RU2347574C2 - Способы лечения коагулопатий с использованием сульфатированных полисахаридов - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к лекарственным средствам и касается применения неантикоагулянтного сульфатированного полисахарида (NASP) для лечения индивидуума, нуждающегося в повышении свертываемости крови. Описанные NASP могут быть введены как самостоятельные средства или в сочетании с другими лекарственными средствами (такими как факторы VIII и VIIIa) для обеспечения гемостаза. Также раскрыт способ лечения индивидуума, нуждающегося в повышении свертываемости крови, предусматривающий введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества композиции, содержащей неантикоагулянтный сульфатированный полисахарид (NASP). Изобретение направлено на создание прокоагулянтного средства, обладающего широким диапазоном применения. 7 н. и 12 з.п. ф-лы, 8 ил., 13 табл.

Description

Изобретение относится к лечению коагулопатий, включающих в себя врожденные нарушения свертываемости крови, приобретенные нарушения свертываемости крови и травму, приводящую к геморрагическим состояниям. В частности, изобретение относится к применению неантикоагулянтных сульфатированных полисахаридов (NASP) для улучшения свертываемости крови и гемостаза при гемофилических состояниях.

Уровень техники

Свертывание крови в норме представляет собой комплекс физиологических и биохимических процессов, включающих в себя активацию каскада факторов свертывания крови, что приводит к образованию фибрина и агрегации тромбоцитов наряду с местной вазоконстрикцией (обзор Davie et al., Biochemistry 30:10363, 1991). Каскад свертывания крови состоит из "внешнего" пути, который, как полагают, является первичным средством стимуляции нормального свертывания крови, и "внутреннего" пути, обеспечивающего более распространенный коагуляционный ответ. В норме ответ на кровотечение включает в себя активацию внешнего пути. Активация внешнего пути начинается с контакта крови с тканевым фактором (TF), кофактором для фактора VII, который становиться доступным или экспрессируется в тканях после повреждения. TF образует комплекс с FVII, который способствует продукции FVIIa. Затем FVIIa ассоциирует с TF и преобразует FX в сериновую протеазу FXa, которая является основным компонентом протромбиназного комплекса. Преобразование протромбина в тромбин с помощью комплекса FXa/FVa/кальций/фосфолипид стимулирует образование фибрина и активацию тромбоцитов, что является необходимым для нормального свертывания крови. Гемостаз в норме дополнительно усиливается факторами внутреннего пути IXa и VIIIa, которые также преобразуют FX в FXa.

При коагулопатиях, которые могут возникать вследствие врожденных нарушений свертываемости крови, приобретенных нарушений свертываемости крови или геморрагических состояний, вызванных травмой, нарушается свертывание крови. Кровотечение является одним из наиболее серьезных и значительных проявлений заболевания и может возникать местно или генерализованно. Местное кровотечение может быть опосредовано повреждением и может дополнительно осложняться из-за поврежденного механизма гемостаза. Врожденное или приобретенное отсутствие любого из факторов свертывания может опосредовать склонность к кровотечениям. Врожденные нарушения свертываемости крови включают в себя гемофилию, рецессивное сцепленное с X-хромосомой нарушение, включающее в себя дефицит фактора свертывания VIII (гемофилия A) или фактора IX (гемофилия B), и болезнь фон Виллебранда, которая является редкой коагулопатией, вызванной тяжелым дефицитом фактора фон Виллебранда. Приобретенные нарушения свертываемости крови могут возникать у индивидуумов без возникавших ранее кровотечений в анамнезе, как результат патологического процесса. Например, приобретенные нарушения свертываемости крови могут быть вызваны ингибиторами или аутоиммунной реакцией против факторов свертывания крови, таких как фактор VIII, фактор фон Виллебранда, факторы IX, V, XI, XII и XIII; или нарушениями гемостаза, такими как нарушения, вызванные заболеваниями печени, которые могут быть связаны со снижением синтеза фактора свертывания. Как правило, при дефиците фактора свертывания лечение проводят замещением фактора, что является дорогостоящим, неудобным (внутривенное введение) и не всегда эффективным. Не менее чем у 20% пациентов, получающих длительную заместительную терапию, могут образовываться нейтрализующие антитела против замещающих факторов.

Таким образом, остается необходимость в новых терапевтических подходах для лечения коагулопатий. Единое фармацевтическое средство, которое является безопасным, удобным и эффективным при различных коагулопатиях, могло бы оказаться благоприятным в клинической практике.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способам и композициям для лечения коагулопатий с использованием в качестве прокоагулянтов неантикоагулянтных сульфатированных полисахаридов (NASP). NASP можно вводить в качестве единственного средства, или в сочетании с еще одним NASP, или с другими гемостатическими средствами. В частности, описано использование NASP для лечения коагулопатий, включая врожденные нарушения свертываемости крови, приобретенные нарушения свертываемости крови и травму, приводящую к геморрагическим состояниям.

В одном из аспектов изобретение относится к способу лечения индивидуума, нуждающегося в повышении свертываемости крови, предусматривающему введение индивидууму терапевтически эффективного количества композиции, содержащей неантикоагулянтный сульфатированный полисахарид (NASP). В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу лечения индивидуума, страдающего коагулопатией, предусматривающему введение индивидууму терапевтически эффективного количества композиции, содержащей NASP. В некоторых вариантах осуществления NASP выбран из группы, состоящей из N-ацетилгепарина (NAH), N-ацетил-де-O-сульфатированного гепарина (NA-de-o-SH), де-N-сульфатированного гепарина (De-NSH), де-N-сульфатированного ацетилированного гепарина (De-NSAH), оксидированного йодной кислотой гепарина (POH), химически сульфатированного ламинарина (CSL), химически сульфатированной альгиновой кислоты (CSAA), химически сульфатированного пектина (CSP), декстрансульфата (DXS), полученных из гепарина олигосахаридов (HDO), пентозанполисульфата (PPS) и фукоидана.

В других вариантах осуществления NASP выбран из группы, состоящей из низкомолекулярных фрагментов перечисленных выше соединений. В предпочтительных вариантах осуществления фрагмент NASP снижает время свертывания крови в анализе dPT. В одном из вариантов осуществления NASP представляет собой фрагмент фукоидана, который снижает время свертывания в анализе dPT.

В дополнительных вариантах осуществления NASP можно вводить совместно с одним или несколькими различными NASP и/или в сочетании с одним или несколькими другими терапевтическими средствами.

В некоторых вариантах осуществления NASP вводят индивидууму для лечения коагулопатий, выбранных из группы, состоящей из гемофилии A, гемофилии B, болезни фон Виллебранда, идиопатической тромбоцитопении, дефицита одного или нескольких факторов контакта, таких как фактор XI, фактор XII, прекалликреин и высокомолекулярный кининоген (HMWK), дефицита одного или нескольких факторов, опосредованного выраженными клиническими кровотечениями, таких как фактор V, фактор VII, фактор VIII, фактор IX, фактор X, фактор XIII, фактор II (гипопротромбинемия) и фактор фон Виллебранда, дефицита витамина К, нарушения фибриногена, включающего афибриногенемию, гипофибриногенемию и дисфибриногенемию, дефицита альфа₂-антиплазмина и обильного кровотечения, такого как кровотечение, вызванное заболеванием печени, заболеванием почек, тромбоцитопенией, тромбоцитарной дисфункцией, гематомы, внутреннего кровотечения, гемартрозов, хирургической операции, травмы, гипотермии, менструации и беременности.

В некоторых вариантах осуществления NASP вводят индивидууму для лечения врожденного нарушения свертываемости или приобретенного нарушения свертываемости, вызванных дефицитом факторов крови. Дефицит фактора крови может быть вызван дефицитом одного или нескольких факторов, включающих в себя, но ими не ограничиваясь, фактор V, фактор VII, фактор VIII, фактор IX, фактор XI, фактор XII, фактор XIII и фактор фон Виллебранда.

В некоторых вариантах осуществления индивидууму, страдающему коагулопатией, вводят терапевтически эффективное количество композиции, содержащей NASP в сочетании с другим терапевтическим средством. Например, индивидууму можно вводить терапевтически эффективное количество композиции, содержащей NASP и один или несколько факторов, выбранных из группы, состоящей из фактора XI, фактора XII, прекалликреина, высокомолекулярного кининогена (HMWK), фактора V, фактора VII, фактора VIII, фактора IX, фактора X, фактора XIII, фактора II, фактора VIIa и фактора фон Виллебранда. Кроме того, лечение может предусматривать введение прокоагулянта, такого как тромбин; активатор внутреннего пути свертывания крови, включая фактор Xa, фактор IXa, фактор XIa, фактор XIIa и VIIa, прекалликреин и высокомолекулярный кининоген; или активатор внешнего пути свертывания крови, включая тканевой фактор, фактор VIIa, фактор Va и фактор Xa. Терапевтические средства, используемые для лечения индивидуума, страдающего коагулопатией, можно вводить в виде одной или различных композиций одновременно, до или после введения NASP.

В другом аспекте изобретение относится к способу обратного эффекта антикоагулянта у индивидуума, способу, предусматривающему введение индивидууму терапевтически эффективного количества композиции, содержащей неантикоагулянтный сульфатированный полисахарид (NASP). В некоторых вариантах осуществления индивидуум может получать лечение антикоагулянтом, включая, но не ограничиваясь ими, гепарин, производное кумарина, такое как варфарин или дикумарол, ингибитор пути тканевого фактора (TFPI), антитромбин III, волчаночный антикоагулянт, антикоагулянтный пептид нематод (NAPc2), фактор VIIa (фактор VIIai) с заблокированным активным центром, ингибиторы фактора IXa, ингибиторы фактор Xa, включая фондапаринукс, идрапаринукс, DX-9065a и разаксабан (DPC906), ингибиторы факторов Va и VIIIa, включая активированный протеин C (APC) и растворимый тромбомодулин, ингибиторы тромбина, включая гирудин, бивалирудин, аргатробан и ксимелагатран. В некоторых вариантах осуществления антикоагулянтом, вводимым индивидууму, могут быть антитела, которые связываются с фактором свертывания, включая, но не ограничиваясь ими, антитела, которые связываются с фактором V, фактором VII, фактором VIII, фактором IX, фактором X, фактором XIII, фактором II, фактором XI, фактором XII, фактором фон Виллебранда, прекалликреином или высокомолекулярным кининогеном (HMWK).

В некоторых вариантах осуществления для обратного эффекта антикоагулянта у пациента можно вводить NASP совместно с одним или несколькими различными NASP и/или в сочетании с одним или несколькими другими терапевтическими средствами. Например, индивидууму можно вводить терапевтически эффективное количество композиции, содержащей NASP и один или несколько факторов, выбранных из группы, состоящей из фактора XI, фактора XII, прекалликреина, высокомолекулярного кининогена (HMWK), фактора V, фактора VII, фактора VIII, фактора IX, фактора X, фактора XIII, фактора II, фактора VIIa и фактора фон Виллебранда. Кроме того, лечение может предусматривать введение прокоагулянта, такого как активатор внутреннего пути свертывания крови, включая фактор Xa, фактор IXa, фактор XIa, фактор XIIa, и VIIIa, прекалликреин и высокомолекулярный кининоген; или активатор внешнего пути свертывания крови, включая тканевой фактор, фактор VIIa, фактор Va и фактор Xa. Терапевтические средства, используемые в сочетании с NASP для обратного эффекта антикоагулянта у пациента можно вводить в виде одной или различных композиций одновременно, до или после введения NASP.

В другом аспекте изобретение относится к способу лечения индивидуума, перенесшему хирургическую или инвазивную процедуру, когда улучшение свертываемости крови было бы желательным, предусматривающему введение индивидууму терапевтически эффективного количества композиции, содержащей неантикоагулянтный сульфатированный полисахарид (NASP). В некоторых вариантах осуществления NASP можно вводить совместно с одним или несколькими различными NASP и/или в сочетании с одним или несколькими другими терапевтическими средствами индивидууму, перенесшему хирургическую или инвазивную процедуру. Например, индивидууму можно вводить терапевтически эффективное количество одного или нескольких факторов, выбранных из группы, состоящей из фактора XI, фактора XII, прекалликреина, высокомолекулярного кининогена (HMWK), фактора V, фактора VII, фактора VIII, фактора IX, фактора X, фактора XIII, фактора II, фактора VIIa и фактора фон Виллебранда. Кроме того, лечение может предусматривать введение прокоагулянта, такого как активатор внутреннего пути свертывания крови, включая фактор Xa, фактор IXa, фактор XIa, фактор XIIa и VIIIa, прекалликреин и высокомолекулярный кининоген; или активатор внешнего пути свертывания крови, включая тканевой фактор, фактор VIIa, фактор Va и фактор Xa. Терапевтические средства, используемые для лечения индивидуума, перенесшего хирургическую или инвазивную процедуру, можно вводить в виде одной или различных композиций одновременно, до или после введения NASP.

В другом аспекте изобретение относится к способу ингибирования активности TFPI у индивидуума, к способу, предусматривающему введение индивидууму терапевтически эффективного количества композиции, содержащей NASP.

В другом аспекте изобретение относится к способу ингибирования активности TFPI в биологическом образце, к способу, предусматривающему объединение биологического образца (например, крови или плазмы) с достаточным количеством неантикоагулянтного сульфатированного полисахарида (NASP) для ингибирования активности TFPI.

