BR112014022435B1 - Inibidores de tfpi e métodos de uso - Google Patents

Abstract

INIBIDORES DE TFPI E MÉTODOS DE USO. A invenção fornece peptídeos que ligam Inibidor de Via de Fator de Tecido (TFPI), incluindo peptídeos inibidores de TFPI e composições dos mesmos. Complexos de peptídeo também são fornecidos. Os peptídeos podem ser usados para inibir um TFPI, intensificar formação de trombina em um sujeito deficiente de fator de coagulação, aumentar a formação de coágulo sanguíneo em um sujeito, tratar um distúrbio de coagulação de sangue em um sujeito, purificar TFPI e identificar um composto de ligação a TFPI.

Description

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção geralmente refere-se a peptídeos que se ligam ao Inibidor da Via do Fator Tecidual (TFPI) e seus usos REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS E INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[002] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US 61/613.865, depositado em 21 de março de 2012, o qual é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Os seguintes pedidos também são incorporados por referência na sua totalidade: Pedido de Patente Provisório US 61/139.272, depositado em 19 de dezembro de 2008, Pedido de Patente US 12/643.818, depositado em 21 de dezembro de 2009; Pedido de Patente Internacional PCT/US2009/069060, depositado em 21 de dezembro de 2009; Pedido de Patente Provisório US 61/315.758, depositado em 19 de março 2010; Pedido de Patente US 13/026.070, depositado em 11 de fevereiro de 2011; e Pedido de Patente Internacional PCT/US2011/024604, depositado em 11 de fevereiro de 2011.

[003] Incorporado por referência em sua totalidade está uma listagem de nucleotídeo lida por computador/sequência de aminoácidos submetida concomitantemente com este e identificada como a seguir: arquivo de texto ASCII nomeado "44241E_SeqListing.txt," 1.248.600 bytes, criado em 31 de janeiro 2013.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] A hemostasia baseia-se na cascata de coagulação de complexo, em que uma série de eventos mediados por fatores de coagulação do sangue leva à conversão da protrombina em trombina. O fator de ativação X (FX) é o evento central de ambas as vias intrínseca e extrínseca da cascata da coagulação. A via extrínseca tem sido proposta como a ativadora primária da cascata de coagulação (Mackman et al., Arterioscler. Thromb. Casc. Biol., 27, 1687-1693 (2007)). O Fator Tecidual Circulante (TF) e o Fator Ativado VII (FVIIa) interagem para formar o "complexo extrínseco", que medeia a ativação de FX. A cascata de coagulação é amplificada através da via intrínseca, durante a qual a ativação sucessiva dos fatores XII, XI, IX, e VIII resulta na formação do complexo FIXa-FVIIIa "intrínseco" que também medeia a ativação de FX. O FX ativado promove a formação de trombina, a qual é necessária para o corpo para criar fibrina e eficazmente limitar a hemorragia.

[005] Graves distúrbios hemorrágicos, tais como a hemofilia, resultam da perturbação da cascata de coagulação do sangue. A Hemofilia A, o tipo mais comum de hemofilia, resulta de uma deficiência no fator VIII, enquanto que a Hemofilia B está associada a deficiências no fator IX (FIX). A Hemofilia C é causada por uma deficiência de Fator XI (FXI) (Cawthern et al., Blood, 91 (12), 4581-4592 (1998)). Atualmente não há cura para a hemofilia e outras doenças de coagulação. A terapia de reposição de fator é o tratamento mais comum para os distúrbios de coagulação do sangue. No entanto, os fatores de coagulação do sangue, tipicamente, são eliminados da corrente sanguínea logo após a administração. Para ser eficaz, o paciente deve receber frequentes infusões intravenosas de concentrados de fator recombinante ou de derivados de plasma, o que é desconfortável, exige ajustes clínicos, é caro e consome tempo. Além disso, a eficácia terapêutica da terapia de substituição de fatores pode diminuir drasticamente quando da formação de anticorpos inibidores. Aproximadamente 30% dos pacientes com hemofilia A grave desenvolvem anticorpos inibidores que neutralizam o fator VIII (FVIII) (Peerlinck e Hermans, Haemophilia, 12, 579-590 (2006)). Poucas opções terapêuticas existem para os pacientes com anticorpos anti-fator.

[006] Assim, existe uma necessidade na técnica para composições e métodos para o tratamento de distúrbios da coagulação do sangue. A presente invenção fornece tais composições e métodos. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] A invenção inclui, por exemplo, um complexo peptídico compreendendo um primeiro peptídeo e um segundo peptídeo, em que o complexo peptídico compreende 30-60 aminoácidos. Em várias modalidades, dois ou mais peptídeos, como descrito aqui (por exemplo, peptídeos incluídos por qualquer uma das fórmulas (I) a (XIV)) são ligados ou fundidos para criar um complexo peptídico (por exemplo, um dímero compreendendo dois peptídeos (que podem ser o mesmo ou diferente), um trímero compreendendo três peptídeos (dois ou mais dos quais podem ser o mesmo ou diferente), etc.). Em várias modalidades, o complexo peptídico se liga a pelo menos dois diferentes epítopos TFPI e, opcionalmente, inibe pelo menos duas funções de TFPI. Em algumas modalidades, o peptídeo ou complexo peptídico da invenção se liga a TFPI-1 (por exemplo, TFPI-1 a) e, opcionalmente, melhora a geração de trombina regulada por TFPI na ausência de FVIII, FIX, e/ou FXI. Uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica) compreendendo o complexo peptídico também é fornecida.

[008] Além disso, a invenção fornece a presente invenção fornece métodos de usar o peptídeo ou complexo peptídico da presente invenção. Por exemplo, a invenção fornece um método de inibição de um TFPI compreendendo o contato do TFPI com um peptídeo, tal como aqui descrito. A invenção também fornece um método para potencializar a formação de trombina em um sujeito com deficiência de fator de coagulação, um método para aumentar a formação de coágulos de sangue em um indivíduo, e um método de tratamento de um distúrbio da coagulação do sangue em um indivíduo. Os métodos são, na sua totalidade, também aqui referidos como, por exemplo, "o método da presente invenção". Os métodos compreendem a administração ao sujeito um peptídeo ou complexo peptídico como aqui fornecido em uma quantidade eficaz para obter um efeito desejado, por exemplo, em uma quantidade eficaz para potencializar a formação de trombina, em uma quantidade eficaz para potencializar a formação de coágulos do sangue, ou uma quantidade eficaz para tratar o distúrbio de coagulação do sangue no sujeito. Outros aspectos da invenção incluem o uso do peptídeo da invenção para a fabricação de um medicamento, um método para o direcionamento de uma célula apresentando TFPI, um método para o tratamento ou diagnóstico de um paciente que sofre de uma doença ou em risco de sofrer de uma doença, um método de purificação de TFPI, e um método de identificação de um composto de ligação a TFPI A menos que expressamente indicado em contrário, a descrição aqui fornecida no que diz respeito a um peptídeo da invenção ou método da invenção aplica-se a todo e qualquer peptídeo da presente invenção e método da presente invenção, respectivamente. Ainda, salvo se explicitamente indicado de outra forma, a descrição fornecida aqui com relação a um peptídeo da invenção ou uso do mesmo se aplica aos complexos peptídicos da invenção.

[009] A invenção também inclui um inibidor de TFPI e se liga a TFPI humano em um primeiro sítio de ligação definido pelos resíduos de aminoácidos F28, K29, A30, D32, I46, F47, e I55 e um segundo sítio de ligação definido pelos resíduos de aminoácidos R41, Y53, C59, E60, Q63, R65, E67, E71, K74, M75, N80, N82, R83, I84, I85, T87, F96, C106, C130, L131, N133, M134, N136, F137, E142, N145 e I146. Um método para a identificação de um composto de ligação a TFPI também é fornecido. O método compreende (a) contatar um peptídeo compreendendo domínio de TFPI Kunitz 1 (KD1) e domínio de Kunitz 2 (KD2) com um composto de teste, e (b) detectar a ligação do composto de teste para um sítio de ligação a TFPI definido por resíduos de aminoácidos KD1-KD2 correspondentes aos resíduos humanos TFPI R41, Y53, C59, E60, Q63, R65, E67, E71, K74, M75, N80, N82, R83, I84, I85, T87, F96, C106, C130, L131, N133, M134, N136, F137, E142, N145 e I146.

[0010] Os seguintes parágrafos numerados cada sucintamente definir uma ou mais variações de exemplares da invenção:

[0011] 1. Um complexo peptídico compreendendo um primeiro peptídeo e um segundo peptídeo, em que o complexo peptídico compreende 30-60 aminoácidos e se liga a pelo menos dois diferentes epítopos TFPI e inibe duas ou mais funções de TFPI.

[0012] 2. Um complexo peptídico compreendendo um primeiro peptídeo e um segundo peptídeo, em que (a) o primeiro peptídeo compreende a estrutura de fórmula (XIII): X6001-X6002-X6003 -X6004 -X6005- X6006- X6007 -X6008 -X6009 -X6010 -X6011 -X6012 -X6013 -X6014-X6015-X6016-X6017-X6018-X6019-X6020 (XIII) (SEQ ID NO: 3153);

[0013] em que X6001 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, L, M, Y, 1Ni, Thi, Bta, Dopa, Bhf, C, D, G, H, I, K, N, Nmf, Q, R, T, V, e W; em que X6002 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Q, G, e K; em que X6003 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, D, E, M, Q, R, S, T, Ede(O), Cmc, A, Aib, Bhs, F, G, H, I, K, L, N, P, V, W e Y; em que X6004 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Aib, E, G, I, K, L, M, P, R, W, Y, A, Bhk, C, D, F, H, k, N, Nmk, Q, S, T e V; em que X6005 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em a, A, Aib, C, D, d, E, G, H, K, k, M, N, Nmg, p, Q, R, NpropilG, aze, pip, tic, oic, hyp, nma, Ncg, Abg, Apg, thz, dtc, Bal, F, L, S, T, V, W e Y; em que X6006 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, C(NEM), D, E, G, H, K, M, N, Q, R, S, V, Cit, C(Acm), Nle, I, Ede(O), Cmc, Ecl, Eea, Eec, Eef, Nif, Eew, Aib, Btq, F, L, T, W e Y; em que X6007 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em I, V, T, Chg, Phg, Tle, A, F, G, K, L, Nmv, P, Q, S, W e Y; em que X6008 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, H, 1Ni, 2Ni, Pmy, Y, e W; em que X6009 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Aib, V, Chg, Phg, Abu, Cpg, Tle, ácido L-2-amino-4,4,4-trifluorobutírico, A, f, I, K, S, e T; em que X6010 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, D, d, E, F, H, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, Nmd, C(NEM), Aib, G, I, L e Nmf; em que X6011 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, a, G, p, Sar, c, hcy, Aib, C, K, G e Nmg; em que X6012 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Y, Tym, Pty, Dopa e Pmy; em que X6013 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Aib, C, F, 1Ni, Thi, Bta, A, E, G, H, K, L, M, Q, R, W e Y; em que X6014 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, C, C(NEM), D, E, K, L, M, N, Q, R, T, V, Hcy, Bhe, F, G, H, I, P, S, W e Y; em que X6015 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em R, (ômega-metil)-R, D, E e K; em que X6016 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em L, Hcy, Hle e Aml; em que X6017 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, a, Aib, C, c, Cha, Dab, Eag, Eew, H, Har, Hci, Hle, I, K, L, M, Nle, Nva, Opa, Orn, R, S, Deg, Ebc, Eca, Egz, Aic, Apc, Egt, (ômega-metil)-R, Bhr, Cit, D, Dap, E, F, G, N, Q, T, V, W e Y; em que X6018 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, Hcy, hcy, C, c, L, Nle, M, N, R, Bal, D, E, F, G, H, I, K, Q, S, T, V, W e Y; em que X6019 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em K, R, Har, Bhk e V; e em que X6020 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em K, L, Hcy, Aml, Aib, Bhl, C, F, G, H, I, Nml, Q, R, S, T, V, W e Y, e

[0014] (b) o segundo peptídeo compreende a estrutura de fórmula (XIV):

[0015] X7001-X7002-X7003-X7004-X7005-X7006-[X7007-X7008- X7009-X7010-X7011-X7012-X7013-X7014-X7015-X7016-X7017- X7018]-X7019-X7020-X7021-X7022-X7023 (XIV) (SEQ ID NO: 3154),

[0016] em que X7001 está presente ou ausente, pelo qual no caso X7001 está presente este é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, C(NEM), D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V e W; em que X7002 está presente ou ausente, pelo qual no caso X7002 está presente este é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, C(NEM), D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W e Y; em que X7003 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, F, I, K, L, R, S, T, V, W e Y; em que X7004 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V e W; em que X7005 é R ou W; em que X7006 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, H, I, K, L, R, V e W; em que X7007 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Orn, homoK, C, Hcy, Dap e K, preferencialmente selecionado do grupo que consiste em C e Hcy; em que X7008 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, G, R, S e T; em que X7009 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em a, A, I, K, L, M, m, Moo, Nle, p, R, Sem e V; em que X7010 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, G, I, K, L, P, R, S, T e V; em que X7011 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D, E, G, S e T; em que X7012 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, a, D, d, E, e, F, f, G, I, K, k, L, l, M, m, Moo, Nle, nle, P, p, R, r, S, s, Sem, T, t, V, v, W e w; em que X7013 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, C(NEM), Con, Con(Meox), D, d, E, e, Eag, F, G, I, K, L, N, R, S, s, T, V e W; em que X7014 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, M, R, S, T, V e W; em que X7015 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, M, Nle, R, S, T, V e W; em que X7016 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, I, K, L, M, Moo, Nle, R, S, Sem, T, V, W e Y; em que X7017 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V, W e Y; em que X7018 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C e D, preferencialmente C; em que X7019 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, F, I, L, S, T, V e W; em que X7020 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F e W; em que X7021 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em I, L e V; em que X7022 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, P, R, S, T, V e W; em que X7023 está presente ou ausente, pelo qual no caso X7023 está presente este é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, C(NEM), Con, Con(Meox), D, E, Eag, F, G, I, K, L, R, S, T, V, W e Y; e em que o peptídeo compreende como uma estrutura cíclica gerada por uma ligação entre X7007 e X7018.

[0017] 3. O complexo de peptídeo do parágrafo 2,

[0018] em que X6001 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em 1Ni, Bta, Dopa, F, L, Y e M; em que X6002 é Q; em que X6003 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D, E, S, M, Q, R, T e C; em que X6004 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em K, Aib, L, P, R, E, G, I, Y, M e W; em que X6005 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em p, Nmg, NpropilG, aze, pip, tic, oic, hyp, a, Aib, D, d, G, H, K, k, N, Q, R, A, E, C e M; em que X6006 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, E, K, R, S, V, C(Acm), Nle, C(NEM), I, Cit, A, D, G, H, N, Q e M; em que X6007 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Tle, V e I; em que X6008 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em H, 1Ni, 2Ni, Pmy, F e Y; em que X6009 é V, Abu ou Tle; em que X6010 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D, P, C, T, A, E, K, M, N, Q, R, F, H, S, V, W e Y; em que X6011 é G, a, c, hcy ou Sar; em que X6012 é Y; em que X6013 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, 1Ni, Bta e C; em que X6014 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Aib, C, E, Hcy, A, D, K, L, M, N, Q, R, T, V e Aib; em que X6015 é R; em que X6016 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em L, Aml, Hle e Hcy; em que X6017 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, C, c, Aic, Eca, Deg, Cha, Dab, Dap, Eag, Eew, H, Har, Hci, Hle, K, Nle, Nva, Opa, Orn, R, I, L, S e M; em que X6018 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, C, c, L, Hcy, N, M e R; em que X6019 é K; e em que X6020 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em L, Aml, Hcy e K.

[0019] 4. O complexo peptídico do parágrafo 2 ou parágrafo 3, em que o primeiro peptídeo e/ou segundo peptídeo ainda compreende aminoácidos N-terminal e/ou porções ligadas a X6001 e/ou X7001 e selecionados do grupo que consiste em FAM-Ttds, PE, Palm, 2-fenil acetila, 3-fenil propionila, 2-(naft-2-il) acetila, hexanoila, 2-metil propionila, 3-metil butanoila, 2-naftilsulfonila, 1-naftilsulfonila, acetila, Con, Con(Meox), AOA, Oxme-AOA, Meox-Lev, ácido levulínico (Lev), e ácido pentinoico (Pyn).

[0020] 5. O complexo peptídico de qualquer um dos parágrafos 2 4, em que o primeiro peptídeo e/ou segundo peptídeo ainda compreende X6021 ligado a X6020 ou X7024 ligado a X7023, respectivamente, em que X6021 e/ou X7024 compreende aminoácidos C-terminal e/ou porções selecionados do grupo que consiste em Hly, K, Orn, Dab, Eag, Dap, Hcy, Pen, C, c, C(NEM), Con, Con(Meox), K (Ttds-maleimidopropionil (EtSH)), K(Tdts-maleimid), K(AOA), K(Myr), K(Ttds-Myr), K(Ttds-Palm), K(Ttds-Ac), K(Ttds-YGlu-Myr), K(AlbuTag), K(4PBSA), Cea, e amida.

[0021] 6. O complexo peptídico de qualquer um dos parágrafos 2-5, em que X7001 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, F, G, H, K, L e S; em que X7002 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em H, F, M e R; em que X7003 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F e Y; em que X7004 é K; em que X7005 é W; em que X7006 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F e H; em que X7007 é C; em que X7008 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, G e S; em que X7009 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em M, SeM e V; em que X7010 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em K, P e R; em que X7011 é D; em que X7012 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, L, l, M e Sem; em que X7013 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D, G, K e S; em que X7014 é G; em que X7015 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em I e T; em que X7016 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D, F, M, SeM e Y; em que X7017 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em S e T; em que X7018 é C; em que X7019 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A e V; em que X7020 é W; em que X7021 é V; em que X7022 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, L, K, R, P e W; em que X7023 está presente ou ausente, pelo qual no caso X7023 está presente este é uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em A, D, F, M, S e Y; e em que o peptídeo compreende como uma estrutura cíclica gerada por uma ligação entre X7007 e X7018.

[0022] 7. O complexo peptídico de qualquer um dos parágrafos 1-6 em que o primeiro peptídeo e o segundo peptídeo está ligado por uma porção ligante, preferencialmente cerca de 1-100 Â em comprimento.

[0023] 8. O complexo peptídico do parágrafo 7, em que a porção ligante é cerca de 5-50 Â em comprimento.

[0024] 9. O complexo peptídico do parágrafo 8, em que a porção ligante é cerca de 10-30 Â em comprimento.

[0025] 10. O complexo peptídico de qualquer um dos parágrafos 7- 9, em que a porção ligante compreende a estrutura Z1-20, em que Z é um aminoácido, ácido hidróxi, etileno glicol, propileno glicol, ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[0026] 11. O complexo peptídico do parágrafo 10, em que Z é G, s, S, a, A, Bal, Gaba, Ahx, Ttds, ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[0027] 12. O complexo peptídico de qualquer um dos parágrafos 7 11, em que a porção ligante é ligada ao primeiro peptídeo e/ou o segundo peptídeo através de uma oxima, uma hidrazida, uma succinimida, um tioéter, um triazol, uma amina secundária, uma amida, ou um dissulfeto.

[0028] 13. O complexo peptídico de qualquer um dos parágrafos 7 12, em que a C-terminal do primeiro peptídeo é ligado a N-terminal do segundo peptídeo através da porção ligante.

[0029] 14. O complexo peptídico de qualquer um dos parágrafos 7 13, em que o primeiro peptídeo compreende a estrutura de fórmula (XIII), e porção ligante se liga ao primeiro peptídeo em N-terminal, em C-terminal, ou nas cadeias laterais de X6001, X6004, X6006, X6010, X6014 ou X6020.

[0030] 15. O complexo peptídico de qualquer um dos parágrafos 1 14, em que o primeiro peptídeo compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 178 ou SEQ ID NO: 4261.

[0031] 16. O complexo peptídico de qualquer um dos parágrafos 1 15, em que o segundo peptídeo compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 1044.

[0032] 17. O complexo peptídico do parágrafo 1 ou parágrafo 2 compreendendo a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 4260.

[0033] 18. O complexo peptídico de qualquer um dos parágrafos 1 17, em que o complexo peptídico é conjugado a uma porção de polietileno glicol (PEG), albumina sérica humana (HSA), um domínio de ligação a HSA, um anticorpo ou fragmento do mesmo, hidroxietil amido, um multímero prolina-alanina-serina (PASilação), um ácido graxo C12C18, ou ácido polisiálico.

[0034] 19. Um inibidor de TFPI que se liga a TFPI humano em um primeiro sítio de ligação definido pelos resíduos de aminoácidos F28, K29, A30, D32, I46, F47, e I55 e em um segundo sítio de ligação definido pelos resíduos de aminoácidos R41, Y53, C59, E60, Q63, R65, E67, E71, K74, M75, N80, N82, R83, I84, I85, T87, F96, C106, C130, L131, N133, M134, N136, F137, E142, N145 e I146.

[0035] 20. O inibidor de TFPI do parágrafo 19, onde o primeiro sítio de ligação é definido pelos resíduos de aminoácidos A27, F28, K29, A30, D31, D32, K36, I38, I46, F47 e I55.

[0036] 21. O inibidor de TFPI do parágrafo 20, onde o primeiro sítio de ligação é definido pelos resíduos de aminoácidos A27, F28, K29, A30, D31, D32, K36, A37, I38, F44, I46, F47 e I55.

[0037] 22. O inibidor de TFPI de qualquer um dos parágrafos 19-21 que é um peptídeo.

[0038] 23. O inibidor de TFPI de qualquer um dos parágrafos 19-21, compreendendo um primeiro peptídeo e um segundo peptídeo ligado por uma porção ligante.

[0039] 24. O inibidor de TFPI do parágrafo23, em que a porção ligante é cerca de 1-100 Â em comprimento, cerca de 5-50 Â, ou cerca de 10-30 Â em comprimento.

[0040] 25. O inibidor de TFPI do parágrafo 23 ou parágrafo 24, em que a porção ligante compreende a estrutura Z1-20, em que Z é um aminoácido, hidróxi ácido, etileno glicol, propileno glicol, ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[0041] 26. O inibidor de TFPI do parágrafo 25, em que Z é G, s, S, a, A, Bal, Gaba, Ahx, Ttds, ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[0042] 27. Uma composição farmacêutica de qualquer um dos parágrafos 1-18 ou um inibidor de TFPI de qualquer um dos parágrafos 19-26 para uso em um método para o tratamento de um sujeito.

[0043] 28. O complexo peptídico ou inibidor de TFPI do parágrafo 27, em que o método é para o tratamento de um distúrbio de coagulação sanguínea.

[0044] 29. Use do complexo peptídico de qualquer um dos parágrafos 1-18 ou o inibidor de TFPI de qualquer um dos parágrafos 19-26 para a fabricação de um medicamento.

[0045] 30. Uso do complexo peptídico de qualquer um dos parágrafos 1-18 ou o inibidor de TFPI de qualquer um dos parágrafos 19-26 para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio de coagulação sanguínea.

[0046] 31. Uma composição farmacêutica compreendendo o complexo peptídico de qualquer um dos parágrafos 1-18 ou o inibidor de TFPI de qualquer um dos parágrafos 19-26 e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0047] 32. A composição farmacêutica do parágrafo 31, em que a composição compreende outro agente farmaceuticamente eficaz.

[0048] 33. A composição farmacêutica do parágrafo 31, em que a composição farmacêutica é para uso em um método para tratar um distúrbio de coagulação sanguínea.

[0049] 34. Um método para tratar um sujeito que sofre de uma doença ou está em risco de sofrer de uma doença, o método compreendendo administrar ao sujeito uma composição farmacêutica do parágrafo 31.

[0050] 35. O método do parágrafo 34, em que a doença é um distúrbio de coagulação sanguínea.

[0051] 36. Um método para identificar um composto de ligação a TFPI, o método compreendendo (a) contatar um peptídeo compreendendo TFPI domínio de Kunitz 1 (KD1) e domínio de Kunitz 2 (KD2) como um composto teste, e (b) detectar ligação do composto teste a um sítio de ligação TFPI definido por resíduos de aminoácidos KD1-KD2 correspondentes aos resíduos de TFPI humano R41, Y53, C59, E60, Q63, R65, E67, E71, K74, M75, N80, N82, R83, I84, I85, T87, F96, C106, C130, L131, N133, M134, N136, F137, E142, N145, e I146.

[0052] 37. O método do parágrafo 36, em que a etapa (b) ainda compreende detectar ligação do composto teste a um sítio de ligação TFPI definido por resíduos de aminoácidos de KD1 correspondente aos resíduos de TFPI humano F28, K29, A30, D32, I46, F47 e I55.

[0053] 38. O método do parágrafo 37, em que o sítio de ligação a TFPI é definido pelos resíduos de aminoácidos de KD1 correspondente aos resíduos de TFPI humano F28, K29, A30, D32, I46, F47, I55A27, D31, K36, A37, I38, F44 e I46.

[0054] 39. Um peptídeo que consiste na sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1337-1355 e 42404268.

[0055] 40. Um método para inibir a degradação de TFPI por uma serina protease, o método compreendendo contatar TFPI com um peptídeo compreendendo a estrutura de fórmula (XIV): X7001-X7002-X7003-X7004-X7005-X7006-[X7007-X7008-X7009- X7010-X7011-X7012-X7013-X7014-X7015-X7016-X7017-X7018]- X7019-X7020-X7021-X7022-X7023 (XIV) (SEQ ID NO: 3154),

[0056] em que X7001 está presente ou ausente, pelo qual no caso X7001 está presente este é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, C(NEM), D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V e W; em que X7002 está presente ou ausente, pelo qual no caso X7002 está presente este é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, C(NEM), D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W e Y; em que X7003 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, F, I, K, L, R, S, T, V, W e Y; em que X7004 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V e W; em que X7005 é R ou W; em que X7006 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, H, I, K, L, R, V e W; em que X7007 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Orn, homoK, C, Hcy, Dap e K, preferencialmente selecionado do grupo que consiste em C e Hcy; em que X7008 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, G, R, S e T; em que X7009 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em a, A, I, K, L, M, m, Moo, Nle, p, R, SeM e V; em que X7010 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, G, I, K, L, P, R, S, T e V; em que X7011 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D, E, G, S e T; em que X7012 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, a, D, d, E, e, F, f, G, I, K, k, L, l, M, m, Moo, Nle, nle, P, p, R, r, S, s, Sem, T, t, V, v, W e w; em que X7013 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, C(NEM), Con, Con(Meox), D, d, E, e, Eag, F, G, I, K, L, N, R, S, s, T, V e W; em que X7014 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, M, R, S, T, V e W; em que X7015 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, M, Nle, R, S, T, V e W; em que X7016 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, I, K, L, M, Moo, Nle, R, S, Sem, T, V, W e Y; em que X7017 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V, W e Y; em que X7018 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C e D, preferencialmente C; em que X7019 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, F, I, L, S, T, V e W; em que X7020 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F e W; em que X7021 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em I, L e V; em que X7022 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, P, R, S, T, V e W; em que X7023 está presente ou ausente, pelo qual no caso X7023 está presente este é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, C(NEM), Con, Con(Meox), D, E, Eag, F, G, I, K, L, R, S, T, V, W e Y; e em que o peptídeo compreende como uma estrutura cíclica gerada por uma ligação entre X7007 e X7018, pelo qual a degradação de TFPI pela serina protease é inibida.

[0057] 41. O método do parágrafo 40, em que X7001 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, F, G, H, K, L e S; em que X7002 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em H, F, M e R; em que X7003 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F e Y; em que X7004 é K; em que X7005 é W; em que X7006 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F e H; em que X7007 é C; em que X7008 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, G e S; em que X7009 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em M, SeM e V; em que X7010 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em K, P e R; em que X7011 é D; em que X7012 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, L, l, M e Sem; em que X7013 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D, G, K e S; em que X7014 é G; em que X7015 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em I e T; em que X7016 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D, F, M, SeM e Y; em que X7017 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em S e T; em que X7018 é C; em que X7019 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A e V; em que X7020 é W; em que X7021 é V; em que X7022 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, L, K, R, P e W; em que X7023 está presente ou ausente, pelo qual no caso X7023 está presente este é uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em A, D, F, M, S e Y; e em que o peptídeo compreende como uma estrutura cíclica gerada por uma ligação entre X7007 e X7018.

[0058] 42. O método do parágrafo 40 ou parágrafo 41, em que o peptídeo é parte de um complexo peptídico que ainda compreende um peptídeo compreendendo a estrutura de fórmula (XIII): X6001-X6002-X6003-X6004-X6005-X6006-X6007-X6008-X6009- X6010-X6011-X6012-X6013-X6014-X6015-X6016-X6017-X6018- X6019-X6020 (XIII) (SEQ ID NO: 3153);

[0059] em que X6001 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, L, M, Y, 1Ni, Thi, Bta, Dopa, Bhf, C, D, G, H, I, K, N, Nmf, Q, R, T, V, e W; em que X6002 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Q, G, e K; em que X6003 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, D, E, M, Q, R, S, T, Ede(O), Cmc, A, Aib, Bhs, F, G, H, I, K, L, N, P, V, W e Y; em que X6004 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Aib, E, G, I, K, L, M, P, R, W, Y, A, Bhk, C, D, F, H, k, N, Nmk, Q, S, T e V; em que X6005 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em a, A, Aib, C, D, d, E, G, H, K, k, M, N, Nmg, p, Q, R, NpropilG, aze, pip, tic, oic, hyp, nma, Ncg, Abg, Apg, thz, dtc, Bal, F, L, S, T, V, W e Y; em que X6006 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, C(NEM), D, E, G, H, K, M, N, Q, R, S, V, Cit, C(Acm), Nle, I, Ede(O), Cmc, Ecl, Eea, Eec, Eef, Nif, Eew, Aib, Btq, F, I, L, T, W e Y; em que X6007 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em I, V, T, Chg, Phg, Tle, A, F, G, I, K, L, Nmv, P, Q, S, W e Y; em que X6008 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, H, 1Ni, 2Ni, Pmy, Y, e W; em que X6009 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Aib, V, Chg, Phg, Abu, Cpg, Tle, ácido L-2-amino-4,4,4-trifluorobutírico, A, f, I, K, S, T e V; em que X6010 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, D, d, E, F, H, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, Nmd, C(NEM), Aib, G, I, L e Nmf; em que X6011 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, a, G, p, Sar, c, hcy, Aib, C, K, G e Nmg; em que X6012 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Y, Tym, Pty, Dopa e Pmy; em que X6013 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Aib, C, F, 1Ni, Thi, Bta, A, E, G, H, K, L, M, Q, R, W e Y; em que X6014 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, C, C(NEM), D, E, K, L, M, N, Q, R, T, V, Hcy, Bhe, F, G, H, I, P, S, W e Y; em que X6015 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em R, (ômega-metil)-R, D, E e K; em que X6016 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em L, Hcy, Hle e Aml; em que X6017 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, a, Aib, C, c, Cha, Dab, Eag, Eew, H, Har, Hci, Hle, I, K, L, M, Nle, Nva, Opa, Orn, R, S, Deg, Ebc, Eca, Egz, Aic, Apc, Egt, (ômega-metil)-R, Bhr, Cit, D, Dap, E, F, G, N, Q, T, V, W e Y; em que X6018 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, Hcy, hcy, C, c, L, Nle, M, N, R, Bal, D, E, F, G, H, I, K, Q, S, T, V, W e Y; em que X6019 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em K, R, Har, Bhk e V; e em que X6020 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em K, L, Hcy, Aml, Aib, Bhl, C, F, G, H, I, Nml, Q, R, S, T, V, W e Y.

[0060] 43. O método de qualquer um dos parágrafos 40-43, em que a protease é elastase, trombina, plasmina, FXa ou quimase.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0061] A Figura 1 é uma ilustração da cascata de coagulação do sangue.

[0062] A Figura 2 é uma ilustração da estrutura secundária do Inibidor da via de Fator Tecidual-1.

[0063] A Figura 3 é uma ilustração da formação de um complexo quaternário compreendendo o Fator Tecidual, Fator Xa (FXa), Fator VIIa (FVIIa), e TFPI.

[0064] A Figura 4 é uma listagem das sequências de aminoácidos de vários peptídeos de ligação a TFPI (por exemplo, peptídeos inibidores de TFPI) que denotam substituições de aminoácidos (em negrito e sublinhado) em referência ao peptídeo JBT0293.

[0065] A Figura 5 é uma ilustração de seleção de exibição de mRNA de peptídeos de ligação a TFPI (por exemplo, peptídeos inibidores de TFPI).

[0066] A Figura 6A é uma ilustração de EC50 de ligação a ELISA e a Figura 6B é uma ilustração de ELISA IC50 descrita no Exemplo 1.

[0067] A Figura 7 é uma curva de ELISA de ligação comparando % OD (eixo-y) e concentração [nM] (eixo-x) para o peptídeo biotinilado JBT0132.

[0068] As Figuras 8A-8D são curvas de ELISA de competição comparando a % OD (eixo-y) e concentração [nM] (eixo-x) com os peptídeos exemplificativos da invenção.

[0069] As Figuras 9A e 9B são sensorgramas que plotam RU (eixo- y) contra o tempo em segundos (eixo-x) para peptídeos JBT0120 e JBT0132.

[0070] As Figuras 10A e 10B são sensorgramas que plotam RU (eixo-y) contra o tempo em segundos (eixo-x) para interação de peptídeo JBT0120 com o Inibidor da via de Fator Tecidual-1 e Inibidor da via de Fator Tecidual-2.

[0071] As Figuras 11A e 11B são gráficos que comparam a quantidade de trombina gerada (nM) (eixo-y) e o tempo em minutos (eixo-x) para o peptídeo JBT0120 e o peptídeo JBT0132 em um ensaio baseado em plasma.

[0072] As Figuras 12-18 são tabelas que listam as sequências de aminoácidos de vários peptídeos de ligação a TFPI; EC50 e a porcentagem de inibição de TFPI observada no ensaio de inibição de FXa, EC50 e a porcentagem de inibição de TFPI observada no ensaio de inibição de tenase extrínseca; e FEIBA, Imunato de Fator VIII (FVIII), ou atividades equivalentes do Fator IX (FIX) (mU/mL) em ensaios baseados em plasma. "*" indica controles negativos.

[0073] As Figuras 19-21 são tabelas que listam os resultados da análise BIAcore de vários peptídeos de ligação a TFPI. "*" indica a controles negativos.

[0074] As Figuras 22-30 são tabelas que listam as sequências de aminoácidos de vários peptídeos de ligação a TFPI; EC50 e a porcentagem de inibição de TFPI observada no ensaio de inibição de FXa, EC50 e a porcentagem de inibição de TFPI observada no ensaio de inibição de tenase extrínseca e FEIBA, Imunato FVIII ou atividades equivalentes FIX (mU/mL) em ensaios baseados em plasma. "*" indica a controles negativos.

[0075] A Figura 31 é um gráfico que compara uma característica farmacocinética (concentração de peptídeo (eixo-y) versus tempo após administração (eixo-x)) de um peptídeo de ligação a TFPI PEGuilado para a característica farmacocinética do mesmo peptídeo sem PEG. Os peptídeos foram administrados por via intravenosa a camundongos C57BL6, com uma dose de 10 mg/kg. Três amostras biológicas foram analisadas para a presença de peptídeo a cada ponto de tempo.

[0076] As Figuras 32-39 são tabelas que listam as sequências de aminoácidos e valores de IC50 ou de EC50 de vários peptídeos da presente invenção. "*" indica a controles negativos.

[0077] A Figura 40 é um gráfico que ilustra uma característica da farmacocinética (concentração de peptídeo (nM) (eixo-y) versus tempo após administração (minutos) (eixo-x)) de um peptídeo de ligação a TFPI PEGuilado após administração subcutânea a camundongos, a uma dose de 10 mg/kg.

[0078] A Figura 41 é um gráfico que correlaciona a quantidade de trombina gerada (nM) (eixo-y) com o tempo (em minutos) (eixo-x) para peptídeo JBT1855 em um ensaio baseado em plasma de plasma de paciente com hemofilia A.

[0079] A Figura 42 é um gráfico que ilustra a quantidade de perda de sangue (μl; eixo-y) observada após um grampeamento na unha em camundongos tratados com JBT-1855 (administração intravenosa ou subcutânea), anticorpo anti-TFPI (administração intravenosa) ou veículo (administração intravenosa) (eixo-x).

[0080] A Figura 43 é um gráfico que representa o resíduo de aminoácido TFPI160 (eixo-x) contra as diferenças de deslocamentos químicos dos sinais HSQC para TFPI160 e TFPI160 livres ligados a JBT0303 (eixo-y).

[0081] A Figura 44 é um modelo de fita da estrutura secundária de regiões ilustrando TFPI de alterações de deslocamentos químicos dos sinais de HSQC quando TFPI160 está complexado com JBT0303 em comparação com TFPI160 não complexado (livre).

[0082] A Figura 45 é um gráfico que representa o resíduo de aminoácido TFPI160 (eixo-x) contra as diferenças de deslocamentos químicos dos sinais de HSQC para TFPI160 e TFPI160 livres ligados a JBT0122 (eixo-y).

[0083] A Figura 46 é um modelo de fita da estrutura secundária da proteína TFPI ilustrando as regiões de alterações de deslocamentos químicos dos sinais de HSQC quando TFPI160 está complexado com JBT0122 em comparação com TFPI160 não complexado (livre).

[0084] A Figura 47 é uma tabela que lista atribuições para o carbono do carbonil (C), o carbono alfa (CA), o carbono beta (CB), o próton de amida (H), e o nitrogênio da amida (N) de JBT0788 com base em espectros de HSQC, HNCACB, HNCA, HNCO e HNN.

[0085] A Figura 48 é um modelo de fita da estrutura secundária de JBT0788 livre.

[0086] A Figura 49 é uma tabela que lista atribuições para o carbono do carbonil (C), o carbono alfa (CA), o carbono beta (CB), o próton de amida (H), e o nitrogênio da amida (N) de JBT0788 complexado com TFPI160 com base em espectros de HSQC, HNCACB, HNCA, HCCOCA e HNCO.

[0087] A Figura 50 é um modelo de fita da estrutura secundária de JBT0788 quando complexado com TFPI160.

[0088] A Figura 51 é uma tabela que lista atribuições para o carbono do carbonil (C), o carbono alfa (CA), o carbono beta (CB), o próton de amida (H), e o nitrogênio da amida (N) de JBT0616 com base em espectros de HSQC, HNCACB e HNN.

[0089] A Figura 52 é um modelo de fita da estrutura secundária de JBT0616 livre.

[0090] A Figura 53 é uma tabela que lista atribuições para o carbono do carbonil (C), o carbono alfa (CA), o carbono beta (CB), o próton de amida (H), e o nitrogênio da amida (N) de JBT0616 complexado com TFPI com base em espectros de HSQC, HNCO, HNCA e HNCOCA.

[0091] A Figura 54 é um modelo de fita da estrutura secundária de JBT0616 quando complexado com TFPI160.

[0092] A Figura 55 é uma estrutura de fita do melhor modelo energeticamente minimizado de KD1 (resíduos 22-79) em complexo com JBT0303 com resíduos propostos para dirigir a interação de proteína-proteína exibida como barras. Os resíduos sublinhados e em itálico pertencem a JBT0303; os resíduos restantes pertencem a KD1 de TFPI.

[0093] A Figura 56 é um tromboelastograma rotacional correlacionando a elasticidade da amostra (mm) com o tempo em segundos(s) para JBT2317.

[0094] A Figura 57 é um tromboelastograma rotacional correlacionando a elasticidade da amostra (mm) com o tempo em segundos(s) para JBT2329.

[0095] A Figura 58 é uma ilustração de um dispositivo de computação.

[0096] A Figura 59 é uma ilustração de um modelo tridimensional (3D) de uma proteína KD1.

[0097] A Figura 60 é uma ilustração de um modelo 3D de um peptídeo de ligação a TFPI.

[0098] A Figura 61 é uma ilustração de um método de modelagem de proteína e interação de peptídeo.

[0099] A Figura 62 é uma tabela que lista as sequências de aminoácidos e valores de IC50 ou de EC50 de vários peptídeos da presente invenção. Designação "n.a." é "não analisado". Dados da curva de progressão foram obtidos utilizando o ensaio de inibição de FXa descrito no Exemplo 3 com o TFPI humano recombinante de comprimento completo. A concentração de ensaio de ensaio de curva de progressão foi de 0,0025% (0,1% Tween80 usado em tampão de diluição de peptídeo).

[00100] A Figura 63 é um gráfico que correlaciona a concentração de peptídeos JBT2325-JBT2329 (nM) (eixo-y) com o tempo após a administração intravenosa (horas) (eixo-x). Os peptídeos compreendendo porções de PEG de peso mais elevado exibiram uma meia vida in vivo prolongada em camundongos. Cada ponto de tempo é representado pela média de três amostras independentes quantificadas por ELISA.

[00101] A Figura 64A-64C são gráficos que correlacionam a concentração de peptídeos JBT2401, JBT2404 e JBT2410 (nM) (eixo- y) com o tempo após a administração intravenosa (horas) (eixo-x). Cada ponto de tempo é representado pela média de três amostras independentes quantificadas por ELISA. Os círculos sólidos simbolizam dados intravenosos, triângulos simbolizam dados subcutâneos.

[00102] A Figura 65 é uma tabela que lista as sequências de aminoácidos de vários peptídeos da presente invenção.

[00103] As Figuras 66A e 66B descrevem curvas de IC50 de peptídeos de ligação a TFPI JBT1837 (SEQ ID NO: 1044) e JBT1857 (SEQ ID NO: 178) e complexo peptídico JBT2547 (SEQ ID NO: 4260) usando dois traçadores: JBT2271 (SEQ ID NO: 4033), um derivado biotinilado de JBT1857 (Figura 66A), e JBT2316 (SEQ ID NO: 1313), um derivado biotinilado de JBT1837 (Figura 66B).

[00104] A Figura 67 é um gráfico de barras que ilustra os resultados de um ensaio de Koff com JBT2547 (SEQ ID NO: 4260) e JBT1857 (SEQ ID NO: 178) (eixo X) apresentado como % inibição de ligação a TFPI pelo peptídeo traçador, JBT2271 (SEQ ID NO: 4033) (eixo Y).

[00105] As Figuras 68A-F ilustram os resultados de ensaios de inibição de FXa usando um complexo peptídico de ligação a TFPI. As Figuras 68A-68D são gráficos que correlacionam a concentração de JBT1837 (triângulos; SEQ ID NO: 1044), JBT1857 (círculos; SEQ ID NO: 178), JBT2547 (losangos; SEQ ID NO: 4260), e JBT1837+JBT1857 (quadrados) (μM) (eixo X) com inibição percentual de TFPI em um ensaio de inibição de FXa realizado com 0,5 nM TFPI humano completo (Figura 68A), 0,5 nM TFPI humano 1-160 (Figura 68B), 0,5 nM TFPI murino 1-160 (Figura 68C), ou 0,5 nM TFPI de macaco cinomolgo1-160 (Figura 68D). Figura 68E ilustra a inibição de TFPI por JBT2547 em concentrações crescentes de TFPI (0,1 a 10 nM da esquerda para a direita) em um ensaio de inibição de FXa. Os pontos dos dados foram ajustados por uma equação de dose-resposta sigmoidal resultando em EC50s (nM) e inibição máxima (%). Figura 68F é um gráfico que correlaciona a inibição de TFPI (%) por JBT2547 (losangos), JBT2548 (círculos), JBT1837 (triângulos) e uma combinação de JBT1837 e JBT1857 (quadrados) (1 μM peptídeo) na presença de concentrações crescentes de TFPI humano completo.

[00106] A Figura 69 ilustra os resultados de ensaios de inibição de tenase extrínseca usando um complexo peptídico de ligação a TFPI. A Figura 69A é um gráfico que correlaciona a concentração de JBT1837 (triângulos; SEQ ID NO: 1044), JBT1857 (círculos; SEQ ID NO: 178), JBT2547 (losangos; SEQ ID NO: 4260), e JBT1837+JBT1857 (quadrados) (μM) (eixo X) com inibição percentual de TFPI em um ensaio de inibição de tenase extrínseca realizado com 0,063 nM TFPI humano completo. A Figura 69B ilustra inibição de TFPI por JBT2547 em concentrações crescentes de TFPI (0,031 a 10 nM da esquerda para a direita) em um ensaio de inibição de tenase extrínseca. Os pontos dos dados foram ajustados por uma equação de dose-resposta sigmoidal resultando em EC50s (nM) e inibição máxima (%). A Figura 69C é um gráfico que correlaciona a inibição máxima percentual de TFPI (eixo Y) mediada por JBT1837 (triângulos; SEQ ID NO: 1044), JBT2548 (círculos; SEQ ID NO: 4261), JBT2547 (losangos; SEQ ID NO: 4260), e JBT1837+JBT1857 (quadrados) (1 μM) com concentração de TFPI humano completo usado no ensaio de inibição de tenase extrínseca. A Figura 69D é um gráfico que correlaciona EC50 de JBT1837 (triângulos; SEQ ID NO: 1044), JBT2548 (círculos; SEQ ID NO: 4261), JBT2547 (losangos); SEQ ID NO: 4260, e JBT1837+JBT1857 (quadrados) (1 μM) com concentração (nM) de TFPI humano completo usado no ensaio de inibição de tenase extrínseca. EC50s foram calculados ajustando a resposta das concentrações de peptídeo em concentrações crescentes de TFPI vs. concentração de TFPI completo.

[00107] As Figuras 70A-70C ilustram os resultados de um ensaio de geração de trombina realizado em plasma inibido por FVIII. As figuras correlacionam geração de pico de Fator IIa (trombina) (nM) (eixo Y) com a concentração (nM) de JBT1837 (triângulo), JBT1857 (círculo), uma combinação de JBT1837+JBT1857 (quadrado), e JBT2547 (losango) (eixo X) na presença de 1,25 nM flTFPI (Figura 70A), 3,75 nM flTFPI (Figura 70B), e 10 nM flTFPI (Figura 70C). Linha pontilhada - plasma normal agrupado (PNP); linha sólida - plasma inibido por FVIII (PNP + aFVIII).

[00108] As Figuras 71A-71B são gráficos que correlacionam inibição percentual de TFPI (eixo Y) atingidas em várias concentrações (eixo X) de JBT2547, JBT1837, e 1857 (Figura 71A) ou JBT2547 (losangos), JBT1837 (triângulos), JBT1837+JBT1857 (quadrados), e JBT2548 (círculos) (Figura 71B) em um ensaio de tenase extrínseca a base de células.

[00109] As Figuras 72A-72C ilustram o efeito pró-coagulante de concentrações crescentes (10, 100, 1000 nM) de JBT2547 (Figura 72A), JBT1837 (Figura 72B), ou JBT1857 (Figura 72C) em sangue total inibido por FVIII na ausência de TFPI completo humano externo adicional (círculos abertos) e presença de quantidades crescentes de TFPI completo externo (2 nM, triângulos fechados; 10 nM, quadrados fechados). Tempos de coagulação de sangue total inibido por FVIII e sangue total normal são apresentados como referência. + = sem tempo de coagulação obtido.

[00110] A Figura 73 é um gráfico que lista exemplos não limitantes de grupos reativos nucleofílicos ou eletrofílicos para ligação ao peptídeo.

[00111] A Figura 74 é um alinhamento de sequência de TFPI KD1- KD2 de diferentes espécies. Os resíduos com uma superfície de contato de 10-25 Â2 = 41, 56, 59, 60, 67, 71, 74, 96, 106, 130, 132, 133, 136, 137, 142; resíduos com uma superfície de contato de 26-60 Â2 =75, 80, 82, 84, 85, 87, 145; resíduos com uma superfície de contato de 61-100 Â2 = 63, 65, 131, 146; resíduos com uma superfície de contato maiores do que 100 Â2 = 83, 134.

[00112] A Figura 75 é uma estrutura em fita do modelo de KD1-KD2 em complexo com JBT1857 e JBT1837.

[00113] A Figura 76A-76D é uma tabela que lista as sequências de vários peptídeos da invenção.

[00114] A Figura 77 é uma tabela que lista as sequências de aminoácido dos vários peptídeos da invenção.

[00115] A Figura 78A-78AA é uma tabela que lista as sequências de aminoácido dos vários peptídeos da invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00116] A presente invenção fornece peptídeos e complexos peptídicos. Em várias modalidades, o peptídeo ou complexo peptídico se liga a Inibidor da Via de fator Tecidual-1 e, em alguns casos, bloqueiam a atividade inibidora do Inibidor da Via de Fator Tecidual-1 (aqui referido como TFPI) no interior da cascata de coagulação do sangue. Após a lesão vascular, fator tecidual (TF) complexa com o Fator VIIa para formar o "complexo extrínseco" ou "complexo de tenase extrínseco", que ativa os Fatores IX e X (Figura 1). O TFPI é o principal regulador natural da atividade do complexo extrínseca TF/FVIIa e, por extensão, desempenha um papel no controle da geração de trombina (Panteleev et al., Eur. J. Biochem., 249, 2016-2031 (2002)). O TFPI é um inibidor de serina protease de 43 kDa que compreende três domínios de inibição do tipo Kunitz (Figura 2). Domínio Kunitz 1 de TFPI se liga a FVIIa e domínio Kunitz 2 se liga a FXa, permitindo que o inibidor forme um complexo quaternário de FXa-TFPI-FVIIa-TF que bloqueia a atividade do complexo extrínseco TF/FVIIa (Figura 3). O TFPI de ligação de FXa também infrarregula a via comum da cascata de coagulação, durante a qual FXa converte a protrombina em trombina (Audu et al., Anesth. Analg., 103(4), 841-845 (2006)). A invenção fornece, por exemplo, peptídeos inibidores de TFPI que bloqueiam a ação inibidora de TFPI sobre a cascata da coagulação de sangue, aumentando assim a formação de trombina. No contexto da divulgação, qualquer peptídeo incluído por qualquer uma das fórmulas (I) a (XIV) descritas aqui e qualquer peptídeo de ligação a TFPI descrito aqui é ainda referenciado como "o peptídeo da invenção" e como "um peptídeo como descrito aqui."

[00117] As sequências de aminoácidos de vários peptídeos de ligação a TFPI são aqui fornecidas. Os aminoácidos convencionais são identificados de acordo com seu código de uma letra ou de três letras padrão, como apresentado na Tabela 1.

[00118] Exemplos de aminoácidos não convencionais e blocos de construção de peptídeos adicionais são identificados de acordo com um código de três letras (com a exceção de Ttds e Dopa, que são abreviaturas de quatro letras comuns) encontradas na Tabela 2. Os blocos de construção adicionais designados por designações ou abreviaturas de três, quatro ou sete-números/letras também estão listados na Tabela 2. As estruturas de alguns blocos de construção estão representadas com um reagente exemplar para a introdução do bloco de construção no interior de um peptídeo (por exemplo, a estrutura fornecida para o 2-naftil sulfonil compreende um cloreto).

[00119] As sequências d e aminoácidos dos peptídeos aqui fornecidos são representadas no formato de sequência de peptídeos típico, tal como seria entendido pelo versado na técnica comum. Por exemplo, o código de três letras ou o código de uma letra de um aminoácido convencional, ou os três, quatro, ou blocos de construção adicionais de código de sete-números/letras, indica a presença do aminoácido ou de um bloco de construção na posição especificada dentro da sequência de peptídeos. O código para cada aminoácido convencional ou bloco de construção está conectado ao código para o aminoácido ou bloco de construção a seguir e/ou anterior em sequência por um hífen. Aminoácidos adjacentes estão conectados por uma ligação química (tipicamente uma ligação de amida). A formação da ligação química remove um grupo hidroxil a partir do grupo 1-carboxil do amino ácido quando a mesma está localizada à esquerda do aminoácido adjacente (por exemplo, aminoácido adjacente a Hle), e remove um hidrogênio a partir do grupo amino do aminoácido quando o mesmo está localizado no lado direito do aminoácido adjacente (por exemplo, aminoácido adjacente a Hle). Entende-se que ambas as modificações podem ser aplicadas para o mesmo aminoácido e aplicam-se aos aminoácidos adjacentes convencionais presentes nas sequências de aminoácidos sem hifens explicitamente ilustradas. Quando um aminoácido contém mais do que um grupo amino e/ou carboxil na cadeia lateral de aminoácido, o grupo amino 2- ou 3- e/ou o grupo 1-carbóxi geralmente são utilizados para a formação de ligações peptídicas. Para aminoácidos não convencionais, um código de 3 letras foi usado onde a primeira letra indica a estereoquímica do C-a-átomo. Por exemplo, uma primeira letra maiúscula indica que a forma-L do aminoácido está presente na sequência de peptídeos, enquanto que a primeira letra minúscula indica que a forma-D do aminoácido correspondente está presente na sequência peptídica. Quando o código de uma letra é utilizado, uma letra minúscula representa um D- aminoácido, enquanto que uma letra maiúscula representa um L- aminoácido. Salvo indicação em contrário, as sequências de aminoácidos são aqui apresentadas na direção N- para C-terminal.

[00120] Os terminais C de várias sequências de Peptídeos de ligação a TFPI aqui descritos são explicitamente ilustrados pela inclusão de um OH, NH2, ou uma abreviatura de uma amina de terminação específica ligada ao código de aminoácido C-terminal através de um hífen. Os N- terminais de vários peptídeos aqui descritos estão explicitamente ilustrados pela inclusão de um átomo de hidrogênio (para um N-terminal livre), ou uma abreviatura para um ácido carboxílico de terminação específica ou outro grupo químico ligado ao código de aminoácido N- terminal por meio de um hífen.

[00121] A invenção fornece um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21 (SEQ ID NO: 3109), em que (usando códigos de letras únicas para aminoácidos) X7 é selecionado do grupo que consiste em L, P, K, S, W, V, N, e Q; X8 é selecionado do grupo que consiste em L, R, N, F, e I; X9 é selecionado do grupo que consiste em Y, V, P, e C; X10 é selecionado do grupo que consiste em F, L, e G; X11 é selecionado do grupo que consiste em L, W, V, A, M, T, e S; X12 é selecionado do grupo que consiste em T, F, V, R, A, D, L, E, S, e Y; X13 é selecionado do grupo que consiste em I, M, G, Q, D, e R; X14 é selecionado do grupo que consiste em G, W, Y, L, M, e H; X15 é selecionado do grupo que consiste em N, P, F, H, K, e Y; X16 é selecionado do grupo que consiste em M, D, E, V, G, e K; X17 é selecionado do grupo que consiste em G, I, R, S, T, e L; X18 é selecionado do grupo que consiste em M, K, L, e I; X19 é selecionado do grupo que consiste em Y, G, R, e S; X20 é selecionado do grupo que consiste em A, E, S, C, e Y; e X21 é selecionado do grupo que consiste em A, V, K, e E.

