括含有环状结构的肽。在这方面，本发明包括肽内含有环状结构(例如，除N和C末端氨基酸之外的氨基酸之间连接形成的一个或多个环)的肽，含有末端氨基酸与肽序列内氨基酸相互作用形成的环状结构的肽，和头接尾环化的肽。肽还可以是周围额外氨基酸或化学取代基形成的较大环状结构的部分。在一些情况下，本发明的肽包含分子内二硫键。在一些实施方案中，分子内二硫键由半胱氨酸残基形成。还提供了包含由非半胱氨酸残基、或非半胱氨酸残基和半胱氨酸残基形成的环状结构的肽。例如，在一个实施方案中，本发明的肽包含至少一个介导环化的非常规氨基酸或化学部分。适合的非常规氨基酸或化学部分包括但不限于FA19205、FA19204、FA19203、FA03202、Hcy、hcy、Cea和c。负责环化的氨基酸或部分足够间隔开以允许形成环结构，例如所述氨基酸或部分被2、3、4、5、6、7、8或更多残基间隔。
一方面，包含式(I)-(III)结构的肽含有被至少三个氨基酸残基间隔开的至少两个半胱氨酸残基(例如，所述肽含有两个半胱氨酸残基)，使得所述半胱氨酸形成分子内二硫键。在一些情况下，半胱氨酸被超过三个氨基酸残基间隔开。例如，在包含式(I)、(II)或(III)结构的肽中，X1000、X1001、X1003、X1004、X1005、X1006、X1010、X1011、X1013、X1014、X1017、X1018、X1020和X1021中的任何两个任选是能够形成二硫桥的半胱氨酸。因此，在一些方面，所述肽包含两个半胱氨酸残基：X1000、X1005、X1010和X1014之一是半胱氨酸，并且X1006、X1010、X1017和X1021之一是半胱氨酸。本发明涵盖半胱氨酸对的所有可能组合，例如X1000和X1006是C；X1000和X1010是C；X1000和X1017是C；X1005和X1017是C；X1010和X1017是C；X1010和X1021是C；或X1014和X1021是C。本发明的其他示例性环状肽包括例如JBT2441、JBT2450、JBT2466-JBT2469、JBT2489-JBT2495、JBT2497-JBT2499和JBT2513-JBT2518(分别是SEQ ID NO：4159、4167、4181-4184、4204-4210、4212-4214和4228-4233)。
本发明还提供了结合TFPI的肽，所述肽包含式(V)结构：X2001-X2002-X2003-X2004-X2005-X2006-[X2007-X2008-X2009-X2010-X2011-X2012-X2013-X2014-X2015-X2016-X2017-X2018]-X2019-X2020-X2021-X2022-X2023(V)(SEQ ID NO：3118)，其中所述肽形成通过X2007和X2018之间的键、例如二硫键(表示为式(V)内的括号)产生的环状结构。在式(V)中，X2001、X2002和X2023独立地存在或不存在。当存在时，X2001是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、G、H、I、K、L、P、R、S、T、V和W；X2002是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T、V和W；和X2023是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V、W和Y。此外，X2003是选自由以下组成的组的氨基酸：A、F、I、K、L、R、S、T、V、W和Y；X2004是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V和W；X2005是W；X2006是选自由以下组成的组的氨基酸：F、H、I、K、L、R、V和W；X2007是选自由以下组成的组的氨基酸：C、Hcy、Dap和K(例如，C或Hcy)；X2008是选自由以下组成的组的氨基酸：A、G、R、S和T；X2009是选自由以下组成的组的氨基酸：a、A、I、K、L、M、m、Nle、p、R、Sem和V；X2010是选自由以下组成的组的氨基酸：A、G、I、K、L、P、R、S、T和V；X2011是选自由以下组成的组的氨基酸：D、E、G、S和T；X2012是选自由以下组成的组的氨基酸：A、a、D、d、E、e、F、f、G、I、K、k、L、l、M、m、Nle、nle、P、p、R、r、S、s、Sem、T、t、V、v、W和w；X2013是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、d、E、e、F、G、I、K、L、R、S、s、T、V和W；X2014是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、M、R、S、T、V和W；X2015是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、M、Nle、R、S、T、V和W；X2016是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、I、K、L、M、Nle、R、S、Sem、T、V、W和Y；X2017是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V、W和Y；X2018是选自由以下组成的组的氨基酸：C和D(例如，X2018是C)；X2019是选自由以下组成的组的氨基酸：A、F、I、L、S、T、V和W；X2020是选自由以下组成的组的氨基酸：F和W；X2021是选自由以下组成的组的氨基酸：I、L和V；并且X2022是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、P、R、S、T、V和W。
在一些情况下，本发明的肽包含式(V)结构，X2001任选是选自由A、D、F、G、H、K、L、P和S组成的组的氨基酸，例如选自由A、D、F、G、H、K、L和S组成的组的氨基酸(当X2001存在时)；X2002任选是选自由A、D、F、G、H、K、L、P、R和S组成的组的氨基酸，例如选自由A、F、H、K、L、M、R和S组成的组的氨基酸(例如H、F、M或R)(当X2002存在时)；X2003任选是选自由A、F、K、L、S和Y组成的组的氨基酸，例如选自由F、S和Y组成的组的氨基酸(例如F或Y)；X2004任选是选自由A、D、F、G、K、L和S组成的组的氨基酸(例如K)；X2005任选是W；X2006任选是选自由F、H、K和L组成的组的氨基酸(例如F或H)；X2007任选是选自由C和HcY组成的组的氨基酸(例如X2007是C)；X2008任选是选自由A、G和S组成的组的氨基酸；X2009任选是选自由a、A、K、L、V、M、m、Nle、Sem和p组成的组的氨基酸，例如选自由M、Nle、p和V组成的组的氨基酸(例如M、Sem或V)；X2010任选是选自由A、G、K、L、P、R和S组成的组的氨基酸，例如选自由A、K、L、P、R和S组成的组的氨基酸(例如K、P或R)；X2011任选是选自由D、G和S组成的组的氨基酸(例如D或S)；X2012任选是选自由A、a、D、d、F、f、G、K、k、L、l、M、m、Nle、P、S和s组成的组的氨基酸，例如选自由D、d、F、f、G、K、k、L、l、M、Nle、P、S和Sem组成的组的氨基酸(例如选自由F、L、l、Sem和M组成的组的氨基酸)；X2013任选是选自由A、D、d、F、G、K、L、S和s组成的组的氨基酸，例如选自由A、D、F、G、K、L和S组成的组的氨基酸(例如D、G、K或S)；X2014任选是选自由D、F、G、K、L和S组成的组的氨基酸(例如D或G)；X2015任选是选自由A、D、F、G、I、K、L、M、Nle、S和T组成的组的氨基酸(例如I或T)；X2016任选是选自由D、F、K、L、M、Nle、S和Y组成的组的氨基酸，例如选自由D、F、K、L、M、Nle、S、Sem和Y组成的组的氨基酸(例如D、F、M、Sem或Y)；X2017任选是选自由A、D、F、G、K、L、S、T和Y组成的组的氨基酸(例如S或T)；X2018任选是C；X2019任选是选自由A、F、L、S和V组成的组的氨基酸(例如A或V)；X2020任选是选自由F和W组成的组的氨基酸(例如W)；X2021任选是选自由L和V组成的组的氨基酸(例如V)；X2022任选是选自由A、D、F、G、K、L、P、R、S和W组成的组的氨基酸，例如选自由A、F、G、K、L、P、R、S和W组成的组的氨基酸(例如选自由F、L、K、R、P和W组成的组的氨基酸)；并且X2023任选是选自由A、D、F、G、K、L、M、S和Y组成的组的氨基酸，例如选自由A、D、F、G、L M、S和Y组成的组的氨基酸(例如选自由A、D、F、M、S和Y组成的组的氨基酸)(当X2023存在时)。
本发明还提供了结合TFPI的肽，所述肽包含式(VI)结构：X2001-X2002-F/Y-K-W-F/H-[C-X2008-M/V-X2010-D-X2012-X2013-G-I/T-X2016-S/T-C]-A/V-W-V-X2022-X2023(VI)(SEQ ID NO：3119)。在包含式(VI)结构的肽中，X2001、X2002和X2023各自独立地存在或不存在。如果X2001、X2002和/或X2023存在，X2001、X2002和X2023的任何一个独立选自任何氨基酸。此外，X2008、X2010、X2012、X2013、X2016和X2022各自独立选自任何氨基酸。
在一些方面，在式(VI)的肽中，X2001任选是选自由A、D、E、F、G、H、I、K、L、P、R、S、T、V和W组成的组的氨基酸，例如选自由A、D、F、G、H、K、L、P和S组成的组的氨基酸(例如选自由A、D、F、G、H、K、L和S组成的组的氨基酸)(当X2001存在时)；X2002任选是选自由A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T、V和W组成的组的氨基酸，例如选自由A、D、F、G、H、K、L、M、P、R和S组成的组的氨基酸(例如选自由A、F、H、K、L、M、R和S例如H、F、M或R组成的组的氨基酸)(当X2002存在时)；X2008任选是选自由A、G、R、S和T组成的组的氨基酸，例如选自由A、G和S组成的组的氨基酸；X2010任选是选自由A、G、I、K、L、P、R、S、T和V组成的组的氨基酸，例如选自由A、G、K、L、P、R和S组成的组的氨基酸(例如，选自由A、K、L、P、R和S例如K、P或R组成的组的氨基酸)；X2012任选是选自由A、a、D、d、E、e、F、f、G、I、I、K、k、L、l、M、m、Nle、nle、P、p、R、r、S、s、Sem、T、t、V、v、W和w组成的组的氨基酸，例如选自由A、a、D、d、F、f、G、K、k、L、l、M、m、Nle、P、S、s和Sem组成的组的氨基酸(例如，选自由D、d、F、f、G、K、k、L、l、M、Nle、P、S和Sem例如F、L、l、Sem或M组成的组的氨基酸)；X2013任选是选自由A、D、d、E、e、F、G、I、K、L、R、S、s、T、V和W组成的组的氨基酸，例如选自由A、D、d、F、G、K、L、S和s组成的组的氨基酸(例如，选自由A、D、F、G、K、L和S例如D、G、K或S组成的组的氨基酸)；X2016任选是选自由A、D、E、F、I、K、L、M、Nle、R、S、Sem、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由D、F、K、L、M、Nle、S、Sem和Y组成的组的氨基酸(例如，选自由D、F、K、L、M、Nle、S和Sem例如F、Sem或M组成的组的氨基酸)；X2022任选是选自由A、D、E、F、G、I、K、L、P、R、S、T、V和W组成的组的氨基酸，例如选自由A、D、F、G、K、L、P、R、S和W组成的组的氨基酸(例如，选自由A、F、G、K、L、P、R、S和W例如F、L、K、R、P或W组成的组的氨基酸)；和/或X2023任选是选自由A、D、E、F、G、I、K、L、R、M、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由A、D、F、G、K、L、M、S和Y组成的组的氨基酸(例如，选自由A、D、F、G、L M、S和Y例如A、D、F、M、S或Y组成的组的氨基酸)(当X2023存在时)。
一方面，本发明的TFPI结合肽包含与式VII序列：Ac-FYYKWH[CGMRDMKGTMSC]AWVKF-NH2(VII)(SEQ ID NO：1040)具有至少60％同一性(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性)的氨基酸序列。任选地，所述肽包含本文定义的式(V)-(VII)的氨基酸序列或由其组成。本发明还包括含有选自由SEQ ID NO：1001-1293组成的组的氨基酸序列或由其组成的肽(例如，包含选自由SEQ ID NO：1001-1212和1290-1291(例如SEQ ID NO：1001-120、1290或1291)组成的组和/或选自由SEQ ID NO：1213-1289组成的组和/或选自由1292和1293组成的组的氨基酸序列或由其组成的肽)。本发明还包括包含选自由SEQ ID NO：1337-1355和4240-4268组成的组的氨基酸序列(或由其组成)的肽(JBT0496、JBT1165、JBT2330-JBT2338、JBT2341、JBT2342、JBT2346-2348、JBT2356、JBT2457、JBT2538、JBT2519-JBT2523、JBT2527-JBT2529、JBT2531-JBT2534、JBT2537、JBT2539-JBT2541、JBT2543-JBT2555)。
本发明还提供了TFPI结合肽，该TFPI结合肽包含式(VIII)结构：X3001-X3002-X3003-X3004-X3005-X3006-X3007-X3008-X3009-X3010-X3011-X3012-X3013-X3014-X3015-X3016-X3017-X3018-X3019-X3020-X3021(VIII)(SEQ ID NO：3120)的至少氨基酸3-21(X3003-X3021)。在式(VIII)中，X3001和X3002独立存在或不存在于所述肽中。如果存在，X3001是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、D、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、E、H和Y；并且X3002是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、D、F、H、K、M、N、P、R、S、T、W、Y、G、I和L。此外，X3003是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W和Y；X3004是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y和P；X3005是选自由以下组成的组的氨基酸：C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W和Y；X3006是选自由以下组成的组的氨基酸：A、W、C、K、P、R和H；X3007是选自由以下组成的组的氨基酸：Q、A、C、F、G、H、I、K、L、N、R、S、T、W和Y；X3008是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y和I；X3009是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、F、G、H、I、L、M、R、S、T、V、W、Y和K；X3010是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y；X3011是选自由以下组成的组的氨基酸：A、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y、C、F和H；X3012是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、H、I、K、L和R；X3013是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、F、G、H、K、L、M、R、S、V、W、Y和I；X3014是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、F、G、H、I、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y和K；X3015是选自由以下组成的组的氨基酸：A、K和R；X3016是选自由以下组成的组的氨基酸：A、F、K和R；X3017是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W、Y、H、A和M；X3018是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、F、I、K、L、M、Q、R、V、W和Y；X3019是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、D、E、F、G、H、K、L、N、P、Q、R、V、W、Y和I；X3020是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、V、W、Y、I和P；并且X3021是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、Y、F和G。
在本发明的一些方面中，肽包含式(VIII)的序列，其中X3001任选是选自由A、C、D、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、E、H和Y组成的组的氨基酸，例如选自由A、C、D、G、K、L、M、N、P、R、S、T、E、H和Y组成的组的氨基酸(当X3001存在时)；X3002任选是选自由C、F、H、K、R、S、W、Y、G、I和L组成的组的氨基酸，例如选自由C、K、R、W、Y、G、I和L组成的组的氨基酸(当X3002存在时)；X3003任选是选自由A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T和W组成的组的氨基酸，例如选自由A、C、G、H、I、K、L、M、R、S、T和W组成的组的氨基酸；X3004任选是选自由A、C、D、G、H、I、K、L、M、N、R、S、T、V和P组成的组的氨基酸，例如选自由A、C、G、H、I、K、L、M、N、R、S、T和P组成的组的氨基酸；X3005任选是选自由C、F、H、I、K、M、R、T、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由C、F、H、K、R和W组成的组的氨基酸；X3006任选是选自由P、H和A组成的组的氨基酸；X3007任选是选自由C、G、R、W、A和L组成的组的氨基酸，例如选自由L、C、R和W组成的组的氨基酸；X3008任选是选自由A、C、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、Y和I组成的组的氨基酸，例如选自由A、C、F、H、K、R、V、W、Y和I组成的组的氨基酸；X3009任选是选自由C、I、R、V和K组成的组的氨基酸，例如选自由C、R、V和K组成的组的氨基酸；X3010任选是选自由A、C、G、H、I、K、L、M、Q、R、S和T组成的组的氨基酸，例如选自由A、C、K、L、Q、R和S组成的组的氨基酸；X3011任选是选自由A、I、K、L、M、R、S、V、W、C、F和H组成的组的氨基酸，例如选自由I、K、L、M、R、V、W、C、F和H组成的组的氨基酸；X3012任选是选自由H和R(例如H)组成的组的氨基酸；X3013任选是选自由C、F、K、L、M、R、V和I组成的组的氨基酸，例如选自由C、K、R、V和I组成的组的氨基酸；X3014任选是选自由A、M、C、F、H、I、L、N、R、S、V、W和K组成的组的氨基酸，例如选自由A、S、C、F、H、I、R和K组成的组的氨基酸；X3015任选是K或R；X3016任选是K或R；X3017任选是选自由A、C、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W、H、A和M组成的组的氨基酸，例如选自由C、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、H、A和M组成的组的氨基酸；X3018任选是选自由A、K、C、I、L、R和W(例如K、C、I、R或W)组成的组的氨基酸；X3019任选是选自由A、C、E、H、K、N、Q、R和I组成的组的氨基酸，例如选自由C、E、H、K、R和I组成的组的氨基酸；X3020任选是选自由C、H、L、M、R、V、I和P(例如C、M、I或P)组成的组的氨基酸；并且X3021任选是选自由A、C、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W、Y、F和G组成的组的氨基酸，例如选自由A、C、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W、F和G组成的组的氨基酸。
本发明还提供了结合TFPI并且包含式(IX)结构：X3001-X3002-X3003-X3004-X3005-X3006-X3007-X3008-X3009-X3010-X3011-H-X3013-X3014-K/R-R-X3017-X3018-X3019-X3020-X3021(IX)(SEQ ID NO：3121)的至少氨基酸3-21(X3003-X3021)的肽。在式(IX)中，X3001和X3002独立存在或不存在于所述肽中。如果存在，X3001和/或X3002独立选自任何氨基酸。同样，X3003、X3004、X3005、X3006、X3007、X3008、X3009、X3010、X3011、X3013、X3014、X3017、X3018、X3019、X3020和X3021各自独立选自任何氨基酸。当存在时，X3001任选是选自由A、C、D、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、E、H和Y组成的组的氨基酸，例如选自由A、C、D、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、E、H和Y组成的组的氨基酸(例如选自由A、C、D、G、K、L、M、N、P、R、S、T、E、H和Y组成的组的氨基酸)。同样，当存在时，X3002任选是选自由A、C、D、F、H、K、M、N、P、R、S、T、W、Y、G、I和L组成的组的氨基酸，例如选自由C、F、H、K、R、S、W、Y、G、I和L组成的组的氨基酸(例如选自由C、K、R、W、Y、G、I和L组成的组的氨基酸)。还是就式(IX)而言，X3003任选是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T和W组成的组的氨基酸(例如选自由A、C、G、H、I、K、L、M、R、S、T和W组成的组的氨基酸)；X3004任选是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y和P组成的组的氨基酸，例如选自由A、C、D、G、H、I、K、L、M、N、R、S、T、V和P组成的组的氨基酸(例如选自由A、C、G、H、I、K、L、M、N、R、S、T和P组成的组的氨基酸)；X3005任选是选自由C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由C、F、H、I、K、M、R、T、W和Y组成的组的氨基酸(例如选自由C、F、H、K、R和W组成的组的氨基酸)；X3006任选是选自由A、W、C、K、P、R和H组成的组的氨基酸，例如选自由P、H和A组成的组的氨基酸；X3007任选是选自由Q、A、C、F、G、H、I、K、L、N、R、S、T、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由C、G、R、W、A和L组成的组的氨基酸(例如L、C、R或W)；X3008任选是选自由A、C、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y和I组成的组的氨基酸，例如选自由A、C、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、Y和I组成的组的氨基酸(例如选自由A、C、F、H、K、R、V、W、Y和I组成的组的氨基酸)；X3009任选是选自由A、C、F、G、H、I、L、M、R、S、T、V、W、Y和K组成的组的氨基酸，例如选自由C、I、R、V和K(例如C、R、V或K)组成的组的氨基酸；X3010任选是选自由A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由A、C、G、H、I、K、L、M、Q、R、S和T组成的组的氨基酸(例如选自由A、C、K、L、Q、R和S组成的组的氨基酸)；X3011任选是选自由A、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y、C、F和H组成的组的氨基酸，例如选自由A、I、K、L、M、R、S、V、W、C、F和H组成的组的氨基酸(例如选自由I、K、L、M、R、V、W、C、F和H组成的组的氨基酸)；X3013任选是选自由A、C、F、G、H、K、L、M、R、S、V、W、Y和I组成的组的氨基酸，例如选自由C、F、K、L、M、R、V和I组成的组的氨基酸(例如C、K、R、V或I)；X3014任选是选自由A、C、F、G、H、I、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y和K组成的组的氨基酸，例如选自由A、M、C、F、H、I、L、N、R、S、V、W和K组成的组的氨基酸(例如选自由A、S、C、F、H、I、R和K组成的组的氨基酸)；X3017任选是选自由A、C、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W、Y、H、A和M组成的组的氨基酸，例如选自由A、C、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W、H、A和M组成的组的氨基酸(例如选自由C、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、H、A和M组成的组的氨基酸)；X3018任选是选自由A、C、F、I、K、L、M、Q、R、V、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由A、K、C、I、L、R和W(例如K、C、I、R或W)组成的组的氨基酸；X3019任选是选自由A、C、D、E、F、G、H、K、L、N、P、Q、R、V、W、Y和I组成的组的氨基酸，例如选自由A、C、E、H、K、N、Q、R和I(例如C、E、H、K、R或I)组成的组的氨基酸；X3020任选是选自由A、C、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、V、W、Y、I和P组成的组的氨基酸，例如选自由C、H、L、M、R、V、I和P(例如C、M、I或P)组成的组的氨基酸；和/或X3021任选是选自由A、C、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、Y、F和G组成的组的氨基酸，例如选自由A、C、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W、Y、F和G组成的组的氨基酸(例如选自由A、C、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W、F和G组成的组的氨基酸)。
在一些方面，本发明的TFPI结合肽包含与式(X)：Ac-GYASFPWFVQLHVHKRSWEMA-NH2(X)(SEQ ID NO：223)序列具有至少60％同一性(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性)的氨基酸序列。任选地，所述肽包含本文定义的式(VIII)-(IX)的氨基酸序列或由其组成。如本文使用的，“至少60％同一性”和类似的术语涵盖从例如60％到100％的任何整数，例如60％、61％、62％等。而且，术语“至少[百分比]同一性”涵盖大于或等于同一的氨基酸数除以本发明肽的氨基酸总数的任何百分比([至少百分比同一性]≥[同一的氨基酸数]/[本发明肽的氨基酸总数])。
本发明还包括含有选自由SEQ ID NO：2001-2498组成的组的氨基酸序列或由其组成的肽(例如，包含选自由SEQ ID NO：2001-2296和2498组成的组(例如SEQ ID NO：2001-2126、2128-2296或2498)和/或选自由SEQ ID NO：2297-2497组成的组(例如SEQ ID NO：2298-2497))的氨基酸序列或由其组成的肽)。本发明还提供含有选自由SEQ ID NO：3001-3108组成的组的氨基酸序列或由其组成的肽(例如，包含选自由SEQ ID NO：3001-3064组成的组(例如SEQ ID NO：3001-3048、3051-3053、3055或3057-3064)和/或选自由SEQ ID NO：3065-3084组成的组(例如SEQ ID NO：3066-3084)和/或选自由SEQ ID NO：3085-3108组成的组的氨基酸序列或由其组成的肽)。
在一些方面，SEQ ID NO：1-7的肽还包含在SEQ ID NO：1-7的N或C末端连接的一个或多个氨基酸。例如，本发明包括含有下列氨基酸序列或由其组成的肽：JBT0047、JBT0051、JBT0055、JBT0131、JBT0132、JBT0133、JBT0155、JBT0158、JBT0162、JBT0163、JBT0164、JBT0166、JBT0169、JBT0170、JBT0171、JBT0174、JBT0175或JBT0293，其所有序列都包含SEQID NO：1的氨基酸序列。包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的示例性肽包括含有下列氨基酸序列或由其组成的肽：JBT0294、JBT0295、JBT0296、JBT0297、JBT0298、JBT0299、JBT0300、JBT0301、JBT0302、JBT0303、JBT0304、JBT0305、JBT0306、JBT0307、JBT0308、JBT0309、JBT0310或JBT0311。包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的示例性肽含有下列氨基酸序列或由其组成：JBT0049、JBT0053、JBT0057、JBT0190、JBT0193或JBT0197。本发明还包括含有下列氨基酸序列或由其组成的肽：JBT0050、JBT0054、JBT0058、JBT0129、JBT0130、JBT0205、JBT0208、JBT0211、JBT0212、JBT0217、JBT0218或JBT0219，其所有序列都包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。包含SEQ ID NO：5的示例性肽包括含有下列氨基酸序列或由其组成的那些肽：JBT0101、JBT0052、JBT0103、JBT0178或JBT0182。本发明还包括含有下列氨基酸序列或由其组成的肽：JBT0120、JBT0124、JBT0247、JBT0248、JBT0251或JBT0252，其每一个都包括SEQ ID NO：6的氨基酸序列。本发明还提供包括SEQ ID NO：7的氨基酸序列的肽，例如，含有下列氨基酸序列或由其组成的肽：JBT0122、JBT0126、JBT0221、JBT0224、JBT0225、JBT0226、JBT0228、JBT0232或JBT0233。本文描述的肽显示在实施例1的表5中和图12-18中。
本发明还包括TFPI结合肽，包含式(XI)结构：X4001-Q-X4003-X4004-X4005-X4006-X4007-X4008-X4009-X4010-X4011-X4012-X4013-X4014-R-X4016-X4017-X4018-X4019-X4020(XI)(SEQ ID NO：3151)。就式(XI)而言，X4001是选自由以下组成的组的氨基酸：F、L、M、Y、1Ni、Thi、Bta和Dopa(例如，F、Y、1Ni、Bta或Dopa)；X4003是选自由以下组成的组的氨基酸：C、D、E、M、Q、R、S、T、Ede(O)和Cmc(例如，D、E或S)；X4004是选自由以下组成的组的氨基酸：Aib、E、G、I、K、L、M、P、R、W和Y(例如K)；X4005是选自由以下组成的组的氨基酸：a、A、Aib、C、D、d、E、G、H、K、k、M、N、Nmg、p、Q、R、N丙基G、aze、pip、tic、oic、hyp、nma、Ncg、Abg、Apg、thz和dtc(例如p、Nmg、N丙基G、aze、pip、tic、oic或hyp)；X4006是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、C(NEM)、D、E、G、H、K、M、N、Q、R、S、V、Cit、C(Acm)、Nle、I、Ede(O)、Cmc、Ecl、Eea、Eec、Eef、Nif和Eew(例如C、E、K、R、S、V、C(Acm)、Nle、C(NEM)、I或Cit)；X4007是选自由以下组成的组的氨基酸：I、V、T、Chg、Phg和Tle(例如，V或Tle)；X4008是选自由以下组成的组的氨基酸：F、H、1Ni、2Ni、Pmy和Y(例如，H、1Ni、2Ni或Pmy)；X4009是选自由以下组成的组的氨基酸：Aib、V、Chg、Phg、Abu、Cpg、Tle和L-2-氨基-4,4,4-三氟丁酸(例如，V、Abu或Tle)；X4010是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、D、d、E、F、H、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、Nmd和C(NEM)(例如，D、P、C或T)；X4011是选自由以下组成的组的氨基酸：A、a、G、p、Sar、c和hcy(例如，G、a、c、hcy或Sar)；X4012是选自由以下组成的组的氨基酸：Y、Tym、Pty、Dopa和Pmy(例如，Y)；X4013是选自由以下组成的组的氨基酸：C、F、1Ni、Thi和Bta(例如，F、1Ni或Bta)；X4014是选自由以下组成的组的氨基酸：A、Aib、C、C(NEM)、D、E、K、L、M、N、Q、R、T、V和Hcy(例如，Aib、C、E或Hcy)；X4016是选自由以下组成的组的氨基酸：L、Hcy、Hle和Aml；X4017是选自由以下组成的组的氨基酸：A、a、Aib、C、c、Cha、Dab、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、Nle、Nva、Opa、Orn、R、S、Deg、Ebc、Eca、Egz、Aic、Apc和Egt(例如，A、Aib、C、c、Aic、Eca或Deg)；X4018是选自由以下组成的组的氨基酸：A、Aib、Hcy、hcy、C、c、L、Nle、M、N和R(例如，A、Aib、C、c、L或Hcy)；X4019是选自由以下组成的组的氨基酸：K、R和Har(例如，K)；并且X4020是选自由以下组成的组的氨基酸：K、L、Hcy和Aml(例如，L、Aml和Hcy)。
式(XI)的TFPI结合肽不包含式(XII)结构：X5001-Q-X5003-X5004-X5005-X5006-I/V-X5008-Aib/V-X5010-G-Y-X5013-X5014-R-L-X5017-X5018-K-K/L(XII)(SEQ ID NO：3152)。在式(XII)中，X5001是选自由以下组成的组的氨基酸：F、L、M和Y；X5003是选自由以下组成的组的氨基酸：C、D、E、M、Q、R、S和T；X5004是选自由以下组成的组的氨基酸：E、G、I、K、L、M、P、R、W和Y；X5005是选自由以下组成的组的氨基酸：a、A、Aib、C、D、d、E、G、H、K、k、M、N、Nmg、Q、R和p；X5006是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、D、E、G、H、K、M、N、Q、R、S和V；X5008是选自由以下组成的组的氨基酸：F、H和Y；X5010是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、D、E、F、H、D、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y；X5013是选自由以下组成的组的氨基酸：Aib、C和F；X5014是选自由以下组成的组的氨基酸：A、Aib、C、D、E、K、L、M、N、Q、R、T和V；X5017是选自由以下组成的组的氨基酸：A、Aib、C、Cha、Dab、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、Nle、Nve、Opa、Orn、R和S；并且X5018是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、L、M、N和R。