В другом аспекте изобретение относится к композиции, содержащей NASP. В некоторых вариантах осуществления NASP выбран из группы, состоящей из N-ацетилгепарина (NAH), N-ацетил-де-O-сульфатированного гепарина (NA-de-o-SH), де-N-сульфатированного гепарина (De-NSH), де-N-сульфатированного ацетилированного гепарина (De-NSAH), оксидированного йодной кислотой гепарина (POH), химически сульфатированного ламинарина (CSL), химически сульфатированной альгиновой кислоты (CSAA), химически сульфатированного пектина (CSP), декстрансульфата (DXS), полученных из гепарина олигосахаридов (HDO), пентозанполисульфата (PPS) и фукоидана. В других вариантах осуществления NASP выбран из группы, состоящей из низкомолекулярных фрагментов перечисленных выше соединений. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления композиция может содержать фармацевтически приемлемый эксципиент. В некоторых вариантах осуществления композиция может дополнительно содержать один или несколько различных NASP и/или одно или несколько терапевтических средств и/или агентов. Например, композиция может дополнительно содержать один или несколько факторов, выбранных из группы, состоящей из фактора XI, фактора XII, прекалликреина, высокомолекулярного кининогена (HMWK), фактора V, фактора VII, фактора VIII, фактора IX, фактора X, фактора XIII, фактора II и фактора фон Виллебранда, тканевого фактора, фактора VIIa, фактора Va и фактора Xa, фактора IXa, фактора XIa, фактора XIIa и VIIIa; и/или один или несколько агентов, выбранных из группы, состоящей из агента APTT, тромбопластина, фибрина, TFPI, яда гадюки Рассела, микроизмельченных частиц диоксида кремния, эллаговой кислоты, сульфатидов и каолина.

В другом аспекте изобретение относится к способу определения ускорения свертывания крови под действием NASP в биологическом образце, к способу, предусматривающему:

a) объединение биологического образца с композицией, содержащей NASP,

b) измерение времени свертывания биологического образца,

c) сравнение времени свертывания биологического образца с временем свертывания соответствующего биологического образца, который не подвергали воздействию NASP, где снижение времени свертывания биологического образца, который подвергали воздействию, если оно наблюдается, означает, что NASP ускоряет свертывание.

В некоторых вариантах осуществления для определения времени свертывания к биологическому образцу можно добавлять один или несколько различных NASP, и/или терапевтических средств, и/или агентов. Например, могут быть добавлены один или несколько факторов, включая, но не ограничиваясь ими, фактор XI, фактор XII, прекалликреин, высокомолекулярный кининоген (HMWK), фактор V, фактор VII, фактор VIII, фактор IX, фактор X, фактор XIII, фактор II и фактор фон Виллебранда, тканевой фактор, фактор VIIa, фактор Va и фактор Xa, фактор IXa, фактор XIa, фактор XIIa и VIIIa; и/или один или несколько агентов, включая, но не ограничиваясь ими, агент APTT, тканевой фактор, тромбопластин, фибрин, TFPI, яд гадюки Рассела, микроизмельченные частицы диоксида кремния, эллаговую кислоту, сульфатиды и каолин.

Эти и другие варианты осуществления настоящего изобретения будут понятны специалисту в данной области, из приведенного здесь описания.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлено повышение времени свертывания гемофильной A плазмы (Hem-A) в присутствии ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), определенное в анализе dPT. График зависимости времени свертывания (секунды) от концентрации TFPI (мкг/мл) показывает, что время свертывания повышается линейно с увеличением дозы TFPI.

На фиг.2 представлено сравнение антикоагулянтной активности потенциальных NASP, N-ацетилгепарина (NAH), N-ацетил-де-O-сульфатированного гепарина (NA-de-O-SH), де-N-сульфатированного гепарина (De-N-SH), де-N-сульфатированного ацетилированного гепарина (De-N-SAH), пентозанполисульфата (PPS), фукоидана и гепарина. Выбранные полисахариды тестировали в различных концентрациях в плазме Hem-A. На фиг.2 представлен график зависимости времени свертывания (секунды) от концентрации (нМ). Показанные на графике точки представляют собой средние значения повторных измерений.

На фиг.3 представлено сравнение эффектов NAH, PPS, фукоидана и гепарина на время свертывания плазмы Hem-A, содержащей 1,25% плазмы FACT, определяемых с использованием анализа aPTT. На фиг.3 представлен график зависимости времени свертывания (секунды) от концентрации NASP (нМ). Показанные точки на графике представляют собой средние значения повторных измерений.

На фиг.4 показано, что NASP, включая NAH, PPS и фукоидан, ускоряют свертывание плазмы Hem-A, содержащей рекомбинантный TFPI. Перед добавлением в плазму NASP в течение короткого периода времени преинкубировали с TFPI. Время свертывания определяли с использованием анализа dPT. Представлен график зависимости времени свертывания (секунды) от концентрации NASP (нМ). Показанные точки на графике представляют собой средние значения повторных измерений. Ингибирование активности TFPI с помощью NASP приводит к снижению времени свертывания плазмы.

На фиг.5 показано, что NASP, включая NAH, PPS и фукоидан, ускоряют свертываемость гемофильной B плазмы (Hem-B), содержащей рекомбинантный TFPI. Перед добавлением в плазму NASP в течение короткого периода времени преинкубировали с TFPI. Время свертывания определяли с использованием анализа dPT. Представлен график зависимости времени свертывания (секунды) от концентрации NASP (нМ). Показанные точки на графике представляют собой средние значения повторных измерений. Ингибирование активности TFPI посредством NASP приводит к снижению времени свертывания плазмы.

На фиг.6 показано, что NAH, PPS и фукоидан ускоряют свертывание плазмы Hem-A, содержащей TFPI, без преинкубации TFPI с NASP перед добавлением TFPI в плазму. Представлен график зависимости времени свертывания (секунды) от концентрации NASP (нМ). Время свертывания определяли с использованием анализа dPT. Показанные точки на графике представляют собой средние значения повторных измерений.

На фиг.7 показано, что PPS и фукоидан ускоряют свертывание плазмы Hem-A в отсутствие экзогенного добавления TFPI. Эффект дозы NASP на усиление активации внешнего пути сравнивали с положительным контролем, фактором VIIa. На фиг.7 представлен график зависимости времени свертывания (секунды) от концентрации NASP (нМ). Время свертывания определяли с использованием анализа dPT. Показанные точки на графике представляют собой средние значения повторных измерений.

На фиг.8 показано, что при анализе dPT фукоидан и PPS ускоряют свертывание плазмы, дефицитной по фактору VII. Время свертывания измеряли после преинкубации плазмы, дефицитной по фактору VII, с различными концентрациями фукоидана или PPS. На фиг.8 представлен график зависимости времени свертывания (секунды) от концентрации NASP (нМ). Показанные точки на графике представляют собой средние значения повторных измерений.

Подробное описание изобретения

Для осуществления настоящего изобретения будут использованы, если нет иных указаний, обычные способы фармакологии, химии, биохимии, технологии свертывания, рекомбинантных ДНК и иммунологии в рамках области техники. Такие технологии подробно описаны в литературе. См., например, Handbook of Experimental Immunology, Vols.I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2-nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.).

I. Определения

В описании настоящего изобретения будут использованы следующие термины, и они предназначены для обозначения следующего.

Следует заметить, что, как используется в этом описании и прилагаемой формуле изобретения, формы единичного числа "некоторый" и "этот" включают в себя обозначение множественного числа, если в содержании явно не указано иное. Таким образом, например, упоминание "NASP" включает в себя смесь двух или более таких средств и т.п.

Как используется в настоящем описании, термин "NASP" относится к сульфатированному полисахариду, который обладает антикоагулянтной активностью в анализах свертываемости по протромбиновому времени с разведенным тромбопластином (dPT) или по активированному частичному тромбопластиновому времени (aPTT), которая составляет не более одной трети и предпочтительно менее одной десятой молярной антикоагулянтной (статистически значимое повышение времени свертывания) активности нефракционированного гепарина (ММ в диапазоне от 8000 до 30000; в среднем 18000 дальтон). NASP могут быть очищенными и/или могут быть модифицированы из природных источников (например, бурые водоросли, древесная кора, ткани животных) или могут быть синтезированы de novo, и их молекулярная масса может находиться в диапазоне от 100 дальтон до 1000000 дальтон. NASP могут быть использованы в способах по настоящему изобретению для улучшения гемостаза при лечении коагулопатий, в частности таких коагулопатий, которые связаны с дефицитом факторов свертывания, или для обратного эффекта антикоагулянтов. Способность NASP стимулировать свертывание и уменьшать кровотечение легко определить с помощью различных анализов свертываемости in vitro (например, анализов dPT и aPTT) и в моделях кровотечения in vivo (например, надрез хвоста, поперечный разрез, время свертывания цельной крови или определение времени кровотечения из эпонихия у мышей и собак с гемофилией). Смотри, например, PDR Staff. Physicians' Desk Reference. 2004, Anderson et al. (1976) Thromb. Res. 9:575-580; Nordfang et al. (1991) Thromb Haemost. 66:464-467; Welsch et al. (1991) Thrombosis Research 64: 213-222; Broze et al. (2001) Thromb Haemost 85:747-748; Scallan et al. (2003) Blood. 102:2031-2037; Pijnappels et al. (1986) Thromb. Haemost. 55:70-73; и Giles et al. (1982) Blood 60:727-730.

Как используется в настоящем описании термин "прокоагулянт" относится к любому фактору или агенту, способному стимулировать или ускорять образование тромба. Прокоагулянт по настоящему изобретению включает в себя любой активатор внутреннего или внешнего пути свертывания, такой как фактор свертывания, выбранный из группы, состоящей из фактора Xa, фактора IXa, фактора XIa, фактора XIIa и VIIIa, прекалликреина, высокомолекулярного кининогена, тканевого фактора, фактора VIIa и фактора Va. Другие агенты, которые обеспечивают свертывание, включают в себя калликреин, инициатор APTT (т.е. агент, содержащий фосфолипид и контактный активатор), яд гадюки Рассела (время RVV) и тромбопластин (для dPT). Контактные активаторы, которые могут использоваться в способах по настоящему изобретению в качестве прокоагулянтных агентов, включают в себя микроизмельченные частицы диоксида кремния, эллаговую кислоту, сульфатиды, каолин или тому подобное, известные специалистам в данной области. Прокоагулянты могут быть получены из неочищенных природных экстрактов, крови или образца плазмы, могут быть выделенными и по существу очищенными, синтетическими или рекомбинантными. Прокоагулянты могут включать в себя природные факторы свертывания или их фрагменты, варианты или ковалентно модифицированные производные, которые сохраняют биологическую активность (т.е. обеспечивают свертывание). Оптимальные концентрации прокоагулянта могут быть определены специалистами в данной области.

Как используется в настоящем описании термин "полисахарид" относится к полимеру, содержащему множество (т.е. два или более) ковалентно связанных остатков сахаридов. Связи могут быть природными или неприродными. Природные связи включают в себя, например, гликозидные связи, а неприродные связи могут включать, например, группы, связанные со сложным эфиром, амидом или оксимом. Полисахариды могут обладать любым из широкого диапазона значением средней молекулярной массы (ММ), но, как правило, оно составляет по меньшей мере приблизительно 100 дальтон. Например, полисахариды могут иметь молекулярную массу по меньшей мере приблизительно 500, 1000, 2000, 4000, 6000, 8000, 10000, 20000, 30000, 50000, 100000, 500000 дальтон или даже выше. Полисахариды могут иметь неразветвленную или разветвленную структуру. Полисахариды могут включать в себя фрагменты полисахаридов, образованные при деградации (например, гидролизе) более крупных полисахаридов. Деградацию можно достичь любым из множества способов, известных специалистам в данной области, включая обработку полисахаридов кислотой, основанием, нагреванием или ферментами, с получением деградированных полисахаридов. Полисахариды могут быть химически изменены и могут иметь модификации, включая, но не ограничиваясь ими, сульфатацию, полисульфатацию, этерификацию и метилирование.

Термин "полученный из" используется в настоящем описании для определения исходного источника молекулы, но он не предназначен для ограничения способа, которым получена эта молекула, который может представлять собой химический синтез или рекомбинантные способы.

Термины "вариант", "аналог" и "мутеин" относятся к биологически активным производным указанной молекулы, которые сохраняют желательную активность, такую как активность в отношении свертывания крови при лечении указанных здесь коагулопатий. Как правило, в случае полипептида (например, фактора свертывания) термины "вариант" и "аналог" относятся к соединениям с последовательностью и структурой нативного полипептида, имеющим одно или несколько аминокислотных добавлений, замещений (как правило, консервативных по своей природе) и/или делеций в нативной молекуле, при условии, что модификации не нарушают биологическую активность, и соединения являются "по существу гомологичными" указанной молекуле, как определено ниже. Как правило, аминокислотная последовательность таких аналогов будет обладать высокой степенью гомологии с указанной последовательностью при выравнивании двух последовательностей, например, гомология аминокислотной последовательности может составлять более 50%, как правило, более 60-70%, еще более конкретно 80-85% или более, как, например, по меньшей мере 90-95% или более. Зачастую аналоги включают в себя такое же количество аминокислот, но имеют замены, как объясняется в данном описании. Кроме того, термин "мутеин" включает в себя полипептиды с одной или несколькими молекулами, подобными аминокислотам, включая, но не ограничиваясь ими, соединения, содержащие только амино и/или имино молекулы, полипептиды, содержащие один или несколько аналогов аминокислот (включая, например, неприродные аминокислоты и тому подобное), полипептиды с замещенными связями, а также другие модификации, известные в данной области, и природные и неприродные (например, синтетические), циклизованные, разветвленные молекулы и тому подобное. Термин также включает в себя молекулы, содержащие один или несколько N-замещенных остатков глицина ("пептоид") и другие синтетические аминокислоты или пептиды. (Описание пептидов смотри, например, в патентах США № 5831005; 5877278 и 5977301; Nguyen et al., Chem Biol. (2000) 7:463-473; и Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:9367-9371). Предпочтительно аналог или мутеин обладает по меньшей мере такой же активностью в отношении свертывания крови, как и нативная молекула. Способы получения аналогов полипептидов и мутеинов известны в данной области и дополнительно описаны ниже.