[00122] Além da estrutura de núcleo estabelecida acima, X7-X21, outras estruturas que são especificamente contempladas são aquelas em que um ou mais aminoácidos adicionais são fixos à estrutura do núcleo (por exemplo, ligadas ao N-terminal ou C-terminal da sequência de aminoácidos X7-X21). Assim, a invenção inclui os peptídeos que compreendem a estrutura do núcleo e que compreendem ainda um ou mais de aminoácidos N-terminais que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: X6, X5X6, X4X5X6, X3X4X5X6(SEQ ID NO: 3110), X2X3X4X5X6(SEQ ID NO: 3111), e X1X2X3X4X5X6(SEQ ID NO: 3112);

[00123] em que X6 é diretamente ligado a X7 da estrutura de núcleo da sequência de aminoácidos, e X1 é selecionado do grupo que consiste em T e G; X2 é selecionado do grupo que consiste em F e V; X3 é selecionado do grupo que consiste em V, W, Y, e F; X4 é selecionado do grupo que consiste em D, Q, e S; X5 é selecionado do grupo que consiste em E, T, N, e S; e X6 é selecionado do grupo que consiste em R, H, K, e A. O peptídeo da invenção em um aspecto compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos QSKKNVFVFGYFERLRAK (SEQ ID NO: 1).

[00124] Em uma modalidade, o peptídeo da invenção compreendendo a estrutura de núcleo compreende um ou mais aminoácidos C-terminais compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em: X22, X22X23, X22X23X24, X22X23X24X25(SEQ ID NO: 3113), X22X23X24X25X26 (SEQ ID NO: 3114), e X22X23X24X25X26X27 (SEQ ID NO: 3115),

[00125] em que X22 é diretamente ligado a X21 da estrutura de núcleo da sequência de aminoácidos,, e X22 é selecionado do grupo que consiste em Q, I, E, W, R, L, e N; X23 é selecionado do grupo que consiste em L, V, M, e R; X24 é selecionado do grupo que consiste em K, L, A, e Y; X25 é F; X26 é G; and X27 é T.

[00126] Em um aspecto, o peptídeo da invenção compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos VIVFTFRHNKLIGYERRY (SEQ ID NO: 4). É também contemplado que o peptídeo da invenção compreende aminoácidos adicionais em ambos os N-terminal e C- terminal da estrutura do núcleo. Neste aspecto, o peptídeo compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos TFVDERLLYFLTIGNMGMYAAQLKF (SEQ ID NO: 3), GVWQTHPRYFWTMWPDIKGEVIVLFGT (SEQ ID NO: 5), KWFCGMRDMKGTMSCVWVKF (SEQ ID NO: 6), ou ASFPLAVQLHVSKRSKEMA (SEQ ID NO: 7).

[00127] A invenção inclui ainda peptídeos compreendendo a sequência de aminoácidos X3X4X5-F-X7-NVF-X11X12-GY-X15X16-RL RAK-X22 (SEQ ID NO: 2), em que X3 é Y ou F; X4 é Q ou S; X5 é N ou S; X7 é K, N, ou Q; X11 é V, A, S, ou T; X12 é F, A, D, L, Q, S, ou Y; X15 é F, K, ou Y; X16 é E ou D; e X22 é L ou N.

[00128] Além disso, a invenção fornece um peptídeo que se liga a TFPI, em que o peptídeo compreende a estrutura de fórmula (I): X1001- X1002-X1003-X1004-X1005-X1006-X1007-X1008-X1009-X1010- X1011-X1012-X1013-X1014-X1015-X1016-X1017-X1018-X1019- X1020 (SEQ ID NO: 3116). Na fórmula (I), X1001 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Bhf, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, Nmf, Q, R, T, V, W, e Y; X1002 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em G, K, e Q; X1003 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, Bhs, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, e Y; X1004 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, Bhk, C, D, E, F, G, H, I, K, k, L, M, N, Nmk, P, Q, R, S, T, V, W, e Y; X1005 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em a, A, Aib, Bal, C, D, d, E, F, G, H, K, k, L, M, N, Nmg, p, Q, R, S, T, V, W, e Y; X1006 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, Btq, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S T, V, W, e Y; X1007 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, F, G, I, K, L, Nmv, P, Q, S, V, W, e Y; X1008 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, H, K, W, e Y; X1009 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, f, I, K, S, T, e V; X1010 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Nmf, P, Q, R, S, T, V, W, e Y; X1011 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Aib, C, K, G, e Nmg; X1012 é Y; X1013 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, C, E, F, G, H, K, L, M, Q, R, W, e Y; X1014 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, Bhe, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, e Y; X1015 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em (ômega-metil)-R, D, E, K, e R; X1016 é L; X1017 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em (ômega-metil)-R, A, Aib, Bhr, C, Cha, Cit, D, Dab, Dap, E, Eag, Eew, F, G, H, Har, Hci, Hle, I, K, L, M, N, Nle, Nva, Opa, Orn, Q, R, S, T, V, W, e Y; X1018 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Bal, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, e Y; e X1019 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Bhk, K, R, e V. X1020 está presente ou ausente na fórmula (I) (ou seja, em alguns casos, o peptídeo da invenção compreende a estrutura X1001-X1002- X1003-X1004-X1005-X1006- X1007-X1008-X1010-X1011-X1012- X1013-X1014-X1015-X1016-X1017-X1018-X1019 (SEQ ID NO: 3116)). Quando X1020 está presente, o mesmo é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em Aib, Bhl, C, F, G, H, I, K, L, Nml, Q, R, S, T, V, W, e Y.

[00129] Por exemplo, o peptídeo da invenção compreende a estrutura de fórmula (I) em que X1001 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em C, F, I, K, L, Nmf, V, M, W, e Y; X1002 é Q; X1003 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, C, D, E, H, K, M, I, N, Q, R, S, T, e V; X1004 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, Aib, C, D, E, G, H, F, I, K, k, L, M, N, Nmk, P, Q, R, S, V, W, e Y; X1005 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em a, A, Aib, Bal, C, d, E, D, F, G, H, K, k, L, M, N, Nmg, p, Q, R, S, T, e Y; X1006 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, Btq, C, D, G, I, K, H, L, M, N, Q, R, S, V, e Y; X1007 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em I, K, L, Q, V, e Y; X1008 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em F, H, e Y; X1009 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em f, I, e V; X1010 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, e Y; X1011 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em G e Nmg; X1012 é Y; X1013 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em Aib, C, F, H, L, W, e Y; X1014 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, Aib, Bhe, C, D, E, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, e Y; X1015 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em E e R; X1016 é L; X1017 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em (ômega-metil)-R, A, Aib, Bhr, C, Cha, Cit, Dab, Dap, Eag, Eew, F, H, Har, Hci, Hle, I, K, L, M, N, Nle, Nva, Opa, Orn, R, S, T, V, e Y; X1018 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, C, D, E, F, I, K, L, M, N, Q, R, V, e W; X1019 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em K e R; e X1020 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em Aib, Bhl, F, K, L, R, e W (quando X1020 está presente no peptídeo).

[00130] Em um aspecto, o peptídeo da invenção compreende a estrutura de fórmula (I) em que X1001 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em F, L, Y, e M; X1002 é Q; X1003 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em M, Q, R, S, T, e C; X1004 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em Aib, K, L, P, R, E, G, I, Y, M, e W; X1005 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em a, Aib, D, d, G, H, K, k, N, Nmg, p, Q, R, A, E, C, e M; X1006 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, C, D, G, H, K, N, Q, R, S, e M; X1007 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em I e V; X1008 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em F, H, e Y; X1009 é V; X1010 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, D, E, K, M, N, Q, R, F, H, P, S, V, W, e Y; X1011 é G; X1012 é Y; X1013 é C ou F; X1014 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, C, D, E, K, L, M, N, Q, R, T, V, e Aib; X1015 é R; X1016 é L; X1017 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, Aib, C, Cha, Dab, Dap, Eag, Eew, H, Har, Hci, Hle, K, Nle, Nva, Opa, Orn, R, I, L, S, e M; X1018 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, L, N, M, e R; X1019 é K; e X1020 é K ou L.

[00131] Quando o aminoácido X1020 está ausente da fórmula (I), o peptídeo da invenção em um aspecto compreende ainda aminoácido X1000 no N-terminal da fórmula (I), tal que o peptídeo compreende ou consiste na estrutura de fórmula (II): X1000-X1001-X1002-X1003- X1004-X1005-X1006-X1007-X1008-X1009-X1010-X1011-X1012- X1013-X1014-X1015-X1016-X1017-X1018-X1019 (II) (SEQ ID NO: 3122). Quando X1000 está presente no peptídeo, X1000 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, E, e P, enquanto os aminoácidos de X1001-X1019 são como definidos acima.

[00132] Em um aspecto adicional, o peptídeo de ligação a TFPI da invenção compreende a estrutura de fórmula (III): X1001-Q-X1003- X1004-X1005-X1006-I/V-X1008-V-X1010-G-Y-C/F-X1014-R-L-X1017- X1018-K-K/L (III) (SEQ ID NO: 3117). Como usado aqui, as designações de aminoácido separadas por "/" se referem a resíduos de aminoácidos alternativos na posição indicada. Por exemplo, com respeito à fórmula (III), o resíduo de aminoácido na posição 7 é Isoleucina ou Valina. X1001, X1003, X1004, X1005, X1006, X1008, X1010, X1014, X1017 e X1018 na fórmula (III) são independentemente selecionados a partir de qualquer aminoácido. Por exemplo, na fórmula (III), X1001 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Bhf, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, Nmf, Q, R, T, V, W, e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, F, I, K, L, Nmf, V, M, W, e Y (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, L, Y e M); X1003 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, Bhs, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, D, E, H, K, M, I, N, Q, R, S, T, e V (por exemplo, o aminoácido é M, Q, R, S, T ou C); X1004 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em, A, Aib, Bhk, C, D, E, F, G, H, I, K, k, L, M, N, Nmk, P, Q, R, S, T, V, W, e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, C, D, E, G, H, F, I, K, k, L, M, N, Nmk, P, Q, R, S, V, W, e Y (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Aib, K, L, P, R, E, G, I, Y, M, e W); X1005 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em a, A, Aib, Bal, C, D, d, E, F, G, H, K, k, L, M, N, Nmg, p, Q, R, S, T, V, W, e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em a, A, Aib, Bal, C, d, E, D, F, G, H, K, k, L, M, N, Nmg, p, Q, R, S, T, e Y (por exemplo, o aminoácido é a, Aib, D, d, G, H, K, k, N, Nmg, p, Q, R, A, E, C, ou M); X1006 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, Btq, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Btq, C, D, G, I, K, H, L, M, N, Q, R, S, V, e Y (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, D, G, H, K, N, Q, R, S, e M); X1008 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, H, K, W, e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, H, e Y; X1010 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Nmf, P, Q, R, S, T, V, W, e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, e Y (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, K, M, N, Q, R, F, H, P, S, V, W, e Y); X1014 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, Bhe, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, Bhe, C, D, E, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, e Y (por exemplo, A, C, D, E, K, L, M, N, Q, R, T, V, ou Aib); X1017 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em (ômega-metil)-R, A, Aib, Bhr, C, Cha, Cit, D, Dab, Dap, E, Eag, Eew, F, G, H, Har, Hci, Hle, I, K, L, M, N, Nle, Nva, Opa, Orn, Q, R, S, T, V, W, e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em (ômega-metil)-R, A, Aib, Bhr, C, Cha, Cit, Dab, Dap, Eag, Eew, F, H, Har, Hci, Hle, I, K, L, M, N, Nle, Nva, Opa, Orn, R, S, T, V, e Y (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, C, Cha, Dab, Dap, Eag, Eew, H, Har, Hci, Hle, K, Nle, Nva, Opa, Orn, R, I, L, S, e M); e/ou X1018 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Bal, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, D, E, F, I, K, L, M, N, Q, R, V, e W (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, L, N, M, e R).

[00133] Em algumas modalidades, o peptídeo da invenção compreende um ou mais resíduos de aminoácidos adicionais fixos aos terminais N- ou C- de uma sequência de aminoácidos. Por exemplo, o peptídeo compreendendo a estrutura de qualquer uma das fórmulas (I)- (III), em algumas modalidades, compreende ainda um ou mais aminoácidos N-terminais diretamente ligados a X1001, em que os aminoácidos N-terminais compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em X1000, X999-X1000, X998-X999- X1000, X997-X998-X999-X1000 (SEQ ID NO: 3123), X996-X997-X998- X999-X1000 (SEQ ID NO: 3124), X995-X996-X997-X998-X999-X1000 (SEQ ID NO: 3125), X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000 (SEQ ID NO: 3126), X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000 (SEQ ID NO: 3127), X992-X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000 (SEQ ID NO: 3128),X991-X992-X993-X994-X995-X996-X997-X998- X999-X1000 (SEQ ID NO: 3129), e X990-X991-X992-X993-X994-X995- X996- X997-X998-X999-X1000 (SEQ ID NO: 3130). Quando o peptídeo compreende um ou mais aminoácidos N-terminal, X1000 é A ou K; X999 é V ou K; X998 é Q ou K; X997 é L ou K; X996 é R ou K; X995 é G ou K; X994 é V ou K; X993 é G ou K; X992 é S ou K; X991 é K; e X990 é K.

[00134] Além das estruturas de núcleo estabelecidas nas fórmulas (I)-(III), outras estruturas que são contempladas são aquelas em que um ou mais aminoácidos adicionais são fixos ao C-terminal da estrutura do núcleo diretamente ligada a X1020. Por exemplo, a adição C-terminal opcionalmente compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em X1021, X1021-X1022, X1021- X1022-X1023, e X1021-X1022-X1023-X1024 (SEQ ID NO: 3131), em que X1021 é T ou K; X1022 é S ou K; e X1023 e X1024 são K.

[00135] A invenção inclui ainda um peptídeo de ligação a TFPI compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60% identidade (por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95 % ou 100% identidade) a uma sequência de aminoácidos Ac-FQSK-Nmg-NVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2 (fórmula IV) (SEQ ID NO: 164). Em alguns casos, o peptídeo compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das fórmulas (I)-(III), como descrito aqui. A invenção também inclui um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 8-978 (por exemplo, um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 8-741 e 962-972 (tal como SEQ ID NOs: 8-741, 962-968, 971, ou 972) e/ou selecionada do grupo consistindo em 742-961 (tal como SEQ ID NOs: 744-961) e/ou selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 973-978).

[00136] A invenção inclui peptídeos que compreendem uma estrutura cíclica. A este respeito, a invenção inclui peptídeos compreendendo estruturas cíclicas dentro do peptídeo (por exemplo, uma ou mais alças formadas por ligação entre aminoácidos diferentes de aminoácidos N- e C-terminais), peptídeos compreendendo uma estrutura cíclica formada pela interação de um aminoácido terminal com um aminoácido dentro da sequência de peptídeos, e peptídeos ciclizados da cabeça à cauda. O peptídeo pode também ser parte de uma estrutura cíclica grande formada por aminoácidos adicionais circundantes ou substituintes químicos. Os peptídeos da invenção, em alguns casos, compreendem ligações de dissulfeto intramoleculares. Em algumas modalidades, as ligações de dissulfeto intramoleculares são formadas por resíduos de cisteína. Os peptídeos que compreendem as estruturas cíclicas constituídas por resíduos não cisteína, ou um resíduo de não cisteína e um resíduo de cisteína, também são fornecidos. Por exemplo, em uma modalidade, o peptídeo da invenção compreende pelo menos um aminoácido não convencional, ou porção química que medeia a ciclização. Aminoácidos ou porções químicas adequadas não convencionais incluem, mas não estão limitados a FA19205, FA19204, FA19203, FA03202, Hcy, hcy, Cea, e c. Os aminoácidos ou porções responsáveis pela ciclização estão suficientemente espaçados entre si para permitir a formação de uma estrutura de alça, por exemplo, os aminoácidos ou porções são separados por dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais resíduos.

[00137] Em um aspecto, o peptídeo que compreende a estrutura de fórmulas (I) - (III) contém pelo menos dois resíduos de cisteína (por exemplo, o peptídeo contém dois resíduos de cisteína), que estão espaçados entre si por pelo menos três resíduos de aminoácidos tais que as cisteínas formam uma ligação de dissulfeto intramolecular. Em alguns casos, as cisteínas estão separadas por mais do que três resíduos de aminoácidos. Por exemplo, no peptídeo que compreende a estrutura de fórmulas (I), (II) ou (III), quaisquer duas de X1000, X1001, X1003, X1004, X1005, X1006, X1010, X1011, X1013, X1014, X1017, X1018, X1020 e X1021 são opcionalmente cisteínas capazes de formar uma ponte de dissulfeto. Assim, em alguns aspectos, o peptídeo contém dois resíduos de cisteína: um de X1000, X1005, X1010 e X1014 é cisteína, e um de X1006, X1010, X1017 e X1021 é uma cisteína. A presente invenção contempla todas as combinações possíveis de pares de cisteína, por exemplo, X1000 e X1006 são C; X1000 e X1010 são C; X1000 e X1017 são C; X1005 e X1017 são C; X1010 e X1017 são C; X1010 e X1021 são C; ou X1014 e X1021 são C. Outros peptídeos cíclicos exemplares da invenção incluem, por exemplo, JBT2441, JBT2450, JBT2466-JBT2469, JBT2489- JBT2495, JBT2497-JBT2499, e JBT2513-JBT2518 (SEQ ID NOs: 4159, 4167, 4181-4184, 4204-4210, 4212-4214, e 4228-4233, respectivamente).

[00138] A invenção fornece ainda um peptídeo que se liga a TFPI, o peptídeo compreendendo a estrutura de fórmula (V): X2001-X2002- X2003-X2004-X2005-X2006-[X2007-X2008-X2009-X2010-X2011- X2012-X2013-X2014-X2015-X2016-X2017-X2018]-X2019-X2020- X2021-X2022-X2023 (V) (SEQ ID NO: 3118), em que o peptídeo forma uma estrutura cíclica gerada por uma ligação, por exemplo, uma ligação dissulfeto, entre X2007 e X2018 (indicado com parênteses dentro da fórmula (V)). Na fórmula (V), X2001, X2002, e X2023 estão independentemente quer presentes ou ausentes. Quando presentes, X2001 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V e W; X2002 um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, R, S, T, V, e W; e X2023 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V, W, e Y. Além disso, X2003 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, F, I, K, L, R, S, T, V, W, e Y; X2004 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V, e W; X2005 é W; X2006 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, H, I, K, L, R, V, e W; X2007 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, Hcy, Dap, e K (por exemplo, C ou Hcy); X2008 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, G, R, S, e T; X2009 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em a A, I, K, L, M, m, Nle, p, R, Sem, e V; X2010 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, G, I, K, L, P, R, S, T, e V; X2011 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D, E, G, S, e T; X2012 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, a, D, d, E, e, F, f, G, I, K, k, L, l, M, m, Nle, nle, P, p, R, r, S, s, Sem, T, t, V, v, W, e W; X2013 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, d, E, e, F, G, I, K, L, R, S, s, T, V, e W; X2014 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, M, R, S, T, V, e W; X2015 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, M, Nle, R, S, T, V, e W; X2016 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, I, K, L, M, Nle, R, S, Sem, T, V, W, e Y; X2017 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V, W, e Y; X2018 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C e D (por exemplo, X2018 é C); X2019 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, F, I, L, S, T, V, e W; X2020 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F e W; X2021 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em I, L, e V; e X2022 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, P, R, S, T, V, e W.

[00139] Em alguns casos, no peptídeo da invenção compreendendo a estrutura de fórmula (V), X2001 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, F, G, H, K, L, P, e S, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, F, G, H, K, L, e S (quando X2001 está presente); X2002 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, F, G, H, K, L, P, R, e S, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, F, H, K, L, M, R, e S (por exemplo, H, F, M ou R) (quando X2002 está presente); X2003 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, F, K, L, S, e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, S, e Y (por exemplo, F ou Y); X2004 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, F, G, K, L, e S (por exemplo, K); X2005 é opcionalmente W; X2006 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, H, K, e L (por exemplo, F ou H); X2007 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C e HcY (por exemplo, X2007 é C); X2008 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, G, e S; X2009 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em a, A, K, L, V, M, m, Nle, Sem, e p, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em M, Nle, p, e V (por exemplo, M, Sem, ou V); X2010 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, G, K, L, P, R, e S, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, K, L, P, R e S (por exemplo, K, P, ou R); X2011 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D, G, e S (por exemplo, D ou S); X2012 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, a, D, d, F, f, G, K, k, L, l, M, m, Nle, P, S, e s, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D, d, F, f, G, K, k, L, l, M, Nle, P, S, e Sem (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, L, l, Sem, e M); X2013 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, d, F, G, K, L, S, e s, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, F, G, K, L e S (por exemplo, D, G, K, ou S); X2014 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D, F, G, K, L, e S (por exemplo, D ou G); X2015 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, F, G, I, K, L, M, Nle, S, e T (por exemplo, I ou T); X2016 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D, F, K, L, M, Nle, S, e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D, F, K, L, M, Nle, S, Sem, e Y (por exemplo, D, F, M, Sem, ou Y); X2017 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, F, G, K, L, S, T, e Y (por exemplo, S ou T); X2018 é opcionalmente C; X2019 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, F, L, S, e V (por exemplo, A ou V); X2020 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F e W (por exemplo, W); X2021 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em L e V (por exemplo, V); X2022 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, F, G, K, L, P, R, S, e W, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, F, G, K, L, P, R, S, e W (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, L, K, R, P, e W); e X2023 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, F, G, K, L, M, S, e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, F, G, L M, S, e Y (por exemplo, uma sequência de aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, F, M, S e Y) (quando X2023 está presente).

[00140] A invenção inclui ainda um peptídeo que se liga a TFPI, em que o peptídeo compreende a estrutura de fórmula (VI): X2001-X2002- F/Y-K-W-F/H-[C-X2008-M/V-X2010-D-X2012-X2013-G-I/T-X2016-S/T- C]-A/V-W-V-X2022-X2023 (VI) (SEQ ID NO: 3119). No peptídeo compreendendo a estrutura de fórmula (VI), X2001, X2002 e X2023 estão, cada um, independentemente presentes ou ausentes. Se X2001, X2002, e/ou X2023 estão presentes, qualquer um de X2001, X2002 e X2023 é independentemente selecionado a partir de qualquer aminoácido. Além disso, X2008, X2010, X2012, X2013, X2016, e X2022 são independentemente selecionados a partir de qualquer aminoácido.

[00141] Em alguns aspectos, no peptídeo de fórmula (VI), X2001 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V, e W, tal como um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, D, F, G, H, K, L, P, e S (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, D, F, G, H, K, L, e S) (quando X2001 está presente); X2002 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, R, S, T, V, e W, tal como um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, D, F, G, H, K, L, M, P, R, e S (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, F, H, K, L, M, R, e S, como H, F, M, ou R) (quando X2002 está presente); X2008 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, G, R, S, e T, tal como um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, G, e S; X2010 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, G, I, K, L, P, R, S, T, e V, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, G, K, L, P, R, e S (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, K, L, P, R, e S, como K, P ou R); X2012 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, a, D, d, E, e, F, f, G, I, I, K, k, L, l, M, m, Nle, nle, P, p, R, r, S, s, Sem, T, t, V, v, W, e W, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, a, D, d, F, f, G, K, k, L, l, M, m, Nle, P, S, s, e Sem (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D, d, F, f, G, K, k, L, l, M, Nle, P, S, e Sem, como F, L, l, Sem, ou M); X2013 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, d, E, e, F, G, I, K, L, R, S, s, T, V, e W, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, d, F, G, K, L, S, e s (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, F, G, K, L, e S, como D, G, K, ou S); X2016 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, I, K, L, M, Nle, R, S, Sem, T, V, W, e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D, F, K, L, M, Nle, S, Sem, e Y (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D, F, K, L, M, Nle, S, e Sem, como F, Sem, ou M); X2022 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, P, R, S, T, V, e W, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, F, G, K, L, P, R, S, e W (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, F, G, K, L, P, R, S, e W, como F, L, K, R, P, ou W); e/ou X2023 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, R, M, S, T, V, W, e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, F, G, K, L, M, S, e Y (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, F, G, L M, S, e Y, como A, D, F, M, S, ou Y) (quando X2023 está presente).

[00142] O peptídeo de ligação a TFPI da invenção, em um aspecto, compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60% identidade (por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% identidade) para a sequência de fórmula VII: Ac-FYYKWH[CGMRDMKGTMSC]AWVKF-NH2 (VII) (SEQ ID NO: 1040). opcionalmente, o peptídeo compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos de fórmula (V)-(VII) como definido aqui. A invenção também inclui um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1001-1293 (por exemplo, um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1001-1212 e 1290- 1291 (tal como SEQ ID NOs: 1001-120, 1290, ou 1291) e/ou selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1213-1289 e/ou selecionada do grupo consistindo em 1292 e 1293). A invenção também inclui um peptídeo compreendendo (ou que consiste em) a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1337-1355 e 4240-4268 (JBT0496, JBT1165, JBT2330- JBT2338, JBT2341, JBT2342, JBT2346-2348, JBT2356, JBT2457, JBT2538, JBT2519- JBT2523, JBT2527- JBT2529, JBT2531- JBT2534, JBT2537, JBT2539- JBT2541, JBT2543- JBT2555).

[00143] A invenção fornece ainda um peptídeo de ligação a TFPI compreendendo pelo menos aminoácidos 3-21 (X3003-X3021) da estrutura de fórmula (VIII): X3001-X3002-X3003-X3004-X3005-X3006- X3007-X3008-X3009-X3010-X3011-X3012-X3013-X3014-X3015- X3016-X3017-X3018-X3019-X3020-X3021 (VIII) (SEQ ID NO: 3120). Na fórmula (VIII), X3001 e X3002 estão independentemente quer presentes ou ausentes no peptídeo. Se presente, X3001 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, C, D, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W, E, H e Y; e X3002 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, C, D, F, H, K, M, N, P, R, S, T, W, Y, G, I, e L. Além disso, X3003 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W, e Y; X3004 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, Y, e P; X3005 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W, e Y; X3006 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, W, C, K, P, R, e H; X3007 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Q, A, C, F, G, H, I, K, L, N, R, S, T, W, e Y; X3008 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, e I; X3009 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, F, G, H, I, L, M, R, S, T, V, W, Y, e K; X3010 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, e Y; X3011 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, G, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, Y, C, F, e H; X3012 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, H, I, K, L, e R; X3013 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, F, G, H, K, L, M, R, S, V, W, Y, e I; X3014 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, F, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, Y, e K; X3015 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, K, e R; X3016 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, F, K, e R; X3017 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, F, G, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W, Y, H, A, e M; X3018 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, F, I, K, L, M, Q, R, V, W, e Y; X3019 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, D, E, F, G, H, K, L, N, P, Q, R, V, W, Y, e I; X3020 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, F, G, H, K, L, M, N, Q, R, V, W, Y, I, e P; e X3021 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, Y, F, e G.

[00144] Em alguns aspectos da invenção, o peptídeo compreende a sequência de fórmula (VIII), em que X3001 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, D, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W, E, H, e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, D, G, K, L, M, N, P, R, S, T, E, H, e Y (quando X3001 está presente); X3002 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, F, H, K, R, S, W, Y, G, I, e L, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, K, R, W, Y, G, I, e L (quando X3002 está presente); X3003 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, e W, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, G, H, I, K, L, M, R, S, T, e W; X3004 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, D, G, H, I, K, L, M, N, R, S, T, V, e P, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, G, H, I, K, L, M, N, R, S, T, e P; X3005 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, F, H, I, K, M, R, T, W, e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, F, H, K, R, e W; X3006 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em P, H, e A; X3007 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, G, R, W, A, e L, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em L, C, R, e W; X3008 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, F, G, H, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, Y, e I, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, F, H, K, R, V, W, Y, e I; X3009 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, I, R, V, e K, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, R, V, e K; X3010 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, G, H, I, K, L, M, Q, R, S, e T, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, K, L, Q, R, e S; X3011 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, I, K, L, M, R, S, V, W, C, F, e H, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em I, K, L, M, R, V, W, C, F, e H; X3012 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em H e R (por exemplo, H); X3013 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, F, K, L, M, R, V, e I, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, K, R, V, e I; X3014 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, M, C, F, H, I, L, N, R, S, V, W, e K, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, S, C, F, H, I, R, e K; X3015 é opcionalmente K ou R; X3016 é opcionalmente K ou R; X3017 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, F, G, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W, H, A, e M, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, G, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, H, A, e M; X3018 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, K, C, I, L, R, e W (por exemplo, K, C, I, R, ou W); X3019 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, E, H, K, N, Q, R, e I, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, E, H, K, R, e I; X3020 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, H, L, M, R, V, I, e P (por exemplo, C, M, I, ou P); e X3021 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, H, I, K, L, M, N, Q, R, V, W, Y, F, e G, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, H, I, K, L, M, N, Q, R, V, W, F, e G.

[00145] A invenção fornece ainda um peptídeo que se liga a TFPI e compreende pelo menos aminoácidos 3-21 (X3003-X3021) da estrutura de fórmula (IX): X3001-X3002-X3003-X3004-X3005-X3006-X3007- X3008-X3009-X3010-X3011-H-X3013-X3014-K/R-R-X3017-X3018- X3019-X3020-X3021 (IX) (SEQ ID NO: 3121). Na fórmula (IX), X3001 e X3002 estão independentemente quer presentes ou ausentes no peptídeo. Se presentes, X3001 e/ou X3002 são independentemente selecionados de qualquer aminoácido. Do mesmo modo, X3003, X3004, X3005, X3006, X3007, X3008, X3009, X3010, X3011, X3013, X3014, X3017, X3018, X3019, X3020 e X3021 são independentemente selecionados a partir de qualquer aminoácido. Quando presentes, X3001 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, C, D, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W, E, H, e Y, tal como um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, C, D, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W, E, H, e Y (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, C, D, G, K, L, M, N, P, R, S, T, E, H, e Y). Do mesmo modo, quando presentes, X3002 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, C, D, F, H, K, M, N, P, R, S, T, W, Y, G, I, e L, tal como um aminoácido selecionado do grupo consistindo em C, F, H, K, R, S, W, Y, G, I e L (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo consistindo em C, K, R, W, Y, G, I, e L). Também com respeito à fórmula (IX), X3003 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W, e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, e W (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, G, H, I, K, L, M, R, S, T, e W); X3004 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, Y, e P, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, D, G, H, I, K, L, M, N, R, S, T, V, e P (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, G, H, I, K, L, M, N, R, S, T, e P); X3005 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W, e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, F, H, I, K, M, R, T, W, e Y (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, F, H, K, R, e W); X3006 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, W, C, K, P, R e H, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em P, H, e A; X3007 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Q, A, C, F, G, H, I, K, L, N, R, S, T, W, e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, G, R, W, A, e L (por exemplo, L, C, R, ou W); X3008 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, e I, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, F, G, H, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, Y, e I (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, F, H, K, R, V, W, Y, e I); X3009 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, F, G, H, I, L, M, R, S, T, V, W, Y, e K, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, I, R, V, e K (por exemplo, C, R, V, ou K); X3010 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, G, H, I, K, L, M, Q, R, S, e T (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, K, L, Q, R, e S); X3011 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, G, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, Y, C, F, e H, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, I, K, L, M, R, S, V, W, C, F, e H (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em I, K, L, M, R, V, W, C, F, e H); X3013 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, F, G, H, K, L, M, R, S, V, W, Y, e I, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, F, K, L, M, R, V, e I (por exemplo, C, K, R, V, ou I); X3014 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, F, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, Y, e K, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, M, C, F, H, I, L, N, R, S, V, W, e K (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, S, C, F, H, I, R, e K); X3017 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, F, G, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W, Y, H, A, e M, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, F, G, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W, H, A, e M (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, G, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, H, A, e M); X3018 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, F, I, K, L, M, Q, R, V, W, e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, K, C, I, L, R, e W (por exemplo, K, C, I, R, ou W); X3019 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, D, E, F, G, H, K, L, N, P, Q, R, V, W, Y, e I, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, E, H, K, N, Q, R, e I (por exemplo, C, E, H, K, R, ou I); X3020 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, F, G, H, K, L, M, N, Q, R, V, W, Y, I, e P, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, H, L, M, R, V, I, e P (por exemplo, C, M, I, ou P); e/ou X3021 é opcionalmente um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, Y, F, e G, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, H, I, K, L, M, N, Q, R, V, W, Y, F, e G (por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, H, I, K, L, M, N, Q, R, V, W, F, e G).

[00146] O peptídeo de ligação a TFPI da invenção compreende, em alguns aspectos, uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60% identidade (por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% identidade) com a sequência de fórmula (X): Ac- GYASFPWFVQLHVHKRSWEMA-NH2 (X) (SEQ ID NO: 223). opcionalmente, o peptídeo compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos de fórmula (VIII)-(IX) como definido aqui. Como usado aqui, "pelo menos 60% identidade" e termos semelhantes engloba qualquer inteiro de, por exemplo, 60%, a 100%, tal como 60%, 61%, 62%, e semelhantes. Além disso, o termo "pelo menos [porcentagem] de identidade" engloba qualquer vantagem que é maior que ou igual ao número de aminoácidos idênticos divididos pelo número total de aminoácidos de peptídeo da invenção ([pelo menos porcentagem de identidade] > [número de aminoácidos idênticos] / [número total de aminoácidos do peptídeo da invenção]).

[00147] A invenção também inclui um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2001-2498 (por exemplo, um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2001-2296 e 2498 (tal como SEQ ID NOs: 2001-2126, 2128-2296, ou 2498) e/ou selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2297-2497 (tal como SEQ ID NOs: 2298-2497)). A invenção fornece ainda um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 3001-3108 (por exemplo, um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 3001-3064 (tal como SEQ ID NOs: 3001-3048, 3051-3053, 3055, ou 3057-3064) e/ou selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 3065-3084 (tal como SEQ ID NOs: 3066-3084) e/ou selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 3085-3108).

[00148] O peptídeo de SEQ ID NOs: 1-7 também, em alguns aspectos, compreende um ou mais aminoácidos fixos no N- ou C- terminal de SEQ ID NOs: 1-7. Por exemplo, a invenção inclui um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos de JBT0047, JBT0051, JBT0055, JBT0131, JBT0132, JBT0133, JBT0155, JBT0158, JBT0162, JBT0163, JBT0164, JBT0166, JBT0169, JBT0170, JBT0171, JBT0174, JBT0175, ou JBT0293, todos os quais compreendem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Peptídeos exemplares compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 incluem peptídeos compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos de JBT0294, JBT0295, JBT0296, JBT0297, JBT0298, JBT0299, JBT0300, JBT0301, JBT0302, JBT0303, JBT0304, JBT0305, JBT0306, JBT0307, JBT0308, JBT0309, JBT0310, ou JBT0311. Peptídeos exemplares compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 compreendem ou consistem em uma sequência de aminoácidos de JBT0049, JBT0053, JBT0057, JBT0190, JBT0193, ou JBT0197. A invenção inclui ainda um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos de JBT0050, JBT0054, JBT0058, JBT0129, JBT0130, JBT0205, JBT0208, JBT0211, JBT0212, JBT0217, JBT0218, ou JBT0219, todos os quais incluindo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Peptídeos exemplares compreendendo SEQ ID NO: 5 incluem aqueles compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos de JBT0101, JBT0052, JBT0103, JBT0178 ou JBT0182. A invenção adicionalmente inclui um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos de JBT0120, JBT0124, JBT0247, JBT0248, JBT0251, ou JBT0252, cada um dos quais incluindo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Um peptídeo incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, por exemplo, um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos de JBT0122, JBT0126. JBT0221, JBT0224, JBT0225, JBT0226, JBT0228, JBT0232, ou JBT0233, também fornecido pela invenção. Os peptídeos descritos aqui são estabelecidos na Tabela 5 do exemplo 1 e nas Figuras 12-18.

[00149] A invenção inclui ainda um peptídeo de ligação a TFPI compreendendo a estrutura de fórmula (XI): X4001-Q-X4003-X4004- X4005-X4006-X4007-X4008-X4009-X4010-X4011-X4012-X4013- X4014-R-X4016-X4017-X4018-X4019-X4020 (XI) (SEQ ID NO: 3151). Com respeito à fórmula (XI), X4001 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, L, M, Y, 1Ni, Thi, Bta, e Dopa (por exemplo, F, Y, 1Ni, Bta, ou Dopa); X4003 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, D, E, M, Q, R, S, T, Ede(O), e Cmc (por exemplo, D, E, ou S); X4004 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Aib, E, G, I, K, L, M, P, R, W, e Y (por exemplo, K); X4005 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em a, A, Aib, C, D, d, E, G, H, K, k, M, N, Nmg, p, Q, R, NpropilG, aze, pip, tic, oic, hyp, nma, Ncg, Abg, Apg, thz, e dtc (por exemplo, p, Nmg, NpropilG, aze, pip, tic, oic, ou hyp); X4006 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, C(NEM), D, E, G, H, K, M, N, Q, R, S, V, Cit, C(Acm), Nle, I, Ede(O), Cmc, Ecl, Eea, Eec, Eef, Nif, e Eew (por exemplo, C, E, K, R, S, V, C(Acm), Nle, C(NEM), I, ou Cit); X4007 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em I, V, T, Chg, Phg, e Tle (por exemplo, V ou Tle); X4008 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, H, 1Ni, 2Ni, Pmy, e Y (por exemplo, H, 1Ni, 2Ni, ou Pmy); X4009 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Aib, V, Chg, Phg, Abu, Cpg, Tle, e ácido L-2-amino-4,4,4-trifluorobutírico (por exemplo, V, Abu, ou Tle); X4010 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, D, d, E, F, H, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, Nmd, e C(NEM) (por exemplo, D, P, C ou T); X4011 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, a, G, p, Sar, c, e hcy (por exemplo, G, a, c, hcy, ou Sar); X4012 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Y, Tym, Pty, Dopa, e Pmy (por exemplo, Y); X4013 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, F, 1Ni, Thi, e Bta (por exemplo, F, 1Ni, ou Bta); X4014 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, C, C(NEM), D, E, K, L, M, N, Q, R, T, V, e Hcy (por exemplo, Aib, C, E, ou Hcy); X4016 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em L, Hcy, Hle, e Aml; X4017 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, a, Aib, C, c, Cha, Dab, Eag, Eew, H, Har, Hci, Hle, I, K, L, M, Nle, Nva, Opa, Orn, R, S, Deg, Ebc, Eca, Egz, Aic, Apc, e Egt (por exemplo, A, Aib, C, c, Aic, Eca, ou Deg); X4018 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, Hcy, hcy, C, c, L, Nle, M, N, e R (por exemplo, A, Aib, C, c, L, ou Hcy); X4019 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em K, R, e Har (por exemplo, K); e X4020 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em K, L, Hcy, e Aml (por exemplo, L, Aml, e Hcy).

[00150] O peptídeo de ligação a TFPI de fórmula (XI) não compreende a estrutura de fórmula (XII): X5001-Q-X5003-X5004- X5005- X5006-I/V-X5008-Aib/V-X5010-G-Y-X5013-X5014-R-L-X5017- X5018-K-K/L (XII) (SEQ ID NO: 3152). Na fórmula (XII), X5001 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, L, M, e Y; X5003 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, D, E, M, Q, R, S, e T; X5004 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em E, G, I, K, L, M, P, R, W, e Y; X5005 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em a, A, Aib, C, D, d, E, G, H, K, k, M, N, Nmg, Q, R, e p; X5006 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, D, E, G, H, K, M, N, Q, R, S, e V; X5008 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, H, e Y; X5010 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, D, E, F, H, D, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, e Y; X5013 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Aib, C, e F; X5014 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, C, D, E, K, L, M, N, Q, R, T, e V; X5017 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, C, Cha, Dab, Eag, Eew, H, Har, Hci, Hle, I, K, L, M, Nle, Nve, Opa, Orn, R, e S; e X5018 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, L, M, N, e R.

[00151] Em um aspecto, o peptídeo de ligação a TFPI descrito aqui ainda compreende aminoácidos N-terminal ou porções. Por exemplo, o peptídeo de ligação a TFPI de fórmula (XI) compreende ainda aminoácidos e/ou porções N-terminais ligadas a X4001, ou X6001 e/ou X7001 de fórmulas (XIII) e (XIV) (descrito abaixo) são ligados aos aminoácidos N-terminal ou porções. Os aminoácidos e/ou porções N- terminais são opcionalmente selecionadas do grupo consistindo em FAM-Ttds, um tag de prolina-glutamato ("PE"), Palm, 2-fenil acetila, 3- fenil propionila, 2-(nafta-2-il) acetila, hexanoila, 2-metil propionila, 3- metil butanoila, 2-naftilsulfonila, acetila, Con, Con(Meox), AOA, Oxme- AOA, Meox-Lev, ácido levulínico (Lev), e ácido pentinoico (Pyn), e 1- naftilsulfonila. Alternativamente ou adicionalmente, o peptídeo de ligação a TFPI (por exemplo, o peptídeo de ligação a TFPI de fórmula (XI), fórmula (XIII), e/ou fórmula (XIV)) ainda compreende um ou mais aminoácido(s) e/ou porções ligadas ao aminoácido C-terminal (por exemplo, X4020, X6020, ou X7022 ou X7023). Os aminoácidos e/ou porções C-terminais são opcionalmente selecionados do grupo que consiste em C, c, C(NEM), K(Ttds-maleimidopropionil(EtSH)), FA19205, FA19204, FA19203, FA03202, K(Tdts-maleimida), K(AOA), e Cea, e amida. Alternativamente, os aminoácidos C-terminal e/ou porções também são selecionados do grupo que consiste em Eag, Con, Con(Meox), Hly, K, Orn, Dab, Dap, Hcy, Pen, K(Myr), K(Ttds-Myr), K(Ttds-Palm), K(Ttds-Ac), K(Ttds-YGlu-Myr), K(AlbuTag), e K(4PBSA). No contexto da fórmula (XI), aminoácidos C-terminal e/ou porções são designados aqui como X4021. No contexto de fórmulas (XIII) e (XIV), aminoácidos C-terminal e/ou porções são designados como X6021 e X7024, respectivamente.

[00152] Em uma modalidade, o peptídeo compreende uma estrutura cíclica formada entre X4018 e X4021. A este respeito, X4018 é opcionalmente C ou c, e X4021 é opcionalmente Cea. Em uma modalidade, o peptídeo compreende uma estrutura cíclica formada entre X4011 e X4014. A este respeito, X4011 é opcionalmente c ou hcy, e X4014 é opcionalmente C ou Hcy.

[00153] A invenção também inclui um peptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4022, 4024, 4032, 4036-4047, 4049-4078, 4086-4097, 41004127, 4129-4170, 4173-4195, 4200-4214, 4217-4225, 4228, 4230, 4231, 4238, e 4239, bem como um peptídeo consistindo na sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1294-1336, 4002, 4013, 4021, 4023, 4025-4031, 4033-4035, 4048, 4079-4085, 4098, 4099, 4128, 4171, 4172, 4196-4199, 4215, 4216, 4226, 4277, 4229, 4232, e 4233.

[00154] Em certas modalidades, o peptídeo da invenção compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos de JBT0047, JBT0049, JBT0101, JBT0120, ou JBT0122 ou qualquer um dos peptídeos inventivos descritos aqui (por exemplo, um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-3108, tal como um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 8-741, 744-968, 971-978, 1001-1210, 1213-1289, 1290-1293, 2001-2126, 2128-2296, 2298-2498, 3001-3048, 3051-3053, 3055, 3057-3064, e 3067-3108; um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 4022, 4024, 4032, 4036-4047, 40494078, 4086-4097, 4100-4127, 4129-4170, 4173-4195, 4200-4214, 42174225, 4228, 4230, 4231, 4238, e 4239; ou um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1294-1336, 4002, 4013, 4021, 4023, 40254031, 4033-4035, 4048, 4079-4085, 4098, 4099, 4128, 4171, 4172, 4196-4199, 4215, 4216, 4226, 4277, 4229, 4232, e 4233), ou um peptídeo compreendendo ou que consiste na sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1337-1355, 31463154 e 4240-4268, ou uma variante de qualquer um dos acima. Por "variante" entende-se um peptídeo compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, deleções de aminoácidos, ou adições de aminoácidos à uma sequência de aminoácido parente. Variantes incluem, entre outras, peptídeos tendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à qualquer uma das sequências de aminoácidos fornecidas aqui enquanto retendo a capacidade de se ligar a TFPI e/ou inibir atividade de TFPI. Em uma modalidade, o peptídeo compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de JBT0132, JBT0303, JBT0193, JBT0178, JBT0120, ou JBT0224.

[00155] Em um aspecto, o peptídeo da invenção consiste em 40 aminoácidos ou menos, tal como 35 aminoácidos ou menos. Opcionalmente, o peptídeo da invenção consiste em 25 aminoácidos ou menos, ou 10 aminoácidos ou menos. Em várias modalidades, o peptídeo compreende 15-35 resíduos de aminoácidos (por exemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, ou 35 resíduos de aminoácidos). Contudo, é também contemplado que um peptídeo aqui descrito compreendendo uma ou mais deleções seja adequado no contexto da invenção desde que o peptídeo se ligue a TFPI e, opcionalmente, bloqueie a inibição de TFPI da cascata de coagulação. Em alguns aspectos, aminoácidos são removidos de dentro de dentro de uma sequência de aminoácidos, no N-terminal, e/ou no C- terminal. Tais fragmentos de peptídeos podem compreender 3-14 resíduos de aminoácidos (por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, ou 14 resíduos de aminoácidos).

[00156] Opcionalmente, o peptídeo da invenção compreende uma ou mais substituições de aminoácido (com referência a qualquer uma de uma sequência de aminoácidos fornecida aqui) que não destroem a capacidade do peptídeo para se ligar a e/ou inibir TFPI. Por exemplo, peptídeos compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em JBT0294, JBT0295, JBT0296, JBT0297, JBT0298, JBT0299, JBT0300, JBT0301, JBT0302, JBT0303, JBT0304, JBT0305, JBT0306, JBT0307, JBT0308, JBT0309, JBT0310, ou JBT0311 são mutantes substitucionais de uma sequência de aminoácidos de JBT0293 (a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 diretamente ligada a um resíduo de fenilalanina no N-terminal e um resíduo de lisina no C-terminal) (ver Figura 4).

[00157] Substituições de aminoácido incluem, mas não estão limitadas àquelas que: (1) reduzem a suscetibilidade à proteólise, (2) reduzem a suscetibilidade à oxidação, (3) alteram afinidades de ligação, e/ou (4) conferem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais sobre um peptídeo. Em um aspecto, a substituição é uma substituição conservativa, em que um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral semelhante. As famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica, e incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina e histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico e ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, e cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, e triptofano), cadeias laterais beta- ramificadas (por exemplo, treonina, valina e isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano e histidina). Será apreciado, no entanto, que um praticante não se limita à criação de substituições conservativas, desde que o peptídeo resultante retenha a capacidade de infrarregular, no todo ou em parte, a atividade de TFPI. A invenção também abrange os peptídeos de ligação a TFPI (peptídeos inibidores de TFPI) compreendendo aminoácidos que ocorrem não naturalmente atípicos, que são bem conhecidos na técnica. Exemplos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente incluem ornitina, citrulina, hidroxiprolina, homosserina, fenilglicina, taurina, iodotirosina, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido α-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 2-amino butírico, ácido y-amino butírico, ácido 2- amino isobutírico, ácido 3-amino propiônico, norleucina, norvalina, sarcosina, homocitrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclo-hexilalanina, β-Alanina, a flúor-aminoácido, a 3-metil aminoácido, α-C-metil aminoácido, a N-metil aminoácido, ácido 2- amino-isobutírico, ácido e—homoglutamático, β-homofenilalanina, β- homolisina, β-homoleucina, β-homoasparagina, β-homoglutamina, β- homoarginina, β-homosserina, β-homotirosina, ácido β-homo aspártico, β-homovalina, β-homoasparagina,(S)-ciclo-hexilalanina, (S)-citrulina, ácido (S)-2,4-diaminobutírico, ácido (S)-2,4-diaminobutírico, ácido (S)- diaminopropiônico, (S)-2-proparglglicina, (S)-N(ômega)-nitro-arginina, L-homofenilalanina, (S)-homo-Arginina, (S)-homo-citrulina, (S)-homo- cisteína, ácido (S)-2-amino-5-metil-hexanoico, (S)-homo-lisina, (S)- norleucina, (S)-N-metilalanina, ácido (S)-N-metil-aspártico, ácido (S)-N- metil-glutâmico, (S)-N-metil-fenilalanina, N-metil-glicina, (S)-N-metil- lisina, (S)-N-metil-leucina, (S)-N-metil-arginina, (S)-N-metil-serina, (S)- N-metil-valina, (S)-N-metil-tirosina, ácido (S)-2-amino-pentanoico, (S)-2- piridil-alanina, (S)-ornitina, L-fenilglicina, ácido 4-fenil-butírico e selenometionina. Os aminoácidos individuais podem ter estereoquímica L ou D quando apropriado, embora a estereoquímica L seja tipicamente empregada para todos os aminoácidos no peptídeo.

[00158] A invenção inclui ainda as variantes de peptídeos de ligação a TFPI (por exemplo, peptídeo inibidor de TFPI) compreendendo um ou mais aminoácidos inseridos dentro de uma sequência de aminoácidos aqui fornecida e/ou ligados ao N-terminal ou C-terminal. Em um aspecto, o peptídeo compreende ainda um ou mais aminoácidos que facilitam a síntese, o manuseamento, ou o uso do peptídeo, incluindo, mas não se limitado a uma ou duas lisinas no N-terminal e/ou C-terminal para aumentar a solubilidade do peptídeo. As proteínas de fusão adequadas incluem, mas não estão limitadas a proteínas compreendendo um peptídeo de ligação a TFPI (peptídeo inibidor de TFPI) ligado a um ou mais polipeptídeos, fragmentos de polipeptídeos ou aminoácidos que, em geral, não são reconhecidos como parte da sequência de proteína. Em um aspecto, um peptídeo de fusão compreende as sequências de aminoácidos inteiras de dois ou mais peptídeos, ou, alternativamente, compreende as porções (fragmentos) de dois ou mais peptídeos. Além de todos ou parte dos peptídeos de ligação a TFPI (peptídeo inibitório de TFPI) aqui descritos, uma proteína de fusão, opcionalmente, inclui a totalidade ou parte de qualquer peptídeo adequado que compreende uma atividade/função biológica desejada. De fato, em alguns aspectos, um peptídeo de ligação a TFPI (peptídeo inibitório de TFPI) está ligado operativamente a, por exemplo, um ou mais dos seguintes: um peptídeo com meia vida de circulação longa, uma proteína marcadora, um peptídeo que facilita a purificação do peptídeo de ligação a TFPI (peptídeo inibitório de TFPI), uma sequência de peptídeo que promove a formação de proteínas multiméricas, ou um fragmento de qualquer um dos anteriores. Parceiros de fusão adequados incluem, mas não estão limitados a um tag de His, um tag de FLAG, um tag de strep, e um tag de Myc. Opcionalmente, o peptídeo de ligação a TFPI (peptídeo inibitório de TFPI) é fundido a uma ou mais entidades que aumentam a meia vida do peptídeo. A meia vida pode ser aumentada, por exemplo, aumentando o peso molecular do peptídeo de ligação a TFPI para evitar depuração renal e/ou incorporação de um ligante para a via de reciclagem mediada por receptor nFc. Em uma modalidade, o peptídeo de ligação a TFPI é fundido com ou quimicamente conjugado com (como descrito mais adiante) um polipeptídeo de albumina ou um fragmento do mesmo (por exemplo, albumina de soro humano (HSA) ou albumina de soro bovino (BSA)). O fragmento de albumina compreende 10%, 25%, 50%, ou 75% da proteína de albumina de comprimento completo. Alternativamente ou em adição, o peptídeo de ligação a TFPI compreende um domínio de ligação de albumina ou ácido graxo que se liga à albumina quando administrado in vivo. Um exemplo de um domínio de ligação a albumina é "albu-tag," uma porção derivada de um ácido 4-(p-iodofenil)-butanoico (Dumelin et al., Angew Chem Int Ed Engl 47:3196-3201 (2008)). Outros parceiros de fusão adequados incluem, mas não estão limitados a um multímero de prolina-alanina-serina (PASilação) e um anticorpo ou fragmento do mesmo (por exemplo, uma porção Fc de um anticorpo).

[00159] Em uma modalidade, dois ou mais peptídeos de ligação a TFPI são fundidos em conjunto por um domínio de multimerização ou ligados por meio de ligação química para gerar um complexo de peptídeo de ligação a TFPI (por exemplo, peptídeo inibidor de TFPI). Os peptídeos de ligação a TFPI podem ser os mesmos ou diferentes. Assim, a invenção fornece um homodímero (isto é, um dímero compreendendo dois peptídeos de ligação a TFPI idênticos), um homomultímeroos (isto é, um complexo que compreende três ou mais peptídeos de ligação a TFPI idênticos), um heterodímero (isto é, um dímero compreendendo dois peptídeos de ligação a TFPI diferentes), e heteromultímero (isto é, um complexo que compreende três ou mais peptídeos de ligação a TFPI, em que pelo menos dois dos peptídeos de ligação a TFPI são diferentes), compreendendo ou consistindo em qualquer um dos peptídeos aqui descritos, opcionalmente ligado por um ou mais ligantes.

[00160] Com relação a isto, a invenção fornece um complexo peptídico compreendendo um primeiro peptídeo e um segundo peptídeo. Qualquer um dos peptídeos descritos aqui são subunidades apropriadas (por exemplo, primeiro peptídeo ou segundo peptídeo) para o complexo peptídico. Em algumas modalidades, o complexo peptídico compreende 25-100 aminoácidos, por exemplo, 30-80 aminoácidos, 3060 aminoácidos, ou 30-50 aminoácidos. O primeiro peptídeo e o segundo peptídeo podem ligar a diferentes regiões (epítopos) de TFPI e, opcionalmente, o complexo peptídico inibe duas ou mais funções TFPI, como, entre outras, ligação de TFPI a FXa e ligação de TFPI a FVIIa. O nível de inibição de pelo menos uma atividade de TFPI (por exemplo, TFPI-1) mediada pelo complexo peptídico é maior do que o nível de inibição obtido pelo primeiro peptídeo ou o segundo peptídeo, isolado ou em combinação, em várias modalidades da invenção. As diferentes regiões (epítopos) em TFPI podem estar no mesmo polipeptídeo TFPI, ou em polipeptídeos TFPI diferentes. As características funcionais e terapêuticas e aplicações diagnósticas de peptídeos de ligação a TFPI monoméricos descritos aqui são ainda aplicáveis aos complexos peptídicos descritos aqui. De modo semelhante, as descrições das modificações aos peptídeos de ligação a TFPI monoméricos também se referem aos complexos peptídicos.