一方面，本文描述的TFPI结合肽还包含N末端氨基酸或部分。例如，式(XI)的TFPI结合肽还包含与X4001连接的N末端氨基酸和/或部分，或式(XIII)和(XIV)(下文描述)的X6001和/或X7001与N末端氨基酸或部分连接。N末端氨基酸和/或部分任选选自由以下组成的组：FAM-Ttds、脯氨酸-谷氨酸标签(“PE”)、Palm、2-苯基乙酰基、3-苯基丙酰基、2-(萘-2-基)乙酰基、己酰基、2-甲基丙酰基、3-甲基丁酰基、2-萘基磺酰基、乙酰基、Con、Con(Meox)、AOA、Oxme-AOA、Meox-Lev、乙酰丙酸(Lev)和戊炔酸(Pyn)和1-萘基磺酰基。可选地或附加地，TFPI结合肽(例如，式(XI)、式(XIII)和/或式(XIV)的TFPI结合肽)还包含与C末端氨基酸(例如，X4020、X6020或X7022或X7023)连接的一个或多个氨基酸和/或部分。C末端氨基酸和/或部分任选选自由以下组成的组：C、c、C(NEM)、K(Ttds-马来酰亚胺基丙酰基(EtSH))、FA19205、FA19204、FA19203、FA03202、K(Tdts-马来酰亚胺)、K(AOA)、Cea和酰胺。可选地，C末端氨基酸和/或部分还选自由以下组成的组：Eag、Con、Con(Meox)、Hly、K、Orn、Dab、Dap、Hcy、Pen、K(Myr)、K(Ttds-Myr)、K(Ttds-Palm)、K(Ttds-Ac)、K(Ttds-γGlu-Myr)、K(AlbuTag)和K(4PBSA)。在式(XI)上下文中，C末端氨基酸和/或部分在这里被命名为X4021。在式(XIII)和(XIV)上下文中，C末端氨基酸和/或部分被分别命名为X6021和X7024。
在一个实施方案中，所述肽包含X4018和X4021之间形成的环状结构。在这点上，X4018任选为C或c，并且X4021任选为Cea。在另一实施方案中，所述肽包含X4011和X4014之间形成的环状结构。在这点上，X4011任选为c或hcy，并且X4014任选为C或Hcy。
本发明还包括由选自由SEQ ID NO：4022、4024、4032、4036-4047、4049-4078、4086-4097、4100-4127、4129-4170、4173-4195、4200-4214、4217-4225、4228、4230、4231、4238和4239组成的组的氨基酸序列组成的肽，以及由选自由SEQ ID NO：1294-1336、4002、4013、4021、4023、4025-4031、4033-4035、4048、4079-4085、4098、4099、4128、4171、4172、4196-4199、4215、4216、4226、4277、4229、4232和4233组成的组的氨基酸序列组成的肽。
在某些实施方案中，本发明的肽包含以下氨基酸序列或由其组成：JBT0047、JBT0049、JBT0101、JBT0120或JBT0122或本文描述的本发明肽的任何一个(例如，包含SEQID NO：1-3108的任一个的氨基酸序列或由其组成的肽，例如包含SEQ ID NO：8-741、744-968、971-978、1001-1210、1213-1289、1290-1293、2001-2126、2128-2296、2298-2498、3001-3048、3051-3053、3055、3057-3064和3067-3108的任一个的氨基酸序列或由其组成的肽；包含SEQ ID NO：4022、4024、4032、4036-4047、4049-4078、4086-4097、4100-4127、4129-4170、4173-4195、4200-4214、4217-4225、4228、4230、4231、4238和4239的任一个的氨基酸序列或由其组成的肽；或包含选自由SEQ ID NO：1294-1336、4002、4013、4021、4023、4025-4031、4033-4035、4048、4079-4085、4098、4099、4128、4171、4172、4196-4199、4215、4216、4226、4277、4229、4232和4233组成的组的氨基酸序列或由其组成的肽)或包含选自由SEQ ID NO：1337-1355、3146-3154和4240-4268组成的组的氨基酸序列或由其组成的肽或前述任何一个的变体。“变体”是指相对于亲本氨基酸序列包含一个或多个氨基酸取代、氨基酸缺失或氨基酸添加的肽。变体包括但不限于与本文提供的氨基酸序列的任何一个具有至少60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性、同时保留结合TFPI和/或抑制TFPI活性的能力的肽。在一个实施方案中，肽包含JBT0132、JBT0303、JBT0193、JBT0178、JBT0120或JBT0224的氨基酸序列或由其组成。
在一个方面，本发明的肽由40个或更少个氨基酸、例如35个或更少个氨基酸组成。任选地，本发明的肽由25个或更少个氨基酸、或10个或更少个氨基酸组成。在各种实施方案中，肽包含15-35个氨基酸残基(例如，15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸残基)。然而，还考虑本文描述的、包含一个或多个缺失的肽也适合本发明上下文，只要所述肽结合TFPI并任选阻断TFPI对凝血级联的抑制。在一些方面，从氨基酸序列内部、N末端和/或C末端去除氨基酸。这样的肽片段可以包含3-14个氨基酸残基(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸残基)。
任选地，本发明的肽包含不破坏所述肽结合和/或抑制TFPI的能力的一个或多个氨基酸取代(比照本文提供的任何氨基酸序列)。例如，包含选自由JBT0294、JBT0295、JBT0296、JBT0297、JBT0298、JBT0299、JBT0300、JBT0301、JBT0302、JBT0303、JBT0304、JBT0305、JBT0306、JBT0307、JBT0308、JBT0309、JBT0310或JBT0311组成的组的氨基酸序列或由其组成的肽是JBT0293的氨基酸序列(在N末端与苯丙氨酸残基和在C末端与赖氨酸残基直接连接的SEQ ID NO：1的氨基酸序列)的取代突变体(参见图4)。
氨基酸取代包括但不限于以下那些：(1)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变结合亲和力，和/或(4)提供或改变肽的其他生理化学或功能性质。在一个方面，取代是保守取代，其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基代替。具有类似侧链的氨基酸残基家族在本技术领域内已经定义，并且包括有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸和谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸)、β-支化侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)的氨基酸。但要理解，实施者不限于产生保守取代，只要所产生的肽保持完全或部分下调TFPI活性的能力。本发明还包括包含本领域公知的非典型的非天然存在的氨基酸的TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)。示例性的非天然存在的氨基酸包括鸟氨酸、瓜氨酸、羟脯氨酸、高丝氨酸、苯基甘氨酸、牛磺酸、碘酪氨酸、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、y-氨基丁酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、正亮氨酸、正缬氨酸、肌氨酸、高瓜氨酸、半胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、3-甲基氨基酸、α-C-甲基氨基酸、N-甲基氨基酸、2-氨基-异丁酸、β-高谷氨酸、β-高苯丙氨酸、β-高赖氨酸、β-高亮氨酸、β-高天冬酰胺、β-高谷氨酰胺、β-高精氨酸、β-高丝氨酸、β-高酪氨酸、β-高天冬氨酸、β-高缬氨酸、β-高天冬酰胺、(S)-环己基丙氨酸、(S)-瓜氨酸、(S)-2,4-二氨基丁酸、(S)-2,4-二氨基丁酸、(S)-二氨基丙酸、(S)-2-炔丙基甘氨酸、(S)-N(ω)-硝基-精氨酸、L-高苯丙氨酸、S)-高精氨酸、(S)-高瓜氨酸、(S)-高半胱氨酸、(S)-2-氨基-5-甲基-己酸、(S)-高赖氨酸、(S)-正亮氨酸、(S)-N-甲基丙氨酸、(S)-N-甲基-天冬氨酸、(S)-N-甲基-谷氨酸、(S)-N-甲基-苯丙氨酸、N-甲基-甘氨酸、(S)-N-甲基-赖氨酸、(S)-N-甲基-亮氨酸、(S)-N-甲基-精氨酸、(S)-N-甲基-丝氨酸、(S)-N-甲基-缬氨酸、(S)-N-甲基-酪氨酸、(S)-2-氨基-戊酸、(S)-2-吡啶基-丙氨酸、(S)-鸟氨酸、L-苯基甘氨酸、4-苯基-丁酸和硒蛋氨酸。适当时，个体氨基酸可以具有L或D立体化学，但肽中的所有氨基酸通常采用L立体化学。
本发明还包括TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)变体，所述变体包含插入本文提供的氨基酸序列内和/或与N末端或C末端相连的一个或多个氨基酸。在一个方面，所述肽还包含促进肽的合成、操作或使用的一个或多个氨基酸，包括但不限于N末端和/或C末端的一个或两个赖氨酸，以增加肽的溶解度。适当的融合蛋白包括但不限于包含与一个或多个一般不被认为是所述蛋白序列的部分的多肽、多肽片段或氨基酸连接的TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)的蛋白质。在一个方面，融合肽包含两个或多个肽的整个氨基酸序列，或者包含两个或多个肽的部分(片段)。除了本文描述的TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)的全部或部分以外，融合蛋白还任选包括包含想要的生物活性/功能的任何适当肽的全部或部分。实际上，在一些方面，TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)与例如以下的一个或多个可操作地连接：具有长循环半衰期的肽，标志蛋白，促进TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)纯化的肽，促进多聚体蛋白形成的肽序列，或前述任一种的片段。适当的融合配偶体包括但不限于His标签、FLAG标签、strep标签和myc标签。任选地，TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)与增强肽半衰期的一个或多个实体融合。可以例如通过增加TFPI结合肽的分子量以避免肾清除和/或并入nFc受体介导的再循环途径的配体来增加半衰期。在一个实施方案中，TFPI结合肽融合或化学轭合至(如下文进一步描述的)白蛋白多肽或其片段(例如，人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA))。白蛋白片段占全长白蛋白的10％、25％、50％或75％。可选地或附加地，TFPI结合肽包括当体内施用时结合白蛋白的白蛋白结合结构域或脂肪酸。白蛋白结合结构域的实例是“albu-标签”，一个衍生自4-(p-碘苯基)-丁酸的部分(Dumelin等人，Angew ChemInt Ed Engl 47：3196–3201(2008))。其他适当的融合配偶体包括但不限于脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸多聚体(PAS化)和抗体或其片段(例如，抗体的Fc部分)。
在一个实施方案中，两个或多个TFPI结合肽融合在一起、通过多聚结构域连接或通过化学键相连以产生TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)复合物。TFPI结合肽可以相同或不同。因此，本发明提供了包含任选通过一个或多个连接体连接的本文描述的肽的任何一个或由其组成的同二聚体(即，包含两个相同的TFPI结合肽的二聚体)、同多聚体(即，包含三个或多个相同的TFPI结合肽的复合物)、异二聚体(即，包含两个不同的TFPI结合肽的二聚体)和异多聚体(即，包含三个或多个TFPI结合肽的复合物，其中所述TFPI结合肽的至少两个是不同的)。
在这点上，本发明提供了包括第一肽和第二肽的肽复合物。本文描述的任何肽是肽复合物的适当亚基(例如，第一肽或第二肽)。在一些实施方案中，肽复合物包含25-100个氨基酸，例如30-80个氨基酸、30-60个氨基酸或30-50个氨基酸。第一肽和第二肽可以结合人TFPI的不同区域(表位)，并且任选地，肽复合物抑制两种或多种TFPI功能，例如但不限于TFPI与FXa的结合和TFPI与FVIIa的结合。在本发明的各种实施方案中，肽复合物介导的对至少一种TFPI(例如TFPI-1)活性的抑制水平大于第一肽或第二肽单独或组合实现的抑制水平。TFPI上不同区域(表位)可以在相同TFPI多肽上或者在不同TFPI多肽上。本文描述的单体TFPI结合肽的功能特征以及治疗和诊断应用也适用于本文描述的肽复合物。类似地，对单体TFPI结合肽修饰的描述也涉及肽复合物。
本发明提供了包括第一肽的肽复合物，所述第一肽包括式(XIII)结构：X6001-X6002-X6003-X6004-X6005-X6006-X6007-X6008-X6009-X6010-X6011-X6012-X6013-X6014-X6015-X6016-X6017-X6018-X6019-X6020(XIII)(SEQ ID NO：3153)。在式(XIII)中，
X6001是选自由F、L、M、Y、1Ni、Thi、Bta、Dopa、Bhf、C、D、G、H、I、K、N、Nmf、Q、R、T、V和W组成的组的氨基酸，例如选自由1Ni、Bta、Dopa、F、L、Y和M组成的组的氨基酸；
X6002是选自由Q、G和K例如Q组成的组的氨基酸；
X6003是选自由C、D、E、M、Q、R、S、T、Ede(O)、Cmc、A、Aib、Bhs、F、G、H、I、K、L、N、P、V、W和Y组成的组的氨基酸，例如，选自由D、E、S、M、Q、R、T和C组成的组的氨基酸；
X6004是选自由Aib、E、G、I、K、L、M、P、R、W、Y、A、Bhk、C、D、F、H、k、N、Nmk、Q、S、T和V组成的组的氨基酸，例如选自由K、Aib、L、P、R、E、G、I、Y、M和W组成的组的氨基酸；
X6005是选自由a、A、Aib、C、D、d、E、G、H、K、k、M、N、Nmg、p、Q、R、N丙基G、aze、pip、tic、oic、hyp、nma、Ncg、Abg、Apg、thz、dtc、Bal、F、L、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由p、Nmg、N丙基G、aze、pip、tic、oic、hyp、a、Aib、D、d、G、H、K、k、N、Q、R、A、E、C和M组成的组的氨基酸；
X6006是选自由A、C、C(NEM)、D、E、G、H、K、M、N、Q、R、S、V、Cit、C(Acm)、Nle、I、Ede(O)、Cmc、Ecl、Eea、Eec、Eef、Nif、Eew、Aib、Btq、F、I、L、T、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由C、E、K、R、S、V、C(Acm)、Nle、C(NEM)、I、Cit、A、D、G、H、N、Q和M组成的组的氨基酸；
X6007是选自由I、V、T、Chg、Phg、Tle、A、F、G、I、K、L、Nmv、P、Q、S、W和Y组成的组的氨基酸，例如Tle、V或I；
X6008是选自由F、H、1Ni、2Ni、Pmy、Y和W组成的组的氨基酸，例如选自由H、1Ni、2Ni、Pmy、F和Y组成的组的氨基酸；
X6009是选自由Aib、V、Chg、Phg、Abu、Cpg、Tle、L-2-氨基-4,4,4-三氟丁酸、A、f、I、K、S、T和V组成的组的氨基酸，例如V、Abu或Tle；
X6010是选自由A、C、D、d、E、F、H、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、Nmd、C(NEM)、Aib、G、I、L和Nmf组成的组的氨基酸，例如选自由D、P、C、T、A、E、K、M、N、Q、R、F、H、S、V、W和Y组成的组的氨基酸；
X6011是选自由A、a、G、p、Sar、c、hcy、Aib、C、K、G和Nmg例如G、a、c、hcy或Sar组成的组的氨基酸；
X6012是选自由Y、Tym、Pty、Dopa和Pmy例如Y组成的组的氨基酸；
X6013是选自由Aib、C、F、1Ni、Thi、Bta、A、E、G、H、K、L、M、Q、R、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由F、1Ni、Bta和C组成的组的氨基酸；
X6014是选自由A、Aib、C、C(NEM)、D、E、K、L、M、N、Q、R、T、V、Hcy、Bhe、F、G、H、I、P、S、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由Aib、C、E、Hcy、A、D、K、L、M、N、Q、R、T、V和Aib组成的组的氨基酸；
X6015是选自由R、(ω-甲基)-R、D、E和K例如R组成的组的氨基酸；
X6016是选自由L、Hcy、Hle和Aml组成的组的氨基酸，例如选自由L、Aml、Hle和Hcy组成的组的氨基酸；
X6017是选自由A、a、Aib、C、c、Cha、Dab、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、Nle、Nva、Opa、Orn、R、S、Deg、Ebc、Eca、Egz、Aic、Apc、Egt、(ω-甲基)-R、Bhr、Cit、D、Dap、E、F、G、N、Q、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由A、Aib、C、c、Aic、Eca、Deg、Cha、Dab、Dap、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、K、Nle、Nva、Opa、Orn、R、I、L、S和M组成的组的氨基酸；
X6018是选自由A、Aib、Hcy、hcy、C、c、L、Nle、M、N、R、Bal、D、E、F、G、H、I、K、Q、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由A、Aib、C、c、L、Hcy、N、M和R组成的组的氨基酸；
X6019是选自由K、R、Har、Bhk和V例如K组成的组的氨基酸；和
X6020是选自由K、L、Hcy、Aml、Aib、Bhl、C、F、G、H、I、Nml、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由L、Aml、Hcy和K组成的组的氨基酸。
可选地，第一肽包括本文描述的式(I)-(IV)和(XI)任一个的结构。在各种实施方案中，第一肽包括选自由SEQ ID NO：8-978、4022、4024、4032、4036-4047、4049-4078、4086-4097、4100-4127、4129-4170、4173-4195、4200-4214、4217-4225、4228、4230、4231、4238、4239、4002、4013、4021、4023、4025-4031、4033-4035、4048、4079-4085、4098、4099、4128、4171、4172、4196-4199、4215、4216、4226、4277、4229、4232和4233组成的组氨基酸序列(或由其组成)。
在一个方面，第二肽包括式(XIV)结构：X7001-X7002-X7003-X7004-X7005-X7006-[X7007-X7008-X7009-X7010-X7011-X7012-X7013-X7014-X7015-X7016-X7017-X7018]-X7019-X7020-X7021-X7022-X7023(XIV)(SEQ ID NO：3154)。在式(XIV)中，
X7001存在或不存在，在X7001存在的情况下，X7001是选自由A、C、C(NEM)、D、E、F、G、H、I、K、L、P、R、S、T、V和W组成的组的氨基酸，例如选自由A、D、F、G、H、K、L和S组成的组的氨基酸；
X7002存在或不存在，在X7002存在的情况下，X7002是选自由A、C、C(NEM)、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由H、F、M和R组成的组的氨基酸；
X7003是选自由A、F、I、K、L、R、S、T、V、W和Y例如F或Y组成的组的氨基酸；
X7004是选自由A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V和W例如K组成的组的氨基酸；
X7005是R或W，例如W；
X7006是选自由F、H、I、K、L、R、V和W例如F或H组成的组的氨基酸；
X7007是选自由Orn、homoK、C、Hcy、Dap和K例如C或Hcy组成的组的氨基酸；
X7008是选自由A、G、R、S和T例如A、G或S组成的组的氨基酸；
X7009是选自由a、A、I、K、L、M、m、Moo、Nle、p、R、Sem和V例如M、Sem或V组成的组的氨基酸；
X7010是选自由A、G、I、K、L、P、R、S、T和V例如K、P或R组成的组的氨基酸；
X7011是选自由D、E、G、S和T例如D组成的组的氨基酸；
X7012是选自由A、a、D、d、E、e、F、f、G、I、K、k、L、l、M、m、Moo、Nle、nle、P、p、R、r、S、s、Sem、T、t、V、v、W和w组成的组的氨基酸，例如选自由F、L、l、M和Sem组成的组的氨基酸；
X7013是选自由A、C、C(NEM)、Con、Con(Meox)、D、d、E、e、Eag、F、G、I、K、L、N、R、S、s、T、V和W组成的组的氨基酸，例如选自由D、G、K和S组成的组的氨基酸；
X7014是选自由A、D、E、F、G、I、K、L、M、R、S、T、V和W例如G组成的组的氨基酸；
X7015是选自由A、D、E、F、G、I、K、L、M、Nle、R、S、T、V和W例如I或T组成的组的氨基酸；
X7016是选自由A、D、E、F、I、K、L、M、Moo、Nle、R、S、Sem、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由D、F、M、Sem和Y组成的组的氨基酸；
X7017是选自由A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V、W和Y例如S或T组成的组的氨基酸；
X7018是选自由C和D例如C组成的组的氨基酸；
X7019是选自由A、F、I、L、S、T、V和W例如A或V组成的组的氨基酸；
X7020是选自由F和W例如W组成的组的氨基酸；
X7021是选自由I、L和V例如V组成的组的氨基酸；
X7022是选自由A、D、E、F、G、I、K、L、P、R、S、T、V和W组成的组的氨基酸，例如选自由F、L、K、R、P和W组成的组的氨基酸；
X7023存在或不存在，在X7023存在的情况下，X7023是选自由A、C、C(NEM)、Con、Con(Meox)、D、E、Eag、F、G、I、K、L、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，例如选自由A、D、F、M、S和Y组成的组的氨基酸；并且所述肽包括通过X7007和X7018之间连接产生的环状结构。
可选地，第二肽包含本文所述式(V)-(VII)任一个的结构。在一些实施方案中，第二肽包含选自由SEQ ID NO：1001-1336组成的组的氨基酸序列(或由其组成)。虽然式(XIII)和式(XIV)的肽在本文被称为复合物的第一肽和第二肽，还考虑具有式(XIII)或式(XIV)结构的单体肽。
结合不同TFPI表位的TFPI结合肽的实例包括JBT0047类肽(表示为例如式(I)-(IV)和(XI)，其实例示于图32、62和65)的实例JBT1857和JBT0120类肽(表示为例如式(V)-(VII)，其实例示于图34)的实例JBT1837。因此，在一个方面，本发明提供了包括肽亚基(例如，第一肽)的肽复合物，所述肽亚基包含与SEQ ID NO：178(JBT1857)或SEQ ID NO：4261(JBT2548)至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。此外，本发明提供了包括肽亚基(例如，第二肽)的肽复合物，所述肽亚基包含与SEQ ID NO：1044(JBT1837)至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。示例性TFPI结合肽二聚体包括JBT2496(SEQ ID NO：4211)、JBT2547(SEQ ID NO：4260)、JBT2521(SEQ ID NO：4242)、JBT2522(SEQ ID NO：4243)、JBT2523(SEQ ID NO：4244)和JBT2533(SEQID NO：4250)。
在本公开的各个方面，肽复合物的肽亚基(例如，第一肽和第二肽)直接融合在一起或者通过连接体部分连接。例如，通过一个肽上的亲核反应性部分与另一个肽上的亲电反应性部分反应或者通过氧化形成二硫化物而使第一肽和第二肽轭合在一起。在示例性实施方案中，第一肽和第二肽通过酰胺键连接，所述酰胺键例如在一个肽上的胺与另一个肽上的羧基反应后形成的酰胺键。要理解，任选地在轭合之前用衍生化剂使肽衍生化。
在一些实施方案中，第一肽和第二肽(和任选其他肽)通过连接体部分连接。任何连接体部分适合用于肽复合物的上下文。在本发明的一些方面，连接体部分在其构象之一中桥接距离约至约例如，约至约(约至约)、约至约(约至约约至约约至约或约至约)。因此，连接体任选在其构象之一中长度为约至约例如长度为约至约或约至约还考虑更大长度(大于约)的连接体。例如，还考虑任选具有约2kDa至约60kDa分子量的生物相容性聚合物用于肽复合物。生物相容性聚合物的实例包括但不限于PEG、PSA、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸多聚体和羟乙基淀粉。
在一个非限制性实例中，连接体部分是具有至少两个(在与第一和第二肽轭合之前)能够与第一肽和第二肽的每一个反应的反应性基团。在一些实施方案中，连接体部分仅具有两个反应性基团并且是双官能的。两个反应性基团都是亲核的、都是亲电的、或者是亲核和亲电反应性基团的组合。反应性基团的非限制性组合示于图73。连接体部分可以含有化学连接产生的结构元件，例如半胱氨酸、肟、酰肼、琥珀酰亚胺、硫醚、三唑、仲胺、酰胺、二硫化物。在各种实施方案中，连接体部分通过肟、酰肼、琥珀酰亚胺、硫醚、三唑、仲胺、酰胺或二硫化物连接至第一肽和/或所述第二肽。连接体部分和反应性基团的其他描述提供于国际专利公布号WO2011/143209，其通过引用整体并入本文。
疏水连接体也适合用于本发明上下文。疏水连接体是本领域已知的。参见例如Bioconjugate Techniques，G.T.Hermanson(Academic Press，San Diego，CA，1996)，其通过引用整体并入本文。适合的疏水连接体部分包括例如8-羟基丁酸和8-巯基辛酸。亲水连接体部分、例如聚亚烷基二醇也适合用于本发明上下文。在一些实施方案中，连接体部分包含约1至约60个原子长的原子链。在一些实施方案中，链原子全部是碳原子。在一些实施方案中，连接体骨架中的链原子选自由C、O、N和S组成的组。可以根据其预期溶解度(亲水性)选择链原子和连接体，以提供更可溶的肽复合物。
一方面，连接体部分包括结构Z1-20，其中Z是寡聚体结构单元。寡聚体结构单元的实例包括但不限于氨基酸、羟酸、乙二醇、丙二醇或前述任何的组合。例如，连接体部分任选是氨基酸、二肽、三肽或含有4-20个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，Z是G、s、S、a、A、Bal、Gaba、Ahx、Ttds或前述任何的组合(例如包含A、S、或A和S组合的肽10-mer)。如果需要，连接部分包括胺、醚、硫醚、马来酰亚胺、二硫化物、酰胺、酯、烯、环烯、炔、trizoyl、氨基甲酸酯、碳酸酯、组织蛋白酶B可裂解的、或腙。
术语“第一肽”和“第二肽”不是意欲表示肽的特定物理顺序，而只是区别肽复合物的不同亚基。肽复合物的亚基可以许多构型的任何一个连接，只要第一肽和第二肽与TFPI相互作用。例如，第一肽的C末端与第二肽的N末端连接，第一肽的N末端与第二肽的C末端连接，第一(或第二)肽的N或C末端与第二(或第一)肽中的内部连接点连接，或者第一和第二肽通过内部连接点(即，位于肽的氨基酸序列内而不在N或C末端的连接点)连接。式(XIII)的第一肽中连接部分的示例性连接点是N末端氨基、C末端羧酸、X6004、X6006、X60010或X60014，经由氨基酸侧链中适当的官能团，例如但不限于胺、羧酸、硫醇、烯、炔、叠氮化物、羰基、氨基氧基、肼和卤素。可以使用超过一种连接体，例如，第一连接部分在第一肽的N末端和第二肽的C末端连接，并且第二连接部分(其可以是相同类型的部分或不同类型的部分)在第一肽的C末端连接和在第二肽的N末端连接。虽然可能的构型的讨论参考第一和第二肽，但要理解，其他肽可以如本文所述连接至第一和/或第二肽。
“衍生物”包括在本发明中，并且包括以不同于氨基酸的添加、缺失或取代的一些方式化学修饰的TFPI结合肽。在这方面，本文提供的本发明肽与聚合物、脂质、其他有机部分和/或无机部分化学键合。肽和蛋白质修饰的例子提供在Hermanson，BioconjugateTechniques，Academic Press(1996)中。本文描述的TFPI结合肽任选包含促进与另一部分(例如，肽部分)轭合的官能团。示例性官能团包括但不限于异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、NHS酯、磺酰氯、醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、芳基化剂、亚胺酯、碳二亚胺、酸酐、烷基卤衍生物(例如，卤代乙酰基衍生物)、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰基衍生物、芳基化剂、硫醇-二硫化物交换试剂(例如，吡啶基二硫化物或TNB硫醇)、二氮杂烷烃、羰二咪唑、N,N’-二琥珀酰碳酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺基氯代甲酸酯和肼衍生物。例如，马来酰亚胺用于产生在体内结合白蛋白的TFPI结合肽。
在一些情况下制备衍生物来增加溶解度、稳定性、吸收或循环半衰期。各种化学修饰消除或减少了药剂的任何不想要的副作用。在一个方面，本发明包括被共价修饰以包括一个或多个水溶性聚合物连接的TFPI结合肽。水溶性聚合物(或其他化学部分)连接至任何氨基酸残基，尽管在一些实施方案中连接至N或C末端是优选的。任选地，聚合物通过一个或多个氨基酸或结构单元连接至肽，所述氨基酸或结构单元提供促进聚合物连接的官能团。例如，JBT2315包括C末端半胱氨酸(相对于式(XI)的位置X4021)，其促进例如马来酰亚胺聚乙二醇(PEG)的添加。有用的聚合物包括但不限于PEG(例如，大小大约40kD、30kD、20kD、10kD、5kD或1kD的PEG)、聚氧乙二醇、聚丙二醇、单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、羟乙基淀粉、纤维素、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚唾液酸(PSA)、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)和聚乙烯醇，以及前述任何的混合物。在一个方面，本发明的肽是聚乙二醇化的肽。PEG部分可以不同形状获得，例如直链或支链。对于水溶性聚合物连接的进一步讨论，参见美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；和4,179,337。用于提高肽半衰期或稳定性的其他部分在本文描述并且包括例如白蛋白(任选被修饰以允许与本发明肽的轭合)、脂肪酸链(例如，C12-C18脂肪酸，例如C14脂肪酸)、抗体或其片段(例如，抗体的Fc部分)和脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸多聚体。
在另一方面，肽衍生物包括特异性针对特定细胞类型、组织和/或器官的靶向部分。可选地，肽与一个或多个有利于纯化、检测、多聚化、与相互作用配偶体结合、和表征肽活性的化学部分连接。示例性的化学部分是生物素。适合与本发明的TFPI结合肽轭合的其他部分包括但不限于光敏剂、染料、荧光染料、放射性核素、含有放射性核素的复合物、酶、毒素和细胞毒剂。光敏剂包括例如Photofrin、Visudyne、Levulan、Foscan、Metvix、CysviewTM、Laserphyrin、Antrin、Photochlor、Photosens、Photrex、Lumacan、Cevira、Visonac、BF-200ALA和Amphinex。如果需要，His标签、FLAG标签、strep标签或myc标签与肽轭合。
另外，在一个方面，本发明的肽在所述肽的N末端氨基酸处酰化。在另一个方面，本发明的肽在所述肽的C末端氨基酸处酰胺化。在又一个方面，本发明的肽在所述肽的N末端氨基酸处酰化并在所述肽的C末端氨基酸处酰胺化。
衍生物还包括含有修饰或非蛋白质氨基酸或修饰的连接体基团的肽(参见例如，Grant，Synthetic Peptides：A User’s Guide，Oxford University Press(1992))。修饰的氨基酸包括例如其中氨基和/或羧基被另一个基团代替的氨基酸。非限制性例子包括掺入硫代酰胺、脲、硫脲、酰基酰肼、酯、烯烃(olefine)、磺酰胺、磷酸酰胺、酮、醇、硼酸酰胺、苯二氮卓和其他的芳族或非芳族杂环的修饰氨基酸(参见Estiarte等人，Burgers MedicinalChemistry，第6版，第1卷，第4部分，John Wiley&Sons，New York(2002))。修饰的氨基酸经常与肽连接，以至少一个上述官能团替代酰胺键。非蛋白质氨基酸包括但不限于β-丙氨酸(Bal)、正缬氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、4-氨基丁酸(γ-Abu)、2-氨基异丁酸(Aib)、6-氨基己酸(ε-Ahx)、鸟氨酸(Orn)、羟脯氨酸(Hyp)、牛磺酸、肌氨酸、瓜氨酸(Cit)、半胱磺酸(Coh)、环己基丙氨酸(Cha)、蛋氨酸亚砜(Meo)、蛋氨酸砜(Moo)、高丝氨酸甲酯(Hsm)、炔丙基甘氨酸(Eag)、5-氟色氨酸(5Fw)、6-氟色氨酸(6Fw)、3′,4′-二甲氧基苯基-丙氨酸(Ear)、3′,4′-二氟苯丙氨酸(Dff)、4′-氟苯基-丙氨酸(Pff)、1-萘基-丙氨酸(1Ni)、1-甲基色氨酸(1Mw)、青霉胺(Pen)、高丝氨酸(Hse)、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸(Phg)、苯并噻吩基丙氨酸(Bta)、L-高半胱氨酸(Hcy)、N-甲基-苯丙氨酸(Nmf)、2-噻吩基丙氨酸(Thi)、3,3-二苯丙氨酸(Ebw)、高苯丙氨酸(Hfe)和S-苄基-L-半胱氨酸(Ece)。许多非蛋白质氨基酸的结构提供于表2。这些和其他的非蛋白质氨基酸可以作为D或L异构体存在。修饰连接体的例子包括但不限于柔性连接体4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺(Ttds)、甘氨酸、6-氨基己酸、β-丙氨酸(Bal)、戊炔酸(Pyn)、以及Ttds、甘氨酸、6-氨基己酸和Bal的组合。
构成本发明肽的氨基酸的同系物可以如表3所示。在任何实施方案中，TFPI结合肽的一个或多个氨基酸用同系物取代。
表3
衍生物还包括包含具有修饰取代基的氨基酸的肽，例如通过用例如氟、氯、碘或溴卤化修饰的氨基酸。在一些实施方案中，TFPI结合肽包括卤化的芳族氨基酸，例如苯丙氨酸。
在一些实施方案中，连接本发明肽内氨基酸的肽(CO-NH)键反向产生“反向修饰(retro-modified)”肽，即包含与参照肽相比以相反方向(NH-CO键)装配的氨基酸残基的肽。反向修饰肽包含与参照肽相同的氨基酸手性。“倒转修饰(inverso-modified)”肽是包含以与参照肽相同的方向装配的氨基酸残基，但氨基酸的手性倒转的本发明肽。因此，在参照肽包含L-氨基酸的情况下，“倒转修饰”肽包含D-氨基酸，反之亦然。倒转修饰肽包含CO-NH肽键。“反向-倒转修饰”肽指包含以相反方向装配的氨基酸残基并且具有倒转手性的肽。反向-倒转类似物具有反向的末端和反向的肽键方向(即，NH-CO)，同时大致保持参照肽中所见的侧链拓扑结构。使用标准方法制备反向-倒转拟肽，包括Meziere等人，J.Immunol.，159，3230-3237(1997)中描述的方法，其通过引用并入本文。部分反向-倒转肽是其中只有部分氨基酸序列反向并用对映异构的氨基酸残基替换的肽。