Как указано выше, аналоги, как правило, включают в себя замены, которые по своей природе являются консервативными, т.е. такие замены, которые осуществляются в пределах семейств аминокислот, которые сходны по своим боковым цепям. Конкретно, как правило, аминокислоты разделяют на четыре семейства: (1) кислотные - аспартат и глутамат; (2) основные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют как ароматические аминокислоты. Например, можно предположить, что отдельное замещение лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серин, или сходная консервативная замена аминокислоты на сходную по структуре аминокислоту, не окажет значительного влияния на биологическую активность. Например, интересующий полипептид может включать в себя до приблизительно 5-10 консервативных или неконсервативных аминокислотных замен или даже до приблизительно 15-25 консервативных или неконсервативных аминокислотных замен или любое число между 5 и 25, при условии, что желательная функция молекулы остается интактной. Специалист в данной области может легко определить участки интересующей молекулы, в которых может быть допущено изменение, обратившись к схемам Hopp/Woods и Kyte-Doolittle, хорошо известным в данной области.

Под термином "производное" подразумевают любую подходящую модификацию указанной интересующей молекулы или ее аналога, такую как сульфатация, ацетилирование, гликозилирование, фосфорилирование, конъюгация с полимером (такая как с полиэтиленгликолем) или другими присоединениями неродственных групп, при условии сохранения желательной биологической активности (например, активность в отношении свертывания, ингибирование активности TFPI). Например, могут быть получены производные полисахаридов с одной или несколькими органическими или неорганическими группами. Примеры включают в себя полисахариды, замещенные по меньшей мере по одной гидроксильной группе другой группой (например, сульфатной, карбоксильной, фосфатной группами, аминогруппой, нитрильной группой, гало, силильной, амидной, ацильной, алифатической, ароматической группой или группой сахарида), или где кислород кольца замещен серой, азотом, группой метилена и тому подобное. Полисахариды могут быть химически изменены, например, для улучшения прокоагулянтной функции. Такие модификации могут включать в себя, но не ограничиваются ими, сульфатацию, полисульфатацию, этерификацию и метилирование. Способы получения аналогов и производных, как правило, доступны в данной области.

Под термином "фрагмент" подразумевают молекулу, содержащую только часть интактной полноразмерной последовательности и структуры. Фрагмент полисахарида может быть образован путем деградации (например, гидролиз) более крупного полисахарида. Активные фрагменты полисахарида, как правило, включают в себя по меньшей мере приблизительно 2-20 сахаридных элементов полноразмерного полисахарида, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 5-10 сахаридных элементов полноразмерной молекулы или любое число между 2 сахаридными элементами и полноразмерной молекулой, при условии, что рассматриваемый фрагмент сохраняет биологическую активность, такую как активность в отношении свертываемости и/или способность ингибировать активность TFPI. Фрагмент полипептида может включать в себя C-концевую делецию, N-концевую делецию и/или внутреннюю делецию в нативном полипептиде. Активные фрагменты конкретного белка, как правило, включают в себя по меньшей мере приблизительно 5-10 смежных аминокислотных остатков полноразмерной молекулы, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 15-25 смежных аминокислотных остатков полноразмерной молекулы и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 20-50 или более смежных аминокислотных остатков полноразмерной молекулы или любое число между 5 аминокислотами и полноразмерной последовательностью, при условии, что рассматриваемый фрагмент сохраняет биологическую активность, такую как активность в отношении свертывания, как определено в настоящем документе.

Термин "по существу очищенный", как правило, относится к выделению вещества (например, сульфатированного полисахарида), так чтобы в образце, в котором вещество находится, оно содержалось в наибольшем проценте. Как правило, по существу очищенный компонент в образце составляет 50%, предпочтительно 80-85%, более предпочтительно 90-95% образца. Технологии очистки интересующих полисахаридов, полинуклеотидов и полипептидов хорошо известны в данной области и включают в себя, например, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию и седиментацию по плотности.

В случае полисахарида или полипептида под термином "выделенный" подразумевают, что указанная молекула выделена и отделена от целого организма, в котором молекула обнаруживается в природе, или присутствует по существу в отсутствие других биологических макромолекул того же типа.

Термин "гомология" относится к проценту идентичности между двумя полинуклеотидными или двумя полипептидными группами. Последовательности двух нуклеиновых кислот или двух полипептидов являются "по существу гомологичными" друг другу, если последовательности по меньшей мере приблизительно на 50%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 75%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 80-85%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 95-98% идентичны на протяжении определенной длины молекулы. Как используется в настоящем описании, к по существу гомологичным также относятся последовательности, обладающие полной идентичностью с указанной последовательностью.

Как правило, термин "идентичность" относится к точному нуклеотид-нуклеотидному или аминокислотно-аминокислотному соответствию последовательностей двух полинуклеотидов или полипептидов соответственно. Процентная идентичность может быть определена непосредственным сравнением информации последовательностей двух молекул (контрольная последовательность и последовательность с неизвестной % идентичностью контрольной последовательности) посредством выравнивания последовательностей, подсчета точного количества совпадений между двумя выровненными последовательностями, делением на длину контрольной последовательности и умножением полученного результата на 100. Для облегчения анализа доступны компьютерные программы, такие как ALIGN, Dayhoff, M.O. в Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC, которые адаптируют алгоритм локальной гомологии Smith и Waterman Advances in Appl. Math. 2:482-489, 1981 для пептидного анализа. Программы для определения идентичности нуклеотидных последовательностей являются доступными в Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (доступна от Genetics Computer Group, Madison, WI) например, программы BESTFIT, FASTA и GAP, которые также основаны на алгоритме Smith и Waterman. Эти программы легко использовать со стандартными параметрами, рекомендованными изготовителем и описанными в Wisconsin Sequence Analysis Package, указанной выше. Например, процентная идентичность конкретной нуклеотидной последовательности контрольной последовательности может быть определена с использованием алгоритма гомологии Smith и Waterman со стандартной оценочной таблицей и штрафом за делецию шесть нуклеотидных позиций.

Другой способ определения процента идентичности в контексте настоящего изобретения представляет собой использование комплекта программ MPSRCH с охраняемым авторским правом University of Edinburgh, разработанного John F. Collins и Shane S. Sturrok, и распространяемого IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Из этого набора комплектов можно использовать алгоритм Smith-Waterman, где стандартные параметры используются для оценочной таблицы (например, штраф за внесение делеции размером 12, штраф на продолжение делеции размером один и делеция шести). Данные, формирующие уровень "совпадения", отражают "идентичность последовательностей". Другие программы, которые можно использовать для вычисления процентной идентичности или сходства между последовательностями, как правило, являются известными в данной области, например, другой программой для выравнивания является BLAST, используемый со стандартными параметрами. Например, можно использовать BLASTN и BLASTP с использованием следующих стандартных параметров: genetic code = standard; filter = none; strand = both; cutoff = 60; expect = 10; Matrix = BLOSUM62; Descriptions = 50 sequenses; sort by = HIGH SCORE; Databases = non-redundant, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss белок + Spupdate + PIR. Подробные описания этих программ легко доступны.

Альтернативно гомологию можно определять гибридизацией полинуклеотидов в условиях, при которых между гомологичными участками формируются стабильные дуплексы, с последующим расщеплением нуклеазой(ами), специфичной к одноцепочечной молекуле, и определением размера расщепленных фрагментов. Последовательности ДНК, которые по существу гомологичны, могут быть идентифицированы в эксперименте с Саузерн-гибридизацией, например, при жестких условиях, как определено для этой конкретной системы. Определение подходящих условий гибридизации находится в пределах компетентности в данной области. См., например, Sambrook et al., выше; DNA Cloning, выше; Nucleic acid Hybridization, выше.

Термин "рекомбинантный", как используется здесь для описания молекулы нуклеиновой кислоты, обозначает полинуклеотид геномного, кДНК, вирусного, полусинтетического или синтетического происхождения, который посредством своего источника или манипуляции не связан со всей или частью молекулы полинуклеотида, с которым он связан в природе. Термин "рекомбинантный", используемый в случае белка или полипептида, обозначает полипептид, получаемый посредством экспрессии рекомбинантного полинуклеотида. Как правило, интересующий ген клонируют и затем экспрессируют в трансформированных организмах, как дополнительно описано ниже. В организме хозяина экспрессируется чужеродный ген для продукции белка в условиях экспрессии.

Под термином "позвоночное" подразумевают любого члена подтипа хордовые, включая, но не ограничиваясь ими, человека и других приматов, включая приматов, не относящихся к человеку, таких как шимпанзе и другие виды человекообразных обезьян и обезьян; сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, козы и лошади; домашних животных, таких как собаки и кошки; лабораторных животных, включая грызунов, таких как мыши, крысы и морские свинки; птиц, включая домашних, диких птиц и пернатую дичь, таких как куры, индейки и другие куриные, утки, гуси и тому подобное. Термин не указывает на конкретный возраст. Таким образом, охватываются и взрослые, и новорожденные индивиды. Изобретение, описанное здесь, предназначено для использования любыми из указанных выше видов позвоночных.

Термин "пациент" относится к живому организму, страдающему состоянием или предрасположенному к возникновению состояния, которое может быть предотвращено или вылечено введением NASP по настоящему изобретению, и включает в себя и человека, и животных.

Как используется здесь, термин "биологический образец" относится к образцу ткани или жидкости, который взят у индивидуума, включая, но не ограничиваясь ими, например, кровь, плазму, сыворотку, фекалии, мочу, костный мозг, желчь, спинномозговую жидкость, лимфу, образцы кожи, наружные секреты кожи, дыхательных, кишечных и урогенитальных трактов, слезную жидкость, мочу, молоко, клетки крови, органы, биоптаты, а также образцы компонентов клеточных культур in vitro, включая, но не ограничиваясь ими, кондиционированные среды, полученные от растущих в культуральной среде клеток и тканей, например рекомбинантных клеток, и компоненты клеток.

Под термином "терапевтически эффективная доза или количество" NASP, фактора крови или другого терапевтического средства подразумевают количество, которое при введении, как описано здесь, приводит к положительному терапевтическому эффекту, такому как уменьшение кровотечения или укорочение времени свертывания.

Как используется здесь, термин "коагулопатия" относится к любому нарушению, связанному с повышенной кровоточивостью, такой как кровотечение при врожденном нарушении свертываемости, приобретенном нарушении свертываемости или травме, которая приводит к геморрагическому состоянию. Такие нарушения, связанные с кровотечениями, включают в себя, но не ограничиваются ими, гемофилию A, гемофилию B, болезнь фон Виллебранда, идиопатическую тромбоцитопению, дефицит одного или нескольких факторов контакта, таких как фактор XI, фактор XII, прекалликреин и высокомолекулярный кининоген (HMMK), дефицит одного или нескольких факторов, ассоциированных с клинически существенным кровотечением, таких как фактор V, фактор VII, фактор VIII, фактор IX, фактор X, фактор XIII, фактор II (гипопротромбинемия) и фактор фон Виллебранда, дефицит витамина К, нарушение, связанное с фибриногеном, включая афибриногенемию, гипофибриногенемию и дисфибриногенемию, дефицит альфа2-антиплазмина и обильное кровотечение, такое как кровотечение, вызванное заболеванием печени, заболеванием почек, тромбоцитопенией, тромбоцитарной дисфункцией, гематомой, внутренним кровотечением, гемартрозами, хирургической операцией, травмой, гипотермией, кровотечение при менструации и беременности.

II. Способы осуществления изобретения

Перед подробным описанием настоящего изобретения следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными составами и параметрами процесса, которые как таковые могут, безусловно, варьировать. Также следует понимать, что используемая здесь терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не предназначена для их ограничения.

Несмотря на то, что для осуществления настоящего изобретения может быть использован ряд способов и веществ, сходных или эквивалентных описанным здесь способам и веществам, в настоящем описании предложены предпочтительные вещества и варианты способов.

A. Общий обзор

Лечение нарушений свертываемости крови, включающих в себя гемофилию (Hem) A и Hem B, тяжелую болезнь фон Виллебранда (svWD) и тяжелый дефицит фактора VII (FVII), как правило, проводят замещением фактором, например, фактором VIII при Hem A и svWD, фактором IX при Hem B и фактором VII(a) при дефиците FVII и другими (недавно описанными в Bishop et al. (2004) Nat. Rev. Drug Discov. 3:684-694; Carcao et al. (2004) Blood Rev. 18:101-113; Roberts et al. (2004) Anesthesiology 100:722-730; и Lee (2004) Int. Anesthesiol. Clin. 42:59-76). Поскольку такие лекарственные средства часто являются эффективными, характеристики, ограничивающие их применение, включают в себя высокую стоимость, неудобство использования (т.е. внутривенное введение) и образование нейтрализующих антител (Bishop et al., выше; Carcao et al., выше; Roberts et al., выше; Lee, выше; и Bohn et al. (2004) Haemophilia 10 Suppl. 1:2-8). Несмотря на то, что FVIIa все чаще используют при различных нарушениях, связанных с кровотечениями (Roberts et al., выше), интерес вызывают альтернативные подходы в лечении с применением единственного прокоагулянтного соединения, лишенного вышеупомянутых ограничений и обладающего широким диапазоном применения.

Одним из общих подходов к улучшению гемостаза у индивидов, страдающих коагулопатией, является улучшение инициации свертывания крови посредством повышающей регуляции внешнего пути свертывания крови. В то время как внутренний и внешний пути свертывания крови обеспечивают образование тромбина и формирование сгустка фибрина (Davie et al. (1991) Biochemistry 30:10363-10370), внешний путь, или путь, опосредуемый тканевым фактором (TF), является основным для инициации и продолжения свертывания in vivo (Mann (2003) Chest 124(3Suppl):1S-3S; Rapaport et al. (1995) Thromb. Haemost. 74:7-17). Одним из возможных механизмов повышающей регуляции активности внешнего пути является подавление ингибитора пути тканевого фактора (TFPI). TFPI представляет собой ингибитор протеиназы типа Кунитца для FVIIa/TF, который обеспечивает тоническую понижающую регуляцию активации внешнего пути (см. Broze (1992) Semin. Hematol. 29:159-169; Broze (2003) J. Thromb. Haemost. 1:1671-1675; и Johnson et al. (1998) Coron. Artery Dis. 9 (2-3):83-87 review). В действительности, дефицит TFPI у гетерозиготных мышей может привести к усилению образования тромбов (Westrick et al. (2001) Circulation 103:3044-3046), а мутация в гене TFPI является фактором риска тромбоза у человека (Kleesiek et al. (1999) Thromb. Haemost. 82:1-5). Регулирование свертывания при гемофилии посредством направленного действия против TFPI было описано Nordfang et al. и Wun et al., которые показали, что антитела против TFPI могут приводить к укорочению времени свертывания плазмы у больного гемофилией (Nordfang et al. (1991) Thromb. Haemost. 66:464-467; Welsch et al. (1991) Thromb. Res. 64:213-222) и что IgG против TFPI улучшают время кровотечения у кроликов, дефицитных по фактору VIII (Erhardtsen et al. (1995) Blood Coagul. Fibrinolysis 6:388-394).