[00161] A invenção fornece um complexo peptídico compreendendo um primeiro peptídeo compreendendo a estrutura de fórmula (XIII): X6001-X6002-X6003-X6004-X6005-X6006-X6007-X6008-X6009- X6010-X6011-X6012-X6013-X6014-X6015-X6016-X6017-X6018- X6019-X6020 (XIII) (SEQ ID NO: 3153). Na fórmula (XIII),

[00162] X6001 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, L, M, Y, 1Ni, Thi, Bta, Dopa, Bhf, C, D, G, H, I, K, N, Nmf, Q, R, T, V, e W, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em 1Ni, Bta, Dopa, F, L, Y e M;

[00163] X6002 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Q, G, e K, como Q;

[00164] X6003 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, D, E, M, Q, R, S, T, Ede(O), Cmc, A, Aib, Bhs, F, G, H, I, K, L, N, P, V, W e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D, E, S, M, Q, R, T e C;

[00165] X6004 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Aib, E, G, I, K, L, M, P, R, W, Y, A, Bhk, C, D, F, H, k, N, Nmk, Q, S, T, e V, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em K, Aib, L, P, R, E, G, I, Y, M e W;

[00166] X6005 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em a, A, Aib, C, D, d, E, G, H, K, k, M, N, Nmg, p, Q, R, NpropilG, aze, pip, tic, oic, hyp, nma, Ncg, Abg, Apg, thz, dtc, Bal, F, L, S, T, V, W e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em p, Nmg, NpropilG, aze, pip, tic, oic, hyp, a, Aib, D, d, G, H, K, k, N, Q, R, A, E, C e M;

[00167] X6006 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, C(NEM), D, E, G, H, K, M, N, Q, R, S, V, Cit, C(Acm), Nle, I, Ede(O), Cmc, Ecl, Eea, Eec, Eef, Nif, Eew, Aib, Btq, F, I, L, T, W e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, E, K, R, S, V, C(Acm), Nle, C(NEM), I, Cit, A, D, G, H, N, Q e M;

[00168] X6007 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em I, V, T, Chg, Phg, Tle, A, F, G, I, K, L, Nmv, P, Q, S, W e Y, como Tle, V ou I;

[00169] X6008 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, H, 1Ni, 2Ni, Pmy, Y, e W, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em H, 1Ni, 2Ni, Pmy, F e Y;

[00170] X6009 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Aib, V, Chg, Phg, Abu, Cpg, Tle, ácido L-2-amino-4,4,4- trifluorobutírico, A, f, I, K, S, T e V, como V, Abu ou Tle;

[00171] X6010 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, D, d, E, F, H, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, Nmd, C(NEM), Aib, G, I, L e Nmf, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D, P, C, T, A, E, K, M, N, Q, R, F, H, S, V, W e Y;

[00172] X6011 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, a, G, p, Sar, c, hcy, Aib, C, K, G e Nmg, como G, a, c, hcy ou Sar;

[00173] X6012 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Y, Tym, Pty, Dopa, e Pmy, como Y;

[00174] X6013 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Aib, C, F, 1Ni, Thi, Bta, A, E, G, H, K, L, M, Q, R, W e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, 1Ni, Bta e C;

[00175] X6014 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, C, C(NEM), D, E, K, L, M, N, Q, R, T, V, Hcy, Bhe, F, G, H, I, P, S, W e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Aib, C, E, Hcy, A, D, K, L, M, N, Q, R, T, V e Aib;

[00176] X6015 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em R, (ômega-metil)-R, D, E e K, como R;

[00177] X6016 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em L, Hcy, Hle, e Aml, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em L, Aml, Hle e Hcy;

[00178] X6017 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, a, Aib, C, c, Cha, Dab, Eag, Eew, H, Har, Hci, Hle, I, K, L, M, Nle, Nva, Opa, Orn, R, S, Deg, Ebc, Eca, Egz, Aic, Apc, Egt, (ômega-metil)- R, Bhr, Cit, D, Dap, E, F, G, N, Q, T, V, W e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, C, c, Aic, Eca, Deg, Cha, Dab, Dap, Eag, Eew, H, Har, Hci, Hle, K, Nle, Nva, Opa, Orn, R, I, L, S e M;

[00179] X6018 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, Hcy, hcy, C, c, L, Nle, M, N, R, Bal, D, E, F, G, H, I, K, Q, S, T, V, W e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, C, c, L, Hcy, N, M e R;

[00180] X6019 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em K, R, Har, Bhk e V, como K; e

[00181] X6020 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em K, L, Hcy, Aml, Aib, Bhl, C, F, G, H, I, Nml, Q, R, S, T, V, W e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em L, Aml, Hcy e K.

[00182] Alternativamente, o primeiro peptídeo compreende a estrutura de qualquer uma das fórmulas (I)-(IV) e (XI) descritas aqui. O primeiro peptídeo, em várias modalidades, compreende (ou consiste em) uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 8-978, 4022, 4024, 4032, 4036-4047, 4049-4078, 4086-4097, 4100-4127, 4129-4170, 4173-4195, 4200-4214, 4217-4225, 4228, 4230, 4231, 4238, 4239, 4002, 4013, 4021, 4023, 4025-4031, 4033-4035, 4048, 4079-4085, 4098, 4099, 4128, 4171, 4172, 41964199, 4215, 4216, 4226, 4277, 4229, 4232, e 4233.

[00183] O segundo peptídeo, em um aspecto, compreende a estrutura de fórmula (XIV): X7001-X7002-X7003-X7004-X7005-X7006- [X7007-X7008-X7009-X7010-X7011-X7012-X7013-X7014-X7015- X7016-X7017-X7018]-X7019-X7020-X7021-X7022-X7023 (XIV) (SEQ ID NO: 3154). Na fórmula (XIV),

[00184] X7001 está presente ou ausente, pelo qual no caso X7001 está presente este é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, C(NEM), D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V e W, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, F, G, H, K, L e S;

[00185] X7002 está presente ou ausente, pelo qual no caso X7002 está presente este é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, C(NEM), D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em H, F, M e R;

[00186] X7003 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, F, I, K, L, R, S, T, V, W e Y, como F ou Y;

[00187] X7004 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V e W, como K;

[00188] X7005 é R ou W, como W;

[00189] X7006 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, H, I, K, L, R, V e W, como F ou H;

[00190] X7007 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Orn, homoK, C, Hcy, Dap e K, como C ou Hcy;

[00191] X7008 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, G, R, S e T, como A, G ou S;

[00192] X7009 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em a, A, I, K, L, M, m, Moo, Nle, p, R, SeM e V, como M, Sem, ou V;

[00193] X7010 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, G, I, K, L, P, R, S, T e V, como K, P ou R;

[00194] X7011 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D, E, G, S e T, como D;

[00195] X7012 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, a, D, d, E, e, F, f, G, I, K, k, L, l, M, m, Moo, Nle, nle, P, p, R, r, S, s, Sem, T, t, V, v, W e w, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, L, l, M e Sem;

[00196] X7013 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, C(NEM), Con, Con(Meox), D, d, E, e, Eag, F, G, I, K, L, N, R, S, s, T, V e W, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D, G, K e S;

[00197] X7014 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, M, R, S, T, V e W, como G;

[00198] X7015 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, M, Nle, R, S, T, V e W, como I ou T;

[00199] X7016 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, I, K, L, M, Moo, Nle, R, S, Sem T, V, W e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D, F, M, SeM e Y;

[00200] X7017 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V, W e Y, como S ou T;

[00201] X7018 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C e D, como C;

[00202] X7019 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, F, I, L, S, T, V e W, como A ou V;

[00203] X7020 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F e W, como W;

[00204] X7021 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em I, L e V, como V;

[00205] X7022 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, P, R, S, T, V e W, como o grupo que consiste em F, L, K, R, P e W;

[00206] X7023 está presente ou ausente, pelo qual no caso X7023 está presente este é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, C(NEM), Con, Con(Meox), D, E, Eag, F, G, I, K, L, R, S, T, V, W e Y, como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, F, M, S e Y; e o peptídeo compreende como uma estrutura cíclica gerada por uma ligação entre X7007 e X7018.

[00207] Alternativamente, o segundo peptídeo compreende a estrutura de qualquer uma das fórmulas (V)-(VII) descritas aqui. O segundo peptídeo, em algumas modalidades, compreende (ou consiste em) uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1001-1336. Enquanto peptídeos de fórmula (XIII) e fórmula (XIV) são referenciados aqui como primeiro e segundo peptídeos do complexo peptídico, peptídeos monoméricos tendo a estrutura de fórmula (XIII) ou fórmula (XIV) são também contemplados.

[00208] Exemplos de peptídeos de ligação a TFPI que se liga aos epítopos TFPI diferentes incluem JBT1857, um exemplo de classe de peptídeos JBT0047 (representado como, por exemplo, fórmulas (I)-(IV) e (XI) e exemplos dos quais são estabelecidos nas Figuras 32, 62, e 65), e JBT1837, um exemplo da classe de peptídeos JBT0120 (representado como, por exemplo, fórmulas (V)-(VII) e exemplos dos quais são estabelecidos na Figura 34). Assim, em um aspecto, a invenção fornece um complexo peptídico compreendendo uma subunidade de peptídeo (por exemplo, um primeiro peptídeo) compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 178 (JBT1857) ou SEQ ID NO: 4261 (JBT2548). Além disso, a invenção fornece um complexo peptídico compreendendo uma subunidade de peptídeo (por exemplo, um segundo peptídeo) compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 1044 (JBT1837). Dímeros de peptídeo de ligação ao TFPI exemplares incluem JBT2496 (SEQ ID NO: 4211), JBT2547 (SEQ ID NO: 4260), JBT2521 (SEQ ID NO: 4242), JBT2522 (SEQ ID NO: 4243), JBT2523 (SEQ ID NO: 4244), e JBT2533 (SEQ ID NO: 4250).

[00209] Em vários aspectos da divulgação, as subunidades de peptídeo (por exemplo, primeiro peptídeo e segundo peptídeo) do complexo peptídico são fundidas diretamente ou são ligadas por uma porção ligante. Por exemplo, o primeiro peptídeo e o segundo peptídeo são conjugados juntos por reação de uma porção reativa nucleofílica em um peptídeo com uma porção reativa eletrofílica em outro peptídeo ou por oxidação para formar um dissulfeto. Em modalidades exemplares, o primeiro e segundo peptídeos são ligados por uma ligação amida, como uma ligação amida que forma na reação de uma amina em um peptídeo com um grupo carboxil em outro peptídeo. Será apreciado que os peptídeos são opcionalmente derivados com um agente de derivatização antes da conjugação.

[00210] Em algumas modalidades, o primeiro peptídeo e o segundo peptídeo (e opcionalmente peptídeos adicionais) são ligados por uma porção ligante. Qualquer porção ligante é apropriada para uso no contexto do complexo peptídico. A porção ligante, em alguns aspectos da invenção, se une em ponte em uma distância de cerca de 1 Â a cerca de 100 Â, por exemplo, cerca de 5 Â a cerca de 80 Â (cerca de 5 Â a cerca de 50Â), cerca de 10 Â a cerca de 70 Â (cerca de 10 Â a cerca de 60 Â, cerca de 10 Â a cerca de 50 Â, cerca de 10 Â a cerca de 40 Â, ou cerca de 10 Â a cerca de 30 Â), em uma de suas conformações. Assim, o ligante é opcionalmente cerca de 1 Â a cerca de 100 Â em comprimento, por exemplo, cerca de 5 Â a cerca de 50Â ou cerca de 10 Â a cerca de 30 Â em comprimento em uma de suas conformações. Ligantes de comprimento maior (mais do que cerca de 100 Â) são também contemplados. Por exemplo, polímeros biocompatíveis, opcionalmente tendo um peso molecular de cerca de 2 kDa a cerca de 60 kDa, são também contemplados para uso no complexo peptídico. Exemplos de polímeros biocompatíveis incluem, entre outros, PEG, PSA, multímero prolina-alanina-serina, e hidroxietil amido.

[00211] Em um exemplo não limitante, a porção ligante é uma molécula com pelo menos dois grupos reativos (antes da conjugação ao primeiro e segundo peptídeos) capazes de reagir com cada um de primeiro peptídeo e o segundo peptídeo. Em algumas modalidades, a porção ligante tem apenas dois grupos reativos e é bifuncional. Os grupos reativos são ambos nucleofílicos, ambos eletrofílicos ou uma combinação de grupos reativos nucleofílicos e eletrofílicos. Combinações não limitantes de grupos reativos são mostradas na Figura 73. A porção ligante pode conter elementos estruturais que resultam de uma ligação química, como, por exemplo, cisteína, oxima, hidrazida, succinimida, tioéter, triazol, amina secundária, amida, dissulfeto. Em várias modalidades, a porção ligante é ligada ao primeiro peptídeo e/ou o segundo peptídeo via uma oxima, uma hidrazida, uma succinimida, um tioéter, um triazol, uma amina secundária, uma amida, ou um dissulfeto. Descrição adicional de porções ligantes e grupos reativos é fornecida na publicação de patente internacional No. WO 2011/143209, incorporada aqui por referência em sua totalidade.

[00212] Ligantes hidrofóbicos são ainda apropriados para uso no contexto da invenção. Ligantes hidrofóbicos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996), que é incorporado por referência em sua totalidade. As porções ligantes hidrofóbicas apropriadas incluem, por exemplo, ácido 8-hidroxioctanoico e ácido 8- mercaptooctanoico. As porções ligantes hidrofílicas como, por exemplo, polialquileno glicol, também são apropriados para uso no contexto da invenção. Em algumas modalidades, a porção ligante compreende uma cadeia de átomos de cerca de 1 a cerca de 60 átomos de comprimento. Em algumas modalidades, os átomos da cadeia são todos átomos de carbono. Em algumas modalidades, os átomos da cadeia na estrutura do ligante são selecionados do grupo que consiste em C, O, N, e S. Os átomos da cadeia e ligantes podem ser selecionados de acordo com suas solubilidades esperadas (hidrofilicidade) de modo a fornecer um complexo peptídico mais solúvel.

[00213] Em um aspecto, a porção ligante compreende a estrutura Z1- 20, em que Z é um bloco de construção de oligômero. Exemplos de blocos de construção de oligômero incluem, entre outros, um aminoácido, ácido hidróxi, etileno glicol, propileno glicol, ou uma combinação de qualquer um dos mesmos. Por exemplo, a porção ligante é opcionalmente um aminoácido, um dipeptídeo, um tripeptídeo, ou um polipeptídeo compreendendo 4-20 aminoácidos. Em algumas modalidades, Z é G, s, S, a, A, Bal, Gaba, Ahx, Ttds, ou uma combinação de qualquer um dos mesmos (como peptídeo dez-mer compreendendo A, S, ou uma combinação de A e S). Se desejado, a porção ligante compreende uma amina, éter, tioéter, maleimida, dissulfeto, amida, éster, alqueno, cicloalqueno, alquino, trizoila, carbamato, carbonato, catepsina B-clivável, ou hidrazona.

[00214] Os termos "primeiro peptídeo" e "segundo peptídeo" não pretendem significar uma ordem física particular dos peptídeos, mas meramente distinguir subunidades diferentes do complexo peptídico. As subunidades do complexo peptídico podem ser ligadas em qualquer um de um número de configurações contanto que o primeiro peptídeo e segundo peptídeo interajam com TFPI. Por exemplo, o C-terminal do primeiro peptídeo é conectado ao N-terminal do segundo peptídeo, o N- terminal do primeiro peptídeo é conectado ao C-terminal do segundo peptídeo, o N- ou C-terminal do primeiro (ou segundo) peptídeo é conectado a um ponto de ligação interno no segundo (ou primeiro) peptídeo, ou o primeiro e segundo peptídeos são conectados através de pontos de ligação internos (ou seja, pontos de ligação localizados dentro da sequência de aminoácidos do peptídeo e não em N- ou C- terminus). Pontos de ligação exemplares para uma porção ligante no primeiro peptídeo de fórmula (XIII) é o grupo amino N-terminal, o ácido carboxílico C-terminal, X6004, X6006, X60010, ou X60014 através de um grupo funcional apropriado na cadeia lateral de aminoácido, como, entre outros, amina, ácido carboxílico, tiol, alqueno, alquino, azida, carbonila, aminoóxi, hidrazina e halogênios. Mais do que um ligante pode ser usado, por exemplo, uma primeira porção ligante é ligada ao N-terminal do primeiro peptídeo e o C-terminal do segundo peptídeo, e uma segunda porção ligante (que pode ser o mesmo tipo de porção ou um tipo diferente de porção) é ligada em C-terminal do primeiro peptídeo e ligado ao N-terminal do segundo peptídeo. Enquanto a discussão de possíveis configurações refere-se ao primeiro e segundo peptídeos, será apreciado que peptídeos adicionais podem estar ligados ao primeiro e/ou segundo peptídeos como descrito aqui.

[00215] "Derivados" são incluídos na invenção e incluem peptídeos de ligação a TFPI que foram quimicamente modificados de alguma forma distinta a partir da adição, deleção ou substituição de aminoácidos. A este respeito, um peptídeo da invenção é aqui fornecido quimicamente ligado com polímeros, lipídeos, outras porções orgânicas, e/ou porções inorgânicas. Exemplos de modificações de peptídeos e de proteínas são dados em Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, (1996). Os peptídeos de ligação a TFPI aqui descritos, opcionalmente, compreendem um grupo funcional que facilita a conjugação com uma outra porção (por exemplo, uma porção de peptídeo). Exemplos de grupos funcionais incluem, mas não estão limitados a, derivados de hidrazina isotiocianato, isocianato, acil azida, éster de NHS, cloreto de sulfonila, aldeído, epóxido, oxirano, carbonato, agente de arilação, imidoéster, carbodi-imida, anidrido, derivados de haleto de alquila (por exemplo, derivados de haloacetila), maleimida, aziridina, derivados de acriloíla, agentes de arilação, reagentes de troca dissulfeto-tiol (por exemplo, dissulfuetos de piridila ou tiol TNB), diazoalcano, carboildi-imadazol, N,N'-Disuccinil-carbonato, e N-hidróxi- óxi-succinimidila cloroformato. O maleimida é útila, por exemplo, para a geração de um peptídeo de ligação a TFPI, que se liga à albumina in vivo.

[00216] Os derivados são preparados, em algumas situações para aumentar a solubilidade, estabilidade, absorção, ou a meia vida em circulação. Várias modificações químicas eliminam ou atenuam qualquer efeito secundário indesejável do agente. Em um aspecto, a invenção inclui os peptídeos de ligação a TFPI covalentemente modificados para incluir uma ou mais ligações de polímeros solúveis em água. Um polímero solúvel em água (ou outro radical químico) está ligado a qualquer resíduo de aminoácido, embora de fixação para o Nou C-terminal é preferível em algumas modalidades. Opcionalmente, um polímero é ligado ao peptídeo através de um ou mais aminoácidos ou blocos de construção que oferecem grupos funcionais que facilitam ligação do polímero. Por exemplo, JBT2315 compreende uma cisteína C-terminal (posição X4021 com respeito à fórmula geral (XI)), que facilita a adição de, por exemplo, um polietilenoglicol-maleimida (PEG). Os polímeros úteis incluem, mas não estão limitados a, PEG (por exemplo, PEG aproximadamente de 40 kD, 30 kD, 20 kD, 10 kD, 5 kD, ou 1 kD de tamanho), polioxietileno glicol, polipropileno glicol, monometóxi-óxi-polietileno glicol, dextrano, amido de hidroxietila, celulose, poli-(N-vinil-pirrolidona)-polietileno glicol, homopolímeros de propileno glicol, copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, ácido polisiálico (PSA), polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol) e álcool polivinílico, bem como misturas de qualquer um dos anteriores. Em um aspecto, o peptídeo da presente invenção é um peptídeo PEGligado. As porções de PEG estão disponíveis em diferentes formas, por exemplo, lineares ou ramificadas. Para uma discussão adicional de anexos de polímeros solúveis em água, ver Patente US 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192, e 4.179.337. Outros fragmentos úteis para melhorar a meia vida ou a estabilidade do peptídeo encontram-se descritos no presente documento e incluem, por exemplo, a albumina (opcionalmente modificada para permitir a conjugação com o peptídeo da invenção), cadeias de ácidos graxos (por exemplo, ácidos graxos C12-C18, tais como um ácido graxo C14), um anticorpo ou fragmento (por exemplo, uma porção Fc de um anticorpo), e multímeros de prolina-alanina-serina.

[00217] Em outro aspecto, um derivado de peptídeo inclui uma porção de direcionamento específica para um tipo particular de célula, tecido e/ou órgãos. Alternativamente, o peptídeo é ligado a uma ou mais porções químicas que facilitam a purificação, detecção, multimerização, ligação, com um parceiro de interação e caracterização da atividade do peptídeo. Uma porção química exemplar é a biotina. Outras porções adequadas para conjugação com o peptídeo de ligação a TFPI da presente invenção incluem, mas não estão limitadas a um fotossensibilizador, um corante, um corante fluorescente, um radionuclídeo, um complexo radionuclídeo contendo, uma enzima, uma toxina, e um agente citotóxico. Fotossensibilizadores incluem, por exemplo, Photofrin, Visudyne, Levulan, Foscan, Metvix, Hexvix®, Cysview™, Laserphyrin, Antrin, Photochlor, Photosens, Photrex, Lumacan, Cevira, Visonac, BF-200 ALA, e Amphinex. Se se desejar, um tag de His, um tag de FLAG, um tag de strep, ou um tag myc é conjugado com o peptídeo.

[00218] Além disso, em um aspecto, os peptídeos da presente invenção são acilados no aminoácido N-terminal do peptídeo. Em outro aspecto, os peptídeos da presente invenção são amidados no aminoácido C-terminal do peptídeo. Em ainda um outro aspecto, os peptídeos da presente invenção são acilados no aminoácido N-terminal do peptídeo e são amidados no aminoácido C- terminal do peptídeo.

[00219] Os derivados também incluem peptídeos compreendendo aminoácidos modificados ou não proteinogênicos, ou um grupo ligante modificado (ver, por exemplo, Grant, Synthetic Peptides: A User's Guide, Oxford University Press (1992)). Aminoácidos modificados incluem, por exemplo, os aminoácidos em que o grupo amino e/ou carboxil é substituído por um outro grupo. Exemplos não limitativos incluem aminoácidos modificados incorporando tioamidas, ureias, tioureias, acilhidrazidas, ésteres, olefinas, sulfonamidas, amidas de ácidos fosfóricos, álcoois, cetonas, amidas de ácido borônico, benzodiazepinas e outros heterociclos aromáticos ou não aromáticos (ver Estiarte et al., Burgers Medicinal Chemistry, 6th edition, Volume 1, Part 4, John Wiley & Sons, New York (2002)). Aminoácidos modificados são muitas vezes ligados ao peptídeo com pelo menos um dos grupos funcionais acima mencionados, em vez de uma ligação amida. Aminoácidos não proteinogênicos incluem, mas não estão limitados, a β-alanina (Bal), norvalina (Nva), norleucina (Nle), ácido 4-aminobutírico (Y-Abu), 2-aminoisobutírico (Aib), ácido 6-aminohexanoico (ε-Ahx), ornitina (Orn), hidroxiprolina (Hyp), taurina, sarcosina, citrulina (Cit), ácido cisteico (Coh), ciclo-hexilalanina (Cha), metioninassulfóxido (Meo), metioninasulfona (Moo), homosserinametiléster (Hsm), propargilglicina (Eag), 5-fluortriptofano (5Fw), 6-fluortriptofano (6Fw), 3',4'-dimetoxifenil-alanina (Ear), 3',4'-difluorfenilalanina (Dff), 4'-f luorofenil-alanina (Pff), 1-naftil-alanina (1Ni), 1-metiltriptofano (1 Mw), penicilamina (Pen), homosserina (Hse), t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina (Phg), benzotienilalanina (Bta), L-homo-cisteína (Hcy), N- metil-fenilalanina (Nmf), 2-tienilalanina (Thi), 3,3-difenilalanina (Ebw), homofenilalanina (Hfe) e S-benzil-L-cisteína (Ece). As estruturas de muitos dos aminoácidos não proteinogênicos são fornecidas na Tabela 2. Estes e outros aminoácidos não proteinogênicos podem existir como isômero D- ou L-. Exemplos de ligantes modificados incluem, mas não estão limitados a, o ligante flexível 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodiamina (TTDS), glicina, ácido 6-amino-hexanoico, beta-alanina (Bal), ácido pentinoico (Pyn), e combinações de Ttds, glicina, ácido 6-amino- hexanoico e Bal.

[00220] Homólogos dos aminoácidos que constituem os peptídeos da presente invenção podem ser como apresentados na Tabela 3. Em qualquer modalidade, um ou mais aminoácidos do peptídeo de ligação a TFPI são substituídos com um homólogo.

[00221] Os derivados também incluem peptídeos que compreendem aminoácidos tendo substituintes modificados, tais como os aminoácidos modificados por halogenação com, por exemplo, flúor, cloro, iodo ou bromo. Em algumas modalidades, o peptídeo de ligação a TFPI compreende um aminoácido aromático halogenado, tal como fenilalanina.

[00222] Em algumas modalidades, as ligações de peptídeo (CO-NH) que unem os aminoácidos dentro do peptídeo da invenção são invertidas para criar um peptídeo "retro-modificado", isto é, um peptídeo compreendendo os resíduos de aminoácidos reunidos na direção oposta (ligações NH-CO) em comparação com o peptídeo de referência. O peptídeo retro-modificado compreende a mesma quiralidade do aminoácido que o peptídeo de referência. Um peptídeo "inverso modificado" é um peptídeo da invenção, que compreende resíduos de aminoácidos reunidos na mesma direção como um peptídeo de referência, mas a quiralidade dos aminoácidos é invertida. Assim, quando o peptídeo de referência compreende L-aminoácidos, o peptídeo "inverso modificado" inclui D-aminoácidos, e vice-versa. Os peptídeos inversos modificados compreendem ligações peptídicas CO- NH. Um peptídeo "retro-inverso modificado" refere-se a um peptídeo compreendendo os resíduos de aminoácidos reunidos na direção oposta e que têm quiralidade invertida. Um análogo retro-inverso tem terminais invertidos e direção invertida de ligações peptídicas (isto é, NH-CO), enquanto que aproximadamente mantendo a topologia da cadeia lateral encontrada no peptídeo de referência. Os peptidomiméticos retro-inversos são feitos usando métodos padrões, incluindo os métodos descritos em Meziere et al, J. Immunol., 159, 3230-3237 (1997), incorporado aqui por referência. Os peptídeos retro- inversos parciais são peptídeos em que apenas uma parte da sequência de aminoácidos é invertida e substituída com resíduos de aminoácidos enantioméricas.

[00223] Os peptídeos de ligação a TFPIs da invenção (incluindo peptídeos inibidores de TFPI) são feitos de uma variedade de maneiras. Em um aspecto, os peptídeos de são sintetizados por meio de técnicas de síntese em fase sólida, incluindo os descritos em Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, 2149 (1963); Davis et al., Biochem. Intl., 10, 394-414 (1985); Larsen et al., J. Am. Chem. Soc., 115, 6247 (1993); Smith et al., J. Peptide Protein Res., 44, 183 (1994); O'Donnell et al., J. Am. Chem. Soc., 118, 6070 (1996); Stewart e Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman (1969); Finn et al., The Proteins, 3° ed., vol. 2, pp. 105-253 (1976); e Erickson et al., The Proteins, 3° ed., vol. 2, pp. 257527 (1976). Alternativamente, o peptídeo de ligação a TFPI (por exemplo, o peptídeo inibidor de TFPI) é expresso de forma recombinante através da introdução de um ácido nucleico codificando um peptídeo de ligação a TFPI (por exemplo, um peptídeo inibidor de TFPI) em células hospedeiras, que são cultivadas para expressar o peptídeo. Tais peptídeos são purificados a partir da cultura de células utilizando técnicas de purificação de proteínas.

[00224] A invenção também abrange um ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um peptídeo da invenção. Os métodos de preparação de molécula de DNA e/ou RNA são bem conhecidos na técnica. Em um aspecto, a molécula de DNA/RNA que codifica um peptídeo aqui fornecido é gerada utilizando técnicas de síntese de química e/ou reação em cadeia com polimerase (PCR). Se desejado, uma sequência de codificação de peptídeo é incorporada em um vetor de expressão. Um vulgar versado na técnica apreciará que qualquer um de uma série de vetores de expressão conhecidos na técnica é adequado no contexto da presente invenção, tais como, mas não se limitando a, plasmídeos, complexos de plasmídeo-lipossoma, e vetores virais. Qualquer um destes vetores de expressão é preparado utilizando técnicas padrões de DNA recombinante descritas em, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates e John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994). Opcionalmente, o ácido nucleico é operativamente ligado a uma ou mais sequências reguladoras, tais como um promotor, ativador, potencializador, sinal de cap, sinal de poliadenilação, ou outro sinal envolvido com o controle de transcrição ou tradução.

[00225] Qualquer um dos peptídeos da presente invenção (ou complexos peptídicos) ou ácidos nucleicos que codificam os peptídeos também é fornecido em uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica). A este respeito, o peptídeo (ou complexo peptídico) é formulado com um (isto é, farmacologicamente aceitável), carreador, tampão, excipiente ou diluente fisiologicamente aceitável tal como descrito mais adiante. Opcionalmente, o peptídeo está na forma de um sal fisiologicamente aceitável, o qual é abrangido pela invenção. "Sais fisiologicamente aceitáveis" significam quaisquer sais que são farmaceuticamente aceitáveis. Alguns exemplos de sais apropriados incluem o acetato, o cloridrato, bromidrato, sulfato, citrato, tartarato, glicolato e oxalato. Se desejado, a composição compreende um ou mais agentes farmaceuticamente eficazes adicionais.

[00226] O peptídeo aqui fornecido opcionalmente inibe pelo menos uma atividade de TFPI-1 (por exemplo, o TFPI-1a ou TFPI-1β), tais como, mas não limitado a, uma atividade infrarregula a cascata de coagulação do sangue. Sem ser limitado por qualquer mecanismo de ação específico, de um mecanismo proposto para a inibição pode envolver a prevenção da formação do complexo quaternário TF-FVIIa- FXA-TFPI. O peptídeo pode inibir a ligação (ou competitivamente alostericamente) de TFPI a FXa (por exemplo, inibem a ligação do domínio Kunitz de TFPI 2 para o Fator Xa ou interrompe a ligação de domínio de TFPI Kunitz 1 para um exosítio do Fator Xa), o complexo TF/FVIIa (por exemplo, inibe a ligação do domínio Kunitz de TFPI 1 para o complexo TF/FVIIa), TF individualmente, e/ou FVIIa individualmente. Com a atividade de TFPI reduzido, TF e FVIIa estão livres para ativar FX que, por sua vez, potencializa a conversão da protrombina em trombina. Surpreendentemente, em uma modalidade, o peptídeo da presente invenção, que se liga a um domínio Kunitz 1 interfere com a inibição mediada por TFPI de FXa. Assim, a invenção fornece um método de, por exemplo, inibir a infrarregulação mediada por TFPI da via extrínseca e/ou comum da cascata de coagulação e/ou potencialização da conversão mediada por FXa da protrombina em trombina, através da administração a um sujeito de um peptídeo aqui descrito que se liga ao domínio Kunitz 1.

[00227] Em um aspecto, o peptídeo da presente invenção exibe atividade antagonística de TFPI no modelo e/ou sistemas plasmáticos. Um sistema de modelo exemplar para a determinação da atividade inibidora TFPI é o ensaio de tenase extrínseca, que testa a capacidade dos peptídeos candidatos para restaurar a ativação de FX mediada por complexo extrínseco na presença de TFPI (que é um inibidor natural da reação de ativação de FX) (ver, por exemplo, Lindhout et al., Thromb. Haemost., 74, 910-915 (1995)). Um outro sistema de modelo para a caracterização de atividade inibidora de TFPI é o ensaio de inibição de FXa, em que a atividade de FXa é medida na presença de TFPI (ver Sprecher et al., PNAS, 91, 3353-3357 (1994)). O ensaio de tenase extrínseca e o ensaio de inibição de FXa são adicionalmente descritos no Exemplo 3. Opcionalmente, o peptídeo da presente invenção potencializa a ativação de FX na presença de TFPI com uma concentração eficaz da metade máxima (EC50) de menos que ou igual a 1 x 10-4 M, menos que ou igual a 1 x 10-5 M, menos que ou igual a 1 x 10-6 M, ou menos que ou igual a 1 x 10-7 M.

[00228] Em um aspecto, atividade agonística de TFPI é caracterizada por um ensaio baseado em plasma. A formação de trombina é desencadeada no plasma substancialmente sem atividade de FVIII ou FIX (por exemplo, a atividade de fator de coagulação residual é inferior a 1%), na presença de um peptídeo candidato. A formação de trombina pode ser detectada usando um substrato cromogênico ou fluorgênico, tal como descrito no Exemplo 4. Um sistema para medir a atividade da trombina é fornecido por Thrombinoscope BV (Maastricht, The Netherlands). Conversão de protrombina é medida usando, por exemplo, um Thrombograph™ (Thermo Scientific, Waltham, MA), e os dados resultantes são compilados em um Trombograma Calibrado Automático gerado por software de Thrombinoscope™ disponível a partir de Thrombinoscope BV. Em certas modalidades, o peptídeo inibidor de TFPI aumenta a quantidade de pico de trombina gerada durante o ensaio e/ou reduz o tempo necessário para conseguir a formação de pico de trombina. Por exemplo, o peptídeo melhora a geração de trombina regulada por TFPI na ausência de FVIII (por exemplo, em plasma com depleção de FVIII) para, pelo menos, 1% do nível de geração de trombina dependente de TFPI no plasma normal. Geralmente, o plasma normal (não afetado) contém cerca de 0,5 U/mL a cerca de 2 U/mL de Fator VIII. Por conseguinte, em alguns casos, um peptídeo de ligação a TFPI (por exemplo, peptídeo inibidor de TFPI) vai potencializar a formação de trombina na ausência de FVIII para pelo menos cerca de 1% da observada na presença de 0,5 U/mL a 2 U/mL de FVIII. Em outras modalidades, o peptídeo potencializa a formação de trombina na ausência de Fator VIII para, pelo menos, cerca de 2%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 7%, ou pelo menos cerca de 10% do nível de formação de trombina no plasma normal, isto é, na presença de níveis fisiológicos de fator VIII. Em diversos aspectos, o peptídeo é administrado a um modelo animal com deficiência da trombina ou hemofilia para caracterizar a atividade inibidora de TFPI in vivo. Tais modelos in vivo são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, os camundongos administrados com anticorpos anti-FVIII para induzir a hemofilia A (Tranholm et al., Blood, 102, 36153620 (2003)); modelos de knock-out de fator de coagulação, tais como, mas não limitados a, camundongos de knock-out de FVIII (Bi et al., Nat. Genet., 10(1), 119-121 (1995)) e camundongos de knock-out de FIX (Wang et al., PNAS, 94(21), 11563-66 (1997)); hemofilia A induzida em coelhos (Shen et al., Blood, 42(4), 509-521 (1973)); e cães Chapel Hill HA (Lozier et al., PNAS, 99, 12991-12996 (2002)).

[00229] Vários peptídeos ligam TFPI a partir de qualquer fonte, incluindo, mas não limitado a camundongo, rato, coelho, cão, gato, vaca, cavalo, porco, porquinho da índia, e primatas. Em uma modalidade, o peptídeo liga-se a TFPI humano. Opcionalmente, o peptídeo de ligação a TFPI (por exemplo, peptídeo inibidor de TFPI) liga-se ao TFPI a partir de mais de uma espécie (isto é, o peptídeo é de reação cruzada entre as múltiplas espécies). Em certos aspectos, o peptídeo liga-se ao TFPI com uma constante de dissociação (KD) de menos que ou igual a 1 x 10-4 M, menos que ou igual a 1 x 10-5 M, menos que ou igual a 1 x 10-6 M, ou menos que ou igual a 1 x 10-7 M. A afinidade pode ser determinada utilizando, por exemplo, e sem limitação, qualquer uma, duas, ou mais de uma variedade de técnicas, tais como ensaio de ELISA por afinidade, um ensaio de ELISA competitivo, e/ou ensaio de ressonância de plasma de superfície (BIAcore™). Quando caracterizada utilizando um ensaio de ELISA de competição (IC50), o peptídeo da presente invenção, opcionalmente, demonstra um IC50 de menos que ou igual a cerca de 50.000 nM. Por exemplo, o peptídeo demonstra um IC50 de menos que ou igual a cerca de 10.000 nM, tal como um IC50 de menos que ou igual a cerca de 5.000 nM, menos que ou igual a cerca de 1.000 nM, ou menos que ou igual a cerca de 500 nM. Em um aspecto, o peptídeo demonstra um IC50 de menos que ou igual a cerca de 250 nM, menos que ou igual a cerca de 100 nM, menos que ou igual a cerca de 50 nM, ou menos que ou igual a cerca de 10 nM. Peptídeos exemplares e seus valores de IC50 são fornecidos nas Figuras 32-39; em alguns casos, os peptídeos são classificados em Grupos A, B, C, D, E, F e G (ver Tabela 4 no Exemplo 1) com base em seus valores de IC50. Em vários aspectos, a invenção fornece peptídeos que fazem parte dos Grupos A, B, C, D, E, F, e/ou G como definido na tabela 4. A afinidade pode também ser determinada por um método cinético ou um método de equilíbrio/solução. Tais métodos são descritos em mais detalhe aqui ou conhecidos na técnica.

[00230] Um outro ensaio adequado para a caracterização dos peptídeos da invenção é um ensaio de koff, que examina a liberação de um peptídeo a partir do TFPI. O resultado do ensaio de koff não é a taxa de constante de dissociação, mas a porcentagem de peptídeo competidor bloqueado da ligação a TFPI por um peptídeo de teste após um período de incubação com TFPI. Um ensaio exemplar koff inclui as seguintes etapas: 1) incubação de uma placa de microtitulação revestida com TFPI com uma quantidade de peptídeo de teste, resultando em aproximadamente 90% ocupação de TFPI, 2) remoção do peptídeo de teste não ligado, 3) adição de um peptídeo traçador biotinilado (isto é, competidor) que compete com o peptídeo de teste para a ligação a TFPI, e 4) incubação por um período de tempo durante o qual os sítios de ligação divulgados pelo peptídeo de teste são ocupados pelo traçador, 5) remoção de um traçador não ligado e peptídeo de teste; e 6) detecção do traçador ligado por uma reação cromogênica usando conjugado de estreptavidina- peroxidase de rábano. O sinal resultante é indicativo de sítios de ligação livres do peptídeo de teste. Um peptídeo de teste que não se dissocia de TFPI durante o período de incubação produz um sinal mais fraco em comparação com um analito que se dissocia completamente.

[00231] Tal como acontece com todos os agentes de ligação e ensaios de ligação, um versado na técnica reconhece que as várias porções as quais um agente de ligação não deve se ligar de forma detectável, a fim de ser biologicamente (por exemplo, terapeuticamente) eficaz seriam exaustivas e impraticáveis de listar. Portanto, o termo "liga especificamente" refere-se à capacidade de um peptídeo se ligar a TFPI com afinidade maior do que se liga a uma proteína de controle não relacionada, que não é TFPI. Por exemplo, o peptídeo pode ligar-se a TFPI com uma afinidade que é pelo menos, 5, 10, 15, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, ou 10000 vezes maior do que a afinidade de uma proteína de controle. Em algumas modalidades, o peptídeo liga-se a TFPI com afinidade maior do que se liga a um "anti-alvo", uma proteína ou outra substância que ocorre naturalmente em humanos cuja ligação do peptídeo pode conduzir a efeitos adversos. Várias classes de peptídeos ou proteínas são potenciais anti-alvos. Devido aos peptídeos inibidores de TFPI exercem a sua atividade no fluxo de sangue e/ou no endotélio, as proteínas plasmáticas representam potenciais anti-alvos. As proteínas que contêm domínios Kunitz (KDS) são potenciais anti-alvos por KDs de diferentes proteínas compartilham uma semelhança significativa. Inibidor da Via do Fator Tecidual-2 (TFPI-2) é muito semelhante ao TFPI-1α e, como TFPI-1α contém KDs (Sprecher et al., PNAS, 91, 3353-3357 (1994)). Assim, em um aspecto, o peptídeo da presente invenção liga-se a TFPI com uma afinidade que é pelo menos 5, 10, 15, 25, ou 50 vezes maior do que a afinidade para um anti-alvo, tais como o TFPI-2.

[00232] Opcionalmente, o peptídeo de ligação a TFPI demonstra uma ou mais características desejadas aqui descritas, e a sequência de aminoácidos de um peptídeo pode ser modificada para otimizar a estabilidade, a ligação e/ou atividade, se desejado. Um peptídeo de ligação a TFPI exemplar liga-se a TFPI com um KD de menos que ou igual a 20 nM e/ou apresenta uma afinidade de ligação para o TFPI que é pelo menos 100 vezes maior do que a afinidade de ligação para um anti-alvo. Alternativamente ou em adição, o peptídeo de ligação a TFPI potencializa a ativação de FX na presença de TFPI com um EC50 (conforme medido utilizando qualquer ensaio adequado, tal como os ensaios descritos aqui) de menos do que ou igual a 50 nM e/ou potencializa a formação de trombina na ausência de Fator VIII para, pelo menos, cerca de 20% (por exemplo, 40%) do nível de formação de trombina no plasma contendo níveis fisiológicos de Fator VIII. Alternativamente ou em adição, o peptídeo de ligação a TFPI alcança o nível desejado de estabilidade do plasma (por exemplo, 50% ou mais de uma dose permanece no plasma após 12 horas) e/ou demonstra uma meia vida in vivo desejada (por exemplo, de pelo menos duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez horas). Alternativamente ou em adição, o peptídeo de ligação a TFPI apresenta um nível desejado de biodisponibilidade, tal como um nível desejado de biodisponibilidade após administração subcutânea (por exemplo, maior que ou igual a 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, ou 50%) e/ou demonstra um nível desejado de atividade inibidora de TFPI a uma dada dose in vivo.

[00233] A invenção inclui ainda um método de inibição de TFPI-1. O método compreende o contato de TFPI com um peptídeo de ligação a TFPI conforme aqui descrito. Qualquer grau de inibição de atividade de TFPI é contemplado. Por exemplo, um peptídeo de ligação a TFPI (por exemplo, peptídeo inibidor de TFPI) reduz a inibição de TFPI da via extrínseca em pelo menos cerca de 5% (por exemplo, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 25%, ou pelo menos cerca de 30%). Em algumas modalidades, o peptídeo de ligação a TFPI (por exemplo, peptídeo inibidor de TFPI) reduz a atividade de TFPI dentro da via extrínseca, em pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75% ou, pelo menos cerca de 90% em relação a atividade de TFPI na ausência do peptídeo.

[00234] Em um aspecto da invenção, os peptídeos de ligação a TFPI são utilizados para detectar e/ou quantificar TFPI in vivo ou in vitro. Um método exemplar de detecção e/ou quantificação de TFPI em uma amostra compreende (a) contatar uma amostra com um peptídeo de ligação a TFPI da invenção, e (b) detectar a ligação do peptídeo de ligação a TFPI para TFPI.

[00235] A invenção inclui ainda um método para direcionamento de estruturas biológicas (incluindo, mas não limitadas a superfícies das células e revestimento endoteliais) onde o TFPI está situado. O método compreende o contato da estrutura biológica (por exemplo, incluindo, sem limitação, uma célula de exibição de TFPI na superfície da célula), com um peptídeo de ligação a TFPI aqui descrito, opcionalmente conjugado a uma porção que adiciona funcionalidade adicional para o peptídeo. A porção pode ser um corante (tal como um corante fluorescente), um radionuclídeo ou um complexo de radionuclídeo contendo, uma proteína (por exemplo, uma enzima, uma toxina, ou um anticorpo) ou um agente citotóxico. Por exemplo, o peptídeo é ligado ou conjugado a uma porção efetora que facilita a detecção dos peptídeos e/ou a purificação e/ou compreende propriedades terapêuticas. Em um aspecto, o conjugado de peptídico ou o peptídeo de ligação a TFPI é administrado a um mamífero para ter como alvo uma célula de exibição de TFPI dentro do mamífero. Opcionalmente, o método compreende ainda a detecção da ligação do peptídeo de ligação a TFPI para TFPI. O método é útil para o diagnóstico e terapia de doenças em que o TFPI é um marcador de diagnóstico adequado para o ou as células expressando TFPI são alvos para uma abordagem terapêutica.

[00236] Os complexos de peptídeo-TFPI são diretamente ou indiretamente detectados. As porções de detecção são amplamente utilizadas na técnica, para identificar substâncias biológicas e incluem, por exemplo, corantes (por exemplo, o corante fluorescente), radionuclídeos e complexos contendo radionuclídeo, e enzimas. Em alguns aspectos, o peptídeo de ligação a TFPI é detectado indiretamente. A este respeito, o peptídeo é, opcionalmente, contatado com um parceiro de interação que se liga ao peptídeo da invenção sem interferir significativamente com a ligação de peptídeo-TFPI, e o parceiro de interação é detectado. Os parceiros de interação exemplares incluem, mas não estão limitados a anticorpos, fragmentos de anticorpos de ligação ao antígeno, anticalinos e miméticos de anticorpos, aptâmeros, estreptavidina, avidina, neutravidina e spiegelmers. Opcionalmente, o parceiro de interação compreende uma unidade de detecção para facilitar a detecção de um complexo de parceiro de interação-peptídeo. O peptídeo de ligação a TFPI é, em algumas modalidades, modificado para facilitar a ligação de um parceiro de interação. Por exemplo, em um aspecto, o peptídeo de ligação a TFPI é conjugado com biotina, que é ligado por um parceiro de interação que compreende estreptavidina. Um parceiro de interação exemplar compreende estreptavidina fundida com peroxidase de rábano, a qual é detectada em, por exemplo, um ensaio de ELISA semelhante. Alternativamente, o peptídeo de ligação a TFPI é modificado para incluir um epítopo de anticorpo, e a ligação do anticorpo correspondente ao complexo de peptídeo-TFPI é detectada. Os métodos de detecção, por exemplo, de anticorpos e fragmentos dos mesmos, são bem conhecidos na técnica.

[00237] Os complexos de peptídeo-TFPI e complexos de peptídeo- parceiro de interações são identificados utilizando qualquer um de uma série de métodos, tais como, mas não limitados a, ensaios bioquímicos (por exemplo, ensaios enzimáticos), espectroscopia (por exemplo, detecção com base na densidade óptica, fluorescência, FRET, BRET, TR-FRET, a polarização de fluorescência, eletroquimioluminescência, ou RMN), tomografia por emissão de pósitrons (PET), e Tomografia Computadorizada por Emissão de Fóton Único (SPECT). As porções detectáveis que facilitam a detecção de fluorescência de complexos de peptídeo-TFPI ou complexos de peptídeo-parceiro de interação incluem, mas não estão limitadas a, fluoresceína, Alexa Fluor® 350, Marina Blue™, Cascade Yellow™, Alexa Fluor® 405, Pacific Blue™, Pacific Orange™, Alexa Fluor® 430, Alexa Fluor® 488, Oregon Green® 488, Alexa Fluor® 500, Oregon Green® 514, Alexa Fluor® 514, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 555, Tetrametilrodamina, Alexa Fluor® 546, Rhodamine B, Rhodamine Red™-X, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Texas Red®, Texas Red®-X, Alexa Fluor® 610, Alexa Fluor® 633, Alexa Fluor® 635, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, Alexa Fluor® 700, Alexa Fluor® 750, B-Ficoeritrina, R-Ficoeritrina, Aloficocianina, BODIPY®, Cy3, Cy5, TAMRA, e proteínas fluorescentes (GFP e derivados dos mesmos). Um exemplo de um peptídeo de ligação a TFPI compreendendo uma porção de detecção fluorescente é JBT2454 (FAM-Ttds- FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKL-NH2 (SEQ ID NO: 4171)), que é marcada com 5,6-carboxifluoresceina.

[00238] Marcadores radioativos também são utilizados para detectar materiais biológicos (por exemplo, TFPI, peptídeo de ligação a TFPIs, ou complexos de peptídeo de ligação a TFPI-TFPI), e, em alguns casos, são ligados aos peptídeos ou parceiros de interação usando um quelante, tal como (mas não limitado a) EDTA (ácido etileno diamina tetra-acético), DTPA (ácido dietileno triamina penta-acético), CDTA (ácido ciclo-hexil 1,2-diamina tetra-acético), EGTA (etilenoglicol-O,O'- bis(2-aminoetil)-N,N,N',N'-tetra-acético), HBED (ácido N,N- bis(hidroxibenzil)-etilenodiamina-N,N'-diacético), TTHA (ácido trietileno tetramina hexa-acético), DOTA (ácido 1,4,7,10-tetr-azaciclododecano- N,N',N'',N"'-tetra-acético), HEDTA (ácido hidroxietildiamina triacético), ou TETA (ácido l,4,8,ll-tetra-azaciclotetradecano-N,N',N",N''' -tetra- acético). Exemplos de marcadores radioativos incluem 99mTc, 203Pb, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 72As, 111In, 113mIn, 114mIn, 97Ru, 62Cu, 64Cu, 52Fe, 52mMn, 51Cr, 186Re. 188Re, 77As, 90Y, 67Cu, 169Er, 117mSn, 121Sn, 127Te, 142Pr, 143Pr, 198Au, 199Au, 149Tb, 161Tb, 109Pd, 165Dy, 149Pm, 151Pm, 153Sm, 157Gd, 166Ho, 172Tm, 169Yb, 175Yb, 177Lu, 105Rh e 111Ag. Metais paramagnéticos também são porções detectáveis que são suscetíveis à peptídeos de ligação a TFPI ou parceiros de interação, opcionalmente através de complexo quelante. Exemplos de metais paramagnéticos incluem, por exemplo, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Pr, Nd, Sm, Yb, Gd, Tb, Dy, Ho e Er.

[00239] Os peptídeos de ligação a TFPIs, por si sós, são, em alguns aspectos, modificados para incluir um ou mais aminoácidos com substituintes ou nuclídeos detectáveis. A este respeito, em uma modalidade, o peptídeo de ligação a TFPI compreende pelo menos um aminoácido compreendendo um isótopo detectável (por exemplo, 13C, 14C, 35S, 3H, 18O ou 15N), e/ou um aminoácido que é halogenado com, por exemplo, 123I, 124I, 125I, 131I, 75Br, 76Br, 77Br ou 82Br. Aminoácidos adequados para halogenação incluem, mas não estão limitados a Tirosina e Triptofano.

[00240] A invenção também fornece um método para o diagnóstico de um sujeito que sofre de uma doença ou distúrbio, ou está em risco de sofrer de uma doença ou distúrbio, em que a doença ou distúrbio é associado com, ou causado por atividade de TFPI aberrante. O método compreende a administração ao sujeito do peptídeo de ligação a TFPI e detecção do complexo de TFPI-peptídeo. Em alguns casos, o peptídeo é conjugado com uma porção detectável, e o método compreende detectar a porção detectável. Exemplos de porções detectáveis são descritas aqui. Em outros casos, o método compreende a administração ao sujeito de um parceiro de interação de peptídeo de ligação a TFPI que se liga ao peptídeo de ligação a TFPI, e detecção do parceiro de interação. Se desejado, o parceiro de interação compreende ou é conjugado com uma porção detectável, e a porção detectável é detectada. A presença da porção detectável indica a presença de TFPI, permitindo, assim, o diagnóstico de uma doença ou distúrbio associado com TFPI (por exemplo, uma doença ou distúrbio, que (i) pode ser tratada pela inibição de TFPI ou (ii) compreende os sintomas que podem ser melhorados ou prevenidos por inibição de TFPI). Se a administração do peptídeo para o sujeito não é desejada, uma amostra biológica é obtida a partir do sujeito, contatado com o peptídeo de ligação a TFPI conforme aqui descrito, e os complexos de TFPI-peptídeo são detectados.

[00241] Os peptídeos da invenção se ligam a TFPI e, portanto, são úteis para a purificação de TFPI ou TFPI recombinante a partir de uma amostra biológica (por exemplo, um fluido biológico, como por exemplo soro), o extrato de fermentação, preparações de tecido, meio de cultura, e semelhantes. A invenção inclui métodos para o uso do peptídeo de ligação a TFPI na produção comercial de TFPI ou em um método para caracterizar moléculas de TFPI. Por exemplo, a invenção inclui um método de purificação de TFPI. O método compreende o contato de uma amostra contendo TFPI com um peptídeo como aqui definido, em condições apropriadas para formar um complexo entre TFPI e o peptídeo; remoção do complexo da amostra, bem como, opcionalmente, a dissociação do complexo para liberar TFPI. Exemplos de condições apropriadas para formar um complexo entre TFPI e o peptídeo são divulgados nos exemplos e, tais condições, podem ser facilmente modificadas para dissociar o complexo de TFPI-peptídeo. Em algumas modalidades, o peptídeo é imobilizado a um suporte, por exemplo, um suporte sólido, para facilitar a recuperação de TFPI. Por exemplo, em uma modalidade, o peptídeo é imobilizado para fase estacionária de cromatografia (por exemplo, sílica, contas de cromatografia de afinidade, ou resinas de cromatografia), uma amostra de TFPI é aplicada à fase estacionária tal que os complexos de TFPI-peptídeo são formados, sendo o restante da amostra removido a partir da fase estacionária, e o TFPI é eluído a partir da fase estacionária. A este respeito, os peptídeos da presente invenção são, em um aspecto, adequados para uso em técnicas de cromatografia de afinidade.

[00242] Um método para potencializar a formação de trombina em um sujeito com deficiência de fator de coagulação também é fornecido. O método compreende a administração ao sujeito de um peptídeo aqui fornecido em condições eficazes para inibir o TFPI. A este respeito, o peptídeo de ligação a TFPI (por exemplo, peptídeo inibidor de TFPI) é administrado em uma quantidade e em condições eficazes para potencializar a formação de trombina no sujeito. Por "deficiente de fator de coagulação" entende-se que o sujeito sofre de uma deficiência de um ou mais fatores sanguíneos necessários para a formação de trombina, tais como o FVIII, FIX ou FXI. De fato, em uma modalidade, o sujeito é deficiente em FVIII. Alternativamente ou em adição, o sujeito é deficiente em Fator IX. As deficiências em fatores de coagulação são identificadas por análise da quantidade de fator em uma amostra clínica. Praticantes classificam hemofilia de acordo com a magnitude da deficiência do fator de coagulação. Sujeitos que sofrem de hemofilia leve têm aproximadamente 5% a 30% da quantidade normal (1 U/mL) de fator VIII ou fator IX. A hemofilia moderada é caracterizada por cerca de 1% a 5% dos níveis normais de Fator VIII, Fator IX, ou Fator XI, enquanto que indivíduos que sofrem de hemofilia grave têm menos de 1% da quantidade normal de Fator VIII, Fator IX, ou Fator XI. As deficiências podem ser identificadas indiretamente por teste de tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT). Testes de APTT medem a duração de tempo necessária para um coágulo de sangue se formar, que é maior em pacientes com deficiência de Fator VIII (hemofilia A), deficiência de Fator IX (hemofilia B), e deficiência de Fator XI (hemofilia C) em comparação com pacientes com níveis de fator de coagulação normais. Quase 100% dos pacientes com deficiência do Fator VIII de severa e moderada podem ser diagnosticados com um APTT. A invenção inclui ainda potencialização da formação de trombina em um sujeito que não sofre de uma deficiência do fator de coagulação. O método compreende a administração a um sujeito (por exemplo, um sujeito que compreende níveis fisiológicos, normais, de fator de coagulação) de um peptídeo aqui fornecido em condições eficazes para potencializar a formação de trombina.