本发明的TFPI结合肽(包括TFPI抑制肽)以多种方式制备。在一个方面，所述肽通过固相合成技术合成，所述技术包括在下列文献中描述的那些：Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85，2149(1963)；Davis等人，Biochem.Intl.，10，394-414(1985)；Larsen等人，J.Am.Chem.Soc.，115，6247(1993)；Smith等人，J.Peptide Protein Res.，44，183(1994)；O’Donnell等人，J.Am.Chem.Soc.，118，6070(1996)；Stewart和Young，Solid PhasePeptide Synthesis，Freeman(1969)；Finn等人，The Proteins，第3版，第2卷，pp.105-253(1976)；和Erickson等人，The Proteins，第3版，第2卷，pp.257-527(1976)。可选地，通过向宿主细胞中引入编码TFPI结合肽(例如TFPI抑制肽)的核酸，并培养宿主细胞以表达所述肽，从而重组表达所述TFPI结合肽(例如TFPI抑制肽)。这样的肽使用标准蛋白纯化技术从细胞培养物中纯化。
本发明还涵盖包含编码本发明肽的核酸序列的核酸。DNA和/或RNA分子的制备方法在本领域中是公知的。在一个方面，使用化学合成技术和/或使用聚合酶链反应(PCR)产生编码本文提供的肽的DNA/RNA分子。如果需要，将肽编码序列并入表达载体。本领域普通技术人员将领会，本领域已知的许多表达载体中的任一种均适合本发明的上下文，例如但不限于质粒、质粒-脂质体复合物和病毒载体。这些表达载体中的任一种使用下列文献描述的标准重组DNA技术来制备：例如，Sambrook等人，Molecular Cloning，a LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates andJohn Wiley&Sons，New York，N.Y.(1994)。任选地，所述核酸与一个或多个调节序列例如启动子、激活子、增强子、帽信号、聚腺苷酸化信号或者参与转录或翻译控制的其他信号可操作地连接。
任何本发明的肽(或肽复合物)或编码所述肽的核酸还以组合物(例如药物组合物)提供。在这方面，所述肽(或肽复合物)与如本文进一步描述的生理可接受的(即药理可接受的)载体、缓冲剂、赋形剂或稀释剂一起配制。任选地，所述肽是生理可接受的盐的形式，其涵盖在本发明中。“生理可接受的盐”是指药学上可接受的任何盐。适当的盐的一些例子包括乙酸盐、盐酸盐、氢溴化物、硫酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乙醇酸酯和草酸盐。如果需要，组合物包含一种或多种另外的药学有效药剂。
本文提供的肽任选抑制至少一种TFPI-1(例如，TFPI-1α或TFPI-1β)的活性，例如但不限于下调凝血级联的活性。不受任何具体作用机制的束缚，提出的抑制机制可以包括防止四元TF-FVIIA-FXA-TFPI复合物的形成。肽可以抑制(竞争性或变构性地)TFPI与FXa结合(例如，抑制TFPI Kunitz结构域2与凝血因子Xa结合，或者阻断TFPI Kunitz结构域1与凝血因子Xa的外部位点结合)、与TF/FVIIa复合物结合(例如，抑制TFPI Kunitz结构域1与TF/FVIIa复合物结合)、与单独的TF结合、和/或与单独的FVIIa结合。随着TFPI活性减小，TF和FVIIa自由地活化FX，FX又增强凝血酶原向凝血酶的转化。令人惊讶地，在一个实施方案中，结合Kunitz结构域1的本发明肽干扰TFPI介导的FXa的抑制。因此，本发明提供了例如通过给受试者施用结合Kunitz结构域1的本文描述的肽来抑制TFPI介导的外源和/或常见凝血级联途径的下调和/或增强FXa介导的凝血酶原向凝血酶转化的方法。
一方面，本发明的肽在模型和/或血浆系统中显示TFPI拮抗活性。用于确定TFPI抑制活性的示例性模型系统是外源性tenase分析，其测试候选肽在TFPI(其是FX活化反应的天然抑制剂)存在下恢复外源复合物介导的FX活化的能力(参见例如，Lindhout等人，Thromb.Haemost.，74，910-915(1995))。用于鉴别TFPI抑制活性的另一个模型系统是FXa抑制分析，其中在TFPI存在下测量FXa活性(参见Sprecher等人，PNAS，91，3353-3357(1994))。外源性tenase分析和FXa抑制分析在实施例3中进一步描述。任选地，本发明的肽在TFPI存在下增强FX活化，半数最大有效浓度(EC50)小于或等于1×10-4Μ、小于或等于1×10-5Μ、小于或等于1×10-6Μ、或小于或等于1×10-7Μ。
一方面，TFPI拮抗活性在基于血浆的分析中表征。在候选肽存在下，在基本上缺乏FVIII或FIX活性(例如，残余凝血因子活性低于1％)的血浆中引发凝血酶形成。可以如实施例4所述，使用发荧光或显色底物检测凝血酶形成。测量凝血酶活性的系统由Thrombinoscope BV(Maastricht，The Netherlands)提供。凝血酶原转化使用例如ThrombographTM(Thermo Scientific，Waltham，MA)测量，将得到的数据编成由可获自Thrombinoscope BV的ThrombinoscopeTM软件产生的校准的自动凝血酶图(CalibratedAutomatic Thrombogram)。在某些实施方案中，TFPI抑制肽增加所述分析期间产生的峰值凝血酶量和/或减少达到峰值凝血酶形成所需的时间。例如，所述肽在FVIII不存在下(例如，FVIII清除的血浆)提高TFPI调节的凝血酶生成，达到正常血浆中TFPI依赖性凝血酶生成水平的至少1％。一般而言，正常(未患病)血浆包含约0.5U/mL至约2U/mL凝血因子VIII。因此，在一些情况下，TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)将在FVIII不存在下提高凝血酶形成，达到在0.5U/mL至2U/mL FVIII存在下观察到水平的至少约1％。在其他实施方案中，所述肽在凝血因子VIII不存在下增强凝血酶形成，达到正常血浆(即，在生理水平的凝血因子VIII存在下)凝血酶形成水平的至少约2％、至少约3％、至少约5％、至少约7％或至少约10％。在各个方面，将所述肽施用于凝血酶缺陷或血友病的动物模型，以鉴别体内TFPI抑制活性。这样的体内模型在技术领域中是已知的，并且包括例如施用抗FVIII抗体以引起甲型血友病的小鼠(Tranholm等人，Blood，102，3615-3620(2003))；凝血因子敲除模型，例如但不限于FVIII敲除小鼠(Bi等人，Nat.Genet.，10(1)，119-121(1995))和FIX敲除小鼠(Wang等人，PNAS，94(21)，11563-66(1997))；诱发甲型血友病的兔(Shen等人，Blood，42(4)，509-521(1973))；和Chapel Hill HA狗(Lozier等人，PNAS，99，12991-12996(2002))。
各种肽结合任何来源的TFPI，所述任何来源包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猫、母牛、马、猪、豚鼠和灵长类动物。在一个实施方案中，所述肽结合人TFPI。任选地，TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)结合来自超过一个物种的TFPI(即，所述肽在多个物种之间具有交叉反应性)。在某些方面，所述肽与TFPI结合的解离常数(KD小于或等于1×10-4M、小于或等于1×10-5M、小于或等于1×10-6M或小于或等于1×10-7M。亲和力可以使用例如但不限于多种技术的任何一种、两种或多种来确定，所述技术例如亲和力ELISA分析、竞争性ELISA分析、和/或表面等离子体共振(BIAcoreTM)分析。当使用竞争性(IC50)ELISA分析表征时，本发明的肽任选表现出小于或等于约50,000nM的IC50。例如，所述肽表现出IC50小于或等于约10,000nM的IC50，例如小于或等于约5,000nM、小于或等于约1,000nM、或小于或等于约500nM的IC50。在一个方面，所述肽表现出小于或等于约250nM、小于或等于约100nM、小于或等于约50nM、或小于或等于约10nM的IC50。示例性的肽及其IC50值提供于图32-39；在一些情况下，肽根据它们的IC50值被分类为A、B、C、D、E、F和G组(参见实施例1的表4)。在各个方面，本发明提供了属于如表4定义的A、B、C、D、E、F和/或G组的肽。亲和力还可以通过动力学方法或平衡/溶液法测定。这样的方法在本文中进一步详细描述或是本领域已知的。
用于鉴别本发明肽的另一适当分析为k解离分析，其检验肽从TFPI的释放。k解离分析结果不是解离速率常数，而是在与TFPI孵育一段时期之后由测试肽阻断与TFPI结合的竞争肽的百分比。一种示例性k解离分析包括以下步骤：1)TFPI涂布的微量滴定板与一定量的测试肽孵育，导致约90％TFPI占据；2)去除未结合的测试肽；3)添加与测试肽竞争结合TFPI的生物素化示踪剂(即竞争剂)肽；4)孵育一段时间，在此期间由测试肽释放的结合位点被示踪剂占据；5)去除未结合的示踪剂及测试肽；和6)通过使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶轭合物的显色反应来检测结合的示踪剂。所得信号指示由测试肽释放的结合位点。相较于完全解离的分析物，在孵育期间不从TFPI解离的测试肽产生较弱信号。
关于所有的结合剂和结合分析，本领域的专业人员认识到，为了生物学(例如治疗上)有效而不应该与结合剂可检测地结合的各个部分的列举将是消耗性而不且实际的。因此，术语“特异性结合”指肽以比它结合非TFPI的无关对照蛋白更大的亲和力结合TFPI的能力。例如，所述肽可以比对照蛋白亲和力大至少5、10、15、25、50、100、250、500、1000或10,000倍的亲和力结合TFPI。在一些实施方案中，所述肽结合TFPI的亲和力比它结合“抗靶”更高，“抗靶”是人中所述肽与其结合可能导致不良效应的蛋白或其他天然存在的物质。几类肽或蛋白质是可能的“抗靶”。因为TFPI抑制肽在血流中和/或内皮处发挥它们的活性，血浆蛋白代表可能的抗靶。包含Kunitz结构域(KD)的蛋白质是可能的抗靶，因为不同蛋白质的KD共有显著相似性。组织因子途径抑制剂-2(TFPI-2)高度类似于TFPI-1α，并且像TFPI-1α一样含有KD(Sprecher等人，PNAS，91，3353-3357(1994))。因此，在一个方面，本发明的肽与TFPI结合的亲和力比与抗靶例如TFPI-2的亲和力高至少5、10、15、25或50倍。
任选地，TFPI结合肽表现出一个或多个本文描述的所需的特点，并且如果需要，可以修饰肽的氨基酸序列以优化结合、稳定性和/或活性。示例性的TFPI结合肽以小于或等于20nM的KD结合TFPI和/或表现出比对抗靶的结合亲和力大至少100倍的对TFPI的结合亲和力。可选地或附加地，TFPI结合肽以小于或等于50nM的EC50(如使用任何适当分析、例如本文所述分析测量的)增强了在TFPI存在下的FX活化和/或增强在凝血因子VIII不存在下的凝血酶形成，达到含有生理水平凝血因子VIII的血浆中凝血酶形成水平的至少约20％(例如40％)。可选地或附加地，TFPI结合肽实现了所需水平的血浆稳定性(例如，50％或更多剂量在12小时之后保持在血浆中)和/或表现出所需的体内半衰期(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10小时)。可选地或附加地，TFPI结合肽表现出所需水平的生物利用度，例如在皮下施用之后所需水平的生物利用度(例如，大于或等于5％、10％、15％、20％、25％、30％或50％)和/或表现出在体内给定剂量下所需水平的TFPI抑制活性。
本发明进一步包括抑制TFPI-1的方法。所述方法包括使TFPI与本文描述的TFPI结合肽接触。考虑任何程度的TFPI活性抑制。例如，TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)降低外源途径的TFPI抑制至少约5％(例如，至少约10％、至少约25％或至少约30％)。在一些实施方案中，与所述肽不存在时的TFPI活性相比，TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)降低外源途径内的TFPI活性至少约50％、至少约75％或至少约90％。
在本发明的一个方面，使用TFPI结合肽检测和/或定量体内或体外TFPI。检测和/或定量样品中TFPI的示例性方法包括(a)使样品与本发明TFPI结合肽接触，和(b)检测TFPI结合肽与TFPI的结合。
本发明进一步包括靶向TFPI定位的生物结构(包括但不限于细胞表面和内皮内衬)的方法。所述方法包括将所述生物结构(例如，包括但不限于细胞表面上展示TFPI的细胞)与本文描述的TFPI结合肽接触，所述TFPI结合肽任选与向所述肽增添附加功能的部分轭合。所述部分可以是染料(例如，荧光染料)、放射性核素或含放射性核素的复合物、蛋白(例如酶、毒素或抗体)或细胞毒性剂。例如，所述肽与促进肽检测和/或纯化和/或包含治疗性质的效应部分连接或轭合。在一个方面，将TFPI结合肽或肽轭合物施用给哺乳动物，以靶向哺乳动物内TFPI展示细胞。任选地，所述方法进一步包括检测TFPI结合肽与TFPI的结合。所述方法可用于治疗和诊断其中TFPI是适合的诊断标志物或TFPI表达细胞是治疗方法的靶的疾病。
直接或间接检测肽-TFPI复合物。检测部分在现有技术中广泛用于鉴别生物物质并且包括例如染料(例如，荧光染料)、放射性核素或含放射性核素的复合物、和酶。在一些方面，间接检测肽-TFPI结合。在这方面，将肽任选地与结合本发明的肽而不显著干扰肽-TFPI结合的相互作用配偶体接触，并检测所述相互作用配偶体。示例性的相互作用配偶体包括但不限于抗体、抗原结合性抗体片段、抗运载蛋白(anticalin)和抗体模拟物、适体、链霉亲和素、亲和素、中和亲和素和镜像异构体(spiegelmer)。任选地，相互作用配偶体包含检测部分以利于检测相互作用配偶体-肽复合物。在一些实施方案中，TFPI结合肽被修饰以利于结合相互作用配偶体。例如，一方面，TFPI结合肽与生物素轭合，生物素被包含链霉亲和素的相互作用配偶体结合。示例性的相互作用配偶体包括与辣根过氧化物酶融合的链霉亲和素，其在例如ELISA样分析中检测。可选地，修饰TFPI结合肽以包括抗体表位，并且检测相应抗体与肽-TFPI复合物的结合。检测例如抗体及其片段的方法是本领域公知的。
使用许多方法的任何一个鉴别肽-TFPI复合物和相互作用配偶体-肽复合物，所述方法例如但不限于生物化学分析(例如酶分析)、光谱分析(例如基于光密度、萤光、FRET、BRET、TR-FRET、萤光偏振、电化学发光或NMR的检测)、正电子发射断层摄影术(PET)和单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)。有利于萤光检测肽-TFPI复合物或相互作用配偶体-肽复合物的可检测部分包括但不限于萤光素、Alexa350、Marina BlueTM、CascadeYellowTM、Alexa405、Pacific BlueTM、Pacific OrangeTM、Alexa430、Alexa488、Oregon488、Alexa500、Oregon514、Alexa514、Alexa532、Alexa555、四甲基若丹明、Alexa546、若丹明B、Rhodamine RedTM-X、Alexa568、Alexa594、TexasTexasAlexa610、Alexa633、Alexa635、Alexa647、Alexa660、Alexa680、Alexa700、Alexa750、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、别藻蓝蛋白、Cy3、Cy5、TAMRA和荧光蛋白(GFP及其衍生物)。包含荧光检测部分的TFPI结合肽的实例是JBT2454(FAM-Ttds-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKL-NH2(SEQ ID NO:4171))，其用5,6-羧基荧光素标记。
放射性标记也用于检测生物材料(例如TFPI、TFPI结合肽或TFPI结合肽-TFPI复合物)，且在一些情况下，使用螯合剂与肽或相互作用配偶体连接，所述螯合剂例如(但不限于)EDTA(乙二胺四乙酸)、DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、CDTA(环己基1,2-二胺四乙酸)、EGTA(乙二醇-O,O’-双(2-氨基乙基)-N,N,N’,N’-四乙酸)、HBED(N,N-双(羟基苄基)-乙二胺-N,N’-二乙酸)、TTHA(三亚乙基四胺六乙酸)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸)、HEDTA(羟基乙二胺三乙酸)或TETA(l,4,8,ll-四氮杂环十四烷-N,N’,N”,N””-四乙酸)。放射性标记的实例包括99mTc、203Pb、66Ga、67Ga、68Ga、72As、111In、113mIn、114mIn、97Ru、62Cu、64Cu、52Fe、52mMn、51Cr、186Re、188Re、77As、90Y、67Cu、169Er、117mSn、121Sn、127Te、142Pr、143Pr、198Au、199Au、149Tb、161Tb、109Pd、165Dy、149Pm、151Pm、153Sm、157Gd、166Ho、172Tm、169Yb、175Yb、177Lu、105Rh和111Ag。顺磁性金属也是适合任选通过螯合剂复合物与TFPI结合肽或相互作用配偶体连接的可检测部分。顺磁性金属的实例包括例如Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Pr、Nd、Sm、Yb、Gd、Tb、Dy、Ho和Er。
在一些方面，TFPI结合肽本身经修饰以包括一个或多个具有可检测取代基或核素的氨基酸。在这方面，在一个实施方案中，TFPI结合肽包含至少一个包含可检测同位素(例如13C、14C、35S、3H、18O或15N)的氨基酸和/或例如123I、124I、125I、131I、75Br、76Br、77Br或82Br卤化的氨基酸。适合卤化的氨基酸包括但不限于酪氨酸和色氨酸。
本发明还提供了用于诊断患有疾病或疾患、或有患疾病或疾患的风险的受试者的方法，其中所述疾病或疾患与异常TFPI活性有关或由其引起。所述方法包括给受试者施用TFPI结合肽和检测TFPI-肽复合物。在一些情况下，所述肽与可检测部分轭合，并且所述方法包括检测所述可检测部分。示例性可检测部分在本文描述。在其他情况下，所述方法包括给受试者施用结合所述TFPI结合肽的TFPI结合肽相互作用配偶体，并检测所述相互作用配偶体。如果需要，所述相互作用配偶体包含可检测部分或与可检测部分轭合，并检测所述可检测部分。可检测部分的存在表明TFPI的存在，从而允许诊断与TFPI有关的疾病或疾患(例如，如下疾病或疾患：(i)可以通过抑制TFPI治疗，或(ii)包括可以通过抑制TFPI缓解或预防的症状)。如果不想给受试者施用所述肽，则从所述受试者获得生物样品，与本文描述的TFPI结合肽接触，并检测TFPI-肽复合物。
本发明的肽结合TFPI，并因此用于从生物样品(例如生物流体，例如血清)、发酵提取物、组织制备物、培养基等纯化TFPI或重组TFPI。本发明包括在TFPI的商业生产中或鉴别TFPI分子的方法中利用TFPI结合肽的方法。例如，本发明包括纯化TFPI的方法。所述方法包括将含有TFPI的样品与本文限定的肽在适合形成TFPI和肽之间复合物的条件下接触；从样品取出复合物；并任选解离所述复合物以释放TFPI。适合于形成TFPI和肽之间复合物的示例性条件公开在实施例中，这样的条件可易于调整以解离TFPI-肽复合物。在一些实施方案中，肽固定在载体、例如固体载体上，以利于TFPI的回收。例如，在一个实施方案中，所述肽固定在色谱固定相上(例如，二氧化硅、亲和色谱珠或色谱树脂)，包含TFPI的样品施加到固定相上，使得TFPI-肽复合物形成，从固定相除去样品的其余部分，从固定相洗脱TFPI。在这方面，本发明的肽一方面适合用于亲和色谱技术。
还提供了在凝血因子缺陷的受试者中提高凝血酶形成的方法。该方法包括在有效抑制TFPI的条件下给受试者施用本文提供的肽。在这方面，TFPI结合肽以有效提高受试者中凝血酶形成的量和条件施用。“凝血因子缺陷”指受试者患有凝血酶形成所需的一种或多种血液因子、例如FVIII、FIX或FXI的缺陷。实际上，在一个实施方案中，受试者是FVIII缺陷。可选或附加地，受试者是凝血因子IX缺陷。凝血因子缺陷通过检查临床样品中凝血因子的量来鉴别。专业人员根据凝血因子缺陷的程度来分类血友病。患有轻度血友病的受试者的凝血因子VIII或凝血因子IX是正常量(1U/ml)的大约5％至30％。中度血友病的特点在于是正常凝血因子VIII、凝血因子IX或凝血因子XI水平的大约1％至5％，而患有严重血友病的受试者具有小于1％正常量的凝血因子VIII、凝血因子IX或凝血因子XI。缺陷可以通过活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)测试来间接鉴别。APTT测试测量了形成血凝块需要的时间长度，与凝血因子水平正常的患者相比，凝血因子VIII缺陷(甲型血友病)、凝血因子IX缺陷(乙型血友病)和凝血因子XI缺陷(丙型血友病)的患者时间长度较长。严重和中度凝血因子VIII缺陷的患者几乎100％可以用APTT诊断。本发明进一步包括在未患凝血因子缺陷的受试者中提高凝血酶形成。该方法包括在有效提高凝血酶形成的条件下给受试者(例如，包含正常生理水平的凝血因子的受试者)施用本文提供的肽。
在一个方面，TFPI结合肽用于增加受试者的血凝块形成。增加血凝块形成的方法包括以有效增加血凝块形成的量和条件给受试者施用本文描述的肽。要领会，所述方法不需要完全恢复凝血级联来达到有益的(例如治疗性)效果。考虑减少与凝血因子缺陷有关的症状发作或严重度的任何凝血酶或血凝块形成的增强或增加。确定所述方法促进凝血酶形成和凝血的效力的方法是本领域已知的并在本文描述。
本发明进一步包括治疗受试者凝血障碍的方法，该方法包括以有效治疗受试者凝血障碍的量和条件给受试者施用一种或多种TFPI结合肽(或肽复合物)，例如本文描述的肽的任何一种或多种。在一个方面，所述肽是抑制TFPI活性的重组或合成的肽。“凝血障碍”包括由凝血因子活性缺陷和血小板活性缺陷引起的出血性障碍。凝血因子包括但不限于凝血因子V(FV)、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXIII、FII(造成低凝血酶原血症)和von Willebrand因子。凝血因子缺陷由例如凝血因子的体内半衰期缩短、凝血因子的结合性质改变、凝血因子的遗传缺陷和凝血因子的血浆浓度降低引起。凝血障碍可以是先天的或获得性的。可能的遗传缺陷包括编码凝血因子的核苷酸序列内的缺失、添加和/或取代，而所述核苷酸序列的不存在、存在和/或取代分别对凝血因子的活性有负面影响。凝血障碍还源自针对凝血因子的抑制物或自体免疫(例如抗体)的产生。在一个例子中，凝血障碍是甲型血友病。可选地，凝血障碍是乙型血友病或丙型血友病。
血小板疾患由血小板功能缺陷或循环血小板数量异常低引起。血小板计数低可归因于例如生产不足、血小板挤伤扣留或不受控的明显破坏。血小板减少症(血小板不足)可能存在种种原因，包括化疗和其他的药物疗法、放疗、手术、意外失血和其他的疾病病症。涉及血小板减少症的示例性疾病病症是：再生障碍性贫血；特发性或免疫血小板减少症(ITP)，包括与乳腺癌有关的特发性血小板减少性紫癜；HIV相关的ITP和HIV相关的血栓性血小板减少性紫癜；引起血小板减少症的转移性肿瘤；系统性红斑狼疮，包括新生儿狼疮综合征脾肿大，Fanconi综合征；维生素B12缺乏；叶酸缺乏；May-Hegglin异常；Wiskott-Aldrich综合征；慢性肝病；与血小板减少症有关的脊髓增生异常综合征；阵发性夜间血红蛋白尿；C7E3Fab(阿昔单抗)治疗后的急性严重血小板减少症；同种免疫血小板减少症，包括母体同种免疫血小板减少症；与抗磷脂抗体和血栓形成有关的血小板减少症；自身免疫血小板减少症；药物引起的免疫血小板减少症，包括卡铂引起的血小板减少症和肝素引起的血小板减少症；胎儿血小板减少症；妊娠期血小板减少症；Hughes综合征；类狼疮血小板减少症；意外和/或大量失血；骨髓增生性疾病；恶性肿瘤患者血小板减少症；血栓性血小板减少症紫癜，包括表现为癌症患者的血栓性血小板减少性紫癜/溶血尿毒症综合征的血栓性微血管病；输血后紫癜(PTP)；自身免疫性溶血性贫血；隐匿性空肠憩室穿孔；纯红细胞再生障碍；自身免疫血小板减少症；流行性肾病；利福平相关的急性肾衰竭；Paris-Trousseau血小板减少症；新生儿同种免疫血小板减少症；阵发性夜间血红蛋白尿；胃癌血液改变；溶血尿毒症综合征(例如，儿童尿毒症病)；和与病毒感染相关的血液表现，包括甲型肝炎病毒和CMV相关的血小板减少症。血小板疾患还包括但不限于，Von Willebrand病、副肿瘤血小板机能障碍、Glanzman血小板机能不全和Bernard-Soulier病。适于用TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)治疗的其他出血疾患包括但不限于：创伤引起的出血性病症；一种或多种接触因子、例如FXI、FXII、前激肽释放酶和高分子量激肽原(HMWK)的缺陷；维生素K缺乏症；纤维蛋白原病，包括无纤维蛋白原血症、低纤维蛋白原血症和纤维蛋白原异常血症；和α2-抗纤维蛋白酶缺陷。在一个实施方案中，TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)用来治疗大量出血，例如手术、创伤、脑内出血、肝病、肾病、血小板减少症、血小板机能障碍、血肿、内出血、关节积血、体温过低、月经、妊娠和登革出血热引起的大量出血。以上所有被认为是本公开上下文中的“凝血障碍”。
在一个方面，本发明的TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)用来逆转受试者中一种或多种抗凝血剂的作用(完全或部分)。众多的抗凝血剂是本领域已知的，并且包括例如肝素；香豆素衍生物，例如华法令或双香豆素；TFPI；AT III；狼疮抗凝物；线虫抗凝肽(NAPc2)；FVIIa抑制剂；活性部位阻断的FVIIa(FVIIai)；活性部位阻断的FIXa(FIXai)；FIXa抑制剂；FXa抑制剂，包括磺达肝素、依达肝素、DX-9065a和拉扎沙班(DPC 906)；活性部位阻断的FXa(FXai)；FVa或FVIIIa的抑制剂，包括活化的蛋白C(APC)和可溶性血栓调节蛋白；凝血酶抑制剂，包括水蛭素、比伐卢定、阿加曲班和希美加群；和结合凝血因子(例如，FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXIII、FII、FXI、FXII、von Willebrand因子、前激肽释放酶或高分子量激肽原(HMWK))的抗体或抗体片段。
如本文使用的，“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指与凝血障碍有关的症状的严重度和/或发作的任何减少。相应地，“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”包括治疗和预防措施。本领域普通技术人员将领会，凝血病症或与之相关的症状的任何程度的预防或缓解均有益于受试者，例如人患者。通过以任何程度减少受试者症状的严重度和/或延迟症状出现，改善了患者的生活质量。相应地，在一个方面，所述方法在已经确定受试者有发生凝血障碍(例如检测到凝血因子(例如FVIII、FIX或FXI)缺陷)风险后或在检测凝血障碍(例如甲型血友病、乙型血友病或丙型血友病)后尽快执行。在另外的方面，施用所述肽完全或部分预防受伤或手术期间的过度失血。
鉴于上述，本发明提供了在受试者的治疗方法中使用的肽(或肽复合物)，所述方法例如治疗其中抑制TFPI是有益的疾病的方法。在一个方面，疾病或疾患是凝血障碍。受试者患有疾病或疾患、或者有患疾病或疾患(或不良生物事件，例如过度失血)的风险。所述方法包括在有效地完全或部分治疗或预防疾病或疾患的量和条件下给受试者施用本发明的肽。本发明还提供了用来制造药剂的肽(或肽复合物)。例如，所述肽(或肽复合物)可用于制造用于治疗如本文详细描述的凝血障碍的药剂。
在一些实施方案中，向受试者施用包含编码本发明肽复合物或肽(例如，TFPI结合肽、TFPI抑制肽)的核酸序列的核酸是有利的。在一个方面，替代或附加于肽复合物或肽(例如，TFPI结合肽、TFPI抑制肽)而提供这样的核酸。表达载体、核酸调节序列、施用方法等在本文和美国专利公布号20030045498中进一步描述。
特定受试者的特定施用方案将部分取决于所使用的本发明TFPI抑制肽、施用的TFPI结合肽(例如TFPI抑制肽)的量、施用途径、治疗的特定疾病、与接受者有关的考虑、和任何副作用的原因和程度。给受试者(例如哺乳动物，如人)施用的肽量和施用条件(例如施用时机、施用途径、剂量方案)足以在合理的时间范围内影响所需的生物反应。剂量通常取决于多种因素，包括使用的特定TFPI结合肽(例如TFPI抑制肽)、受试者的年龄和体重、以及受试者中任何疾病或疾患的存在和严重度。剂量大小还将由施用的途径、时机和频率决定。相应地，临床医生可以滴定剂量并改变施用途径，以获得最佳治疗效果，常规的范围寻找技术是本领域普通技术人员已知的。纯粹作为说明，在一个方面，所述方法包括根据上述因素施用例如约0.1μg/kg至约100mg/kg或更多。在其他的实施方案中，所述剂量范围可以从1μg/kg至约75mg/kg；或5μg/kg至约50mg/kg；或10μg/kg至约20mg/kg。在某些实施方案中，剂量包括约0.5mg/kg至约20mg/kg(例如，约1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.3mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、4.5mg/kg、5mg/kg、5.5mg/kg、6mg/kg、6.5mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg)的肽。鉴于许多凝血障碍的慢性性质，可以想象受试者将在持续数周、数月或数年的疗程中接受TFPI结合肽(例如TFPI抑制肽)，并可能需要每日或每周一剂或多剂。在其他的实施方案中，持续相对短的治疗期，例如1至14天，施用TFPI结合肽(例如TFPI抑制肽)，以治疗急性病症(例如，由手术或外伤或接受凝血替代疗法的受试者中凝血因子抑制剂/自身免疫事件引起的出血)。
施用生理可接受的组合物、例如包含本文描述的肽的药物组合物的适当方法是本领域公知的。虽然可以使用超过一种途径来施用肽，但特定的途径可以提供比其他途径更直接和更有效的反应。根据情况，药物组合物被涂抹或滴注到体腔中、通过皮肤或粘膜吸收、口服、吸入和/或导入循环。在一个方面，包含TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)的组合物通过静脉内、动脉内或腹膜内施用，以将本发明的肽引入循环。非静脉内施用也是适当的，特别是在低分子量治疗剂的情况下。在某些情况中，希望通过口服、局部、舌下、阴道、直肠、肺；通过脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、门静脉内、病灶内、髓内、鞘内、心室内、透皮、皮下、鼻内、尿道或经肠方式的注射；通过持续释放系统；或通过植入装置来递送包含TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)的药物组合物。如果需要，TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)可以通过动脉内或静脉内施用而区域施用，提供给目标区，例如通过股动脉递送至腿。在一个实施方案中，所述肽并入微粒中，如例如以下中描述的：美国专利5,439,686和5,498,421，以及美国专利公布2003/0059474、2003/0064033、2004/0043077、2005/0048127、2005/0170005、2005/0142205、2005/142201、2005/0233945、2005/0147689、2005/0142206、2006/0024379、2006/0260777、2007/0207210、2007/0092452、2007/0281031和2008/0026068。可选地，所述组合物通过将上面已经吸收或包裹了所需分子的膜、海绵或另一适当材料的植入来施用。当使用植入装置时，在一个方面，所述装置被植入任何适当的组织中，在各个方面，所需分子的递送是通过扩散、定时释放团剂、或连续施用。在其他方面，TFPI抑制肽在手术程序或受伤治疗期间直接施用于暴露的组织，或通过输血程序施用。治疗递送方法是技术人员公知的，其中的一些进一步描述在例如美国专利号5,399,363中。
为了利于施用，在一个实施方案中将TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)或肽复合物配制成包含载体(即，介质、佐剂、缓冲剂或稀释剂)的生理可接受的组合物。使用的特定载体仅受物理化学因素(例如溶解度和不与肽反应)以及施用途径的限制。生理可接受的载体是本领域公知的。适合于注射使用的示例说明性药物形式包括但不限于无菌水溶液或分散体，和用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末(例如参见美国专利号5,466,468)。注射制剂进一步描述在例如Pharmaceutics and Pharmacy Practice，J.B.LippincottCo.，Philadelphia.Pa.，Banker和Chalmers.编辑，238-250页(1982)，和ASHP Handbook onInjectable Drugs，Toissel，第4版，622-630页(1986))。包含本文提供的肽的药物组合物任选放置在容器内，连同提供此类药物组合物使用说明书的包装材料。一般而言，这样的说明书包括描述以下内容的清楚表达：试剂浓度，以及在某些实施方案中可能是重构药物组合物所必要的赋形剂成分或稀释剂的相对量。
适当时，本发明的TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)或肽复合物与其他物质和/或其他治疗形式组合施用，以达到附加的或加强的生物效应。联合治疗包括但不限于血浆来源或重组的凝血因子、血友病预防治疗、免疫抑制剂、血浆凝血因子抑制性抗体拮抗剂(即抗抑制剂)、抗纤维蛋白溶解剂、抗生素、激素疗法、抗炎剂(例如，非甾体抗炎药物(NSAID)或甾体抗炎物质)、促凝剂、和止痛药。在一个方面，所述方法是对传统的替代凝血因子治疗方案的辅助疗法，包括给受试者施用例如FXIII、FXII、FXI(例如，(Laboratoire francais du Fractionnement et des Biotechnologies，Les Ulis，France)和FXI浓缩物(BioProducts Laboratory，Elstree，Hertfordshire，UK))、FX、FIX(例如，凝血因子IX(Wyeth，Madison，NJ)；SD(Grifols，LosAngeles，CA)；(CSL Behring，King of Prussia，PA)；BEBULIN–VHTM(Baxter，Deerfield，IL)；SD(Grifols，Los Angeles，CA)；或PROPLEX TTM(Baxter，Deerfield，IL))、FVIII(例如，ADVATETM(Baxter，Deerfield，IL)；FS(CSL Behring，King of Prussia，PA)；(Wyeth，Madison，NJ)、XYNTHATM(Wyeth，Madison，NJ)、和FS(Bayer，Pittsburgh，PA)；(Grifols，Los Angeles，CA)；HEMOPHIL MTM(Baxter，Deerfield，IL)；(Talecris Biotherapeutics-USA，Research Triangle Park，NC)；或MONARC-MTM(Baxter，Deerfield，IL))、FVIIa(例如，FVIIa(NovoNordisk，Princeton，NJ)和FVII浓缩物(Baxter Bioscience，Vienna，Austria，或BioProducts Laboratory，Elstree，Hertfordshire，UK))、FV、FVa、FII和/或FIII。在某些情况下，受试者还接收FEIBAVH ImmunoTM(Baxter BioScience，Vienna，Austria)，其是冻干的无菌人血浆级分，具有凝血因子VIII抑制剂旁路活性。FEIBA VH ImmunoTM包含大致等单位的凝血因子VIII抑制剂旁路活性和凝血酶原复合物因子(凝血因子II、VII、IX和X，以及蛋白C)。其他示例性的联合治疗包括但不限于前激肽释放酶、高分子量激肽原(HMWK)、VonWillebrand因子、组织因子和凝血酶。可选或附加地，TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)与一种或多种不同的TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)共同配制。一方面，TFPI结合肽的施用允许减少实现想要生物反应所需的共同治疗剂的剂量。