Как класс сульфатированные полисахариды характеризуются большим количеством видов биологической активности часто с благоприятным профилем переносимости у животных и человека. Эти полианионные молекулы, как правило, получают из растений и тканей животных, и к ним относится широкий диапазон подклассов, включая гепарины, гликозаминогликаны, фукоиданы, каррагенаны, пентозанполисульфаты и дерматансульфаты или декстрансульфаты (Toida et al. (2003) Trends in Glycoscience and Glycotechnology 15:29-46). Описаны сульфатированные полисахариды с более низкой молекулярной массой, менее гетерогенные и химически синтезированные, и были достигнуты различные степени разработки лекарственных средств (Sinay (1999) Nature 398:377-378; Bates et al. (1998) Coron. Artery Dis. 9:65-74; Orgueira et al. (2003) Chemistry 9:140-169; McAuliffe (1997) Chemical Industry Magazine 3:170-174; Williams et al. (1998) Gen. Pharmacol. 30:337-341). Гепариноподобные сульфатированные полисахариды проявляют различную антикоагулянтную активность, опосредуемую взаимодействием с антитромбином III и/или кофактором гепарина II (Toida et al., выше). В частности, определенные соединения природного происхождения или химически модифицированные проявляют другие виды биологической активности при концентрациях (или дозах), при которых антикоагулянтная активность не является существенной (Williams et al. 1998) Gen. Pharmacol. 30:337-341; Wan et al. (2002) Inflamm. Res. 51:435-443; Bourin et al. (1993) Biochem. J. 289 (Pt 2):313-330; McCaffrey et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Commun. 184:773-781; Luyt et al. (2003) J. Pharmacol. Exp. Ther. 305:24-30). Кроме того, было показано, что гепаринсульфат показывает сильные взаимодействия с TFPI (Broze (1992) Semin. Hematol. 29:159-169; Broze (2003) J. Thromb. Haemost. 1:1671-1675; Johnson et al. (1998) Coron. Artery Dis. 9:83-87; Novotny et al. (1991) Blood; 78(2):394-400).

Как описано здесь, определенные сульфатированные полисахариды взаимодействуют с TFPI и ингибируют его активность при более низких концентрациях, чем полисахариды, связанные с антикоагуляцией. Такие молекулы могут быть использованы в условиях, когда нарушено образование сгустка.

B. NASP в качестве стимуляторов свертываемости

Настоящее изобретение основано на открытии, что неантикоагулянтные сульфатированные полисахариды (NASP) могут быть использованы в качестве прокоагулянтов при лечении пациентов с коагулопатиями. Авторы изобретения открыли новый подход в регуляции гемостаза, в котором, что парадоксально, для стимуляции свертывания используются сульфатированные полисахариды, такие как гепаринподобные сульфатированные полисахариды. Выбранные сульфатированные полисахариды, описанные здесь, в значительной степени лишены антикоагулянтной активности или проявляют активность в отношении стимуляции образования сгустка при концентрациях, значительно более низких, чем концентрация, при которой они проявляют антикоагулянтную активность, и, таким образом, их обозначают как "неантикоагулянтные сульфатированные полисахариды".

Как показано в примерах 4-6, NASP приводят к свертыванию плазмы у больных гемофилией A (Hem-A) или гемофилией B (Hem-B) по результатам анализов свертывания: протромбиновому времени с разведенным тромбопластином (dPT) и активированному частичному тромбопластиновому времени (aPTT). Кроме того, NASP снижают время кровотечения после повреждения в моделях гемофилии A и B на мышах (пример 7). В экспериментах, описанных здесь, как показано в анализах свертывания, некоторые предполагаемые NASP демонстрируют по меньшей мере десятикратное снижение антикоагулянтной активности по сравнению с гепарином. Более того, подкласс NASP, включая пентозанполисульфат (PPS) и фукоидан, ингибировали ингибитор пути тканевого фактора (TFPI) и улучшали (т.е. ускоряли) время свертывания человеческой плазмы при гемофилии A и гемофилии B или плазмы со сниженными уровнями FVII при исследовании в концентрациях, изменяющихся от 4 до 500 нМ, в анализе протромбинового времени с разведенным тромбопластином (dPT). Улучшение гемостаза in vivo наблюдали у мышей с гемофилией A или B после подкожного введения низкой дозы PPS или фукоидана или сочетания NASP и вспомогательного вещества для фактора. Также наблюдалось повышение выживаемости мышей с дефицитом фактора после осуществления кровотечения. Эти результаты показывают, что системное введение отдельных NASP может представлять собой уникальный подход в регуляции гемостаза при коагулопатиях.

Таким образом, изобретение относится к использованию NASP для регуляции гемостаза у больных коагулопатиями, включая врожденные нарушения свертываемости крови, приобретенные нарушения свертываемости крови и травму, приводящую к геморрагическим состояниям.

C. NASP

NASP для использования в способах по настоящему изобретению представляют собой сульфатированные полисахариды с прокоагулянтной активностью. Некоагулянтные свойства потенциальных NASP определяли с использованием анализов свертываемости, таких как протромбиновое время с разведенным тромбопластином (dPT) или активированное частичное тромбопластиновое время (aPTT). Некоагулянтные сульфатированные полисахариды проявляли не более одной трети и предпочтительно менее одной десятой антикоагулянтной активности (измеренной по статистически значимому увеличению времени свертывания) нефракционированного гепарина (диапазон ММ от 8000 до 30000; средняя ММ 18000 дальтон).

Сульфатированные полисахариды с возможной активностью NASP включают в себя, но не ограничиваются ими, гликозаминогликаны (GAG), гепаринподобные молекулы, включая N-ацетилгепарин (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) и N-десульфатированный гепарин (Sigma-Aldrich), сульфатоиды, полисульфатированные олигосахариды (Karst et al. (2003) Curr. Med. Chem. 10:1993-2031; Kuszmann et al. (2004) Pharmazie. 59:344-348), хондроитинсульфаты (Sigma-Aldrich), дерматансульфаты (Celsus Laboratories Cincinnati, OH), фукоидан (Sigma-Aldrich), пентозанполисульфат (PPS) (Ortho-McNeil Pharmaceuticals, Raritan, NJ), фукопиранонсульфаты (Katzman et al. (1973) J. Biol. Chem. 248:50-55) и новые сульфатоиды, такие как GM1474 (Williams et al. (1998) General Pharmacology 30:337) и SR 80258A (Burg et al. (1997) Laboratory Investigation 76:505), и новые гепариноиды, и их аналоги. NASP могут быть очищены и/или модифицированы из природных источников (например, бурые водоросли, древесная кора, ткани животных) или могут быть синтезированы de novo, и их молекулярная масса может изменяться от 100 дальтон до 1000000 дальтон. Дополнительные соединения с возможной активностью NASP включают в себя оксидированный йодной кислотой гепарин (POH) (Neoparin, Inc., San Leandro, CA), химически сульфатированный ламинарин (CSL) (Sigma-Aldrich), химически сульфатированную альгиновую кислоту (CSAA) (Sigma-Aldrich), химически сульфатированный пектин (CSP) (Sigma-Aldrich), декстрансульфат (DXS) (Sigma-Aldrich), полученные из гепарина олигосахариды (HDO) (Neoparin, Inc., San Leandro, CA).

В принципе, любая свободная гидроксильная группа моносахаридного компонента гликоконъюгата может быть модифицирована сульфатированием с получением сульфатированного гликоконъюгата для возможного использования в качестве NASP в практике настоящего изобретения. Например, такие сульфатированные гликоконъюгаты могут включать в себя, но не ограничиваться ими, сульфатированные мукополисахариды (остатки D-глюкозамина и D-глюкуроновой кислоты), курдлан (карбоксиметиловый эфир, серная кислота, карбоксиметилированный курдлан) (Sigma-Aldrich), сульфатированный шизофиллан (Itoh et al. (1990) Int. J. Immunopharmacol. 12:225-223; Hirata et al. (1994) Pharm. Bull. 17:739-741), сульфатированные гликозаминогликаны, сульфатированный полисахарид-пептидогликановый комплекс, сульфатированный алкилмальтоолигосахарид (Katsuraya et al. (1994) Carbohydr Res. 260:51-61), сульфат амилопектина, N-ацетилгепарин (NAH) (Sigma-Aldrich), N-ацетил-де-O-сульфатированный гепарин (NA-de-o-SH) (Sigma-Aldrich), де-N-сульфатированный гепарин (De-NSH) (Sigma- Aldrich) и Де-N-сульфатированный ацетилированный гепарин (De-NSAH) (Sigma-Aldrich).

Способность NASP стимулировать свертывание и уменьшать кровотечение легко определить, используя различные анализы свертываемости in vitro (например, анализы dPT и aPTT) и в моделях кровотечения in vivo (например, определение времени кровотечения при надрезе хвоста или из эпонихия у мышей или собак с гемофилией). Смотри, например, PDR Staff. Physicians' Desk Reference. 2004, Anderson et al. (1976) Thromb. Res. 9:575-580; Nordfang et al. (1991) Thromb Haemost. 66:464-467; Welsch et al. (1991) Thrombosis Research 64:213-222; Broze et al. (2001) Thromb Haemost 85:747-748; Scallan et al. (2003) Blood. 102:2031-2037; Pijnappels et al. (1986) Thromb. Haemost. 55:70-73; и Giles et al. (1982) Blood 60:727-730. Анализы свертываемости можно выполнять в присутствии NASP и одного или нескольких факторов крови, прокоагулянтов или других агентов. Например, можно добавлять один или несколько факторов, включая, но не ограничиваясь ими, фактор XI, фактор XII, прекалликреин, высокомолекулярный кининоген (HMMK), фактор V, фактор VII, фактор VIII, фактор IX, фактор X, фактор XIII, фактор II и фактор фон Виллебранда, тканевой фактор, фактор VIIa, фактор Va и фактор Xa, фактор IXa, фактор XIa, фактор XIIa и VIIIa; и/или один или несколько агентов, включая, но не ограничиваясь ими, агент APTT, тромбопластин, фибрин, TFPI, яд гадюки Рассела, микроизмельченные частицы диоксида кремния, эллаговую кислоту, сульфатиды и каолин.

В примерах 3-4 и на фигурах 2-3 представлено подтверждение, что вещества, указанные в настоящем документе как NASP являются действительно "неантикоагулянтными", т.е. что они по существу не увеличивают время свертывания в исследуемом диапазоне концентраций. Такие соединения могут быть использованы в способах и композициях по настоящему изобретению при условии, что любая антикоагулянтная активность, которую они могут проявлять, возникает лишь при концентрациях, значительно более высоких, чем концентрация, при которой они проявляют прокоагулянтную активность. Соотношение концентрации, при которой появляется нежелательная антикоагулянтная активность, и концентрации, при которой появляется желательная прокоагулянтная активность, рассматривается как терапевтический индекс для рассматриваемого NASP. Терапевтический индекс для NASP по настоящему изобретению может составлять 5, 10, 30, 100, 300, 1000 или более.

D. Фармацевтические композиции

Кроме того, для получения фармацевтической композиции композиции NASP по настоящему изобретению могут необязательно содержать один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов. Иллюстративные эксципиенты включают в себя, но не ограничиваются ими, углеводороды, неорганические соли, противомикробные средства, антиоксиданты, поверхностно-активные вещества, буферы, кислоты, основания и их сочетания. Эксципиенты, подходящие для композиций, вводимых инъекцией, включают в себя воду, спирты, многоатомные спирты, глицерин, растительные масла, фосфолипиды и поверхностно-активные вещества. В качестве эксципиента могут быть представлены углеводороды, такие как сахар, производное сахара, такое как альдит, альдоновая кислота, этерифицированный сахар и/или полимер сахара. Конкретные углеводородные эксципиенты включают в себя, например, моносахариды, такие как фруктоза, мальтоза, галактоза, глюкоза, D-манноза, сорбоза и тому подобное; дисахариды, такие как лактоза, сахароза, трегалоза, целлобиоза и тому подобное; полисахариды, такие как рафиноза, мелизитоза, мальтодекстрины, декстраны, крахмалы и тому подобное; и альдиты, такие как маннит, ксилит, мальтит, лактит, ксилит, сорбит (глюцит), пиранозилсорбит, миоинозит и тому подобное. Эксципиент также может включать в себя неорганическую соль или буфер, такой как лимонная кислота, хлорид натрия, хлорид калия, сульфат натрия, нитрат калия, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия и их сочетания.

Композиция по настоящему изобретению также может включать в себя противомикробное средство для профилактики или остановки роста микроорганизмов. Неограничивающие примеры противомикробных средств, подходящих для настоящего изобретения, включают в себя хлорид бензалкония, хлорид бензэтония, бензиловый спирт, хлорид цетилпиридиния, хлорбутанол, фенол, фенилэтиловый спирт, нитрат фенилртути, тимеросол и их сочетания.

Также в композиции может находиться антиоксидант. Антиоксиданты используют для предотвращения окисления, таким образом, предотвращая деградацию NASP или других компонентов препарата. Подходящие для использования в настоящем изобретении антиоксиданты включают в себя, например, аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, гипофосфористую кислоту, монотиоглицерин, пропилгаллат, бисульфит натрия, формальдегидсульфоксилат натрия, метабисульфит натрия и их сочетания.