[00243] Em um aspecto, o peptídeo de ligação a TFPI (por exemplo, peptídeo inibidor de TFPI) é utilizado para aumentar a formação de coágulos do sangue em um sujeito. O método de aumento da formação de coágulos do sangue compreende a administração ao sujeito de um peptídeo aqui descrito, em uma quantidade e em condições eficazes para aumentar a formação de coágulos de sangue. Será apreciado que o método não necessita restaurar completamente a cascata de coagulação para alcançar um efeito benéfico (por exemplo, terapêutico). Qualquer potencialização ou aumento de trombina ou da formação de coágulos do sangue, que reduz o aparecimento ou a gravidade dos sintomas associados à deficiência do fator de coagulação é contemplado. Os métodos para determinar a eficácia do método para promover a formação de trombina e a coagulação do sangue são conhecidos na técnica e aqui descritos.

[00244] A invenção inclui ainda um método de tratamento de um distúrbio da coagulação do sangue em um sujeito, o método compreendendo a administração ao sujeito de um ou mais peptídeos de ligação a TFPI (ou complexos peptídicos), tais como qualquer um ou mais dos peptídeos aqui descritos, em uma quantidade e em condições eficazes para tratar o distúrbio de coagulação do sangue no sujeito. Em um aspecto, o peptídeo é um peptídeo sintético ou recombinante que inibe a atividade de TFPI. "O distúrbio de coagulação" inclui distúrbios hemorrágicos causados por atividade do fator de coagulação do sangue deficiente e a atividade plaquetária deficiente. Fatores de coagulação de sangue incluem, mas não estão limitados a fator V (FV), FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXIII, FII (responsável por hipoprotrombinemia), e fator de von Willebrand. As deficiências em fatores são causadas, por exemplo, por uma meia vida in vivo reduzida do fator, propriedades de ligação alteradas do fator, defeitos genéticos do fator, e uma concentração plasmática reduzida do fator. Os distúrbios de coagulação podem ser congênitos ou adquiridos. Os defeitos potenciais genéticos incluem deleções, adições e/ou substituições no interior de uma sequência de nucleotídeos que codifica um fator de coagulação, cuja ausência, presença e/ou substituição, respectivamente, tem um impacto negativo sobre a atividade do fator de coagulação. Os distúrbios de coagulação também resultam do desenvolvimento de inibidores ou autoimunidade (por exemplo, anticorpos) contra fatores de coagulação. Em um exemplo, o distúrbio de coagulação é hemofilia A. Em alternativa, o distúrbio de coagulação é a hemofilia B ou a hemofilia C.

[00245] Os distúrbios de plaquetas são causados por função plaquetária deficiente ou anormalmente baixo número de plaquetas em circulação. A baixa contagem de plaquetas pode ser devido, por exemplo, a subprodução, sequestro de plaquetas, ou destruição patente não controlada. A trombocitopenia (deficiência de plaquetas) pode estar presente por várias razões, incluindo quimioterapia e terapia de outros fármacos, terapia de radiação, cirurgia, perda de sangue acidental, e outras condições de doença. As condições de doença exemplares que envolvem trombocitopenia são: anemia aplástica; idiopática ou trombocitopenia imune (ITP), incluindo púrpura trombocitopênica idiopática associada com o câncer de mama; ITP associada ao HIV e púrpura trombocitopênica trombótica relacionada com o HIV, tumores metastáticos, que resultam em trombocitopenia, lúpus eritematoso sistêmico, incluindo a síndrome de lúpus neonatal, esplenomegalia, síndrome de Fanconi, deficiência de vitamina B12, deficiência de ácido fólico; anomalia de May-Hegglin; Síndrome de Wiskott-Aldrich, doença hepática crônica, síndrome mielodisplásica associada com trombocitopenia; hemoglobinúria paroxística noturna, trombocitopenia profunda aguda após terapia com c7E3 Fab (Abciximab); trombocitopenia aloimune, incluindo trombocitopenia aloimune materna, trombocitopenia associada com anticorpos antifosfolipídeos e trombose; trombocitopenia autoimune; trombocitopenia imune induzida por fármacos, incluindo trombocitopenia induzida por carboplatina e trombocitopenia induzida por heparina, trombocitopenia fetal; trombocitopenia gestacional, síndrome de Hughes; trombocitopenia lupóide, perda de sangue acidental e/ou massiva; distúrbios mieloproliferativo, trombocitopenia em pacientes com malignidades; púrpura trombocitopênica trombótica, incluindo microangiopatia trombótica manifestando-se como púrpura trombocitopênica trombótica/síndrome urêmica hemolítica em pacientes com câncer; púrpura pós-transfusional (PTP), anemia hemolítica autoimune; perfuração de divertículo oculto jejunal; aplasia de células vermelhas pura, trombocitopenia autoimune; nefropatia epidêmica; insuficiência renal aguda associada a rifampicina; trombocitopenia de Paris- Trousseau, trombocitopenia aloimune neonatal; hemoglobinúria paroxística noturna, alterações hematológicas em câncer de estômago; síndromes hemolíticas urêmicas (por exemplo, condições urêmicas da infância), e manifestações hematológicas relacionadas com a infecção viral, incluindo vírus da hepatite A e trombocitopenia associada a CMV. Distúrbios plaquetários também incluem, mas não estão limitados a doença de Von Willebrand, a disfunção plaquetária paraneoplástica, trombastenia Glanzman, e doença de Bernard-Soulier. Distúrbios hemorrágicos adicionais passíveis de tratamento com um peptídeo de ligação a TFPI (por exemplo, peptídeo inibidor de TFPI) incluem, mas não estão limitadas a, condições hemorrágicas induzidas por trauma, uma deficiência em um ou mais fatores de contato, tais como o FXI, FXII, pré-calicreína, e quininogênio de elevado peso molecular (HMWK); deficiência de vitamina K, um distúrbio de fibrinogênio, incluindo afibrinogenemia, hipofibrinogenemia e disfibrinogenemia e deficiência de alfa2-antiplasmina. Em uma modalidade, o peptídeo de ligação a TFPI (por exemplo, peptídeo inibidor de TFPI) é utilizado para tratar a hemorragia excessiva, tais como hemorragia excessiva causada por cirurgia, trauma, hemorragia intracerebral, doença hepática, doença renal, trombocitopenia, disfunção plaquetária, hematomas, hemorragia interna, hemartrose, hipotermia, menstruação, gravidez e febre hemorrágica da dengue. Todos acima são considerados "distúrbios de coagulação do sangue", no contexto da descrição.

[00246] Em um aspecto, o peptídeo de ligação a TFPI (por exemplo, peptídeo inibidor de TFPI) da invenção é usado para reverter os efeitos (no todo ou em parte) de um ou mais anticoagulantes em um sujeito. Anticoagulantes numerosos são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, heparina, derivados da cumarina, tal como varfarina ou dicumarol; TFPI; AT III; anticoagulante lúpico; peptídeo anticoagulante nematóide (NAPc2); inibidores de FVIIa; sítio ativo bloqueado do FVIIa (FVIIai), sítio ativo bloqueado do FIXa (FIXai); inibidores de FIXa, inibidores de FXa, incluindo fondaparinux, idraparinux, DX-9065a, e razaxaban (DPC906); sítio ativo bloqueado de FXa (IFXai); inibidores de FVa ou FVIIIa, incluindo proteína C ativada (APC) e trombomodulina solúvel, inibidores da trombina, incluindo a hirudina, bivalirudina, argatrobana, e ximelagatrana, e os anticorpos ou fragmentos de anticorpos que se ligam a um fator de coagulação (por exemplo, FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXIII, FII, FXI, FXII , o fator de von Willebrand, pré- calicreína, ou quininogênio de elevado peso molecular (HMWK)).

[00247] Conforme aqui usado, "tratar" e "tratamento" refere-se a qualquer redução na gravidade e/ou aparecimento de sintomas associados a um distúrbio da coagulação sanguínea. Deste modo, "tratar" e "tratamento" incluem medidas terapêuticas e profiláticas. Um vulgar perito na técnica apreciará que qualquer grau de proteção a partir de, ou melhoria de um distúrbio da coagulação do sangue ou dos sintomas a ela associada é benéfico a um sujeito, tal como um paciente humano. A qualidade de vida de um paciente é melhorada reduzindo a qualquer grau da severidade os sintomas em um sujeito e/ou retardando o aparecimento de sintomas. Deste modo, o método em um aspecto é realizado tão cedo quanto possível depois de ter sido determinado que um sujeito está em risco de desenvolver um distúrbio da coagulação do sangue (por exemplo, uma deficiência em fator de coagulação (por exemplo, FVIII, FIX ou FXI) é detectada) ou tão cedo quanto possível após um distúrbio da coagulação do sangue (por exemplo, a hemofilia A, hemofilia B, ou hemofilia C) é detectada. Em um aspecto adicional, o peptídeo é administrado a proteger, no todo ou em parte, contra a perda de sangue excessiva durante a cirurgia ou lesão.

[00248] Em face do exposto, a presente invenção fornece um peptídeo (ou complexo peptídico) para uso em um método para o tratamento de um sujeito, tal como um método para o tratamento de uma doença em que a inibição de TFPI é benéfica. Em um aspecto, a doença ou distúrbio é um distúrbio da coagulação sanguínea. O sujeito sofrendo de uma doença ou distúrbio, ou está em risco de sofrer de uma doença ou distúrbio (ou evento biológico adverso, tais como a perda de sangue excessiva). O método compreende a administração ao sujeito do peptídeo (ou complexo peptídico) da presente invenção em uma quantidade e em condições eficazes para tratar ou prevenir, em todo ou em parte, da doença ou distúrbio. A invenção fornece ainda um peptídeo (ou complexo peptídico) para uso na fabricação de um medicamento. Por exemplo, o peptídeo (ou complexo peptídico) pode ser utilizado na fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio da coagulação do sangue, como descrito em detalhe aqui.

[00249] Em algumas modalidades, é vantajoso administrar a um sujeito um ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificando um complexo peptídico ou peptídeo (por exemplo, peptídeo de ligação a TFPI, peptídeo inibidor de TFPI) da invenção. Tal ácido nucleico, em um aspecto, é fornecido, em vez de, ou além de, um complexo peptídico ou peptídeo (por exemplo, ligação a TFPI, inibidor de TFPI). Os vetores de expressão, sequências reguladoras de ácidos nucleicos, os métodos de administração, e semelhantes, são descritos mais adiante neste documento e na publicação de Patente US n°. 20030045498.

[00250] Um regime de administração especial para um sujeito em particular dependerá, em parte, do peptídeo inibidor de TFPI da invenção usado, da quantidade de peptídeos de ligação a TFPI (por exemplo, peptídeo inibidor de TFPI) administrado, da rota de administração, da doença particular a ser tratada, considerações relevantes para receptor, e a causa e a extensão de quaisquer efeitos secundários. A quantidade de peptídeo administrada a um sujeito (por exemplo, um mamífero, tal como um humano), e as condições de administração (por exemplo, tempo de administração, rota de administração, regime de dosagem) são suficientes para afetar a resposta biológica desejada ao longo de um período de tempo razoável. A dosagem tipicamente depende de uma variedade de fatores, incluindo o peptídeo de ligação a TFPI (por exemplo, peptídeo inibidor de TFPI) particular empregado, a idade e peso corporal do sujeito, assim como a presença e gravidade de uma doença ou distúrbio no sujeito. O tamanho da dose também será determinado pela rota, temporização, e frequência de administração. Deste modo, o clínico pode titular a dosagem e modificar a rota de administração para obter o efeito terapêutico ótimo e técnicas de determinação da faixa convencionais são bem conhecidas dos vulgares peritos na técnica. Puramente a título de ilustração, em um aspecto, o método compreende a administração, por exemplo, de cerca de 0,1 μg/kg até cerca de 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores acima mencionados. Em outras modalidades, a dosagem pode variar de 1 μg/kg até cerca de 75 mg/kg, ou 5 μg/kg até cerca de 50 mg/kg, ou 10 μg/kg até cerca de 20 mg/kg. Em certas modalidades, a dose compreende cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 20 mg/kg (por exemplo, cerca de 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,3 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 3,5 mg/kg, 4 mg/kg, 4,5 mg/kg, 5 mg/kg, 5,5 mg/kg, 6 mg/kg, 6,5 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, ou 10 mg/kg) do peptídeo. Dada a natureza crônica de muitos distúrbios de coagulação do sangue, prevê-se que um sujeito receberá o peptídeo de ligação a TFPI (por exemplo, peptídeo inibidor de TFPI) durante um curso de tratamento que dura semanas, meses ou anos, e pode necessitar de uma ou mais doses diárias ou semanais. Em outras modalidades, o peptídeo de ligação a TFPI (por exemplo, peptídeo inibidor de TFPI) é administrado para o tratamento de uma condição aguda (por exemplo, hemorragia causada por cirurgia ou trauma, ou fator inibidor / episódios autoimunes em sujeitos que receberam terapia de substituição da coagulação) durante um período de tratamento relativamente curto, por exemplo, um a 14 dias.

[00251] Os métodos adequados de administração de uma composição fisiologicamente aceitável, tal como uma composição farmacêutica compreendendo um peptídeo aqui descrito, são bem conhecidos na técnica. Embora mais de uma rota poder ser utilizada para administrar um peptídeo, uma rota particular pode fornecer uma reação mais imediata e mais eficaz do que outra rota. Dependendo das circunstâncias, a composição farmacêutica é aplicada ou instilada em cavidades corporais, absorvida através da pele ou mucosas, ingerida, inalada, e/ou introduzida na circulação. Em um aspecto, uma composição compreendendo um peptídeo inibidor de TFPI é administrada por via intravenosa, intra-arterial, ou intraperitoneal para introduzir o peptídeo da presente invenção para a circulação. A administração não intravenosa também é apropriada, em particular, com respeito a terapias de baixos pesos moleculares. Em certas circunstâncias, é desejável distribuir uma composição farmacêutica que compreende o peptídeo inibidor de TFPI por via oral, por via tópica, por via sublingual, vaginal, retal, pulmonar, por meio de injeção intracerebral (intraparenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraportal, intralesional, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutânea, intranasal, uretral, ou por via entérica, por sistemas de liberação sustentada, ou por dispositivos de implantação. Se desejado, o peptídeo inibidor de TFPI é administrado regionalmente através de administração intra-arterial ou intravenosa alimentando uma região de interesse, por exemplo, através da artéria femoral para a distribuição à perna. Em uma modalidade, o peptídeo é incorporado em uma micropartícula, tal como descrito, por exemplo, nas Patentes US 5.439.686 e 5.498.421, e Publicações de Patente US 2003/0059474, 2003/0064033, 2004/0043077, 2005/0048127, 2005/0170005, 2005 / 0142205, 2005/142201, 2005/0233945, 2005/0147689. 2005/0142206, 2006/0024379, 2006/0260777, 2007/0207210, 2007/0092452, 2007/0281031 e 2008/0026068. Alternativamente, a composição é administrada através da implantação de uma membrana, esponja ou outro material apropriado sobre o qual a molécula desejada tenha sido absorvida ou encapsulada. Onde um dispositivo de implantação é usado, o dispositivo em um aspecto é implantado em qualquer tecido adequado, e a distribuição da molécula desejada é, em vários aspectos, através de difusão, bolus liberado com o tempo, ou administração contínua. Em outros aspectos, o peptídeo inibidor de TFPI é administrado diretamente ao tecido exposto durante o procedimento cirúrgico ou tratamento de lesões, ou é administrado por meio de procedimentos de transfusão de sangue. Abordagens de distribuições terapêuticas são bem conhecidas do versado na técnica, alguns dos quais estando descritas, por exemplo, na Patente US 5.399.363.

[00252] A fim de facilitar a administração, do peptídeo de ligação a TFPI (por exemplo, o peptídeo inibidor de TFPI) ou complexo peptídico em uma modalidade é formulado em uma composição fisiologicamente aceitável que compreende um carreador (por exemplo, veículo, adjuvante, tampão, ou um diluente). O carreador particular empregado está limitado apenas por considerações físico-químicas, tais como solubilidade e não tem de reatividade com o peptídeo, e pela rota de administração. Os carreadores fisiologicamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica. Formas farmacêuticas ilustrativas adequadas para uso injetável incluem, sem limitação, soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis (por exemplo, ver Patente US n°. 5.466.468). As formulações injetáveis são também descritas em, por exemplo, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Co., Philadelphia. Pa., Banker e Chalmers. eds., páginas 238-250 (1982), e ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4a ed., páginas 622-630 (1986)). Uma composição farmacêutica compreendendo um peptídeo aqui fornecido é opcionalmente colocada dentro de recipientes, juntamente com material de embalagem que fornece instruções referentes ao uso de tais composições farmacêuticas. Geralmente, tais instruções incluem uma expressão tangível descrevendo a concentração do reagente, bem como, em certas modalidades, as quantidades relativas de ingredientes excipientes ou diluentes que podem ser necessárias para reconstituir a composição farmacêutica.

[00253] Quando apropriado, o peptídeo de ligação a TFPI (por exemplo, o peptídeo inibidor de TFPI) ou complexo peptídico da presente invenção é administrado em combinação com outras substâncias e/ou outras modalidades terapêuticas para alcançar um efeito biológico adicional ou aumentado. Os co-tratamentos incluem, mas não estão limitados a fatores de coagulação recombinantes ou derivados do plasma, tratamentos de profilaxia de hemofilia, imunossupressores, antagonistas de anticorpo de inibição do fator de plasma (isto é, anti-inibidores), antifibrinolíticos, antibióticos, terapia hormonal, agentes anti-inflamatórios (por exemplo, Fármacos Anti- inflamatórios Não Esteroides (AINEs) ou substâncias anti-inflamatórias esteroides), pró-coagulantes, e analgésicos. Em um aspecto, o método é uma terapia auxiliar para substituição tradicional de regimes de fator de tratamento envolvendo a administração de, por exemplo, FXIII, FXII, FXI (por exemplo, HEMOLEVEN® (Laboratoire francais du Fractionnement et des Biotechnologies, Les Ulis, France) e concentrado de FXI (BioProducts Laboratory, Elstree, Hertfordshire, UK)), FX, FIX (por exemplo, BENEFIX® Fator IX de Coagulação (Wyeth, Madison, NJ); ALFANINE® SD (Grifols, Los Angeles, CA); MONONINE® (CSL Behring, King of Prussia, PA); BEBULIN-VH™ (Baxter, Deerfield, IL); PROFILNINE® SD (Grifols, Los Angeles, CA); ou PROPLEX T™ (Baxter, Deerfield, IL)), FVIII (por exemplo, ADVATE™ (Baxter, Deerfield, IL); HELIXATE® FS (CSL Behring, King of Prussia, PA); REFACTO® (Wyeth, Madison, NJ), XYNTHA™ (Wyeth, Madison, NJ), KOGENATE® e KOGENATE® FS (Bayer, Pittsburgh, PA); ALFANATE® (Grifols, Los Angeles, CA); HEMOPHIL M™ (Baxter, Deerfield, IL); KOATE®-DVI (Talecris Biotherapeutics-USA, Research Triangle Park, NC); ou MONARC-M™ (Baxter, Deerfield, IL)), FVIIa (por exemplo, NOVOSEVEN® FVIIa (Novo Nordisk, Princeton, NJ) e concentrado de FVII (Baxter Bioscience, Vienna, Austria, ou BioProducts Laboratory, Elstree, Hertfordshire, UK)), FV, FVa, FII, e/ou FIII, a um sujeito. Em alguns casos, o sujeito também recebe FEIBA VH Immuno™ (Baxter BioScience, Vienna, Austria), que é uma porção de plasma humano estéril liofilizada com atividade de derivação inibidora de Fator VIII. FEIBA VH Immuno™ contém aproximadamente unidades iguais de atividade de derivação inibidora de Fator VIII e Fatores do Complexo de Protrombina (Fatores II, VII, IX e X, proteína C). Outros exemplos de co-tratamentos incluem, mas não estão limitados a, pré- calicreína, quininogênio de elevado peso molecular (HMWK), fator de von Willebrand, o Fator de Tecido e trombina. Alternativamente ou em adição, o peptídeo de ligação a TFPI (por exemplo, peptídeo inibidor de TFPI) é coformulado com um ou mais peptídeos de ligação a TFPI (por exemplo, peptídeo inibidor de TFPI) diferentes. Em um aspecto, a administração do peptídeo de ligação a TFPI, permite uma redução na dose de coterapêutico necessário para atingir uma resposta biológica desejada.

[00254] A presente invenção inclui, assim, a administração a um sujeito de um peptídeo de ligação a TFPI (por exemplo, o peptídeo inibidor de TFPI) da invenção (ou vários peptídeos de ligação a TFPI, ou um complexo peptídico), em combinação com uma ou mais substâncias adicionalmente apropriadas, cada uma delas sendo administrada de acordo com um regime adequado para o medicamento. Estratégias de administração incluem a administração concorrente (por exemplo, o peptídeo inibidor de TFPI) (isto é, a administração substancialmente simultânea) e administração não concorrente (isto é, administração em tempos diferentes, em qualquer ordem, quer se sobrepondo ou não) do peptídeo de inibidor TFPI (ou complexo peptídico) e um ou mais agentes adicionalmente adequados. Será apreciado que os diferentes componentes são opcionalmente administrados na mesma composição ou em composições separadas, e pelas mesmas ou diferentes rotas de administração.

[00255] Em algumas modalidades, o peptídeo da presente invenção é conjugado com uma porção, por exemplo, uma porção terapêutica ou de diagnóstico, tal como as porções de detecção e de co-tratamentos descritas acima. Alternativamente ou em adição, o peptídeo é administrado em combinação com um parceiro de interação (por exemplo, um anticorpo, fragmento de anticorpo, anticalina, aptâmero ou spiegelmer) que (a) se liga ao peptídeo e (b) é terapeuticamente ativo e/ou está ligado a uma porção que fornece uma funcionalidade adicional para o parceiro de interação (por exemplo, um agente terapêutico, de diagnóstico ou de detecção). Porções apropriadas incluem, mas não estão limitadas a fotossensibilizadores, corantes, radionuclídeos, complexos contendo radionuclídeos, enzimas, toxinas, anticorpos, fragmentos de anticorpos, e os agentes citotóxicos e, em alguns casos, a porção possui atividade terapêutica (isto é, atinge um efeito biológico vantajoso ou desejado). O par de parceiro de interação-peptídeo ou conjugado de peptídeo é adequado para uso em qualquer um dos métodos aqui descritos, tais como métodos de tratamento de um paciente que sofre de uma doença ou distúrbio, ou está em risco de sofrer de uma doença ou distúrbio.

[00256] A invenção ainda fornece um método para inibir a degradação de TFPI por uma serina protease. A degradação de protease pode complicar o manuseio de TFPI em ambientes de pesquisa. Além disso, embora a inibição de TFPI seja desejada para melhorar várias condições médicas (por exemplo, hemofilia), TFPI pode ser desejado em outras modalidades clínicas para, por exemplo, reduzir a coagulação. Por "inibir" entende-se a proteção, em todo ou em parte, da degradação ou clivagem por uma protease. Serina proteases são bem caracterizadas e incluem por exemplo, elastase, trombina, plasmina, FXa ou quimase. O método compreende contatar TFPI com um peptídeo compreendendo a estrutura de fórmula (XIV):

[00257] X7001-X7002-X7003-X7004-X7005-X7006-[X7007-X7008- X7009-X7010-X7011-X7012-X7013-X7014-X7015-X7016-X7017- X7018]-X7019-X7020-X7021-X7022-X7023 (XIV) (SEQ ID NO: 3154),

[00258] em que X7001 está presente ou ausente, pelo qual no caso X7001 está presente este é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, C(NEM), D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V e W;

[00259] em que X7002 está presente ou ausente, pelo qual no caso X7002 está presente este é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, C(NEM), D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W e Y;

[00260] em que X7003 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, F, I, K, L, R, S, T, V, W e Y;

[00261] em que X7004 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V e W;

[00262] em que X7005 é R ou W;

[00263] em que X7006 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, H, I, K, L, R, V e W;

[00264] em que X7007 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Orn, homoK, C, Hcy, Dap e K, preferencialmente selecionado do grupo que consiste em C e Hcy;

[00265] em que X7008 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, G, R, S e T;

[00266] em que X7009 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em a, A, I, K, L, M, m, Moo, Nle, p, R, SeM e V;

[00267] em que X7010 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, G, I, K, L, P, R, S, T e V;

[00268] em que X7011 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D, E, G, S e T;

[00269] em que X7012 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, a, D, d, E, e, F, f, G, I, K, k, L, l, M, m, Moo, Nle, nle, P, p, R, r, S, s, Sem, T, t, V, v, W e w;

[00270] em que X7013 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, C(NEM), Con, Con(Meox), D, d, E, e, Eag, F, G, I, K, L, N, R, S, s, T, V e W;

[00271] em que X7014 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, M, R, S, T, V e W;

[00272] em que X7015 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, M, Nle, R, S, T, V e W;

[00273] em que X7016 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, I, K, L, M, Moo, Nle, R, S, Sem, T, V, W e Y;

[00274] em que X7017 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V, W e Y;

[00275] em que X7018 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C e D, preferencialmente C;

[00276] em que X7019 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, F, I, L, S, T, V e W;

[00277] em que X7020 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F e W;

[00278] em que X7021 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em I, L e V;

[00279] em que X7022 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, E, F, G, I, K, L, P, R, S, T, V e W;

[00280] em que X7023 está presente ou ausente, pelo qual no caso X7023 está presente este é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, C(NEM), Con, Con(Meox), D, E, Eag, F, G, I, K, L, R, S, T, V, W e Y; e

[00281] em que o peptídeo compreende como uma estrutura cíclica gerada por uma ligação entre X7007 e X7018, pelo qual a degradação de TFPI pela serina protease é inibido. Opcionalmente, X7001 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, D, F, G, H, K, L e S; X7002 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em H, F, M e R; X7003 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F e Y;X7004 é K; X7005 é W; X7006 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F e H; X7007 é C; X7008 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, G e S; X7009 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em M, SeM e V; X7010 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em K, P e R; X7011 é D; em que X7012 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, L, l, M e Sem; em que X7013 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D, G, K e S; em que X7014 é G; em que X7015 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em I e T; em que X7016 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D, F, M, SeM e Y; em que X7017 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em S e T; em que X7018 é C; em que X7019 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A e V; em que X7020 é W; em que X7021 é V; em que X7022 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, L, K, R, P e W; em que X7023 está presente ou ausente, pelo qual no caso X7023 está presente este é uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em A, D, F, M, S e Y; e em que o peptídeo compreende como uma estrutura cíclica gerada por uma ligação entre X7007 e X7018. O "contatar" pode ser realizado in vitro ou in vivo. As considerações de dosagem e via de administração descritas aqui são aplicáveis ao método de inibição de degradação proteolítica.

[00282] O peptídeo é opcionalmente parte de um complexo peptídico que ainda compreende um peptídeo compreendendo a estrutura de fórmula (XIII):

[00283] X6001-X6002-X6003-X6004-X6005-X6006-X6007-X6008- X6009-X6010-X6011-X6012-X6013-X6014-X6015-X6016-X6017- X6018-X6019-X6020 (XIII) (SEQ ID NO: 3153);

[00284] em que X6001 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, L, M, Y, 1Ni, Thi, Bta, Dopa, Bhf, C, D, G, H, I, K, N, Nmf, Q, R, T, V, e W;

[00285] em que X6002 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Q, G, e K;

[00286] em que X6003 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em C, D, E, M, Q, R, S, T, Ede(O), Cmc, A, Aib, Bhs, F, G, H, I, K, L, N, P, V, W e Y;

[00287] em que X6004 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Aib, E, G, I, K, L, M, P, R, W, Y, A, Bhk, C, D, F, H, k, N, Nmk, Q, S, T e V;

[00288] em que X6005 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em a, A, Aib, C, D, d, E, G, H, K, k, M, N, Nmg, p, Q, R, NpropilG, aze, pip, tic, oic, hyp, nma, Ncg, Abg, Apg, thz, dtc, Bal, F, L, S, T, V, W e Y;

[00289] em que X6006 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, C(NEM), D, E, G, H, K, M, N, Q, R, S, V, Cit, C(Acm), Nle, I, Ede(O), Cmc, Ecl, Eea, Eec, Eef, Nif, Eew, Aib, Btq, F, I, L, T, W e Y;

[00290] em que X6007 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em I, V, T, Chg, Phg, Tle, A, F, G, I, K, L, Nmv, P, Q, S, W e Y;

[00291] em que X6008 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, H, 1Ni, 2Ni, Pmy, Y, e W;

[00292] em que X6009 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Aib, V, Chg, Phg, Abu, Cpg, Tle, ácido L-2-amino-4,4,4- trifluorobutírico, A, f, I, K, S, T e V;

[00293] em que X6010 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, C, D, d, E, F, H, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, Nmd, C(NEM), Aib, G, I, L e Nmf;

[00294] em que X6011 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, a, G, p, Sar, c, hcy, Aib, C, K, G e Nmg;

[00295] em que X6012 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Y, Tym, Pty, Dopa e Pmy;

[00296] em que X6013 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Aib, C, F, 1Ni, Thi, Bta, A, E, G, H, K, L, M, Q, R, W e Y;

[00297] em que X6014 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, C, C(NEM), D, E, K, L, M, N, Q, R, T, V, Hcy, Bhe, F, G, H, I, P, S, W e Y;

[00298] em que X6015 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em R, (ômega-metil)-R, D, E e K;

[00299] em que X6016 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em L, Hcy, Hle e Aml;

[00300] em que X6017 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, a, Aib, C, c, Cha, Dab, Eag, Eew, H, Har, Hci, Hle, I, K, L, M, Nle, Nva, Opa, Orn, R, S, Deg, Ebc, Eca, Egz, Aic, Apc, Egt, (ômega-metil)-R, Bhr, Cit, D, Dap, E, F, G, N, Q, T, V, W e Y;

[00301] em que X6018 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em A, Aib, Hcy, hcy, C, c, L, Nle, M, N, R, Bal, D, E, F, G, H, I, K, Q, S, T, V, W e Y;

[00302] em que X6019 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em K, R, Har, Bhk e V; e

[00303] em que X6020 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em K, L, Hcy, Aml, Aib, Bhl, C, F, G, H, I, Nml, Q, R, S, T, V, W e Y.

[00304] A invenção fornece ainda um método para identificar um composto de ligação a TFPI, tal como um peptídeo de ligação a TFPI. Em um aspecto, o método compreende (a) contatar de um peptídeo compreendendo domínio Kunitz de TFPI 1 (KD1) com um peptídeo de ligação a TFPI aqui descrito e um composto de teste em condições que permitem a formação de complexos de peptídeo de ligação a TFPI-KD1. O método compreende ainda (b) medir complexos de peptídeo de ligação a TFPI-KD1 formados na etapa (a), e (c) comparar a quantidade de complexos de peptídeo de ligação a TFPI-KD1 formada na presença do composto de teste com o número de complexos de peptídeo de ligação a TFPI-KD1 formados na ausência do composto de teste. Uma redução no número de complexos de peptídeo de ligação a TFPI-KD1 formados na presença do composto de teste em comparação com o número de complexos de peptídeo de ligação a TFPI-KD1 formados na ausência do composto de teste indica que o composto de teste é um composto de ligação a TFPI. Em um aspecto, o método compreende ainda a formação de complexos de ligação a TFPI-KD1 na ausência do composto de teste para comparação na etapa (c), embora isso não seja necessário na medida em que a informação pode ser obtida separadamente (por exemplo, a partir de padrões de referência anteriormente preparados).

[00305] KD1, o peptídeo de ligação a TFPI, e o composto de teste são combinados simultaneamente ou sequencialmente, opcionalmente com etapas de lavagem, antes e/ou após a adição do peptídeo de ligação a TFPI e/ou só composto de teste. Em uma modalidade, o peptídeo que compreende KD1 é contatado com um peptídeo de ligação a TFPI aqui descrito em condições que permitem a formação de complexos de peptídeo de ligação a TFPI-KD1, o peptídeo de ligação a TFPI não ligado é removido, e os complexos de KD-peptídeo restantes são contatados com um composto de teste. O deslocamento do peptídeo de ligação a TFPI a partir de complexos de peptídeo-TFPI é detectado, e indica que o composto de teste é um composto de ligação a TFPI. O deslocamento é detectado, por exemplo, medindo o número de complexos de peptídeo de ligação a TFPI-KD1, antes e após exposição ao composto de teste.

[00306] Os complexos de peptídeo de ligação a TFPI-KD1, são detectados e/ou medidos (quantificados), utilizando quaisquer meios de detecção adequados, incluindo meios de detecção conhecidos na técnica para a detecção de peptídeos em uma amostra. Por exemplo, em uma modalidade da invenção, o peptídeo de ligação a TFPI compreende um marcador que gera um sinal. Exemplos de marcadores são aqui descritos e incluem, por exemplo, radionuclídeos, corantes fluorescentes, isótopos, substratos de enzimas, e enzimas. O método compreende a medição do sinal gerado por complexos de peptídeo de ligação a TFPI-KD1 e comparação do sinal gerado por complexos de peptídeo de ligação a TFPI-KD1 formados na presença do composto de teste com o sinal gerado por complexos de peptídeo de ligação a TFPI- KD1 formados na ausência do composto de teste. Uma redução do sinal a partir de uma amostra compreendendo os complexos de peptídeo de ligação a TFPI-KD1 expostos ao composto de teste (em comparação com o sinal gerado por uma amostra similar de complexos de peptídeo de ligação a TFPI-KD1 não expostos ao composto de teste) indica que a formação do complexo foi inibida ou interrompida, e que o composto de teste é um composto de ligação a TFPI.

[00307] A presente invenção também fornece um método de identificação de um composto de ligação a TFPI que interfere com as interações de TFPI-FXa. O método baseia-se, pelo menos em parte, na verificação surpreendente de que o TFPI KD1 liga-se a um exosítio de FXa e contribui para a inibição de TFPI da atividade de FXa. Em um aspecto, o método compreende o contato de um peptídeo que consiste essencialmente em KD1 (isto é, um peptídeo compreendendo KD1 na ausência de KD2) com FXa na presença de um composto de teste em condições que permitem a ligação de KD1 a FXa. O método compreende ainda a comparação da ligação de KD1-FXa na presença do composto de teste com a ligação de KD1-FXa na ausência do composto de teste. Uma diminuição na ligação de KD1-FXa na presença do composto de teste em comparação com a ligação de KD1-FXa na ausência do composto de teste indica que o composto de teste é um composto de ligação a TFPI. A ligação a KD1-FXa pode ser detectada e/ou quantificada utilizando qualquer método, tal como os métodos aqui descritos. Por exemplo, KD1 ou FXa é marcado, e o sinal gerado pelos complexos de KD1-FXa expostos ao composto de teste é comparado com o sinal gerado pelos complexos de KD1-FXa não expostos ao composto de teste.

[00308] Os métodos da presente invenção para identificar compostos de ligação a TFPI são particularmente sensíveis às várias técnicas de rastreio de alta produtividade conhecidas na técnica. Qualquer "composto de teste" (por exemplo, molécula pequena, peptídeo, proteína (tal como um anticorpo ou um seu fragmento), peptidomimético, ou um polinucleotídeo (DNA ou RNA)) é adequada para o rastreio, utilizando os métodos aqui descritos. Se desejado, uma coleção, população, ou uma biblioteca de compostos de teste é testada para ligação a TFPI (e, opcionalmente, a atividade anti-TFPI), utilizando os métodos aqui descritos. Há um número de bibliotecas diferentes utilizadas para a identificação de inibidores de TFPI, incluindo, mas não se limitando a, bibliotecas químicas, bibliotecas de produtos naturais, e bibliotecas combinatórias que incluem peptídeos e/ou moléculas orgânicas. Uma biblioteca química, em alguns aspectos, consiste em análogos estruturais de compostos conhecidos ou compostos que são identificados como de "acertos" ou de "condução" através de métodos de rastreio. As bibliotecas de produtos naturais são coleções de substâncias isoladas de micro-organismos produzidos por animais, plantas ou organismos marinhos. As bibliotecas combinatórias são compostas de um grande número de peptídeos ou compostos orgânicos, tipicamente como uma mistura. Os métodos aqui descritos também são úteis para o rastreio de uma biblioteca de exibição ou de ácidos nucleicos, tal como uma biblioteca de exibição de levedura, uma biblioteca de exibição de bactérias, uma biblioteca de exibição de fagos, uma biblioteca de exibição de ribossomas, uma biblioteca de exibição de mRNA, uma biblioteca de RNA, ou uma biblioteca de DNA. Um método de rastreio de uma biblioteca de exibição é exemplificado no Exemplo 1. Métodos de rastreio de elevada produtividade abrangidos pela invenção incluem procedimentos automatizados que permitem rastreio de dezenas a centenas de milhares de compostos de teste.

[00309] Em outro aspecto, o método da invenção para a identificação de um composto de ligação a TFPI compreende o contato de um peptídeo que compreende (ou consiste em) KD1 com um composto de teste, e detecção da ligação do composto de teste a um sítio de ligação a TFPI definido por resíduos de aminoácido KD1 correspondentes aos resíduos de TFPI humanos Phe28, Lys29, Ala30, Asp32, Ile46, Phe47 e Ile55, tais como um sítio de ligação definido pelos resíduos de TFPI humanos Ala27, Phe28, Lys29, Ala30, Asp31, Asp32, Lys36, Ile38, Ile46, Phe47 e Ile55. Em uma modalidade, o sítio de ligação é definido por resíduos de aminoácidos correspondentes aos resíduos de TFPI humanos Ala27, Phe28, Lys29, Ala30, Asp31, Asp32, Lys36, Ala37, Ile38, Phe44, Phe47, Ile46 e Ile55. O sítio de ligação corresponde ao sítio de ligação a TFPI de JBT1857, um peptídeo de ligação a TFPI que inibe a atividade de TFPI em certo número de ensaios funcionais. JBT1857 é um exemplo de um peptídeo da classe de peptídeos JBT0047 representada aqui como, por exemplo, fórmulas (I)-(IV) e (XI), e exemplos das quais são estabelecidas nas in Figuras 32, 62, e 65.

[00310] Além disso, a invenção fornece um método para identificar um composto de ligação a TFPI compreende contatar um peptídeo compreendendo KD1-KD2 (incluindo a região do polipeptídeo TFPI ligando a KD1 e KD2) como um composto teste, e detectar ligação do composto teste a um sítio de ligação TFPI definido por KD1-KD2 resíduos de aminoácidos correspondente aos resíduos de TFPI humano R41, Y53, C59, E60, Q63, R65, E67, E71, K74, M75, N80, N82, R83, I84, I85, T87, F96, C106, C130, L131, N133, M134, N136, F137, E142, N145, e I146. O sítio de ligação corresponde ao sítio de ligação a TFPI of JBT1837, um peptídeo de ligação a TFPI que inibe a atividade de TFPI em um número de ensaios funcionais. JBT1837 é um exemplo de um peptídeo da classe de peptídeos JBT0120 representada aqui como, por exemplo, fórmulas (V)-(VII), e exemplos dos quais são estabelecidos na Figura 34.

[00311] Os resíduos de aminoácido do sítio de ligação a TFPI aqui descritos são em referência à sequência de aminoácidos de TFPI humano, e a numeração refere-se à posição do aminoácido recitada em relação ao N-terminal de TFPI humano. Apenas com a finalidade de ilustrar a posição do sítio de ligação a TFPI, a sequência de aminoácidos de um fragmento de TFPI humano compreendendo KD1 é fornecida como SEQ ID NO: 4234 (DSEEDEEHTIITDTELPPLKLMHSF CAFKADDGPCKAIMKRFFFNIFTRQCEEFIGGCEGNQNRFESLEEC KKMCTRDNA (aminoácidos 26-75 de codificação de KD1 estão indicadas em negrito)). Aminoácidos correspondentes de outros polipeptídeos de TFPI (por exemplo, polipeptídeos de TFPI a partir de organismos diferentes, ou fragmentos polipeptídicos de TFPI) são identificados, por exemplo, através do alinhamento de uma sequência de aminoácidos de polipeptídeo de SEQ ID NO: 4234. Embora, em uma modalidade, o peptídeo compreendendo TFPI KD1 não inclua outras regiões da proteína TFPI responsáveis pela atividade de TFPI, outras modalidades implicam o uso de um peptídeo compreendendo os aminoácidos 1-160 de TFPI humano (compreendendo KD1 e KD2) ou compreendendo TFPI humano de comprimento completo (contendo KD1-KD3).

[00312] A ligação de um composto de teste para o sítio de ligação a TFPI como aqui definido é detectada através de qualquer um dos métodos numéricos, incluindo os métodos de detecção descritos no presente documento. Um método exemplar para a detecção de ligação usa a ressonância magnética nuclear (RMN) para reconhecer os deslocamentos químicos nos resíduos de aminoácidos no interior do sítio de ligação a TFPI. Os deslocamentos químicos nas posições de aminoácidos TFPI 28-30, 32, 46, 47, e 55, e, opcionalmente, nas posições 27, 31, 36-38, e 44, indicam a interação do composto de teste com estes pontos de contato de aminoácidos em TFPI. De modo semelhante, deslocamentos químicos em posições de aminoácidos de TFPI 41, 53, 59, 60, 96, 106, 130, 133, 136, 137, 142, 63, 65, 67, 71, 74, 75, 80, 82-85, 87, 131, 134, 145, e 146 denota interação de um composto teste com estes pontos de contato de aminoácido em TFPI. Para determinar a presença ou ausência de deslocamentos químicos em determinados aminoácidos resultantes da ligação do composto de teste, os dados de RMN obtidos a partir do complexo de composto de teste-KD1 são comparados com os dados de RMN obtidos a partir do peptídeo de TFPI livre (por exemplo, peptídeo KD1 livre ou peptídeo KD1-KD2 livre). O uso de RMN para detectar a ligação entre um composto de teste e TFPI é ainda descrito nos Exemplos.

[00313] Em alternativa, a ligação de um composto de teste para o sítio de ligação a TFPI aqui definido é determinada indiretamente por detecção de alterações na capacidade de TFPI KD1 opcionalmente em combinação com KD2, para interagir com os seus parceiros de ligação naturais, por exemplo, FVIIa ou FXa. A este propósito, o método, em um aspecto, compreende o contato do peptídeo compreendendo TFPI KD1 com FVIIa na presença do composto de teste em condições que permitem a ligação de FVIIa para KD1, e ligação de KD1-FVIIa é comparada com ligação de KD1-FVIIa na ausência do teste composto. Alternativamente ou adicionalmente, o método compreende o contato do peptídeo compreendendo TFPI KD1 com FXa na presença do composto de teste em condições que permitem a ligação de KD1 para FXa, e comparação da ligação de KD1 FXa na presença do composto de teste com a ligação de KD1-FXa na ausência do composto de teste. Opcionalmente, o peptídeo que compreende KD1 também compreende KD2, e o método compreende o contato do peptídeo com FXa na presença de um composto de teste em condições que permitem a ligação de KD2 para FXa, e ligação de KD2-FXa é comparada com a ligação de KD2-FXa na ausência do composto de teste. Uma diminuição na ligação de KD1-FVIIa, ligação de FXa KD1, ou ligação de KD2-FXa na presença do composto de teste (em comparação com ligação de FVIIa-KD1, ligação de KD1-FXa, ou ligação de KD2-FXa na ausência do composto de teste) indica que o composto de teste é um composto de ligação a TFPI. O método compreende opcionalmente o contato de KD1 e/ou KD2 para FVIIa e/ou FXa na ausência do composto teste como uma referência para a comparação de ligação na presença do composto de teste.

[00314] A ligação de KD a FVIIa ou FXa é determinada e/ou quantificada utilizando qualquer método adequado para detectar interações proteína-proteína, tais como os métodos aqui descritos utilizando marcadores detectáveis. A ligação do composto de teste para o sítio de ligação a TFPI é, em alternativa, detectada utilizando um ensaio enzimático. A atividade enzimática de FVIIa ou FXa é um substituto adequado para avaliar a ligação das proteínas a TFPIKD1ou KD2; os compostos de teste que se ligam no sítio de ligação a TFPI aqui definido inibem a atividade de TFPI, o que resulta em aumento da atividade de FVIIa e FXa. Os ensaios enzimáticos para a avaliação da atividade de FVIIa ou FXa são descritos em detalhe aqui.

[00315] A invenção ainda inclui compostos identificados como compostos de ligação a TFPI nos métodos da invenção, bem como composições compreendendo um ou mais compostos identificados. Métodos para isolar ou purificar um composto, como composto de ligação a TFPI (por exemplo, um peptídeo de ligação a TFPI) identificado como descrito aqui são conhecidos na técnica e descritos acima. Em alguns aspectos, compostos de ligação a TFPI identificados como descrito aqui são inibidores de TFPI que regulam para baixo ou eliminam uma ou mais atividades de TFPI. A invenção fornece um inibidor de TFPI que liga TFPI humano em um primeiro sítio de ligação definido pelos resíduos de aminoácidos F28, K29, A30, D32, I46, F47, e I55 (por exemplo, um sítio de ligação definido por resíduos de aminoácidos A27, F28, K29, A30, D31, D32, K36, I38, I46, F47, e I55, como um sítio de ligação definido por resíduos de aminoácidos A27, F28, K29, A30, D31, D32, K36, A37, I38, F44, I46, F47, e I55) e em um segundo sítio de ligação definido pelos resíduos de aminoácidos R41, Y53, C59, E60, Q63, R65, E67, E71, K74, M75, N80, N82, R83, I84, I85, T87, F96, C106, C130, L131, N133, M134, N136, F137, E142, N145, e I146. As designações de aminoácidos correspondem às posições de resíduo de aminoácidos em TFPI humano. Em vários aspectos, o inibidor de TFPI é um peptídeo. O inibidor de TFPI, em várias modalidades, compreende um primeiro peptídeo e um segundo peptídeo ligado por uma porção ligante como descrito aqui.

[00316] Em uma modalidade, a invenção inclui um método para a purificação de um composto que inibe a atividade de FXa. O método compreende o contato de um peptídeo compreendendo TFPI KD1 com um composto em condições que permitam a formação de complexos de composto-KD1, remoção do composto não ligado, e dissociação dos complexos de composto-KD1 para liberar o composto que se liga a TFPI. O uso de um inibidor de TFPI identificado e/ou purificado como aqui descrito para a fabricação de um medicamento, tal como um medicamento para o tratamento de um distúrbio da coagulação do sangue, é fornecido, assim como um método para tratar um paciente que sofre de uma doença ou está em risco de sofrer de uma doença, compreendendo a administração do inibidor de TFPI para o sujeito.

[00317] Além disso, um método de inibição de TFPI humano é fornecido, em que o método compreende o contato de TFPI humano com um inibidor que se liga a TFPI humano em um sítio de ligação definido pelos resíduos de aminoácidos Phe28, Lys29, Ala30, Asp32, Phe47, Ile46 e Ile55. Outro aspecto da invenção inclui um método para tratar um sujeito que sofre de uma doença ou está em risco de sofrer de uma doença. O método compreende a administração ao sujeito de um inibidor que se liga a TFPI humano em um sítio de ligação definido pelos resíduos de aminoácidos Phe28, Lys29, Ala30, Asp32, Phe47, Ile46 e Ile55. Em um aspecto, o sítio de ligação de TFPI humano é definido pelos resíduos de aminoácidos Ala27, Phe28, Lys29, Ala30, Asp31, Asp32, Lys36, Ile38 Ile46, Phe47, e Ile55, tais como um sítio de ligação definido pelos resíduos de aminoácidos Ala27, Phe28, Lys29, Ala30, Asp31, Asp32, Lys36, Ala37, Ile38, Phe44, Ile46, Phe47 e Ile55. Alternativamente ou além disso, o método de inibição de TFPI compreende contatar TFPI humano com um inibidor que liga a TFPI humano em um sítio de ligação definido por resíduos de aminoácidos R41, Y53, C59, E60, Q63, R65, E67, E71, K74, M75, N80, N82, R83, I84, I85, T87, F96, C106, C130, L131, N133, M134, N136, F137, E142, N145 e I146. A invenção ainda fornece um método para tratar um sujeito que sofre de ou em risco de sofrer de uma doença, o método compreendendo administrar a um sujeito um inibidor que liga TFPI humano em um sítio de ligação definido por resíduos de aminoácidos R41, Y53, C59, E60, Q63, R65, E67, E71, K74, M75, N80, N82, R83, I84, I85, T87, F96, C106, C130, L131, N133, M134, N136, F137, E142, N145 e I146. Em vários aspectos, o inibidor liga TFPI em um sítio de ligação definido por resíduos de aminoácidos F28, K29, A30, D32, I46, F47, e I55 (e opcionalmente A27, D31, K36, A37, I38, e F44) e um sítio de ligação definido por resíduos de aminoácidos R41, Y53, C59, E60, F96, C106, C130, N133, N136, F137, E142, Q63, R65, E67, E71, K74, M75, N80, N82, R83, I84, I85, T87, L131, M134, N145, e I146.

[00318] Qualquer inibidor que contata o sítio de ligação a TFPI como aqui definido e inibe (infrarregula ou atenua) uma ou mais atividades de TFPI é adequado para uso no contexto do método. O inibidor de TFPI é, opcionalmente, um peptídeo de ligação a TFPI, tal como um peptídeo de ligação a TFPI com as características aqui descritas.

[00319] A invenção inclui ainda meios de armazenamento de computador e métodos para a modelagem de compostos-TFPI candidatos no sítio de ligação a TFPI como aqui definido. A modelagem tridimensional (3D) de proteínas pode ser usada em conjunto com os modelos 3D dos vários ensaios de ligação de compostos de TFPI (por exemplo, peptídeos ou pequenas moléculas) para determinar o ajuste entre os compostos e aminoácidos alvos em TFPI. Devido a eficácia de um composto de teste em inibir o TFPI poder ser limitada se o composto não permanece ligado ao TFPI durante um período de tempo suficiente para efetuar uma resposta biológica, a tendência dos dois para permanecerem acoplados pode ser prevista para desenvolver uma classificação de afinidade.

[00320] A análise da superfície em 3D da proteína de TFPI e o ajuste do composto correspondente à superfície, tendo em conta a classificação de afinidade, as modificações do composto (por exemplo, um peptídeo) podem ser desenvolvidas para melhorar tanto o número de pontos de contato entre na superfície e o composto quanto a força das ligações nos pontos de contato. A eficácia dos candidatos com base de produto químico e inibidores de TFPI com base em peptídeos pode similarmente ser modelada usando esta técnica, que facilita o modelo racional de compostos de ligação a TFPI. Um modelo de computador de superfície tridimensional (3D) de KD1 (opcionalmente ligado a KD2) permite testar a capacidade dos vários peptídeos ou químicos para fixara um subconjunto identificado de aminoácidos que define um sítio de ligação a TFPI e inibe KD1 (e, opcionalmente, KD2). Em um aspecto, uma superfície da proteína KD1 é modelada no espaço 3D em um computador, em particular, uma superfície delimitada pelos aminoácidos alvos em KD1. Os modelos 3D de vários peptídeos, por exemplo, podem ser coincididos com a superfície para determinar a quantidade de aminoácidos de TFPI alvos que é contatada pelo peptídeo e também para desenvolver uma classificação de afinidade prevendo quanto tempo o peptídeo irá permanecer ligado à superfície alvo.

[00321] Alterando o modelo de peptídeos e repetindo a modelagem por computador, as classificações de afinidade podem ser rapidamente geradas por uma família de peptídeos. As variantes peptídicas mais promissoras (por exemplo, um segundo peptídeo que compreende uma ou mais substituições dentro da sequência de aminoácidos de um peptídeo precursor) podem ser escolhidas para ensaios físicos adicionais, se desejado.

[00322] A presente invenção fornece um meio de armazenamento de computador com instruções executáveis de computador que, quando executado no processador de um computador, implementa um método de modelagem de interação entre pontos tridimensionais (3D) selecionados em uma proteína TFPI KD1 e um composto de teste. O método compreende a obtenção de um modelo 3D de estrutura de proteína para a proteína de TFPI KD1; determinar uma relação 3D entre um subconjunto selecionado de aminoácidos na estrutura da proteína, em que o subconjunto selecionado de aminoácidos compreende Phe28, Lys29, Ala30, Asp32, Ile46, Phe47 e Ile55; modelar uma superfície delimitada pelo subconjunto selecionado de aminoácidos; obter um modelo 3D de composto de teste de um composto de teste; coincidir o modelo 3D de composto de teste com a superfície delimitada pelo subconjunto selecionado de aminoácidos, e identificar pontos de contato entre o subconjunto selecionado de aminoácidos da superfície e o modelo 3D de composto de teste. Opcionalmente, o método compreende ainda a determinação de um número de pontos de contato entre a superfície e o modelo 3D de composto de teste, e registro de uma classificação de afinidade para o modelo 3D de composto de teste correspondente ao número de pontos de contato. Em um aspecto, o subconjunto selecionado de aminoácidos compreende (ou consiste em) Ala27, Phe28, Lys29, Ala30, Asp31, Asp32, Lys36, Ala37, Ile38, Phe44, Ile46, Phe47 e Ile55. O método ainda compreende, opcionalmente, obter um modelo 3D de composto de teste atualizado com base em um segundo composto de teste; coincidir o modelo 3D de composto de teste atualizado com a superfície delimitada pelo subconjunto selecionado de aminoácidos e identificar os pontos de contato entre o subconjunto identificado selecionado de aminoácidos da superfície e o modelo 3D de composto de teste atualizado em um monitor do computador. Em uma modalidade, o método compreende ainda determinar o um número de pontos de contato entre a superfície e o modelo 3D de composto de teste atualizado, determinar um tipo de ligação para cada ponto de contato entre a superfície e o modelo 3D do composto de teste atualizado, e registrar uma nova classificação de afinidade com base no número de pontos de contato e um agregado dos tipos de ligação para cada ponto de contato entre a superfície e o modelo 3D de composto de teste atualizado. A classificação de afinidade atualizada é então comparada com a nova classificação de afinidade para determinar se o composto de teste ou segundo composto de teste tem um índice de afinidade mais elevado, se for desejado. Os pontos de contato podem ser visualizados no computador, facilitando, assim, a otimização ou modelo dos compostos de ligação a TFPI.