因此，本发明包括给受试者施用本发明的TFPI结合肽(例如TFPI抑制肽)(或多种TFPI结合肽或肽复合物)与一种或多种其他适当物质的组合，每一种都根据适合于该药剂的方案施用。施用策略包括TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)(或肽复合物)和一种或多种其他适当药剂同时施用(即，基本上同时间施用)和非同时施用(即，在不同的时间以任何顺序施用，不管是否重叠)。要领会，不同的组分任选在相同或分开的组合物中并通过相同或不同的施用途径施用。
在一些实施方案中，本发明的肽与部分轭合，所述部分例如治疗或诊断部分，例如检测部分和上面描述的联合治疗。可选或附加地，所述肽与相互作用配偶体(例如抗体、抗体片段、抗运载蛋白、适体或镜像异构体)组合施用，所述相互作用配偶体(a)结合所述肽并且(b)有治疗活性和/或与提供相互作用配偶体附加功能的部分(例如治疗剂、诊断剂或检测剂)连接。适合的部分包括但不限于光敏剂、染料、放射性核素、含放射性核素的复合物、酶、毒素、抗体、抗体片段和细胞毒性剂，在一些情况下，所述部分具有治疗活性(即，实现有利的或想要的生物效应)。肽轭合物或肽-相互作用配偶体对适合用于本文描述的任何方法，例如治疗患有疾病或疾患或有患疾病或疾患风险的受试者的方法。
本发明还提供了抑制丝氨酸蛋白酶对TFPI降解的方法。蛋白酶降解可以使在研究环境中处理TFPI复杂化。此外，尽管TFPI抑制是要改善各种医学病症(例如，血友病)，但是在其他临床实施方案中可能需要TFPI，例如减少凝血。“抑制”表示完全或部分防止蛋白酶的降解或裂解。丝氨酸蛋白酶是良好表征的，并且包括例如弹性蛋白酶、凝血酶、血纤蛋白溶酶、FXa或胃促胰酶。所述方法包括使TFPI与包含式(XIV)结构的肽接触：
X7001-X7002-X7003-X7004-X7005-X7006-[X7007-X7008-X7009-X7010-X7011-X7012-X7013-7014-X7015-X7016-X7017-X7018]-X7019-X7020-X7021-X7022-X7023(XIV)(SEQ ID NO：3154)，
其中X7001存在或不存在，在X7001存在的情况下，X7001是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、C(NEM)、D、E、F、G、H、I、K、L、P、R、S、T、V和W；
其中X7002存在或不存在，在X7002存在的情况下，X7002是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、C(NEM)、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W和Y；
其中X7003是选自由以下组成的组的氨基酸：A、F、I、K、L、R、S、T、V、W和Y；
其中X7004是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V和W；
其中X7005是R或W；
其中X7006是选自由以下组成的组的氨基酸：F、H、I、K、L、R、V和W；
其中X7007是选自由Orn、homoK、C、Hcy、Dap和K组成的组，优选选自由C和Hcy组成的组的氨基酸；
其中X7008是选自由以下组成的组的氨基酸：A、G、R、S和T；
其中X7009是选自由以下组成的组的氨基酸：a、A、I、K、L、M、m、Moo、Nle、p、R、Sem和V；
其中X7010是选自由以下组成的组的氨基酸：A、G、I、K、L、P、R、S、T和V；
其中X7011是选自由以下组成的组的氨基酸：D、E、G、S和T；
其中X7012是选自由以下组成的组的氨基酸：A、a、D、d、E、e、F、f、G、I、K、k、L、l、M、m、Moo、Nle、nle、P、p、R、r、S、s、Sem、T、t、V、v、W和w；
其中X7013是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、C(NEM)、Con、Con(Meox)、D、d、E、e、Eag、F、G、I、K、L、N、R、S、s、T、V和W；
其中X7014是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、M、R、S、T、V和W；
其中X7015是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、M、Nle、R、S、T、V和W；
其中X7016是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、I、K、L、M、Moo、Nle、R、S、Sem、T、V、W和Y；
其中X7017是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V、W和Y；
其中X7018是选自由C和D组成的组的氨基酸，优选C；
其中X7019是选自由以下组成的组的氨基酸：A、F、I、L、S、T、V和W；
其中X7020是选自由以下组成的组的氨基酸：F和W；
其中X7021是选自由以下组成的组的氨基酸：I、L和V；
其中X7022是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、P、R、S、T、V和W；
其中X7023存在或不存在，在X7023存在的情况下，X7023是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、C(NEM)、Con、Con(Meox)、D、E、Eag、F、G、I、K、L、R、S、T、V、W和Y；和
其中所述肽包括通过X7007和X7018之间连接产生的环状结构，藉此抑制所述丝氨酸蛋白酶对TFPI的降解。任选地，X7001是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、F、G、H、K、L和S；X7002是选自由以下组成的组的氨基酸：H、F、M和R；X7003是选自由以下组成的组的氨基酸：F和Y；X7004是K；X7005是W；X7006是选自由以下组成的组的氨基酸：F和H；X7007是C；X7008是选自由以下组成的组的氨基酸：A、G和S；X7009是选自由以下组成的组的氨基酸：M、Sem和V；X7010是选自由以下组成的组的氨基酸：K、P和R；X7011是D；其中X7012是选自由以下组成的组的氨基酸：F、L、l、M和Sem；其中X7013是选自由以下组成的组的氨基酸：D、G、K和S；其中X7014是G；其中X7015是选自由以下组成的组的氨基酸：I和T；其中X7016是选自由以下组成的组的氨基酸：D、F、M、Sem和Y；其中X7017是选自由以下组成的组的氨基酸：S和T；其中X7018是C；其中X7019是选自由以下组成的组的氨基酸：A和V；其中X7020是W；其中X7021是V；其中X7022是选自由以下组成的组的氨基酸：F、L、K、R、P和W；其中X7023存在或不存在，在X7023存在的情况下，X7023是选自由以下组成的组的氨基酸序列：A、D、F、M、S和Y；和其中所述肽包括通过X7007和X7018之间连接产生的环状结构。“接触”可以在体外或体内进行。本文描述的施用剂量和途径的考虑也适用于抑制蛋白降解的方法。
所述肽任选是肽复合物的部分，所述肽复合物还包括包含下式(XIII)结构的肽：
X6001-X6002-X6003-X6004-X6005-X6006-X6007-X6008-X6009-X6010-X6011-X6012-X6013-X6014-X6015-X6016-X6017-X6018-X6019-X6020(XIII)(SEQ ID NO：3153)；
其中X6001是选自由以下组成的组的氨基酸：F、L、M、Y、1Ni、Thi、Bta、Dopa、Bhf、C、D、G、H、I、K、N、Nmf、Q、R、T、V和W；
其中X6002是选自由以下组成的组的氨基酸：Q、G和K；
其中X6003是选自由以下组成的组的氨基酸：C、D、E、M、Q、R、S、T、Ede(O)、Cmc、A、Aib、Bhs、F、G、H、I、K、L、N、P、V、W和Y；
其中X6004是选自由以下组成的组的氨基酸：Aib、E、G、I、K、L、M、P、R、W、Y、A、Bhk、C、D、F、H、k、N、Nmk、Q、S、T和V；
其中X6005是选自由以下组成的组的氨基酸：a、A、Aib、C、D、d、E、G、H、K、k、M、N、Nmg、p、Q、R、N丙基G、aze、pip、tic、oic、hyp、nma、Ncg、Abg、Apg、thz、dtc、Bal、F、L、S、T、V、W和Y；
其中X6006是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、C(NEM)、D、E、G、H、K、M、N、Q、R、S、V、Cit、C(Acm)、Nle、I、Ede(O)、Cmc、Ecl、Eea、Eec、Eef、Nif、Eew、Aib、Btq、F、I、L、T、W和Y；
其中X6007是选自由以下组成的组的氨基酸：I、V、T、Chg、Phg、Tle、A、F、G、I、K、L、Nmv、P、Q、S、W和Y；
其中X6008是选自由以下组成的组的氨基酸：F、H、1Ni、2Ni、Pmy、Y和W；
其中X6009是选自由以下组成的组的氨基酸：Aib、V、Chg、Phg、Abu、Cpg、Tle、L-2-氨基-4,4,4-三氟丁酸、A、f、I、K、S、T和V；
其中X6010是选自由以下组成的组的氨基酸：A、C、D、d、E、F、H、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、Nmd、C(NEM)、Aib、G、I、L和Nmf；
其中X6011是选自由以下组成的组的氨基酸：A、a、G、p、Sar、c、hcy、Aib、C、K、G和Nmg；
其中X6012是选自由以下组成的组的氨基酸：Y、Tym、Pty、Dopa和Pmy；
其中X6013是选自由以下组成的组的氨基酸：Aib、C、F、1Ni、Thi、Bta、A、E、G、H、K、L、M、Q、R、W和Y；
其中X6014是选自由以下组成的组的氨基酸：A、Aib、C、C(NEM)、D、E、K、L、M、N、Q、R、T、V、Hcy、Bhe、F、G、H、I、P、S、W和Y；
其中X6015是选自由以下组成的组的氨基酸：R、(ω-甲基)-R、D、E和K；
其中X6016是选自由以下组成的组的氨基酸：L、Hcy、Hle和Aml；
其中X6017是选自由以下组成的组的氨基酸：A、a、Aib、C、c、Cha、Dab、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、Nle、Nva、Opa、Orn、R、S、Deg、Ebc、Eca、Egz、Aic、Apc、Egt、(ω-甲基)-R、Bhr、Cit、D、Dap、E、F、G、N、Q、T、V、W和Y；
其中X6018是选自由以下组成的组的氨基酸：A、Aib、Hcy、hcy、C、c、L、Nle、M、N、R、Bal、D、E、F、G、H、I、K、Q、S、T、V、W和Y；
其中X6019是选自由以下组成的组的氨基酸：K、R、Har、Bhk和V；和
其中X6020是选自由以下组成的组的氨基酸：K、L、Hcy、Aml、Aib、Bhl、C、F、G、H、I、Nml、Q、R、S、T、V、W和Y。
本发明还提供了用于鉴别TFPI结合化合物、例如TFPI结合肽的方法。一方面，该方法包括(a)使包含TFPI Kunitz结构域1(KD1)的肽与本文描述的TFPI结合肽和测试化合物在允许形成KD1-TFPI结合肽复合物的条件下接触。该方法还包括(b)测量步骤(a)中形成的KD1-TFPI结合肽复合物，和(c)比较测试化合物存在下形成的KD1-TFPI结合肽复合物的数目与测试化合物不存在下形成的KD1-TFPI结合肽复合物的数目。测试化合物存在下形成的KD1-TFPI结合肽复合物的数目与测试化合物不存在下形成的KD1-TFPI结合肽复合物的数目相比减少，指示测试化合物是TFPI结合化合物。一方面，该方法还包括在步骤(c)中用于比较的测试化合物不存在下形成KD1-TFPI结合复合物，尽管这不是必需的，因为该信息可单独获得(例如，获自之前制备的参照标准)。
同时或顺序组合KD1、TFPI结合肽和测试化合物，任选地在添加TFPI结合肽和/或测试化合物之前和/或之后进行洗涤步骤。在一个实施方案中，使包含KD1的肽与本文描述的TFPI结合肽在允许形成KD1-TFPI结合肽复合物的条件下接触，去除未结合的TFPI结合肽，并使其余KD-肽复合物与测试化合物接触。检测从TFPI-肽复合物置换TFPI结合肽，指示测试化合物是TFPI结合化合物。例如通过在暴露于测试化合物之前和之后测量KD1-TFPI结合肽复合物的数目来检测置换。
使用任何适当的检测手段检测和/或测量(定量)KD1-TFPI结合肽复合物，包括本领域已知用于检测样品中的肽的检测手段。例如，在本发明的一个实施方案中，TFPI结合肽包括产生信号的标记。示例性标记在本文描述并且包括例如放射性核素、荧光染料、同位素、酶底物和酶。所述方法包括测量KD1-TFPI结合肽复合物产生的信号并比较在测试化合物存在下形成的KD1-TFPI结合肽复合物产生的信号与在测试化合物不存在下形成的KD1-TFPI结合肽复合物产生的信号。来自暴露于测试化合物的包含KD1-TFPI结合肽复合物的样品的信号减少(与未暴露于测试化合物的KD1-TFPI结合肽复合物的类似样品产生的信号相比)指示复合物形成已经被抑制或破坏，并且测试化合物是TFPI结合化合物。
本发明还提供了鉴别干扰TFPI-FXa相互作用的TFPI结合化合物的方法。该方法至少部分基于以下令人惊讶的发现：TFPI KD1结合FXa外部位点并促进TFPI对FXa活性的抑制。一方面，该方法包括使基本由KD1组成的肽(即，包含KD1而不含KD2的肽)与FXa在测试化合物存在下在允许KD1与FXa结合的条件下接触。该方法还包括比较测试化合物存在下的KD1-FXa结合与测试化合物不存在下的KD1-FXa结合。测试化合物存在下的KD1-FXa结合与测试化合物不存在下的KD1-FXa结合相比的减少指示测试化合物是TFPI结合化合物。可以使用任何方法，例如本文描述的方法来检测和/或定量KD1-FXa结合。例如，标记KD1或FXa，并比较暴露于测试化合物的KD1-FXa复合物产生的信号与未暴露于测试化合物的KD1-FXa复合物产生的信号。
用于鉴别TFPI结合化合物的本发明方法特别适合本领域已知的各种高通量筛选技术。任何“测试化合物”(例如，小分子、肽、蛋白(例如抗体或其片段)、拟肽或多核苷酸(DNA或RNA))适合使用本文描述的方法筛选。如果需要，使用本文描述的方法根据TFPI结合(和任选地，抗TFPI活性)筛选测试化合物集合、群体或文库。存在许多用于鉴别TFPI抑制剂的不同文库，包括但不限于化学文库、天然产物文库和包括肽和/或有机分子的组合文库。在一些方面，化学文库由已知化合物或通过其他筛选方法鉴别为“活性化合物(hit)”或“先导化合物(lead)”的化合物的结构类似物组成。天然产物文库是从微生物、动物、植物或海洋生物分离或产生的物质集合。组合文库由通常作为混合物的大量肽或有机化合物构成。本文描述的方法还用于筛选展示或核酸文库，例如酵母展示文库、细菌展示文库、噬菌体展示文库、核糖体展示文库、mRNA展示文库、RNA文库或DNA文库。实施例1示例说明了一种筛选展示文库的方法。本发明涵盖的高通量筛选方法包括允许筛选数万至数十万测试化合物的自动化程序。
另一方面，用于鉴别TFPI结合化合物的本发明方法包括使包含KD1(或由其组成)的肽与测试化合物接触，并检测测试化合物与对应于人TFPI残基Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47和Ile55的KD1氨基酸残基限定的TFPI结合位点、例如人TFPI残基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ile38、Ile46、Phe47和Ile55限定的结合位点的结合。在一个实施方案中，结合位点由对应于人TFPI残基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47和Ile55的氨基酸残基限定。所述结合位点对应于JBT1857的TFPI结合位点，JBT1857是在许多功能测定中抑制TFPI活性的TFPI结合肽。JBT1857是本文表示为例如式(I)-(IV)和(XI)的JBT0047类肽的一个肽实例，其实例示于图32、62和65。
此外，本发明提供了鉴别TFPI结合化合物的方法，包括使包含KD1-KD2(包括TFPI多肽中连接KD1和KD2的区域)的肽与测试化合物接触，并检测测试化合物与对应于人TFPI残基R41、Y53、C59、E60、Q63、R65、E67、E71、K74、M75、N80、N82、R83、I84、I85、T87、F96、C106、C130、L131、N133、M134、N136、F137、E142、N145和I146的KD1-KD2氨基酸残基限定的TFPI结合位点的结合。所述结合位点对应于JBT1837的TFPI结合位点，JBT1837是在许多功能测定中抑制TFPI活性的TFPI结合肽。JBT1837是本文表示为例如式(V)-(VII)的JBT0120类肽的一个肽实例，其实例示于图34。
本文描述的TFPI结合位点氨基酸残基参照人TFPI氨基酸序列，并且编号指引用的氨基酸相对于人TFPI的N末端的位置。仅为了示例说明TFPI结合位点的位置，包含KD1的人TFPI的片段的氨基酸序列提供为SEQ ID NO：4234(DSEEDEEHTIITDTELPPLKLMHSFCAFKADDGPCKAIMKRFFF NIFTRQCEEFIGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRDNA(编码KD1的氨基酸26-75以粗体显示))。例如，通过使多肽氨基酸序列与SEQ ID NO：4234比对而鉴别了其他TFPI多肽(例如，来自不同生物体的TFPI多肽，或TFPI多肽片段)的相应氨基酸。同时，在一个实施方案中，包含TFPI KD1的肽不包括负责TFPI活性的TFPI蛋白的其他区域，其他实施方案需要使用包含人TFPI的氨基酸1-160(包括KD1和KD2)或包含全长人TFPI(包括KD1-KD3)的肽。
使用许多方法的任何一个检测测试化合物与本文定义的TFPI结合位点的结合，包括本文描述的检测方法。用于检测结合的示例性方法采用核磁共振(NMR)来识别TFPI结合位点内氨基酸残基的化学位移。TFPI氨基酸位置28-30、32、46、47和55，以及任选位置27、31、36-38和44的化学位移指示测试化合物与TFPI上的这些氨基酸接触点的相互作用。类似地，TFPI氨基酸位置41、53、59、60、96、106、130、133、136、137、142、63、65、67、71、74、75、80、82-85、87、131、134、145和146的化学位移指示测试化合物与TFPI上的这些氨基酸接触点的相互作用。为了确定测试化合物结合导致的特定氨基酸的化学位移的存在或缺乏，获自KD1-测试化合物复合物的NMR数据与获自游离TFPI肽(例如，游离KD1肽或游离KD1-KD2肽)的NMR数据比较。NMR检测测试化合物与TFPI之间结合的用途进一步描述于实施例。
可选地，通过检测任选与KD2组合的TFPI KD1与其天然结合配偶体(例如FVIIa或FXa)相互作用的能力的改变来间接测定测试化合物与本文定义的TFPI结合位点的结合。就这点而言，所述方法一方面包括使包含TFPI KD1的肽与FVIIa在测试化合物存在下在允许KD1与FVIIa结合的条件下接触，并且将KD1-FVIIa结合与测试化合物不存在下的KD1-FVIIa结合相比较。可选地或附加地，所述方法包括使包含TFPI KD1的肽与FXa在测试化合物存在下在允许KD1与FXa结合的条件下接触，并且将测试化合物存在下的KD1-FXa结合与测试化合物不存下的KD1-FXa结合相比较。任选地，包含KD1的肽还包含KD2，并且所述方法包括使所述肽与FXa在测试化合物存在下在允许KD2与FXa结合的条件下接触，并且将KD2-FXa结合与测试化合物不存下的KD2-FXa结合相比较。测试化合物存在下的KD1-FVIIa结合、KD1-FXa结合或KD2-FXa结合的降低(与测试化合物不存在下的KD1-FVIIa结合、KD1-FXa结合或KD2-FXa结合相比较)指示测试化合物是TFPI结合化合物。所述方法任选包括使KD1和/或KD2与FVIIa和/或FXa在测试化合物不存在下接触，作为比较测试化合物存在下的结合的参照。
使用适合检测蛋白质-蛋白质相互作用的任何适当方法，诸如本文描述的方法，使用可检测标记，测定和/或定量KD与FVIIa或FXa的结合。可选地，使用酶分析来检测测试化合物与TFPI结合位点的结合。FVIIa或FXa酶活性是评价蛋白与TFPI KD1或KD2结合的适当替代；结合本文定义的TFPI结合位点的测试化合物抑制TFPI活性，导致FVIIa和FXa活性增加。用于评估FVIIa或FXa活性的酶分析详述于本文中。
本发明还包括在本发明方法中鉴别为TFPI结合化合物的化合物，以及包含一或多种所鉴别的化合物的组合物。用于分离或纯化化合物、例如如本文所述鉴别的TFPI结合化合物(例如，TFPI结合肽)的方法是本领域已知的且在上文中描述。在一些方面，如本文所述鉴别的TFPI结合化合物是下调或消除一种或多种TFPI活性的TFPI抑制剂。本发明提供了在由氨基酸残基F28、K29、A30、D32、I46、F47和I55限定的第一结合位点(例如，由氨基酸残基A27、F28、K29、A30、D31、D32、K36、I38、I46、F47和I55限定的结合位点，例如由氨基酸残基A27、F28、K29、A30、D31、D32、K36、A37、I38、F44、I46、F47和I55限定的结合位点)和由氨基酸残基R41、Y53、C59、E60、Q63、R65、E67、E71、K74、M75、N80、N82、R83、I84、I85、T87、F96、C106、C130、L131、N133、M134、N136、F137、E142、N145和I146限定的第二结合位点结合人TFPI的TFPI抑制剂。氨基酸命名对应于人TFPI中的氨基酸残基位置。在各个方面，TFPI抑制剂是肽。在各个实施方案中，TFPI抑制剂包含通过本文描述的连接体部分连接的第一肽和第二肽。
在一个实施方案中，本发明包括用于纯化抑制FXa活性的化合物的方法。该方法包括使包含TFPI KD1的肽与化合物在允许形成化合物-KD1复合物的条件下接触，去除未结合的化合物，并解离化合物-KD1复合物以释放结合TFPI的化合物。提供如本文所述鉴别和/或纯化的TFPI抑制剂用于制备药剂、例如用于治疗凝血障碍的药剂的用途，以及用于治疗罹患疾病或处于罹患疾病的风险的受试者的方法，包括给所述受试者施用所述TFPI抑制剂。
此外，提供了抑制人TFPI的方法，其中该方法包括使人TFPI与在由氨基酸残基Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47和Ile55限定的结合位点结合人TFPI的抑制剂接触。本发明的另一方面包括治疗罹患疾病或处于罹患疾病风险的受试者的方法。该方法包括给受试者施用在由氨基酸残基Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47和Ile55限定的结合位点结合人TFPI的抑制剂。在一个方面，人TFPI结合位点由氨基酸残基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ile38、Ile46、Phe47和Ile55限定，诸如由氨基酸残基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47和Ile55限定的结合位点。可选或附加地，抑制TFPI的方法包括使人TFPI与在由氨基酸残基R41、Y53、C59、E60、Q63、R65、E67、E71、K74、M75、N80、N82、R83、I84、I85、T87、F96、C106、C130、L131、N133、M134、N136、F137、E142、N145和I146限定的结合位点结合人TFPI的抑制剂接触。本发明还提供了治疗罹患疾病或处于罹患疾病风险的受试者的方法，该方法包括给受试者施用在由氨基酸残基R41、Y53、C59、E60、Q63、R65、E67、E71、K74、M75、N80、N82、R83、I84、I85、T87、F96、C106、C130、L131、N133、M134、N136、F137、E142、N145和I146限定的结合位点结合人TFPI的抑制剂。在各个方面，抑制剂在由氨基酸残基F28、K29、A30、D32、I46、F47和I55(和任选地A27、D31、K36、A37、I38和F44)限定的结合位点和由氨基酸残基R41、Y53、C59、E60、F96、C106、C130、N133、N136、F137、E142、Q63、R65、E67、E71、K74、M75、N80、N82、R83、I84、I85、T87、L131、M134、N145和I146限定的结合位点结合TFPI。
接触本文定义的TFPI结合位点且抑制(下调或消除)一种或多种TFPI活性的任何抑制剂都适用于该方法的上下文中。TFPI抑制剂任选为TFPI结合肽，诸如具有本文所述特性的TFPI结合肽。
本发明还包括用于模拟本文定义的TFPI结合位点中的候选TFPI-化合物的计算机储存介质和方法。蛋白质的三维(3D)模拟可连同各种测试TFPI结合化合物(例如肽或小分子)的3D模型一起使用来确定化合物与TFPI中的靶向氨基酸之间的拟合。因为如果测试化合物不保持与TFPI连接持续一段足以实现生物反应的时段，则该化合物抑制TFPI的效力可受限制，所以可预测两者保持偶联的趋势以发展亲和力等级。
通过参考亲和力等级分析TFPI蛋白的3D表面和相应化合物与该表面的拟合，可发展对化合物(例如肽)的修饰以提高表面与化合物之间接触点的数目和接触点处的键的强度。可使用此技术类似地模拟基于化学品的候选物和基于肽的TFPI抑制剂的效力，这有利于TFPI结合化合物的合理设计。KD1(任选与KD2连接)的三维(3D)表面的计算机模型允许测试各种肽或化学品与限定TFPI结合位点且抑制KD1(和任选KD2)的鉴别的氨基酸子集连接的能力。一方面，KD1蛋白的表面在计算机上以3D空间模拟，特别是由KD1中的靶向氨基酸界定的表面。例如，各种肽的3D模型可与表面匹配以确定有多少个靶TFPI氨基酸由肽接触并且也发展预测肽会保持与靶表面连接多久的亲和力等级。
通过改变肽模型并重复计算机模拟，可快速产生一个肽家族的亲和力等级。如果需要，可以选出最有前景的肽变体(例如在亲本肽的氨基酸序列内包含一个或多个取代的第二肽)供进一步物理测试。
本发明提供具有计算机可执行指令的计算机储存介质，当在计算机处理器上执行时，所述指令实施模拟TFPI KD1蛋白中所选三维(3D)点与测试化合物之间相互作用的方法。该方法包括获得该TFPI KD1蛋白的蛋白质结构3D模型；确定该蛋白质结构中的所选氨基酸子集之间的3D关系，其中所选氨基酸子集包括Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47和Ile55；模拟由所选氨基酸子集界定的表面；获得测试化合物的测试化合物3D模型；匹配该测试化合物3D模型与由所选氨基酸子集界定的表面；并鉴别该表面的所选氨基酸子集与该测试化合物3D模型之间的接触点。任选地，该方法还包括确定该表面与该测试化合物3D模型之间的接触点的数目；并记录该测试化合物3D模型的对应于接触点数目的亲和力等级。一方面，所选氨基酸子集包括Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47和Ile55(或由其组成)。该方法还任选包括获得基于第二测试化合物的更新的测试化合物3D模型；匹配该更新的测试化合物3D模型与由所选氨基酸子集界定的表面；并在计算机显示器上鉴别表面的所选氨基酸子集与更新的测试化合物3D模型之间的经鉴别的接触点。在一个实施方案中，该方法还包括确定表面与更新的测试化合物3D模型之间的接触点的数目；确定表面与更新的测试化合物3D模型之间的每个接触点的结合类型；并基于接触点数目和表面与更新的测试化合物3D模型之间的每个接触点的结合类型的集合记录新亲和力等级。如果需要，然后比较更新的亲和力等级与新亲和力等级以确定是测试化合物还是第二测试化合物具有更高亲和力等级。接触点可在计算机上显示，藉此有利于TFPI结合化合物的优化或设计。
此外，本发明提供具有计算机可执行指令的计算机储存介质，当在计算机处理器上执行时，所述指令实施模拟TFPI KD1-KD2蛋白中所选三维(3D)点与测试化合物之间相互作用的方法。该方法包括获得该TFPI KD1-KD2区域的蛋白质结构3D模型；确定该蛋白质结构中的所选氨基酸子集之间的3D关系，其中所选氨基酸子集包括R41、Y53、C59、E60、F96、C106、C130、N133、N136、F137、E142、Q63、R65、E67、E71、K74、M75、N80、N82、R83、I84、I85、T87、L131、M134、N145和I146；模拟由所选氨基酸子集界定的表面；获得测试化合物的测试化合物3D模型；匹配该测试化合物3D模型与由所选氨基酸子集界定的表面；并鉴别该表面的所选氨基酸子集与该测试化合物3D模型之间的接触点。该方法还包括确定表面与测试化合物3D模型之间接触点的数目；并记录对应于接触点数目的测试化合物3D模型的亲和力等级。在各个实施方案中，所述方法包括测定所选氨基酸子集之间的3D关系，所述氨基酸子集包括F28、K29、A30、D32、I46、F47和I55(和任选地，A27、D31、K36、A37、I38和/或F44)以及R41、Y53、C59、E60、Q63、R65、E67、E71、K74、M75、N80、N82、R83、I84、I85、T87、F96、C106、C130、L131、N133、M134、N136、F137、E142、N145和I146。
在另一实施方案中，计算机储存介质具有计算机可执行指令，当在计算机处理器上执行时，所述指令实施比较肽与TFPI Kunitz结构域1蛋白(KD1)中所选三维点(3D)的方法，该方法包括产生KD1蛋白的蛋白质结构；确定KD1蛋白中所选氨基酸子集的三维模型，其中该氨基酸子集包括Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47和Ile55；确定肽的三维模型；将该肽的3D模型与所选氨基酸子集的3D模型拟合；并产生该肽对所选氨基酸子集的亲和力，其中该亲和力基于所述子集中与肽接触的氨基酸数目及每个接触点的结合强度。可选地，所述计算机可执行指令实施比较肽与TFPI Kunitz结构域1和Kunitz结构域2(KD1-KD2)中所选三维点(3D)的方法，该方法包括产生KD1-KD2蛋白的蛋白质结构；确定KD1-KD2蛋白中所选氨基酸子集的三维模型，其中该氨基酸子集包括R41、Y53、C59、E60、Q63、R65、E67、E71、K74、M75、N80、N82、R83、I84、I85、T87、F96、C106、C130、L131、N133、M134、N136、F137、E142、N145和I146(任选与F28、K29、A30、D32、I46、F47和I55组合(和进一步任选与A27、D31、K36、A37、I38和/或F44组合))；确定肽的三维模型；将该肽的3D模型与所选氨基酸子集的3D模型拟合；并产生该肽对所选氨基酸子集的亲和力。
此外，提供比较测试化合物与TFPI KD1或TFPI KD1-KD2蛋白中所选三维点的方法。该方法包括在计算机存储器中产生KD1蛋白的蛋白质结构；在计算机处理器确定KD1蛋白中所选氨基酸子集的三维模型，其中所选氨基酸子集包括Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47和Ile55；在计算机处理器处确定测试化合物的三维模型；在计算机处理器处将测试化合物的3D模型与所选氨基酸子集的3D模型拟合；并在计算机处理器处产生测试化合物对所选氨基酸子集的亲和力，其中该亲和力基于所述子集中与测试化合物接触的氨基酸的数目和每个接触点处结合强度。可选地，该方法包括在计算机处理器确定KD1-KD2蛋白中所选氨基酸子集的三维模型，其中所选氨基酸子集包括R41、Y53、C59、E60、F96、C106、C130、N133、N136、F137、E142、Q63、R65、E67、E71、K74、M75、N80、N82、R83、I84、I85、T87、L131、M134、N145和I146，任选与F28、K29、A30、D32、I46、F47和I55组合(并进一步任选与A27、D31、K36、A37、I38和/或F44组合)。在一些实施方案中，该方法还包括显示测试化合物与所选氨基酸子集的3D模型之间拟合的3D展示，和任选地对多个测试化合物重复本文所述的步骤并储存所述多个测试化合物每一个的各自的亲和力。
参考图58，用于实施要求保护的方法和设备的示例性系统包括计算机110形式的通用计算装置。用虚线轮廓显示的组件在技术上不是计算机110的一部分，而是用于说明图58的示例性实施方案。计算机110的组件可包括(但不限于)处理器120、系统存储器130、内存/显卡接口121和I/O接口122。系统存储器130和图形处理器190可耦合至内存/显卡接口121。监视器191或其他图形输出装置可耦合至图形处理器190。
一系列系统总线可耦合各种系统组件，包括在处理器120、内存/显卡接口121和I/O接口122之间的高速系统总线123，在内存/显卡接口121与系统存储器130之间的前侧总线124，以及在内存/显卡接口121与图形处理器190之间的高级图形处理(AGP)总线125。系统总线123可为若干类型的总线结构中的任一个，作为例子而非限制，此类架构包括工业标准架构(ISA)总线、微通道架构(MCA)总线及增强型ISA(EISA)总线。随着系统架构发展，可以使用其他总线架构及晶片组但通常大体遵循此模式。例如，诸如Intel及AMD的公司分别支持英特尔集线器架构(Intel Hub Architecture，IHA)及HypertransportTM架构。
计算机110通常包括多种计算机可读介质。计算机可读介质可以是可由计算机110访问的任何可用介质，并且包括易失性和非易失性介质、可移动和不可移动介质。作为例子而非限制，计算机可读介质可以包括计算机存储介质。计算机存储介质包括以任何方法或技术实现的用于存储诸如计算机可执行指令、数据结构、程序模块或其他数据等信息的易失性和非易失性、可移动和不可移动介质。计算机存储介质包括RAM、ROM、EEPROM、闪存或其他存储器技术、CD-ROM、数字多功能盘(DVD)或其他光盘存储、磁盒、磁带、磁盘存储或其他磁性存储设备、或物理上体现电子数据的其他物理存储元件，并且不包括任何传播介质，例如无线电波或调制的载波信号。
系统存储器130包括易失性和/或非易失性存储器形式的计算机存储介质，只读存储器(ROM)131和随机存取存储器(RAM)132。系统ROM131可含有永久性系统资料143，例如计算机特定的配置数据。RAM 132通常含有可由处理器120即刻存取和/或正在操作的数据和/或程序模组。作为例子而非限制，图58示例说明了操作系统134、应用程序135、其他程序模块136和程序数据137。
I/O接口122可耦合系统总线123与许多其他总线126、127和128，总线126、127和128将多种内部和外部装置耦合至计算机110。串行外设接口(SPI)总线126可与含有基本例程的基本输入/输出系统(BIOS)存储器133连接，所述基本例程帮助例如启动期间计算机110内元件之间传递信息。
超级输入/输出芯片160可用于连接许多‘旧式(legacy)’外设，例如软盘152、键盘/鼠标162和打印机196。在一些实施方案中，超级I/O芯片160可用总线127(诸如低引脚数(LPC)总线)与I/O接口122连接。超级I/O芯片160的各种实施方案可在商业市场上广泛获得。在一个实施方案中，总线128可以是外设组件互连(PCI)总线。
计算机110还可以包括其他可移动/不可移动、易失性/非易失性计算机存储介质。仅作为例子，图58示例说明了对不可移动、非易失性磁介质读写的硬盘驱动器140。硬盘驱动器140可以是常规的硬盘驱动器。
可移动介质，例如通用串行总线(USB)存储器153、火线(IEEE 1394)或CD/DVD驱动器156，可直接或经由接口150与PCI总线128连接。可以在示例性操作环境下使用的其他可移动/不可移动、易失性/非易失性计算机存储介质包括但不限于磁带盒、闪存卡、数字多功能盘、数字录像带、固态RAM、固态ROM等。
以上讨论并在图58中示出的驱动器及其相关联的计算机存储介质为计算机110提供了对计算机可读指令、数据结构、程序模块和其他数据的存储。例如，在图58中，硬盘驱动器140被示为存储操作系统144、应用程序145、其他程序模块146和程序数据147。注意，这些组件可以与操作系统134、应用程序135、其他程序模块136和程序数据137相同或不同。操作系统144、应用程序145、其他程序模块146和程序数据147在这里被给定了不同的标号以说明至少它们是不同的副本。用户可以通过输入设备，诸如鼠标/键盘162或其他输入设备组合向计算机20输入命令和信息。其他输入设备(未显示)可以包括麦克风、操纵杆、游戏垫、盘式卫星天线、扫描仪等。这些和其他输入设备通常由I/O接口总线之一(例如SPI 126、LPC127或PCI 128)连接至处理器120，但也可以使用其他总线。在一些实施方案中，其他设备可以经由超级I/O芯片160耦合至并行端口、红外接口、游戏端口等(未描绘)。