В качестве эксципиента может быть представлено поверхностно-активное вещество. Иллюстративные поверхностно-активные вещества включают в себя полисорбаты, такие как "Tween 20" и "Tween 80" и плюроники, такие как F68 и F88 (BASF, Mount Olive, New Jersey); сложные эфиры сорбитана; липиды, такие как фосфолипиды, такие как лецитин и другие фосфатидилхолины, фосфатидилэтаноламины (предпочтительно не в форме липосом), жирные кислоты и сложные эфиры жиров; стероиды, такие как холестерин; хелатирующие агенты, такие как EDTA; и цинк и другие подходящие катионы.

В качестве эксципиента в композиции могут быть представлены кислоты или основания. Неограничивающие примеры кислот, которые могут использоваться, включают в себя кислоты, которые выбраны из группы, состоящей из хлористоводородной кислоты, уксусной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, яблочной кислоты, молочной кислоты, муравьиной кислоты, трихлоруксусной кислоты, азотной кислоты, перхлорной кислоты, фосфорной кислоты, серной кислоты, фумаровой кислоты и их сочетаний. Примеры подходящих оснований включают в себя, но не ограничиваются ими, основания, выбранные из группы, состоящей из гидроксида натрия, ацетата натрия, гидроксида аммония, гидроксида калия, ацетата аммония, ацетата калия, фосфата натрия, фосфата калия, цитрата натрия, формиата натрия, сульфата натрия, сульфата калия, фумарата калия и их сочетания.

Количество NASP (например, находящееся в системе для доставки лекарственного средства) в композиции будет изменяться в зависимости от количества факторов, но оптимальной является терапевтически эффективная доза, если композиция находится в дозированной форме или контейнере (например, ампуле). Терапевтически эффективная доза может быть определена экспериментально посредством повторных введений возрастающих количеств композиции с целью определения, какое количество вызывает клинически желательный результат.

Количество любого отдельного эксципиента в композиции будет изменяться в зависимости от природы и функции эксципиента и конкретной необходимости для композиции. Как правило, оптимальное количество любого отдельного эксципиента определяют посредством стандартного экспериментирования, т.е. посредством получения композиции, содержащей различные количества эксципиента (варьирующие от низких до высоких), определения стабильности и других параметров, а затем определения диапазона, в котором оптимальный результат достигается без значительных побочных эффектов. Как правило, однако, эксципиент(ы) представлены в композиции в количестве приблизительно от 1% до приблизительно 99% по массе, предпочтительно от приблизительно 5% до приблизительно 98% по массе, более предпочтительно от приблизительно 15% до приблизительно 95% эксципиента по массе, с наиболее предпочтительными концентрациями менее 30% по массе. Эти вышеупомянутые фармацевтические эксципиенты вместе с другими эксципиентами описаны в "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed., Williams & Williams, (1995), the "Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), и Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000.

Композиции включают в себя все типы составов и, в частности, составы, подходящие для инъекции, например порошки или лиофилизаты, которые перед использованием могут быть восстановлены с помощью растворителя, а также готовые для инъекции растворы или суспензии, сухие нерастворимые композиции для объединения с носителем перед использованием и эмульсии и жидкие концентраты для разбавления перед введением. Примеры подходящих разбавителей для восстановления твердых композиций перед инъекцией включают в себя бактериостатическую воду для инъекций, 5% декстрозу в воде, фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера, физиологический раствор, стерильную воду, деионизированную воду и их сочетания. В отношении жидких фармацевтических композиций можно предположить растворы и суспензии. Дополнительные предпочтительные композиции включают в себя композиции для пероральной, окулярной или местной доставки.

Фармацевтические препараты здесь также могут находиться в шприце, устройстве для имплантации и сходных с ними в зависимости от предполагаемого способа доставки и использования. Предпочтительно композиции NASP, описанные здесь, находятся в единичных дозированных формах, подразумевая количество конъюгата или композиции по настоящему изобретению, пригодное для единичной дозы, в предварительно измеренной или предварительно упакованной форме.

Композиции NASP по настоящему изобретению могут необязательно включать в себя один или несколько дополнительных средств, таких как гемостатические агенты, факторы крови или другие лекарственные средства, используемые для лечения состояния или заболевания индивидуума. В частности, предпочтительными являются препараты, в состав которых входит один или несколько факторов крови, таких как фактор XI, фактор XII, прекалликреин, высокомолекулярный кининоген (HMMK), фактор V, фактор VII, фактор VIII, фактор IX, фактор X, фактор XIII, фактор II, фактор VIIa и фактор фон Виллебранда. Композиции NASP также могут включать в себя другие прокоагулянты, такие как активатор внутреннего пути свертывания, включая, но не ограничиваясь ими, фактор Xa, фактор IXa, фактор XIa, фактор XIIa и VIIIa, прекалликреин и высокомолекулярный кининоген; или активатор внешнего пути свертывания, включая, но не ограничиваясь ими, тканевой фактор, фактор VIIa, фактор Va и фактор Xa. Композиции NASP могут включать в себя природные, синтетические или рекомбинантные факторы свертывания или фрагменты, варианты или их ковалентно модифицированные производные, которые сохраняют биологическую активность (т.е. обеспечивают свертывание). Альтернативно такие средства могут находиться в отдельной от NASP композиции и их можно совместно вводить одновременно с композицией NASP по настоящему изобретению, до или после введения композиции NASP по настоящему изобретению.

E. Введение

Индивидууму следует пройти по меньшей мере один терапевтически эффективный курс лечения NASP. Под термином "терапевтически эффективный курс лечения" подразумевают курс лечения, который при его прохождении приводит к положительному терапевтическому ответу в отношении лечения индивидуума коагулопатией. Особый интерес представляет курс лечения NASP, который приводит к улучшению гемостаза. Под термином "положительный терапевтический ответ" понимают, что лечение индивидуума осуществляют в соответствии с этим изобретением, приводящим к улучшению в отношении одного или нескольких симптомов коагулопатии, включая такие улучшения, как укорочение времени свертывания крови и уменьшение кровотечения и/или снижение необходимости в заместительной терапии фактором.

В некоторых вариантах осуществления вводятся многократные терапевтически эффективные дозы композиции, содержащей один или несколько NASP и/или другие терапевтические средства, такие как гемостатические агенты, факторы крови или другие лекарственные средства. Композиции по настоящему изобретению, как правило, хотя и не обязательно, вводят перорально, посредством инъекции (подкожно, внутривенно или внутримышечно), посредством инфузии или местно. Фармацевтический препарат непосредственно перед введением может находиться в форме жидкого раствора или суспензии, но также может находиться в другой форме, такой как сироп, крем, мазь, таблетка, капсула, порошок, гель, матрица, суппозиторий или сходные с ними. Также предусматриваются дополнительные способы введения, такие как легочное, ректальное, чрескожное, чресслизистое, интратекальное, перикардиальное, внутриартериальное, внутримозговое, внутриглазное, внутрибрюшинное и так далее. Фармацевтические композиции, содержащие NASP и другие средства, могут быть введены одним и тем же или различными путями введения в соответствии с любым приемлемым с медицинской точки зрения способом, известным в данной области.

В конкретном варианте осуществления композицию по настоящему изобретению используют для местной доставки NASP, например, для лечения кровотечения, возникшего в результате повреждения, ранения или хирургической операции. Препараты по настоящему изобретению также могут использоваться для местного лечения. Например, NASP можно вводить посредством инъекции в область кровотечения или в форме твердого вещества, жидкости или мази предпочтительно с помощью лейкопластыря или покрытия на рану. Также могут использоваться суппозитории, капсулы, в частности устойчивые к желудочному соку капсулы, капли или аэрозоли. Для направления действия в области кровотечения выбирают конкретный препарат и подходящий способ введения.

В другом варианте осуществления фармацевтические композиции, содержащие NASP и/или другие средства, вводят профилактически, например перед запланированной хирургической операцией. Такое профилактическое использование будет особенно эффективно для индивидуумов с известными предсуществующими нарушениями свертываемости крови.

В другом варианте осуществления по настоящему изобретению фармацевтические композиции, содержащие NASP и/или другие средства, находятся в составе с непрерывным высвобождением или в составе, который вводят с использованием устройства для непрерывного высвобождения. Такие устройства хорошо известны в данной области и включают в себя, например, пластыри для чрескожного введения и миниатюрные имплантируемые дозаторы, которые могут обеспечить доставку лекарственного средства в течение периода времени в постоянном, устойчивом режиме с множеством доз для достижения эффекта непрерывного высвобождения фармацевтической композиции, не обладающей способностью к непрерывному высвобождению.

Также изобретение относится к способу введения конъюгата, содержащего NASP, как предусмотрено здесь, пациенту, который является чувствительным к лечению NASP, содержащемуся в конъюгате или композиции. Способ предусматривает введение любым из описанных здесь способов терапевтически эффективного количества конъюгата или системы для доставки лекарственного средства, предпочтительно представленных как часть фармацевтической композиции. Способ введения может использоваться для лечения любого состояния, которое является чувствительным к лечению NASP. Более конкретно, представленные здесь композиции являются эффективными для лечения коагулопатий, включая гемофилию A, гемофилию B, болезнь фон Виллебранда, идиопатическую тромбоцитопению, дефицит одного или нескольких факторов контакта, таких как фактор XI, фактор XII, прекалликреин и высокомолекулярный кининоген (HMMK), дефицит одного или нескольких факторов, ассоциированных с клинически существенным кровотечением, таких как фактор V, фактор VII, фактор VIII, фактор IX, фактор X, фактор XIII, фактор II (гипопротромбинемия) и фактор фон Виллебранда, дефицит витамина К, нарушение фибриногена, включая афибриногенемию, гипофибриногенемию и дисфибриногенемию, дефицит альфа2-антиплазмина и обильное кровотечение, такое как кровотечение, вызванное заболеванием печени, заболеванием почек, тромбоцитопенией, тромбоцитарной дисфункцией, гематомой, внутренним кровотечением, гемартрозом, хирургической операцией, травмой, гипотермией, кровотечение при менструации и беременности.

Специалистам в данной области будет понятно, для каких состояний лечение с помощью конкретного NASP будет эффективно. Фактическая доза, которую следует вводить, будет изменяться в зависимости от возраста, массы и общего состояния индивидуума, а также от тяжести состояния, на которое направлено лечение, назначения лечащего врача и вводимого конъюгата. Терапевтически эффективные количества могут быть определены специалистами в данной области и их можно подбирать в соответствии с конкретными потребностями в каждом конкретном случае.

Как правило, терапевтически эффективное количество будет находиться в диапазоне от приблизительно 0,01 мг/кг до 200 мг/кг NASP в сутки, более предпочтительно от приблизительно 0,01 мг/кг до 20 мг/кг в сутки, еще более предпочтительно от приблизительно 0,02 мг/кг до 2 мг/кг в сутки. Предпочтительно такие дозы находятся в диапазоне 0,01-50 мг/кг четыре раза в сутки (QID), 0,01-10 мг/кг QID, 0,01-2 мг/кг QID, 0,01-0,2 мг/кг QID, 0,01-50 мг/кг три раза в сутки (TID), 0,01-10 мг/кг TID, 0,01-2 мг/кг TID, 0,01-0,2 мг/кг TID, 0,01-100 мг/кг дважды в сутки (BID), 0,01-10 мг/кг BID, 0,01-2 мг/кг BID или 0,01-0,2 мг/кг BID. Количество вводимого соединения будет зависеть от эффективности конкретного NASP и желательных параметров или прокоагулянтного эффекта и пути введения.

NASP (опять же предпочтительно представленный как часть фармацевтического препарата) можно вводить отдельно или в сочетании с другими NASP или терапевтическими средствами, такими как гемостатические агенты, факторы крови или другие лекарственные средства, используемые для лечения конкретного состояния или заболевания, в соответствии со множеством режимов дозирования, зависящих от назначения лечащего врача, необходимости для пациента и так далее. Конкретный режим дозирования будет известен специалистам в данной области или может быть определен экспериментально с использованием стандартных способов. Иллюстративные режимы дозирования включают в себя, но не ограничиваются ими, введение пять раз в сутки, четыре раза в сутки, три раза в сутки, дважды в сутки, один раз в сутки, три раза в неделю, один раз в неделю, дважды в месяц, один раз в месяц и любое их сочетание. Предпочтительными являются композиции, требующие дозирования не более одного раза в сутки.

NASP могут быть введены перед, одновременно или после введения других средств. Если предусмотрено введение одновременно с другими средствами, то NASP может быть представлен в одной с ними композиции или в отдельной композиции. Таким образом, NASP и другие средства могут быть введены индивидууму посредством сочетанной терапии. Под термином "сочетанная терапия" подразумевают введение пациенту сочетания веществ, оказывающих терапевтический эффект, приводящий к лечению пациента. Например, сочетанной терапии можно достичь введением дозы фармацевтической композиции, содержащей NASP, и дозы фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно другое средство, такое как гемостатический агент или фактор свертывания (например, FVIII или FIX), которые в сочетании составляют терапевтически эффективную дозу, в соответствии с конкретным режимом дозирования. Аналогично один или несколько NASP и терапевтических средств могут быть введены в виде по меньшей мере одной терапевтической дозы. Введение отдельных фармацевтических композиций можно осуществлять одновременно или в различное время (т.е. последовательно, в любом порядке, на одни и те же сутки или на различные сутки) до тех пор, пока терапевтический эффект сочетания этих веществ не приведет к эффекту проводимого у индивидуума лечения.