[00323] Além disso, a invenção fornece uma mídia de armazenamento em computador tendo instruções executáveis em computador que, quando executadas no processador de um computador, implementa um método para modelar a interação entre pontos tridimensionais (3D) selecionados em uma proteína TFPI KD1- KD2 e um composto teste. O método compreende obter um modelo 3D da estrutura da proteína para a região da proteína TFPI KD1-KD2; determinar uma relação 3D entre um subgrupo selecionado de aminoácidos na estrutura da proteína, em que o subgrupo selecionado de aminoácidos compreende R41, Y53, C59, E60, F96, C106, C130, N133, N136, F137, E142, Q63, R65, E67, E71, K74, M75, N80, N82, R83, I84, I85, T87, L131, M134, N145, e I146; modelar uma superfície ligada pelo subrupo selecionado de aminoácidos; obter um modelo 3D do composto teste combinando o modelo 3D do composto teste para a superfície ligada pelo subgrupo selecionado de aminoácidos; e identificar pontos de contato entre o subgrupo selecionado de aminoácidos da superfície e modelo 3D de composto teste. O método também opcionalmente ainda compreende determinar um número de pontos de contato entre a superfície e o modelo 3D de composto teste; e registrar uma classificação de afinidade para o modelo 3D do composto teste correspondendo ao número de pontos de contato. Em várias modalidades, o método compreende determinar uma relação 3D entre um subgrupo selecionado de aminoácidos compreendendo F28, K29, A30, D32, I46, F47 e I55 (e, opcionalmente A27, D31, K36, A37, I38, e/ou F44), bem como R41, Y53, C59, E60, Q63, R65, E67, E71, K74, M75, N80, N82, R83, I84, I85, T87, F96, C106, C130, L131, N133, M134, N136, F137, E142, N145, e I146.

[00324] Em outra modalidade, o computador tem meios de armazenamento de instruções executáveis de computador que, quando executadas no processador de um computador, implementam um método de comparação de um peptídeo para pontos tridimensionais (3D) selecionados de um domínio Kunitz de TFPI uma proteína (KD1), compreendendo o método a criação de uma estrutura de proteína para a proteína KD1; determinar um modelo tridimensional de um subconjunto selecionado de aminoácidos na proteína KD1, em que o subconjunto de aminoácidos compreende Phe28, Lys29, Ala30, Asp32, Ile46, e Phe47 Ile55; determinar um modelo tridimensional de um peptídeo, ajustar o modelo 3D do peptídeo para o modelo 3D do subconjunto selecionado de aminoácidos, e gerar uma afinidade do peptídeo para o subconjunto selecionado de aminoácidos, em que a afinidade é baseada em um certo número de aminoácidos no subconjunto em contato com o peptídeo e uma força de ligação em cada ponto de contato.. Alternativamente, as instruções executáveis em computador implementam um método para comparar um peptídeo aos pontos tridimensionais selecionados (3D) em um domínio de Kunitz 1 de TFPI e domínio de Kunitz 2 (KD1-KD2), o método compreendendo criar uma estrutura de proteína para a proteína KD1-KD2; determinar um modelo tridimensional de um subgrupo selecionado de aminoácidos na proteína KD1-KD2, em que o subgrupo de aminoácidos compreende R41, Y53, C59, E60, Q63, R65, E67, E71, K74, M75, N80, N82, R83, I84, I85, T87, F96, C106, C130, L131, N133, M134, N136, F137, E142, N145, e I146 (opcionalmente em combinação com F28, K29, A30, D32, I46, F47, e I55 (e, ainda opcionalmente em combinação com A27, D31, K36, A37, I38, e/ou F44)); determinar um modelo tridimensional de um peptídeo; ajustar o modelo 3D do peptídeo ao modelo 3D do subgrupo selecionado de aminoácidos; e gerar uma afinidade do peptídeo para o subgrupo selecionado de aminoácidos.

[00325] Além disso, um método de comparação de um composto de teste para pontos tridimensionais (3D) selecionados em uma proteína TFPI KD1 ou proteína TFPI KD1-KD2 é fornecido. O método compreende criar uma estrutura de proteína para a proteína KD1 em uma memória de um computador; determinar um modelo tridimensional de um subconjunto selecionado de aminoácidos na proteína KD1 em um processador do computador, em que o subconjunto selecionado de aminoácidos compreende Phe28, Lys29, Ala30, Asp32, Ile46, Phe47, e Ile55; determinar um modelo tridimensional de um composto de teste no processador do computador; ajustar o modelo 3D do composto de teste para o modelo 3D do subconjunto selecionado de aminoácidos no processador do computador, e gerar uma afinidade do composto de teste para o subconjunto selecionado de aminoácidos no processador do computador, em que a afinidade é baseada em um certo número de aminoácidos no subconjunto em contato com o composto de teste e uma força de ligação em cada ponto de contato. Alternativamente, o método compreende determinar um modelo tridimensional de um subgrupo selecionado de aminoácidos na proteína KD1-KD2 em um processador de computador, em que o subgrupo selecionado de aminoácidos compreende R41, Y53, C59, E60, F96, C106, C130, N133, N136, F137, E142, Q63, R65, E67, E71, K74, M75, N80, N82, R83, I84, I85, T87, L131, M134, N145, e I146, opcionalmente em combinação com F28, K29, A30, D32, I46, F47, e I55 (e, ainda opcionalmente em combinação com A27, D31, K36, A37, I38, e/ou F44). O método compreende ainda, em algumas modalidades, a exibição de uma representação em 3D do ajuste entre o composto de teste e o modelo 3D do subconjunto selecionado de aminoácidos e, opcionalmente, repetir as etapas aqui descritas, para uma pluralidade de compostos de teste e salvar as respectivas afinidades para cada um da pluralidade de compostos de teste.

[00326] Com referência à Figura 58, um sistema exemplar para implementar o método e aparelho reivindicado inclui um dispositivo de computação de uso geral, na forma de um computador 110. Os componentes mostrados no contorno tracejado não são tecnicamente parte do computador 110, mas são utilizados para ilustrar a modalidade exemplar da Figura 58. Os componentes do computador 110 podem incluir, mas não estão limitados a um processador 120, uma memória de sistema 130, uma interface de memória/gráfico 121 e uma interface de I/O 122. A memória de sistema 130 e um processador de gráficos 190 podem ser acoplados à interface de memória/gráfica 121. Um monitor 191 ou outro dispositivo de saída gráfica pode ser acoplado ao processador de gráficos 190.

[00327] Uma série de barramentos do sistema pode acoplar vários componentes de sistemas, incluindo um barramento de sistema de alta velocidade 123 entre o processador 120, a interface de memória/gráfica 121 e a interface de I/O 122, um barramento no lado da frente 124 entre a interface de memória/gráfica 121 e memória de sistema 130, e um barramento de processamento gráfico avançado (AGP) 125 entre a interface de memória/gráfica 121 e o processador gráfico 190. O barramento de sistema 123 pode ser qualquer um dos vários tipos de estruturas de barramento, incluindo, a título de exemplo, e não como limitação, tais arquiteturas incluem o barramento Industry Standard Architecture (ISA) (barramento de arquitetura padrão industrial) barramento Micro Channel Architecture (MCA) (baramento de Arquitetura de Microcanal) e barramento Enhanced ISA (EISA) (barramento ISA potencializado). Na medida em que as arquiteturas de sistema evoluem, outras arquiteturas de barramento e conjuntos de chips podem ser usadas, mas, muitas vezes, geralmente seguem esse padrão. Por exemplo, empresas como a Intel e a AMD sustentam a arquitetura Intel Hub (IHA) e a arquitetura HyperTransport™, respectivamente.

[00328] O computador 110 normalmente inclui uma variedade de meios legíveis por computador. Meios legíveis por computador podem ser quaisquer meios disponíveis que podem ser acessados por computador 110 e incluem tanto meios voláteis quanto não voláteis, e meios removíveis e não removíveis. Por meio de exemplo, e não por limitação, o meio legível por computador pode compreender meios de armazenamento de computador. Os meios de armazenamento de computador incluem tanto meios voláteis quanto não voláteis, e meios removíveis e não removíveis implementados em qualquer método ou tecnologia para o armazenamento de informações, tais como instruções executáveis por computador, estruturas de dados, módulos de programas ou outros dados. O meio de armazenamento de computador inclui memória RAM, ROM, EEPROM, flash ou outra tecnologia de memória, CD-ROM, discos digitais versáteis (DVD) ou outros armazenamentos de disco óptico, cassetes magnéticos, fita magnética, armazenamento em disco magnético ou outros dispositivos de armazenamento magnéticos ou outros elementos de armazenamento que, fisicamente, incorporam os dados eletrônicos e excluem qualquer meio propagado, tais como ondas de rádio ou sinais de portadores modulados.

[00329] A memória do sistema 130 inclui suportes informáticos na forma de memória volátil e/ou não volátil a tais como memória somente de leitura (ROM) 131 e memória de acesso aleatório (RAM) 132. O sistema ROM 131 pode conter dados permanentes do sistema 143, tais como dados de configuração específica de computador. RAM 132, tipicamente, contém dados e/ou módulos de programa que estão imediatamente acessíveis a e/ou atualmente são operados pelo processador 120. A título de exemplo, e não como limitação, a Figura 58 ilustra o sistema de operação 134, os programas de aplicação 135, outros módulos de programas 136, e dados de programa 137.

[00330] A interface I/O 122 pode acoplar o barramento de sistema 123 com uma série de outros barramentos 126, 127 e 128 que acoplam uma variedade de dispositivos internos e externos ao computador 110. Um barramento de interface periférico serial (SPI) 126 pode conectar- se a uma memória de sistema de entrada/saída básico (BIOS) 133 contendo as rotinas básicas que ajudam a transferir informações entre elementos de dentro do computador 110, como durante a partida.

[00331] Um chip super de entrada/saída 160 pode ser usado para ligar um número de periféricos 'legados', tais como disquetes 152, teclado/mouse 162 e uma impressora 196, como exemplos. O chip super de I/O 160 pode ser ligado à interface de I/O 122 com um barramento 127 tal como um barramento de baixa contagem de pino (LPC), em algumas modalidades. Várias modalidades do chip super I/O 160 estão amplamente disponíveis no mercado comercial. Em uma modalidade, o barramento 128 pode ser um Peripheral Component Interconnect bus (PCI) (barramento de interconexão de componente periférico).

[00332] O computador 110 pode também incluir outros meios de armazenamento removíveis / não removíveis, voláteis / não voláteis do computador. A título de exemplo apenas, a Figura 58 ilustra uma unidade de disco rígido 140 que lê de ou escreve para não meios magnéticos removíveis, não voláteis. A unidade de disco rígido 140 pode ser uma unidade de disco rígido convencional.

[00333] O meio removível, como uma memória de barramento serial universal (USB) 153, FireWire (IEEE 1394), ou CD/DVD 156 pode ser conectado ao barramento PCI 128 diretamente ou através de uma interface 150. Outros meios removíveis / não removíveis, voláteis / não voláteis de armazenamento que podem ser utilizados no ambiente operacional exemplificativo incluem, mas não estão limitados a cassetes de fita magnética, cartões de memória flash, discos digitais versáteis, fita de vídeo digital, RAM de estado sólido, ROM de estado sólido, e semelhantes.

[00334] Os drivers e os seus meios de armazenamento de computador associados discutidos acima e ilustrados na Figura 58, fornecem o armazenamento de instruções legíveis por computador, estruturas de dados, módulos de programas e outros dados para o computador 110. Na Figura 58, por exemplo, a unidade de disco rígido 140 é ilustrada como o sistema operativo de armazenamento 144, programas de aplicação 145, outros módulos de programas 146, e dados de programa 147. Note-se que estes componentes podem ser os mesmos ou diferentes do sistema operativo 134, programas de aplicação 135, outros módulos de programas 136, e dados de programa 137. Sistema operativo 144, programas de aplicação 145, outros módulos de programas 146, e dados de programa 147 são dados com números diferentes aqui para ilustrar que, no mínimo, são cópias diferentes. Um usuário pode digitar comandos e informações para o computador 20 através de dispositivos de entrada, como um mouse/teclado 162 ou outra combinação de dispositivo de entrada. Outros dispositivos de entrada (não mostrados) podem incluir um microfone, joystick, game pad, antena parabólica, scanner ou semelhantes. Estes dispositivos de entrada e outros são muitas vezes ligados ao processador 120 através de um dos barramentos de interface de I/O, tais como o SPI 126, o LPC 127, ou o PCI 128, mas outros barramentos podem ser utilizados. Em algumas modalidades, os outros dispositivos podem ser acoplados a portas paralelas, interfaces de infravermelhos, portas de jogos, e semelhantes (não representados), através do chip super de I/O 160.

[00335] O computador 110 pode operar em um ambiente de rede utilizando portas de comunicação lógicas a um ou mais computadores remotos, tais como um computador remoto 180 através de um controlador de interface de rede (NIC) 170. O computador remoto 180 pode ser um computador pessoal, um servidor, um roteador, um PC de rede, um dispositivo peer ou outro nó de rede comum, e tipicamente inclui muitos ou todos os elementos descritos acima relativamente ao computador 110. A ligação lógica entre a placa de rede 170 e o computador remoto 180 representada na Figura 58 pode incluir uma rede de área local (LAN), uma rede de áreas amplas (WAN), ou ambas, mas pode também incluir outras redes. Tais ambientes de rede são comuns em escritórios, redes de computadores de toda empresa, intranets e Internet.

[00336] A Figura 59 ilustra um modelo 3D de uma proteína TFPI 200 mostrando aminoácidos representativos 202, 204, 206 que compreendem a proteína TFPI. A região específica da proteína TFPI de interesse é KD1, não ilustrada especificamente. A superfície mostrada é formada pelo posicionamento dos aminoácidos que constituem a proteína. A superfície formada por aminoácidos específicos na região KD1 é de interesse quando se estuda ou cria um inibidor de TFPI. Como discutido em mais detalhe neste documento, os efeitos biológicos de KD1 são inibidos por ligação de certos aminoácidos dentro da região KD1. Especificamente, estes aminoácidos alvos incluem Ala27, Phe28, Lys29, Ala30, Asp31, Asp32, Lys36, Ala37, Ile38, Phe44, Ile46, Phe47 e Ile55.

[00337] A Figura 60 ilustra um peptídeo 300 que se liga a pelo menos uma parte dos aminoácidos alvos listados acima.

[00338] A Figura 61 é uma ilustração de um método de realizar a modelagem de interação KD1 e peptídeo.

[00339] Um modelo 3D de uma proteína pode ser obtido (bloco 302) e armazenado em uma memória 140 de um computador 110. O modelo pode ser gerado localmente usando uma ferramenta conhecida, ou pode ser obtido a partir de uma fonte pública. Numa modalidade, a proteína é TFPI KD1 200.

[00340] A relação 3D entre um subconjunto selecionado de aminoácidos na estrutura da proteína pode ser determinada (bloco 304). Em uma modalidade, o subconjunto selecionado de aminoácidos compreende Phe28, Lys29, Ala30, Asp32, Ile46, Phe47 e Ile55 e, opcionalmente, compreende ainda Ala27, Asp31, Lys36, e Ile38 e, opcionalmente, compreende ainda Ala37 e Phe44. Alternativamente ou além disso, o subgrupo selecionado de aminoácidos compreende R41, Y53, C59, E60, Q63, R65, E67, E71, K74, M75, N80, N82, R83, I84, I85, T87, F96, C106, C130, L131, N133, M134, N136, F137, E142, N145 e I146. Nem todos os aminoácidos listados aqui são necessários para a ligação ter um efeito inibidor (por exemplo, terapêutico). Isto é, os subconjuntos adicionais deste grupo podem também ter propriedades de interesse.

[00341] Para o subgrupo particular de aminoácidos de interesse, de uma superfície delimitada pelo subconjunto selecionado de aminoácidos pode ser modelada. Um perímetro exterior pode ser definido por aqueles aminoácidos que não têm aminoácidos adicionais de interesse em cada lado. A textura da superfície pode ser definida pela localização 3D de cada aminoácido no subconjunto (bloco 306).

[00342] Um modelo 3D de um composto de ligação a TFPI candidato (por exemplo, um peptídeo) de interesse pode ser gerado e armazenado a uma memória 140 do computador 110 (bloco 308).

[00343] O modelo 3D de peptídeo pode ser coincidido ou ajustado na superfície delimitada pelo subconjunto selecionado de aminoácidos (bloco 310). O melhor ajuste entre os dois pode ser desenvolvido nos pontos de interesse, isto é, n os aminoácidos selecionados de KD1. Várias ferramentas informáticas disponíveis para modelagem 3D e tal ajuste podem ser usadas para criar modelos 3D e coincidir um com o outro. Um exemplo é a ferramenta HADDOCK descrita em: "de Vries, S. J., van Dijk, A. D. J., Krzeminski, M., van Dijk, M., Thureau, A., Hsu, V., Wassenaar, T. and Bonvin, A. M. J. J. (2007), HADDOCK versus HADDOCK: New features and performance of HADDOCK2.0 on the CAPRI targets. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 69: 726-733. doi: 10.1002/prot.21723"

[00344] Os pontos de contato entre o modelo de superfície do subconjunto selecionado de aminoácidos da superfície e o modelo 3D do composto de teste (por exemplo, um peptídeo), podem ser identificados, armazenados e, opcionalmente, exibidos em um monitor 191 de computador 110 (bloco 312). Um composto (por exemplo, um peptídeo), pode ser modificado para aumentar o número de pontos de contato ou a força das ligações nos pontos de contato. Para facilitar a modelagem deste efeito, uma métrica, descrita mais adiante, pode ser desenvolvida para medir a afinidade do composto a se ligar à proteína de interesse, no nosso exemplo, KD1.

[00345] Além disso, os pontos de contato entre a superfície e o modelo 3D do composto podem ser contados (bloco 314) e um índice de afinidade para o modelo 3D do composto pode ser registrado em função do número de pontos de contato (bloco 316). Por exemplo, se todos os 14 aminoácidos acima mencionados são alvos e 12 dos 14 são, na verdade, contatados, ou ligados, pelo modelo 3D do composto, uma classificação de afinidade, de 12/14 ou 0,86 pode ser calculada e registrada.

[00346] No entanto, a classificação de afinidade como uma medida de quão firmemente um composto candidato é acoplado e, portanto, quanto tempo que pode ficar ligado a KD1 pode ser mais bem descrita em termos não só do número de ligações de interesse, mas também o do tipo de ligação. O tipo de ligação para cada um dos pontos de contato também pode ser determinado (bloco 318). No que diz respeito aos peptídeos de ligação a TFPI, as ligações hidrofóbicas com uma distância intermodular de < 4 angstroms podem ser diferenciadas a partir de ligações com uma distância intermolecular de 2,6-3,2 angstroms. Em uma modalidade, as ligações de menos de 3,2 angstroms podem ser atribuídas a uma ponderação de 1,5 e as ligações > que 3,2 angstroms podem ser atribuídas a uma ponderação de 1,25. A classificação de afinidade pode ser atualizada ou recalculada, tendo em conta o tipo de ligação utilizando esta ou outra ponderação (bloco 320). Por exemplo, se, no exemplo anterior, cinco das ligações são ligações curtas e sete das ligações são ligações longas, a nova classificação de afinidade pode ser (5*1,5 + 7*1,25)/14 = 1,16.

[00347] Se apenas 7 aminoácidos de KD1 são alvos e quatro se conectam com ligações curtas, a classificação de afinidade pode ser (4*1,5)/7 = 0,86. No entanto, neste caso, os poucos aminoácidos específicos serão considerados quando são feitas comparações com outras classificações de afinidade. Por exemplo, todas as classificações podem ser normalizadas para um padrão com base no total de sítios alvos desejados.

[00348] Se não mais iterações devem ser realizadas a ramificação "não" do bloco 322 pode ser tomada e os resultados podem ser armazenados para posterior análise e tomada de decisão (bloco 324). Se os peptídeos adicionais ou variantes do peptídeo previamente testados, estão sendo analisados, a ramificação "sim" do bloco 322 pode ser tomada e um modelo novo ou atualizado do peptídeo de interesse pode ser gerado ou obtido e armazenado (bloco 326). As etapas descritas nos blocos 310-320 podem ser repetidas e os resultados da execução atual podem ser comparados com os resultados de ensaios anteriores para determinar quais os peptídeos/variantes têm maiores classificações de afinidade e merecem mais trabalho, incluindo o teste físico possível.

[00349] A capacidade de ter como alvo sítios particulares com modelagem 3D e de gerar uma classificação comparativa permite que centenas, se não milhares de amostras sejam processadas e comparadas com relativa facilidade, evitando o tempo e custo de cristalografia de raios-x. Esta técnica pode ser particularmente aplicável para a modelagem associada com os aminoácidos F28, K29, A30, D32, I46, F47, I55, A27, D31, K36, I38, F2, A37 e F44 de TFPI KD 1 e/ou R41, Y53, C59, E60, Q63, R65, E67, E71, K74, M75, N80, N82, R83, I84, I85, T87, F96, C106, C130, L131, N133, M134, N136, F137, E142, N145, e I146 de TFPI KD1-KD2.

[00350] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citadas nesta especificação são aqui incorporadas por referência como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por referência. Além disso, todo o documento destina-se a ser relacionada como uma divulgação unificada, e deve ser entendido que todas as combinações de características aqui descritas são contempladas, mesmo que a combinação de características que não são encontradas em conjunto na mesma frase, ou número, ou secção do presente documento. Por exemplo, onde a terapia de proteína é descrita, modalidades envolvendo a terapia de polinucleotídeo (utilizando polinucleotídeos / vectores que codificam para a proteína) são especificamente contempladas, e o inverso também é verdadeiro. Embora a invenção anterior tenha sido descrita com algum detalhe a título de ilustração e exemplo para fins de clareza de entendimento, será prontamente aparente para os vulgares peritos na técnica à luz dos ensinamentos deste invento que certas alterações e modificações podem ser feitas ao mesmo sem sair do espírito ou do âmbito das reivindicações anexas. A invenção inclui, por exemplo, todas as modalidades da invenção, de âmbito mais restrito do que de modo algum as variações especificamente mencionadas acima. No que diz respeito aos aspectos da invenção descrita como um género, todas as espécies individuais são individualmente consideradas aspectos separados da invenção. No que diz respeito aos aspectos da invenção descrita ou reivindicada, com "um" ou "uma", deve entender-se que estes termos significam "um ou mais", a menos que inequivocamente contexto requer um significado mais restrito. No que diz respeito aos elementos descritos como um ou mais dentro de um conjunto, deve ser entendido que todas as combinações dentro do conjunto são contempladas. Finalmente, a não ser que um elemento é definido reivindicação recitando a palavra "meio" e uma função sem a recitação de qualquer estrutura, não se pretende que o âmbito de qualquer elemento reivindicação ser interpretados com base na aplicação de 35 USC § 112, sexto parágrafo.

EXEMPLOS

[00351] A presente invenção, desse modo, geralmente descrita, será entendida mais facilmente por referência aos exemplos a seguir, que são fornecidos a título de ilustração e não se destinam a limitar a invenção.

EXEMPLO 1

[00352] O exemplo a seguir descreve a produção, identificação e seleção de peptídeos para ligação a TFPI.

[00353] Os peptídeos candidatos foram obtidos de fornecedores comerciais (por exemplo, PolyPeptide Laboratories SAS (Strasbourg, France) e JPT Peptídeo Technologies GmbH (Berlin, Alemanha)). Os métodos para a síntese de peptídeos candidatos são fornecidos acima. Os peptídeos candidatos foram sintetizados como sais de trifluoracetato (TFA) com uma pureza de >90% ou >60%. Todos os peptídeos foram solvidos em DMSO a uma concentração de estoque de 10 mM. As sequências de peptídeo por ligação TFPI foram identificadas usando uma biblioteca de exibição de mRNA. A tecnologia de exibição de mRNA é superior à outra biblioteca de técnicas de rastreio para permitir uma diversidade de 1014 sequências diferentes dentro de um pool de partida e evitando, por exemplo, as etapas in vivo necessárias para a exposição do fago. Em breve, a tecnologia envolve ligar diretamente mRNA a seu peptídeo candidato codificado através de uma molécula de puromicina (figura 5). O método de visualização do mRNA é adicionalmente descrito no Pedido de Patente Internacional U.S. N° WO 2005/051985 e Liu et al., Methods in Enzymology, 318, 268-293 (2000). O TFPI foi imobilizado para um suporte sólido através de biotina e exposto aos complexos de peptídeo-RNA candidatos. Os complexos de peptídeo-RNA candidatos ligados ao TFPI foram isolados, e o RNA reverso transcrito para obter DNA de codificação. Os ligantes de alta afinidade foram obtidos após seis a dez rodadas de seleção usando uma estratégia evasiva competitiva. Muitos dos peptídeos candidatos tinham 31 aminoácidos de comprimento (flanquamento de 27 aminoácidos randomizados e 2 aminoácidos ambos terminais).

[00354] Os peptídeos selecionados foram sintetizados e submetidos à otimização de peptídeo usando uma análise de varredura baseada em microarranjo para identificar fragmentos de peptídeo mantendo a afinidade de ligação por TFPI. Por exemplo, uma varredura baseada em microarranjo de JBT0047 foi realizada usando uma série de 20 fragmentos de aminoácido do peptídeo, as sequências que sobrepostas por 19 aminoácidos. Brevemente, peptídeos modificados por amino- oxiacetato, de N-terminal, foram impressos em lâminas de vidro de epóxido de Corning. Após a lavagem e a secagem, os slides foram tratados em uma estação de incubação TECAN HS400®. Os slides foram lavados por dois minutos em solução salina Tris-tamponada com 0,1% TWEEN 20® (TBST) e bloqueados por 30 minutos em tampão T- 20 SuperBlock®, baseado em Tris (CaCl2 a 5mm) (Pierce). Após o bloqueio, os slides foram lavados por 2,5 minutos em TBST. Os slides foram posteriormente incubados com TFPI rotulados por DYLIGHT® 649 (a 1 μg/mL em tampão SuperBlock® T-20, baseado em Tris (CaCh a 5mm)) por 45 minutos e lavados duas vezes com TBST de fluxo contínuo por dez minutos. Os slides foram submetidos a uma lavagem final com o tampão de citrato de sódio por solução salina durante dois minutos e secos ao ar por quatro minutos. Os slides foram digitalizados em um scanner de 4000B axônio GenePix® e os exames foram analisados utilizando o software GenePix® Pro. A análise de truncamento de N-terminal e -C complementou a análise de verificação. Os resultados da verificação de microarranjo demonstraram que o peptídeo de JBT0293 ligou-se a TFPI com a mais alta afinidade. Uma série de mutantes de substituição com base na sequência de aminoácidos de JBT0293 foi gerada e testada para as propriedades de ligação de TFPI.

[00355] A afinidade de um subconjunto de peptídeos para TFPI foi demonstrada através de um ensaio imunossorvente ligado por enzima ensaio tipo (ELISA) (ligação (EC50) ELISA) realizado com peptídeos biotinilados. Placas de noventa e seis poços MaxiSorp (Nunc) foram revestidas com 3 μg/mL de TFPI em tampão de revestimento (Na2COβ a 15 mM, NaHCO3 a 35 mM, pH 9,6) durante a noite. As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem a 350 μL (HNaT: NaCI a 175 mM, HEPES a 25 mM, CaCl2a 5 mM, 0,1% Tween 80, pH 7,35), e subsequentemente bloqueadas com 2% extrato de levedura a 200 μL em HNaT por 2 horas. As placas foram então lavadas três vezes com HnaT a 350 μL. Os peptídeos candidatos biotinilados foram diluídos a partir do estoque de DMSO 1/200 em HNaT. A concentração de peptídeo inicial seria 50 μM se nenhum precipitado aparecesse durante a diluição de 1/200 da solução de estoque de peptídeo a 10 mM. As pré- diluições do estoque de peptídeo em DMSO seriam conduzidas se precipitados fossem formados. Os peptídeos diluídos foram aplicados às placas de Maxisorp, as diluições em série (1/3) foram formadas, e as diluições foram incubadas por 1,5 hora à temperatura ambiente. A incubação foi seguida por três etapas de lavagem (HnaT a 350 μL). O peptídeo de ligação foi detectado por incubação com estreptavidina conjugada com perioxidase de raiz forte (1 hora), seguida por três etapas de lavagem com HNaT e uma conversão cromogênica subsequente de TMB adicionado (3,3’5,5’-tetrametilbenzidina). O ensaio é ilustrado na figura 6A.

[00356] Geralmente, a ligação de peptídeo com TFPI imobilizado ficou significantemente acima da pré-existente. Os valores EC50 para peptídeos biotinilados são fornecidos nas figuras 32 a 39. A curva de ligação de um peptídeo de ligação de TFPI, JBT0132, é retratada na Figura 7. O EC50 de JBT0132 foi calculado para ser cerca de 2,2 nM.

[00357] Além disso, a competição (IC50) ELISA foi realizada utilizando peptídeos de ligação com TFPI biotinilados, como "traçadores" para competir com peptídeos candidatos não-biotinilados de ligação por TFPI. O princípio do ensaio é mostrado na figura 6B. Placas de noventa e seis poços Maxisorp (Nunc) foram revestidas com 3 μg/mL de TFPI em tampão de revestimento (Na2COβ a 15 mM, NaHCO3 a 35 mM, pH 9,6) durante a Noite. A concentração de TFPI pode ser alterada dependendo das condições específicas de ensaio; em outros ensaios ELISA de IC50 mencionados neste documento, o tampão de revestimento continha 0,05 μg/mL de TFPI. As placas foram lavadas três vezes com um tampão de lavagem a 350 μL (HNaT: NaCl a 175 mM, HEPES a 25 mM, CaCl2 a 5 mM, 0,1% Tween 80, pH 7,35), e bloqueadas com 2% extrato de levedura a 200 μL, em HNaT por 2 horas. As placas foram então lavadas três vezes com HNaT a 350 μL. Os peptídeos traçadores biotinilados foram aplicados a uma concentração correspondente aos respectivos valores EC90 determinados no ensaio ELISA de ligação (mediana se n> 2). Uma solução de estoque competidora de peptídeo (a 10 mM) foi diluída em 1/33,3 de HNaT sem HSA, e uma diluição de 1/3 em série foi preparada com HNaT com DMSO a 3%. A estratégia utilizada na diluição de um ensaio em particular dependerá da afinidade dos peptídeos. A diluição foi adicionalmente diluída com o peptídeo traçador biotinilado em uma razão de 1:6 (diluição competidora a 20 μL e peptídeo traçador a 100 μL). A mistura de peptídeo competidor e traçador foi aplicada na placa de microtitulação revestida por TFPI e incubou-se durante 1,5 hora. As placas foram lavadas três vezes com HNaT a 350 μL. A ligação de peptídeo-TFPI foi detectada através da aplicação estreptavidina conjugada com HRP da placa de microtitulação, incubando a mistura durante uma hora, lavando a placa três vezes com 350 μL de HNaT, aplicando TMB (3,3'5,5'-tetrametilbenzidina), e detectando a conversão cromogênica subsequente de TMB por HRP. Os gráficos de IC50 para peptídeos não-biotinilados representativos são fornecidos nas figuras 8A a 8D. As medições de IC50, medições de peptídeos JBT0303, JBT0120 e JBT0224 são apresentadas na tabela 3.

[00358] Além do ensaio de competição ELISA (IC50), um ensaio de rastreio foi utilizado para medir o número mais elevado de peptídeos em paralelo. O rastreio ELISA é similar à competição ELISA de IC50 com a exceção de que apenas três concentrações diferentes do competidor foram utilizadas (300 nM, 100 nM e 33,3 nM para a classe JBT0047 e 50000 nM, 16667 nM e 5556 nM para a classe JBT0122). Em alguns casos, os resultados do rastreio foram expressos como percentagem de inibição do sinal do marcador em relação a um peptídeo competidor (peptídeo competidor JBT0477 para a família JBT0047, e peptídeo competidor JBT1697 para a família JBT0122). Os resultados do ensaio de competição de IC50 e os resultados do ensaio de rastreio de peptídeos preparados e testados de acordo com os métodos descritos neste documento são fornecidos nas figuras 32 a 39. A média dos valores de IC50 apresentada nas figuras 32 a 39 é baseada em um maior número de ensaios do que os valores apresentados na tabela 3 e, portanto, os valores podem variar superficialmente. Os resultados de rastreio ELISA são apresentados como percentagem de inibição de ligação do peptídeo traçador JBT0131. Diversos peptídeos que foram analisados utilizando o teste ELISA de IC50 são classificados nas figuras 32 a 39 de acordo com a sua afinidade de ligação conforme definido na tabela 4.

[00359] Os peptídeos de ligação com TFPI exemplares identificados utilizando os métodos descritos neste documento são apresentados na tabela 5. Alguns peptídeos foram biotinilados, e muitos incluem as lisinas de N-terminal e -C para promover a solubilidade. Diversos peptídeos exibiram a atividade inibitória de TFPI em modelo e/ou sistemas de ensaio plasmático, como descrito abaixo.

[00360] Este exemplo fornece os métodos exemplares de geração e caracterização de peptídeos de ligação a TFPI (por exemplo, peptídeos inibitórios de TFPI). Todos os peptídeos na tabela 5 foram encontrados para ligar-se ao TFPI-1α humano. A análise de mutação demonstrou que pelo menos um aminoácido em um peptídeo de ligação por TFPI pode ser substituído, mantendo a afinidade por TFPI. Os peptídeos da tabela 5 testados em ensaios ELISA ligaram-se a TFPI-1α com um EC50 de menos de 10 μM (1 x 10-5 M) e um IC50 de menos de 50 μM.

EXEMPLO 2

[00361] Os peptídeos de ligação a TFPI selecionados foram caracterizados em termos de ligação "anti-alvo". Este exemplo demonstra que peptídeos de ligação de TFPI exibem afinidade reduzida para proteínas de não-TFPI-1.

[00362] TFPI-2 foi selecionado como um anti-alvo devido à sua semelhança com o TFPI-1. As cinéticas de ligação de peptídeos de ligação a TFPI para TFPI-1 humano (resíduos 29-282 fundidos no C- terminal de um 10 His-tag; MW (peso molecular) de 41 kDa (R&D Systems, Minneapolis, MN; catálogo número 2974-PI)) murino TFPI-1 (resíduos 29-289 fundidos na extremidade de C-terminal para 10 His- tag, MW 41kDa (R&D Systems; catalogue número 2975-PI)), e TFPI-2 (R&D Systems, Minneapolis, MN) foram estudadas usando um BIAcore™ 3000 ensaio de ressonância de plasmon de superfície (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, UK). As proteínas de TFPI foram imobilizados em um chip C1 (GE Healthcare, Order Code: BR-1005-40) por química de acoplamento de amina apontando para 500 EF. Diversos peptídeos de ligação a TFPI foram utilizados como analitos para interagir com as proteínas de TFPI imobilizadas. Uma taxa de fluxo de 30 μL/min foi utilizada. Após 180 segundos, 180 μL de solução de peptídeo foram injetados em seis concentrações diferentes, variando de 3,84 nM a 656,25 nM, seguido por um tempo de dissociação de 480 segundos. O chip foi regenerado com 45 μL de NaOH a 10 mM. Cada experiência de ligação foi precedida e seguida por quatro medições com tampão HBS-P (HEPES a 10 mM, pH 7,4, NaCl a 150 mM, 0,005% P20), acrescidos de 1% DMSO e 0,8% P80. O software BIAevaluation® Versão 4.1 (GE Healthcare) foi empregado para analisar os dados. Os sensorgramas foram ajustados a uma curva de ligação de Langmuir 1:1 para determinar kon e koff e calcular KD.

[00363] Determinados peptídeos testados, por exemplo, JBT0050, JBT0121, JBT0205 e JBT0211, ligados à célula em branco e constantes a partir daqueles sensorgramas não podem ser determinados. JBT0133 mostrou ligação fraca com TFPI-1. Os sensorgramas de outros peptídeos forneceram constantes de ligação confiáveis. Os resultados da análise de BIAcore dos diversos peptídeos de ligação a TFPI são fornecidos na tabela 6 e figuras 19 a 21. Cada um dos peptídeos listados na tabela 6 apresentaram um KD de menos de 10 μM. Além dos peptídeos listados abaixo, JBT0375 e JBT0477, mutantes de substituição de JBT0293 na posição de aminoácido 5 (JBT0375) ou posições de aminoácido 5 e 10 (JBT0477), também exibiram um KD de menos de 10 μM. JBT1837 (SEQ ID NO: 1044) também demonstraram um KD de menos do que 10 μM (KD = 0,5 nM; kon = 8 x 103 1/Ms; koff = 1.3 x 10-6 1/s). Os sensorgramas de dois dos peptídeos são fornecidos como figuras 9A e 9B.

[00364] A interação com o anti-alvo TFPI-2 também foi examinada. O sinal máximo gerado a partir da interação de peptídeo candidato com TFPI-2 humano foi muito mais baixo do que os sinais obtidos com TFPI- 1 como um parceiro de interação. A análise cinética de sinais de ligação de TFPI-2 baixos foi sujeita a erros e, portanto, a comparação visual dos sensorgramas foi utilizada para estimar a afinidade de ligação. Um sensorgrama ilustrando a ligação de JBT0120 a TFPI-1 e TFPI-2 é fornecido como figuras 10A e 10B. JBT0120 liga-se a TFPI-2 com afinidade 10 vezes mais baixa em comparação com a sua afinidade de ligação ao TFPI-1. JBT0132 também foi encontrado expor, pelo menos, uma afinidade 10 vezes maior afinidade para o TFPI-1 do que para o TFPI-2.

[00365] Os dados fornecidos por este exemplo confirmam que os peptídeos de ligação a TFPI se ligam especificamente a TFPI-1.

EXEMPLO 3

[00366] O exemplo seguinte descreve a caracterização da atividade inibitória de TFPI dos peptídeos selecionados identificados no Exemplo 1 utilizando a inibição de FXa e os ensaios de inibição de tenase extrínseca. Ambos os ensaios são preditivos de atividade em sistemas plasmáticos. O ensaio de tenase extrínseca fornece uma visão sobre a influência dos peptídeos em (a) interação de FXa e TFPI e (b) interação do complexo FXa-TFPI com o complexo TF-FVIIa. O ensaio de inibição de FXa mede a influência de um peptídeo sobre a interação de FXa e TFPI apenas.

[00367] O complexo de tenase extrínseca é responsável pela ativação de FX e FIX após o início do processo de coagulação. O complexo extrínseco é composto por FVIIa, Fator de Tecido (TF), e o substrato FX. Para determinar a influência dos peptídeos na inibição mediada por TFPI do complexo de tenase extrínseca, um ensaio enzimático acoplado foi estabelecido. 1/6,25 dos peptídeos foi diluído a partir de estoques a 10 mM em DMSO e adicionalmente diluído por % de diluições em série em tampão ou DMSO para evitar a precipitação indesejada. O TFPI foi diluído em HNaCa-HSA ou BSA (HEPES a 25 mM; NaCl a 175 mm; CaCl2 a 5mM, 0,1% HSA ou de BSA, pH 7,35). FVIIa, TF lipidado, vesículas fosfolipídicas (DOPC/POPS 80/20), e o substrato cromogênico específico para o FXa (S-2222 (disponível a partir de DiaPharma, West Chester, OH)), todos diluídos em HNaCa- HSA, foram adicionados a placas de 96 poços. Após um período de incubação, as diluições de TFPI e peptídeo foram adicionadas, resultando em uma concentração final de DMSO a 2,5% (se presentes no estoque de peptídeo). A ativação de FX foi iniciada pela adição de FX aos poços. FXa mediado por conversão do substrato cromogênico foi determinado pela observação de um aumento de absorvência utilizando um leitor de microplacas. A quantidade de FXa gerada em determinados momentos foi calculada a partir das leituras de OD. O FXa gerado em 20 minutos após o início da reação foi considerado para o cálculo de EC50 a partir de gráficos de concentração do peptídeo versus a inibição de TFPI (%).

[00368] A inibição funcional de TFPI também foi examinada utilizando um ensaio de inibição de FXa. Um substrato cromogênico específico de Fxa (S-2222) e TFPI, ambos diluídos em HNaCa-HSA, foram adicionados a placas de 96 poços. 1/6,25 dos peptídeos foi diluído a partir de estoques a 10 mM em DMSO e adicionalmente diluído por % de diluições em série em tampão ou DMSO para evitar a precipitação indesejada. As diluições de peptídeo (2,5 μL) foram adicionadas às placas de 96 poços, o que resulta em uma concentração final de 2,5% DMSO (se presentes no estoque de peptídeo). A conversão do substrato cromogênico foi desencadeada pela adição de FXa, e a cinética da conversão foi medida em um leitor de microplaca. Pelo fato de TFPI inibir FXa lentamente, as leituras de OD após 115 minutos, foram consideradas para o cálculo de EC50 a partir de gráficos de concentração do peptídeo versus a inibição de TFPI (%).

[00369] Os resultados do ensaio de tenase extrínseca e do ensaio de inibição de FXa são fornecidos na tabela 7 e figuras 22 a 27.

[00370] Re ferindo-se à tabela 7, JB T0120, JBT0132, e JBT0224 restauraram a ativação de FX mediada pelo complexo extrínseco na presença de TFPI-1 com um valor de EC50 de <2 μM, resultando em entre cerca de 20% a cerca de 60% inibição da atividade de TFPI. JBT0047 (EC50 = 1,4 μM), JBT0131 (EC50 = 2,2 μM), e JBT0293 (EC50 = 2,9 μM) também restauraram a atividade de complexo extrínseco, na presença de TFPI-1. Além disso, JBT0120, JBT0132, JBT0224 e JBT0303 restauraram a atividade de FXa na presença de TFPI-1 com um valor de EC50 de <5 μM, resultando em entre cerca de 5% a cerca de 50% inibição da atividade de TFPI, no ensaio de inibição de FXa. JBT0047 (EC50 = 0,7 μM), JBT0131 (EC50 = 8,2 μM), JBT0293 (EC50 = 1,3 μM), JBT0297 (EC50 = 0,6 μM), e JBT0305 (EC50 = 2,3 μM) também restauraram a atividade de FXa na presença de TFPI-1 no ensaio de inibição de FXa. Este exemplo confirma que os peptídeos da presente invenção são antagonistas de TFPI.

EXEMPLO 4

[00371] Neste exemplo, a atividade inibitória de TFPI dos peptídeos é estabelecida usando um ensaio baseado em plasma.

[00372] A influência dos peptídeos na geração de trombina foi medida em duplicado, através de trombografia automatizada calibrada em um leitor Fluorskan Ascent® (Thermo Labsystems, Helsinki, Finlândia, excitação de filtros de 390 nm e emissão de 460 nm) após a clivagem lenta de substrato fluorgênico específico de trombina Z-Gly- Gly-Arg-AMC (Hemker, Pathophysiol. Haemost. Thromb., 33, 4-15 (2003)). O plasma de pacientes com deficiência de FVIII ou FIX (George King Bio-Medical Inc., Overland Park, KN) foi obtido para o ensaio. A atividade do fator de coagulação residual para cada um dos plasmas foi inferior a 1%. Como um modelo para a deficiência de FVIII mediada pelo anticorpo, um plasma normal agrupado congelado (George King Bio-Medical Inc., Overland Park, KN) foi incubado com título elevado, inativado por calor, plasma FVIII anti-humano criado em cabra (4490 BU/mL; Baxter BioScience, Vienna, Austria), dando origem a 50 BU/mL. Os plasmas foram misturados com inibidor de tripsina de milho (CTI) (Hematologic Technologies, Inc., Essex Junction, VT) para inibir a contaminação do Fator XIIa, resultando em uma concentração final de 40 μg/mL.

[00373] O plasma preaquecido (37°C) no plasma (80 μL) foi adicionado a cada poço de uma microplaca de 96 poços (Immulon 2HB, clear U-bottom; Thermo Electron, Waltham, MA). Para disparar a geração de trombina pelo Fator de Tecido, 10 μL de baixo reagente de PPP contendo pequenas quantidades (12 pM) de Fator de Tecido humano recombinante e vesículas fosfolipídicas compostos por fosfatidilserina, fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina (48 μM) (Thrombinoscope BV, Maastricht, Holanda) foram adicionados. 1/7,5 dos peptídeos foi diluído a partir de estoques a 10 mM com DMSO e adicionalmente 1/8,33 com Aqua-Dest resultando em uma concentração de 12% DMSO, proporcionando uma concentração de 0,5% DMSO na mistura de ensaio final. Pouco antes de colocar a placa em um leitor preaquecido (37°C), 5 mL de solução salina tamponada com HEPES a 5 mg/mL de albumina sérica humana (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, Missouri, USA) ou 12% DMSO em Aqua-Dest foram adicionados, seguidos da adição de diluições de peptídeo ou proteína de referência (FVIII Immunate reference standard (Baxter BioScience, Vienna, Austria); padrão de referência de atividade passando pelo inibidor do Fator VIII (FEIBA) (Baxter BioScience, Vienna, Austria); NovoSeven (Novo Nordisk, Denmark); e plasma humano purificado FIX (Enzyme Research Laboratories, South Bend, IL)). A geração de trombina foi iniciada por meio da supressão em cada poço de 20 μL de reagente FluCa (Thrombinoscope BV, Maastricht, The Netherlands), contendo um substrato fluorgênico e CaCl2 tamponado por HEPES (a 100 mM). A intensidade da fluorescência foi registrada a 37°C.

[00374] Os parâmetros das curvas de geração de trombina resultantes foram calculados utilizando software Thrombinoscope™ (Thrombinoscope BV, Maastricht, The Netherlands) e calibrador de trombina para corrigir o filtro interno e efeitos de consumo de substrato (Hemker, Pathophysiol. Haemost. Thromb., 33, 4-15 (2003)). Para o cálculo da atividade de geração de trombina de determinadas concentrações de peptídeo equivalentes às proteínas de referência (por exemplo, o padrão de referência FVIII Immunate®, padrão de referência FEIBA), as quantidades de trombina no pico de cada curva de geração de trombina (pico de trombina, nM) foram plotadas contra as concentrações padrão, e estão ajustadas com um algoritmo não linear. Com base nesta calibração, atividades equivalentes de FVIII Immunate, FIX, FEIBA ou NovoSeven foram calculadas. Os resultados para diversos peptídeos são fornecidos nas figuras 12 a 18 e 28 a 30. Os resultados representativos são fornecidos na tabela 8. (* indica que o plasma deficiente de FVIII foi obtido a partir de um doador diferente).

[00375] Com referência à tabela 8, JBT0120, JBT0132, JBT0224 e JBT0303 aperfeiçoaram a geração de trombina dependente de TFPI em um plasma com depleção de FVIII a níveis superiores a 1% do nível de geração de trombina no plasma contendo FVIII (% da atividade equivalente de FVIII). Os peptídeos testados exibiram cerca de 5% a 40% da atividade equivalente de FVIII em plasma deficiente de FVIII. JBT0120 e JBT0132 aperfeiçoaram pico de trombina e o tempo de pico, dose dependente, tal como ilustrado nas figuras 11A e 11B.

[00376] Os mutantes de substituição com base na sequência de aminoácidos de JBT0293 também foram testados em um ensaio baseado em plasma, bem como a inibição de FXa e o ensaio de inibição de tenase extrínseca descritos no exemplo 3. Os resultados representativos são fornecidos na tabela 9.

[00377] Além disso, JBT0477, que compreende a sequência de aminoácido de JBT0293 mas para substituições em posições de aminoácido 5 e 10 da sequência de JBT0293, aperfeiçoa a geração de trombina equivalente a 413 mU/mL de FVIII (em 1 μM de peptídeo) no plasma deficiente de FVIII. A mutação de substituição de JBT0293 resultou em peptídeos altamente otimizados em relação à afinidade para TFPI e atividade melhorada em inibição de Fxa, inibição de tenase extrínseca e ensaios baseados em plasma.

EXEMPLO 5

[00378] O exemplo seguinte demonstra que os peptídeos da presente invenção podem ser modificados pela adição de grupos que melhoram as propriedades físico-químicas ou farmacocinéticas dos peptídeos. Conforme ilustrado a seguir, a adição de PEG de 40 kDa aos peptídeos aqui descritos melhorou dramaticamente o comportamento farmacocinético dos peptídeos. O exemplo também descreve a otimização de um peptídeo de ligação a TFPI, JBT1857, para reduzir a susceptibilidade à proteólise.

[00379] Os métodos de conjugação de porções químicas ou biológicas de peptídeos são conhecidos na técnica. Para adicionar PEG (polietileno glicol) aos peptídeos aqui descritos, um grupo funcional (AOA = acetato de amino-óxi) foi adicionado à extremidade de N- terminal dos peptídeos para o acoplamento de aldeídos e cetonas. Alternativamente, uma cisteína foi adicionada à porção de C-terminal do peptídeo para o acoplamento com maleimida (Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996)). Os peptídeos (JBT1586) AOA-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2 (SEQ ID NO: 166) e (JBT1587) Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKLC-NH2 (SEQ ID NO: 167) foram utilizados para a modificação de N-terminal e C-terminal com PEG, respectivamente. AOA-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL- NH2 (SEQ ID NO: 166) e Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKLC-NH2 (SEQ ID NO: 167), foram incubadas com excesso de 40 kDa de mPEG- Propionaldeído (SUNBRIGHT ME-400AL2, NOF, Japão) e 40 kDa de mPEG-maleimida (SUNBRIGHT ME-400MA, NOF, Japan), respectivamente. Os peptídeos Peguilados resultantes, JBT1852 e JBT1855, mostram afinidades semelhantes em relação à estrutura a partir de Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2 (JBT0740) (SEQ ID NO: 66).

[00380] Os peptídeos Peguilados resultantes demonstraram a estabilidade de plasma significativamente aumentada e meia vida de plasma prolongada em camundongos. A figura 31 ilustra os resultados de uma análise farmacocinética do peptídeo livre JBT0740 (Ac- FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2) (SEQ ID NO: 66) em comparação ao peptídeo PEGuilado de C-terminal JBT1855 (Ac- FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKLC ( PEG (40 kD))-NH2) (SEQ ID NO: 252), após uma administração intravenosa a camundongos. Em contraste com o peptídeo não-PEGuilado, o peptídeo PEGuilado está presente em concentrações elevadas no plasma de camundongo por 100 minutos após a administração. O peptídeo não-PEGuilado é rapidamente removido do plasma. A figura 40 ilustra os resultados de um estudo farmacocinético de JBT1855 seguindo injeção subcutânea. JBT1855 também melhorou fortemente a geração de trombina no ensaio descrito no exemplo 4 (figura 41).

[00381] Os peptídeos JBT1852 e JBT1855 também foram caracterizados nos ensaios descritos nos exemplos 1 a 4 e comparados ao JBT0740 e outros peptídeos na família de JBT0047. Os resultados representativos são fornecidos na tabela 10 indicada abaixo.

*formulado em 25 mm de HEPES, pH 7,35, NaCl a 175 mM

[00382] Os peptídeos listados na tabela 10 também foram ensaiados para interação com o anti-alvo TFPI-2 e gerados sinais muito baixos para medição de afinidade confiável. Os dados sugerem que a PEGuilação não retiram a atividade inibitória dos peptídeos inventivos ou afetam negativamente a seletividade para o TFPI-1. Ensaio de Tenase Extrínseca de base celular

[00383] A capacidade dos peptídeos de ligação a TFPI descritos acima para restaurar a conversão de FX para Fxa mediada pelo complexo de tenase extrínseca foi determinada utilizando um ensaio de tenase extrínseca de base celular. O ensaio de tenase extrínseca de base celular também foi empregado para explorar a influência de peguilação em um peptídeo de ligação a TFPI exemplar da invenção, JBT0740. As células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) foram contadas e semeadas em meio de crescimento completo em uma placa de 96 poços (nitidamente preta com fundo claro) a uma densidade de 1,5x104 células por poço. As células foram crescidas durante a noite (durante cerca de 16 a 18 horas), lavadas duas vezes com um meio basal preaquecido, estimuladas com 1 ng/mL de TNFα recombinante (Sigma Aldrich (Cat.No. T6674)) em 200 μL de meio basal durante quatro horas a 37°C, e lavadas duas vezes com 200 μL de tampão de cultura de células preaquecido. O tampão (50 μL) contendo FVIIa (Enzyme Research Laboratories), o TFPI de ligação de peptídeos (dissolvido em DMSO ou solução salina tamponada com Hepes, com ou sem 0,1% Tween-80), ou anticorpos de αTFPI foram aplicados às células e incubados durante 20 minutos a 37°C, permitindo a formação do complexo de FVIIa/TF e ligação de antagonistas de TFPI a TFPI. Após o período de incubação, 50 μL de tampão de cultura de célula contendo um substrato específico de FX e Fxa (Fluophen FXa (HYPHEN BioMed)) foram aplicados, resultando em um volume final de 100 μL de mistura tampão de cultura de célula nas células. As concentrações finais foram: 39 pM FVIIa; 170 nM de FX, 250 μM de Fluophen FXa, e 2,5% DMSO (quando os peptídeos foram dissolvidos em DMSO).

[00384] A placa de 96 poços foi transferida para um leitor de fluorescência preaquecido (37°C) para a detecção de conversão do substrato fluorogênico específico de Fxa por FXa, que é gerada pelo complexo de TF/FVIIa na superfície de HUVECs estimulados. As leituras feitas depois de nove minutos de incubação foram utilizadas para calcular o efeito inibitório de TFPI dos peptídeos de ligação a TFPI ou anticorpos. A inibição percentual aproximada de TFPI observada em diversas concentrações dos seguintes peptídeos (que pertencem à família de JBT0047) é apresentada na tabela 11: JBT0717 (Ac-FQSK- NMG-NVFVDGYFERLRAKL-NH2) (SEQ ID NO: 61), JBT0740 (Ac- FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2) (SEQ ID NO: 66), JBT1584 (Ac- FQSK-NMG-NVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2) (SEQ ID NO: 164), e JBT1857 (Ac-Aib-FQSKpNVHVDGYFERL -AKL-NH2) (SEQ ID NO: 178).

[00385] Os peptídeos Peguilados também foram testados usando o ensaio de tenase extrínseca de base celular. JBT0740 (SEQ ID NO: 66) foi conjugado com uma porção PEG de 1 kD em N-terminal para produzir JBT1853 ou em C-terminal para produzir JBT1854. JBT1853 e JBT1854 inibiram TFPI em 20% ou menos, dependendo da quantidade de peptídeo utilizado no ensaio. JBT1855, que compreende uma porção PEG de 40 kD em C-terminal (peptídeo parental, JBT0740) teve um melhor desempenho no ensaio de base celular do que JBT1852, que compreende uma porção PEG de 40 kD na extremidade de N-terminal. JBT1855 mediou 20 a 30% inibição de TFPI, enquanto JBT1852 inibiu a atividade de TFPI em 10% ou menos.

[00386] Os peptídeos da família JBT0120, JBT0120, JBT0415, JBT0444, JBT1426 e JBT1837, também foram testados no ensaio de tenase extrínseca de base celular e encontrados a inibir o TFPI a um grau menor em comparação com peptídeos da família de JBT0047. A atividade inibitória parcial ou reduzida pode ser desejável em algumas modalidades da invenção. Semelhante aos peptídeos da família de JBT0047, a optimização de peptídeo aumentou a atividade inibitória de TFPI de peptídeos da família de JBT0120.