计算机110可使用经由网络接口控制器(NIC)170至一个或多个远程计算机、例如远程计算机180的逻辑连接而在网络化环境中操作。远程计算机180可以是个人计算机、服务器、路由器、网络PC、对等设备或其他常见的网络节点，且通常包括上文相对于计算机110描述的元件的许多或全部。在图58中描绘的NIC 170和远程计算机180之间的逻辑连接可以包括局域网(LAN)、广域网(WAN)、或两者，但也可以包括其他网络。这样的联网环境在办公室、企业范围计算机网络、内联网和因特网中是常见的。
图59示例说明TFPI蛋白200的3D模型，其显示构成TFPI蛋白的代表性氨基酸202、204、206。感兴趣的TFPI蛋白的特定区域是未明确示出的KD1。所示表面通过构成蛋白质的氨基酸的定位形成。当研究或产生TFPI抑制剂时，由KD1区域中特定氨基酸形成的表面为人所关注。如本文中更详细论述的，KD1的生物效应通过结合KD1区域内的某些氨基酸而受到抑制。具体地，这些靶氨基酸包括Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47和Ile55。
图60示例说明与以上所列靶氨基酸的至少一部分结合的肽300。
图61是进行KD1和肽相互作用模拟的方法的示例说明。
可获得蛋白质的3D模型(方框302)且储存在计算机110的存储器140。该模型可使用已知工具局部产生或可获自公共来源。在一个实施方案中，所述蛋白质是TFPI KD1200。
可确定蛋白质结构中所选氨基酸子集之间的3D关系(方框304)。在在一个实施方案中，所选氨基酸子集包括Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47和Ile55；并且任选还包括Ala27、Asp31、Lys36和Ile38；并且任选还包括Ala37和Phe44。可选或附加地，所选氨基酸子集包括R41、Y53、C59、E60、Q63、R65、E67、E71、K74、M75、N80、N82、R83、I84、I85、T87、F96、C106、C130、L131、N133、M134、N136、F137、E142、N145和I146。并非此处所列的每一氨基酸都是结合以具有抑制(例如治疗)效应所需的。即，该组的其他子集也可具有相关性质。
对于相关氨基酸的特定子集，可以模拟由所选氨基酸子集界定的表面。外周可以由在每侧不具有其他相关氨基酸的那些氨基酸限定。表面的纹理可以由子集中的每个氨基酸的3D位置限定(方框306)。
可产生相关候选TFPI结合化合物(例如肽)的3D模型且储存在计算机110的存储器140(方框308)。
肽3D模型可以与由所选氨基酸子集界定的表面匹配或拟合(方框310)。可在相关点处，即在KD1的所选氨基酸上产生两者之间的最佳拟合。若干计算机工具可用于此类3D模拟和拟合，且可用于产生3D模型并使之相互匹配。一个实例是描述于以下的HADDOCK工具：“de Vries,S.J.,van Dijk,A.D.J.,Krzeminski,M.,van Dijk,M.,Thureau,A.,Hsu,V.,Wassenaar,T.和Bonvin,A.M.J.J.(2007)，HADDOCK versus HADDOCK：New features andperformance of HADDOCK2.0on the CAPRI targets.Proteins：Structure,Function,andBioinformatics，69：726–733.doi：10.1002/prot.21723”
表面的所选氨基酸子集的表面的模型与测试化合物(例如肽)3D模型之间的接触点可被鉴别、储存和任选地在计算机110的监视器191上显示(方框312)。化合物(例如肽)可被修饰以增加接触点数目或接触点处的键强度。为了有助于模拟该效应，可开发以下进一步描述的度量标准来衡量化合物与相关蛋白质(在我们的实例中是KD1)结合的亲和力。
此外，可以计数表面与化合物3D模型之间的接触点(方框314)，且可以记录对应于接触点数目的化合物3D模型的亲和力等级(方框316)。例如，如果所有14个上列氨基酸被靶向且14个中的12个由化合物3D模型实际接触或结合，则可以计算并记录12/14或0.86的亲和力等级。
然而，作为候选化合物偶合得多紧密以及由此其可保持与KD1偶联多久的量度的亲和力等级可不仅用相关键的数目而且可用键的类型来更准确地加以描述。也可确定每个接触点的结合类型(方框318)。关于TFPI结合肽，分子间距离≤4埃的疏水键可与分子间距离为2.6-3.2埃的键相区别。在一个实施方案中，小于3.2埃的键可被分配1.5的权重，且大于3.2埃的键可被分配1.25的权重。亲和力等级可参考使用这种或另一种加权的结合类型来更新或再计算(方框320)。例如，如果在之前实例中5个键为短键且7个键为长键，则新亲和力等级可为(5*1.5+7*1.25)/14＝1.16。
如果仅靶向KD1的7个氨基酸且4个以短键连接，则亲和力等级可为(4*1.5)/7＝0.86。然而，在这种情况下，当与其他亲和力等级进行比较时，将考虑较少靶向氨基酸。例如，所有等级都可以标准化为基于总的所需靶位点的标准。
如果不进行更多迭代，则不可采用方框322的分支，且结果可被储存以供进一步分析和决策(方框324)。如果要分析其他肽或之前测试的肽的变异体，则可采用方框322的‘是’分支且可产生或以其他方式获得并储存相关肽的新或更新模型(方框326)。可重复方框310至320的步骤且当前操作的结果可与先前操作的结果比较以确定哪些肽/变体具有较高亲和力等级和值得更多研究，包括可能的物理测试。
用3D模拟靶特定位点并产生比较等级的能力允许相对容易地处理若非数千也有数百个的样本并比较，避免了x射线结晶术的时间及成本。此技术可以特别适用于与TFPIKD1的F28、K29、A30、D32、I46、F47、I55、A27、D31、K36、I38、F2、A37和F44氨基酸和/或TFPIKD1-KD2的R41、Y53、C59、E60、Q63、R65、E67、E71、K74、M75、N80、N82、R83、I84、I85、T87、F96、C106、C130、L131、N133、M134、N136、F137、E142、N145和I146相关的模拟。
本说明书引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同每个出版物或专利申请被明确且单独地指出通过引用并入本文。另外，整个文件预期作为统一公开内容而关联，应该理解，涵盖本文描述的特征的所有组合，即使特征的组合没有在本文件的同一句子或段落或章节中一起出现。例如，在描述蛋白疗法时，明确涵盖涉及多核苷酸疗法(使用编码蛋白的多核苷酸/载体)的实施方案，反过来也一样。虽然为了清楚理解的目的，借助说明和实例已经较详细地描述了前述发明，但本领域普通技术人员根据本发明的教导容易理解可以作出某些改变和修改而不背离所附权利要求的精神或范围。例如，本发明包括在范围上以任何方式比上述具体提到的变体更窄的本发明实施方案。关于作为类属描述的本发明的方面，所有个体种类都被个别认为是本发明的单独的方面。关于用“一个”或“一种”描述或主张的本发明的方面，要理解这些术语表示“一或多”，除非上下文明确地要求了更加限定的含意。关于被描述为一组内的一个或多个的要素，应该理解，涵盖该组内的所有组合。最后，除非通过引述词语“装置(means)”和没引述任何结构的功能来定义一个权利要求元件，则不预期任何权利要求元件的范围基于35U.S.C.§112第六段的申请来解释。
实施例
由此总体描述的本发明将参考以下实施例更容易地理解，以下实施例的提供仅作为示例说明而不是要限制本发明。
实施例1
以下实施例描述结合TFPI的肽的产生、鉴别和筛选。
肽候选物从供应商(例如，PolyPeptide Laboratories SAS(Strasbourg，France)和JPT Peptide Technologies GmbH(Berlin，Germany))获得。上面提供了合成候选肽的方法。候选肽合成为三氟乙酸(TFA)盐，纯度为>90％或>60％。所有肽溶解在DMSO中达储存浓度10mM。TFPI结合肽序列使用mRNA展示文库鉴别。mRNA展示技术优于其他的文库筛选技术，允许起始池内多达1014个不同序列，并避免例如噬菌体展示所需的体内步骤。简言之，所述技术包括将mRNA与其编码的候选肽通过嘌呤霉素分子直接连接(图5)。mRNA展示方法进一步描述在国际专利公布号WO2005/051985和Liu等人，Methods in Enzymology，318，268-293(2000)中。TFPI通过生物素固定到固体载体上并暴露于候选肽-RNA复合物。分离结合了TFPI的候选肽-RNA复合物，并将所述RNA反转录以获得编码DNA。使用竞争性规避策略，在六到十轮选择之后，获得高亲和力结合剂。许多候选肽的长度是31个氨基酸(27个随机化氨基酸和在两端旁侧的2个氨基酸)。
将选择的肽合成并使用基于微阵列的扫描分析进行肽优化，以鉴别维持TFPI结合亲和力的肽片段。例如，使用所述肽的一系列20氨基酸片段进行JBT0047的基于微阵列的扫描，所述片段的序列有19个氨基酸重叠。简言之，将N端经氨基氧基乙酸酯修饰的肽印在Corning环氧化物玻璃载玻片上。在洗涤并干燥之后，在TECAN HS400TM孵育站中处理载玻片。载玻片于含有0.1％TWEEN(TBST)的Tris缓冲盐水中洗涤2分钟，并于基于Tris的T-20SuperBlockTM缓冲液(5mM CaCl2)(Pierce)中阻断30分钟。在阻断之后，载玻片于TBST中洗涤2.5分钟。载玻片随后与DYLIGHTTM649标记的TFPI(1μg/ml于基于Tris的T-20SuperBlockTM缓冲液(5mM CaCl2))一起孵育45分钟，并用连续流动的TBST持续10分钟洗涤2次。对载玻片用盐水-柠檬酸钠缓冲液作最终洗涤持续2分钟，并空气干燥4分钟。在Axon4000B扫描仪中扫描载玻片，并使用Pro软体分析扫描。N端和C端截短分析补充扫描分析。微阵列扫描结果证明肽JBT0293以最高亲和力结合TFPI。产生基于JBT0293的氨基酸序列的一系列取代突变体并测试TFPI结合性质。
经由用生物素化肽进行的酶联免疫吸附检定(ELISA)样检定(结合(EC50)ELISA)证明一个子集的肽对TFPI的亲和力。96孔MaxiSorp板(Nunc)经含3μg/mL TFPI的涂布缓冲液(15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH9.6)涂布过夜。板用350μl洗涤缓冲液(HNaT：175mM NaCl，25mM HEPES，5mM CaCl2，0.1％Tween 80，pH7.35)洗涤3次，并随后用200μl含2％酵母提取物的HNaT阻断2小时。板然后用350μl HNaT洗涤3次。生物素化候选肽自DMSO储存溶液开始在HNaT中1/200稀释。如果10mM肽储液1/200稀释期间没有出现沉淀，那么初始肽浓度是50μM。如果形成沉淀，则进行肽储液在DMSO中的预稀释。将稀释的肽施加到Maxisorp板，产生连续稀释液(1/3)，将所述稀释液在室温下孵育1.5小时。孵育后接着三个洗涤步骤(350μlHNaT)。通过用辣根过氧化物酶轭合的链霉亲和素孵育(1小时)，然后用HNaT进行三个洗涤步骤，和随后添加TMB(3,3’5,5’-四甲基联苯氨)显色转化，来检测结合的肽。所述检定示例说明于图6Α。
一般而言，肽与固定化TFPI的结合将显著超过背景。图32-39给出了生物素化肽的EC50值。图7描绘了一个TFPI结合肽JBT0132的结合曲线。JBT0132的EC50经计算为约2.2nM。
另外，使用生物素化的TFPI结合性肽作为“示踪剂”进行竞争(IC50)ELISA，与非生物素化的候选肽竞争TFPI结合。检定原理描绘在图6B中。96孔MaxiSorp板(Nunc)用含3μg/mL TFPI的涂布缓冲液(15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH9.6)涂布过夜。可以根据检定的特定条件来改变TFPI的浓度；在本文参考的其他IC50ELISA检定中，涂布缓冲液含有0.05μg/mlTFPI。用350μl洗涤缓冲液(HNaT：175mM NaCl，25mM HEPES，5mM CaCl2，0.1％Tween 80，pH7.35)洗涤板三次，并用含200μl 2％酵母提取物的HNaT阻断2小时。板然后用350μl HNaT洗涤三次。以对应于其在结合ELISA中测定的相应EC90值(n>2时，中值)的浓度施加生物素化的示踪肽。肽的竞争剂储液(10mM)在没有HSA的HNaT中1/33.3稀释，用含3％DMSO的HNaT制备一系列1/3稀释液。特定检定中采用的稀释策略取决于肽的亲和力。所述稀释液用生物素化的示踪肽以1：6的比率进一步稀释(20μl竞争剂稀释液和100μl示踪肽)。竞争剂和示踪肽的混合物施加到TFPI涂布的微量滴定板并孵育1.5小时。板用350μl HNaT洗涤三次。通过向微量滴定板施加HRP轭合的链霉亲和素，孵育混合物一小时，用350μl HNaT洗板三次，施加TMB(3,3’5,5’-四甲基联苯胺)，并检测随后TMB通过HRP的显色转化，来检测肽-TFPI结合。图8A-8D提供了代表性的非生物素化肽的IC50图。肽JBT0303、JBT0120和JBT0224的IC50测量结果示于表3。
表3
除了竞争ELISA(IC50)检定外，利用筛选检定来平行测量更大数目的肽。筛选ELISA类似于竞争IC50ELISA，除了仅仅使用三个不同浓度的竞争剂(对于JBT0047类为300nM、100nM和33.3nM，对于JBT0122类为50000nM、16667nM和5556nM)。在一些情况中，筛选结果表示为相对于竞争肽(JBT0047家族的竞争肽是JBT0477，JBT0122家族的竞争肽是JBT1697)，示踪信号的百分比抑制。图32-39提供了根据本文提出的方法制备和筛选的肽的竞争IC50检定结果和筛选检定结果。图32-39显示的平均IC50值是基于比表3中显示的值更大数目的检定，因此，所述值稍有差别。筛选ELISA的结果表示为示踪肽JBT0131结合的百分比抑制。使用IC50ELISA分析的几个肽根据其在表4显示的结合亲和力，在图32-39中分类。
表4
TFPI竞争ELISA IC<sub>50</sub>[nM] 组
＜50nM A
50≤x＜100nM B
100≤x＜250nM C
250≤x＜1000nM D
1000≤x＜5000nM E
5000≤x＜10000nM F
10000≤x＜50000nM G
利用本文描述的方法鉴别的示例性TFPI结合肽显示在表5中。一些肽是生物素化的，并且很多包含N和C末端赖氨酸以提高溶解度。如下所述，几个肽在模型和/或血浆检定系统中呈现TFPI抑制活性。
表5
本实施例提供了生成和表征TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)的示例性方法。发现表5中所有肽均结合人TFPI-1α。突变分析证明，TFPI结合肽中至少一个氨基酸可以被取代，同时保持对TFPI的亲和力。在ELISA检定中测试的表5的肽与TFPI-1α结合的EC50小于10μM(1×10-5M)并且IC50小于50μM。
实施例2
选择的TFPI结合肽在“抗靶”结合方面进一步表征。本实施例证明，TFPI结合肽表现出对非TFPI-1蛋白质的亲和力降低。
TFPI-2由于它与TFPI-1的相似性而被选为抗靶。使用BIAcore3000TM表面等离子体共振检定(GE Healthcare，Chalfont St.Giles，UK)研究TFPI结合肽与人TFPI-1(在C末端处与10His标签融合的残基29-282；MW 41kDa(R&D Systems，Minneapolis，MN；目录号2974-PI))、鼠TFPI-1(在C末端处与10His标签融合的残基29-289；MW41kDa(R&D Systems；目录号2975-PI))和TFPI-2(R&D Systems，Minneapolis，MN)的结合动力学。TFPI蛋白通过胺偶联化学而固定在C1芯片(GE Healthcare，订购代码：BR-1005-40)，目标为500RU。使用几个TFPI结合肽作为分析物，与固定化的TFPI蛋白相互作用。采用30μl/分钟的流速。180秒后，注射180μl范围从3.84nM至656.25nM的六个不同浓度的肽溶液，随后是480秒的解离时间。芯片用45μl10mM NaOH再生。在每次结合试验之前和之后用HBS-P缓冲液(10mM HEPES，pH7.4，150mM NaCl，0.005％P20)加上1％DMSO和0.8％P80进行四次测量。利用版本4.1软件(GE Healthcare)分析数据。将感应图对1：1Langmuir结合曲线进行拟合，以确定k结合和k解离，并计算KD。
某些测试肽，例如JBT0050、JBT0121、JBT0205和JBT0211，与空白孔结合，并且从那些感应图不能确定结合常数。JBT0133显示与TFPI-1弱结合。来自其他肽的感应图给出了可靠的结合常数。表6和图19-21提供了几个TFPI结合肽的BIAcore分析结果。表6列出的每个肽显示小于10μM的KD。除了以下列出的肽，JBT0375和JBT0477(JBT0293在氨基酸位置5(JBT0375)的取代突变体或氨基酸位置5和10(JBT0477))也表现出小于10μM的KD。JBT1837(SEQ ID NO：1044)也证明了小于10μM的KD(KD＝0.5nM；k结合＝8×1031/Ms；k解离＝1.3×10-61/s)。两种肽的感应图提供为图9A和9B。
表6
肽 k<sub>结合</sub>(1/Ms) k<sub>解离</sub>(1/s) K<sub>D</sub>(M)
JBT0047 4.0x10<sup>5</sup> 1.9x10<sup>-2</sup> |4.7x10<sup>-8</sup>
JBT0120 1.17x10<sup>6</sup> 4.78x10<sup>-2</sup> 4.08x10<sup>-8</sup>
JBT0131 1.4x10<sup>5</sup> 6.0x10<sup>-2</sup> 4.31x10<sup>-7</sup>
JBT0132 3.55x10<sup>4</sup> 3.26x10<sup>-2</sup> 9.17x10<sup>-7</sup>
JBT0224 6.39x10<sup>4</sup> 1.95x10<sup>-2</sup> 3.05x10<sup>-7</sup>
JBT0293 6.0x10<sup>5</sup> 5.6x10<sup>-2</sup> 9.5x10<sup>-8</sup>
JBT0297 5.0x10<sup>5</sup> 1.4x10<sup>-2</sup> 2.9x10<sup>-8</sup>
JBT0303 8.13x10<sup>5</sup> 2.75x10<sup>-2</sup> 3.4x10<sup>-8</sup>
JBT0305 7.5x10<sup>5</sup> 3.1x10<sup>-2</sup> 6.1x10<sup>-8</sup>
还检查了与TFPI-2抗靶的相互作用。候选肽与人TFPI-2相互作用产生的最大信号比TFPI-1作为相互作用配偶体获得的信号低得多。低TFPI-2结合信号的动力学分析容易产生误差；因此，感应图的视觉比较用于估计结合亲和力。图10A和10B提供了示例说明JBT0120与TFPI-1和TFPI-2结合的感应图。JBT0120结合TFPI-2的亲和力比它结合TFPI-1的亲和力低10倍。还发现JBT0132表现出比对TFPI-2高至少10倍的对TFPI-1的亲和力。
本实施例提供的数据证实，TFPI结合肽特异性结合TFPI-1。
实施例3
下面的实施例描述了使用FXa抑制和外源性tenase抑制检定，表征实施例1中鉴别的选择肽的TFPI抑制活性。所述两个检定预测血浆系统的活性。外源性tenase检定有助于了解所述肽对以下的影响：(a)FXa和TFPI的相互作用，和(b)FXa-TFPI复合物与TF-FVIIa复合物的相互作用。FXa抑制仅检定测量肽对FXa和TFPI相互作用的影响。
外源性tenase复合物在凝血过程开始后，造成FX和FIX活化。所述外源复合物由FVIIa、组织因子(TF)和FX底物构成。为了确定肽对外源性tenase复合物的TFPI介导抑制的影响，建立了酶联检定。肽从10mM储液(在DMSO中)1/6.25稀释，并通过在缓冲液或DMSO中连续1/4稀释而进一步稀释，以防止不想要的沉淀。TFPI在HNaCa-HSA或BSA(25mM HEPES；175mM NaCl；5mM CaCl2；0.1％HSA或BSA；pH7.35)中稀释。向96孔板加入全部都在HNaCa-HSA中稀释的FVIIa、脂质化TF、磷脂囊泡(DOPC/POPS 80/20)和FXa特异性显色底物(S-2222(可获自DiaPharma，West Chester，OH))。孵育期后，添加TFPI和肽稀释液，得到2.5％DMSO(如果存在于肽储液中)终浓度。通过向孔中添加FX，启动FX活化。通过使用微板读数器观察吸光度增加，测定FXa介导的显色底物转化。由OD读数计算某些时点产生的FXa的量。考虑反应开始后20分钟产生的FXa用于从肽浓度对比TFPI抑制(％)的曲线计算EC50。
还使用FXa抑制检定检查了TFPI的功能抑制。均在HNaCa-HSA中稀释的FXa特异性显色底物(S-2222)和TFPI添加到96孔板中。肽从10mM储液(在DMSO或Aqua-Dest中)1/6.25稀释，并通过在缓冲液或DMSO中连续1/4稀释而进一步稀释，以防止不想要的沉淀。向96孔板添加肽稀释液(2.5μl)，得到2.5％DMSO(如果存在于肽储液中)终浓度。通过添加FXa引发显色底物的转化，在微板读数器中测量转化动力学。因为IFPI缓慢抑制FXa，考虑115分钟之后的OD读数用于从肽浓度对比TFPI抑制(％)的曲线计算EC50。
表7和图22-27提供了外源性tenase检定和FXa抑制检定的结果。
表7
参考表7，JBT0120、JBT0132和JBT0224在TFPI-1存在下恢复外源复合物介导的FX活化，EC50<2μM，导致约20％至约60％的TFPI活性抑制。JBT0047(EC50＝1.4μM)、JBT0131(EC50＝2.2μM)和JBT0293(EC50＝2.9μM)也在TFPI-1存在下恢复外源复合物活性。另外，在FXa抑制检定中，JBT0120、JBT0132、JBT0224和JBT0303在TFPI-1存在下恢复FXa活性，EC50<5μM，导致约5％至约50％的TFPI活性抑制。在FXa抑制检定中，JBT0047(EC50＝0.7μM)、JBT0131(EC50＝8.2μM)、JBT0293(EC50＝1.3μM)、JBT0297(EC50＝0.6μM)和JBT0305(EC50＝2.3μM)也在TFPI-1存在下恢复FXa活性。本实施例证实本发明的肽是TFPI拮抗剂。
实施例4
在本实施例中，使用基于血浆的检定来确定肽的TFPI抑制活性。
在缓慢裂解凝血酶特异性荧光底物Z-Gly-Gly-Arg-AMC(Hemker，Pathophysiol.Haemost.Thromb.，33，4-15(2003))之后，在Fluoroskan读数器(Thermo Labsystems，Helsinki，Finland；滤器390nM激发和460nM发射)中通过自动校准的血栓图像，双份测量肽对凝血酶生成的影响。获取FVIII或FIX缺陷患者的血浆(GeorgeKing Bio-Medical Inc.，Overland Park，KN)供测试。每个血浆的残余凝血因子活性低于1％。作为用于抗体介导的FVIII缺陷的模型，将冷冻的合并的正常血浆(George King Bio-Medical Inc.，Overland Park，KN)与在山羊中产生的高滴度、热灭活的抗人FVIII血浆(4490BU/ml；Baxter BioScience，Vienna，Austria)一起孵育，达到50BU/mL。血浆与玉米胰蛋白酶抑制剂(CTI)(Hematologic Technologies,Inc.，Essex Junction，VT)混合，以抑制凝血因子XIIa污染，导致终浓度为40μg/mL。
预温的(37℃)血浆(80μL)加到96孔微板(Immulon 2HB，透明U底；ThermoElectron，Waltham，MA)的每个孔中。为了触发通过组织因子产生凝血酶，添加10μL包含低量(12pM)重组人组织因子和由磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和磷酯酰乙醇胺构成的磷脂囊泡(48μM)(Thrombinoscope BV，Maastricht，The Netherlands)的低PPP试剂。肽从10mM储液用DMSO以1/7.5稀释，并用Aqua-Dest以1/8.33进一步稀释，导致DMSO浓度为12％，在最终检定混合物中提供0.5％DMSO浓度。在即将把板放入预温的(37℃)读数器之前，加入5μL含有5mg/mL人血清白蛋白(Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，Missouri，USA)的HEPES缓冲盐水或含12％DMSO的Aqua-Dest，然后加入肽稀释液或参照蛋白(FVIII Immunate参照标准(Baxter BioScience，Vienna，Austria)、凝血因子VIII抑制剂旁路活性(FEIBA)参照标准品(Baxter BioScience，Vienna，Austria)；NovoSeven(Novo Nordisk，Denmark)；和纯化的人血浆FIX(Enzyme Research Laboratories，South Bend，IL))。通过向每孔分配20μL含有荧光底物和HEPES缓冲的CaCl2(100mM)的FluCa试剂(Thrombinoscope BV，Maastricht，The Netherlands)，启动凝血酶生成。37℃下记录荧光强度。
使用ThrombinoscopeTM软件(Thrombinoscope BV，Maastricht，The Netherlands)和凝血酶校正器来校正内部滤器和底物消耗效应，计算所得到的凝血酶生成曲线的参数(Hemker，Pathophysiol.Haemost.Thromb.，33，4-15(2003))。为了计算某些与参照蛋白(例如，FVIII参照标准品、FEIBA参照标准品)等效的肽浓度的凝血酶生成活性，针对标准浓度绘制各凝血酶生成曲线的峰值凝血酶量(峰值凝血酶，nM)，并通过非线性算法拟合。根据该校正，计算FVIII Immunate、FIX、FEIBA或NovoSeven的等效活性。图12-18和图28-30提供了各种肽的结果。代表性结果提供在表8中。(*表示从不同供体获得的FVIII缺陷血浆。)
表8
参考表8，JBT0120、JBT0132、JBT0224和JBT0303在FVIII清除的血浆中将TFPI依赖性凝血酶生成提高到超过在含有FVIII的血浆中凝血酶生成水平的1％(％FVIII等效活性)。测试肽在FVIII缺陷血浆中表现出大约5％-40％的FVIII等效活性。如图11A和11B所示，JBT0120和JBT0132剂量依赖性地提高峰值凝血酶和峰值时间。
在基于血浆的检定以及实施例3中描述的FXa抑制和外源性tenase抑制检定中测试了基于JBT0293的氨基酸序列的取代突变体。代表性结果提供于表9。
表9
此外，包含JBT0293的氨基酸序列但是在JBT0293的氨基酸位置5和10有取代的JBT0477提高了FVIII缺陷血浆中凝血酶生成，相当于413mU/ml FVIII(以1μM的肽)。JBT0293的取代突变得到了在对TFPI亲和力以及在FXa抑制、外源性tenase抑制和基于血浆的检定中活性提高方面高度优化的肽。
实施例5
下面的实施例证明本发明的肽可以通过添加提高肽的物理化学或药代动力学性质的部分加以修饰。如下面示例说明的，向本文描述的肽添加40kDa PEG显著改善了肽的药代动力学行为。本实施例还描述了TFPI结合肽JBT1857的优化，以减少对蛋白水解的敏感性。
使化学或生物部分与肽轭合的方法是本领域已知的。为了将PEG(聚乙二醇)加入本文描述的肽，向所述肽的N末端添加官能团(AOA＝氨基氧乙酸)，用于偶联醛和酮。可选地，向所述肽的C末端部分添加半胱氨酸，用于与马来酰亚胺偶联(Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press(1996))。将肽(JBT1586)AOA-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2(SEQ ID NO：166)和(JBT1587)Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKLC-NH2(SEQ ID NO：167)用于分别用PEG进行N末端和C末端修饰。AOA-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2(SEQ ID NO：166)和Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKLC-NH2(SEQ ID NO：167)分别与过量的40kDa mPEG-丙醛(SUNBRIGHT ME-400AL2，NOF，Japan)和40kDa mPEG-马来酰亚胺(SUNBRIGHT ME-400MA，NOF，Japan)一起孵育。得到的聚乙二醇化肽，JBT1852和JBT1855表现出与起始结构Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2(JBT0740)(SEQ ID NO：66)相比类似的亲和力。
得到的聚乙二醇化肽在小鼠中表现出显著增加的血浆稳定性和延长的血浆半衰期。图31示例说明了在静脉施用给小鼠之后，游离肽JBT0740(Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2)(SEQ ID NO：66)与C末端聚乙二醇化肽JBT1855(Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKLC(PEG(40kD))-NH2)(SEQ ID NO：252)比较的药代动力学分析结果。与未聚乙二醇化的肽对比，聚乙二醇化的肽在施用后100分钟时在小鼠血浆中以高浓度存在。未聚乙二醇化的肽则从血浆迅速清除。图40示例说明了JBT1855在皮下注射之后的药代动力学分析结果。JBT1855还在实施例4描述的检定中强劲提高了凝血酶生成(图41)。
还在实施例1-4描述的检定中表征了JBT1852和JBT1855肽，并与JBT0740和JBT0047家族的其他肽对比。代表性的结果提供于以下提出的表10。
表10
*在25mM HEPES，pH7.35，175mM NaCl中配制
还检定了表10中列出的肽与TFPI-2抗靶的相互作用，且产生的信号对于可靠亲和力测量而言过低。数据表明聚乙二醇化没有消除本发明肽的抑制活性或负面影响对TFPI-1的选择性。
基于细胞的外源性tenase检定
上述TFPI结合肽恢复外外源性tenase复合物介导的转化FX至FXa的能力也使用基于细胞的外源性tenase检定来测定。基于细胞的外源性tenase检定还用于研究聚乙二醇化对本发明的示例性TFPI结合肽JBT0740的影响。计数人脐静脉内皮细胞(HUVEC)并以每孔1.5x104细胞的密度接种于96孔板(黑色平板，具有透明底)中的完全生长培养基中。使细胞生长过夜(持续约16至18小时)，用预温的基本培养基洗涤2次，在37℃下用1ng/ml重组TNFα(Sigma Aldrich(目录号T6674))于200μl基本培养基中刺激4小时，且用200μl预温的细胞培养缓冲液洗涤2次。含有FVIIa(Enzyme Research Laboratories)、TFPI结合肽(溶解于DMSO或Hepes缓冲盐水，有或没有0.1％Tween-80)或αTFPI抗体的缓冲液(50μl)施加至细胞中，且在37℃下孵育20分钟，从而允许FVIIa/TF复合物形成及TFPI拮抗剂与TFPI结合。在孵育期之后，施加50μl含有FX和FXa特异性底物(Fluophen FXa(HYPHEN BioMed))的细胞培养缓冲液，导致细胞上最终体积100μl的细胞培养缓冲液混合物。最终浓度为：39pM FVIIa；170nM FX；250μM Fluophen FXa，和2.5％DMSO(肽溶解于DMSO时)。
将96孔板转移至预温(37℃)的萤光读数器以检测通过FXa的FXa特异性萤光底物转化，FXa是由经刺激的HUVEC的表面上TF/FVIIa复合物产生的。在孵育9分钟之后获取的读数用于计算TFPI结合肽或抗体的TFPI抑制效应。在以下肽(属于JBT0047家族)的各种浓度下观察到的TFPI的近似百分比抑制示于表11中：JBT0717(Ac-FQSK-Nmg-NVFVDGYFERLRAKL-NH2)(SEQ ID NO：61)、JBT0740(Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2)(SEQ ID NO：66)、JBT1584(Ac-FQSK-Nmg-NVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2)(SEQ ID NO：164)和JBT1857(Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKL-NH2)(SEQ ID NO：178)。
表11
还使用基于细胞的外源性tenase检定测试了聚乙二醇化肽。JBT0740(SEQ ID NO：66)在N端处与1kD PEG部分轭合以产生JBT1853或在C端处轭合以产生JBT1854。JBT1853和JBT1854抑制TFPI 20％或更少，取决于检定中使用的肽的量。在C端处包含40kD PEG部分的JBT1855(亲本肽JBT0740)在基于细胞的检定中表现优于在N端处包含40kD PEG部分的JBT1852。JBT1855介导20-30％TFPI抑制，而JBT1852抑制TFPI活性10％或更少。
JBT0120家族的肽JBT0120、JBT0415、JBT0444、JBT1426和JBT1837也在基于细胞的外源性tenase检定中测试并发现在比JBT0047家族肽更小程度上抑制TFPI。降低或部分抑制活性可以是本发明的一些实施方案中所需的。与JBT0047家族的肽类似，肽优化增加了JBT0120家族肽的TFPI抑制剂活性。
在检查JBT1857的稳定性和抑制活性的过程中，确定肽的氨基酸序列在Val9与Asp10之间含有蛋白酶裂解位点。位置9处的Tle的取代(产生JBT2431)和位置10处的Pro的取代(产生JBT2432)阻断了肽的裂解且使肽的血浆稳定性增强约3倍，从27％(JBT1857)至82％(JBT2431)和76％(JBT2432)。在Gly11与Tyr12之间鉴别出另一推定裂解位点。G11a取代(产生JBT2414)进一步提高肽的稳定性至100％。所有稳定性都在人血浆中孵育24小时之后通过定量ELISA测定。
上述结果证明利用非常规氨基酸优化本文描述的TFPI结合肽提高了TFPI抑制和血浆稳定性。另外，本发明的聚乙二醇化肽在基于细胞的外源性tenase检定中抑制TFPI活性，其中C端聚乙二醇化肽表现优于N端聚乙二醇化肽。本发明的TFPI结合肽抑制游离TFPI和细胞结合TFPI两者的活性。
实施例6
以下实施例示例说明本文所述的肽降低动物模型中出血的能力。
10周龄的C57Bl/6NCrl小鼠在研究之前圈养2周。在趾甲夹住之前30分钟，给动物施用(a)JBT1855(10mg/kg)，经由尾静脉静脉内(i.v.)或在颈区域皮下(s.c.)，(b)抗TFPI抗体(18mg/kg；i.v.)，或(c)媒介物(175mM NaCl，25mM HEPES，pH7.35；10ml/kg；i.v.)。在趾甲夹住之前10分钟用80mg/kg戍巴比妥麻醉动物。为了实现出血，移除右后爪小趾的趾甲。将爪浸没于0.9％NaCl溶液中以收集血液持续60分钟的时期。在溶解之后通过分光光度法对失血进行定量。在整个实验过程中保持温度恒定于37℃。研究结果说明于图42并概括于表12。
表12
本发明聚乙二醇化的肽JBT1855的静脉内或皮下施用与单独媒介物治疗相比减少了小鼠的失血。
实施例7
以下实施例描述经由核磁共振和x射线结晶学对TFPI-肽相互作用的表征。具体地，在分子水平上使用2D 15N-杂核单量子相干(HSQC)光谱考察了拮抗肽JBT0303、JBT0122和JBT0415的TFPI结合位点；JBT0303、JBT0122和JBT0415与TFPI160相互作用的残基；和复合及游离JBT0303、JBT0122和JBT0415的二级结构。使用x射线结晶学检查JBT1857与TFPI的KD1的相互作用，并定位介导JBT1857结合的TFPI KD1的残基。
TFPI160上JBT0303结合位点的鉴别
15N-标记的TFPI160制备物用于以JBT0303进行的TFPI160的滴定实验。在30℃下在Varian 600MHz光谱仪上记录不含和含递增量的肽的～500μM 15N-TFPI160样品的HSQC光谱。肽-蛋白质相互作用显示缓慢交换行为(kex<<Δω)，意味着各TFPI残基产生游离蛋白质和蛋白质-肽复合物的有限信号。不同于其中混合物产生具有根据种群平均位置的仅1个峰的快速交换行为(kex>>Δω)，缓慢交换行为不允许在肽结合后追踪信号。因此，为了定位结合位点，需要归属TFPI160-JBT0303复合物的移位峰。这需要制备13C/15N-TFPI160和JBT0303的样品。