F. Применение

В одном из аспектов NASP могут использоваться в способах по настоящему изобретению для улучшения гемостаза при лечении коагулопатий, в частности нарушений, связанных с дефицитом факторов свертывания, или для обратного эффекта антикоагулянтов у индивидуума. NASP могут быть введены индивидууму для лечения коагулопатий, включая врожденные нарушения свертываемости крови, приобретенные нарушения свертываемости крови и геморрагические состояния, вызванные травмой. Примеры коагулопатий, которым можно осуществлять терапию NASP включают в себя, но не ограничиваются ими, гемофилию A, гемофилию B, болезнь фон Виллебранда, идиопатическую тромбоцитопению, дефицит одного или нескольких факторов контакта, таких как фактор XI, фактор XII, прекалликреин и высокомолекулярный кининоген (HMMK), дефицит одного или нескольких факторов, связанных со значительным клиническим кровотечением, таких как фактор V, фактор VII, фактор VIII, фактор IX, фактор X, фактор XIII, фактор II (гипопротромбинемия) и фактор фон Виллебранда, дефицит витамина К, нарушение, связанное с фибриногеном, включая афибриногенемию, гипофибриногенемию и дисфибриногенемию, дефицит альфа2-антиплазмина и обильное кровотечение, такое как кровотечение, вызванное заболеванием печени, заболеванием почек, тромбоцитопенией, тромбоцитарной дисфункцией, гематомой, внутренним кровотечением, гемартрозами, хирургической операцией, травмой, гипотермией, кровотечение при менструации и беременности. В некоторых вариантах осуществления NASP используются для лечения врожденных нарушений свертываемости крови, включая гемофилию A, гемофилию B и болезнь фон Виллебранда. В других вариантах осуществления NASP используются для лечения приобретенных нарушений свертываемости крови, включая дефицит фактора VIII, фактора фон Виллебранда, фактора IX, фактора V, фактора XI, фактора XII и фактора XIII, в частности нарушений, вызванных ингибиторами или аутоиммунной реакцией против фактора свертывания крови, или гемостатические нарушения, вызванные заболеванием или состоянием, которое приводит к снижению синтеза факторов свертывания.

Необходимость для пациента будет зависеть от конкретной коагулопатии, на которую направлено лечение. Например, NASP можно вводить для лечения хронического состояния (например, врожденного или приобретенного дефицита фактора свертывания) многократными дозами в течение продолжительного периода времени. Альтернативно NASP можно вводить для лечения острого состояния (например, кровотечение в результате хирургической операции или травмы или периодов, связанных с ингибитором фактора/аутоиммунной реакцией против фактора у индивидуумов, получающих заместительную терапию факторами свертывания) единичной или многократными дозами в течение относительно короткого периода времени, например одной или двух недель. Кроме того, лечение NASP можно использовать в сочетании с другими гемостатическими агентами, факторами крови и лекарственными средствами. Например, индивидуум может получать терапевтически эффективное количество одного или нескольких факторов, выбранных из группы, состоящей из фактора XI, фактора XII, прекалликреина, высокомолекулярного кининогена (HMMK), фактора V, фактора VII, фактора VIII, фактора IX, фактора X, фактора XIII, фактора II, фактора VIIa и фактора фон Виллебранда. Кроме того, лечение может предусматривать введение прокоагулянта, такого как активатор внутреннего пути свертывания, включая фактор Xa, фактор IXa, фактор XIa, фактор XIIa и VIIIa, прекалликреин и высокомолекулярный кининоген; или активатор внешнего пути свертывания, включая тканевой фактор, фактор VIIa, фактор Va и фактор Xa. Кроме того, может быть необходима трансфузия продуктов крови для замещения кровопотери у индивидуумов, перенесших обильную кровопотерю, и в случаях повреждения для остановки кровотечения может быть приемлемым хирургическое лечение.

Изобретение также относится к способу обратного изменения эффектов антикоагулянтов у индивидуума, способу, предусматривающему введение индивидууму терапевтически эффективного количества композиции, содержащей NASP. В определенных вариантах осуществления индивидуум может получать лечение антикоагулянтом, включая, но не ограничиваясь ими, гепарин, производное кумарина, такое как варфарин или дикумарол, TFPI, AT III, волчаночный антикоагулянт, антикоагулянтный пептид нематод (NAPc2), фактор VIIa (фактор VIIai) с заблокированным активным центром, ингибиторы фактора IXa, ингибиторы фактор Xa, включая фондапаринукс, идрапаринукс, DX-9065a и разаксабан (DPC906), ингибиторы факторов Va и VIIIa, включая активированный протеин C (APC) и растворимый тромбомодулин, ингибиторы тромбина, включая гирудин, бивалирудин, аргатробан и ксимелагатран. В некоторых вариантах осуществления в качестве антикоагулянта у индивидуума могут быть антитела, которые связываются с фактором свертываемости, включая, но не ограничиваясь ими, антитела, которые связываются с фактором V, фактором VII, фактором VIII, фактором IX, фактором X, фактором XIII, фактором II, фактором XI, фактором XII, фактором фон Виллебранда, прекалликреином или высокомолекулярным кининогеном (HMWK).

В некоторых вариантах осуществления для обратного эффекта антикоагулянта у индивидуума NASP можно вводить отдельно или совместно с одним или несколькими различными NASP и/или в сочетании с одним или несколькими другими терапевтическими средствами. Например, индивидууму можно вводить терапевтически эффективное количество композиции, содержащей NASP и один или несколько факторов, выбранных из группы, состоящей из фактора XI, фактора XII, прекалликреина, высокомолекулярного кининогена (HMWK), фактора V, фактора VII, фактора VIII, фактора IX, фактора X, фактора XIII, фактора II, фактора VIIa и фактора фон Виллебранда. Кроме того, лечение может предусматривать введение прокоагулянта, такого как активатор внутреннего пути свертывания крови, включая фактор Xa, фактор IXa, фактор XIa, фактор XIIa и VIIIa, прекалликреин и высокомолекулярный кининоген; или активатор внешнего пути свертывания крови, включая тканевой фактор, фактор VIIa, фактор Va и фактор Xa.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу улучшения свертываемости крови у индивидуума, перенесшего хирургическую или инвазивную процедуру, способу, предусматривающему введение индивидууму терапевтически эффективного количества композиции, содержащей неантикоагулянтный сульфатированный полисахарид (NASP). В некоторых вариантах осуществления NASP можно вводить совместно с одним или несколькими различными NASP и/или в сочетании с одним или несколькими другими терапевтическими средствами индивидууму, перенесшему хирургическую или инвазивную процедуру. Например, индивидууму можно вводить терапевтически эффективное количество одного или нескольких факторов, выбранных из группы, состоящей из фактора XI, фактора XII, прекалликреина, высокомолекулярного кининогена (HMWK), фактора V, фактора VII, фактора VIII, фактора IX, фактора X, фактора XIII, фактора II, фактора VIIa и фактора фон Виллебранда. Кроме того, лечение может предусматривать введение прокоагулянта, такого как активатор внутреннего пути свертывания крови, включая фактор Xa, фактор IXa, фактор XIa, фактор XIIa и VIIIa, прекалликреин и высокомолекулярный кининоген; или активатор внешнего пути свертывания крови, включая тканевой фактор, фактор VIIa, фактор Va и фактор Xa.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу ингибирования активности TFPI, предусматривающему комбинирование композиции, содержащей TFPI с достаточным количеством NASP для ингибирования активности TFPI. В некоторых вариантах осуществления активность TFPI ингибируют у индивидуума способом, предусматривающим введение индивидууму терапевтически эффективного количества композиции, содержащей NASP. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу ингибирования активности TFPI в биологическом образце, способу, предусматривающему объединение биологического образца (например, крови или плазмы) с достаточным для ингибирования активности TFPI количеством NASP.

III. Эксперимент

Ниже приведены примеры конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения. Примеры предоставлены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

Были предприняты попытки обеспечить точность в отношении используемых показателей (например, количества, температуры и тому подобное), однако, конечно, следует учитывать некоторые экспериментальные ошибки и отклонения.

Пример 1

Материалы и способы

A. Агенты

Гепарин, и модифицированные гепарины, и фукоидан были приобретены у Sigma (St. Louis, MO). Источником пентозанполисульфата натрия (PPS) было лекарственное средство Эльмирон, отпускаемое по рецепту, приобретаемое у Ortho-McNeil Pharmaceuticals (Raritan, NJ). Плазму человека приобретали у George King Biomedical (Overland Park, KS). Факторы VIIa и рекомбинантный TFPI человека были приобретены у American Diagnostica (Stamford, CT), и фактор VIII представлял собой ReFacto^R, отпускаемый по рецепту, приобретенный у Wyeth Pharmaceuticals (Madison, NJ). SIMPLASTIN EXCEL и агент для APTT приобретали у bioMerieux (Durham, NC) или Organon Teknika (Roseland, New Jersey).

B. Животные

Мыши Hem-A (гомозиготные по аллелю FVIII KO экзона 16) были лицензированы в John Hopkins University, и мыши Hem-B (гомозиготные по FIX KO экзонов 1-3) были лицензированы в University of North Carolina at Chapel Hill. Все процедуры с животными выполняли в соответствии с "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. Washington, D.C.: National Academy Press; 1996), и все они были рассмотрены и одобрены институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию.

C. Анализы свертываемости

Анализ активированного частичного тромбопластинового времени (aPTT)

Анализ aPTT выполняли, как описано ранее, с модификациями (PDR Staff. Physicians' Desk Reference. 2004, Anderson Lo, Barrowcliffe, T.W., Holmer, E., Johnson, E.A., Sims, G.E.C. Thromb. Res.1976; 9:575-580). Фибриновые чашки 25 мМ CaCl₂ (Fisher) предварительно нагревали до 37°C. В нагретые пробирки Добавляли 0,1 мл размороженной плазмы человека (нормальной или взятой у больного гемофилией). С 95 мкл плазмы инкубировали 5 мкл физиологического раствора (например, Sigma) или 5 мкл тестируемого средства (например, NASP), растворенного в физиологическом растворе в течение 30 минут при комнатной температуре. Агент APTT (например, Organon Teknika) восстанавливали в 3 мл дистиллированной воды и в каждую пробирку добавляли 0,1 мл восстановленного раствора, содержащего агент APTT. Из пробирок в предварительно нагретые фибриновые чашки переносили 0,2 мл плазмы, содержащей тестируемое вещество или контрольный физиологический раствор и aPTT агент, и инкубировали в течение 2-3 минут. Для стимуляции свертывания добавляли 0,1 мл предварительно нагретого 25 мМ CaCl₂ и определяли время свертывания плазмы с помощью фиброметра BBL FIBROSYSTEM.

Анализ протромбинового времени с разведенным тромбопластином (dPT)

Используемый анализ dPT представлял собой модифицированный стандартный клинический анализ PT (Nordfang et al. (1991) Thromb Haemost 66:464-467; Welsch et al. (1991) Thrombosis Research 64:213-222). Тромбопластиновый агент SIMPLASTIN EXCEL (Organon Teknika) восстанавливали с помощью разбавителя от изготовителя и дополнительно разбавляли до 1:100 в 0,9% физиологическом растворе. Перед началом анализа тромбопластиновый агент, 25 мМ CaCl₂ и образцы плазмы предварительно нагревали до 37°C. В пробирки для микроцентрифугирования помещали аликвоты 100 мкл размороженной плазмы. Для измерения ингибирования активности TFPI к 95 мкл плазмы добавляли 5 мкл физиологического раствора (например, Sigma) или 5 мкл тестируемого вещества (например, сульфатированного полисахарида) и инкубировали в течение приблизительно 30 минут при комнатной температуре. В фибриновые чашки (Fisher), предварительно нагретые до 37°С, добавляли 100 мкл разбавленного тромбопластинового агента и 100 мкл 25 мМ CaCl₂. Для инициации свертывания в фибриновые чашки, содержащие тромбопластиновый агент и CaCl₂, добавляли 100 мкл плазмы (нормальной или гемофильной), содержащей тестируемое вещество или контрольный физиологический раствор. Время свертывания плазмы определяли с помощью фиброметра BBL FIBROSYSTEM.

Анализ времени кровотечения у животных

Анализ времени кровотечения может использоваться для измерения изменений гемостатической функции у нормальных или гемофильных (дефицит FVIII, или FIX, или vWF) грызунов после введения тестируемого вещества (например, контрольного носителя или NASP). Тестируемое вещество (например, контрольный носитель или NASP) вводили грызуну один или два раза в сутки перорально, парентерально или посредством длительной инфузии. Например, 0,1 мл/10 г массы тела (подлопаточное введение) тестируемого вещества в дозах в диапазоне от 0,1 до 10 мг/кг можно вводить с использованием игл маленького калибра дважды в сутки в течение по меньшей мере одних суток и предпочтительно более чем 3 суток. В день анализа кровотечения грызунам проводили анестезию с помощью кетамина/ксилазина (или изофлурана). Грызунов располагали ровно на стерильной подушке с чашкой Петри с физиологическим раствором для погружения хвоста. Крем EMLA наносили на предполагаемую область надреза хвоста грызунов. У мышей надрезали самый конец хвоста и хвост помещали в чашку с физиологическим раствором и включали счетное устройство. У крыс выполняли надрез 8 мм в длину с глубиной 1 мм на дорзальной части хвоста крысы, который затем перемещали в физиологический раствор. Записывали время остановки видимого кровотечения в физиологическом растворе. Для грызунов время кровотечения составляет приблизительно 10 минут для здоровых контрольных мышей и 6 минут для здоровых контрольных крыс. После завершения анализа времени кровотечения хвост грызунов сушили стерильным индикатором, проверяли на наличие гемостаза и грызуна возвращали в клетку. При необходимости в области надреза могли применять нитрат серебра.

Альтернативно время кровотечения можно измерять у мышей (Broze et al. (2001) Thromb. Haemost. 85:747-748) или у собак (Scallan et al. (2003) Blood 102:2031-2037; Pijnappels et al. (1986) Thromb. Haemost. 55:70-73) другими способами. Альтернативные или дополнительные фармакодинамические результаты могут включать в себя забор крови у подвергаемых лечению NASP индивидуумов для непосредственного анализа или для отделения плазмы и измерения времени свертывания ex vivo (например, время свертывания цельной крови и/или PT, и/или APTT) или уровня фактора свертывания.