[00387] No decurso da análise da estabilidade e atividade inibitória de JBT1857, determinou-se que a sequência de aminoácidos do peptídeo continha um local de clivagem de protease entre Val9 e Asp10. A substituição de Tle na posição 9 (gerando JBT2431) e a substituição de Pro na posição 10 (gerando JBT2432) bloqueou a clivagem do peptídeo e melhorou a estabilidade do plasma do peptídeo em cerca de três vezes a partir de 27% (JBT1857) a 82% (JBT2431) e 76% (JBT2432). Um local de clivagem putativo adicional foi identificado entre Gly11 e Tyr12. Uma substituição G11a (gerando JBT2414) melhorou a estabilidade do peptídeo de 100%. Todas as estabilidades foram determinadas por ELISA quantitativo após 24 horas de incubação em plasma humano.

[00388] Os resultados descritos acima demonstram que a otimização dos peptídeos de ligação a TFPI aqui descritos utilizando aminoácidos não convencionais melhorou a inibição de TFPI e a estabilidade do plasma. Além disso, os peptídeos peguilados da invenção inibem a atividade de TFPI em um ensaio de tenase extrínseca de base celular, com os peptídeos peguilados de C-terminal desempenhando melhor do que os peptídeos peguilados de N-terminal. Os peptídeos de ligação a TFPI da presente invenção inibem a atividade de TFPI livre e TFPI ligado à célula.

EXEMPLO 6

[00389] O exemplo seguinte ilustra a capacidade dos peptídeos descritos na presente invenção para reduzir a hemorragia, em um modelo animal.

[00390] Camundongos de dez semanas de idade C57Bl/6NCrl foram alojados durante duas semanas antes do estudo. Trinta minutos antes de levar uma picada na unha, os animais foram administrados (a) JBT1855 (10 mg/kg) por via intravenosa (iv) através da veia da cauda ou por via subcutânea (sc) no pescoço, (b) o anticorpo anti-TFPI (18 mg/kg, iv), ou (c) veículo (NaCl a 175 mM, HEPES a 25 mM, pH 7,35, a 10 ml/kg, iv). Os animais foram anestesiados com 80 mg/kg de pentobarbital dez minutos antes de levar uma picada na unha. Para alcançar o sangramento, a unha do dedo pequeno da pata traseira direita foi removida. A pata foi submersa em uma solução de 0,9% NaCl, para a coleta de sangue durante um período de 60 minutos. A perda de sangue foi quantificada por espectrofotometria após a lise. A temperatura foi mantida constante a 37°C ao longo do decorrer da experiência. Os resultados do estudo estão ilustrados na figura 42 e resumidos na Tabela 12.

[00391] Na administração intravenosa ou subcutânea de JBT1855, um peptídeo peguilado da invenção, reduziu a perda de sangue em camundongos em comparação ao tratamento com veículo apenas. EXEMPLO 7

[00392] O exemplo seguinte descreve a caracterização de interações de peptídeo com TFPI através de ressonância magnética nuclear e cristalografia de raio-X. Em particular, o local de ligação de TFPI dos peptídeos antagonistas JBT0303, JBT0122 e JBT0415, os resíduos de JBT0303, JBT0122 JBT0415 e interagindo com TFPI160, e a estrutura secundária de JBT0303 livre e complexado, JBT0122 e JBT0415 foram investigados em um nível molecular utilizando espectros de coerência quântica simples de 2D 15N-heteronucleares (HSQC). A interação de JBT1857 e KD1 de TFPI foi examinada utilizando cristalografia de raio- X, e os resíduos de TFPI KD1 que medeiam a ligação de JBT1857 foram mapeados.

Identificação do sítio de ligação de JBT0303 em TFPI160

[00393] A preparação de 15N-marcado de TFPI160 foi usada para experiências de titulação de TFPI160 com JBT0303. Os espectros HSQC de uma amostra 15N-TFPI160 de ~500 μM sem e com quantidades crescentes de peptídeo foram registrados a 30°C em um espectrômetro Varian de 600 MHz. A interação de proteína-peptídeo mostrou um comportamento de troca lenta (kθx << Δw), o que significa que cada resíduo de TFPI resulta em um sinal definido para a proteína livre e do complexo de proteína-peptídeo. Ao contrário do comportamento de troca rápida (kex >> Δw), no caso de uma mistura em apenas um pico, com posição média de acordo com a população de espécies, o comportamento de troca lenta não permite o rastreamento dos sinais sobre a ligação de peptídeo. Desse modo, a fim de localizar o local de ligação, os picos deslocados do complexo de TFPI160- JBT0303 precisavam ser atribuídos. Isto exigiu a preparação de uma amostra de 13C/15N-TFPI160 e JBT0303.

[00394] Inicialmente, uma amostra foi preparada com 992 μM de 13C/15N-TFPI160 e 1190 μM de JBT0303. No entanto, a amostra de RMN resultou em espectros de baixa qualidade, que não permitem a avaliação do complexo. A amostra gelificou, provavelmente devido à formação de agregados de alto peso molecular. Desse modo, os dados de RMN obtidos predominantemente mostraram sinais provenientes das partes mais flexíveis de TFPI160 marcadas por isótopo. Portanto, as condições das amostras foram reinvestigadas para outras experiências. A partir de uma série de experimentos 15N-HSQC conduzidos no complexo de TFPI160-JBT0303, concluiu-se que a formação de gel pode ser evitada por diluição da amostra e aquisição de dados à temperatura elevada. A concentração final de 13C/15N- TFPI160 ficou de 331 μM e que a de JBT0303 ficou 397 μM. A qualidade dos espectros foi melhorada. Devido à concentração mais baixa e a razão de sinal-para-ruído reduzida, a avaliação teve de ser feita com base em experimentos de HNCA, HNCO e HNCOCA.

[00395] Com exceção de quatro resíduos previamente avaliados, todos os resíduos que poderiam ser avaliados em apo-TFPI160 poderiam ser avaliados no complexo de TFPI160-JBT0303. A avaliação de alguns resíduos era ambígua devido à falta de picos nos espectros 3D. Além disso, os picos de três resíduos eram apenas visíveis no espectro de HSQC a partir do experimento de titulação original. No entanto, todos os picos próximos onde inequivocamente avaliados e, consequentemente, a avaliação desses resíduos é provável que esteja correta.

[00396] As alterações de desvios químicos dos sinais de HSQC de 15N-TFPI160 ligado a JBT0303 em comparação com o TFPI160 livre encontram-se ilustradas na figura 43. Os resíduos submetidos ao desvio químico mais forte estavam exclusivamente no domínio Kunitz 1. Os desvios químicos de resíduos F25, F28, D32, A37, T48 e Y56 deslocaram mais (> 2 ppm). Os resíduos I38, I46, F47 e F54 também deslocaram mais do que 1,5 ppm. Não está claro se os resíduos de N- terminal de F25 estão envolvidos na interação com JBT0303, pois os resíduos 20 a 24 não são avaliados. L19 mostra uma alteração de desvio químico no valor de ~ 0,6 ppm. Desse modo, em contraste com as crenças precedentes, de que os aminoácidos dentro dos resíduos 1 a 18 de TFPI estão envolvidos no peptídeo de ligação, os presentes dados sugerem que existe pouca, se nenhuma, ligação de peptídeo à cauda de N-terminal de TFPI. Um modelo de fita da estrutura secundária da proteína de TFPI ilustrando as regiões de alterações de desvios químicos dos sinais de HSQC de TFPI160 ligado a JBT0303 em comparação com TFPI160 livre é apresentado na figura 44.

[00397] Para identificar mais especificamente o local de ligação de JBT0303 em TFPI160, as taxas de troca de amida de 15N-TFPI160 e 15N-TFPI160+JBT0303 foram determinadas. O experimento de troca de amida detecta principalmente alterações no ambiente da estrutural principal do peptídeo pela medição de troca de H de grupos amida. A frequência de H2O é irradiada com uma potência suficientemente elevada que não é dissipada pelo relaxamento, resultando em uma saturação completa e supressão do sinal de H2O. Um efeito colateral deste método de supressão do sinal de H2O é que a supressão é transferida para NHs de amida permutável, que troca com solvente (troca H/H). A transferência de saturação é dependente da taxa de troca H / H, que é semiquantitativa. O efeito é reduzido para os grupos NH mais protegidos (isto é, NHs desprotegidos são mais atenuados do que NHs protegidos). Se um NH protegido encontra-se em proximidade a H- alfa de um ligante, uma maior taxa de troca será observada em comparação com a forma de apo. De modo similar, as trocas de H podem ser mediadas por grupos OH de Ser, Thr ou Tyr.

[00398] Os espectros de HSQC sem e com supressão de água de apo-15N TFPI160 e o complexo de 15N-TFPI160-JBT0303 foram registrados. A taxa de troca relativa de cada resíduo de TFPI160 foi determinada calculando a razão entre as intensidades dos picos nos espectros de HSQC com e sem supressão de água. Uma comparação entre os conjuntos de dados de 15N-TFPI160 e 15N-TFPI160+JBT0303 revelou que os resíduos de TFPI 25, 26, 36, 62, 63, 127, 132 e 152 exibiram mais do que 10% redução da taxa de troca de amida do complexo, à medida que os resíduos 29, 30, 42, 45, 49, 50, 56, 66 e 98 apresentaram mais de 10% aumento da taxa de troca.

[00399] As restrições derivadas do experimento de troca de amida foram incluídas no cálculo de modelos HADDOCK refinados: (a) os ângulos de torção são tomados a partir de cálculos de TALOS para K4, K5, V7, F8, Y12-A18 de JBT0303 (experimentos de desvio químico), (b) resíduos de KD1 com as alterações dos desvios químicos de mais de 1,5 ppm estão envolvidos na ligação de JBT0303: F25, F28, D32, A37, I38, I46, F47, T48, F54 e Y56 (experimentos de desvio químico), (c) o lado hidrofóbico da hélice anfipática de JBT0303 é ligado a KD1: Y12 ou L16 ou L20 de JBT0303 liga-se a D32 ou A37 ou I38 ou F54 ou Y56 de KD1 (experimentos de desvio químico), (d) R15 ou K19 de JBT0303 liga-se a D31 ou D32 ou E60 de KD1 (experimentos de desvio químico), (e) F8 ou V9 de JBT0303 liga-se a F25 ou F28 de KD1 (experimentos de desvio químico), (f) Y12 ou F13 de JBT0303 liga-se a I46 ou F47 ou T48 de KD1 (experimentos de desvio químico), (g) Q2 de JBT0303 se liga a Y56 de KD1 (experimentos de desvio químico), (h) F1 de JBT0303 se liga a M39 ou F66 de KD1 (experimentos de troca de amida), (i) S3 ou K4 ou K5 de JBT0303 liga-se a F66 (experimentos de troca de amida), (j) F8 ou V7 ou V9 de JBT0303 liga-se a F25 ou C26 ou N62 ou Q63 de KD1 (experimentos de troca de amida), (k) V9 ou D10 ou G11 ou R15 de JBT0303 liga-se a F28 ou K29 ou A30 de KD1 (experimentos de troca de amida), (l) Y12 ou F13 de JBT0303 liga-se a N45 de KD1 (experimentos de troca de amida); (m) Y12 ou F13 ou E14 ou R15 liga se a R49 ou Q50 de KD1 (experimentos de troca de amida), e (n) L20 de JBT0303 liga-se a K36 de KD1 (experimentos de troca de amida). Os dados convergidos para essencialmente um modelo do complexo de KD1 + JBT0303.

Identificação do sitio de ligação de JBT0122 em TFPI160

[00400] Tal como acontece com o 13C/15N-TFPI160+JBT0303, a amostra de RMN de 13C/15N-TFPI160+JBT0122 resultou em espectros de RMN de má qualidade, devido à formação de um gel. A concentração de 723 μM de 13C/15N-TFPI160+JBT0122 leva à formação de agregados de ordem superior. A amostra foi diluída a 361,5 mM e os espectros registrados a 37°C, resultando em uma qualidade melhorada dos espectros. Os espectros de HNCO, HNCA e HNCOCA foram adquiridos. Exceto para cinco resíduos, todos os picos previamente avaliados de apo-TFPI160 poderiam ser avaliados no complexo de TFPI160- JBT0122. Os resíduos submetidos a fortes alterações de desvios químicos e suscetíveis de interagir com o peptídeo muitas vezes não resultaram em picos nos espectros 3D. Os picos na região de ligação entre um domínio Kunitz 1 (KD1) e domínio Kunitz 2 (KD2), no entanto, também exibiram baixas intensidades. Desse modo, a atribuição desses picos é ambígua. Alguns picos eram apenas visíveis em HSQC do experimento de titulação original. A sua avaliação era, na maioria dos casos determinada, como os picos sobrepostos em TFPI160 e espectros de HSCQ de TFPI160 + JBT0122.

[00401] As alterações de desvios químicos dos sinais de HSQC de 15N-TFPI160 ligado a JBT0122 em comparação com o TFPI160 livre encontram-se ilustradas na figura 45. As alterações de desvios químicos foram encontradas exclusivamente para resíduos de KD2. Em geral, a extensão das alterações de desvios químicos causadas pela ligação de JBT0122 a TFPI160 foi menos pronunciada do que a de JBT0303. Os resíduos com a mais forte perturbação de desvio químico foram F96, G128, G129, G132, N133 e N136. C97, E101, T111, F114, N135 e F137 foram perturbados, exibindo as alterações de desvios químicos de mais do que 0,5 ppm. Um modelo de fita da estrutura secundária da proteína de TFPI ilustrando as regiões de alterações de desvios químicos dos sinais de HSQC de TFPI160 ligado a JBT0122 em comparação com o TFPI160 livre é apresentado na figura 46.

Identificação dos resíduos de JBT0122 que interagem com TFPI160

[00402] Para a avaliação do sinal de estrutura principal sequencial de JBT0122, o peptídeo de 13C/15N-marcado foi produzido de forma recombinante. Brevemente, o peptídeo foi expresso como uma proteína de fusão com a tiorredoxina em E. coli. O peptídeo 13C/15N-marcado foi preparado utilizando um meio M9 contendo 3,0 g/l de 13C-glicose e 1,0 g/l de 15NH4Cl. A proteína de fusão foi purificada por afinidade utilizando uma coluna de Ni-quelante e uma etiqueta de poli-histidina. O peptídeo foi clivado pela trombina. A tiorredoxina/his-tag e trombina foram removidas, utilizando uma coluna de Ni-quelante e uma coluna de benzamidina, respectivamente. O peptídeo foi então purificado por cromatografia de fase reversa. Pureza, integridade, e identidade foram verificadas através de SDS-PAGE, RP-HPLC e espectrometria de massa. O JBT0122 recombinante foi denominado JBT0788 e tinha dois resíduos adicionais na sua extremidade N-terminal, glicina e serina, que representam os resíduos do local de clivagem da trombina.

[00403] A avaliação de JBT0788 foi feita com base nos espectros de HSQC, HNCACB, HNCA, HNCO e HNN registrados a 10°C em um espectrômetro de Varian de 600 MHz e avaliados utilizando o software SPARKY. A temperatura foi reduzida em comparação com os experimentos de RMN com TFPI160 para melhorar a qualidade de espectros. A partir dos espectros gravados, o carbono de carbonila (C), o carbono alfa (CA), o carbono beta (CB), o próton de amida (H), e o nitrogênio de amida (N) da maioria dos resíduos foram avaliados. A avaliação para os resíduos H13 e R17 foi ambígua. Um HNCOCA conduziu a uma avaliação inequívoca para estes resíduos.

[00404] Uma tabela de avaliação para JBT0788 é fornecida na figura 47. Dois conjuntos de sinais para os resíduos 4 a 12 foram observados nos espectros de JBT0788. Considerando-se que a estrutura primária de JBT0788 não esteja comprometida, os dois conjuntos de sinais de resultado provável de uma isomerização cis/trans da ligação de peptídeo entre F6 e P7. A razão de 76:24 foi determinada para conformação maior:menor com base nas intensidades dos sinais correspondentes no espectro de HSQC. Tal como avaliado a partir do desvio de Cα da prolina, a conformação maior é possível ser trans, como o seu valor de Cα de 63,16 ppm é mais elevada do que a conformação menor (62,49 ppm).

[00405] Um dos propósitos da avaliação foi extrair a estrutura secundária do peptídeo a partir de desvios químicos de Cα. Os desvios químicos de Cα são influenciados por ângulos Φ e Φ e, assim, pela estrutura secundária do peptídeo. Em β-fitas, Cα é geralmente deslocado para reduzir ppm, em α-h^lices, Cα é geralmente deslocado para maior ppm. Subtraindo-se o valor medido de Cα de um valor de bobina aleatório tabulado, os valores negativos são calculados para os resíduos em β-fitas e valores positivos para resíduos em α-h^lices. Desse modo, uma batelada de valores negativos consecutivos indica uma β-fita enquanto uma batelada de valores positivos consecutivos indica uma α-h^lice.

[00406] JBT0788 exibiu uma mancha ampla de valores de Cα aumentados (Δδ (Cα) = Cαmθdido-Cbobina aleatória) indicando uma α-h^lice compreendendo os resíduos 8 a 26. Os valores de Δδ (Cα) para α- hélices estáveis nas estruturas terciárias das proteínas nativas estão normalmente entre 3 a 4 ppm. Os valores de Δδ (Cα) de α-h^lice de JBT0788 subiram para cerca de 1,7 ppm, indicando uma maior flexibilidade do que uma hélice média dentro de uma proteína. Outra característica de JBT0788 é a prolina na posição 7, diretamente de N- terminal para a-hélice, que se ajusta bem como as a-hélices em proteínas são frequentemente terminadas por uma prolina no N- terminal. O resíduo 6 tem um forte valor negativo, que é causado pela prolina vizinha conhecida por forçar o seu N-terminal vizinho a uma conformação similar à β-fita. O valor fortemente positivo do resíduo de C-terminal 31 é também típico de resíduos sem um terminal C-vizinho. A ligação entre o peptídeo F6 e P7 em JBT0788 adota duas conformações, uma conformação trans (76%) e uma cis (24%). A conformação nesta posição influencia a conformação dos resíduos consecutivos. Na isoforma trans, a a-hélice começa imediatamente após P7, a a-hélice da isoforma cis não começa até resíduo L12. Um modelo de fita que ilustra a estrutura secundária de JBT0788 livre é apresentado na figura 48.

[00407] Os desvios químicos dentro de JBT0788 também podem ser utilizados para calcular os ângulos de torção utilizando software TALOS. TALOS é um sistema de banco de dados para a previsão empírica de ângulos de torção da estrutura principal Φ e Φ, utilizando uma combinação de cinco tipos (HA, CA, CB, CO, N) de avaliações de desvio químico para uma determinada proteína ou peptídeo de sequência. O método de TALOS é uma extensão da observação de que muitos tipos de desvios químicos secundários (isto é, as diferenças entre os desvios químicos e os seus correspondentes valores de bobina aleatórios) estão correlacionados com os aspectos da estrutura secundária da proteína. O objetivo de TALOS é utilizar o desvio secundário e a informação de sequência, com a finalidade de fazer previsões quantitativas para ângulos da estrutura principal da proteína Φ e Φ, e para proporcionar uma medida das incertezas nessas previsões. TALOS utiliza os desvios secundários de um determinado resíduo de previsão de ângulos Φ e Φ para esse resíduo. TALOS inclui também a informação a partir de resíduos anteriores e seguintes ao fazer previsões para um determinado resíduo. A ideia subjacente de TALOS é a de que um pode encontrar um tripleto de resíduos em uma proteína de estrutura conhecida com desvios secundários similares e sequência para um tripleto de uma proteína-alvo, então os ângulos Φ e Φ na estrutura conhecida serão preditores úteis para os ângulos no alvo. Na prática, TALOS procura um banco de dados para as 10 melhores correspondências para um tripleto dado na proteína alvo.

[00408] Com a finalidade de avaliar o espectro de HSQC de JBT0788 complexado com TFPI160, uma amostra consistindo em 400 μm de 13C/15N-JBT0788 e 400 μm de TFPI160 foi preparada. Tal como acontece com as amostras de RMN anteriores do peptídeo e TFPI160, a amostra gelificou. A amostra foi diluída e o pellet dissolvido em DMSO deuterado, resultando em uma concentração final de ~300 μM de 13C/15N-JBT0788 + TFPI160 e 5% DMSO. As medições foram realizadas a 40°C. Isto melhora a qualidade do espectro adquirido. Os experimentos foram adquiridos no modo TROSY para dar conta das propriedades de relaxamento de uma amostra parcialmente agregada. A tecnologia de crio-sonda de espectrômetro de Varian de 600 MHz foi empregada, devido à baixa concentração do complexo de proteína- peptídeo na amostra. A qualidade de dados resultantes foi suficiente para obter os desvios de estrutura principal de JBT0788 quando se utiliza a tecnologia de crio-sonda e adquire as experiências de ressonância tripla em duplicado. A avaliação de JBT0788 em complexo com TFPI160 foi realizada com base nos espectros de HNCA, HNCOCA e HNCO. A partir dos espectros gravados, o carbono de carbonila (CO), o carbono alfa (CA), o próton da amida (H), e o nitrogênio da amida (N) da maior parte dos resíduos foram avaliados. Uma tabela de avaliação para JBT0788 complexado com TFPI160 é fornecida na figura 49.

[00409] Uma característica de apo-JBT0788 foi a presença de dois conjuntos de sinais para os resíduos 4 a 12 de aminoácidos, provavelmente resultantes de uma isomerização de cis/trans da ligação de peptídeo entre F6 e P7. No complexo JBT0788-TFPI160, apenas um conjunto de picos é observado, sugerindo que apenas uma das conformações se ligue a TFPI160. Apo-JBT0788 também exibiu uma mancha amplo de valores de Cα aumentados (Δδ (Cα) = Cαmedido — Cαbobina aleatória = positivo) indicando uma a-hélice atingindo do resíduo 8 ao resíduo 26. Como mencionado acima, os valores de Δδ (Cα) para α- hélices estáveis nas estruturas terciárias das proteínas nativas estão normalmente entre 3 a 4 ppm. Os valores Δδ (Ca) de a-hélice de apo- JBT0788 aumentam para cerca de 1,7 ppm, indicando uma maior flexibilidade do que uma hélice média dentro de uma proteína. Quando complexados com TFPI, os resíduos 8 a 26 exibiram valores de entre 3 a 5 ppm, o que indica a formação de uma a-hélice estável ou hélices. Um modelo de fita que ilustra a estrutura secundária de JBT0788 quando complexada com TFPI160 é apresentado na figura 50. Grandes alterações de desvio químico dentro de JBT0788 causadas por ligação a TFPI160 são uniformemente distribuídas ao longo do comprimento do peptídeo. Os resíduos submetidos a perturbação de desvio químico mais forte foram os resíduos S5, A9, Q11, Y28 e K29 com mais do que 4 ppm. Os resíduos Y3, A4, V10, L12, S15, M21, A22, L23, e A24 foram perturbados por mais de 3 ppm.

Identificação de resíduos de JBT0303 que interagem com TFPI160

[00410] JBT0303 foi produzido de forma recombinante utilizando o mesmo procedimento como descrito acima para JBT0122 e marcado com isótopos com 13C e 15N. O JBT0303 recombinante foi nomeado JBT0616 e tinha uma glicina e uma serina adicionais em sua extremidade de N-terminal. A avaliação de JBT0616 foi realizada com base nos espectros de HSQC, HNCACB e HNN, que foram registrados a 10°C em um espectrômetro Varian de 500 MHz e avaliados utilizando o software SPARKY. A qualidade do espectro de JBT0616 foi melhor do que a de JBT0788, embora as condições experimentais, com relação a tampão, temperatura, tubo de RMN, e parâmetros de RMN fossem idênticas. O carbono alfa (CA), o carbono beta (CB), o próton de amida (H), e o nitrogênio de amida (N) da maior parte dos resíduos foram avaliados. A avaliação foi baseada principalmente no menos sensível, mas mais HNCACB informativo ao invés do HNCA. Em combinação com o espectro HNN, isso resultou em uma avaliação inequívoca de todos os resíduos derivados de JBT0303.

[00411] Uma tabela de atribuição para JBT0616 é fornecida na figura 51. A estrutura secundária foi extraída a partir de desvios químicos de Cα e determinada por TALOS utilizando as avaliações de H, CA, CB, CO e N. Tal como JBT0788, JBT0616 exibiu uma mancha de valores Δδ(Cα) positivos indicativos de conformação α-helicoidal. A hélice foi localizada na parte de C-terminal do peptídeo e compreendeu os resíduos 10 a 18. Como para JBT0788, os valores Δδ(Cα) de até cerca de 1,8 ppm foram calculados, qualificando esta hélice como relativamente estável para tal peptídeo curto. Um modelo de fita que ilustra a estrutura secundária de JBT0616 é apresentado na figura 52. O valor fortemente positivo do resíduo de C-terminal 20 é, como resíduo 31 em JBT0788, típico para resíduos sem um C-terminal vizinho. Os resíduos de N-terminal de 1 a 9 de JBT0616 exibiram valores ΔY(Cα) ligeiramente positivos, o que sugere uma preferência para uma estrutura α-helicoidal.

[00412] A avaliação de JBT0616 em complexo com TFPI160 foi realizada usando uma amostra de peptídeo de 13C/15N-marcado com um excesso de TFPI160 não marcado. Os espectros de HSQC, HNCA, HNCOCA e HNCO foram registrados em um espectrômetro Varian de 800 MHz e avaliados utilizando o software SPARKY. Os espectros foram registrados a 30°C. Utilizando estes espectros, o carbono alfa (CA), o carbono beta (CO), o próton de amida (H), e o nitrogênio de amida (N) da maior parte dos resíduos foram avaliados, como estabelecido na tabela da figura 53. A estrutura secundária de JBT0616 em complexo com TFPI160 foi extraída a partir de desvios químicos de Cα e calculada por TALOS. Tal como o peptídeo livre, JBT0616 em complexo com TFPI160 exibiu uma mancha de C-terminal de valores de Δδ(Cα) positivos indicativos de conformação α-helicoidal. A estabilidade de hélice-a é aumentada mediante a formação do complexo. O que foi encontrado sugere que a região de C-terminal de JBT0616 seja o motivo principal de ligação. Os valores Δδ(Cα) para os resíduos de N-terminal também mudaram, mas em menor grau. A estrutura secundária de JBT0616 quando complexada com TFPI é ilustrada no modelo de fita na figura 54.

[00413] As alterações mais significativas de desvios químicos sobre a formação do complexo foi observada para os resíduos de Q2, K5, F8, V9 e A18 de JBT0616 com mais do que 7 ppm. Os resíduos F13, R17, K19 e L20 também foram perturbados e demonstraram alterações de desvios químicos de mais do que 4 ppm. As alterações de desvio químico forte de resíduos em N-terminal indicaram que não é apenas a α-h^lice de C-terminal anfipático que impulsiona a ligação do peptídeo para TFPI160.

[00414] Os resultados a partir dos experimentos de RMN, em combinação com a análise de substituições de JBT0477 foi usada para criar um modelo de KD1 em complexo com JBT0303 usando HADDOCK (High Ambiguity Driven protein-protein DOCKing) software. Haddock é um método de encaixe flexível orientado por informação para a modelagem de complexos biomoleculares. HADDOCK distingue-se de métodos de encaixe ab-initio no fato de que codifica a informação de interfaces de proteína identificadas ou previstas em restrições de interação ambíguas (AIRs) para conduzir o processo de docking. A identificação do local de ligação em TFPI160 e nos peptídeos, conforme revelado pelos dados de desvio químico, os ângulos de torção dos peptídeos tal como determinado pelo software TALOS, e a análise de substituição de JBT0477 fornecem os suportes para o cálculo dos modelos.

[00415] Para o cálculo dos modelos KD1-JBT0303 HADDOCK, as restrições utilizadas foram: (a) os ângulos de torção foram tomados a partir dos cálculos de TALOS para K4, K5, V7, F8, Y12-A18 de JBT0303, (b) os resíduos de KD1 com as alterações de desvio químico de mais de 1,5 ppm estão envolvidos na ligação a JBT0303: F25, F28, D32, A37, I38, I46, F47, T48, F54 e Y56, (c) o lado hidrofóbico da hélice anfipática de JBT0303 está ligado a KD1: Y12 ou L16 ou L20 de JBT0303 liga-se a D32 ou A37 ou I38 ou F54 ou Y56 de KD1, (d) R15 ou K19 de JBT0303 se liga a D31 ou D32 ou E60 de KD1, (e) F8 ou V9 de JBT0303 liga-se a F25 ou F28 de KD1, (f) Y12 ou F13 de JBT0303 liga-se a I46 ou F47 ou T48 de KD1, e (g) Q2 de JBT0303 se liga a Y56 de KD1. A interação de Q2 JBT0303 - Y56 KD1 também foi considerada como um dispositivo de retenção para o modelo de cálculo.

[00416] As alterações de desvio químico forte foram observadas por K5 de JBT0303 até a formação do complexo. Para os resíduos restantes de JBT0303 considerados para conduzir a interação de proteína- peptídeo, os modelos estão em boa concordância com os dados. O modelo de KD1-JBT0303 com os locais de potência mais baixa F8 de JBT0303 na proximidade de F25 e F28 de TFPI, explicando as alterações de desvio químico observadas e os dados da análise de substituição. V9 de JBT0303 interage com a mancha hidrofóbica de KD1 incluindo F54. Y12, F13, L16 e L20 de JBT0303 também enfrentam a mancha hidrofóbica de KD1. A proximidade de Y12 para F28, I46, T48 de F13 a F47, T48, de L16 a F54 e L20 A37, I38 provoca as perturbações observadas de desvio químico de RMN destes resíduos no complexo, a conservação de Y12 e L16 pode ser devida às interações extensas destes resíduos com a proteína. K19 de JBT0303 está em uma posição que permita a interação com D32 de KD1. O papel de R15 de JBT0303 parece haver uma interação com a mancha hidrofóbica de KD1, bem como com D32. Além disso, o modelo explica porque um aspartato carregado negativamente é preferido na posição 10 de JBT0303, que pode interagir com o K29 carregado positivamente de KD1. Uma glicina na posição 11 de JBT0303 está presente, devido às restrições de natureza espacial e conformacional nesta posição. Um modelo de HADDOCK KD1 (resíduos 22-79 de TFPI compreendendo KD1) em complexo com JBT0303 é fornecido na figura 55.

Modelos de JBT0740 e JBT1857 ligados a KD1

[00417] Os peptídeos JBT0740 e JBT1857 (FQSK-dP- NBHBDGYFERL-Aib-AKL (SEQ ID NO: 178)), ambos os derivados de JBT0303, demonstram valores de EC50 significativamente melhorados no ensaio de inibição de FXa-TFPI (a 0,11 Mea 0,0023 μM, respectivamente ) e Kd inferior, tal como determinado por Biacore. Os modelos de JBT0740 e JBT1857 em complexo com TFPI KD1 (resíduos 22-79 de TFPI160) foram calculados por HADDOCK usando restrições similares como para JBT0303: (a) as restrições para os ângulos de torção de resíduos 4 e 5 de JBT0740 e JBT1857 foram alteradas com a finalidade de levar em consideração as substituições na posição 5 dos derivados de JBT0303, (b) os ângulos de torção foram tomados a partir dos cálculos de TALOS para V7, F8, Y12-A18 de JBT0303 e, em contraste com JBT0303, nenhum valor fixo para Phi e Psi foi fornecido para K4 e para NmetG5/dP5, (c) NmetG5 e dP5 estão na configuração cis, (d) os resíduos de KD1 com alterações dos desvios químicos de mais de 1,5 ppm estão envolvidos na ligação com JBT0303: F25, F28, D32 , A37, I38, I46, F47, T48, F54 e Y56 (e) o lado hidrofóbico da hélice anfipática de JBT0303 é ligado a KD1, (f) Y12 ou L16 ou L20 de JBT0303 liga-se a D32 ou A37 ou I38 ou F54 ou Y56 de KD1, (g) os resíduos R15 ou K19 de JBT0303 ligam-se a D31 ou D32 ou E60 de KD1, (h) os resíduos V9 ou F8 de JBT0303 ligam-se a F25 ou F28 de KD1, (i) os resíduos Y12 ou F13 de JBT0303 ligam-se a I46 ou F47 ou T48 de KD1, e (j) o resíduo Q2 de JBT0303 se liga a Y56 de KD1.

[00418] Os modelos energeticamente mais favoráveis HADDOCK de JBT0740 e JBT1857 ilustraram outro modo de ligação em comparação com JBT0303. As diferenças mais óbvias estavam na região dos resíduos 5 a 11. Desvios menos dramáticos foram observados com o N- terminal e C-terminal dos peptídeos. No entanto, a ligação diferente dos terminais também podem contribuir para a ligação otimizada dos derivados de JBT0303 a TFPI.

Estrutura de Cristal de raio-X de JBT1857 ligado a KD1

[00419] A estrutura cristalina de KD1 em complexo com um peptídeo de ligação com KD1, JBT1857, foi determinada. O TFPI recombinante foi expresso em E. coli e oxidativamente redobrado a partir de corpos de inclusão. Os aminoácidos de TFPI 1 a 150 compreendendo um local de clivagem da trombina na junção de sequência do ligante TFPI KD1 e KD2 (TFPI1-150-Trombina (MADSEEDEEHTIITDTELPPLKLMHSF CAFKADDGPCKAIMKRFFFNIFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEE CKKMCTRDNANRLVPRGSQQEKPDFCFLEEDPGICRGYITRYFYN NQTKQCERFKYGGCLGNMNNFETLEECKNICEDG (SEQ ID NO: 4235)), foram clonados em um vetor de expressão de E. coli (pET19b). A sequência de TFPI 1-150-Trombina compreende dois aminoácidos na extremidade de N-terminal, que são artefatos de expressão recombinante, e não fazem parte da sequência do tipo selvagem do aminoácido de TFPI. As sequências que codificam domínios de Kunitz 1 e 2 estão em negrito. E. coli (BL21(DE3)pLysS) foi cultivado em MagicMedia™ e TFPI 1-150-Trombina foi expressa como corpos de inclusão insolúveis. Os corpos de inclusão foram coletados por lise de E. Coli por incubação com BugBuster Master Mix e purificados mediante lavagem com Tris a 50 mM/HCl pH 8, 0,1% Tween 20. Os corpos de inclusão foram dissolvidos em ureia a 8 M, Tris 50 mM/HCl pH 8,0 e TFPI 1-150-Trombina foi reduzida por adição de DTT a 20 mM. A redobragem oxidativa foi realizada por rápida diluição de 1/10 em um tampão contendo Tris a 50 mM/HCl pH 1,1 e glutationa oxidada a 10 mM, seguido por diálise contra excesso Tris a 10 mM/HCl pH 7. A TFPI1-150-Trombina foi purificada através de um protocolo de purificação sequencial usando uma troca iônica de Q Sepharose FF e um meio de afinidade de peptídeo (JBT131). TFPI1-150-TFPI purificado foi digerido proteoliticamente por incubação com trombina (1U trombina/mg TFPI1-150-Trombina, o local de clivagem, LVPR / GS), resultando na geração de Nterm KD1-Trombina (MADSEEDEEHTIITDTELPPLKLMHSFCAFKADDGPC KAIMKRFFFNIFTRQCEEFIGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRDNANR LVPR (SEQ ID NO: 4236)) e KD2-Trombina (GSQQEKPDFCFLE EDPGICRGYITRYFYNNQTKQCERFKYGGCLGNMNNFETLEECKNI CEDG (SEQ ID NO: 4237)). Nterm KD1-Trombina foi purificada a partir da mistura de digestão usando benzamidina sefarose para a remoção de trombina, seguindo-se uma coluna de afinidade de peptídeo JBT131. Nterm KD1-trombina purificada foi usada para a formação do complexo com JBT1857 e adicionalmente cristalização.

[00420] O peptídeo antagonista, JBT1857, foi preparado por síntese em fase sólida. A cocristalização com êxito de complexos equimolares foi obtida sob MES a 100 mM pH 6,5, 20% PEG 4000, NaCl a 600 mM. Cristais difratados melhor que a resolução de 2,5 Â, embora com alguma geminação não mero-hedral. Os dados de diporção foram processados com iMosflm e SCALA do pacote de programa de CCP4, revelando uma forma de cristal monoclínica com dimensões de células da unidade de grupo de espaço C2 a = 113,67 Â, b = 69,32 Â, c = 42,37 A, α = 90,0° β, = 92,97°, Y = 90,0°, (Leslie, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 62(Pt 1), 48-57 (2006); Evans, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 62(Pt 1), 72-82 (2006)). Os cálculos de autorrotação indicaram uma simetria não cristalográfica de aproximadamente duas vezes. Consistente com isto, duas moléculas foram localizadas na unidade assimétrica relacionada por uma rotação de 170°. A pesquisa Patterson foi realizada utilizando-se o programa PHASER e um conjunto de estrutura de estruturas de cristal de domínio Kunitz 2 disponíveis como modelos de pesquisa (McCoy et al., J Appl Crystallogr, 40(Pt 4), 658-674 (2007)). A célula unitária continha cerca de 64% solvente. A densidade média não cristalográfica de elétrons e de construto do modelo e refinamento do modelo foi realizada com programas Coot, Refmac, MAIN e CNS. O modelo atual foi completamente definido para ambas as cópias de peptídeo JBT1857 e a interação com a proteína com corrente R = 0,257, Rfree = 0,298, desvio da geometria ideal rms(ligação) = 0,008 Â, rms (ângulo) = 1,8°.

[00421] Estrutura de JBT1857: a estrutura de JBT1857 pode ser segmentada em (i) âncora de N-terminal consistindo em acetilado PhelAP-Gln2AP, (ii) um laço em forma de Q compreendendo Ser3AP- Asn6AP, (iii) um segmento intermediário e construído a partir de Val7AP His8AP, (iv) um Val9AP-Gly11AP contendo laço de glicina apertado, e (v) uma a-hélice de C-terminal compreendendo Tyr12AP-Leu20AP. Como aqui utilizado, o subscritoAP indica a sequência numérica no "peptídeo antagonista" JBT1857. A conformação de hélice-a é estabilizada por uma alanina de α-metila não natural posicionada no centro da hélice (posição 17AP), uma amida de C-terminal, que completa um padrão de ligação de hidrogênio 1 a 4 de a-hélice; e um conjunto de estoque pelas cadeias laterais aromáticas de His8AP, Tyr12AP e Phe13AP. Estes efeitos cooperam para estabilizar o C- terminal de a-hélice espontaneamente em solução, de acordo com os dados de dicroísmo circular do peptídeo. O empilhamento de cadeia aromática lateral observada (His8AP, Tyr12AP, Phe13AP) impõe uma curva acentuada que só pode ser realizada por glicina na posição 11AP. Esta seleção estrutural é refletida por perdas dramáticas na afinidade de ligação após substituição de Gly11AP por qualquer outro aminoácido. A conformação do segmento de laço de N-terminal é, em parte, estabilizada por uma D-prolina, conhecida por induzir uma conformação de curva fechada, e uma ligação de hidrogênio 1-4 através do oxigênio de carbonila de Ser3AP com o nitrogênio de amida de Asn6AP. Todas as correntes de anel laterais (Tyr1AP, Pro5AP, His8AP, Tyr12AP, Phe13AP) apontam para a mesma direção, o que lhes permite interagir com o domínio KD1 de TFPI.

[00422] Interação de JBT1857 e KD1: as interações entre JBT1857 e KD1 foram determinadas. Os contatos hidrofóbicos são interações com uma distância intermolecular de < 4 Â, enquanto as ligações de hidrogênio têm uma distância entre 2,6-3,2 Â. PhelAP interage não especificamente com TFPI entrando em contato com Phe2 e Ala27. Em contraste, o Gln2AP entra em contato com um pacote profundamente enterrado de TFPI e produz as interações hidrofóbicas com Phe28, Lys29, Ile46 e Phe47. Além disso, o grupo amida do Gln2AP forma três ligações de H com Phe28-CO, Phe44-CO-NH e Ile46. O Q-laço de JBT1857, compreendendo Ser3AP-Asn6AP, medeia interações hidrofóbicas bastante limitadas com a proteína; Ser3AP, Pro5AP Asn6AP e interage com Lys29 e Phe47. Val7AP do segmento intermediário de JBT1857 também se liga a Lys29 e Phe47. His8AP contribui principalmente para interações de empilhamento aromáticas intramoleculares com Tyr12AP e em parte com Phe13AP, e exibe uma interação hidrofóbica com Ala30 de TFPI. De modo similar, a glicina- laço-Val9AP Gly11AP contribui poucos contatos com o domínio Kunitz. Val9AP interage diretamente com KD1 pela formação de uma ligação de hidrogênio com o grupo carbonila de Ala30 e uma interação hidrofóbica com Asp32. Tyr12AP medeia uma ligação de hidrogênio, através do seu grupo hidroxila, com o nitrogênio de amida de Ile55 e uma interação hidrofóbica com Asp30. Leu16AP faz parte de um contato hidrofóbico com Ile55. Além das interações hidrofóbicas em grande parte da hélice de C-terminal do peptídeo, com a proteína, existem interações eletrostáticas entre Arg15AP e Asp32. Além disso, Lys19AP contribui para a ligação a TFPI por formação de uma ligação de hidrogênio para o grupo carbonila de Ala37 e contatos com Lys36 e Ile38. A superfície de contato de TFPI tem um caráter hidrofóbico geral com algumas manchas cartografadas quentes, e uma força motriz da formação de complexos com JBT1857 é a complementaridade da superfície estérica.

[00423] Este exemplo a descreve a caracterização da estrutura secundária de peptídeos exemplificativos da invenção e que correlaciona a estrutura com a função inibitória dos peptídeos. O exemplo também identifica os resíduos de TFPI de aminoácidos que interagem com JBT1857, um peptídeo de ligação de TFPI que inibe a atividade de TFPI.

EXEMPLO 8

[00424] O exemplo a seguir descreve peptídeos de ligação a TFPI adicionais modificados pela adição de porções que aumentam as propriedades físico-químicas ou farmacocinéticas dos peptídeos. O exemplo descreve adicionalmente um método para avaliar a formação de coágulos no sangue todo utilizando tromboelastografia de rotação.

[00425] JBT1857 (família de peptídeo JBT0047) foi conjugado com porções de PEG diferentes, e a afinidade de ligação e a atividade inibitória de TFPI dos peptídeos peguilados foram examinadas. JBT1857 foi modificado pela adição de uma cisteína de C-terminal para produzir JBT2315 (Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKLC-NH2 (SEQ ID NO: 4077)), o qual foi conjugado com a extremidade C-de terminal com porções PEG de maleimida lineares de tamanho crescente: 5 kD, 12 kD, 20 kD, 30 kD e 40 kD, utilizando os métodos descritos no exemplo 5. Os peptídeos peguilados resultantes foram designados como se segue:

Estabilidade, afinidade de ligação, e atividade inibitória de TFP de peptídeos peguilados.

[00426] Os peptídeos peguilados demonstraram a estabilidade do plasma significativamente aumentada em plasma de camundongo e humano. Os peptídeos foram adicionados às amostras de plasma de camundongo ou humano, e a percentagem da quantidade inicial de peptídeo remanescente no plasma de 24 horas após a adição foi medida por IC50 ELISA em placas Maxisorp revestidas com 0,05 mg/mL de TFPI (traçador de peptídeo JBT2271 a 2,26 nM). Menos do que aproximadamente 10% da quantidade inicial de JBT1857 e JBT2317 permaneceram no plasma, enquanto que 40% ou mais da quantidade inicial dos peptídeos de ligação a TFPI permaneceram depois de 24 horas. Cerca de 60% ou mais de JBT2327 e JBT2329 foram detectados. Os peptídeos peguilados também são significativamente mais estáveis em plasma humano em comparação com os peptídeos não modificados. Cerca de 60% ou mais do peptídeo peguilado foram mantidos após 24 horas. Os peptídeos não modificados ficaram mais estáveis no plasma humano do que no plasma de camundongo, cerca de 20% ou mais da quantidade inicial permaneceram após 24 horas de incubação.

[00427] Os peptídeos peguilhados também foram caracterizados nos ensaios descritos nos exemplos 1 a 4 e comparados com JBT1857. Os resultados representativos são fornecidos na tabela 14 indicada abaixo. O ensaio de geração de trombina foi realizado como descrito no exemplo 4, e os resultados são fornecidos como EC50, correspondendo à concentração de peptídeo que melhorou quantidade máxima de trombina de pico (nM).

*Competição ELISA realizada com o traçador JBT2271 (a 1 nM) e 0,05 μg/mL de TFPI no tampão de revestimento.

[00428] A adição de cisteína de C-terminal travada com NEM não influenciou significativamente a afinidade de ligação de JBT2317 ou a atividade do peptídeo na inibição de FXa, ensaio de tenase extrínseca, ou ensaio de geração de trombina em comparação com JBT1857. O tamanho de PEG não impacta significativamente a capacidade dos peptídeos de ligação a TFPI de restaurar a atividade de FXa na presença de TFPI-1. No ensaio de tenase extrínseca de exemplo 3, a atividade inibidora aumentada com porções de PEG de peso molecular mais elevado de até 20 kD PEG. A atividade não melhora adicionalmente para porções de 30 kD ou 40 kD. No ensaio de geração de trombina do exemplo 4, utilizando plasma humano, EC50 diminuiu com o tamanho de PEG, e a inibição máxima de TFPI (medida pelo pico FIIA (nM)) aumentou com o tamanho de PEG. No plasma de camundongo, a ligação de PEG de 40 kD a um peptídeo de ligação a TFPI aumentou a inibição máxima de TFPI.

[00429] A capacidade dos peptídeos de ligação a TFPI peguilados de restaurar a atividade do complexo de tenase extrínseca para a conversão de FX para FXa também foi determinada utilizando um ensaio de tenase extrínseca de base celular utilizando o método do exemplo 5. A adição de cisteína ao C-terminal travada com NEM não influenciou significativamente a atividade de JBT2317 no ensaio de tenase extrínseca de base celular em comparação com JBT1857. A conjugação de porções de PEG (de 5 kD, 20 kD, 30 kD, ou 40 kD) para JBT2317 aumentou a atividade inibitória de TFPI de 5 a 20%. Tromboelastografia rotacional

[00430] A avaliação visco-elástica contínua de formação de coágulo de sangue total humano e firmeza foi realizada por tromboelastografia de rotação com preparações de sangue total, na presença ou ausência de peptídeos. As amostras de sangue de um indivíduo saudável foram atraídas para Sarstedt Mono S citratado (a 0,106 M ou 3,2% (p/v) de Na-citrato) (5 ml), mistura de uma parte de citrato com nove porções de sangue, utilizando uma agulha borboleta de calibre 21. Uma porção das amostras de sangue foi incubada com título elevado, antissoro de FVIII anti-humano inativado por calor produzido em cabra (3876 BU/mL; Baxter BioScience, Vienna, Austria), resultando em 51 BU/mL. As amostras de teste foram preparadas por dissolução de quantidades de peptídeos em DMSO ou solução salina tamponada com HEPES (com ou sem 0,1% Tween 80).

[00431] As gravações foram feitas utilizando um analisador de coagulação de tromboelastografia ROTEM (Pentapharm, Munich, Germany), a 37°C. Resumidamente, o sangue é adicionado a uma cuveta descartável de suporte da cuveta aquecida. Um pino descartável (sensor) é fixado na ponta de um eixo de rotação. O eixo é guiado por um sistema de rolamento de esferas de alta precisão e gira para trás e para frente. O eixo está ligado a uma mola para a medição da elasticidade. A posição exata do eixo é detectada pela reflexão da luz sobre um pequeno espelho no eixo. A perda de elasticidade, quando os coágulos de amostra levam a uma alteração da rotação do eixo. Os dados obtidos são analisados por computador e visualizados em um tromboelastograma. A elasticidade mostra tromboelastograma (mm) versus tempo(s). Uma elasticidade de cerca de zero é observada antes da formação do coágulo iniciar. Os vestígios de imagem do espelho, acima e abaixo da linha de zero indicam o efeito da formação de coágulos na rotação do eixo.

[00432] Antes de iniciar cada experiência, o sangue tratado com citrato foi misturado com todo o inibidor de tripsina de milho (CTI) (Hematologic Technologies, Inc., Essex Junction, VT, USA) proporcionando uma concentração final de 62 μg/mL para a inibição específica de FXIIa, com a finalidade de inibir a ativação de contato mediada por FXIIa. A configuração de amostragem foi como se segue: para 20 μL de amostra de teste ou de controle, 300 μL de todo sangue de citratado tratado preaquecido CTI (a 37°C) foi adicionado, seguido por 20 μL de uma diluição 1:15 de reagente TF PRP contendo fator de tecido humano recombinante (rTF, 3pM) (TS40, Thrombinoscope BV, Maastricht, The Netherlands). A coagulação foi iniciada pela adição de CaCl2 de 20 μL a 200 mM (star-TEM®, Pentapharm, Munich, Germany) e as gravações foram deixadas prosseguir durante pelo menos 120 minutos. A concentração final de rTF no ensaio foi de 11 ou 44 fM.

[00433] Os parâmetros tromboelastográficos de tempo de coagulação (TC), tempo de formação de coágulos (CFT) e da firmeza máxima do coágulo (FCM) foram registrados de acordo com as instruções do fabricante. CT é definido como o tempo desde o início da medição até o início da formação do coágulo. CFT é definido como o tempo desde o início da formação do coágulo, até uma amplitude de 20 mm ser atingida. MCF é a diferença máxima na amplitude entre os dois traços durante o ensaio. A primeira derivada dos dados de tromboelastograma é traçada para ser obtido um gráfico de velocidade (mm/s) em função do tempo(s). A partir deste gráfico, a velocidade máxima (maxV) é determinada. O momento em que a velocidade máxima é obtida (maxV-t) é também determinado.

[00434] Os resultados exemplares são ilustrados nas figuras 56 e 57. JBT1857 e JBT2317 restauraram os parâmetros de coagulação no sangue Hem A. O peptídeo de ligação a TFPI peguilhado (de 40 kD) JBT2329 também restaurou os parâmetros de coagulação prolongados em sangue Hem A, tal como ilustrado na figura 57. A peguilação de JBT2317 reduz o tempo de coagulação e o tempo de formação do coágulo. Estudo de Picada na Unha

[00435] O efeito da perda de sangue em JBT2329 em camundongos naive também foi estudado. Foi administrados veículo, 1 mg/kg JBT2329, ou 0,1 mg/kg JBT2329 (N = 19 ou 20 para cada grupo) aos camundongos C57BL6 por via intravenosa 30 minutos antes da picada na unha a 10 ml/kg. Os animais foram anestesiados 10 minutos antes da picada na unha com 80 mg/kg de pentobarbital (ip). No tempo = 0 minutos, a unha do dedo do pé pequeno da pata traseira direita foi cortada pouco antes do leito ungueal. A pata foi transferida para um frasco previamente cheio com 0,9% solução de NaCl. As amostras de sangue foram coletadas para análise, durante os primeiros 30 minutos após a picada nas unhas e os próximos 30 minutos depois disso, e a média do volume coletado para os grupos foi calculada e comparada. A média de perda de sangue em camundongos tratados com veículo foi de cerca de 30,5 μL ao longo dos primeiros 30 minutos, 52,1 μL durante o segundo período de 30 minutos, resultando em cerca de 82,6 μL da perda de sangue durante 60 minutos. Na administração de contraste, de 0,1 mg/kg JBT2329 reduziu a perda de sangue em cerca de 50% durante os primeiros 30 minutos (16,0 μL) e cerca de 64% em relação ao segundo período de 30 minutos (18,7 μL), o que resulta em uma redução de cerca de 60% da perda de sangue total durante 60 minutos (34,7 μL) em comparação com os camundongos tratados com veículo. O aumento da dose de JBT2329 a 1,0 mg/kg adicionalmente reduziu a perda de sangue de pelo menos cerca de 10%; 12,2 μL foram coletados durante os primeiros 30 minutos, 10,6 μL foram coletados durante o segundo período de 30 minutos, resultando em 22,8 μL coletados durante o período de coleta inteiro de 60 minutos. JBT2329 também reduziu de forma eficaz a hemorragia quando administrado por via subcutânea, em comparação com os camundongos naive tratados com veículo; a injeção subcutânea de 10 mg/kg de JBT2329 reduziu a perda de sangue durante os 60 minutos seguintes de picada de unha em cerca de 58% em relação a sujeitos tratados com veículo.

[00436] Os resultados descritos acima foram gerados utilizando um derivado de JBT1857 compreendendo uma porção de PEG linear ligada ao C-terminal do peptídeo e um derivado de JBT1586 compreendendo uma porção de PEG no N-terminal. Os peptídeos que compreendem um local de conjugação alternativo ou porção química alternativa também foram gerados. Uma porção de PEG linear de 40 kD foi conjugada com o resíduo 14 de JBT1857 para gerar JBT2404. A porção de PEG linear de 40 kD de JBT2329 foi substituída com um radical de PEG ramificado de 40 kD para gerar JBT2401. JBT1857 também foi modificado para compreender K (Ttds-Maleimidopropionil) (JBT2374) na extremidade de C-terminal. JBT2374 foi usado para gerar JBT2410, um conjugado de HSA JBT2374. JBT2375, um derivado compreendendo K(AOA) de JBT1857, foi usado para aldeído de PSA duplo para o peptídeo JBT1857, resultando em JBT2430. JBT2401, JBT2404, JBT2410 e JBT2430 foram caracterizados usando os ensaios descritos acima. Os resultados representativos estão resumidos na tabela 15:

[00437] Este exemplo demonstra que um peptídeo de ligação a TFPI exemplar da invenção, JBT1857, é um potente inibidor de TFPI e pode ser acrescido e conjugado com PEG, sem perda de atividade. A peguilação aumentou a atividade inibitória de TFPI em diversos ensaios funcionais. Surpreendentemente, os peptídeos conjugados para porções de PEG de peso mais elevado demonstraram maior atividade inibitória de TFPI. JBT2329, compreendendo uma porção de PEG linear de 40 kD, reduziu significativamente a perda de sangue em um modelo animal clinicamente relevante. A conjugação de PEG dentro da sequência de aminoácido de JBT1857, o uso de uma porção de PEG ramificado, e fixação de HSA e PSA não destruíram a atividade do peptídeo.

EXEMPLO 9

[00438] O exemplo seguinte descreve a caracterização de dois peptídeos de ligação a TFPI da presente invenção, JBT1837 e JBT1857. JBT1837 (Ac-SYYKWH [CAMRDMKGTMTC] VWVKF-NH) (SEQ ID NO: 1044) é um peptídeo cíclico da família que se liga a JBT0120 KD1 e KD2 de TFPI. JBT1857 (Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKL-NH2) (SEQ ID NO: 178) é um peptídeo linear da família que se liga a JBT0047 KD1 de TFPI. A afinidade e atividade inibitória de TFPI de JBT1837 e JBT1857 foram examinadas utilizando os ensaios descritos nos exemplos 1 a 4, os resultados os quais estão resumidos na tabela 16.