最初，用992μM 13C/15N-TFPI160和1190μM JBT0303制备样品。然而，NMR样品产生不允许复合物归属的不良品质光谱。样品胶化，可能由于高分子量聚集体的形成。因此，所得NMR数据主要显示由经同位素标记的TFPI160的最柔性部分产生的信号。因此，再考察样品条件供进一步实验。根据对TFPI160-JBT0303复合物进行的一系列15N-HSQC实验，结论是凝胶形成可通过样品稀释和在升高温度下获取数据来避免。13C/15N-TFPI160的最终浓度为331μM，且JBT0303的最终浓度为397μM。光谱品质得以改善。归因于较低浓度和降低的信噪比，必须基于HNCA、HNCO和HNCOCA实验进行归属。
除了4个先前归属的残基，可在apo-TFPI 160中归属的所有残基都可在TFPI160-JBT0303复合物中归属。一些残基的归属由于3D光谱中缺乏峰而不明确。此外，3个残基的峰仅在来自原始滴定实验的HSQC光谱中可见。然而，附近的所有峰都被明确归属，因此，这些残基的归属可能是正确的。
相较于游离TFPI160，与JBT0303结合的15N-TFPI160的HSQC信号的化学位移变化示例说明于图43。经历最强化学位移的残基仅在Kunitz结构域1上。残基F25、F28、D32、A37、T48和Y56的化学位移移位最大(>2ppm)。残基I38、I46、F47和F54也移位超过1.5ppm。不清楚是否F25的N端残基参与和JBT0303的相互作用，因为残基20-24未归属。L19显示化学位移变化总计～0.6ppm。因此，与TFPI的残基1-18内的氨基酸参与肽结合的先前观点相反，本数据表明即使有也很少的肽与TFPI的N端尾结合。图44提出TFPI蛋白的二级结构的带状模型，示例说明了相较于游离TFPI160，与JBT0303结合的TFPI160的HSQC信号的化学位移变化的区域。
为了更具体鉴别TFPI160上的JBT0303结合位点，测定了15N-TFPI160和15N-TFPI160+JBT0303的酰胺交换率。酰胺交换实验主要通过测量酰胺基的H交换来检测肽骨架环境中的变化。用足够高以致不因弛豫而消散的能量来照射H2O频率，导致H2O信号的完全饱和和抑制。这种H2O信号抑制的方法的副作用在于抑制转移至与溶剂交换(H/H交换)的可交换酰胺NH。饱和转移取决于半定量的H/H交换率。对于经更多保护的NH基团而言，该作用降低(即，未经保护的NH比经保护的NH更多衰减)。如果经保护的NH位于配体的H-α附近，则观察到相较于apo形式更高的交换率。类似地，H交换可由Ser、Thr或Tyr的OH基团介导。
记录apo15N-TFPI160和15N-TFPI160-JBT0303复合物的无和有水抑制的HSQC光谱。通过计算有和无水抑制的HSQC光谱中的峰强度的比率来确定TFPI160的各残基的相对交换率。15N-TFPI160与15N-TFPI160+JBT0303的数据集的比较揭示TFPI残基25、26、36、62、63、127、132和152在复合物中展现超过10％的酰胺交换率降低，而残基29、30、42、45、49、50、56、66和98展现超过10％的交换率增加。
包括源于酰胺交换实验的约束以计算改进的HADDOCK模型：(a)扭角取自JBT0303的K4、K5、V7、F8、Y12-A18的TALOS的计算(化学位移实验)；(b)化学位移变化超过1.5ppm的KD1的残基参与结合JBT0303：F25、F28、D32、A37、I38、I46、F47、T48、F54和Y56(化学位移实验)；(c)JBT0303的两亲性螺旋的疏水侧与KD1结合：JBT0303的Y12或L16或L20与KD1的D32或A37或I38或F54或Y56结合(化学位移实验)；(d)JBT0303的R15或K19与KD1的D31或D32或E60结合(化学位移实验)；(e)JBT0303的F8或V9与KD1的F25或F28结合(化学位移实验)；(f)JBT0303的Y12或F13与KD1的I46或F47或T48结合(化学位移实验)；(g)JBT0303的Q2与KD1的Y56结合(化学位移实验)；(h)JBT0303的F1与KD1的M39或F66结合(酰胺交换实验)；(i)JBT0303的S3或K4或K5与F66结合(酰胺交换实验)；(j)JBT0303的V7或F8或V9与KD1的F25或C26或N62或Q63结合(酰胺交换实验)；(k)JBT0303的V9或D10或G11或R15与KD1的F28或K29或A30结合(酰胺交换实验)；(l)JBT0303的Y12或F13与KD1的N45结合(酰胺交换实验)；(m)Y12或F13或E14或R15与KD1的R49或Q50结合(酰胺交换实验)；和(n)JBT0303的L20与KD1的Κ36结合(酰胺交换实验)。数据汇集成KD1+JBT0303复合物的基本上一个模型。
TFPI160上JBT0122结合位点的鉴别
如同13C/15N-TFPI160+JBT0303复合物一样，13C/15N-TFPI160+JBT0122NMR样品由于凝胶形成而产生品质不良的光谱。723μM 13C/15N-TFPI160+JBT0122的浓度导致高阶聚集体的形成。样品稀释至361.5μM且在37℃下记录光谱，导致改良的光谱品质。获得HNCO、HNCA和HNCOCA光谱。除了5个残基，apo-TFPI160的所有先前归属的峰可在TFPI160-JBT0122复合物中加以归属。经历最强化学位移变化且可能与肽相互作用的残基常不在3D光谱中产生峰。然而，Kunitz结构域1(KD1)与Kunitz结构域2(KD2)之间的连接区域中的峰也展现较低强度。因此，这些峰的归属不明确。一些峰仅在原始滴定实验的HSQC中可见。在大多数情况下，其归属为确定的，因为峰在TFPI160和TFPI160+JBT0122HSCQ光谱中重迭。
与JBT0122结合的15N-TFPI160相较于游离TFPI160的HSQC信号的化学位移变化示例说明于图45。仅发现KD2的残基的显著化学位移变化。一般而言，由JBT0122与TFPI160结合引起的化学位移变化的程度比由JBT0303与TFPI160结合引起的化学位移变化的程度不明显。具有最强化学位移扰动的残基为F96、G128、G129、G132、N133和N136。C97、E101、T111、F114、N135和F137经扰动，展现超过0.5ppm的化学位移变化。图46中提出TFPI蛋白的二级结构的带状模型，说明与JBT0122结合的TFPI160的HSQC信号相较于游离TFPI160的化学位移变化的区域。
与TFPI160相互作用的JBT0122的残基的鉴别
为了JBT0122的连续骨架信号归属，重组产生13C/15N标记的肽。简言之，肽在大肠杆菌中作为与硫氧还蛋白的融合蛋白表达。使用含有3.0g/l 13C-葡萄糖和1.0g/l 15NH4Cl的M9培养基制备13C/15N标记的肽。使用Ni螯合柱和聚组氨酸标签亲和纯化融合蛋白。通过凝血酶裂解肽。分别使用Ni螯合柱和苯甲脒柱移除硫氧还蛋白/His标签和凝血酶。接着通过反相色谱纯化肽。通过SDS-PAGE、RP-HPLC和质谱验证纯度、完整性和身份。重组JBT0122命名为JBT0788，并且在其N端具有2个额外残基，甘氨酸和丝氨酸，其表示凝血酶裂解位点的残余。
JBT0788的归属基于在10℃下在Varian 600MHz光谱仪上记录且使用SPARKY软件归属的HSQC、HNCACB、HNCA、HNCO和HNN光谱进行。相较于用TFPI160进行的NMR实验，降低温度以改善光谱品质。根据记录的光谱，归属大多数残基的羰基碳(C)、α碳(CA)、β碳(CB)、酰胺质子(H)和酰胺氮(N)。残基H13和R17的归属不明确。HNCOCA导致这些残基的明确归属。
JBT0788的归属表提供于图47。在JBT0788的光谱中观察到残基4-12的两组信号。考虑到JBT0788的一级结构未受损，两组信号可能由F6与P7之间的肽键的顺/反异构化引起。基于HSQC光谱中相应信号的强度确定主要：次要构象的比率为76:24。如根据脯氨酸的Cα位移所判断，主要构象可能为反式，因为其63.16ppm的Cα值高于次要构象(62.49ppm)。
归属的一个目的是从Cα化学位移提取肽的二级结构。Cα化学位移受角和ψ影响，且因此受肽的二级结构影响。在β链中，Cα通常移位至较低ppm；在α螺旋中，Cα通常移位至较高ppm。通过列表显示的无规卷曲值减去测量的Cα值，计算得到β链中残基的负值和α螺旋中残基的正值。因此，一片区连续负值指示β链，而一片区连续正值指示α螺旋。
JBT0788展现一大片区增加的Cα值(Δδ(Cα)＝Cα测量–Cα无规卷曲)，指示包含残基8至26的α螺旋。天然蛋白质的三级结构内的稳定α螺旋的Δδ(Cα)值通常是3-4ppm。JBT0788的α螺旋的Δδ(Cα)值上升至约1.7ppm，指示比蛋白质内平均螺旋更大的柔性。JBT0788的另一特征为N端直接连接α螺旋的位置7的脯氨酸，其配合良好，因为蛋白质中的α螺旋常以N端脯氨酸终止。残基6具有较强负值，其由已知迫使其N端相邻氨基酸成为β链样构象的相邻脯氨酸引起。C端残基31的强正值对于无C端相邻氨基酸的残基而言也是典型的。JBT0788中F6与Ρ7之间的肽键采用2种构象，反式(76％)和顺式构象(24％)。该位置的构象影响连续残基的构象。在反式同种型中，α螺旋紧接P7之后开始；顺式同种型的α螺旋直至残基L12才开始。图48中提出说明游离JBT0788的二级结构的带状模型。
JBT0788内的化学位移也可用来使用TALOS软件计算扭角。TALOS为一种用于使用给定蛋白质或肽序列的5种(HA、CA、CB、CO、N)化学位移归属的组合来经验预测和ψ骨架扭角的数据库系统。TALOS方法为许多种二级化学位移(即，化学位移与其相应无规卷曲值之间的差异)与蛋白质二级结构的方面相关的观察的延伸。TALOS的目标在于使用二级位移和序列信息以定量预测蛋白质骨架角和ψ，且提供这些预测的不确定性的量度。TALOS使用给定残基的二级位移来预测该残基的和ψ角。当对给定残基作预测时，TALOS还包括来自下一和前一残基的信息。TALOS背后的想法在于如果可以发现具有与靶蛋白中三联体类似的二级位移和序列的已知结构蛋白质中残基的三联体，则所述已知结构中的和ψ角将是所述靶中所述角的有用预测物。在实践中，TALOS搜索数据库中与靶蛋白中的给定三联体的10个最佳匹配。
为了归属与TFPI160复合的JBT0788的HSQC光谱，制备由400μM13C/15N-JBT0788和400μM TFPI160组成的样品。如同先前的肽和TFPI160的NMR样品一样，样品胶化。稀释样品且将沉淀溶解于氘化DMSO中，产生～300μM 13C/15N-JBT0788+TFPI160和5％DMSO的最终浓度。在40℃下进行测量。这改善了所得光谱的品质。以TROSY模式获得实验以说明部分聚集的样品的弛豫性质。归因于样品中的蛋白质-肽复合物的低浓度，采用Varian 600MHz光谱仪上的冷冻探针技术。当利用冷冻探针技术并一式两份获得三重共振实验时，所得数据品质足以获得JBT0788的骨架位移。基于HNCA、HNCOCA和HNCO光谱进行与TFPI160的复合物中的JBT0788的归属。根据记录的光谱，归属大多数残基的羰基碳(CO)、α碳(CA)、酰胺质子(H)和酰胺氮(N)。与TFPI160复合的JBT0788的归属表提供于图49。
apo-JBT0788的一个特征为存在氨基酸残基4-12的两组信号，可能由F6与P7之间的肽键的顺/反异构化引起。在JBT0788-TFPI160复合物中，仅观察到一组峰，意味仅一种构象与TFPI160结合。apo-JBT0788也展现一大片区增加的Cα值(Δδ(Cα)＝Cα测量–Cα无规卷曲＝正)，指示α螺旋自残基8延伸至残基26。如上所述，天然蛋白质的三级结构内的稳定α螺旋的Δδ(Cα)值通常是3-4ppm。apo-JBT0788的α螺旋的Δδ(Cα)值增加至约1.7ppm，比蛋白质内平均螺旋更大的柔性。当与TFPI复合时，残基8至26展现3-5ppm的值，指示一个或多个稳定α螺旋的形成。图50中提出说明JBT0788与TFPI160复合时的二级结构的带状模型。由与TFPI160结合引起的JBT0788内的较大化学位移变化均匀分布于肽的长度上。经历最强化学位移扰动的残基为超过4ppm的残基S5、A9、Q11、Y28和K29。残基Y3、A4、V10、L12、S15、M21、A22、L23和A24被扰动超过3ppm。
与TFPI160相互作用的JBT0303的残基的鉴别
使用与上述针对JBT0122描述的相同程序重组产生JBT0303并用13C和15N同位素标记。重组JBT0303命名为JBT0616且在其N端处具有另一甘氨酸和丝氨酸。基于在10℃下在Varian 500MHz光谱仪上记录且使用SPARKY软件归属的HSQC、HNCACB和HNN光谱进行JBT0616的归属。JBT0616的光谱的品质优于JBT0788的光谱的品质，尽管有关缓冲液、温度、NMR管和NMR参数的实验条件是相同的。归属大多数残基的α碳(CA)、β碳(CB)、酰胺质子(H)和酰胺氮(N)。归属主要基于较不敏感但更多信息的HNCACB而非HNCA。与HNN光谱组合，这导致所有源于JBT0303的残基的明确归属。
JBT0616的归属表提供于图51。二级结构是提取自Cα化学位移且通过TALOS确定，使用H、CA、CB、CO和N的归属。与JBT0788一样，JBT0616展现指示α螺旋构象的一片区正Δδ(Cα)值。螺旋位于肽的C端部分且包含残基10-18。对于JBT0788，计算Δδ(Cα)值多达约1.8ppm，定性该螺旋对于此类短肽而言相对稳定。图52提出说明JBT0616的二级结构的带状模型。与JBT0788中的残基31一样，C端残基20的强正值对于无C端相邻氨基酸的残基是典型的。JBT0616的N端残基1-9展现略微正Δγ(Cα)值，表明偏向于α螺旋结构。
使用13C/15N标记的肽样品和过量未标记TFPI160进行与TFPI160的复合物中JBT0616的归属。在Varian 800MHz光谱仪上记录HSQC、HNCA、HNCOCA和HNCO光谱且使用SPARKY软件归属。在30℃下记录光谱。使用这些光谱，归属大多数残基的α碳(CA)、β碳(CO)、酰胺质子(H)和酰胺氮(N)，如图53中的表中所提出。与TFPI160的复合物中的JBT0616的二级结构提取自Cα化学位移且由TALOS计算。与游离肽一样，与TFPI160的复合物中的JBT0616展现指示α螺旋构象的一片区C端正Δδ(Cα)值。在复合物形成后，α螺旋的稳定性增加。该发现表明JBT0616的C端区为核心结合基序。N端残基的Δδ(Cα)值也变化，但程度较小。JBT0616在与TFPI复合时的二级结构说明于图54中的带状模型中。
在复合物形成后，观察到JBT0616的残基Q2、K5、F8、V9和A18的化学位移变化的最显著，超过7ppm。残基F13、R17、K19和L20也经扰动且显示化学位移变化超过4ppm。在N端处的残基的强化学位移变化指示不仅仅两亲性C端α螺旋驱动肽与TFPI160结合。
NMR实验结果与JBT0477取代分析的组合用于使用HADDOCK(高不明确性驱动的蛋白质-蛋白质对接(High Ambiguity Driven protein-protein DOCKing))软件产生与JBT0303的复合物中的KD1的模型。HADDOCK是一种用于模拟生物分子复合物的信息驱动的柔性对接方法。HADDOCK本身与从头开始的对接方法的区别在于以下事实：其编码在不明确的相互作用约束(ambiguous interaction restraint，AIR)中鉴定或预测为驱动对接过程的蛋白界面的信息。如通过化学位移数据揭示的TFPI160和肽上的结合位点的鉴别、如通过软件TALOS确定的肽的扭角、和JBT0477的取代分析提供了模型计算的约束。
为计算KD1-JBT0303HADDOCK模型，采用以下约束：(a)扭角取自JBT0303的K4、K5、V7、F8、Y12-A18的TALOS的计算；(b)化学位移变化超过1.5ppm的KD1的残基参与和JBT0303的结合：F25、F28、D32、A37、I38、I46、F47、T48、F54和Y56；(c)JBT0303的两亲性螺旋的疏水侧与KD1结合：JBT0303的Y12或L16或L20与KD1的D32或A37或I38或F54或Y56结合；(d)JBT0303的R15或K19与KD1的D31或D32或E60结合；(e)JBT0303的F8或V9与KD1的F25或F28结合；(f)JBT0303的Y12或F13与KD1的I46或F47或T48结合；和(g)JBT0303的Q2与KD1的Y56结合。Q2JBT0303–Y56KD1相互作用也视为模型计算的约束。
观察到JBT0303的K5在复合物形成后的强化学位移变化。对于被认为驱动肽-蛋白质相互作用的JBT0303的其余残基，模型与数据良好相符。能量最低的KD1-JBT0303的模型使JBT0303的F8靠近TFPI的F25和F28，解释了观察的化学位移变化和来自取代分析的数据。JBT0303的V9与KD1的疏水片区(包括F54)相互作用。JBT0303的Y12、F13、L16和L20也面对KD1的疏水片区。Y12与F28、I46、T48，F13与F47、T48，L16与F54，和L20与A37、I38邻近引起复合物中观察到的那些残基的NMR化学位移的扰动；Y12和L16的保守可能归因于这些残基与蛋白质的广泛相互作用。JBT0303的Κ19处于允许与KD1的D32相互作用的位置中。JBT0303的R15的作用似乎为与KD1的疏水片区以及与D32相互作用。此外，模型解释了为何带负电荷的天冬氨酸优选在JBT0303的位置10；其可与KD1的带正电荷的K29相互作用。JBT0303的位置11的甘氨酸的存在是因为在此位置的立体和构象约束。与JBT0303的复合物中的KD1(包含KD1的TFPI残基22-79)的HADDOCK模型提供于图55。
与KD1结合的JBT0740和JBT1857的模型
肽JBT0740和JBT1857(FQSK-dP-NBHBDGYFERL-Aib-AKL(SEQ ID NO：178))都是JBT0303的衍生物，在FXa-TFPI抑制检定中显示显著增强的EC50值(分别为0.11μM和0.0023μM)和如通过Biacore测定的较低Kd。与TFPI KD1(TFPI160的残基22-79)的复合物中的JBT0740和JBT1857的模型通过使用与针对JBT0303类似的约束的HADDOCK计算：(a)修正JBT0740和JBT1857的残基4和5的扭角的约束以考虑在JBT0303衍生物的位置5处的取代；(b)扭角是取自JBT0303的V7、F8、Y12-A18的TALOS的计算，且与JBT0303相反，不对K4和NmetG5/dP5的和ψ给予固定值；(c)NmetG5和dP5是呈顺式构象；(d)化学位移变化超过1.5ppm的KD1的残基参与和JBT0303的结合：F25、F28、D32、A37、I38、I46、F47、T48、F54和Y56；(e)JBT0303的两亲性螺旋的疏水侧与KD1结合；(f)JBT0303的Y12或L16或L20与KD1的D32或A37或I38或F54或Y56结合；(g)JBT0303的R15或K19与KD1的D31或D32或E60结合；(h)JBT0303的残基F8或V9与KD1的F25或F28结合；(i)JBT0303的残基Y12或F13与KD1的I46或F47或T48结合；和(j)JBT0303的残基Q2与KD1的Y56结合。
能量上最有利的JBT0740和JBT1857的HADDOCK模型说明相较于JBT0303不同的结合模式。最明显差异在于残基5至11的区域。在肽的N端和C端观察到较不明显的偏差。然而，不同的末端结合也可能有助于JBT0303衍生物与TFPI的优化结合。
与KD1结合的JBT1857的X射线晶体结构
测定与KD1结合肽JBT1857的复合物中的KD1的晶体结构。TFPI在大肠杆菌中重组表达并从包涵体氧化再折叠。在连接KD1和KD2的TFPI连接体序列内包含凝血酶裂解位点的TFPI氨基酸1-150(TFPI1-150-凝血酶(MADSEEDEEHTIITDTELPPLKLMHSFCAFKADDGPCKAIMKRFFFN IFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRDNANRLVPRGSQQE KPDFCFLEEDPGICRGYITRYFYNNQTKQCERFKYGGCLGNMNNFET LEECKNICEDG(SEQ ID NO：4235))被克隆入大肠杆菌表达载体(pET19b)。TFPI 1-150-凝血酶序列在N端包含作为重组表达的人工产物且不是野生型TFPI氨基酸序列的一部分的2个氨基酸。编码Kunitz结构域1和2的序列用粗体显示。大肠杆菌(BL21(DE3)pLysS)在MagicMediaTM中培养且TFPI 1-150-凝血酶以不溶性包涵体表达。通过与BugBuster Master Mix一起孵育来溶解大肠杆菌而收获包涵体，并在用50mM Tris/HClpH8，0.1％Tween 20洗涤后纯化。将包涵体溶解于8M脲、50mM Tris/HCl pH8.0，并且TFPI1-150-凝血酶在添加20mM DTT后还原。通过快速1/10稀释入含有50mM Tris/HCl pH10和1.1mM氧化谷胱甘肽的缓冲液中来进行氧化再折叠，随后针对20mM Tris/HCl pH7进行过度透析。再折叠的TFPI1-150-凝血酶通过使用Q Sepharose FF阴离子交换和肽亲和(JBT131)介质的连续纯化方案来纯化。纯化的TFPI1-150-TFPI通过与凝血酶(1U凝血酶/mg TFPI1-150-凝血酶，裂解位点，LVPR/GS)一起孵育而蛋白水解消化，导致产生N端KD1-凝血酶(MADSEEDEEHTIITDTELPPLKLMHSFCAFKADDGPCKAIMKRFFFN IFTRQCEEFIGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRDNANRLVPR(SEQ ID NO：4236))和KD2-凝血酶(GSQQEKPDFCFLEEDPGICRGYITRYFYNNQTKQCERFKYGGCLGN MNNFETLEECKNICEDG(SEQ ID NO：4237))。使用用于移除凝血酶的苯甲脒琼脂糖，随后JBT131肽亲和柱而从消化混合物纯化N端KD1-凝血酶。经纯化的N端kD1-凝血酶用于与JBT1857形成复合物并进一步进行结晶。
通过固相合成制备拮抗肽JBT1857。在100mM MES pH6.5，20％PEG 4000，600mMNaCl下获得等摩尔复合物的成功共结晶。尽管有一些非缺面孪晶，但晶体衍射好于分辨率。衍射数据用来自CCP4程序包的iMosflm和SCALA处理，揭示了具有以下单位晶胞尺寸的单斜晶体形式：α＝90.0°，β＝92.97°，γ＝90.0°，空间群C2(Leslie，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr，62(Pt 1)，48-57(2006)；Evans，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr，62(Pt 1)，72-82(2006))。自旋计算指示大致两倍的非结晶学对称性。与此一致，2个分子以通过170°旋转相关的不对称单元定位。通过使用程序PHASER和作为搜索模型的可用Kunitz结构域2晶体结构的结构整体进行Patterson搜索(McCoy等人，J Appl Crystallogr，40(Pt 4)，658-674(2007))。单位晶胞含有约64％溶剂。用Coot、Refmac、MAIN和CNS程序进行非结晶学电子密度平均化和模型构建和模型改进。当前模型完全限定用于JBT1857肽的拷贝和与蛋白质的相互作用，当前R＝0.257，R游离＝0.298，与理想几何结构的偏差rms(角)＝1.8°。
JBT1857结构：JBT1857的结构可区段化为(i)由乙酰化Phe1AP-Gln2AP组成的N端锚；(ii)包含Ser3AP-Asn6AP的Ω形环；(iii)从Val7AP和His8AP构建的中间区段；(iv)含有Val9AP-Gly11AP的紧密甘氨酸环；和(v)包含Tyr12AP-Leu20AP的C端α螺旋。如本文所用，下标AP指示“拮抗肽”JBT1857中的序列编号。α螺旋的构象由以下稳定：位于螺旋中心(位置17AP)的非天然α-甲基丙氨酸；完成α螺旋的1-4氢键合模式的C端酰胺；和His8AP、Tyr12AP和Phe13AP的芳族侧链形成的堆叠簇。这些作用自发地协作稳定溶液中的C端α螺旋，与肽的圆二色性数据一致。观察的芳族侧链堆叠(His8AP、Tyr12AP、Phe13AP)强制产生仅可由位置11AP的甘氨酸完成的紧密转角。该结构约束反映为在用任何其他氨基酸置换Gly11AP后结合亲和力的明显损失。N端环区段的构象由已知诱导紧密转角构象的D-脯氨酸、和由Ser3AP的羰基氧与Asn6AP酰胺氮形成的1-4氢键部分地稳定。所有环侧链(Tyr1AP、Pro5AP、His8AP、Tyr12AP、Phe13AP)点都朝向同一方向，使其能够与TFPI的KD1结构域相互作用。
JBT1857与KD1相互作用：测定JBT1857与KD1之间的相互作用。疏水性接触为分子间距离的相互作用，而氢键具有的距离。Phe1AP与TFPI非特异性相互作用，从而与Phe2和Ala27接触。相反，Gln2AP接触TFPI的深埋袋，且与Phe28、Lys29、Ile46和Phe47疏水性相互作用。此外，Gln2AP的酰胺基与Phe28-CO、Phe44-CO和Ile46-NH形成三个H键。JBT1857的包含Ser3AP-Asn6AP的Ω环介导而非限制与蛋白质的疏水性相互作用；Ser3AP、Pro5AP和Asn6AP与Lys29和Phe47相互作用。JBT1857的中间区段的Val7AP也与Lys29和Phe47结合。His8AP主要促成与Tyr12AP和部分与Phe13AP的分子内芳族堆叠相互作用，且展现与TFPI的Ala30的疏水性相互作用。类似地，甘氨酸环Val9AP-Gly11AP促使与Kunitz结构域的少数接触。Val9AP通过与Ala30的羰基形成氢键和与Asp32的疏水性相互作用而直接与KD1相互作用。Tyr12AP介导经由其羟基与Ile55的酰胺氮形成的氢键和与Asp30的疏水性相互作用。Leu16AP是与Ile55的疏水性接触的一部分。除了肽的C端螺旋与蛋白质的大部分疏水性相互作用外，在Arg15AP与Asp32之间还有静电相互作用。此外，Lys19AP通过与Ala37的羰基形成氢键和与Lys36和Ile38接触而有助于与TFPI结合。TFPI接触表面具有包含一些图示热点的总体疏水性特性，且与JBT1857形成复合物的驱动力为立体表面互补性。
本实施例描述本发明的示例性肽的二级结构的表征并将结构与肽的抑制功能关联。本实施例还鉴别与抑制TFPI活性的TFPI结合肽JBT1857相互作用的TFPI氨基酸残基。
实施例8
以下实施例描述通过添加增强肽的物理化学或药代动力学性质的部分而修饰的其他TFPI结合肽。本实施例还描述一种使用旋转血栓弹性描记术(thromboelastography)评估全血中血凝块形成的方法。
JBT1857(JBT0047肽家族)与不同PEG部分轭合，并检查聚乙二醇化肽的结合亲和力和TFPI抑制活性。JBT1857通过添加C端半胱氨酸而修饰以产生JBT2315(Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKLC-NH2(SEQ ID NO：4077))，使用实施例5中描述的方法使JBT2315在C端处与具有以下递增尺寸的线性马来酰亚胺PEG部分轭合：5kD、12kD、20kD、30kD和40kD。所得聚乙二醇化肽如下指示：
表13
聚乙二醇化肽的稳定性、结合亲和力和TFPI抑制活性
聚乙二醇化肽在小鼠和人血浆中显示显著增加的血浆稳定性。添加肽至小鼠或人血浆的样品中，且在添加之后24小时剩余在血浆中的肽的初始量的百分比通过在经0.05mg/ml TFPI(2.26nM示踪肽JBT2271)涂布的Maxisorp板上IC50ELISA来测量。小于约10％初始量的JBT1857和JBT2317剩余在血浆中，而在24小时之后剩余有40％或更多初始量的聚乙二醇化TFPI结合肽。检测到约60％或更多的JBT2327和JBT2329。相较于未修饰的肽，聚乙二醇化肽在人血浆中也显著更稳定。在24小时之后剩余约60％或更多的聚乙二醇化肽。未修饰的肽在人血浆中比在小鼠血浆中更稳定；在孵育24小时之后，剩余约20％或更多的初始量。
实施例1-4中描述的检定中还表征了聚乙二醇化肽并与JBT1857比较。代表性结果提供于以下提出的表14中。如实施例4中所述进行凝血酶生成检定，且结果以对应于改善峰值凝血酶(nM)半数最大的肽浓度的EC50提供。
表14
*用于涂布缓冲液中的示踪剂JBT2271(1nM)和0.05μg/ml TFPI进行竞争ELISA。
相较于JBT1857，添加用NEM阻断的C端半胱氨酸不显著影响FXa抑制、外源性tenase检定或凝血酶生成检定中JBT2317的结合亲和力或肽的活性。PEG大小不显著影响TFPI结合肽恢复在TFPI-1存在下的FXa活性的能力。在实施例3的外源性tenase检定中，抑制活性随PEG部分的分子量增大(直至20kD PEG)而增加。对于30kD或40kD PEG部分，活性不进一步提高。在使用人血浆的实施例4的凝血酶生成检定中，EC50随PEG大小而减小，且TFPI的最大抑制(如通过峰值FIIa(nM)测量的)随PEG大小而增加。在小鼠血浆中，40kD PEG与TFPI结合肽的连接增加TFPI的最大抑制。
聚乙二醇化TFPI结合肽恢复用于将FX转化成FXa的外源性tenase复合物活性的能力也使用基于细胞的外源性tenase检定来测定，使用了实施例5的方法。相较于JBT1857，添加用NEM阻断的C端半胱氨酸不显著影响JBT2317在基于细胞的外源性tenase检定中的活性。PEG部分(5kD、20kD、30kD或40kD)与JBT2317轭合使TFPI抑制活性增加5-20％。
旋转血栓弹性描记术
通过在存在或不存在肽下用全血制品通过旋转血栓弹性描记术进行人全血凝块形成和坚实度(firmness)的连续粘弹性评估。将来自健康个体的血液样品吸入含柠檬酸盐化的Sarstedt Mono S(0.106M或3.2％(w/v)柠檬酸钠)(5ml)中，混合1份柠檬酸盐与9份血液，使用21号蝴蝶针。一部分血液样品与山羊中产生的高滴度热失活的抗人FVIII抗血清(3876BU/ml；Baxter BioScience，Vienna，Austria)一起孵育，得到51BU/mL。通过溶解一定量的肽于DMSO或HEPES缓冲盐水(有或无0.1％Tween 80)中制备测试样品。
在37℃下使用ROTEM血栓弹性描记凝血分析仪(Pentapharm，Munich，Germany)进行记录。简言之，将血液加入加热的比色管固持器中的一次性比色管中。一次性插脚(传感器)固定于旋转轴顶端。轴由高精度滚珠轴承系统引导且来回旋转。轴与用于测量弹性的弹簧连接。轴的精确位置由轴上小镜上的光反射检测。当样品凝结时，弹性损失导致轴旋转的变化。所得数据经计算机分析并显示于血栓弹性描记图中。血栓弹性描记图显示相对于时间(s)的弹性(mm)。在开始形成凝块之前，观察到弹性为约零。在零线之上和之下的镜像痕迹指示凝块形成对轴旋转的影响。
在开始各实验之前，柠檬酸盐化的全血与玉米胰蛋白酶抑制剂(CTI)(Hematologic Technologies,Inc.，Essex Junction，VT，USA)混合，提供了用于特异性抑制FXIIa的最终浓度62μg/mL，以抑制FXIIa介导的接触活化。分析方案如下：向20μL测试样品或对照中添加300μL预温(37℃)的经CTI处理的柠檬酸盐化的全血，随后添加20μL含有重组人组织因子(rTF，3pM)(TS40，Thrombinoscope BV，Maastricht，The Netherlands)的TFPRP试剂的1:15稀释液。凝血通过添加20μL 200mM CaCl2(Pentapharm，Munich，Germany)而起始，并允许记录进行至少120分钟。检定中的rTF的最终浓度为11或44fM。
根据制造商说明书记录凝结时间(CT)、凝块形成时间(CFT)和最大凝块坚实度(MCF)的血栓弹性描记参数。CT定义为自开始测量至开始形成凝块的时间。CFT定义为自开始形成凝块直至达到20mm的幅度的时间。MCF为检定期间两个痕迹之间最大的幅度差异。绘制血栓弹性描记图的数据的一阶导数以获得速度(mm/s)相对于时间(s)的图。根据此图，确定最大速度(maxV)。还确定获得最大速度的时间(maxV-t)。
示例性结果说明于图56和57。JBT1857和JBT2317恢复Hem A血液中的凝血参数。聚乙二醇化(40kD)TFPI结合肽JBT2329也恢复Hem A血液中的延长的凝血参数，如图57中示例说明的。JBT2317的聚乙二醇化降低凝结时间和凝块形成时间。
趾夹研究
还研究了JBT2329对首次试验小鼠失血的影响。在趾夹之前30分钟，以10ml/kg向C57BL6小鼠静脉施用媒介物、1mg/kg JBT2329或0.1mg/kg JBT2329(每组N＝19或20)。在趾夹之前10分钟用80mg/kg戊巴比妥(i.p.)麻醉动物。在时间＝0分钟时，刚好在甲床之前切割右后爪的小趾的趾甲。爪转移至用0.9％NaCl溶液预填充的管形瓶中。在趾夹后的第一个30分钟和之后的下一个30分钟期间收集血液样品用于分析，且计算并比较各组的平均收集体积。经媒介物治疗的小鼠中的平均失血为第一个30分钟约30.5μl，第二个30分钟时期52.1μl，导致60分钟失血约82.6μl。相反，0.1mg/kg JBT2329的施用使失血在第一个30分钟减少约50％(16.0μl)并且在第二个30分钟时期减少约64％(18.7μl)，导致相较于媒介物治疗的小鼠在60分钟内总失血减少约60％(34.7μl)。增加JBT2329的剂量至1.0mg/kg进一步减少失血至少约10％；第一个30分钟收集12.2μl，第二个30分钟时期收集10.6μl，导致整个60分钟收集时期收集22.8μl。相较于经媒介物治疗的首次试验小鼠小鼠，当皮下施用时，JBT2329也有效减少出血；相较于经媒介物治疗的受试者，皮下注射10mg/kg JBT2329使趾夹之后60分钟期间的失血减少约58％。
上述结果使用包含与肽的C端连接的线性PEG部分的JBT1857衍生物和包含在N端的PEG部分的JBT1586衍生物产生。也产生包含替代轭合位点或替代化学部分的肽。40kD线性PEG部分与JBT1857的残基14轭合以产生JBT2404。JBT2329的线性40kD PEG部分经40kD分支PEG部分替代以产生JBT2401。JBT1857也经修饰而在C端处包含K(Ttds-马来酰亚胺基丙酰基)(JBT2374)。JBT2374用于产生JBT2410，即JBT2374的一种HSA轭合物。JBT2375，即包含K(AOA)的JBT1857衍生物，用于将PSA醛与肽JBT1857偶联，产生JBT2430。使用上述检定表征JBT2401、JBT2404、JBT2410和JBT2430。代表性结果概述于表15：
表15
本实施例证明本发明的示例性TFPI结合肽JBT1857为TFPI的有效抑制剂且可经官能化并与PEG轭合而不损失活性。在几个功能检定中，聚乙二醇化增加了TFPI抑制活性。惊人地，与较高重量PEG部分轭合的肽显示增强的TFPI抑制活性。包含40kD线性PEG部分的JBT2329显著减少临床相关动物模型中的失血。在JBT1857的氨基酸序列内的PEG轭合、分支PEG部分的使用、和HSA与PSA的连接不破坏肽的活性。
实施例9
以下实施例描述本发明的两种TFPI结合肽JBT1837和JBT1857的表征。JBT1837(Ac-SYYKWH[CAMRDMKGTMTC]VWVKF-NH)(SEQ ID NO：1044)为JBT0120家族的结合TFPI的kD1和KD2的环状肽。JBT1857(Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKL-NH2)(SEQ ID NO：178)为JBT0047家族的结合TFPI的KD1的线性肽。使用实施例1-4中描述的检定来检查JBT1837和JBT1857的亲和力和TFPI抑制活性，其结果概括于表16。
表16
经由BiaCore测量的肽对人TFPI的亲和力小于1nM。JBT1837和JBT1857的通过ELISA测量的亲和力(IC50)分别为4.8nM和2.5nM。JBT1837自人TFPI的解离比JBT1857更缓慢(即，相较于JBT1857，JBT1837持续较长时期保持与人TFPI结合)。使用全长人TFPI(“flTFPI”)与截短人TFPI(254氨基酸“R&D TFPI”)两者进行FXa抑制检定(0.1nMFXa，0.5nMTFPI，0.25％DMSO)。在0.5nM TFPI下，截短TFPI的活性受JBT1837与JBT1857两者完全抑制，而全长TFPI受JBT1857和JBT1837分别抑制85％和95％。在较高浓度的flTFPI(例如10nMflTFPI)下，JBT1837完全抑制TFPI活性，而JBT1857部分抑制TFPI活性。当flTFPI用于FXa抑制研究时，EC50也较高。
在外源性tenase检定中，约85％的截短TFPI由两种肽抑制。全长TFPI活性由JBT1837和JBT1857分别抑制约56％和48％。惊人地，在基于细胞的外源性tenase检定中，JBT1837抑制细胞相关的TFPI活性约50％，而JBT1857几乎完全抑制细胞结合的TFPI活性。在基于血浆的功能检定中，JBT1837在人FVIII抑制血浆和FIX缺陷血浆中比JBT1857更有效抑制TFPI。JBT1837校正实施例8中描述的ROTEM检定中FVIII抑制血液中的凝血参数。JBT1857也正面影响凝血参数，但在检定中表现得不如JBT1837有效。