Анализ времени свертывания цельной крови (WBCT)

Анализ WBCT осуществляли следующим образом. Мышам кратковременно проводили анестезию в камере с изофлураном. Затем у мышей осуществляли забор крови (например, 150 мкл) в пластиковые пробирки для забора крови из ретроорбитального сплетения. Пробирки помещали в водяную баню при 37°C и для измерения времени свертывания использовали секундомер. В течение этого периода времени пробирки переворачивали с интервалом в 1 минуту. Определяли время, необходимое для свертывания крови (полный/не частичный сгусток).

Статистический анализ

Для анализов свертываемости использовали t-тест Стьюдента для анализа статистической значимости между образцами, обработанными NASP и контрольными носителями. Данные тестов кровотечения у мышей исследовали на наличие статистической значимости по сравнению с контрольными носителями (или другими группами, как показано в таблицах, приведенных ниже) с помощью анализа хи-квадрат. Практически идентичные результаты были получены при использовании точного теста Фишера.

Пример 2

TFPI увеличивает время свертывания при анализе dPT

Следующие ниже эксперименты осуществляли для демонстрации увеличения времени свертывания при введении TFPI в анализе dPT и для определения концентрации для использования в следующих экспериментах с NASP. Маточный раствор TFPI в количестве 100 мкг/мл (American Diagnostica, Stamford, CT) последовательно разводили в физиологическом растворе с получением растворов TFPI в следующих концентрациях: 20, 15, 10, 6 и 2 мкг/мл. С 95 мкл плазмы, дефицитной по FVIII, смешивали 5 мкл этих разведений TFPI и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Проводили анализ dPT следующим образом: тромбопластин SIMPLASTIN разбавляли до 1:100 в физиологическом растворе и предварительно нагревали до 37°C. Предварительно 25 мМ CaCl₂ и 100 мкл тестируемой плазмы, содержащей TFPI, нагревали до 37°C. Смешивали 100 мкл тромбопластина SIMPLASTIN и 100 мкл CaCl₂ и измеряли время свертывания с использованием фиброметра BBL. Результаты суммированы в таблице 1.

Таблица 1 Время свертывания в присутствии TFPI
Концентрация TFPI в плазме (мкг/мл)	Время свертывания (секунды)
1	>200
0,75	173
0,5	98
0,3	94
0,1	60

TFPI повышал время свертывания Hem-A плазмы с линейной зависимостью от дозы (см. фиг.1). На основании этих данных для анализа прокоагулянтной функции NASP была выбрана концентрация TFPI 0,5 мкг/мл.

Пример 3

Тестирование NASP

Соединения сульфатированных полисахаридов, включая модифицированные гепарины, пентозанполисульфат и фукоидан тестировали на наличие антикоагулянтной активности и сравнивали с гепарином для того, чтобы определить, можно ли их отнести к "неантикоагулянтным". Проходившие тестирование соединения перечислены в таблице 2.

Таблица 2 Антикоагулянтная активность NASP, для которых проводили тестирование
NASP	Компания/каталожный номер	MM (кДа)
N-ацетилгепарин (NAH)	Sigma Chem. Co. A8036	18
N-ацетил-де-О-сульфатированный гепарин (NA-de-o-SH)	Sigma Chem. Co. A6039	18
де-N-сульфатированный гепарин (De-NSH)	Sigma Chem. Co. D4776	18
де-N-сульфатированный ацетилированный гепарин (De-NSAH)	Sigma Chem. Co. D9808	18
Пентозанполисульфат натрия (PPS)	Ivax Pharmaceuticals, Inc. NDC 17314-9300-1	5
Фукоидан	Sigma Chem. Co. F5631	100
Гепарин натрия	Sigma Chem. Co. H4784	18

Тестируемые соединения разбавляли до концентрации 100 мкМ, 10 мкМ, 2 мкМ и 200 нМ. Для каждого тестируемого соединения к 237,5 мкл плазмы Hem-A добавляли 12,5 мкл разбавленного раствора, содержащего тестируемое соединение, и инкубировали при комнатной температуре. Для анализов времени свертывании крови dPT отбирали 100 мкл плазмы, содержащей тестируемое соединение, как описано в примере 2. Результаты суммированы в таблице 3, приведенной ниже.

Таблица 3 Эффект NASP на время свертывания∗ в соответствии с анализом dPT
Концентрация NASP (нМ)	NAH	NA-de-O-SH	De-N-SH	De-N-S-AH	PPS	Гепарин	Фукоидан
10	38	40	40	39	39	40	39
100	37	40	38	37	37	92	38
500	36	40	38	40	40	400	60
5000	38	40	41	55	70
∗ Приведенные значения представляют собой время свертывания (в секундах) для выбранных полисахаридов. Время свертывания плазмы Hem-A в отсутствие NASP составляет 41,5 секунд.

Как показано в таблице 3 и на фиг.2, гепарин при концентрациях, превышающих 10 нМ, проявлял явные антикоагулянтные свойства, в то время как N-ацетилгепарин (NAH), N-ацетил-де-O-сульфатированный гепарин (NA-de-O-SH), де-N-сульфатированный гепарин (De-N-SH) показывали небольшое увеличение или не показывали увеличения времени свертывания при концентрациях больше 5000 нМ. Аналогично фукоидан и PPS были лишь слабыми антикоагулянтами, увеличивая время свертывания на 50% при концентрациях, приблизительно от 10 до 100 раз выше соответственно, чем для гепарина, и, таким образом, были определены как "неантикоагулянтные". Приблизительно идентичный профиль наблюдали для плазмы здорового человека (данные не представлены).

Пример 4

Эффект NASP на свертываемость плазмы человека в соответствии с анализом aPTT

Эффект NASP на время свертывания плазмы измеряли также с использованием анализа aPTT для того, чтобы определить, можно ли их отнести к "неантикоагулянтным". Проводили разведения FACT, "нормальной" плазмы здорового человека (George King Biomedical) в плазме Hem-A человека с получением плазмы с концентрациями плазмы здорового человека от 0,31 до 100%. Затем проводили анализ aPTT следующим образом: 100 мкл смеси плазмы FACT-Hem-A и 100 мкл агента aPTT смешивали и инкубировали при 37°C в течение 3 минут. Добавляли 100 мкл CaCl₂ и измеряли время свертывания плазмы с использованием фиброметра BBL. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4 Эффект концентрации FACT на время свертывания
Концентрация FACT в плазме Hem-A (%)	Время аРТТ (секунды)
100	40
50	40
25	42
10	50
5	54
2,5	60
1,25	64
0,63	69
0,31	76
0	96

На основании этих данных для анализов при тестировании NASP на прокоагулянтную активность была выбрана концентрация FACT 1,25%. Эффект NASP на время свертывания плазмы определяли следующим образом: 5 мкл NASP добавляли к 95 мкл 1,25% FACT, разведенной в плазме Hem-A человека, и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Анализ aPTT проводили для определения времени свертывания плазмы, как описано в примере 1. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5 Эффект NASP на время свертывания плазмы в соответствии с анализом apt
Концентрация NASP (нМ)	Время свертывания с NAH (с)	Время свертывания с PPS (с)	Время свертывания с фукоиданом (с)	Время свертывания с гепарином (с)
0,16			71
0,8	70	70	70	70
4	69	71	71	70
20	67	72	75	200
100	74	80	119	Не свернулась
500	85	113		Не свернулась

Дополнительное подтверждение активности "NASP" демонстрировали посредством оценки трех соединений в анализе свертываемости APTT с плазмой Hem-A. Концентрации, приводящие к приблизительно 50% увеличению времени свертывания, были в 10 или в 100 или больше 500 раз выше для фукоидана, PPS и NAH соответственно, чем для гепарина (см. фиг.3).

Пример 5

Ингибирование активности TFPI с помощью NASP

A. Преинкубация TFPI с NASP перед добавлением в плазму

Ингибирование активности TFPI с помощью NASP оценивали в анализе свертываемости dPT с нормальной или гемофильной плазмой и добавлением рекомбинантного TFPI. Перед добавлением плазмы разбавленный рекомбинантный TFPI преинкубировали с NASP в течение 5 минут при комнатной температуре. После добавления плазмы смесь инкубировали в течение дополнительных 25 минут, после чего начинали dPT. Результаты анализов, проведенных на плазме Hem-A, представлены в таблице 6 и на фиг.4.

Таблица 6 Ингибирование активности TFPI с помощью NASP в плазме Hem-A
Концентрация NASP (нМ)	Время свертывания с фукоиданом (с)	Время свертывания с PPS (с)	Время свертывания с NAH (с)
500	75	74	84
100	46	57	99
20	54	55	141
4	72	91	160
0,8	108	111	158
0,16	130	158	144

Время свертывания плазмы Hem-A отдельно составляло 44 с.

Время свертывания плазмы Hem-A + TFPI составляло 151 с.

TFPI в конечной концентрации приблизительно 0,5 мкг/мл удлинял время свертывания плазмы от приблизительно 40 секунд до 100-200 секунд в зависимости от эксперимента и источника плазмы человека. Если активность TFPI ингибируется сульфатированными полисахаридами, тогда в присутствии NASP можно было бы наблюдать укорочение времени свертывания (см. Nordfang et al. (1991) Thromb. Haemost. 66 (4):464-467). Как представлено на фиг.4, добавление фукоидана и PPS в концентрациях, превышающих 1 нМ, значительно ускоряло свертывание плазмы Hem-A, содержащей TFPI. Напротив, для укорочения времени свертывания для NAH была необходима концентрация приблизительно 100 нМ, а гепарин (не представлено) только удлинял время свертывания. Важно, что при оптимальных концентрациях PPS или фукоидана время свертывания укорачивалось до времени без TFPI или до уровней с контрольным носителем или незначительно ниже, и степень нейтрализации эффекта TFPI охватывала по меньшей мере 100-кратный диапазон (например, от 5 до 500 нМ).

Ускорение свертывания плазмы посредством NASP в присутствии TFPI также тестировали в плазме Hem-B и нормальной плазме. Результаты анализов, проведенных для плазмы Hem-B, представлены в таблице 7 и на фиг.5.

Таблица 7 Ингибирование активности TFPI с помощью NASP в плазме Hem-B
Концентрация NASP (нМ)	Время свертывания с фукоиданом (с)	Время свертывания с PPS (с)	Время свертывания с NAH (с)
500	60	56	68
100	50	52	94
20	54	65	106
4	80	82	106
0,8	95	90	101
0,16	108	106	102
Время свертывания плазмы Hem-B отдельно составляло 46 с. Время свертывания плазмы Hem-B + TFPI составляло 101 с.

Ускорение свертываемости плазмы посредством NASP, вероятно, с помощью ингибирования активности TFPI было сходным образом продемонстрировано на плазме Hem-B (таблица 7 и фиг.5) и на плазме здорового человека (данные не представлены). Ранговый порядок эффективности между NASP был идентичен для исследований с плазмой Hem-A и профиль концентрация-эффект был практически идентичным.

B. Ингибирование активности TFPI без преинкубации TFPI с NASP

Эксперименты повторяли без преинкубации сульфатированных полисахаридов с TFPI перед воздействием на плазму. Для увеличения строгости теста ингибирования активности TFPI посредством NASP TFPI добавляли в плазму перед добавлением NASP. Результаты представлены в таблице 8 и на фиг.6.

Таблица 8 Ингибирование TFPI с помощью NAH и PPS в плазме Hem-A без преинкубации
Концентрация NASP (нМ)	Время свертывания с NAH (с)	Время свертывания с PPS (с)	Время свертывания с фукоиданом (с)
500	89	73	90
100	125	76	54
20	184	81	59
4	180	156	78
0,8	165	192	210
Hem-A + TFPI: 183 с. Hem-A отдельно, без TFPI: 45 с.

Как изображено на фиг.6, NASP отчетливо демонстрировали такие же свойства в отношении ускорения времени свертывания плазмы Hem-A с приблизительно идентичным профилем доза-эффект, что и в исследованиях с преинкубацией (фиг.4). Интересно, что фукоидан был наиболее эффективным и диапазон концентраций для значительного ускорения свертываемости был более чем 100-кратным. Таким образом, эти исследования показали, что определенные NASP, такие как PPS и фукоидан, могут проявлять активность в отношении нейтрализации TFPI и что такая эффективность показана для очень широкого диапазона концентраций, где не наблюдался запуск антикоагулянтной цепи.

Пример 6

Улучшение свертывания гемофильной плазмы посредством NASP в отсутствие добавления TFPI

Также было проведено тестирование способности NASP ускорять свертывание плазмы с дефицитом фактора в отсутствие добавления TFPI с помощью анализов dPT. Прокоагулянтный ответ, если наблюдался, мог быть связан с нейтрализацией эндогенной активности TFPI, который находится в человеческой плазме в количестве приблизительно 100 нг/мл (Nordfang et al., выше), главным образом, ассоциированном с липопротеинами или тромбоцитами (Broze et al. (1992) Semin. Hematol. 29:159-169; Broze et al. (2003) J. Thromb. Haemost. 1:1671-1675).

A. Ускорение свертывания плазмы Hem-A в отсутствие экзогенного TFPI

Было проведено тестирование способности NASP ускорять свертывание плазмы Hem-A в отсутствие экзогенного TFPI. Фукоидан или PPS титровали в плазме Hem-A и проводили анализы dPT. Кроме того, профиль доза-эффект для фактора VIIa анализировали в качестве положительного контроля усиления активации внешнего пути. Результаты представлены на фиг.7 и в таблице 9.

Таблица 9 Ускорение свертывания плазмы Hem-A в отсутствие экзогенного TFPI
Концентрация NASP (нМ)	Время свертывания с фукоиданом (с)	Время свертывания с PPS (с)	Время свертывания с FVIIa (с)
100	56	60
20	55	62	49
4	63	66	56
0,8	68	68	62
0,16	70	69	68
Время свертывания плазмы Hem-A отдельно, без NASP: 69 с.