[00439] A afinidade dos peptídeos para TFPI humano medida através de BIAcore foi inferior a 1 nM. A afinidade medida por ELISA (IC50) foi de 4,8 nM para JBT1837 e 2,5 nM para JBT1857. JBT1837 dissociou TFPI humano de forma mais lenta do que JBT1857 (ou seja, JBT1837 permaneceu ligado ao TFPI humano durante um período de tempo mais longo em comparação com JBT1857). Um ensaio de inibição do FXa foi realizado utilizando tanto comprimento total de TFPI humano ("flTFPI") e TFPI humano truncado (254 aminoácidos "R & D" TFPI) (0,1 nM de FXa, 0,5 nM de TFPI, 0,25% DMSO). A atividade de TFPI truncado foi totalmente inibida por ambos JBT1837 e JBT1857, 0,5 nM de TFPI, enquanto todo o comprimento de TFPI foi inibido 85% e 95%, em JBT1857 e JBT1837, respectivamente. Em concentrações superiores de flTFPI (por exemplo, 10 nM de flTFPI), JBT1837 inibiu completamente a atividade de TFPI, enquanto JBT1857 inibiu parcialmente a atividade de TFPI. EC50 também foi mais elevado quando flTFPI foi utilizado no estudo de inibição de FXa.

[00440] No ensaio de tenase extrínseca, cerca de 85% TFPI truncado foram inibidos por ambos os peptídeos. O comprimento total da atividade de TFPI foi inibido a cerca de 56% e 48% por JBT1837 e JBT1857, respectivamente. Surpreendentemente, no ensaio de tenase extrínseca de base celular, JBT1837 inibiu a atividade de TFPI associado à célula em cerca de 50%, enquanto que JBT1857 inibiu quase totalmente a atividade de TFPI ligado à célula. No ensaio funcional baseado em plasma, JBT1837 inibiu TFPI de forma mais eficiente do que JBT1857 em plasma inibido por FVIII humano e plasma deficiente de FIX. JBT1837 corrigiu os parâmetros de coagulação no sangue inibido por FVIII no ensaio ROTEM descrito no exemplo 8. JBT1857 também impactou positivamente os parâmetros de coagulação no sangue, mas de forma menos eficiente do que JBT1837 no ensaio.

[00441] Este exemplo comparou a afinidade e a atividade inibitória de peptídeos de ligação a TFPI cíclicos e lineares que têm diferentes regiões alvo da proteína de TFPI. JBT1837 (um peptídeo cíclico pertencente à família JBT0120) e JBT1857 (um peptídeo linear pertencente à família JBT0047) se ligam de forma eficiente ao TFPI humano com afinidades inferiores a 1 nM e são inibidores potentes. A interação de FXa-TFPI é completamente bloqueada com concentrações baixas de TFPI por ambos os peptídeos, enquanto a inibição de TFPI por JBT1857 é reduzida na presença de concentrações mais elevadas de TFPI. Ambos os peptídeos inibem parcialmente a atividade de TFPI de tamanho completo no ensaio de tenase extrínseca, e JBT1857 inibe a atividade de TFPI a um maior grau no ensaio de tenase extrínseca de base celular em comparação com JBT1837. Comparado com JBT1857, JBT1837 inibe TFPI de forma mais eficiente em plasma deficiente de FVIII. Ambos os peptídeos melhoram os parâmetros de coagulação do sangue humano todo inibido por FVIII por reduzir o tempo de coagulação, enquanto JBT1857 melhora a velocidade de formação de coágulos em um grau menor em comparação com JBT1837.

EXEMPLO 10

[00442] Este exemplo a ilustra a atividade in vivo de peptídeos de ligação a TFPI da invenção de um modelo animal clinicamente relevante. Como descrito abaixo, um peptídeo de ligação a TFPI exemplar reduziu significativamente a perda de sangue de um animal, quando administrado com doses subótimas de FVIII e FIX.

[00443] JBT2329, um peptídeo de ligação a TFPI peguilado (40 kD) (família de JBT0047) que reage de forma cruzada com o TFPI humano e murino, foi testado no modelo de sangramento na ponta da cauda em camundongos nocaute de FVIII e camundongos nocaute de FIX. Os camundongos nocaute de FVIII espelham estreitamente a condição de pacientes de hemofilia A, e o modelo de sangramento da ponta da cauda é amplamente utilizado em investigação para avaliar a eficácia de drogas através da medição, por exemplo, do tempo de hemorragia, a perda de sangue, ou a sobrevivência. ADVATE, um rFVIII comercialmente disponível, serve como uma referência, e animais tratados por tampão ADVATE serviram como controles negativos. Cada grupo continha 16 camundongos nocaute de FVIII (8 femininos + 8 masculinos). JBT2329 (1 mg/kg ou 0,1 mg/kg) de anticorpo ou anti-TFPI (maTFPI, 18 mg/kg) foi administrado 30 minutos antes da ponta da cauda ter sido cortada. ADVATE (10 IU/kg, ou 50 IU mg/kg) ou tampão ADVATE foi administrado cinco minutos antes da cauda ter sido cortada. As substâncias de teste e de controle foram administradas como um bolus intravenoso, através de uma injeção na veia da cauda lateral. Os animais foram anestesiados por uma injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina. Cerca de 10 minutos mais tarde, 2 mm da ponta da cauda foram cortados. As pontas da cauda foram colocadas em solução salina quente (a aproximadamente 37°C) e o sangue foi coletado ao longo de um período de observação de 60 minutos. A quantidade de sangue foi determinada por gravimetria. No final do período de observação de 60 minutos, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical antes da recuperação da anestesia.

[00444] A perda de sangue total mediana em animais tratados por tampão foi de 930 mg. A perda de sangue total mediana em sujeitos tratados com anticorpo anti-murino TFPI (maTFPI) foi de 724 mg. A redução da perda de sangue total mediana foi mais pronunciada quando os sujeitos foram administrados maTFPI com ADVATE. Uma combinação de maTFPI + 10 IU kg ADVATE conduziu a uma perda de sangue total mediana de 136 mg, os animais tratados com maTFPI + 50 IU/kg ADVATE experimentaram uma perda de sangue total mediana de 13 mg. A perda de sangue total mediana dos animais tratados com 10 ou 50 IU/kg ADVATE apenas experimentou perda de sangue mediana de 798 e 364 mg, respectivamente. A superioridade do tratamento de combinação de maTFPI + ADVATE sobre ADVATE isoladamente foi estatisticamente mostrada para maTFPI + 50 IU/kg ADVATE versus 50 IU/kg ADVATE (p = 0,0010). Apesar de não ser estatisticamente significativamente superior a perda de sangue, em animais tratados com maTFPI + 10 IU/kg ADVATE era distintamente inferior nos animais tratados com 10 IU/kg ADVATE isoladamente.

[00445] A eficácia, definida como a superioridade estatisticamente significativa sobre o tampão a um nível de 2,5%, foi mostrada para JBT2329 administrado em doses de 1 mg/kg em combinação com 10 e 50 IU/kg ADVATE e administrado em doses de 0,1 mg/kg em combinação com 50 IU/kg ADVATE (p <0,0004). Os animais tratados com JBT2329 em combinação com ADVATE mostraram uma redução clinicamente relevante em perda de sangue, embora os resultados não fossem estatisticamente significativos (p > 0,0506). A administração de 1 mg/kg de JBT2329 sem ADVATE não reduziu a perda de sangue total mediana superior à observada em animais tratados com tampão (930 mg).

[00446] JBT2329 também foi testado em um modelo de camundongo nocaute FIX de sangramento na ponta da cauda, que é um modelo clinicamente relevante para pacientes humanos com hemofilia B. A metodologia foi substancialmente similar à descrita acima, com relação ao modelo de nocaute FVIII. Em vez de ADVATE, um recombinante FIX (rFIX) serviu como referência. A perda de sangue total mediana em animais tratados por tampão foi de 935 mg. A perda de sangue total mediana em animais tratados com um anticorpo anti-murino TFPI (maTFPI) foi de 774 mg. A perda de sangue total mediana foi reduzida ainda mais, quando os animais receberam um tratamento combinado de maTFPI e rFIX. Uma combinação de maTFPI + 10 IU/kg rFIX conduziu a uma perda de sangue total mediana de 25 mg, enquanto que os animais tratados com maTFPI + 50 IU/kg rFIX exibiram uma perda de sangue total mediana de 10 mg. A perda de sangue mediana dos animais tratados com 10 ou 25 IU/kg rFIX isoladamente experimentou uma perda de sangue mediana de 888 e 774 mg, respectivamente.

[00447] A eficácia, definida como a superioridade estatisticamente significativa sobre o tampão a um nível de 2,5%, foi mostrada para JBT2329 quando administrado em uma dose de 1mg/kg em combinação com 10 IU/kg rFIX e de 0,1 mg/kg em combinação com 10 IU/kg rFIX. A superioridade de JBT2329 em combinação com rFIX sobre a administração de rFIX isoladamente foi observada (p <0,0172), ao passo que o tratamento com 1 mg/kg de JBT2329 isoladamente não conduziu a uma redução significativa na perda de sangue total mediana em comparação com os animais tratados com tampão (p = 0,321).

[00448] Em suma, JBT2329 promoveu uma redução clinicamente relevante da perda de sangue, quando coadministrado com doses subótimas de FVIII e rFIX em todas as doses testadas. Além disso, a administração intravenosa de JBT2329 foi bem tolerada em todos os sujeitos de todos os grupos de tratamento, sem quaisquer sinais de toxicidade aguda.

EXEMPLO 11

[00449] Os peptídeos de ligação a TFPI descritos neste documento são adequados para a detecção de TFPI em uma amostra, tal como a amostra biológica. Este exemplo descreve um método para a detecção de TFPI utilizando os peptídeos da invenção em um formato de ensaio ELISA similar.

[00450] A sequência de peptídeo JBT1857 foi modificada de N- terminal pela adição de uma porção de biotinil-Ttds para gerar JBT2271 (Biotinil-TTDS-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKL-NH2 (SEQ ID NO: 4033)). Uma placa de microtitulação de 96 poços (Maxisorp, Nunc) foi revestida com 50 μL por poço de tampão de revestimento (Na2CO3 a 15 mM, NaHCO3 a 35 mM, pH 9,3) contendo uma gama de concentrações de TFPI (0 a 3 μg/mL, TFPI recombinante, R & D Systems) por 1 hora à temperatura ambiente. A placa foi lavada três vezes com 350 μL de tampão de lavagem/poço (NaCl a 175 mM, CaCl2 a 5 mM, HEPES a 25 mM, 0,1% Tween 80, pH 7,35). A placa foi então bloqueada com 100 μL de tampão de bloqueio (2% extrato de levedura, NaCl a 175 mM, CaCl2 a 5mM, HEPES a 25 mM, 0,1% Tween 80, pH 7,35), durante 1 hora à temperatura ambiente. A placa foi então lavada três vezes com 350 μL de tampão de lavagem. Cinquenta μL de soluções de JBT2271 concentrado de forma diferente em tampão de lavagem (100-0 nM) foram adicionados a cada poço. A placa foi incubada durante 1 hora e lavada três vezes com 350 μL de tampão de lavagem. Para cada poço, 50 μL de estreptavidina de peroxidase de raiz forte conjugada (R & D Systems, 1:200 em tampão de lavagem) são adicionados. Após um período de incubação de 1 hora à temperatura ambiente, a placa foi lavada três vezes com tampão de lavagem. Cinquenta μL de solução de TMB (SeramunBlau fast, Seramun) foram adicionados a cada poço. Após uma incubação de 1,5 minuto à temperatura ambiente, a reação foi parada pela adição de 50 μL de H2SO4 a 1 M por poço. A absorbância foi medida em um fotômetro (Molecular Devices Spectramax M5) a 450 e 620 nm.

[00451] JBT2271 permitiu a detecção de tão pouco como 4,1 x 10-14 mol de TFPI por poço. Os resultados do ensaio descrito acima ilustram que os peptídeos da invenção são ferramentas poderosas para a identificação e/ou quantificação de TFPI em uma amostra.

EXEMPLO 12

[00452] Este exemplo descreve condições para um ensaio koff exemplar para caracterização de peptídeos de ligação a TFPI.

[00453] Os poços de uma placa de microtitulação (96 poços, Maxisorp, Nunc) foram revestidos com 1,6 nM de TFPI em tampão de revestimento (Na2CO3 a 15 mM, NaHCO3 a 35 mM, pH 9,3) durante duas horas à temperatura ambiente. A placa foi então lavada três vezes com 350 μL de tampão de lavagem (NaCl a 175 mM, CaCl2 a 5 mM, HEPES a 25 mM, 0,1% Tween 80, pH 7,35), e os poços foram bloqueados com 100 μL de tampão de bloqueio (2% extrato de levedura, NaCl a 175 mM, CaCl2 a 5 mM, HEPES a 25 mM, 0,1% Tween 80, pH 7,35). Se um período de incubação de 24 horas for empregado, os poços serão bloqueados por, pelo menos, uma hora. Os poços de controle usados por um período de incubação de 15 minutos são bloqueados por um período adicional de 23,5 horas.

[00454] Para um período de 24 horas de incubação, os poços são lavados três vezes com 350 μL de tampão de lavagem e são incubados com 50 μL de peptídeo de teste em tampão de lavagem. A concentração de peptídeo de teste depende da concentração IC90 individual determinada em, por exemplo, ensaio ELISA de TFPI IC50 descrito neste documento. Os poços revestidos com TFPI são expostos ao peptídeo de teste durante aproximadamente 15 minutos. Os poços são subsequentemente lavados três vezes com 350 μL de tampão de lavagem e 50 μL de peptídeo traçador (concorrente) são adicionados. Um peptídeo traçador exemplar é JBT2271 (1,13 nM em tampão de lavagem). Os poços de controle (sinal máximo) são incubados com o traçador apenas. Os poços em branco que faltam TFPI são incubados com traçador apenas. A adição do peptídeo traçador inicia o período de incubação de 24 horas.

[00455] Um período de incubação de 15 minutos é utilizado como um controle, se a concentração IC90 do ensaio de peptídeo conduzir a uma redução de 90% do sinal máximo. Os poços bloqueados por um período adicional de 23,5 horas são lavados três vezes com 350 μL de tampão de lavagem para remover o tampão de bloqueio. Subsequentemente, 50 μL de analito em tampão de lavagem são adicionados e os poços são incubados durante 15 minutos. A concentração de peptídeo de teste utilizado depende da concentração IC90 do peptídeo determinado utilizando, por exemplo, um ensaio ELISA de TFPI IC50. A incubação é de 15 minutos seguida por três lavagens com 350 μL de tampão de lavagem e adição de 50 μL de peptídeo traçador. Os poços de controle (sinal máximo) são incubados com o traçador apenas. Os poços em branco que faltam TFPI também são incubados com traçador apenas.

[00456] A placa é lavada três vezes com 350 μL de tampão de lavagem, e 50 μL de estreptavidina-peroxidase de raiz forte conjugada (R & D Systems, 1:200 em tampão de lavagem) são adicionados a cada poço. Após um período de incubação de uma hora à temperatura ambiente, a placa é lavada três vezes com tampão de lavagem. A solução de TMB (50 μL por poço; SeramunBlau fast, Seramun) é adicionada. Após uma incubação de 1,5 minutos à temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 50 μL de H2SO4 a 1M por poço. A absorbância é medida utilizando um fotômetro (Spectramax M5, Molecular Devices) a 450 e 620 nm. Os resultados do ensaio são apresentados como uma percentagem da densidade ótica corrigida (DO450-OD620) de poços expostos ao peptídeo de teste e ao peptídeo traçador em relação aos poços revestidos com TFPI expostos ao traçador apenas.

EXEMPLO 13

[00457] TFPI inibe a atividade de FVIIa/TF pela ligação a FVIIa através de um domínio Kunitz 1 (KD1). Este exemplo descreve um método exemplar para avaliar a influência de TFPI de peptídeos de ligação a TFPI na inibição de TFPI em FVIIa/TF.

[00458] As medições cinéticas foram realizadas em HEPES a 25 mM, NaCl a 175 mM, CaCl2 a 5 mM, 0,1% BSA, pH 7,3 a 25°C em placas de microtitulação de 96 poços. Vinte μL de fatores de tecido solúveis (resíduos 33-251; Criative Biomart) e 20 ul de FVIIa (ERL) em concentrações finais de 100 nM e 5 nM, respectivamente, foram misturados e incubados durante 15 minutos. Vinte μL de peptídeo de ligação a TFPI, em diferentes concentrações finais (0 a 2 mM) foram adicionados à mistura e incubados durante mais 15 minutos. Com a finalidade de medir a atividade residual do complexo de FVIIa/STF, a mistura reacional foi incubada durante 60 minutos com 20 μL de TFPI (200 nM). A reação foi iniciada pela adição de um substrato cromogênico, Chromozym-tPA (Roche) (1 mM). A alteração na absorbância a 405 nm foi monitorizada por meio de um leitor ELISA Labsystems IEMS durante 30 minutos. A atividade de FVIIa/STF medida na ausência de TFPI foi considerada "atividade de 100%", no contexto do ensaio. Por plotagem da concentração de peptídeo contra a atividade residual, os valores de EC50 foram determinados.

[00459] JBT1857 e JBT1837 foram rastreados contra TFPI160, TFPI1-150-trombina, NTermKD1, KD1 e KD2 (controle negativo). JBT1857 demonstrou uma EC50 de cerca de 0,21 a 0,23 μM para TFPI160, TFPI1-150-Trombina, NTermKD1 e KD1. JBT1837, que se liga a KD1 e KD2, demonstrou uma EC50 de cerca de 0,17 a 0,19 μM para TFPI160 e TFPI1-150-Trombina, enquanto que a atividade em ensaios que envolvem NTermKD1 e KD1 foi aproximadamente da pré- existente.

[00460] Os resultados descritos acima demonstram que os peptídeos de ligação a TFPI eficientemente inibem a interação de TFPI-FVIIa/TF. JBT1857 inibiu de forma eficiente fragmentos contendo TFPI KD1 como uma entidade funcional mínima. Desse modo, este ensaio enzimático confirma os dados de raios-X cristalográficos colocando o local de ligação de JBT1857 dentro de KD1. JBT1837 inibiu fragmentos de TFPI que contêm os primeiros dois domínios de Kunitz, sugerindo que os locais de ligação de JBT1837 fossem situados dentro da região KD1- ligante-KD2 de TFPI. Uma combinação de domínios de Kunitz e os fragmentos de um TFPI clivado por trombina (1-150) não restaurou a atividade inibitória de JBT1837 no ensaio cromogênico. O ensaio enzimático descrito neste documento é um substituto adequado para a detecção da ligação de um peptídeo de ligação a TFPI (ou um composto de teste) para TFPI, e é útil para examinar o efeito inibitório de TFPI dos compostos de ligação a TFPI.

EXEMPLO 14

[00461] Este exemplo descreve a influência da conjugação de PEG e HSA em peptídeos de ligação a TFPI exemplares in vivo.

[00462] Para a análise farmacocinética, camundongos C57BL6 foram tratados com diversos peptídeos de ligação a TFPI conjugados a PEGs e HSA de diferente peso molecular. A dose dos conjugados de peptídeo-PEG e peptídeo-HSA foi normalizada para 1 mg/kg (teor de peptídeo). A normalização assegura a comparabilidade entre os conjugados de peso molecular diferente. Os conjugados de peptídeo foram dissolvidos em NaCl a 175 mM, HEPES a 25 mM pH 7,35 e administrados por via intravenosa através da veia da cauda ou por via subcutânea na região do pescoço. A extração de sangue foi retirada a partir de três animais (retro bulbar) e coletada em tubos de heparina em diversos pontos de tempo após a administração. As amostras foram centrifugadas, e o conteúdo de peptídeo conjugado no plasma foi determinado por ELISA.

[00463] A figura 63 ilustra a concentração de peptídeos de TFPI peguilados detectada no plasma em diversos pontos de tempo após a administração, e a tabela 17 fornece informações detalhadas sobre a meia vida terminal e biodisponibilidade de JBT2325-JBT2329, JBT2401, JBT2404 e JBT2410.

[00464] JB1 l"2329, JBT24 01 e J BT2404 são peptídeos conjugados com PEG linear de 40 kDa (JBT2329 e JBT2404) ou PEG ramificado de 40 kDa (JBT2401). Os conjugados de 40 kDa exibiram uma meia vida terminal maior (HL_ À _z) em comparação com os peptídeos conjugados com PEGs menores após a administração intravenosa. A área sob a curva (AUC) da curva de concentração-tempo resultante da administração subcutânea de peptídeos foi comparada com a AUC gerada após a administração intravenosa para calcular a biodisponibilidade dos peptídeos. Os resultados são mostrados na tabela 16. Os dados demonstram que a conjugação de peptídeo de ligação a TFPI de moléculas de peso molecular mais elevado permite uma biodisponibilidade subcutânea de mais de 30%.

[00465] As figuras 64A a C ilustram o perfil farmacocinético de JBT2401, JBT2404 e JBT2410 resultante da administração subcutânea e intravenosa de peptídeos a camundongos. JBT2404 compreende um PEG conjugado à cisteína na posição relativa X4014 com a fórmula (XI). JBT2401 compreende um PEG ramificado, e JBT2410 é conjugado com HSA. A figura 64A demonstra que a fusão de uma molécula de elevado peso molecular de um peptídeo de ligação a TFPI em uma posição interna aumenta a meia vida. A meia vida também é aumentada se utilizar PEG ramificado (JBT2401) e HSA, o que aumentou a meia vida in vivo de JBT2410 em comparação com os conjugados tendo PEGs com menor tamanho (por exemplo, JBT2325) ou peptídeo livre (vide figura 31).

[00466] Este exemplo ilustra que as propriedades in vivo de diversos peptídeos descritos neste documento podem ser melhoradas por conjugação com moléculas de maior peso molecular (tal como PEG) e/ou com ligantes de nFcR (tal como HSA).

EXEMPLO 15

[00467] O exemplo seguinte descreve a caracterização da interação do JBT1837 com KD1-KD2 de TFPI, sozinho e na presença de JBT1857, através de cristalografia de raios-X. Nativa-PAGE

[00468] Nativa-PAGE foi realizada para confirmar que os peptídeos de ligação a TFPI que ligam diferentes regiões do TFPI podem ligar-se o TFPI KD1-KD2 simultaneamente. Quinze por cento de géis de poliacrilamida (sem SDS) foram utilizados para a eletroforese em gel nativo em amostras que compreendem (1) um fragmento de TFPI que compreende KD1-KD2, (2) KD1-KD2 e JBT1857, (3) KD1-KD2 e JBT1837, e (4) KD1-KD2 com ambos JBT1857 e JBT1837. Glicerina e vermelho de Ponceau foram adicionadas às amostras de proteína. O tampão do ânodo foi obtido por dissolução de 25 mM de imidazol em 1 litro de água e ajustando o pH a 7 com HCl. Tampão do catodo claro foi preparado por dissolução de 7,5 mM e imidazol e 50 mM de tricina em um litro de água. Foi adicionada água a cada solução para alcançar um volume final de dois litros. Serva Blue G (0,02% p/v final) foi adicionado a dois litros de tampão de catodo para gerar tampão de catodo estoque azul 10X (estoque azul 10X). Os géis foram corridos durante 30 minutos a 80 V, em seguida, durante cerca de três horas, a 250 V. Os géis foram corados e descoloridos como descrito em Chakavarti et al, J Vis Exp., 12; (16) (2008).

[00469] KD1-KD2 foi visualizada no gel como uma banda única. Amostras compreendendo K1-K2, em combinação com JBT1857 e/ou JBT1837 resultaram em um desvio da banda KD1-KD2 inicial para um peso molecular mais elevado para proporção de carga. Depois de misturar KD1-KD2 e JBT1837, foi observada precipitação parcial, indicando uma diminuição na solubilidade após a formação do complexo. JBT1857 deslocou a banda KD1-KD2 completa, enquanto JBT1837 deslocou aproximadamente 1/3 da banda inicial. Além disso, na presença de ambos JBT1837 e JBT1857, os deslocamentos de bandas de KD1-KD2 para o peso molecular mais elevado para proporção de carga, indicando a formação de um complexo ternário constituído por KD1-KD2, JBT1837 e JBT1857. Assim, JBT1837 e JBT1857 podem ligar-se a TFPI simultaneamente. Materiais e Métodos - Interação de JBT1837 com KD1-KD2

[00470] Crescimento de Cristal: cristais iniciais foram formados a 20°C por mistura de 0,4 μL de um complexo 1: 1 (1,5 mg/mL, 10 mM Tris/8,0, NaCl 100 mM) com 0,2 μL de precipitante (20% p/v PEG 6000, 50 mM imidazol pH 8,0). Os cristais foram reproduzidos a 20°C por mistura de 1 μL de proteína com um 0,5 μL de precipitante (20% p/v de PEG 6000, 50 mM Imidazol pH 8,0). Um crioprotetor (30% p/v de PEG 6000, glicerol 34%) foi adicionado à gota de cristal (concentração final de 25% glicerol) para proteger os cristais resultantes a partir de desordem e a formação de gelo durante resfriamento rápido com nitrogênio líquido.

[00471] Processamento de Dados: Os dados de diporção foram coletados de 87,26Â para 1,95 Â e avaliados utilizando os pacotes MOSFLM e iMOSFLM (Leslie, (2006) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 62, 48-57), seguido pela fusão e ampliação usando suíte CCP4 (McCoy et al., (2007) J Appl Crystallogr 40, 658-674). Os cristais pertencem ao grupo espacial ortorrômbico P 212121 com dimensões de célula unitária de a = 42,35 A, b = 44,13 A, c = 174,53 A, α = β = Y = 90,0° e 2 complexos na unidade assimétrica. A pesquisa de Patterson foi realizada utilizando o programa PHASER (McCoy, supra) e dois conjuntos de pesquisa, uma estrutura de cristal de KD2 (1TFX) (Burgering et al. (1997) J Mol Biol 269, 395-407) e uma estrutura cristalina previamente resolvida de KD1. A célula unitária continha aproximadamente 54% solvente. Média de densidade de elétrons não cristalográfica, construção de modelos e refinamento de modelo foram realizados com os programas Coot e Refmac (McCoy, supra; Murshudov et al, (1997) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53, 240-55). O modelo atual é completamente definido para ambas as cópias do peptídeo JBT1837 (23AA) e a interação com a proteína com corrente R = 0,213, Rfree = 0,245, desvio de rms de geometria ideal (ligação) = 0,0098 Â, rms (ângulo) = 1,28°.

[00472] A análise da interação de superfície: A interação de superfície de KD1-KD2 e JBT1837 foi analisada com PDB e PISA. O impacto dos aminoácidos individuais foi ponderado pela redução total da sua área acessível por solvente após a formação do complexo (BSAA área acessível ao solvente enterrado) e considerado por gerar uma matriz de interação em 2D. Materiais e Métodos - Interação de KD1-KD2 com JBT1837 e JBT1857

[00473] Crescimento de Cristal: cristais iniciais onde formados a 20°C por mistura de 0,4 μL de complexo 1:1:1 (1,5 mg/mL, 10 mM Tris/8,0, NaCl 100 mM) com 0,2 μL de precipitante (2 M (NH4)2SO4, 5% PEG 400, 100 mM de MES, pH 6,5). Os cristais foram reproduzidos e otimizados a 20°C por mistura de 1 μL de proteína com 0,5 μL de precipitante (1,5 M (NH4)2SO4, 5% PEG 400, 100 mM de MES, pH 6,5). Um crioprotetor (2 M (NH4)2SO4, glicerol a 25%) foi adicionado em etapas à gota de cristal (concentração final de 2,3 M de (NH4)2SO4 e 20% glicerol) para proteger os cristais resultantes a partir de perturbações e a formação de gelo durante o resfriamento rápido com nitrogênio líquido. A queda foi coberto com crio-óleo e cristais foram colhidos.

[00474] Processamento de Dados: Os dados de diporção foram coletados a partir de 74,3Â a 2,7Â e avaliados usando os pacotes MOSFLM e iMOSFLM, seguido pela fusão e ampliação usando suíte CCP4 (Leslie, (2006) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 62, 48-57; Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50, 760-3 (1994)). Os cristais pertencem ao grupo espacial tetragonal P 43212 com dimensões de célula unitária de a = 79,07 A, b = 79,07 A, c = 218,17 A, α = β = Y = 90,0°. Cristalografia de raios X - Resultados

[00475] A estrutura KD1-KD2 é definida na densidade de elétrons a partir de L21 por E148; enquanto quimicamente presente, os resíduos D149 e G150 são conformacionalmente desordenados em duas cópias da molécula cristalograficamente independentes.

[00476] Ambos os domínios mostram uma estrutura do tipo Kunitz. Apenas ~ 1/3 da estrutura é envolvida em elementos de estrutura secundária; estes são dois elementos α-helicoidais curtos em S24-A27 (KD1)/D95-F98 (KD2) (α1/α3) e L69-M75/L140-E148 (α2/α4) e uma folha β de duas fitas que compreende M39-N45/I110-N116 (β1/β3) e R49-I55/K120-K126 (β2/β4). Estes elementos formam a estrutura topológica que é estabilizada por três pontes dissulfeto canônicas envolvendo C26-C76, C35-C59, e C51-C72 e em KD1 e -C95-C147, C106-C130, e C122-C143 em KD2.

[00477] Esta é a primeira estrutura de TFPI composta por KD1, KD2 e seu ligante elucidada por cristalografia de raios-X. Notavelmente, JBT 1837 trava KD1-KD2 em um estado conformacional distinto em que ambos os domínios Kunitz são relacionados por meio de uma simetria dupla. Além disso, a conformação de TFPI está intrinsecamente estabilizada por duas voltas, uma volta β (tβ) de T77-A81 e uma volta Y (tY) de Q90-K93. tβ é estabilizada por três pontes de hidrogênio (O K74- N N82, O N80 NZ K74, O N82 Nε-H23) e leva a um encurtamento de α2 em KD1 por dois resíduos em comparação aos homólogos de Kunitz e os domínios da estrutura cristalina de KD1 isolado. ty é estabilizado por quatro pontes de hidrogênio (O T88-N D95, O Q90-N K93, O K93-N Q90, Oy T88-Oy D95).

[00478] O peptídeo 23mer JBT 1837 assume uma estrutura tipo β- hairpin que pode ser dividida em (i) o pino, uma folha β de duas fitas compreendendo Y2AP-A8AP e T17AP-F23AP; (ii) e o orifício da agulha, uma folha β compreendendo D11AP T15AP. (O subscrito AP indica a numeração sequencial no peptídeo antagonista (JBT1837)). A folha β é estabilizada por uma ponte de dissulfeto (C7AP e C18AP) e um zíper hidrofóbico que compreende as cadeias laterais de Y3AP, W5AP e W20AP.

[00479] Analisando a interação entre KD1-KD2 e JBT1837 com o servidor PISA resultou em uma superfície total de interação de 1340Â2. Mais do que 2/3 da superfície de interação consiste em uma âncora hidrofóbica em JBT1837 interagindo com resíduos distribuídos por TFPI, incluindo KD1, KD2, e o ligante, como ilustrado por uma matriz de interação, um resumo do qual é fornecido na Tabela 18, e Figura 74.

[00480] Além dos contatos hidrofóbicos, a matriz identifica interações polares que estabilizam o complexo TFPI-JBT1837, por exemplo, por ligações de hidrogênio entre a cadeia lateral de H6AP com o carbonil oxigênio de M134 e Nε de W5AP com o carbonil oxigênio do Q63, bem como uma fita β curta compreendendo M16AP-C18AP e R83-I85. Além disso NZ de K4AP é equidistantemente coordenada pelas cadeias laterais de E67 e E142.

[00481] Além do seu papel na estabilização JBT1837, a ponte de dissulfeto de C7AP-C18AP encaixa perfeitamente dentro de uma cavidade hidrofóbica formada por E71, M75, N82, e I84, desempenhando assim, um papel importante na estabilização do complexo TFPI-JBT1837.

[00482] Embora TFPI é conservado principalmente através de espécies diferentes, os resíduos chave dentro do ligante e KD2 (M134, I146) são apenas compartilhados por parentes próximos da espécie humana (Figura 74). Além disso, a substituição de A81V em macaque desestabiliza a volta β do ligante por impedimento estérico, prejudicando a interação subsequente do ligante com JBT1837.

[00483] KD1 do complexo KD1+JBT1857 previamente resolvido foi sobreposto ao complexo KD1-KD2 + JBT1837 para fornecer um modelo da disposição da estrutura ternária. O modelo sugere que JBT1837 e JBT1857 se ligam aos locais opostos de KD1. O C-terminal de JBT1857 e o N-terminal de JBT1837 foram 20Â afastados; assim, uma porção ligante de aproximadamente 20 Â de comprimento, correspondendo a cerca de 10 aminoácidos, poderia conectar JBT1857 e JBT1837 e permitir aos locais de ligação respectivos de subunidades em TFPI.

[00484] Cristais de KD1-KD2+JBT1837 + JBT1857 pertencem ao grupo espacial tetragonal P 43212 e difratam uma resolução máxima de 2,7Â. Eixos em parafusos foram confirmados por extinções axiais e análise de conteúdo celular indicou uma massa de 72 kDa na unidade assimétrica. Assumindo que o complexo ternário cristalizado, este corresponde a três (62 kDa, 61 solvens%) ou quatro (82 kDa, 46% solvens) cópias na unidade assimétrica. No entanto, a estrutura pode não ser totalmente resolvida, possivelmente devido à flexibilidade inerente à estrutura da molécula KD1- KD2. Análise das interações entre TFPI e JBT1837, bem como a conformação induzida por peptídeos de TFPI, sugere que JBT1837 pode não ligar-se ao TFPI de espécies diferentes da humana. A elevada seletividade de JBT1837 é vantajosa uma vez que minimiza a reatividade cruzada e assim efeitos secundários indesejados. JBT1857 liga-se a TFPI em um sítio diferente, PAGE nativa demonstrou que ambos os peptídeos podem se ligar a TFPI ao mesmo tempo. Esta análise é ainda confirmada por um modelo baseado na estrutura cristalina de KD1-KD2+JBT1837+JBT1857 (Figura 75). O C-terminal de JBT1857 e o N-terminal de JBT1837 caem apenas 20 Â afastados, e um ligante de, por exemplo, dez Ala (ou Ser) permitiria a ligação de ambos JBT1837 e JBT1857 para seus locais de ligação dentro de TFPI.

EXEMPLO 16

[00485] O exemplo seguinte descreve a caracterização de um peptídeo que se liga ao complexo TFPI.

[00486] Os peptídeos de ligação a TFPI foram produzidos como aqui descrito. Os peptídeos foram sintetizados como sais trifluoroacetato (TFA) com uma pureza > 90%, e resolvidos em DMSO a uma concentração estoque de 10 mM.

[00487] ELISAs de competição (IC50) foram realizados utilizando peptídeos ligados a TFPI biotinilados como "marcadores" para competir pela ligação a TFPI com peptídeos candidatos não biotinilados. O princípio do ensaio é mostrado na Figura 6B. Noventa e seis placas de Maxisorp (Nunc) foram revestidas com 0,05 μg/mL de TFPI em tampão de revestimento (15 mM de Na2CO3, 35 mM de NaHCO3, pH 9,6) durante a noite. As placas foram lavadas três vezes com 350 μL de tampão de lavagem (HNaT: 175 mM NaCl, 25 mM HEPES, 5 mM CaCl2, 0,1% Tween 80, pH 7,35), e bloqueadas com 200 μL de extrato de levedura 2% em HNaT durante duas horas. As placas foram então lavadas três vezes com 350 μL de HNaT. Peptídeos biotinilados marcadores foram aplicados em uma concentração correspondendo aos respectivos valores de EC90 determinados em um ELISA de ligação (valor médio se n > 2). Uma solução estoque de competição do peptídeo candidato (10 mM ou pré-diluído em DMSO) foi diluída 1/33,3 em HNaT, e uma série de diluição 1/3 foi preparada com HNaT com 3% DMSO. A estratégia de diluição utilizada em um ensaio particular foi ajustada com base na afinidade do peptídeo. A diluição foi ainda diluída com o peptídeo marcador biotinilado em uma proporção de 1:6 (20 μL diluição de competição e 100 μL de peptídeo marcador). A mistura de competidor e peptídeo marcador foi aplicada à placa de microtitulação revestida com TFPI e incubada durante 1,5 horas. As placas foram lavadas três vezes com 350 μL de HNaT. A ligação do peptídeo a TFPI foi detectada através da aplicação de estreptavidina conjugada a peroxidase de rábano (HRP) à placa de microtitulação, incubando a mistura durante uma hora, lavando a placa três vezes com 350 μL de HNaT, aplicando TMB (3,3’5,5’-tetrametilbenzidina), e detectando a subsequente conversão cromogênica de TMB por HRP. Gráficos de IC50 para os peptídeos representativos JBT1857 (SEQ ID NO: 178), JBT1837 (SEQ ID NO: 1044) e o complexo peptídico JBT2547 complexo (Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib- AKLSSSSSSSSSSSYYKWH[CAMRDMKGTMTC]VWVKF-NH2 (SEQ ID NO: 4260)) estão representados nas Figuras 66A e 66B.

[00488] O complexo peptídico JBT2547 inibidor de TFPI, compreendendo dois peptídeos de ligação a TFPI diferentes (JBT1857 e JBT1837) que se ligam a dois locais diferentes em TFPI, mostrou uma IC50 de 1,33x10-9 M (marcador JBT2271) e uma IC50 de 5,57x10-10 M (marcador JBT2316), que foi comparável ou menor do que o valor de IC50 de subunidades peptídicas.

[00489] Além disso, a ligação de JBT2547 ao TFPI completo foi caracterizada por um ensaio de ressonância de plasmon de superfície (BIAcore T200 ™, GE Healthcare, Chalfont St Giles, Reino Unido). TFPI-1 completo recombinante foi imobilizado em um chip CM5 visando 500 RU. O peptídeo foi injetado em uma taxa de fluxo de 30 μL/minuto em concentrações que variam de 1 a 16 nM em tampão HBS-P, pH 7,4, 0,1% DMSO. Subsequentemente, o peptídeo foi dissociado durante 600 segundos. BIAcore Evaluation Software T200 ™ foi utilizado para analisar os dados, que revelaram que JBT2547 se liga firmemente a TFPI completo com uma constante de ligação < 1 nM. O KD foi calculado como sendo de 7,49 x 10-12M.

EXEMPLO 17

[00490] Este exemplo descreve um método exemplar para caracterizar a afinidade de ligação de um complexo de peptídeo de ligação a TFPI usando um ensaio de koff.

[00491] Os poços de uma placa de microtitulação (96 poços, Maxisorp, Nunc) foram revestidos com 1,6 nM de TFPI em tampão de revestimento (15 mM de Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9,3) durante duas horas em temperatura ambiente. A placa foi então lavada três vezes com 350 μL de tampão de lavagem (175 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 25 mM HEPES, 0,1% Tween 80, pH 7,35), e os poços foram bloqueados com 100 μL tampão de bloqueio (extrato de levedura a 2%, 175 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 25 mM HEPES, 0,1% Tween 80, pH 7,35). Se um período de incubação de 24 horas foi utilizado, os poços foram bloqueados durante pelo menos uma hora. Os poços de controle utilizados para um período de incubação de 15 minutos foram bloqueadas durante 23,5 horas adicionais.

[00492] Durante um período de incubação de 24 horas, os poços foram lavados três vezes com 350 μL tampão de lavagem e incubados com 50 μL de peptídeo de teste (JBT2547 (SEQ ID NO: 4260) ou JBT1857 (SEQ ID NO: 178)) em tampão de lavagem. A concentração do peptídeo de teste foi ajustada com base na concentração IC90 individual determinada em, por exemplo, o ensaio de ELISA IC50 de TFPI aqui descrito. Os poços revestidos com TFPI foram expostos ao peptídeo de teste por aproximadamente 15 minutos. Os poços foram subsequentemente lavados três vezes com 350 μL de tampão de lavagem, e 50 μL de peptídeo marcador (competição) (JBT2271 (SEQ ID NO: 4033)) foi adicionado. Os poços de controle (sinal máximo) foram incubadas apenas com marcador. Poços vazios sem revestimento de TFPI foram incubados apenas com marcador. A adição do peptídeo marcador iniciou o período de incubação de 24 horas.

[00493] Um período de incubação de 15 minutos foi utilizado como um controle, se a concentração IC90 do peptídeo teste provocou uma redução de 90% do sinal máximo. Poços bloqueados durante mais 23,5 horas foram lavados três vezes com 350 μL de tampão de lavagem para remover o tampão de bloqueio. Subsequentemente, 50 μL de analito em tampão de lavagem foi adicionado, e os poços foram incubados durante 15 minutos. A concentração do peptídeo de teste utilizada foi ajustada com base na concentração IC90 do peptídeo determinada utilizando, por exemplo, um ensaio ELISA IC50. de TFPI. A incubação de 15 minutos foi seguida por três etapas de lavagem com 350 μL de tampão de lavagem e a adição de 50 μL de peptídeo marcador. Os poços de controle (sinal máximo) foram incubadas apenas com marcador. Poços sem TFPI em branco também foram incubados apenas com marcador.

[00494] A placa foi lavada três vezes com 350 μL de tampão de lavagem, e 50 μL de estreptavidina conjugada com HRP (R&D Systems, 1:200 em tampão de lavagem) foi adicionado a cada poço. Após um período de incubação de uma hora em temperatura ambiente, a placa foi lavada três vezes com tampão de lavagem. Foi adicionada solução TMB (50 μL por poço; SeraminBlau fast, Seramin). Após uma incubação de 1,5 minuto em temperatura ambiente, a reação foi interrompida pela adição de 50 μL de 1 M H2SO4 por poço. A absorbância foi medida utilizando um fotômetro (Spectramax M5, Molecular Devices) a 450 nm e 620 nm.

[00495] Os resultados do ensaio são apresentados na Figura 67 como um percentual da densidade óptica corrigida (OD450-OD620) de poços expostos ao peptídeo teste e peptídeo marcador em relação aos poços revestidos com TFPI expostos apenas ao marcador. Após 24 horas, o complexo peptídico de ligação a TFPI continuou a bloquear a ligação do marcador a TFPI. Em contraste, JBT1857 dissociou-se de TFPI durante o período de incubação de 24 horas. Assim, JBT2547 dissociou-se significativamente mais lento de TFPI doi que uma das subunidades peptídicas, JBT1857.

[00496] A afinidade de JBT2528 para TFPI também foi determinada utilizando os métodos aqui descritos: KD = 1,6 nM; kon = 6,5 x 105 1/Ms; koff = 9,7 x 10-4 1/s. JBT2528 se liga a TFPI KD1.

EXEMPLO 18

[00497] Este exemplo descreve a estabilidade plasmática de complexo peptídico JBT 2547 de ligação a TFPI no plasma de camundongo e humano. JBT2547 (SEQ ID NO: 4260) e JBT1857 (SEQ ID NO: 178) foram adicionadas às amostras de plasma humano ou de camundongo e incubadas durante 24 horas a 37°C. O percentual da quantidade inicial de peptídeo remanescente após a incubação foi determinado por ELISA de IC50 em placas Maxisorp revestidas com 0,05 mg/mL de TFPI (2,26 nM de peptídeo marcador JBT2271). Menos de 5% da quantidade inicial de JBT1857 permaneceu no plasma de camundongo após o período de incubação, enquanto que 15% da quantidade inicial de JBT-2547 permaneceu após o mesmo período de incubação. Da mesma forma, JBT2547 foi mais estável no plasma humano em comparação com JBT1857 e JBT1837; 27% da quantidade original de JBT1857 e 46% JBT1837 permaneceram após 24 horas enquanto 54% da quantidade original de JBT2547 foi detectada. Assim, o complexo de JBT1857 e JBT1837 aumentou a estabilidade e resistência a proteases do plasma. JBT2528 (Hex-FQSKp-C (Acm) -VH- Tle-DaYFERL-Aib-AKL-NH2 (SEQ ID NO: 4246)) também apresentou estabilidade melhorada: 93% da quantidade original permaneceu após 24 horas em plasma humano, e 35% da quantidade original permaneceu após 24 horas, em plasma de camundongo.

EXEMPLO 19

[00498] O exemplo seguinte descreve a caracterização da atividade inibitória do complexo peptídico de ligação a TFPI e monômeros de peptídeo de ligação a TFPI utilizando ensaios de inibição de FXa e inibição de tenase extrínseca descritos no Exemplo 3 ligação.

[00499] Os peptídeos foram diluídos em tampão de reação 1,25X + 0,1% Tween-80 (31,25 mM HEPES; 218,75 mM NaCl, 6,25 mM CaCl2; 0,125% BSA, pH 7,35) a partir de estoques de 1 ou de 10 mM (em DMSO). TFPI, FVIIa, e TF lipidizado foram diluídos em tampão de reação 1,25X. Vesículas de fosfolipídeos (DOPC/POPS 80/20) e do substrato cromogênico específico para FXa (S-2222 (disponível a partir de Diapharma, West Chester, OH)), todos diluídos em água destilada, foram adicionados às placas de 96 poços. Após um período de incubação, TFPI e diluições de peptídeos foram adicionados. A concentração de TFPI no ensaio de inibição de tenase extrínseca foi de 0,0625 nM. Ativação de FX foi iniciada pela adição de FX aos poços. Conversão do substrato cromogênico mediada por FXa foi determinada pela observação de um aumento de absorbância utilizando um leitor de microplacas. A quantidade de FXa gerada em certos pontos de tempo foi calculada a partir das leituras de OD. FXa gerado aos 20 minutos após o início da reação foi considerado para o cálculo de EC50 a partir de gráficos de concentração de peptídeo versus inibição de TFPI (%).

[00500] A inibição funcional de TFPI também foi avaliada utilizando um ensaio de inibição do FXa. Um substrato cromogênico específico para FXa (S-2222) e vesículas de fosfolipídeos (DOPC/POPS 80/20), ambos diluídos em água destilada, e proteínas de TFPI (TFPI humano completo, TFPI humano 1-160, TFPI murina 1-160, e TFPI cinomolgo 1160) diluídos em tampão de reação 1,25X foram adicionados às placas de 96 poços. A concentração de TFPI no ensaio de inibição do FXa foi de 0,5 nM. Os peptídeos foram diluídos a partir de estoques de 1 ou 10 mM (em DMSO) em tampão de reação 1,25 x + 0,1% Tween-80. As diluições de peptídeos (2,5 μL) foram adicionadas às placas de 96 poços. A conversão de substrato cromogênico foi desencadeada por adição de FXa, e a cinética da conversão foi medida em um leitor de microplacas. Leituras de DO após 115 minutos foram consideradas para o cálculo da EC50 de gráficos de concentração de peptídeo versus a inibição da TFPI.

[00501] Os resultados do ensaio de inibição do FXa e ensaio de tenase extrínseca são fornecidos na Tabela 19 e Figuras 68 A e 68B. TABELA 19

[00502] JBT1837, JBT2547, JBT2528, e a combinação de JBT1837 e JBT1857 inibiram de modo muito eficiente 0,5 nM de TFPI 1-160 completo e truncado em C-terminal (Tabela 19 e Figuras 68A e 68B) no ensaio de inibição de FXa. JBT1857 inibiu de forma menos eficiente ambos TFPIs com EC50s de 4,3 e 3,1 nM, respectivamente. Em concentrações superiores a 100 nM, JBT1837, JBT2547, e a combinação de JBT1837 e JBT1857 bloquearam totalmente a atividade de TFPI, como indicado por uma inibição máxima de quase 100%. JBT1857 (e JBT2528) é um inibidor parcial de TFPI e demonstrou alguma atividade inibitória residual de TFPI em concentrações e saturação elevadas. A inibição de ambos TFPIs completo e truncado em C-terminal confirma que os epítopos de ligação dos peptídeos estão dentro de domínios de Kunitz 1 e 2, e que a região C-terminal de TFPI não é necessária para a inibição eficaz da atividade de TFPI.

[00503] Os peptídeos candidatos também foram analisados quanto à inibição de TFPI murino e de macaco cinomolgo. Proteínas TFPI truncadas em C-terminal de murino e de macaco (TFPI 1-160) foram utilizadas em um ensaio de inibição do FXa realizado como aqui descrito. Os resultados estão resumidos na Tabela 20 e Figuras 68C e 68D.

*nenhum máximo atingido para ajuste

[00504] JBT1837 não inibiu TFPI 1-160 de camundongo até 10 μM (Figura 68C). TFPI de macaco cinomolgo foi apenas fracamente inibida em concentrações μM, provavelmente devido às diferenças de sequência inter-espécies, que são incompatíveis com a ligação de JBT1837 (Figura 68D). JBT1857 inibiu de modo eficiente TFPI de camundongo em um EC50 de 7,2 nM, que é comparável à inibição de TFPI humano. TFPI de macaco cinomolgo foi inibida de forma ineficiente por JBT1857, provavelmente devido a uma substituição de Ala para Pro dentro do sítio de ligação de JBT1857.

[00505] JBT2547 inibiu de forma mais eficiente ambos TFPI de camundongo e macaco cinomologo. JBT2547 mediou uma redução maior de aproximadamente 200 vezes e 10 vezes de EC50s em comparação com JBT1857 e para a combinação de JBT1837 e JBT1857. Isto indica ainda que a fusão molecular das duas entidades peptídicas aumenta sua atividade inibidora de TFPI.

[00506] Para demonstrar que o complexo peptídico inibe eficazmente concentrações elevadas de TFPI, os peptídeos foram titulados em concentrações crescentes de TFPI humano. JBT2547 estequiometricamente e totalmente (100%) inibiu a atividade de TFPI em todas as concentrações testadas (até 10 nM) (Figuras 68E e 68F). Em contraste, os peptídeos JBT1837 e JBT2548 (um derivado de JBT1857) são inibidores parciais de TFPI em concentrações elevadas (Figura 68D). Ligar peptídeos inibitórios a TFPI para formar um complexo peptídico aumenta a inibição da atividade de TFPI.

[00507] No ensaio de tenase extrínseca, JBT2547 restaurou a ativação de FX mediada por complexo extrínseco na presença de TFPI com uma EC50 de 0,3 nM, o que resulta em quase 100% inibição da atividade de TFPI em baixa concentração de TFPI (0,063 nM). JBT1837, JBT1857 e a combinação de JBT1837 + JBT1857 inibiu TFPI de modo menos eficientemente, como indicado pelo aumento de EC50 e reduziu a inibição máxima (Figura 69A). Para demonstrar que o complexo peptídico inibe eficazmente concentrações elevadas de TFPI, JBT2547 foi titulada em concentrações crescentes de TFPI. JBT2547 inibiu eficientemente a atividade de TFPI em todas as concentrações testadas (até 10 nM) com menores EC50s dos peptídeos testados (Figuras 69B- 69D). Em contraste, os peptídeos JBT1837, JBT2548, e a combinação de peptídeos JBT1837 + JBT1857 parcialmente inibiram TFPI em concentrações elevadas (Figuras 69C-69D) com a maior EC50 em comparação com JBT2547.

[00508] As atividades antagonistas de TFPI de JBT1837, JBT1857, uma mistura de JBT1837 e JBT1857, e JBT2547 também foram determinadas em sistemas de reações em que o FXa foi inibido por TFPI na presença de Ca2+, fosfolípido (PL) + Ca2+, e PL + Ca2+ + proteína S. A eficácia pela qual os peptídeos bloqueiam a atividade de TFPI aumenta na ordem JBT1857, JBT1837, a mistura de JBT1837 e JBT1857, e JBT2547. JBT1837 e JBT1857 não bloquearam completamente o TFPI, particularmente não na presença de cofator proteína S. Uma mistura de JBT1837 e JBT1857 foi mais potente como antagonista de TFPI que os peptídeos individuais. O peptídeo de fusão JBT2547 foi de longe o melhor antagonista de TFPI; em uma concentração de 50 nM o complexo peptídeo bloqueou quase completamente o TFPI, mesmo na presença de PL + Ca2+ + proteína S.

[00509] Este exemplo demonstra que a ligação de dois peptídeos de ligação a TFPI da invenção por, por exemplo, fusão molecular, aumenta a atividade inibitória de TFPI. JBT1837 impede a formação do complexo de FXa-TFPI primário (complexo de encontro) e em concentrações elevadas pode bloquear totalmente a inibição de TFPI do FXa. JBT1857 impede a transição do encontro fraco ao complexo TFPI-FXa justo e inibe parcialmente TFPI uma vez que na presença de JBT1857 é ainda possível formar o complexo TFPI-FXa primário (complexo de encontro). Uma fusão molecular dos dois peptídeos de ligação a TFPI demonstraram um elevado grau de atividade inibitória do que cada peptídeo por si só e uma mistura das subunidades de peptídeos (isto é, o efeito foi maior do que o aditivo).

EXEMPLO 20

[00510] Neste exemplo, a atividade inibitória de TFPI de um complexo peptídico de ligação a TFPI é caracterizada usando o ensaio baseado em plasma do Exemplo 4. Peptídeos de ligação a TFPI foram testados sob condições fisiológicas (~0,2 nM TFPI completo) conforme as condições miméticas elevaram os níveis plasmáticos de TFPI completo (até 10 nM TFPI completo).

[00511] A influência dos peptídeos sobre a geração de trombina na ausência ou na presença de flTFPI exógeno foi medida em duplicada, através de trombografia automatizada calibrada em um leitor Fluoroskan Ascent® (Thermo Labsystems, Helsinque, Finlândia; filtros 390 nm de excitação e 460 nm de emissão) após a clivagem lenta de um substrato fluorogênico específico para trombina (Hemker, Pathophysiol. Haemost. Thromb., 33, 4-15 (2003)). Como um modelo para a deficiência de FVIII mediada por anticorpos, plasma normal reunido congelado (George King Bio-Medical Inc., Overland Park, KN) foi incubado com título elevado, inativado pelo calor, de plasma anti- FVIII humano gerado em cabra (4490 BU/mL; Baxter Bioscience, Viena, Áustria), dando origem a 50 BU/mL. Os ensaios foram igualmente realizados com o macaco cinomolgo e o plasma de macaco sagui. Os plasmas foram misturados com o inibidor de tripsina de milho (CTI) (Hematologic Technologies, Inc., Essex Junction, VT) para inibir a contaminação do Fator XIIa, o que resulta em uma concentração final de 40 ug/mL.