本实施例比较了靶向TFPI蛋白的不同区域的环状和线性TFPI结合肽的亲和力和TFPI抑制活性。JBT1837(属于家族JBT0120的环状肽)和JBT1857(属于家族JBT0047的线性肽)以小于1nM的亲和力有效结合人TFPI且为有效抑制剂。在低TFPI浓度下，FXa-TFPI相互作用完全由两种肽阻断，而在较高浓度的TFPI存在下，JBT1857对TFPI的抑制减少。两种肽均部分抑制外源性tenase检定中的全长TFPI的活性，且相较于JBT1837，JBT1857在更大程度上抑制基于细胞的外源性tenase检定中的TFPI活性。相较于JBT1857，JBT1837在FVIII缺陷血浆中更有效抑制TFPI。两种肽均通过减少凝结时间来改善FVIII抑制人全血的凝血参数，而JBT1857与JBT1837相比在更小程度上改善凝块形成速度。
实施例10
本实施例说明本发明的TFPI结合肽在临床相关动物模型中的体内活性。如下所述，当施用次佳剂量的FVIII和FIX时，示例性TFPI结合肽显著减少动物失血。
在FVIII敲除小鼠和FIX敲除小鼠中，在尾尖出血模型中测试与人和鼠TFPI交叉反应的聚乙二醇化(40kD)TFPI结合肽JBT2329(JBT0047家族)。FVIII敲除小鼠密切反映甲型血友病患者的病症，且尾尖出血模型广泛用于通过测量例如出血时间、失血或存活来评估药物功效的研究中。ADVATE是一种商业途径可获得的rFVIII，用作参比，且经ADVATE缓冲液治疗的动物用作阴性对照。各组都含有16只FVIII敲除小鼠(8只雌性+8只雄性)。在切割尾尖之前30分钟施用JBT2329(1mg/kg或0.1mg/kg)或抗TFPI抗体(maTFPI；18mg/kg)。在切除尾部之前5分钟施用ADVATE(10IU/kg或50IU mg/kg)或ADVATE缓冲液。经由侧尾静脉注射以静脉快速浓注施用测试和对照物质。通过腹膜内注射100mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪麻醉动物。约10分钟后，切除2mm尾尖。将尾尖放入温热盐水(约37℃)中并经60分钟的观察期收集血液。以重量分析方式测定血液量。在60分钟的观察期结束时，动物在自麻醉恢复之前通过颈椎脱位术人道杀死。
经缓冲液治疗的动物中的中值总失血为930mg。经鼠抗TFPI抗体(maTFPI)治疗的受试者中的中值总失血为724mg。当给受试者施用maTFPI与ADVATE时，中值总失血的减少更明显。maTFPI+10IU/kg ADVATE的组合导致136mg的中值总失血，经maTFPI+50IU/kg ADVATE治疗的动物经历13mg的中值总失血。经10或50IU/kg单独ADVATE治疗的动物的中值失血分别经历798和364mg的中值失血。针对maTFPI+50IU/kg ADVATE与50IU/kg ADVATE，统计学显示了maTFPI+ADVATE的组合治疗比单独ADVATE的优越性(p＝0.0010)。尽管不是统计学上显著优越的，但经maTFPI+10IU/kg ADVATE治疗的动物中的失血明显低于经单独10IU/kgADVATE治疗的动物中的失血。
显示了以1mg/kg与10和50IU/kg ADVATE组合给药和以0.1mg/kg与50IU/kgADVATE组合给药的JBT2329的功效，定义为超越2.5％水平的缓冲液的统计学显著的优越性(p<0.0004)。经JBT2329与ADVATE的组合治疗的动物显示临床相关的失血减少，尽管结果不是统计学显著的(p≥0.0506)。在不存在ADVATE下施用1mg/kg JBT2329相对于缓冲液治疗的动物中观察到的中值总失血(930mg)没有减少中值总失血。
还在FIX敲除尾尖出血小鼠模型中测试JBT2329，该模型为乙型血友病人患者的临床相关模型。该方法基本上类似于以上针对FVIII敲除模型描述的方法。替代ADVATE，重组FIX(rFIX)用作参比。缓冲液治疗的动物中的中值总失血为935mg。经鼠抗TFPI抗体(maTFPI)治疗的动物中的中值总失血为774mg。当动物接受maTFPI与rFIX的组合治疗时，中值总失血进一步减少。maTFPI+10IU/kg rFIX的组合导致25mg的中值总失血，而经maTFPI+50IU/kg rFIX治疗的动物展现10mg的中值总失血。经10或25IU/kg单独rFIX治疗的动物的中值失血分别经历888和774mg的中值失血。
显示了JBT2329以1mg/kg与10IU/kg rFIX组合给药和以0.1mg/kg与10IU/kg rFIX组合给药时的功效，定义为比2.5％水平的缓冲液的统计学显著的优越性。观察到JBT2329与rFIX组合超越单独施用rFIX的优越性(p<0.0172)，而相较于经缓冲液治疗的动物，用1mg/kg单独JBT2329治疗没有导致中值总失血显著减少(p＝0.321)。
总而言之，在所有经测试的剂量下，当与次佳剂量的FVIII和rFIX共施用时，JBT2329促进了临床相关的失血减少。此外，静脉内施用JBT2329在跨越所有治疗组的所有受试者中都耐受良好而无任何急性毒性体征。
实施例11
本文所述的TFPI结合肽适于检测样品、例如生物样品中的TFPI。本实施例描述一种使用本发明肽在ELISA样检定形式中检测TFPI的方法。
JBT1857的肽序列通过添加生物素基-Ttds部分而被N端修饰以产生JBT2271(生物素基-Ttds-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKL-NH2(SEQ ID NO：4033))。在室温下，96孔微量滴定板(Maxisorp，Nunc)经每孔50μl含有一定范围的TFPI浓度(0-3μg/ml，人重组TFPI，R&DSystems)的涂布缓冲液(15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH9.3)涂布1小时。板用每孔350μl/孔洗涤缓冲液(175mM NaCl，5mM CaCl2，25mM HEPES，0.1％Tween80，pH7.35)洗涤3次。板接着在室温下用100μl阻断缓冲液(2％酵母提取物，175mM NaCl，5mM CaCl2，25mM HEPES，0.1％Tween 80，pH7.35)阻断1小时。板接着用350μl洗涤缓冲液洗涤3次。添加50μl不同浓度JBT2271的洗涤缓冲液溶液(100-0nM)至各孔中。将板孵育1小时并用350μl洗涤缓冲液洗涤3次。向各孔中添加50μl链霉亲和素-辣根过氧化物酶轭合物(R&D Systems，1:200于洗涤缓冲液中)。在室温孵育1小时的时期之后，板用洗涤缓冲液洗涤3次。添加50μl TMB溶液(SeramunBlau fast，Seramun)至各孔中。在室温下孵育1.5分钟之后，通过添加每孔50μl1M H2SO4来终止反应。在450和620nm下，在光度计(Molecular Devices Spectramax M5)中测量吸光度。
JBT2271允许检测每孔少至4.1×10-14摩尔的TFPI。上述检定的结果说明本发明肽为鉴别和/或定量样品中的TFPI的强大工具。
实施例12
本实施例描述用于表征TFPI结合肽的示例性k解离检定的条件。
在室温下，微量滴定板(96孔，Maxisorp，Nunc)的孔经含1.6nM TFPI的涂布缓冲液(15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH9.3)涂布2小时。板接着用350μl洗涤缓冲液(175mM NaCl，5mM CaCl2，25mM HEPES，0.1％Tween 80，pH7.35)洗涤3次，且将孔用100μl阻断缓冲液(2％酵母提取物，175mM NaCl，5mM CaCl2，25mM HEPES，0.1％Tween 80，pH7.35)阻断。如果采用24小时的孵育期，则各孔被阻断至少1小时。用于15分钟孵育期的对照孔被阻断额外23.5小时。
对于24小时孵育期，将孔用350μl洗涤缓冲液洗涤3次且与50μl含测试肽的洗涤缓冲液一起孵育。测试肽的浓度取决于例如本文所述的TFPI IC50ELISA检定中测定的个体IC90浓度。TFPI涂布的孔暴露于测试肽约15分钟。将孔随后用350μl洗涤缓冲液洗涤3次且添加50μl示踪肽(竞争剂)。一种示例性示踪肽为JBT2271(1.13nM于洗涤缓冲液中)。对照孔(最大信号)仅与示踪剂一起孵育。缺乏TFPI的空白孔仅与示踪剂一起孵育。示踪肽的添加使24小时孵育期开始。
如果测试肽的IC90浓度导致最大信号减少90％，则采用15分钟孵育期作为对照。阻断额外23.5小时的孔用350μl洗涤缓冲液洗涤3次以移除阻断缓冲液。随后，添加50μl含分析物的洗涤缓冲液且孵育孔15分钟。所用测试肽的浓度取决于使用例如TFPI IC50ELISA检定测定的肽的IC90浓度。在孵育15分钟后，用350μl洗涤缓冲液洗涤3次且添加50μl示踪肽。对照孔(最大信号)仅与示踪剂一起孵育。缺乏TFPI的空白孔也仅与示踪剂一起孵育。
板用350μl洗涤缓冲液洗涤3次，且添加50μl链霉亲和素-辣根过氧化物酶轭合物(R&D Systems，1:200于洗涤缓冲液中)至各孔中。在室温下孵育1小时的时期之后，板用洗涤缓冲液洗涤3次。添加TMB溶液(每孔50μl；SeramunBlau fast，Seramun)。在室温下孵育1.5分钟之后，通过添加每孔50μl 1M H2SO4来终止反应。在450和620nm下，使用光度计(Spectramax M5，Molecular Devices)测量吸光度。检定结果呈现为暴露于测试肽和示踪肽的孔相对于仅暴露于示踪剂的TFPI涂布的孔的校正光密度(OD450-OD620)的百分比。
实施例13
TFPI通过经由Kunitz结构域1(KD1)与FVIIa结合来抑制FVIIa/TF活性。本实施例描述一种评估TFPI结合肽对FVIIa/TF的TFPI抑制的影响的示例性方法。
在25℃下在96孔微量滴定板中于25mM HEPES，175mM NaCl，5mM CaCl2，0.1％BSA，pH7.3中进行动力学测量。混合最终浓度分别为100nM和5nM的20μl可溶性组织因子(残基33-251；Creative Biomart)和20μl FVIIa(ERL)并孵育15分钟。添加20μl变化的终浓度(0-2μM)的TFPI结合肽至混合物中并孵育另外15分钟。为了测量FVIIa/sTF复合物的残余活性，反应混合物与20μl TFPI(200nM)一起孵育60分钟。反应通过添加显色底物Chromozym-tPA(Roche)(1mM)起始。通过使用Labsystems iEMS ELISA读数器持续30分钟监测405nm下的吸光度变化。在不存在TFPI下测量的FVIIa/sTF活性视为在检定上下文中的“100％活性”。通过绘制相对于残余活性的肽浓度，确定EC50值。
相对于TFPI160、TFPI1-150-凝血酶、NTermKD1、KD1和KD2(阴性对照)筛选JBT1857和JBT1837。JBT1857显示对TFPI 160、TFPI1-150-凝血酶、NTermKD1和KD1的EC50为约0.21-0.23μM。结合KD1和KD2的JBT1837显示对TFPI160和TFPI1-150-凝血酶的EC50为约0.17-0.19μM，而在涉及NTermKD1和KD1的检定中的活性大约是背景。
上述结果证明TFPI结合肽有效抑制TFPI-FVIIa/TF相互作用。JBT1857有效抑制含有KD1作为最小功能实体的TFPI片段。因此，该酶促检定证实将JBT1857的结合位点置于KD1内的X射线结晶学数据。JBT1837抑制含有前2个Kunitz结构域的TFPI片段，表明JBT1837结合位点位于TFPI的KD1-连接体-KD2区内。Kunitz结构域与凝血酶裂解的TFPI的片段(1-150)的组合没有恢复显色检定中JBT1837的抑制活性。本文所述的酶促检定为适用于检测TFPI结合肽(或测试化合物)与TFPI结合的代用物，并用于检查TFPI结合化合物的TFPI抑制效应。
实施例14
本实施例描述PEG和HSA轭合对体内示例性TFPI结合肽的影响。
为了药代动力学分析，C57B16小鼠用与不同分子量PEG和HSA轭合的各种TFPI结合肽治疗。肽-PEG和肽-HSA轭合物的剂量标准化为1mg/kg(肽含量)。标准化确保不同分子量的轭合物之间的可比性。将肽轭合物溶解于175mM NaCl，25mM HEPES pH7.35并经由尾静脉静脉内或在颈区中皮下施用。在施用后几个时间点从3只动物获取(眼球后)血液抽取物且收集在肝素化小瓶中。离心样品，且通过ELISA定量血浆中的肽-轭合物含量。
图63说明在施用后几个时间点血浆中检测的聚乙二醇化TFPI肽的浓度，且表17提供关于JBT2325-JBT2329、JBT2401、JBT2404和JBT2410的终末半衰期和生物利用度的详细信息。
表17
JBT2329、JBT2401和JBT2404为与40kDa线性PEG(JBT2329和JBT2404)或40kDa分支PEG(JBT2401)轭合的肽。在静脉内施用之后，40kDa轭合物展现比与较小PEG轭合的肽更长的终末半衰期(HL_λ_z)。由皮下施用肽产生的浓度-时间曲线的曲线下面积(AUC)与在静脉内施用之后产生的AUC进行比较以计算肽的生物利用度。结果显示于表16。数据证明TFPI结合肽与较高分子量分子的轭合允许超过30％的皮下生物利用度。
图64A-C说明由向小鼠皮下和静脉内施用肽而产生的JBT2401、JBT2404和JBT2410的药代动力学特征。JBT2404包含与在相对于式(XI)的位置X4014的半胱氨酸轭合的PEG。JBT2401包含分支PEG，且JBT2410与HSA轭合。图64A说明较高分子量分子与TFPI结合肽在内部位置融合增加半衰期。如果使用相较于具有较小尺寸PEG的轭合物(例如JBT2325)或游离肽增加JBT2410的体内半衰期的分支PEG(JBT2401)和HSA，则半衰期也增加(参见图31)。
本实施例说明本文所述的各种肽的体内性质可通过与较高分子量分子(如PEG)和/或nFcR配体(如HSA)轭合而改善。
实施例15
以下实施例描述了通过X射线结晶表征JBT1837单独或在JBT1857存在下与TFPI的KD1-KD2相互作用。
天然PAGE(Native-PAGE)
进行天然PAGE以证实结合TFPI不同区域的TFPI结合肽可以同时结合TFPI kD1-KD2。15％的聚丙烯酰胺凝胶(无SDS)用于对样品进行天然凝胶电泳，所述样品包括(1)包含KD1-KD2的TFPI片段，(2)KD1-KD2和JBT1857，(3)KD1-KD2和JBT1837，和(4)KD1-KD2与JBT1857和JBT1837两者。向蛋白样品添加甘油和丽春红。通过将25mM咪唑溶解于1升水并用HCl调节pH至7而获得阳极缓冲液。通过将7.5mM咪唑和50mM两性离子缓冲剂(tricine)溶解于1升水而制备澄清的阴极缓冲液。向每个溶液添加水，达到2升的终体积。向2升的阴极缓冲液添加Serva Blue G(0.02％w/v终浓度)以产生蓝色的储存10X阴极缓冲液(蓝色储液10X)。凝胶在80V下电泳30分钟，然后在250V下电泳约3小时。如Chakavarti等人，J VisExp.，12；(16)(2008)所述使凝胶染色和脱色。
KD1-KD2在凝胶中显示为单一条带。包含与JBT1857和/或JBT1837组合的K1-K2的样品导致初始KD1-KD2条带向较高分子量电荷比移动。在混合KD1-KD2和JBT1837之后，观察到部分沉淀，指示复合物形成之后溶解度降低。JBT1857移动了整个KD1-KD2条带，而JBT1837移动了初始条带的大约1/3。此外，在JBT1837和JBT1857同时存在下，KD1-KD2条带向最高的分子量电荷比移动，指示由KD1-KD2、JBT1837和JBT1857组成的三元复合物的形成。因此，JBT1837和JBT1857可以同时结合TFPI。
材料和方法-JBT1837与KD1-KD2的相互作用
晶体生长：通过混合0.4μl 1:1复合物(1.5mg/ml；10mM Tris/8.0，100mM NaCl)与0.2μl沉淀剂(20％w/v PEG 6000，50mM咪唑pH8.0)而在20℃下形成初始晶体。通过混合1μl蛋白与0.5μl沉淀剂(20％w/v PEG6000，50mM咪唑pH8.0)而在20℃下再生晶体。添加冷冻保护剂(30％w/v PEG 6000，34％甘油)至晶滴(终浓度25％甘油)以防止得到的晶体在用液氮快速冷却期间混乱和形成冰。
数据处理：收集至的衍射数据并使用MOSFLM和iMOSFLM包(Leslie，(2006)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 62，48-57)评价，随后使用CCP4套件(McCoy等人，(2007)J Appl Crystallogr 40，658-674)合并和标定。晶体属于斜方晶空间群P 212121，晶胞大小α＝β＝γ＝90.0°，和不对称单元的2个复合物。使用PHASER程序(McCoy，同上)和两个搜索系综(search ensemble)，KD2的晶体结构(1TFX)(Burgering等人(1997)J Mol Biol269，395-407)和之前分离的KD1晶体结构，进行Patterson搜索。晶胞含有大约54％溶剂。使用程序Coot和Refmac(McCoy，同上；Murshudov等人，(1997)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53，240-55)进行非结晶电子密度平均、模型构建和模型改进。当前模型完全限定用于JBT1837肽(23AA)的拷贝和与蛋白质的相互作用，当前R＝0.213，R游离＝0.245，与理想几何结构的偏差rms(角)＝1.28°。
相互作用表面的分析：使用PDBePISA分析KD1-KD2与JBT1837的相互作用表面。单个氨基酸的影响通过复合物形成之后其溶剂可及面积的总体减少(埋溶剂可及面积BSAA)来衡量，并通过产生2D相互作用矩阵来考虑。
材料和方法–KD1-KD2与JBT1837和JBT1857的相互作用
晶体生长：通过混合0.4μl 1:1:1复合物(1.5mg/ml；10mM Tris/8.0，100mM NaCl)与0.2μl沉淀剂(2M(NH4)2SO4，5％PEG 400，100mM MESpH6.5)而在20℃下形成初始晶体。通过混合1μl蛋白与0.5μl沉淀剂(1.5M(NH4)2SO4，5％PEG 400，100mM MES pH6.5)而在20℃下再生并优化晶体。逐步添加冷冻保护剂(2M(NH4)2SO4，25％甘油)至晶滴(终浓度2.3M(NH4)2SO4和20％甘油)以防止得到的晶体在用液氮快速冷却期间混乱和形成冰。用冷冻油覆盖晶滴并收获晶体。
数据处理：收集至的衍射数据并使用MOSFLM和iMOSFLM包评价，随后使用CCP4套件(Leslie，(2006)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 62，48-57；ActaCrystallogr D Biol Crystallogr 50，760-3(1994))合并和标定。晶体属于四方晶空间群P 43212，晶胞大小α＝β＝γ＝90.0°。
X射线结晶学结果
以L21至E148的电子密度定义KD1-KD2结构；虽然化学上存在，残基D149和G150在分子的两个结晶学独立拷贝中构象上混乱。
两个结构域都显示Kunitz型结构。仅～1/3结果参与二级结构元件；这些是两个短α-螺旋元件S24-A27(KD1)/D95-F98(KD2)(α1/α3)和L69-M75/L140-E148(α2/α4)和包含M39-N45/I110-N116(β1/β3)和R49-I55/K120-K126(β2/β4)的双链β片层。这些元件形成由三个正则二硫键稳定的拓扑架构，所述二硫键包括KD1中的C26-C76、C35-C59和C51-C72以及KD2中的C95-C147、C106-C130和C122-C143。
通过X射线结晶学阐明TFPI的第一结构由KD1、KD2及其连接体组成。明显地，JBT1837以不同的构象状态锁定KD1-KD2，其中两个Kunitz结构域通过二重对称相关。此外，TFPI的构象的内在稳定通过两个转角进行，来自T77-A81的β转角(tβ)和来自Q90-K93的γ转角(tγ)。tβ通过三个氢键(O K74-N N82，O N80-NζK74，O N82-NεH23)来稳定，并导致KD1中的α2与同系Kunitz结构域和单独KD1晶体结构相比缩短两个残基。tγ由四个氢键(OT88-N D95，O Q90-N K93，O K93-N Q90，OγT88-OδD95)稳定。
23mer肽JBT1837呈现β发夹样结构，其可以被分段成(i)插脚，包含Y2AP-A8AP和T17AP-F23AP的双链β片层；(ii)和针眼，包含D11AP-T15AP的β转角。(下标AP指示拮抗肽(JBT1837)中的序列编号。)β片层由二硫桥(C7AP和C18AP)和包含Y3AP、W5AP和W20AP侧链的疏水拉链稳定。
使用PISA服务器分析KD1-KD2和JBT1837之间的相互作用得到的总体相互作用表面。超过2/3的相互作用表面由JBT1837中与散布于TFPI的残基相互作用的疏水锚组成，包括KD1、KD2和连接体，如相互作用阵列所示例说明的，其概述提供于表18和图74。
表18
除了疏水接触，阵列鉴别了稳定TFPI-JBT1837复合物的极性相互作用，例如，通过H6AP侧链与M134的羰基氧以及W5AP的Nε与Q63的羰基氧的氢键，以及包含M16AP-C18AP和R83-I85的短β链。此外，K4AP的Nζ由E67和E142的侧链等距离配位。
除了其在JBT1837稳定中的作用，C7AP-C18AP的二硫桥完美拟合E71、M75、N82和I84形成的疏水腔，由此在稳定TFPI-JBT1837复合物中发挥显著作用。
尽管TFPI在不同物种中主要是保守的，但是连接体和KD2中的关键残基(M134，I146)仅由与人物种亲缘物种共有(图74)。此外，猕猴中的A81V取代通过空间位阻而使连接体的β转角不稳定，损害了连接体后来与JBT1837的相互作用。
将之前溶解的KD1+JBT1857复合物的KD1叠加至KD1-KD2+JBT1837复合物以提供三元结构布置的模型。该模型表明，JBT1837和JBT1857结合KD1的对位。JBT1857的C末端和JBT1837的N末端分开因此，连接体部分长度大约相当于约10个氨基酸，会连接JBT1857和JBT1837，并允许结合TFPI上各自结合位点的亚基。
KD1-KD2+JBT1837+JBT1857晶体属于四方晶空间群P 43212，并且衍射至的最大分辨率。通过轴向消除来证实螺旋轴，并且晶胞内含分析指示不对称单元中72kDa的质量。假设三元复合物结晶，这对应于不对称单元中3(62kDa；61％溶剂)或4(82kDa；46％溶剂)个拷贝。然而，该结构不能完全溶解，可能是由于KD1-KD2分子结构的固有柔性。TFPI与JBT1837之间相互作用的分析以及TFPI的肽诱导的构象表明，JBT1837可能不结合非人物种的TFPI。JBT1837的高选择性是有利的，因为这最小化交叉反应性和因此不想要的副作用。JBT1857在不同位点结合TFPI，并且天然PAGE说明两个肽可以同时结合TFPI。该分析进一步通过KD1-KD2+JBT1837+JBT1857的基于晶体结构的模型所证实(图75)。JBT1857的C末端和JBT1837的N末端位置分开仅并且例如10个Ala(或Ser)的连接体允许JBT1837和JBT1857两者与其TFPI内的结合位点结合。
实施例16
以下实施例描述结合TFPI的肽复合物的表征。
如本文描述的产生TFPI结合肽。肽作为三氟乙酸盐(TFA)合成，纯度>90％，并且溶解于DMSO至10mM的储存浓度。
使用生物素化的TFPI结合肽作为“示踪剂”进行竞争(IC50)ELISA，以竞争与非生物素化候选肽的TFPI结合。鉴定原理描绘于图6B。用涂布缓冲液(15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH9.6)中0.05μg/mL TFPI涂布96孔Maxisorp板(Nunc)过夜。用350μl洗涤缓冲液(HNaT：175mM NaCl，25mM HEPES，5mM CaCl2，0.1％Tween 80，pH7.35)洗涤板三次，并用200μlHNaT中2％酵母提取物阻断2小时。然后用350μl HNaT洗涤板三次。生物素化示踪剂以对应于其各自在结合ELISA中测定的EC90值(如果n>2，则是平均值)的浓度应用。将候选肽的竞争储存溶液(10mM或在DMSO中预稀释)在HNaT中稀释1/33.3，并用含3％DMSO的HNaT制备连续1/3稀释液。基于肽的亲和力来调整特定检定中使用的稀释策略。稀释液用生物素化示踪肽以1:6的比率进一步稀释(20μl竞争剂稀释液和100μl示踪肽)。将竞争剂和示踪剂肽的混合物应用至TFPI涂布的微量滴定板并孵育1.5小时。板用350μl HNaT洗涤三次。通过以下来检测肽-TFPI结合：将辣根过氧化物酶(HRP)轭合的链霉亲和素应用至微量滴定板，孵育混合物1小时，用350μl HNaT洗涤板三次，应用TMB(3,3’5,5’-四甲基联苯胺)，并检测随后HRP对TMB的生色转化。代表性肽JBT1857(SEQ ID NO：178)、JBT1837(SEQ ID NO：1044)和肽复合物JBT2547(Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKLSSSSSSSSSSSYYKWH[CAMRDMKGTMTC]VWVKF-NH2(SEQ ID NO：4260))的IC50图描绘于图66A和66B。
包含结合TFPI内两个不同位点的两个不同TFPI结合肽(JBT1857和JBT1837)的TFPI抑制肽复合物JBT2547证明了1.33x10-9M的IC50(示踪剂JBT2271)和5.57x10-10M的IC50(示踪剂JBT2316)，其与肽亚基的IC50相当或更低。
此外，在表面等离子体共振检定(BIAcore T200TM，GE Healthcare，ChalfontSt.Giles，UK)中表征结合全长TFPI的JBT2547。将重组的全长TFPI-1固定在针对500RU的CM5芯片。以在HBS-P缓冲液，pH7.4，0.1％DMSO中范围从1至16nM的浓度，以30μL/分钟的流速注射肽。随后，解离肽600秒。利用BIAcore T200TM评价软件来分析数据，其揭示JBT2547以<1nM的结合常数紧密结合全长TFPI。计算KD为7.49×10-12M。
实施例17
本实施例描述了使用k解离检定表征TFPI结合肽复合物的结合亲和力的示例性方法。
室温下用涂布缓冲液(15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH9.3)中1.6nM TFPI涂布微量滴定板(96孔，Maxisorp，Nunc)的孔2小时。然后用350μl洗涤缓冲液(175mM NaCl，5mMCaCl2，25mM HEPES，0.1％Tween 80，pH7.35)洗涤板三次，并用100μl阻断缓冲液(2％酵母提取物，175mM NaCl，5mM CaCl2，25mM HEPES，0.1％Tween 80，pH7.35)阻断孔。如果采用24小时孵育期，孔被阻断至少1小时。用于15分钟孵育期的对照孔被阻断额外23.5小时。
对于24小时孵育期，用350μl洗涤缓冲液洗涤孔三次并与洗涤缓冲液中50μl测试肽(JBT2547(SEQ ID NO：4260)或JBT1857(SEQ ID NO：178))孵育。基于在例如本文描述的TFPI IC50ELISA检定中测定的个体IC90浓度来调节测试肽的浓度。使TFPI涂布孔暴露于测试肽大约15分钟。随后用350μl洗涤缓冲液洗涤孔三次，添加50μl示踪剂(竞争剂)肽(JBT2271(SEQ ID NO：4033))。对照孔(最大信号)与仅示踪剂一起孵育。缺少TFPI涂布的空白孔与仅示踪剂一起孵育。添加示踪肽开始了24小时孵育期。
如果测试肽的IC90浓度导致最大信号90％减少，则采用15分钟孵育期作为对照。被封闭额外23.5小时的孔用350μl洗涤缓冲液洗涤三次以去除阻断缓冲液。随后，添加50μl洗涤缓冲液中的分析物，孵育孔15分钟。基于使用例如TFPI IC50ELISA检定测定的肽的IC90浓度来调节使用的测试肽的浓度。15分钟孵育之后是三次用350μl洗涤缓冲液洗涤步骤，并添加50μl示踪肽。对照孔(最大信号)与仅示踪剂一起孵育。缺少TFPI的空白孔与仅示踪剂一起孵育。
板用350μl洗涤缓冲液洗涤三次，并向每个孔添加50μl HRP轭合的链霉亲和素(R&D Systems，洗涤缓冲液中1:200)。室温下1小时孵育期之后，用洗涤缓冲液洗涤板三次。添加TMB溶液(50μl每孔；SeramunBlau fast，Seramun)。室温下1.5分钟孵育之后，通过添加每孔50μl 1M H2SO4而终止反应。使用光度计(Spectramax M5，Molecular Devices)在450nM和620nM下测量吸光度。
图67以暴露于测试肽和示踪肽的孔的校正光密度(OD450-OD620)相对于仅暴露于示踪剂的TFPI涂布孔的百分比提供检定结果。24小时之后，TFPI结合肽复合物继续阻断示踪剂与TFPI的结合。相反，JBT1857在24小时孵育期间从TFPI解离。因此，JBT2547从TFPI的解离显著慢于其肽亚基之一JBT1857。
还使用本文描述的方法测定了TFPI的JBT2528的亲和力：KD＝1.6nM；k结合＝6.5×1051/Ms；k解离＝9.7×10-41/s。JBT2528结合TFPIkD1。
实施例18
本实施例描述了小鼠和人血浆中TFPI结合肽复合物JBT-2547的血浆稳定性。将JBT2547(SEQ ID NO：4260)和JBT1857(SEQ ID NO：178)添加至小鼠或人血浆的样品并在37℃孵育24小时。通过在用0.05mg/ml TFPI(2.26nM示踪肽JBT2271)涂布的Maxisorp板上的IC50ELISA测定孵育之后剩余的肽初始量的百分比。JBT1857初始量的小于5％在孵育期之后保留在小鼠血浆中，而JBT-2547的初始量的15％在相同孵育期之后保留。类似地，JBT2547在人血浆中比JBT1857和JBT1837更稳定；JBT1857的初始量的27％和JBT1837的46％在24小时之后保留，而JBT2547的初始量的54％被检测。因此，JBT1857和JBT1837的复合物增加了稳定性和对血浆蛋白酶的抗性。JBT2528(Hex-FQSKp-C(Acm)-VH-Tle-DaYFERL-Aib-AKL-NH2(SEQ ID NO：4246))还表现出增强的稳定性：初始量的93％在24小时之后保留在人血浆中，并且初始量的35％在24小时之后保留在小鼠血浆中。
实施例19
以下实施例描述了使用实施例3中描述的FXa抑制和外源性tenase抑制检定表征TFPI结合肽复合物和TFPI结合肽单体的TFPI抑制活性。
从1或10mM储液(DMSO中)在1.25X反应缓冲液+0.1％Tween-80(31.25mM HEPES；218.75mM NaCl；6.25mM CaCl2；0.125％BSA；pH7.35)中稀释肽。在1.25X反应缓冲液中稀释TFPI、FVIIa和脂化TF。向96孔板添加磷脂囊泡(DOPC/POPS 80/20)和FXa特异性生色底物(S-2222(可获自DiaPharma，West Chester，OH))，全部在Aqua dest.中稀释。孵育期之后，添加TFPI和肽稀释液。外源性tenase抑制检定的TFPI浓度是0.0625nM。通过向孔中添加FX而开始FX活化。通过使用微板读数器观察吸光度增加来测定FXa介导的生色底物转化。从OD读数计算在某些时间点产生的FXa的量。考虑反应开始后20分钟产生的FXa用于从肽浓度与TFPI抑制(％)的曲线计算EC50。
还使用FXa抑制检定检查TFPI的功能抑制。向96孔板添加在Aqua dest.中稀释的FXa特异性生色底物(S-2222)和磷脂囊泡(DOPC/POPS 80/20)以及在1.25X反应缓冲液中稀释的TFPI蛋白(全长人TFPI、人TFPI 1-160、鼠TFPI 1-160和短尾猴TFPI 1-160)。FXa抑制检定中的TFPI浓度是0.5nM。在1.25x反应缓冲液+0.1％Tween-80中从1或10mM储液(DMSO中)稀释肽。向96孔板添加肽稀释液(2.5μl)。通过添加FXa触发生色底物的转化，并且在微板读数器中测量转化动力学。考虑115分钟后的OD读数用于从肽浓度与TFPI抑制的曲线计算EC50。
来自FXa抑制检定和外源性tenase检定的结果提供于表19以及图68A和68B。
表19
在FXa抑制检定中，JBT1837、JBT2547、JBT2528、以及JBT1837和JBT1857的组合非常有效抑制了0.5nM全长和C末端截短的TFPI1-160(表19以及图68A和68B)。JBT1857较不有效地抑制了分别具有4.3和3.1nM EC50的两个TFPI。在高于100nM的浓度下，JBT1837、JBT2547、以及JBT1837和JBT1857的组合完全阻断TFPI活性，如通过接近100％最大抑制所指示的。JBT1857(和JBT2528)是TFPI的部分抑制剂，并且在高和饱和浓度下证明了一些残余TFPI抑制活性。全长和C末端截短的TFPI的抑制证实，肽的结合表位在Kunitz结构域1和2内，并且TFPI的C末端区域不是TFPI活性有效抑制所需的。
还分析了候选肽对鼠和短尾猴TFPI的抑制。C末端截短的鼠和猴TFPI蛋白(TFPI1-160)用于如本文描述进行的FXa抑制检定。结果概括于表20以及图68C和68D。
表20
*没有达到拟合的最大量
JBT1837没有抑制多达10μM的小鼠TFPI 1-160(图68C)。短尾猴TFPI在μM浓度下仅得到微弱抑制，可能是由于与JBT1837的结合不相容的种间序列差异(图68D)。JBT1857有效抑制了小鼠TFPI，导致7.2nM的EC50，这与人TFPI的抑制相当。短尾猴TFPI没有被JBT1857有效抑制，可能是由于JBT1857结合位点内Ala至Pro的取代。
JBT2547最有效抑制小鼠和短尾猴TFPI。JBT2547介导了与JBT1857、以及JBT1837和JBT1857的组合相比约200倍以及10倍更大的EC50减少。这进一步指示两个肽实体的分子融合增加了其TFPI抑制活性。
为了说明肽复合物有效抑制高浓度的TFPI，以递增的人TFPI浓度滴定肽。JBT2547化学计量地且完全(100％)抑制所有测试浓度(达10nM)的TFPI活性(图68E和68F)。相反，肽JBT1837和JBT2548(JBT1857的衍生物)是高浓度TFPI的部分抑制剂(图68D)。连接TFPI抑制肽形成肽复合物增强了TFPI活性的抑制。
在外源性tenase检定中，JBT2547在具有0.3nM的EC50的TFPI存在下恢复外源性复合物介导的FX活化，导致TFPI活性在低TFPI浓度(0.063nM)下近100％抑制。JBT1837、JBT1857以及JBT1837+JBT1857的组合较不有效地抑制了TFPI，如通过较高EC50和减少的最大抑制所指示的(图69A)。为了证明肽复合物有效抑制高浓度TFPI，以递增的TFPI浓度滴定JBT2547。JBT2547以测试肽的最低EC50有效抑制所有测试浓度(达10nM)下的TFPI活性(图69B-69D)。相反，肽JBT1837、JBT2548以及JBT1837+JBT1857的组合以比JBT2547更高的EC50部分抑制高浓度的TFPI(图69C-69D)。
在其中FXa在Ca2+、磷脂(PL)+Ca2+、和PL+Ca2++蛋白S存在下受到TFPI抑制的反应系统中还测定了JBT1837、JBT1857、JBT1837和JBT1857的混合物、以及JBT2547的TFPI拮抗剂活性。肽阻断TFPI活性的效力以JBT1857、JBT1837、JBT1837和JBT1857的混合物、以及JBT2547的顺序增加。JBT1837和JBT1857没有完全阻断TFPI，特别是在辅因子蛋白S存在下没有。JBT1837和JBT1857的混合物作为TFPI拮抗剂比个体肽更有效。融合肽JBT2547是迄今最好的TFPI拮抗剂；在50nM浓度下，肽复合物几乎完全阻断TFPI，即使是在PL+Ca2++蛋白S存在下。
本实施例说明，本发明的两个TFPI结合肽通过例如分子融合的连接提高了TFPI抑制活性。JBT1837防止主要TFPI-FXa复合物(相遇复合物)的形成，并且在高浓度下可以完全阻断FXa的TFPI抑制。JBT1857防止弱相遇向紧密TFPI-FXa复合物的转变，并且部分抑制TFPI，因为在JBT1857存在下，其依然可能形成主要的TFPI-FXa复合物(相遇复合物)。两个TFPI结合肽的分子融合证明了比每个单独肽和肽亚基混合物更大程度的抑制活性(即，效果大于加和)。
实施例20
在本实施例中，使用实施例4的基于血浆的检定表征TFPI结合肽复合物的TFPI抑制活性。在生理条件(～0.2nM全长TFPI)以及模拟升高的全长TFPI血浆水平(达10nM全长TFPI)的条件下测试TFPI结合肽。