[00512] Plasma preaquecido (37°C) (80 μL) foi adicionado a cada poço de uma microplaca de 96 poços (Immulon 2HB, fundo em U claro; Thermo Eletron, Waltham, MA). Para acionar a geração de trombina pelo Fator Tecidual, 10 μL de reagente baixo PPP contendo fator tecidual humano recombinante (12 pM) e vesículas de fosfolipídeos compostas de fosfatidilserina, fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina (48 μM) (Thrombinoscope BV, Maastricht, Holanda) foram adicionados. Pouco antes de colocar a placa no leitor preaquecido (37°C), 5 μL de soluções de peptídeos foram adicionados, resultando em concentrações plasmáticas de 1- 100 nM. Finalmente, 5 μL de salina tamponado com HEPES a 5 mg/mL de albumina de soro bovino (Sigma- Aldrich Corporation, St. Louis, Missouri, EUA) ou diluição de 5 μL de TFPI completo (flTFPI) foram adicionados. A proteína flTFPI (3557 nM) foi expressa em células SK Hep e purificada. As concentrações plasmáticas de flTFPI variaram entre 0,31 e 10 nM, o que é equivalente a um aumento de ~ 2 a 50 vezes na concentração plasmática de flTFPI endógeno. A geração de trombina foi iniciada pela adição de 20 μL de FluCa (Thrombinoscope BV, Maastricht, Holanda), que contém um substrato fluorogênico e CaCl2 tamponado com HEPES (100 mM). A intensidade da fluorescência foi registada a 37°C. Os parâmetros das curvas de geração de trombina resultantes foram calculados usando o software Thrombinoscope™ (Thrombinoscope BV, Maastricht, Holanda) e calibrador de trombina para corrigir filtros internos e os efeitos do consumo de substrato (Hemker, Pathophysiol. Haemost. Thromb., 33, 4-15 (2003)). A diluição final de plasma, concentração de TF, e temperatura de ensaio para o ensaio de plasma humano foram 1:1,5, 1 pM, e 37°C, respectivamente. A diluição final de plasma, concentração de TF, e temperatura de ensaio para o ensaio de plasma C57B16 de camundongo e ensaio de plasma FVII -/- de camundongo foram 1:2,4, 0,4 pM, e 33°C, respectivamente. A diluição final de plasma, concentração de TF, e temperatura de ensaio para os ensaios do plasma e de macaco cinomolgo e sagui foram 1:1,5, 0,6 pM, e 37°C, respectivamente.

[00513] Os resultados representativos para a melhoria da geração de trombina de plasma inibido por FVIII humano são fornecidos na Tabela 21.

[00514] JBT1837, J BT1857, uma mistura de JBT1837 + JBT1857, e o complexo de JBT1837 e JBT1857 (JBT2547) melhoraram a geração de trombina de plasma inibido por FVIII com EC50s semelhantes. A eficácia máxima em relação a um anticorpo policlonal anti-TFPI foi maior para JBT2547, demonstrando que a fusão dos dois peptídeos de ligação a TFPI aqui descritos aumenta a inibição da atividade de TFPI no plasma.

[00515] As Figuras 70A-70C ilustram a atividade inibitória de 1-100 nM do peptídeo de fusão JBT2547 (diamante) para os níveis elevados de níveis plasmáticos de flTFPI (1,25, 3,75 e 10 nM) no ensaio de geração de trombina. Em comparação com JBT1837 (triângulo) e JBT1857 (círculo), JBT2547 mostra uma capacidade substancialmente maior para aumentar o pico de trombina mesmo na presença de níveis plasmáticos muito elevados de flTFPI. Embora a combinação de JBT1837 e JBT1857 (quadrado) melhorou a resposta sobre cada peptídeo monomérico isolado, a combinação de monômeros não atinge o nível de ativação atingido pelo complexo peptídico. O potencial antagonista de TFPI de JBT2547 também foi testado na presença de uma ampla faixa de concentrações de flTFPI de até 10 nm, que é equivalente a 50 vezes mais elevada do que a concentração plasmática de flTFPI fisiológico. Concentrações de 50-100 nM JBT2547 totalmente compensaram o efeito anticoagulante de 10 nM de flTFPI, e os valores de pico de trombina no atingiram níveis plasmáticos normais ou acima. As concentrações de JBT2547 inferiores a 50 nM melhoraram a geração de trombina de plasma inibido por FVIII de modo dependente de flTFPI.

[00516] Os resultados dos experimentos da geração de trombina com vários plasmas de animais encontram-se resumidos nas Tabelas 22 e 23

*"-" indica que não há ajuste de curva

[00517] JBT1837 não inibiu TFPI de camundongo e macaco sagui em concentrações relevantes. TFPI de macaco cinomolgos é um pouco inibida apenas em concentrações μM. JBT1857 eficientemente inibiu TFPIs de camundongo e macaco sagui, enquanto que TFPI de macaco cinomolgo foi menos eficientemente inibido por JBT1857, provavelmente devido a uma substituição de aminoácidos Ala para Pro dentro do local de ligação de JBT1857 que é conservado como uma Ala em TFPI de humano, camundongo e macaco sagui. A TFPI de macaco cinomolgo é mais eficientemente inibida pelo peptídeo de fusão JBT2547.

EXEMPLO 21

[00518] Este exemplo descreve a capacidade dos peptídeos de ligação a TFPI descritos acima, em restaurar a conversão mediada pelo complexo de tenase extrínseca de FX para FXa, em um ensaio de tenase extrínseca à base de células. O ensaio foi realizado como descrito no Exemplo 5. As concentrações de FXa obtidas após nove minutos de reação, na presença de 100mM de anticorpo policlonal anti- TFPI humano (R&D Systems, AF2974) foram ajustadas para 100% e as amostras que não foram expostas ao anticorpo foram definidas como 0% efeito inibidor de TFPI, permitindo a avaliação da atividade inibitória do peptídeo. Os resultados do ensaio encontram-se ilustrados nas Figuras 71A e 71B. JBT2547 demonstrou inibição melhorada de HUVEC TFPI em comparação com o JBT1837, JBT1857, JBT2548, e uma mistura de JBT1857 e JBT1837. Inibição completa de TFPI foi alcançada em concentrações tão baixas quanto 10nM.

EXEMPLO 22

[00519] Este exemplo descreve um método para avaliar a formação de coágulos no sangue total usando tromboelastografia de rotação (ROTEM). O ensaio foi realizado como descrito no Exemplo 8. A configuração analítica foi como a seguir: 300 μL de sangue total com citrato tratado com CTI preaquecido (37°C) foi adicionado a uma amostra de peptídeo (10, 100, 1000 nM concentração de ensaio final) ou um controle, seguido pela adição de uma diluição 1:15 de reagente de TF PRP contendo o fator tecidual humano recombinante (rTF, 3pM) (TS40, Thrombinoscope BV, Maastricht, Holanda). Em certos experimentos, TFPI completo exógeno (flTFPI) em concentrações finais de 2 ou de 10 nM foi adicionado para simular os níveis plasmáticos de flTFPI de até 50 vezes além do normal. A coagulação foi iniciada pela adição de 20 μL de 200 mM CaCl2 (star-TEM®, Pentapharm, Munique, Alemanha) e os registros foram deixadas prosseguir durante pelo menos 120 min. A concentração final de rTF no ensaio foi de 44 fM. Os parâmetros tromboelastográficos de tempo de coagulação (CT), tempo de formação do coágulo (CFT) e firmeza máxima do coágulo (MCF) foram registrados de acordo com as instruções do fabricante. CT é definido como o tempo desde o início da medição para o início da formação do coágulo. CFT é definido como o tempo desde o início da formação do coágulo, até uma amplitude de 20 mm ser atingida. MCF é a diferença máxima na amplitude entre os dois traços durante o ensaio.

[00520] A adição de TFPI completo ao sangue total inibido por FVIII na ausência de peptídeos inibidores de TFPI inibiu substancialmente a coagulação como indicado por um aumento acentuado no tempo de coagulação (Figuras 72A-72C). JBT2528 e JBT1837 melhoraram os parâmetros hemostáticos globais de plasma inibido por FVIII (EC50 = 11 nM e 4 nm, respectivamente). JBT1837 e JBT2548 melhoraram a coagulação, reduzindo o tempo de coagulação para os níveis normais de um modo dependente da concentração (Figuras 72B e 72C, círculos abertos). Estes peptídeos não conseguiram alcançar tempos de coagulação do sangue inibido por FVIII em concentrações aumentadas de TFPI (por exemplo, aumento, 10 nM). Em contraste, as concentrações de JBT2547 acima de 100 nM completamente restauraram a coagulação normal do sangue total inibida por FVIII ao qual foi adicionado 2 nM e 10 nM de TFPI completo.

[00521] Este exemplo confirma ainda que complexos peptídicos de ligação a TFPI neutralizam TFPI de modo eficiente e restauram a coagulação normal, mesmo em concentrações aumentadas de TFPI.

EXEMPLO 23

[00522] As plaquetas contêm TFPI completa, que é liberado para o plasma após a ativação plaquetária e resulta em uma concentração de TFPI plaquetário no plasma que se aproxima de 50-75% do TFPI completo no plasma em locais de lesão. Este exemplo demonstra a inibição de TPFI plaquetário, por peptídeos da invenção.

[00523] Coleta de sangue e preparação do plasma: As amostras de sangue foram coletadas a partir de um número de diferentes doadores. Nove volumes de sangue venoso foram colhidos por punção venosa em um volume de 1,09 de citrato trissódico com ou sem 500 μg/mL de CTI e centrifugados a 250xg durante 15 minutos para a preparação de plasma rico em plaquetas (PRP) ou a 2860xg para a preparação de plasma pobre em plaquetas (PPP). PPP foi dividido em alíquotas, congelado e armazenado a -80°C até à sua utilização. Em experimentos em que um pool de plasma normal (NP) foi usado, o sangue colhido a partir de mais de 25 indivíduos saudáveis foi centrifugado a 2000xg durante 15 minutos para separar o plasma das células sanguíneas, e de novo em 11000xg durante 5 minutos para se obter plasma pobre em plaquetas.

[00524] Isolamento de plaquetas: Sangue (45 ml) foi colhido em 7,5 ml de citrato ácido/dextrose (ACD, 80 mM de citrato trissódico, ácido cítrico 52 mM, glicose 183 mM) e centrifugado durante 15 min a 248xg. Para eliminar os eritrócitos residuais, o sobrenadante (plasma rico em plaquetas, PRP) foi centrifugado durante um período adicional de 5 minutos a 248xg. O PRP foi posteriormente centrifugado durante 15 minutos a 2760 rpm (1360xg) para girar as plaquetas. O pellet de plaquetas foi lavado duas vezes por ressuspensão em 20 ml (primeira lavagem) e 15 ml (segunda lavagem) tampão de plaquetas (10 mM HEPES, 136 mM NaCl, 2,7 mM KC1, 2,0 mM MgCl2, 0,5% albumina de soro bovino e 0,2% glicose, pH 6,6), seguido por centrifugação durante 15 minutos a 2760 rpm (1360xg). Após a segunda etapa de lavagem, as plaquetas foram novamente suspensas em tampão de plaquetas 3,5 mL (pH 7,5) e a concentração de plaquetas foi determinada em um contador de Coulter. Por fim, a suspensão de plaquetas foi diluída para a concentração de plaquetas necessária por diluição com tampão de plaquetas (pH 7,5) e 40 μL de uma solução a 25 mg/mL do peptídeo sintético Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS) foi adicionada por 3,5 ml suspensão de plaquetas para inibir a agregação plaquetária durante o armazenamento em temperatura ambiente.

[00525] Caracterização funcional de TFPI de plaquetas: TFPI foi liberado a partir de plaquetas isoladas pela ativação das plaquetas a 37°C durante 15 min com 100 ng/mL de convulxina. As plaquetas foram giradas por centrifugação (15 minutos a 2800xg) em um tubo de centrifugação Eppendorf e o sobrenadante foi coletado como fonte de TFPI de plaquetas. Plaquetas TFPI foram quantificadas com um ELISA de TFPI completo usando TFPI recombinante como padrão. A atividade funcional de TFPI de plaquetas foi comparada com a atividade de TFPI recombinante em dois sistemas de ensaio: 1) inibição da ativação de FX catalisada por FVIIa em um sistema modelo e 2) a inibição da geração de trombina em plasma deficiente de TFPI.

[00526] No ensaio de sistema modelo, o efeito de várias concentrações de TFPI recombinante ou de plaquetas em ativação de FX catalisada por TF-FVIIa foi determinado a 37°C em um tampão 25 mM HEPES (pH 7,7), 175 mM NaCl, 5 mg/mL albumina de soro bovino (BSA) contendo 2 pM FVIIa, 5 nM TF, 100 nM FX, e 400 uM Fluophen FXa. Neste ensaio FVIIa, TF, TFPI e Fluophen FXa foram pré-incubados durante 7 minutos a 37°C em tampão HEPES e ativação de FX foi iniciada pela adição de FX. Curvas de progresso da conversão de fluophen Fxa pelo FXa gerado foram determinadas em leitor Fluoroskan Ascent® (Thermo Labsystems, Helsinque, Finlândia) e corrigidas para o consumo de Fluophen Fxa e os chamados efeitos de filtro interno (Udenfriend S, Fluorescence Assay in Biology and Medicine. New York, Academic Press, 1996, vol 1, pp13, 118, vol 2, pp182-185) pela metodologia que também é utilizada para a correção de curvas de geração de trombina para o consumo de substrato (Hemker et al. Pathophysiol Haemost Thromb, 32, 249-53 (2002)). Os períodos de geração FXa e os efeitos da TFPI nestes foram obtidos tomando a primeira derivada das curvas de progresso corrigidas da conversão de Fluophen FXa. Em alternativa, o efeito de TFPI na ativação de FX catalisada por TF-FVIIa também foi seguido com um substrato cromogênico específico de FXa, por exemplo, 125 μM CS-11 (65).

[00527] No ensaio de geração de trombina, plasma depletado de TFPI foi reconstituído com quantidades variáveis de TFPI recombinante ou TFPI derivado de plaquetas, e a geração de trombina foi determinada utilizando o método Trombograma Automatizado Calibrado (CAT) por Hemker et al. supra. A geração de trombina foi iniciada no plasma pela adição de várias concentrações de TF recombinante (0,1-10 pM), 16 mM CaCl2, 30 μM vesículas de fosfolipídeos (l,2-dioleoil-sn-glicero-3- fosfo-serina/1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina /1,2-dioleoil-sn- glicero-3-fosfatidilcolina, 20/20/60, H/H/M) e 30-50 μg/mL de inibidor de tripsina de milho (CTI). Em experimentos em PRP, nenhuma vesícula de fosfolipídeo foi adicionada ao plasma. A atividade da trombina no plasma foi monitorada continuamente com o substrato fluorogênico Z- Gly-Gly-Arg-AMC (BACHEM, Bubendorf, Suíça). A fluorescência foi lida em um leitor Fluoroskan Ascent® (Thermo Labsystems, Helsinque, Finlândia) e as curvas de geração de trombina foram calculadas usando o software Thrombinoscope™ (Thrombinoscope, Maastricht, Holanda).

[00528] Análise do efeito dos peptídeos da invenção em TFPI recombinante, de plasma, e de plaquetas: Os efeitos dos peptídeos de ligação a TFPI sobre a atividade anticoagulante de TFPI foi testada em sistemas modelo (inibição de FXa e ativação de FX catalisada por TF- FVIIa por TFPI) e no plasma (plasma depletado de NP, PPP, PRP ou TFPI reconstituído com TFPI recombinante ou de plaquetas ou plaquetas). O efeito dos peptídeos sobre a inibição do FXa por TFPI foi seguido em um tampão HNBSA (50 mM HEPES pH 7,7, 175 mM NaCl, 5 mg/mL BSA) contendo 125 μM CS-11 (65), 1 mM EDTA ou 3 mM CaCl2 e, se presentes, concentrações variadas do peptídeo e TFPI, 80 nM de proteína S e/ou 30 μM de vesículas de fosfolipídeos (20:60:20 DOPS/DOPC/DOPE), que foram pré-incubadas durante 10 minutos a 37°C. hFXa foi adicionado e o aumento da absorbância a 405 nm foi seguida em um leitor de microplacas Ultra (Bio-Tek, Burlington, VT, EUA) até um taxa de estado constante de conversão do substrato cromogênico ser alcançada (~ 60 min). Curvas de progresso da conversão do substrato cromogênico foram ajustadas à equação de velocidade integrada para a inibição de ligação lenta-justa (Huang et al, J Biol Chem, 268, 26950-55 (1993)): At = A0 + (vs t) + (v0 - vs).(1 - exp (-kobs.t))/kobs

[00529] em que At é a absorbância a 405 nm no tempo t; A0 é a absorbância inicial a 405 nm; vs é a velocidade do estado estacionário final; v0 é a velocidade inicial; kobs é a constante de velocidade aparente para a transição de v0 para vs (Fxa-TFPI para Fxa-TFPI*). O valores v0 e vs em relação às taxas de conversão do substrato cromogênico por FXa na ausência de TFPI, representam a extensão da formação do complexo de FXa-TFPI frouxo e justo.

[00530] O efeito dos peptídeos na inibição da ativação de FX catalisada por TF-FVIIa por TFPI foi determinado a 37°C em um tampão 25 mM HEPES (pH 7,7), 175 mM NaCl, 5 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA) tampão contendo 2 pM FVIIa, 5 nM TF, 100 nM FX, 400 μM Fluophen FXa e quantidades variáveis de peptídeo e TFPI (recombinantes ou derivado de plaquetas). Neste ensaio FVIIa, TF, TFPI, peptídeo, e Fluophen FXa foram pré-incubados durante 7 minutos a 37°C no tampão HEPES, e ativação de FX foi iniciada pela adição de FX. Curvas de progresso da conversão de Fluophen Fxa pelo Fxa gerado foram determinadas em leitor Fluoroskan Ascent® (Thermo Labsystems, Helsinque, Finlândia) e corrigidas para o consumo de Fluophen FXa e os chamados efeitos de filtro interno pela metodologia que também é usada para a correção de curvas de geração de trombina para substrato. Os cursos de tempo de geração de FXa e os efeitos da TFPI nestes foram obtidos tomando a primeira derivada da curva de progresso corrigidos da conversão de Fluophen Fxa. Em alternativa, o efeito de TFPI na ativação de FX catalisada por TF-FVIIa foi seguido com um substrato cromogênico específico de FXa, por exemplo, 125 μM CS-11 (65).

[00531] O efeito dos peptídeos em TFPI de plasma e de plaquetas foi avaliado através da medição dos seus efeitos sobre a geração de trombina determinados como descrito abaixo em plasma depletado de NP, PPP, PRP ou TFPI reconstituído com TFPI recombinante ou de plaquetas ou plaquetas. Nos experimentos em plasma depletado de PRP ou TFPI reconstituído com as plaquetas, as plaquetas foram ativadas ou não ativadas com 80 ng/mL de convulxina ou 40 ug/mL de colágeno Horm (concentração final no poço). Para simular plasma de hemofilia, experimentos de geração de trombina foram realizados na presença de um plasma inibidor de cabra do qual 1 μL foi adicionado a 80 μL plasma para neutralizar o FVIII.

[00532] Em experimentos de geração de trombina, o plasma foi adicionado à placa de microtitulação e, se presente, misturado com quantidades adequadas de fosfolipídeos, plaquetas, TFPI, anticorpos anti-FVIII, anti-TFPI, peptídeos e incubadas durante 7 minutos a 37°C. Após esta pré-incubação, TF e ativador de plaquetas (se presente) foram adicionados imediatamente, seguido por uma mistura de substrato fluorogênico/mistura CaCl2 (FluCa) que inicia a geração de trombina.

[00533] Resultados: O TFPI de sobrenadante de plaquetas inibiu a inativação de FX catalisada por TF-FVIIa de um modo dependente da concentração. A inibição por sobrenadante de plaquetas foi impedido por um coquetel de anticorpos anti-TFPI, que ressalta que foi o TFPI no sobrenadante de plaquetas que é o inibidor da ativação de FX catalisada por TF-FVIIa. No entanto, as taxas de ativação de FX na presença de sobrenadante das plaquetas e anti-TFPI foram maiores do que a taxa de ativação de FX sem sobrenadante de plaquetas, sugerindo que o sobrenadante das plaquetas continha uma pequena quantidade de um ativador de FX, por exemplo, o FVIIa. Isto sugere que os dados são uma subestimativa da concentração de TFPI de plaquetas, devido ao fato de que mais FVIIa deve ser inibido quando o sobrenadante de plaquetas está presente na mistura de ensaio do que mistura de ensaio em que a curva de calibração é feita com TFPI recombinante em tampão.

[00534] A atividade funcional de plaquetas TFPI também foi testada no plasma deficiente em TFPI e comparada com a atividade de TFPI recombinante não glicosilada. As concentrações de TFPI a partir de diferentes doadores de plaquetas foram determinadas com um ELISA em que TFPI recombinante não glicosilada foi utilizado como calibrador. Embora nenhuma titulação tenha sido realizada com as diferentes preparações de TFPI em plasma em deficiente TFPI, a inspeção dos efeitos de TFPI de plaqueta e recombinante na geração de trombina demonstrou que, na base da concentração, TFPI de plaquetas e recombinante exibem atividades anticoagulantes semelhantes.

[00535] JBT1837, JBT1857, JBT1837 + JBT1857, e JBT2547 (50 nM) bloquearam a capacidade de TFPI de plaquetas em inibir a ativação de FX catalisada por TF-FVIIa. O peptídeo de fusão foi mais eficaz e bloqueou completamente a atividade anticoagulante de TFPI. JBT1857 foi o menos eficaz seguido por JBT1837 e a mistura de JBT1837 e JBT1857. Titulação com JBT2547 demonstrou que uma concentração de 10 nM inibiu quase completamente a atividade de TFPI de plaquetas.

[00536] Um estudo adicional foi realizado para melhor elucidar os efeitos de TFPI de plasma e de plaquetas sobre a inibição da geração de trombina no plasma rico em plaquetas (PRP) e plasma pobre em plaquetas (PPP). Para discriminar entre a regulação para baixo da geração de trombina por plasma TFPI de plaquetas e TFPI derivado de plasma, os experimentos foram realizados em plasma depletado de TFPI complementado com plaquetas (fonte de TFPI de plaquetas) e/ou várias quantidades de TFPI purificado adicionado (simulando de variação de níveis plasmáticos de TFPI). Um experimento preliminar no plasma depletado de TFPI suplementado com plaquetas ativadas por convulxina mostrou que os anticorpos anti-TFPI aumentaram a geração de trombina, que indicou que TFPI liberado das plaquetas inibe a geração de trombina.

[00537] Depreende-se que a geração de trombina em PRP precisou de TF. Em PRP sem CTI e no PRP ao qual CTI foi adicionado mais tarde, o ETP e a altura do pico de trombina quase não foram afetados pela concentração de TF (TF não foi necessário) e apenas o intervalo de tempo foi encurtado em TF crescente. Quando PRP foi preparado a partir de sangue que foi coletado em citrato mais CTI, ambos o tempo de atraso e o pico de trombina foram afetados pela concentração de TF, indicando que experimentos realizados em PRP exigem que o sangue deva ser colhido em CTI.

[00538] Nas experimentos acima descritas, o plasma foi pré-ativado com convulxina para promover a liberação de plaquetas em TFPI antes de se iniciar a geração de trombina com TF mais de Ca2+. Uma vez que a convulxina não é um gatilho fisiológico, uma comparação da geração de trombina em PRP com plaquetas não ativadas e plaquetas pré- ativadas com convulxina, colágeno e ionóforo de Ca foi realizada. Verificou-se que a capacidade de geração de trombina das plaquetas aumentou na ordem não ativadora = ionóforo < colágeno <convulxina.

[00539] Além disso, nos experimentos descritos acima, as plaquetas foram pré-incubadas com o ativador do (pré-ativadas) durante 7 minutos na presença de TF, e a geração de trombina foi iniciada com uma mistura de substrato fluorogênico/mistura Ca2+. Quando o ativador de plaquetas convulxina é adicionado ao PRP 10-15 segundos antes de iniciar a geração de trombina, com a mistura de substrato fluorogênico/Ca2+, substancialmente menos trombina é gerada do que no PRP em que as plaquetas foram pré-ativadas com convulxina antes da geração de trombina ser iniciada. Em vista destes resultados, estudos posteriores não irão incluir a pré-ativação das plaquetas, e colágeno ou nenhum ativador será utilizado primariamente em experimentos em PRP.

[00540] Os efeitos dos antagonistas do TFPI foram inicialmente testados em PRP preparado a partir de sangue colhido em CTI. Geração de trombina desencadeada no PRP com 0,1 pM de TF + colágeno foi substancialmente reforçada por ambos um coquetel anti-TFPI e JBT2547. Isto mostra que o TFPI é um importante regulador da geração de trombina nas plaquetas, e que JBT2547 é tão eficaz como um coquetel anti-TFPI em neutralizar a atividade anticoagulante de TFPI. TFPI mal regulou para baixo a geração de trombina em PRP acionado com uma quantidade alta (10 pM) de TF.

[00541] A maior parte da trombina gerada no PRP em baixo de TF (1 pM) pareceu ser formada através da Xase intrínseca e, portanto, requer o FVIII. Ambos JBT2547 e um coquetel anti-TFPI aumentaram substancialmente a geração de trombina no PRP em que o FVIII foi neutralizado com anticorpos anti-FVIII, uma condição representativa de plasma de hemofilia. JBT2547 também aumentou a geração de trombina em plasma depletado de TFPI suplementado com plaquetas que não foram ativadas ou que foram ativadas com colágeno.

[00542] Os experimentos com JBT2547 foram realizados com 4 μM de peptídeo, o que, tendo em conta a afinidade de JBT2547 para TFPI (faixa sub-nM), é provável que seja um grande excesso. Com efeito, ambos em PPP e PRP, 5-10 nM de JBT2547 sejam suficientes para inibir completamente o TFPI.

[00543] Para testar se o TFPI no plasma, derivados de plasma ou de plaquetas, é completamente inibido pelo coquetel de anticorpo TFPI ou JBT2547, uma titulação de TFPI foi realizada em PPP e em PRP na ausência e na presença de um coquetel de anticorpo TFPI. Maiores concentrações de TFPI sobre TFPI que está presente no plasma mais o que é liberado a partir de plaquetas gradualmente inibiu a geração de trombina. Na presença de um coquetel de anticorpo TFPI, todas as curvas de geração de trombina foram as mesmas, indicando que o coquetel de anticorpo TFPI não é um inibidor parcial de TFPI mas neutraliza completamente o TFPI.

[00544] Em PPP, baixas concentrações de TFPI adicionado (0,050,5 nM) inibiram substancialmente a geração de trombina e gráficos de parâmetros de geração de trombina (log de tempo de atraso ou 1nETP) em função de TFPI total (TFPI de plasma + TFPI adicionado) podem ser ajustados a uma linha reta assumindo que o plasma continha ~ 0,3 nM de TFPI. Isto indicou que a atividade anticoagulante de TFPI adicionado é similar à de TFPI que está presente no plasma. Em PRP, quantidades muito maiores de TFPI adicionado foram necessárias para inibir a geração de trombina.

[00545] O complexo peptídico JBT2547 melhorou a geração de trombina em 3-4 vezes em PPP com uma concentração eficaz (EC50) de 2 nM e melhorou a geração de trombina 2 vezes em PRP com uma EC50 de 8 nM. A geração de trombina no PRP ao qual um anticorpo de FVIII inibidor foi adicionado para simular PRP de um paciente hemofílico foi aumentada 3 vezes pelo complexo peptídico. Os dados aqui descritos estabelecem que os peptídeos da invenção ligam-se ao TFPI derivado de plasma, recombinante, e derivado de plaquetas, e aumenta a geração de trombina através do bloqueio dos efeitos anti-coagulantes de TFPI de plaquetas e de plasma.

EXEMPLO 24

[00546] Este exemplo descreve o efeito hemostático de peptídeos da invenção em um modelo murino de sangramento articular hemofílico.

[00547] O objetivo do estudo foi avaliar o efeito de um peptídeo PEGuilado exemplar da invenção em hemartrose induzida por punção em um modelo murino de hemofilia A. O peptídeo JBT2329 foi administrado em uma dose de 1 mg/kg a camundongos deficientes de FVIII com hemofilia grave (E16 FVIII B6; 129S4-F8 tm 1 Kaz/J) através de injeção intravenosa na veia da cauda. Várias doses de FVIII recombinante (ADVATE, 10, 50 e 100 UI/kg) também foram administrados isoladamente ou em combinação com JBT2329. Após cada administração do produto, a cápsula articular do joelho direito, foi perfurada com uma agulha de calibre 30 para induzir a hemorragia. Os animais foram sacrificados três dias após a lesão e o sangramento foi avaliado através de métodos macroscópicas e histológicas. O modelo animal e os métodos de avaliação de sangramento são descritos adicionalmente em Hakobyan et al. Haeomophilia, 14, 804-809 (2008). Resumo de escores de sangramento (SBS), que incluem escores de sangramento visuais e histológicos, foram atribuídos a cada articulação. A administração de um peptídeo PEGuilado da invenção antes da lesão reduz significativamente o sangramento articular. O efeito protetor de 1 mg/kg de JBT2329 foi significativamente maior do que o efeito de 10 UI/kg ADVATE, mas menos do que 100 UI/kg ADVATE, como determinado por SBS. Não houve diferença significativa no efeito protetor conferido por 1 mg/kg de JBT2329 e 50 UI/kg de ADVATE. Os resultados aqui descritos ainda confirmam que os peptídeos da invenção fornecem um efeito profilático ou de proteção contra o sangramento em um modelo in vivo de hemofilia A.

EXEMPLO 25

[00548] Este exemplo descreve o efeito de peptídeos da invenção sobre a capacidade do TFPI em ligar-se aos receptores que medeiam a degradação e depuração celular. A farmacocinética TFPI ligado ao peptídeo também é descrita.

[00549] A ligação de TFPI completo (fl-TFPI) à proteína relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP) foi estudada usando um ensaio de ressonância de plasmon de superfície BIAcore T200™ (GE Healthcare, Chalfont St Giles, Reino Unido) a 37°C. LRP foi biotinilada utilizando um kit de biotinilação de acordo com o protocolo do fabricante (Thermo Scientific). Em seguida, imobilização por neutravidina (2500 RU) a um chip C1 Série S Sensor (GE Healthcare) utilizando química padrão de acoplamento de amina de acordo com os protocolos do fabricante, proteína Cluster II FC Chimera LRP-1 humana recombinante biotinilada (R&D Systems) foi ligada à superfície por meio de interações biotina-neutravidina resultando em 450 RUs. Após a imobilização, fl-TFPI foi injetado em uma taxa de fluxo de 30 μL/min em uma única concentração de 10 nM diluído em tampão de corrida (HBS- N, 0,1% P80, 5 mM CaCl2). fl-TFPI foi subsequentemente dissociado por alteração do fluxo paras as condições do tampão de corrida. Quando a interação da fl-TFPI e PRL foi estudada na presença de peptídeos (JBT1837, JBT1857, JBT2329 (JBT1857 + 40 kD PEG), ou JBT2547 (JBT1837+JBT1857)) ou polietileno-glicol (40 kDa), 1 μM de concentração final do peptídeo ou PEG foi adicionado para fl-TFPI.

[00550] TFPI interagiu de forma eficiente com LRP imobilizado com taxas on e off rápidas. TFPI truncado sem domínio Kunitz 3 (KD3) e o C-terminal não interage com LRP. Por inspeção visual, foi evidente que fl-TFPI ligado a JBT1837, JBT1857 ou JBT2329 ainda interage com LRP. TFPI complexado com o peptídeo de fusão JBT2547 resultou em uma resposta maior do que a observada para TFPI complexado com peptídeos individuais. As cinéticas de associação e dissociação inalteradas da interação LRP-fl-TFPI na presença e na ausência de um complexo peptídico (JBT2547) sugere que diferentes resultados estão associados com o aumento do peso molecular do complexo fl-TFPI- JBT2547 e ligação simultânea potencial de LRP e peptídeo à fl-TFPI por JBT2547. Uma ligeira diminuição na interação de fl-TFPI LRP foi observada quando TFPI foi ligado a JBT2329 (JBT1857 PEGuilado), enquanto que 40 kD PEG isolado não influencia o sistema de ensaio, o que sugere que um peptídeo ligado a PEG altamente hidratado interfere ligeiramente com a interação de fl-TFPI LRP.

[00551] A interação de TFPI com receptor asialoglicoproteína (ASGPR) também foi avaliada utilizando um ensaio ressonância de plasma de superfície BIAcore 3000 ™ (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Reino Unido) a 25°C. Após a imobilização do ASGPR (Novus Biologicals, 470 RU) a um chip CM5 Série S Sensor (GE Healthcare) utilizando uma química padrão de acoplamento de amina de acordo com os protocolos do fabricante, fl-TFPI foi injetado em uma taxa de fluxo de 30 μL/min no modo de análise de ciclo único, em concentrações que variam de 3,84 nM a 150 nM diluídas em tampão de corrida (HBS, pH 7,4, 0,1% P80, 5 mM CaCl2). fl-TFPI foi subsequentemente dissociado por alteração do fluxo paras as condições de tampão de corrida. Quando a interação da fl-TFPI e ASGPR foi estudada na presença de JBT1837, JBT1857, JBT2329, ou JBT2547, 1 μM de concentração final de peptídeo foi adicionada ao fl-TFPI.

[00552] Fl-TFPI interagiu de forma eficiente com ASGPR imobilizado com taxas on e off rápidas. TFPI truncado em C-terminal não interagiu com ASGPR. Foi evidente a partir de inspeção visual que fl-TFPI ligado a JBT1857 ou JBT2547 interagiu com ASGPR. Como LRP, TFPI complexou ao peptídeo de fusão JBT2547 gerado em resposta maior. Também de modo semelhante à interação de fl-TFPI para LRP, JBT2329 diminuiu a interação ASGPR-fl-TFPI, enquanto que a 40 kDa PEG sozinho não influenciou o sistema de ensaio. Os dados sugerem que peptídeos ligados a PEG altamente hidratadas da presente invenção interferem com a interação TFPI-ASGPR através de impedimento estérico.

[00553] Para estudar o impacto de peptídeos ligados a TFPI sobre a farmacocinética de TFPI in vivo, grupos de camundongos (C57B16, sexo masculino, 20-25 g) foram tratados com fl-TFPI humano (775 nM, 5 mL/kg, i.v.), o fl-TFPI humano complexado com um excesso molar de 10 vezes de JBT2528 (775 nM hu fl-TFPI, 7752 nM JBT2528, 5 mL/kg, i.v.) ou fl-TFPI humano complexado com um excesso molar de 10 vezes de JBT2534 (775 nM hu fl-TFPI, 7752 nM JBT2534, 5 mL/kg, i.v.). JBT2528 tem a mesma sequência peptídica como JBT2534, mas sem a modificação de 40 kD PEG. Como tal, JBT2528 serve como um controle para um possível impacto de PEGuilação no ensaio. Em vários pontos de tempo, três camundongos foram sacrificados, o sangue foi retirado por punção cardíaca, e o plasma foi isolado e armazenado congelado (< -60°C) para análise posterior. Os pontos de tempo de amostragem foram os seguintes pontos: fl-TFPI, 0,5, 1, 2 minutos; fl- TFPI-JBT2528, 0,5, 1, 2, 3, 5, 8 minutos; e fl-TFPI- JBT2534, 1, 2, 5, 10, 20, 35 minutos.

[00554] As amostras de plasma foram analisadas para o TFPI humano com um ELISA, que é específico para o TFPI humano. Para quantificação, os poços de uma placa de microtitulação (Nunc Maxisorp) foram revestidos com 1 μg/mL de um anticorpo monoclonal anti-TFPI humano específico para KD2 (Sanquin, etiqueta branca; MW1845) durante a noite a 4°C, seguido por três ciclos de lavagem com TBS contendo 0,1% Tween 20 (TBST). Os poços foram bloqueados durante 1 hora em temperatura ambiente com TBS contendo 2% leite seco desnatado (BioRad). 100 μL de amostra diluída foram aplicadas aos poços e incubadas durante 2 horas em temperatura ambiente. Após a lavagem com TBST (5x), os poços foram incubados durante 1 hora com 0,5 μg/mL de um anticorpo policlonal de coelho anti hTFPI (ADG72; American Diagnostica), lavados 5x com TBST, e incubados durante 1 hora adicional com 0,2 μg/mL de um anticorpo de cabra anti coelho marcado com HRP (A0545; Sigma). A cor foi desenvolvida por adição de 100 μL de substrato (SureBlue TMP, KLP) e parando com 50μL, de 1 M HCl. A absorbância a 450 nm foi medida com um leitor de microplacas (Thermo Appliskan Reader). fl-TFPI purificado endógeno, expresso por células SKHep, foi utilizado como padrão de proteína em concentrações de 0,25-16 ng/mL para a quantificação (Innovations Baxter GmbH). As amostras de plasma foram diluídas de 1/20 a 1/800, dependendo da concentração de TFPI humano esperada.

[00555] fl-TFPI humano teve uma meia-vida muito curta e recuperação in vivo muito fraca. No ponto de tempo mais recente (0,5 min), observou-se apenas um décimo do nível esperado de TFPI. A recuperação e a meia-vida do fl-TFPI permaneceram inalteradas quando fl-TFPI foi complexado com os peptídeos testados. Este experimento indica que a PEGuilação de um peptídeo de ligação a TFPI provavelmente não confere uma maior meia-vida de fl-TFPI e não afeta a eliminação de TFPI.

[00556] Este exemplo demonstra que os peptídeos representativos da invenção não diminuem de forma significativa a interação de TFPI com receptores de clearance e não aumentam a meia-vida do TFPI in vivo.

EXEMPLO 26

[00557] Este exemplo demonstra a capacidade dos peptídeos da invenção para inibir a degradação proteolítica da TFPI.

[00558] O TFPI é proteoliticamente inativada por várias enzimas, incluindo a elastase, trombina, plasmina, FXa e quimase. Ver, por exemplo, Hamuro et al. FEBS Journal, 274, 3056- 3077 (2007). Estudou-se o impacto da proteína de fusão JBT2547, bem como as subunidades de peptídeos individuais JBT1837 e JBT1857, na degradação proteolítica de fl-TFPI por elastase dos neutrófilos. Elastase de neutrófilos é uma protease representante de clivagem de TFPI dentro Lys86 e Gln90 localizado entre os domínios de Kunitz 1 e Kunitz 2.

[00559] Para digestão proteolítica de fl-TFPI, 5 nM de fl -TFPI foram incubadas com 5 nM de elastase de neutrófilos (purificada a partir de neutrófilos humanos, Calbiochem) em tampão de reação (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,5) a 37°C. A reação foi realizada com e sem 1 μM de JBT1837, JBT1857, ou JBT2547. A proteólise foi monitorada por análise de Western blot. Foram colhidas amostras a partir da mistura de reação depois de 0, 5, 15, 30 e 60 minutos e imediatamente aquecido a 96°C durante 5 minutos em tampão de carregamento de SDS em condições de redução. As amostras foram separadas em um gel 4-20% Tris-glicina SDS-poliacrilamida, e as proteínas foram transferidas para uma membrana de PVDF. Depois do bloqueio a membrana com leite em pó desnatado, proteínas de TFPI foram detectadas com um anticorpo policlonal de coelho contra o TFPI humano (AF2974, R&D Systems) e um anticorpo secundário anti-coelho conjugado a HRP (Sigma). O substrato quimioluminescente SuperSignal Oeste Femto (Thermo Scientific) foi aplicado para desenvolver um sinal quimioluminescente que foi capturado em filme. As bandas reveladas foram quantificadas por densitometria.

[00560] Na ausência de peptídeos, a degradação progressiva de fl- TFPI por elastase dos neutrófilos foi observada no espaço de 1 hora. A banda de ~43 kD visualizada no Western Blot correspondente a fl-TFPI intacto quase desaparecido completamente, enquanto que dois produtos de clivagem foram formados por clivagem da ligação peptídica T87-T88. Quando JBT2547 estava presente, a proteólise de fl-TFPI foi bloqueada durante o tempo monitorado, indicando que JBT2547 protege fl-TFPI da degradação por elastase in vitro. As subunidades peptídicas individuais mediaram efeitos diferentes sobre clivagem de fl- TFPI. O JBT1837 protegeu fl-TFPI de proteólise durante uma hora, semelhante aos resultados observados para JBT2547. Em contraste, JBT1857 teve apenas um menor ou nenhum efeito sobre a elastase de clivagem.

Claims (20)

1. Complexo de peptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro peptídeo e um segundo peptídeo, em que (a) o primeiro peptídeo compreende a estrutura de fórmula (XIII): X6001-Q-X6003-X6004-X6005-X6006-X6007-X6008- X6009-X6010-X6011-X6012-X6013-X6014-X6015-X6016-X6017- X6018-X6019-X6020 (XIII) (SEQ ID NO: 3153); em que X6001 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em F, L, M, Y, 1Ni, Thi, Bta, Dopa e Nmf; em que X6003 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em C, D, E, M, Q, R, S, T, Ede(O) e Cmc; em que X6004 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em Aib, E, G, I, K, L, P, R, Y, Nmk e V; em que X6005 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em a, A, Aib, D, d, E, G, H, K, k, N, Nmg, p, Q, R, NpropylG, aze, pip, tic, oic, hyp, nma, Ncg, Nme, Abg, Apg, dtc, F, L e Y; em que X6006 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, C, C(NEM), D, E, G, H, K, N, Q, R, S, V, Cit, C(Acm), Nle, Ede(O), Cmc, Ecl, Eea, Eec, Eef, Nif, Eew, e I; em que X6007 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em I, V, T e Chg; em que X6008 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em F, H, 1Ni, 2Ni, Pmy e Y; em que X6009 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em Aib, V, Phg, Abu, Cpg, Tle e ácido L-2-amino-4,4,4- trifluorbutírico; em que X6010 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, C, D, E, F, H, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, Y, Nmd e C(NEM); em que X6011 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, a, G, p, Sar, c e hcy; em que X6012 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em Y, Dopa e Pmy; em que X6013 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em Aib, C, F, 1Ni, Thi e Bta; em que X6014 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, Aib, C, C(NEM), D, E, K, L, M, N, Q, R, T, V, Hcy e W; em que X6015 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em R e E; em que X6016 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em L, Hcy, Hle e Aml; em que X6017 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, Aib, C, c, Cha, Dab, Eag, Eew, H, Har, Hci, Hle, I, K, L, Nle, Nva, Opa, Orn, R, S, Deg, Ebc, Eca, Egz, Aic, Apc, Egt, Bhr, Dap, e V; em que X6018 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, Aib, C, c, L, Nle, M, N e R; em que X6019 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em K e Har; e em que X6020 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em K, L, Hcy, Aml e Bhl; e (b) o segundo peptídeo compreende a estrutura de fórmula (XIV): X7001-X7002-X7003-K-W-X7006-[C-X7008-X7009-X7010- D-X7012-X7013-X7014-X7015-X7016-X7017-C]-X7019-W-V-X7022- X7023 (XIV) (SEQ ID NO: 3154), em que X7001 está ou presente ou ausente, pelo que em caso de X7001 estar presente ele é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, C(NEM), D, E, F, G, H, K, L, P, Pyn e S; em que X7002 está ou presente ou ausente, pelo que em caso de X7002 estar presente ele é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em C(NEM), F, H, K, L, M, Pyn, R, S e Y; em que X7003 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em F, S e Y; em que X7006 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em F, H, e L; em que X7008 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, G e S; em que X7009 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em M, Moo, Nle e V; em que X7010 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em K, L, P e R; em que X7012 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em K, L, l, M, Moo, Nle e S; em que X7013 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em D, F, G, K, L e S; em que X7014 é D ou G; em que X7015 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em G, I, K, S e T; em que X7016 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em D, F, K, L, M, Moo, Nle, S e Y; em que X7017 é S ou T; em que X7019 é A ou V e W; em que X7020 é W; em que X7021 é V; em que X7022 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em F, K, L, P, R, S e W; em que X7023 está ou presente ou ausente, pelo que em caso de X7023 estar presente ele é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, D, Eag, F, L, M, S e Y; em que o peptídeo compreende como uma estrutura cíclica gerada por uma ligação entre X7007 e X7018; e em que o C-terminal do primeiro peptídeo está ligado ao N- terminal do segundo peptídeo através de uma porção ligante.

2. Complexo de peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que em que X6001 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em 1Ni, Bta, Dopa, F, L, Y e M; em que X6003 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em D, E, S, M, Q, R, T e C; em que X6004 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em K, Aib, L, P, R, E, G, I, Y, M e W; em que X6005 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em p, Nmg, NpropylG, aze, pip, tic, oic, hyp, a, Aib, D, d, G, H, K, k, N, Q, R, A e E; em que X6006 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em C, E, K, R, S, V, C(Acm), Nle, C(NEM), I, Cit, A, D, G, H, N e Q; em que X6007 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em V e I; em que X6008 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em H, 1Ni, 2Ni, Pmy, F e Y; em que X6009 é V, Abu ou Tle; em que X6010 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em D, P, C, T, A, E, K, M, N, Q, R, F, H, S, V e Y; em que X6011 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em G, a, c, hcy e Sar; em que X6012 é Y; em que X6013 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em F, 1Ni, Bta e C; em que X6014 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em Aib, C, E, Hcy, A, D, K, L, M, N, Q, R, T, V e Aib; em que X6015 é R; em que X6016 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em L, Aml, Hle e Hcy; em que X6017 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, Aib, C, c, Aic, Eca, Deg, Cha, Dab, Dap, Eag, Eew, H, Har, Hci, Hle, K, Nle, Nva, Opa, Orn, R, I, L e S; em que X6018 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, Aib, C, c, L, N, M e R; em que X6019 é K; e em que X6020 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em L, Aml, Hcy e K.

3. Complexo de peptídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro peptídeo e/ou o segundo peptídeo ainda compreendem aminoácido(s) N-terminal e/ou porções ligadas a X6001 e/ou X7001 e são selecionados do grupo consistindo em FAM-Ttds, PE, Palm, 2-fenil acetila, 3-fenil propionila, 2-(naft-2-il) acetila, hexanoila, 2-metil propionila, 3-metil butanoila, 2-naftilsulfonila, 1-naftilsulfonila, acetila, Con, Con(Meox), AOA, Oxme-AOA, Meox-Lev, ácido levulínico (Lev) e ácido pentinoico (Pyn).

4. Complexo de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o primeiro peptídeo e/ou o segundo peptídeo ainda compreendem X6021 ligado a X6020 ou X7024 ligado a X7023, respectivamente, em que X6021 e/ou X7024 compreendem aminoácido(s) C-terminal e/ou porções selecionadas do grupo consistindo em Hly, K, Orn, Dab, Dap, Eag, Hcy, Pen, C, c, C(NEM), Con, Con(Meox), K(Ttds-maleimidopropionyl(EtSH)), K(Tdts- maleimid), K(AOA), K(Myr), K(Ttds-Myr), K(Ttds-Palm), K(Ttds-Ac), K(Ttds-YGlu-Myr), K(AlbuTag), K(4PBSA), Cea e amida.

5. Complexo de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que X7001 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, D, F, G, H, K, L e S; em que X7019 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A e V; em que X7022 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em F, L, K, R, P e W; em que X7023 está ou presente ou ausente, pelo que em caso de X7023 estar presente ele é uma sequência de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em A, D, F, M, S e Y.

6. Complexo de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a porção ligante é de 1 a 100 Â em comprimento, de 5 a 50 Â em comprimento ou de 10 a 30 Â em comprimento.

7. Complexo de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a porção ligante compreende a estrutura Z1-20, em que Z é um aminoácido, hidróxi ácido, etileno glicol, propileno glicol, ou uma combinação de qualquer um dos anteriores.

8. Complexo de peptídeo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que Z é G, s, S, a, A, Bal, Gaba, Ahx, Ttds, ou uma combinação de qualquer um dos anteriores.

9. Complexo de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a porção ligante é fixada ao primeiro peptídeo e/ou ao segundo peptídeo via uma oxima, uma hidrazida, uma succinimida, um thioéter, um triazol, uma amina secundária, uma amida ou um dissulfeto.

10. Complexo de peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro peptídeo compreende a sequência de aminoácido estabelecida em SEQ ID NO: 4261 e o segundo peptídeo compreende a sequência de aminoácido estabelecida em SEQ ID NO: 1334.

11. Complexo de peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido estabelecida em SEQ ID NO: 4260.

12. Complexo de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o complexo de peptídeo é conjugado a uma porção de polietileno glicol (PEG), albumina sérica humana (HSA), um domínio de ligação a HSA, um anticorpo ou fragmento dos mesmos, hidroxietil amido, um multímero prolina-alanina-serina (PASilação) ou um ácido graxo C12-C18.

13. Complexo de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é para uso em um método para o tratamento de um sujeito.

14. Uso do complexo de peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio de coagulação de sangue.

15. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o complexo de peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

16. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que compreende um agente farmaceuticamente eficaz adicional.

17. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica é para uso em um método de tratar distúrbio de coagulação de sangue.

18. Uso de um peptídeo compreendendo a estrutura de fórmula (XIV): X7001-X7002-X7003-X7004-X7005-X7006-[X7007-X7008- X7009-X7010-X7011-X7012-X7013-X7014-X7015-X7016-X7017- X7018]-X7019-X7020-X7021-X7022-X7023 (XIV) (SEQ ID NO: 3154), em que X7001 está ou presente ou ausente, pelo que em caso de X7001 estar presente ele é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, C, C(NEM), D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V e W; em que X7002 está ou presente ou ausente, pelo que em caso de X7002 estar presente ele é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, C, C(NEM), D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W e Y; em que X7003 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, F, I, K, L, R, S, T, V, W e Y; em que X7004 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V e W; em que X7005 é R ou W; em que X7006 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em F, H, I, K, L, R, V e W; em que X7007 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em Orn, homoK, C, Hcy, Dap e K; em que X7008 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, G, R, S e T; em que X7009 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em a, A, I, K, L, M, m, Moo, Nle, p, R, Sem e V; em que X7010 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, G, I, K, L, P, R, S, T e V; em que X7011 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em D, E, G, S e T; em que X7012 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, a, D, d, E, e, F, f, G, I, K, k, L, l, M, m, Moo, Nle, nle, P, p, R, r, S, s, Sem, T, t, V, v , W e w; em que X7013 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, C, C(NEM), Con, Con(Meox), D, d, E, e, Eag, F, G, I, K, L, N, R, S, s, T, V e W; em que X7014 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, D, E, F, G, I, K, L, M, R, S, T, V e W; em que X7015 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, D, E, F, G, I, K, L, M, Nle, R, S, T, V e W; em que X7016 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, D, E, F, I, K, L, M, Moo, Nle, R, S, Sem, T, V, W e Y; em que X7017 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V, W e Y; em que X7018 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em C e D; em que X7019 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, F, I, L, S, T, V e W; em que X7020 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em F e W; em que X7021 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em I, L e V; em que X7022 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, D, E, F, G, I, K, L, P, R, S, T, V e W; em que X7023 está ou presente ou ausente, pelo que em caso de X7023 estar presente ele é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, C, C(NEM), Con, Con(Meox), D, E, Eag, F, G, I, K, L, R, S, T, V, W e Y; e em que o peptídeo compreende como uma estrutura cíclica gerada por uma ligação entre X7007 e X7018, pelo que a degradação de TFPI pela serina protease é inibida, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para reduzir a coagulação.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que: X7001 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, D, F, G, H, K, L e S; X7002 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em H, F, M e R; X7003 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em F e Y; X7004 é K; X7005 é W; X7006 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em F e H; X7007 é C; X7008 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, G e S; X7009 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em M, Sem e V; X7010 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em K, P e R; X7011 é D; X7012 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em F, L, l, M e Sem; X7013 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em D, G, K e S; X7014 é G; X7015 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em I e T; X7016 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em D, F, M, Sem e Y; X7017 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em S e T; X7018 é C; X7019 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A e V; X7020 é W; X7021 é V; X7022 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em F, L, K, R, P e W; X7023 está ou presente ou ausente, pelo que em caso de X7023 estar presente ele é uma sequência de aminoácidos selecionados de do grupo consistindo em A, D, F, M, S e Y; e em que o peptídeo compreende como uma estrutura cíclica gerada por uma ligação entre X7007 e X7018.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é parte de um complexo de peptídeo que compreende ainda um peptídeo compreendendo a estrutura de fórmula (XIII): X6001-X6002-X6003-X6004-X6005-X6006-X6007-X6008- X6009-X6010-X6011-X6012-X6013-X6014-X6015-X6016-X6017- X6018-X6019-X6020 (XIII) (SEQ ID NO: 3153); em que X6001 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em F, L, M, Y, 1Ni, Thi, Bta, Dopa, Bhf, C, D, G, H, I, K, N, Nmf, Q, R, T, V e W; em que X6002 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em Q, G e K; em que X6003 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em C, D, E, M, Q, R, S, T, Ede(O), Cmc, A, Aib, Bhs, F, G, H, I, K, L, N, P, V, W e Y; em que X6004 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em Aib, E, G, I, K, L, M, P, R, W, Y, A, Bhk, C, D, F, H, k, N, Nmk, Q, S, T e V; em que X6005 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em a, A, Aib, C, D, d, E, G, H, K, k, M, N, Nmg, p, Q, R, NpropylG, aze, pip, tic, oic, hyp, nma, Ncg, Abg, Apg, thz, dtc, Bal, F, L, S, T, V, W e Y; em que X6006 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, C, C(NEM), D, E, G, H, K, M, N, Q, R, S, V, Cit, C(Acm), Nle, I, Ede(O), Cmc, Ecl, Eea, Eec, Eef, Nif, Eew, Aib, Btq, F, I, L, T, W e Y; em que X6007 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em I, V, T, Chg, Phg, Tle, A, F, G, I, K, L, Nmv, P, Q, S, W e Y; em que X6008 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em F, H, 1Ni, 2Ni, Pmy, Y e W; em que X6009 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em Aib, V, Chg, Phg, Abu, Cpg, Tle, ácido L-2-amino-4,4,4- trifluorbutírico, A, f, I, K, S, T e V; em que X6010 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, C, D, d, E, F, H, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, Nmd, C(NEM), Aib, G, I, L e Nmf; em que X6011 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, a, G, p, Sar, c, hcy, Aib, C, K, G e Nmg; em que X6012 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em Y, Tym, Pty, Dopa e Pmy; em que X6013 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em Aib, C, F, 1Ni, Thi, Bta, A, E, G, H, K, L, M, Q, R, W e Y; em que X6014 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, Aib, C, C(NEM), D, E, K, L, M, N, Q, R, T, V, Hcy, Bhe, F, G, H, I, P, S, W e Y; em que X6015 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em R, (ômega-metil)-R, D, E e K; em que X6016 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em L, Hcy, Hle e Aml; em que X6017 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, a, Aib, C, c, Cha, Dab, Eag, Eew, H, Har, Hci, Hle, I, K, L, M, Nle, Nva, Opa, Orn, R, S, Deg, Ebc, Eca, Egz, Aic, Apc, Egt, (ômega-metil)-R, Bhr, Cit, D, Dap, E, F, G, N, Q, T, V, W e Y; em que X6018 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, Aib, Hcy, hcy, C, c, L, Nle, M, N, R, Bal, D, E, F, G, H, I, K, Q, S, T, V, W e Y; em que X6019 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em K, R, Har, Bhk e V; e em que X6020 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em K, L, Hcy, Aml, Aib, Bhl, C, F, G, H, I, Nml, Q, R, S, T, V, W e Y.

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