在凝血酶特异性荧光底物(Hemker，Pathophysiol.Haemost.Thromb.，33，4-15(2003))的缓慢裂解之后，在Fluoroskan读数器(Thermo Labsystems，Helsinki，Finland；滤器，390nM激发和460nM发射)中通过校准的自动化血栓描记术一式两份测量肽在外源性flTFPI不存在或存在下对凝血酶生成的影响。作为抗体介导的FVIII缺陷的模型，将冷冻汇集的正常血浆(George King Bio-Medical Inc.，Overland Park，KN)与山羊中产生的高滴度、热失活的抗人FVIII血浆(4490BU/ml；Baxter BioScience，Vienna，Austria)一起孵育，产生50BU/mL。还使用短尾猴和狨猴血浆进行检定。血浆与玉米胰蛋白酶抑制剂(CTI)(Hematologic Technologies,Inc.，Essex Junction，VT)混合以抑制凝血因子XIIa污染，得到40μg/mL的终浓度。
向96孔微板(Immulon 2HB，透明U底；Thermo Electron，Waltham，MA)的每个孔添加预温的(37℃)血浆(80μL)。为了触发组织因子生成凝血酶，添加10μL含有重组人组织因子(12pM)的PPP低试剂和由磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺(48μM)(Thrombinoscope BV，Maastricht，The Netherlands)构成的磷脂囊泡。在将板放入预温的(37℃)读数器中之前，添加5μL肽，得到1-100nM的血浆浓度。最后，添加5μL含有5mg/mL牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，Missouri，USA)的HEPES缓冲盐水或5μL全长TFPI(flTFPI)稀释液。已经在SK Hep细胞中表达flTFPI蛋白(3557nM)并纯化。flTFPI的血浆浓度在0.31和10nM之间变化，等同于内源性flTFPI血浆浓度的～2至50倍增加。通过添加含有荧光底物和HEPES缓冲CaCl2(100mM)的20μL FluCa试剂(Thrombinoscope BV，Maastricht，The Netherlands)而开始凝血酶生成。记录37℃下的荧光强度。使用ThrombinoscopeTM软件(Thrombinoscope BV，Maastricht，The Netherlands)和凝血酶校准仪计算得到的凝血酶生成曲线的参数以校正内部滤器和底物消耗效应(Hemker，Pathophysiol.Haemost.Thromb.，33，4-15(2003))。人血浆检定的最终血浆稀释、TF浓度和检定温度分别是1:1.5、1pM和37℃。小鼠C57B16血浆检定和小鼠FVII-/-血浆检定的最终血浆稀释、TF浓度和检定温度分别是1:2.4、0.4pM和33℃。短尾猴和狨猴血浆检定的最终血浆稀释、TF浓度和检定温度分别是1:1.5、0.6pM和37℃。
人FVIII抑制的血浆的凝血酶生成提高的代表性结果提供于表21。
表21
JBT1837、JBT1857、JBT1837+JBT1857的混合物、以及JBT1837和JBT1857的复合物(JBT2547)提高了具有相似EC50的FVIII抑制血浆的凝血酶生成。相对于多克隆抗TFPI抗体的最大效力对于JBT2547是最高的，说明本文描述的两个TFPI结合肽的融合增强了血浆中TFPI活性的抑制。
图70A-70C示例说明了1-100nM融合肽JBT2547(菱形)在凝血酶生成检定中对升高水平的flTFPI血浆水平(1.25、3.75和10nM)的抑制活性。与JBT1837(三角形)和JBT1857(圆形)相比，JBT2547显示了基本上更大的增加凝血酶峰值的能力，即使在极高flTFPI血浆水平存在下。尽管组合JBT1837和JBT1857(正方形)相对于每个单独单体肽提高了响应，但是单体组合没有实现由肽复合物实现的活化水平。还在达10nM的广浓度范围flTFPI存在下测试了JBT2547的TFPI拮抗潜力，这等同于比生理flTFPI血浆浓度高50倍。50-100nM JBT2547的浓度完全补偿了10nM flTFPI的抗凝血作用，并且凝血酶峰值达到正常血浆水平或更高。低于50nM的JBT2547浓度以flTFPI依赖方式提高了FVIII抑制血浆的凝血酶生成。
使用几个动物血浆的凝血酶生成实验的结果概括于表22和23。
表22
表23
*“-”指示无曲线拟合
JBT1837没有抑制相关浓度的小鼠和狨猴TFPI。短尾猴TFPI仅在μM浓度下得到弱抑制。JBT1857有效抑制了小鼠和狨猴TFPI，而短尾猴TFPI较不有效地受JBT1857抑制，可能是由于JBT1857的结合位点内Ala至Pro氨基酸取代，这在人、小鼠和狨猴TFPI中是保守的，为Ala。短尾猴TFPI得到融合肽JBT2547的最有效抑制。
实施例21
本实施例描述了本文所述TFPI结合肽在基于细胞的外源性tenase检定中恢复外源性tenase复合物介导的FX至FXa转化的能力。如实施例5所述进行检定。在100nM多克隆抗人TFPI抗体(R&D Systems，AF2974)存在下反应9分钟之后获得的FXa浓度设为100％，并且将没有暴露于抗体的样品设为0％TFPI抑制作用，允许评估肽的抑制活性。检定结果示例说明于图71A和71B。JBT2547说明了与JBT1837、JBT1857、JBT2548、以及JBT1857和JBT1837的混合物相比提高的HUVEC TFPI抑制。在低至约10nM的浓度下实现了TFPI的完全抑制。
实施例22
本实施例描述了使用旋转血栓弹性描记法(ROTEM)评估全血中血凝块形成的方法。如实施例8所述进行检定。分析建立如下：将300μL预热(37℃)CTI处理的柠檬酸盐化的全血添加至肽样品(10、100、1000nM最终检定浓度)或对照，随后添加含有重组人组织因子(rTF，3pM)(TS40，Thrombinoscope BV，Maastricht，The Netherlands)的TF PRP试剂的1:15稀释液。在某些实施方案中，添加终浓度2或10nM的外源性全长TFPI(flTFPI)以刺激flTFPI血浆水平超过正常达50倍。通过添加20μL 200mM CaCl2(Pentapharm，Munich，Germany)而开始凝血，允许记录进行至少120分钟。检定中rTF的终浓度是44fM。根据生产商说明书记录凝结时间(CT)、血凝块形成时间(CFT)和最大的血凝块硬度(MCF)的血栓弹性描记参数。CT被定义为从开始测量到开始形成血凝块的时间。CFT被定义为从开始形成血凝块直至达到20mm幅度的时间。MCF为检定期间两个痕迹之间最大的幅度差异。
在TFPI抑制肽不存在下向FVIII抑制的全血添加全长TFPI基本上抑制了凝血，如凝结时间明显增加所指示的(图72A-72C)。JBT2528和JBT1837改善了FVIII抑制的血浆的总的止血参数(分别地，EC50＝11nM和4nM)。JBT1837和JBT2548通过以浓度依赖方式减少凝结时间至正常水平而改善了凝血(图72B和72C；开放圆形)。这些肽在增加TFPI浓度(例如，10nM)下未能达到FVIII抑制的血液的凝结时间。相反，高于100nM的JBT2547的浓度完全恢复了向其中添加2nM和10nM全长TFPI的FVIII抑制全血的正常凝血。
本实施例进一步证实TFPI结合肽复合物有效中和TFPI并恢复正常凝血，即使在增加的TFPI浓度下。
实施例23
血小板含有全长TFPI，其在血小板活化后释放入血浆，并导致血浆中血小板TFPI浓度大约为受伤部位血浆中全长TFPI的50-75％。本实施例说明本发明肽对血小板TFPI的抑制。
血液收集和血浆制备：从许多不同供体收集血液样品。通过静脉穿刺将9体积静脉血抽入有或没有500μg/ml CTI的1体积1.09柠檬酸三钠，并以250xg离心15分钟以制备血小板富集的血浆(PRP)或以2860xg离心以制备血小板贫乏的血浆(PPP)。将PPP分成小份、快速冷冻并储存在-80℃直至使用。在其中使用正常血浆池(NP)的实验中，从超过25个健康个体收集的血液以2000xg离心15分钟以从血细胞分离血浆，并再以11000xg离心5分钟以获得血小板贫乏的血浆。
血小板分离：在7.5ml柠檬酸/右旋糖(ACD，80mM柠檬酸三钠，52mM柠檬酸，183mM葡萄糖)上收集血液(45ml)并在15分钟期间以248xg离心。为了去除残余红血球，以248xg离心上清液(血小板富集的血浆，PRP)额外5分钟。随后在15分钟期间以2760rpm(1360xg)离心PRP，以旋降血小板。通过在20ml(第一次洗涤)和15ml(第二次洗涤)血小板缓冲液(10mMHEPES，136mM NaCl，2.7mM KCl，2.0mM MgCl2，0.5％牛血清白蛋白和0.2％葡萄糖，pH6.6)中重悬，随后在15分钟期间以2760rpm(1360xg)离心，洗涤血小板沉淀两次。在第二次洗涤步骤之后，将血小板重悬于3.5ml血小板缓冲液(pH7.5)，并在Coulter计数器中测定血小板浓度。最后，通过用血小板缓冲液(pH7.5)稀释而将血小板悬液稀释至所需的血小板浓度，并且每3.5ml血小板悬液添加40μl25mg/ml合成肽Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS)的溶液，以抑制室温下储存期间的血小板聚集。
血小板TFPI的功能表征：通过在37℃下15分钟期间用100ng/ml convulxin活化血小板而从分离的血小板释放TFPI。通过在Eppendorf离心管中离心(2800xg，15分钟)旋降血小板，收集上清液作为血小板TFPI来源。使用重组TFPI作为标准品，用全长TFPI ELISA定量血小板TFPI。在两个检定系统中对比血小板TFPI的功能活性与重组TFPI的活性：1)模型系统中FVIIa催化的FX活化的抑制和2)TFPI缺陷血浆中凝血酶生成的抑制。
在模型系统检定中，在含有2pM FVIIa、5nM TF、100nM FX和400uM Fluophen FXa的25mM HEPES(pH7.7)、175mM NaCl、5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)缓冲液中37℃下测定不同浓度重组或血小板TFPI对TF-FVIIa催化的FX活化的影响。在该检定中，FVIIa、TF、TFPI和Fluophen FXa在HEPES缓冲液中37℃下预孵育7分钟，并且通过添加FX而开始FX活化。在Fluoroskan读数器(Thermo Labsystems，Helsinki，Finland)中测定产生的FXa对fluophen FXa转化的进程曲线，并通过还用于校正底物消耗的凝血酶生成曲线的方法(Hemker等人，Pathophysiol Haemost Thromb，32，249-53(2002))校正Fluophen FXa消耗和所谓的内部滤器效应(Udenfriend S，Fluorescence Assay in Biology andMedicine.New York，Academic Press，1996，第1卷，pp13，118，第2卷，pp182–185)。通过取Fluophen FXa转化的校正的进程曲线的一阶导数而获得FXa生成的时间过程和TFPI对其的作用。可选地，TFPI对TF-FVIIa催化的FX活化的效应之后还接着FXa特异性生色底物，例如125μM CS-11(65)。
在凝血酶生成检定中，用不同量的重组TFPI或血小板衍生的TFPI重构TFPI清除的血浆，使用Hemker等人(同上)描述的校准的自动化Thrombogram(CAT)方法测定凝血酶生成。通过添加不同浓度的重组TF(0.1-10pM)、16mM CaCl2、30μM磷脂囊泡(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸/1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺/1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱，20/20/60，M/M/M)和30-50μg/ml玉米胰蛋白酶抑制剂(CTI)而在血浆中开始凝血酶生成。在PRP中的实验中，没有向血浆添加磷脂囊泡。用荧光底物Z-Gly-Gly-Arg-AMC(BACHEM，Bubendorf，Switzerland)连续监测血浆中的凝血酶活性。在Fluoroskan读数器(Thermo Labsystems，Helsinki，Finland)中读取荧光并使用ThrombinoscopeTM软件(Thrombinoscope，Maastricht，Netherlands)计算凝血酶生成曲线。
本发明肽对重组、血浆和血小板TFPI的作用的分析：在模型系统(TFPI对FXa和TF-FVIIa催化的FX活化的抑制)和血浆(用重组或血小板TFPI或血小板重构的NP、PPP、PRP或TFPI清除的血浆)中测试TFPI结合肽对TFPI的抗凝活性的作用。在HNBSA缓冲液(50mMHEPES pH7.7，175mM NaCl，5mg/mL BSA)中跟踪肽对TFPI对FXa抑制的作用，所述HNBSA缓冲液包含125μM CS-11(65)、1mM EDTA或3mM CaCl2和可能存在的不同浓度的肽和TFPI、80nM蛋白S和/或30μM磷脂囊泡(20:60:20DOPS/DOPC/DOPE)，其在37℃下预孵育10分钟。添加hFXa，并且在超微板读数器(Ultra Microplate Reader)(Bio-Tek，Burlington，VT，USA)中跟踪405nm下的吸光度增加，直至获得生色底物转化的稳态速率(～60分钟)。生色底物转化的进程曲线拟合缓慢-紧密结合抑制的综合速率方程(Huang等人，J Biol Chem，268，26950-55(1993))：
At＝A0+(vs.t)+(v0-vs).(1-exp(-kobs.t))/kobs
其中At是时间t时405nm处的吸光度；A0是405nm处的初始吸光度；vs是最终稳态速度；v0是初始速度；kobs是从v0向vs转变(FXa-TFPI至FXa-TFPI*)的表观速率常数。相对于TFPI不存在下通过FXa的生色底物转化速率的值v0和vs代表松散和紧密FXa-TFPI复合物形成的程度。
在含有2pM FVIIa、5nM TF、100nM FX、400μM Fluophen FXa和不同量的肽和TFPI(重组或血小板衍生的)的25mM HEPES(pH7.7)，175mM NaCl，5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)缓冲液在37℃下测定肽对通过TFPI的TF-FVIIa催化的FX活化的抑制的作用。在该检定中，FVIIa、TF、TFPI、肽和Fluophen FXa在HEPES缓冲液中37℃下预孵育7分钟，并且通过添加FX而开始FX活化。在Fluoroskan读数器(Thermo Labsystems，Helsinki，Finland)中测定产生的FXa对Fluophen FXa转化的进程曲线，并通过还用于校正底物凝血酶生成曲线的方法校正Fluophen FXa消耗和所谓的内部滤器效应。通过取Fluophen FXa转化的校正的进程曲线的一阶导数而获得FXa生成的时间过程和TFPI对其的作用。可选地，TFPI对TF-FVIIa催化的FX活化的效应之后还接着FXa特异性生色底物，例如125μM CS-11(65)。
通过测量其对如以下描述在使用重组或血小板TFPI或血小板重构的NP、PPP、PRP或TFPI清除血浆中测定的凝血酶生成的作用来评估肽对血浆和血小板TFPI的作用。在PRP中或在用血小板重构的TFPI清除的血浆中的实验中，血小板未被活化或者用80ng/mlconvulxin或40ug/ml Horm胶原蛋白(孔中的终浓度)活化。为了刺激血友病血浆，在山羊抑制剂血浆存在下进行凝血酶生成实验，将1μl山羊抑制剂血浆添加至80μl血浆以中和FVIII。
在凝血酶生成实验中，向微量滴定板添加血浆，并且与可能存在的适量磷脂、血小板、TFPI、抗FVIII、抗TFPI抗体、肽混合并在37℃下孵育7分钟。在该预孵育之后，立即添加TF和血小板活化剂(如果存在)，随后添加开始凝血酶生成的混合荧光底物/CaCl2混合物(FluCa)。
结果：血小板上清液TFPI以浓度依赖性方式抑制TF-FVIIa催化的FX失活。通过抗TFPI抗体混合物预防血小板上清液的抑制，其强调血小板上清液中的TFPI是TF-FVIIa催化的FX活化的抑制剂。然而，在血小板上清液和抗TFPI存在下的FX活化速率高于没有血小板上清液时的FX活化速率，表明血小板上清液含有小量FX活化剂，例如FVIIa。这表明该数据因为以下事实而低估了血小板TFPI浓度：与其中校准曲线用缓冲液中的重组TFPI制成的检定混合物相比，当检定混合物中存在血小板上清液时，更多FVIIa必然受到抑制。
还在TFPI缺陷血浆中测试了血小板TFPI的功能活性并与重组的非糖基化TFPI活性相比较。使用ELISA测定来自不同供体的血小板TFPI的浓度，其中使用重组非糖基化TFPI作为校准剂。尽管没有使用在TFPI缺陷血浆中不同的TFPI制品进行滴定，但是血小板和重组TFPI对凝血酶生成作用的检查显示，在浓度基础上，血小板和重组TFPI表现出类似的抗凝血活性。
JBT1837、JBT1857、JBT1837+JBT1857和JBT2547(50nM)阻断了血小板TFPI抑制TF-FVIIa催化的FX活化的能力。融合肽是最有效的，并且完全阻断了TFPI的抗凝血活性。JBT1857是最不有效的，之后是JBT1837以及JBT1837和JBT1857的混合物。JBT2547的滴定说明，10nM的浓度几乎完全抑制了血小板TFPI的活性。
进行额外研究以进一步阐明血浆和血小板TFPI对血小板富集血浆(PRP)和血小板贫乏血浆(PPP)中凝血酶生成抑制的作用。为了区分血小板TFPI和血浆衍生的TFPI对凝血酶生成的下调，在补充了血小板(血小板TFPI来源)和/或不同量的添加的纯化TFPI(模拟血浆TFPI水平的变化)的TFPI清除血浆中进行实验。在补充了convulxin活化的血小板的TFPI清除血浆中的初步实验显示，抗TFPI抗体增强了凝血酶生成，这指示从血小板释放的TFPI抑制凝血酶生成。
似乎PRP中的凝血酶生成需要TF。在没有CTI的PRP中和之后向其添加CTI的PRP中，ETP和凝血酶峰高很难受到TF浓度的影响(TF不是必需的)，并且递增的TF仅缩短滞后时间。当从在柠檬酸盐加CTI中收集的血液制备PRP时，滞后时间和凝血酶峰都受到TF浓度的影响，指示在PRP中进行的实验需要血液必须在CTI中收集。
在上述实验中，用convulxin预活化血浆以促进血小板TFPI释放，然后开始用TF加Ca2+的凝血酶生成。因为convulxin不是生理引发剂，进行了在含有非活化血小板和用convulxin、胶原蛋白和Ca-离子载体预活化的血小板的PRP中凝血酶生成的比较。似乎血小板的凝血酶生成能力以如下顺序增加：无活化剂＝离子载体<胶原蛋白<convulxin。
此外，在上述实验中，血小板在TF存在下与活化剂预孵育(预活化)7分钟，并且用荧光底物/Ca2+混合物开始凝血酶生成。与在其中血小板在开始凝血酶生成之前用convulxin预活化的PRP中相比，当用荧光底物/Ca2+混合物开始凝血酶生成之前10-15秒钟向PRP添加血小板活化剂convulxin时产生明显更少的凝血酶。鉴于这些结果，未来研究不会包括血小板预活化，并且胶原蛋白或无活化剂将主要用于PRP中的实验。
在从CTI上收集的血液制备的PRP中开始测试TFPI拮抗剂的作用。抗TFPI混合物和JBT2547都明显增强用0.1pM TF+胶原蛋白在PRP中引发的凝血酶生成。这显示，TFPI是血小板上凝血酶生成的主要调节剂，并且JBT2547在中和TFPI的抗凝血活性方面与抗TFPI混合物同样有效。TFPI难以下调用高量(10pM)TF引发的PRP中凝血酶生成。
以低TF(1pM)在PRP中生成的凝血酶的主要部分似乎是通过内源性Xase形成的，因此需要FVIII。JBT2547和抗TFPI混合物明显增加PRP中凝血酶生成，其中FVIII用抗FVIII中和，血友病血浆的代表性状况。JBT2547还增强了补充有未活化或用胶原蛋白活化的血小板的TFPI清除的血浆中的凝血酶生成。
使用4μM肽进行JBT2547的实验，考虑JBT2547对TFPI的亲和力(nM以下的范围)，其可能是过量的。实际上，在PPP中和PRP中，5-10nM JBT2547足以完全抑制TFPI。
为了测试血浆中的血浆或血小板衍生的TFPI完全受TFPI抗体混合物还是JBT2547的抑制，在TFPI抗体混合物不存在和存在下在PPP和PRP中进行TFPI滴定。增加TFPI浓度超过血浆中存在的TFPI加上从血小板释放的，逐渐抑制了凝血酶生成。在TFPI抗体混合物存在下，所有凝血酶生成曲线是相同的，指示TFPI抗体混合物不是部分TFPI抑制剂，而是完全中和TFPI。
在PPP中，添加的低浓度TFPI(0.05-0.5nM)明显抑制凝血酶生成，并且凝血酶生成参数(log滞后时间或ln ETP)作为总TFPI(血浆TFPI+添加的TFPI)的函数的曲线可以拟合成直线，假设该血浆含有～0.3nM TFPI。这指示添加的TFPI的抗凝血活性类似于血浆中存在的TFPI的抗凝血活性。在PRP中，需要明显更大量的添加TFPI来抑制凝血酶生成。
肽复合物JBT2547以2nM的有效浓度(EC50)使PPP中的凝血酶生成增强3-4倍，并且以8nM的EC50使PRP中的凝血酶生成增强2倍。向其中添加抑制性FVIII抗体以模拟血友病患者的PRP的PRP中的凝血酶生成被肽复合物增强3倍。本文描述的数据确立了本发明肽结合血浆衍生的、重组的和血小板衍生的TFPI，并且通过阻断血小板和血浆-TFPI的抗凝血作用而增强凝血酶生成。
实施例24
本实施例描述了本发明肽在血友病关节出血的鼠模型中的止血作用。
本研究目的是评价本发明的示例性聚乙二醇化肽在甲型血友病的鼠模型中对穿刺诱导的关节出血的作用。通过静脉内尾静脉注射以1mg/kg的剂量给具有严重血友病的FVIII缺陷小鼠(E16FVIII B6；129S4-F8tm l kaz/J)施用肽JBT2329。还单独或与JBT2329组合施用各种剂量的重组FVIII(ADVATE；10、50和100IU/kg)。在每次产品施用之后，用30号针头穿刺右膝关节囊以诱导出血。损伤后三天处死动物，并通过总体和组织学方法评估出血。评价出血的动物模型和方法进一步描述于Hakobyan等人，Haemophilia，14，804-809(2008)。为每个关节分配概括的出血评分(SBS)，包括视觉和组织学出血评分。在损伤之前施用本发明的聚乙二醇化肽显著减少了关节出血。1mg/kg JBT2329的保护作用显著大于10IU/kg ADVATE的作用，但是小于100IU/kg ADVATE，如通过SBS测定的。1mg/kg JBT2329和50IU/kg ADVATE提供的保护作用没有显著差异。本文描述的结果进一步证实，本发明肽在甲型血友病体内模型中提供了针对出血的预防或保护作用。
实施例25
本实施例描述了本发明肽对TFPI结合介导清除和细胞降解的受体的能力的影响。还描述了肽结合的TFPI的药代动力学。
在37℃下使用BIAcore T200TM表面等离子体共振检定(GE Healthcare，ChalfontSt.Giles，UK)研究了全长TFPI(fl-TFPI)与低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)的结合。使用生物素化试剂盒根据生产商的方案(Thermo Scientific)生物素化LRP。在使用标准胺偶联化学根据生产商方案将中和亲和素固定(2500RU)至S系列传感器芯片C1(GE Healthcare)之后，将生物素化的重组人LRP-1簇II Fc嵌合蛋白(R&D Systems)通过生物素-中和亲和素相互作用结合至表面，得到450RU。固定之后，以在电泳缓冲液(HBS-N，0.1％P80，5mMCaCl2)中稀释的10nM单一浓度、30μL/分钟的流速注射fl-TFPI。随后通过改变流动至电泳缓冲液条件而解离fl-TFPI。当在肽(JBT1837、JBT1857、JBT2329(JBT1857+40kD PEG)或JBT2547(JBT1837+JBT1857))或聚乙二醇(40kD)存在下研究fl-TFPI和LRP的相互作用时，向fl-TFPI添加1μM终浓度的肽或PEG。
TFPI与固定化LRP以快速的结合和解离速率有效地相互作用。缺少kunitz结构域3(KD3)和C末端的截短的TFPI不与LRP相互作用。通过目视检查，明显地是，与JBT1837、JBT1857或JBT2329结合的fl-TFPI依然与LRP相互作用。与融合肽JBT2547复合的TFPI得到比与单肽复合的TFPI观察到的更高的响应。在肽复合物(JBT2547)存在和不存在下，LRP-fl-TFPI相互作用的不变的结合和解离动力学表明，不同的结果与fl-TFPI-JBT2547复合物的增加的分子量以及LRP和肽通过JBT2547可能同时与fl-TFPI结合有关。当TFPI结合至JBT2329(聚乙二醇化的JBT1857)时观察到fl-TFPI LRP相互作用的略微减少，而单独40kDPEG不影响检定系统，表明高度水合的PEG连接的肽略微干扰fl-TFPI LRP相互作用。
还在25℃下使用BIAcore 3000TM表面等离子体共振检定(GE Healthcare，Chalfont St.Giles，UK)评价了TFPI与无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的相互作用。在使用标准胺偶联化学根据生产商方案将ASGPR(Novus Biologicals，470RU)固定至S系列传感器芯片CM5(GE Healthcare)之后，以在电泳缓冲液(HBS pH7.4，0.1％P80，5mM CaCl2)中稀释的范围从3.84nM至150nM的浓度下、在单一循环分析模式中以30μL/分钟的流速注射fl-TFPI。随后通过改变流动至电泳缓冲液条件而解离fl-TFPI。当在肽JBT1837、JBT1857、JBT2329或JBT2547存在下研究fl-TFPI和ASGPR的相互作用时，向fl-TFPI添加1μM终浓度的肽。
Fl-TFPI与固定化ASGPR以快速的结合和解离速率有效地相互作用。C末端截短的TFPI不与ASGPR相互作用。目视检查明显看到，与JBT1857或JBT2547结合的fl-TFPI与ASGPR相互作用。与LRP一样，与融合肽JBT2547复合的TFPI产生更高的响应。还类似于fl-TFPI与LRP的相互作用，JBT2329减少了ASGPR-fl-TFPI相互作用，而单独40kD PEG不影响检定系统。数据表明，本发明的高度水合的PEG连接的肽通过空间位阻干扰TFPI-ASGPR相互作用。
为了研究TFPI结合肽对体内TFPI药代动力学的影响，用人fl-TFPI(775nM，5mL/kg，i.v.)、与10倍摩尔过量的JBT2528复合的人fl-TFPI(775nM hu fl-TFPI，7752nMJBT2528，5mL/kg，i.v.)或与10倍摩尔过量的JBT2534复合的人fl-TFPI(775nM hu fl-TFPI，7752nM JBT2534，5mL/kg，i.v.)治疗数组小鼠(C57Bl6，雄性，20–25g)。JBT2528具有与JBT2534相同的肽序列，但是缺少40kD PEG修饰。这样，JBT2528用作检定中可能的PEG化影响的对照。在不同时间点，处死三只小鼠，通过心脏穿刺取血，分离血浆并冷冻(<-60℃)储存供进一步分析。取样时间点如下：fl-TFPI，0.5、1、2分钟；fl-TFPI–JBT2528，0.5、1、2、3、5、8分钟；和fl-TFPI–JBT2534，1、2、5、10、20、35分钟。
使用特异性针对人TFPI的ELISA分析血浆样品中的人TFPI。为了定量，用1μg/mL单克隆抗人KD2特异性TFPI抗体(Sanquin，White label；MW1845)4℃下涂布微量滴定板(NuncMaxisorp)的孔过夜，随后进行用含有0.1％Tween 20的TBS(TBST)三次洗涤循环。室温下用含有2％无脂干乳(BioRad)的TBS阻断孔1小时。将100μL稀释的样品施加至孔并在室温孵育2小时。用TBST(5x)洗涤之后，孔与0.5μg/mL多克隆兔抗hTFPI抗体(ADG72；AmericanDiagnostica)孵育1小时，用TBST洗涤5x，并与0.2μg/mL山羊抗兔HRP标记抗体(A0545；Sigma)进一步孵育1小时。通过添加100μL底物(SureBlue TMP，KLP)并用50μL 1M HCl停止来显色。用微量滴定板读数器(Thermo Appliskan Reader)测量450nM下的吸光度。SKHep细胞表达的纯化的内源性fl-TFPI以0.25–16ng/ml的浓度用作标准蛋白，用于定量(BaxterInnovations GmbH)。根据预期的人TFPI浓度，血浆样品从1/20稀释至1/800。
人fl-TFPI具有极短的半衰期和极差的体内回收。在最早的时间点(0.5分钟)，仅观察到预期TFPI水平的十分之一。当fl-TFPI与测试肽复合时，fl-TFPI的回收和半衰期保持不变。本实验指示TFPI结合肽的聚乙二醇化可能不赋予fl-TFPI更长的半衰期，并且不影响TFPI清除。
本实施例说明，本发明的代表性肽不显著减少TFPI与清除受体的相互作用，并且不增加TFPI的体内半衰期。
实施例26
本实施例说明本发明的肽抑制TFPI蛋白降解的能力。
TFPI被几种酶蛋白水解失活，所述酶包括弹性蛋白酶、凝血酶、血纤蛋白溶酶、FXa和胃促胰酶。参见例如，Hamuro等人，FEBS Journal，274，3056-3077(2007)。研究了融合蛋白JBT2547以及个体肽亚基JBT1837和JBT1857对嗜中性粒细胞弹性蛋白酶蛋白水解降解fl-TFPI的影响。嗜中性粒细胞弹性蛋白酶是在位于Kunitz 1和Kunitz 2结构域之间的Lys86和Gln90内裂解TFPI的代表性蛋白酶。
为了fl-TFPI的蛋白水解消化，5nM fl-TFPI与5nM嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(从人嗜中性粒细胞纯化，Calbiochem)在反应缓冲液(50mM Tris，300mM NaCl，10mM CaCl2，pH7.5)中37℃下孵育。载有和没有1μM JBT1837、JBT1857或JBT2547的情况下进行反应。通过Western印迹分析监测蛋白水解。在0、5、15、30和60分钟之后以及在还原条件下在SDS加载缓冲液中96℃加热5分钟立即从反应混合物取小份。在4-20％Tris-甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离样品，将蛋白转移至PVDF膜。在用无脂干乳阻断膜之后，用针对人TFPI的兔多克隆抗体(AF2974，R&D Systems)和二级抗兔HRP轭合抗体(Sigma)检测TFPI蛋白。施加SuperSignal West Femto化学发光底物(Thermo Scientific)以产生化学发光信号，其被捕获在膜上。通过光密度法定量产生的条带。
在肽不存在下，观察1小时内嗜中性粒细胞弹性蛋白酶对fl-TFPI的逐渐降解。在Western印迹中显现的对应于完整fl-TFPI的～43kD条带几乎完全消失，而通过肽键T87-T88的裂解形成了两个裂解产物。当JBT2547存在时，在监测期间阻断fl-TFPI的蛋白水解，指示JBT2547防止fl-TFPI在体外被弹性蛋白酶降解。个体肽亚基介导了对fl-TFPI裂解的不同作用。JBT1837防止fl-TFPI蛋白水解持续1小时，类似于针对JBT2547观察到的结果。相反，JBT1857对弹性蛋白酶裂解仅具有较小或没有作用。

Claims (28)

1.一种肽复合物，包括第一肽和第二肽，其中
所述第一肽由SEQ ID NO：178组成，并且所述第二肽由SEQ ID NO：1044组成，以及其中所述第一肽的C末端与所述第二肽的N末端通过连接体部分连接。
2.如权利要求1所述的肽复合物，其中所述肽复合物包含SEQ ID NO:4260。
3.如权利要求1所述的肽复合物，其中所述肽复合物由SEQ ID NO:4260组成。
4.如权利要求1-3任一项所述的肽复合物，其中所述第一肽和/或第二肽还包括额外的选自由以下组成的组的N末端氨基酸和/或部分：FAM-Ttds、PE、Palm、2-苯基乙酰基、3-苯基丙酰基、2-(萘-2-基)乙酰基、己酰基、2-甲基丙酰基、3-甲基丁酰基、2-萘基磺酰基、1-萘基磺酰基、乙酰基、Con、Con(Meox)、AOA、Oxme-AOA、Meox-Lev、乙酰丙酸(Lev)和戊炔酸(Pyn)。
5.如权利要求1-3任一项所述的肽复合物，其中所述第一肽和/或第二肽还包括额外的选自由以下组成的组的C末端氨基酸和/或部分：Hly、K、Orn、Dab、Dap、Eag、Hcy、Pen、C、c、C(NEM)、Con、Con(Meox)、K(Ttds-马来酰亚胺基丙酰基EtSH)、K(Tdts-马来酰亚胺)、K(AOA)、K(Myr)、K(Ttds-Myr)、K(Ttds-Palm)、K(Ttds-Ac)、K(Ttds-γGlu-Myr)、K(AlbuTag)、K(4PBSA)、Cea和酰胺。
6.如权利要求1-3任一项所述的肽复合物，其中所述第一肽和所述第二肽通过长度的连接体部分连接。
7.如权利要求4所述的肽复合物，其中所述第一肽和所述第二肽通过长度的连接体部分连接。
8.如权利要求5所述的肽复合物，其中所述第一肽和所述第二肽通过长度的连接体部分连接。
9.如权利要求6所述的肽复合物，其中所述连接体部分长度为
10.如权利要求9所述的肽复合物，其中所述连接体部分长度为
11.如权利要求6所述的肽复合物，其中所述连接体部分包括结构Z1-20，其中Z是氨基酸、羟酸、乙二醇、丙二醇、或前述任何的组合。
12.如权利要求7所述的肽复合物，其中所述连接体部分包括结构Z1-20，其中Z是氨基酸、羟酸、乙二醇、丙二醇、或前述任何的组合。
13.如权利要求8所述的肽复合物，其中所述连接体部分包括结构Z1-20，其中Z是氨基酸、羟酸、乙二醇、丙二醇、或前述任何的组合。
14.如权利要求11-13任一项所述的肽复合物，其中Z是G、s、S、a、A、Bal、Gaba、Ahx、Ttds或前述任何的组合。
15.如权利要求6所述的肽复合物，其中所述连接体部分通过肟、酰肼、琥珀酰亚胺、硫醚、三唑、仲胺、酰胺或二硫化物连接至所述第一肽和/或所述第二肽。
16.如权利要求7或8所述的肽复合物，其中所述连接体部分通过肟、酰肼、琥珀酰亚胺、硫醚、三唑、仲胺、酰胺或二硫化物连接至所述第一肽和/或所述第二肽。
17.如权利要求1-3任一项所述的肽复合物，其中所述肽复合物轭合至聚乙二醇(PEG)部分、人血清白蛋白(HSA)、HSA结合结构域、抗体或其片段、羟乙基淀粉、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸多聚体、或C12-C18脂肪酸。
18.如权利要求4所述的肽复合物，其中所述肽复合物轭合至聚乙二醇(PEG)部分、人血清白蛋白(HSA)、HSA结合结构域、抗体或其片段、羟乙基淀粉、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸多聚体、或C12-C18脂肪酸。
19.如权利要求5所述的肽复合物，其中所述肽复合物轭合至聚乙二醇(PEG)部分、人血清白蛋白(HSA)、HSA结合结构域、抗体或其片段、羟乙基淀粉、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸多聚体、或C12-C18脂肪酸。
20.如权利要求6所述的肽复合物，其中所述肽复合物轭合至聚乙二醇(PEG)部分、人血清白蛋白(HSA)、HSA结合结构域、抗体或其片段、羟乙基淀粉、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸多聚体、或C12-C18脂肪酸。
21.如权利要求7-13和15任一项所述的肽复合物，其中所述肽复合物轭合至聚乙二醇(PEG)部分、人血清白蛋白(HSA)、HSA结合结构域、抗体或其片段、羟乙基淀粉、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸多聚体、或C12-C18脂肪酸。
22.如权利要求14所述的肽复合物，其中所述肽复合物轭合至聚乙二醇(PEG)部分、人血清白蛋白(HSA)、HSA结合结构域、抗体或其片段、羟乙基淀粉、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸多聚体、或C12-C18脂肪酸。
23.如权利要求16所述的肽复合物，其中所述肽复合物轭合至聚乙二醇(PEG)部分、人血清白蛋白(HSA)、HSA结合结构域、抗体或其片段、羟乙基淀粉、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸多聚体、或C12-C18脂肪酸。
24.如权利要求1-23任一项所述的肽复合物在制备药剂中的用途。
25.如权利要求1-23任一项所述的肽复合物在制备用于治疗凝血障碍的药剂中的用途。
26.一种药物组合物，包含权利要求1-23任一项所述的肽复合物和药学上可接受的载体。
27.如权利要求26所述的药物组合物，其中所述组合物包括另外的药用有效剂。
28.如权利要求26或27所述的药物组合物，其中所述药物组合物用于治疗凝血障碍的方法中。
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