И фукоидан, и PPS значительно ускоряли время свертывания зависимой от дозы форме, и фукоидан, проявлял наибольшую активность и максимальную эффективность. Как и в других исследованиях, существовал диапазон для прокоагулянтного эффекта, который в случае фукоидана варьировал от приблизительно 5 нМ до больше 100 нМ. На фиг.7 следует отметить, что в то время, как кривая эффекта начинает отражать повышение концентраций фукоидана больше 100 нМ, свертывание все еще ускоряется по отношению к контрольному носителю и, таким образом, фукоидан является прокоагулянтом. В то время, как укорочение времени свертывания от приблизительно 70 с до 55 с при 20 нМ фукоидана не является большим пределом, NAH активностью не обладал. Такое ускорение ранее наблюдалось для прокоагулянтных факторов, подобных FVIIa и тромбину. Таким образом, добавление FVIIa в концентрации 20 нМ ускоряло время свертывания на приблизительно 20 с, что было более высоким показателем, чем для фукоидана (фиг.7). Однако интересно заметить, что фукоидан в концентрации 20 нМ действовал сравнимо с фармакологической концентрацией FVIIa 5 нМ.

B. Ускорение свертывания плазмы Hem-B и плазмы, дефицитной по FVII в отсутствие экзогенного TFPI

Оценку истинной прокоагулянтной активности NASP продолжили для других коагулопатий человека, проведя тестирование активности NASP в плазме Hem-B и плазме, дефицитной по FVII. В случае плазмы Hem-B наблюдали результаты, сходные с результатами в случае плазмы Hem-A (данные не представлены).

Регуляцию свертывания в плазме, дефицитной по фактору VII, также оценивали в анализах dPT. Как ожидалось, плазма, дефицитная по FVII, не сворачивалась в течение 300 с без добавления FVIIa. Добавление FVIIa приблизительно в концентрации 0,1 нМ восстанавливало время свертывания до приблизительно 150 с (данные не представлены). Такое изменение времени свертывания, показанное в анализе dPT, имитирует некоторые формы дефицита фактора VII у человека. Титрование фукоидана и PPS в плазме, дефицитной по FVII, ускоряло время свертывания. Результаты представлены на фиг.8 и в таблице 10.

Таблица 10 Ускорение свертывания плазмы, дефицитной по фактору VII в отсутствие экзогенного TFPI
Концентрация NASP (нМ)	Время свертывания с фукоиданом (с)	Время свертывания с PPS (с)
500	111	113
100	74	142
20	120	159
4	147	181
0,8	168	198
Время свертывания без NASP, без FVIIa: >300 с. Время свертывания без NASP, + 0,1 нМ FVIIa: 173 с.

Как представлено на фиг.8, титрование фукоидана и PPS ускоряет свертывание плазмы, дефицитной по фактору VII, и, как наблюдалось в отношении плазмы Hem-A, фукоидан был значительно более активным и эффективным, чем PPS. В очередной раз, терапевтический диапазон был широким; в случае фукоидана существенное ускорение свертывания наблюдалось при концентрациях, находящихся в диапазоне от приблизительно 10 нМ до 500 нМ.

Пример 7

Улучшенный гемостаз у мышей, которым вводили NASP

Мышам Hem A или Hem B вводили PPS и фукоидан для оценки возможного улучшения гемостаза in vivo. NASP вводили подкожно с частотой дозирования, которая достаточно хорошо переносима для гемофильных мышей, и биодоступность для этого способа введения для различных сульфатированных полисахаридов была предварительно установлена (MacGregor et al. (1985) Thromb. Haemost. 53:411-414; Millet et al. (1999) Thromb. Haemost. 81:391-395). Время полураспада PPS и фукоидана могло составлять 1-2 часа. Таким образом, был выбран режим дозирования дважды в сутки. Предварительные исследования показали, что дозирование в течение нескольких суток было более предпочтительным, чем дозирование в течение 1-2 суток.

Эффект введения NASP на регуляцию свертывания у мышей, которым его вводили, оценивали на основании нескольких возможных результатов, включая выделение плазмы для анализа dPT, забор крови для анализа времени свертывания цельной крови (WBCT), время острого кровотечения и продолжительность выживания после надреза хвоста или поперечного надреза (Broze et al. (2001) Thromb. Haemost. 85:747-748). Результаты исследований in vivo в течение 5 суток с PPS и фукоиданом суммированы в таблицах 11-13.

A. Эффективность PPS у мышей Hem-A и Hem-B

Проводили тестирование эффективности PPS в отношении улучшения свертываемости у мышей Hem-A и Hem-B. Самцам и самкам мышей Hem-A и Hem-B вводили PPS в дозе 0,02, 0,06, или 0,2 мг/кг или носитель в виде физиологического раствора подкожно дважды в сутки в течение 5 суток. На утро пятых суток после начала дозирования хвост надрезали на расстоянии 1 см от конца и проводили мониторирование поведения и выживаемости в течение следующих 20-24 часов. Результаты представлены в таблице 11.

Таблица 11 Улучшение гемостаза у гемофильных мышей, которым вводили PPS
Гемофилия	Группа по введению	n/группа	Процент выживаемости (20 часов после надреза)
А (дефицит FVIII)	Контрольный носитель	8	25
	0,02 мг/кг	5	20
	0,06 мг/кг	9	44#
	0,2 мг/кг	5	40
В (дефицит FIX)	Контрольный носитель	8	25
	0,06 мг/кг	9	44#
Мышей случайным образом разделяли на группы и вводили подкожно дозу указанного вещества дважды в сутки в течение 4,5 суток с последующим надрезом хвоста (t=0). #p=0,07 против носителя.

Введение мышам Hem-A PPS в количестве 0,06 мг/кг показало приблизительно двукратное улучшение выживаемости, но результат не был статистически значимым (0,05<p<0,1) (таблица 11). Кроме того, терапевтическую пользу подтверждали визуальными наблюдениями техническим персоналом, у которого не было информации в отношении группы по введению, которые наблюдали более нормальное поведение (меньшая вялость и группирование) и менее обильное кровотечение у животных со средней и высокой дозой по сравнению с группой контрольного носителя. Таким образом, последовательное введение мышам Hem-B более эффективной дозы 0,06 мг/кг подкожно дважды в сутки приводило к результату, идентичному результату, наблюдавшемуся у мышей, дефицитных по FVIII.

Кроме того, было проведено тестирование эффективности PPS для улучшения свертываемости у мышей Hem-B с помощью анализов dPT. У всех мышей осуществляли забор крови перед исследованием для определения исходного (предшествующего испытанию) времени свертывания. Мышам (в возрасте 14 недель) вводили PPS подкожно дважды в сутки в течение 4,5 суток в следующих дозах: 2, 0,3 и 0,06 мг/кг в объеме 250 мкл. Через 4,5 суток у мышей осуществляли забор крови и определяли время свертывания в собранных образцах крови. Результаты представлены в таблице 12.

Таблица 12 Свертываемость у мышей Hem-B, которым вводили PPS NASP улучшают dPT
Группа (мг/кг)	Индивидуальное время свертывания через 4,5 суток (мин)	Среднее время свертывания через 4,5 суток (мин)
0,06	44
	42	37
	26
0,3	43
	31	38
	39
2,0	44
	45	44
	44
dPT нативной Hem-B находилось в диапазоне 44-50 с.

B. Эффективность фукоидана у мышей Hem-A

Учитывая улучшенную активность и диапазон эффективности фукоидана по отношению к PPS в некоторых анализах свертываемости, описанных выше, были проведены дополнительные исследования с фукоиданом на мышах Hem-A. При первом исследовании с фукоиданом установили приблизительно такой же режим, как описано для PPS, но с небольшим изменением уровней доз. Самцам мышей Hem-A подкожно вводили фукоидан в дозе 0,1 или 1,0 мг/кг или физиологический раствор дважды в сутки в течение 4 суток. Утром на 5-е сутки мышам давали двойную дозу фукоидана перед тестом с кровотечением. Выживаемость и поведение животных оценивали у мышей, которым вводили фукоидан, по сравнению с мышами, которым вводили контрольный носитель.

Во втором исследовании с фукоиданом оценивали сочетанную терапию с фактором VIII. Это исследования выполняли, как описано выше, за исключением утра пятых суток, мышам вводили внутривенную болюсную дозу 53 мЕ/мышь FVIII (приблизительно 1,25% от нормального уровня FVIII) в вену хвоста на расстоянии, близком к телу. Как и ранее, латеральную вену хвоста, и не артерию, пересекали через 2 часа в области, соответствующей диаметру приблизительно 2,7 мм. В этих исследованиях фукоидана использовали модификацию пересечения вены хвоста, так как было обнаружено, что это позволяет более точно оценить гемостаз и его регуляцию (Broze et al. (2001) Thromb. Haemost. 85:747-748). Выживаемость и клинические наблюдения записывали в течение 20-24 часов. Результаты представлены в таблице 13.

Таблица 13 Эффективность фукоидана и сочетания фукоидан + FVIII у мышей с гемофилией A
Группа по введению	n/группа	% выживаемости
		9 часов	20 часов
Контрольный носитель	14	21	7
Фукоидан (0,1 мг/кг)	13	61∗	38+
Фактор VIII (восстановление 1,25%)	7	57∗	57∗
Фукоидан + FVIII	7	86∗	86∗#
Мышей случайным образом разделяли на группы и дважды в сутки подкожно вводили дозу носителя или NASP в течение 4,5 суток с последующим надрезом вены хвоста (t=0). Где указано, за 2 часа до надреза вводили FVIII. Следует заметить, что восстановление 1% FVIII приводит к ~10% выживаемости, в то время как восстановление 2% FVIII приводит к ~100% выживаемости у этих мышей. ∗ p<0,05 по сравнению с носителем + p=0,06 по сравнению с носителем #p=0,06 по сравнению с фукоиданом

В первом исследовании введение мышам фукоидана в дозе 0,1 мг/кг оказалось более эффективным, чем введение носителя в дозе 1,0 мг/кг (выживаемость в течение приблизительно 10 часов составляла 1/6 для носителя, 4/6 для дозы 0,1 мг/кг и 3/6 для дозы 1,0 мг/кг). Таким образом, второе исследование проводили с фукоиданом в дозе 0,1 мг/кг.

Как показано в верхних двух строках таблицы 13, введение фукоидана мышам Hem A значительно улучшало выживаемость при кровотечении. Поведение животных, как описано выше, было более нормальным у всех мышей, которым вводили фукоидан в течение первых 8-10 часов после надреза, и явно лучше в течение длительного срока у приблизительно половины животных.

Эффективность сочетанной терапии предварительно оценивали при введении мышам FVIII +/- фукоидан (таблица 13). Предварительное исследование для подбора дозы для введения FVIII отдельно для мышей Hem A за два часа до надреза хвоста показало очень высокое соотношение доза-эффект для выживаемости. Введение ReFacto^R в количестве 1% нормы приводило к приблизительно 10% выживаемости, в то время как дозирование в количестве 2% нормы приводило к приблизительно 100% выживаемости (данные не представлены). Таким образом, для получения приблизительно 50% выживаемости выбирали дозу FVIII для восстановления, равную 1,25%. В частности, процент выживаемости в группе, которой вводили фукоидан + FVIII, был постоянно более высоким, чем процент выживаемости для фукоидана или FVIII по отдельности. Таким образом, результаты исследований PPS и фукоидана показали улучшение гемостаза в моделях гемофилии после введения выбранного NASP.

Заключение

Был проведен ряд исследований для тестирования NASP на улучшение свертывания в моделях гемофилии ex vivo и in vivo. Были идентифицированы сульфатированные полисахариды с по существу пониженными антикоагулянтными свойствами по сравнению с гепарином. Было показано, что подгруппа таких NASP, а именно фукоидан и PPS, эффективно ингибирует активность TFPI, главного понижающего регулятора внешнего пути свертывания крови. Фукоидан и PPS улучшали протромбиновое время свертывания с разведенным тромбопластином в человеческой плазме, дефицитной по факторам VII, VIII или IX. Терапевтическая польза введения фукоидана или PPS in vivo была очевидна из тестов с кровотечениями у гемофильных мышей.

И PPS, и фукоидан могут проявлять антикоагулянтную активность при более высоких концентрациях, вероятно, вследствие взаимодействия с кофактором гепарина II (Church et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:3618-3623; Giedrojc et al. (1999) J. Cardiovasc. Pharmacol. 34:340-345). Для подкожного введения PPS для удлинения свертывания крысам требовались дозы >5 мг/кг (Giedrojc et al., выше), и оказалось, что кролики хорошо переносили фукоидан даже при внутривенном ведении дозы 10 мг/кг (Granert et al. (1999) Infect. Immun. 67:2071-2074). Таким образом, наблюдаемые результаты показывают, что у грызунов с гемофилией гемостаз улучшается при дозах ≤0,1 мг/кг. Уровни доз, которые улучшали гемостаз in vivo, были ниже, чем дозы, которые приводили к другим эффектам, о которых сообщалось (Toida et al. (2003) Trends in Glycoscience and Glycotechnology 15:29-46; Luyt et al. (2003) J. Pharmacol. Exp. Ther. 305:24-30; Berteau et al. (2003) Glycobiology 13:29R-40R; Granert et al., выше; и Sweeney et al. (2002) Blood 99:44-51).

Не ограничиваясь конкретной теорией, ингибированию TFPI посредством NASP может принадлежать часть наблюдаемых улучшений свертываемости ex vivo и in vivo. Нейтрализация TFPI антителами также показала улучшение гемостаза в модели Hem A на кроликах и ускорение свертывания человеческой гемофильной плазмы (Nordfang et al., выше; Welsch et al., выше; и Erhardtsen et al. (1995) Blood Coagul. Fibrinolysis 6:388-394). В настоящих исследованиях только соединения, ингибирующие активность TFPI, также снижали время свертывания гемофильной плазмы в анализе dPT. Более того, фукоидан проявлял лучшую активность и, возможно, больший максимальный эффект по сравнению с PPS в тесте свертывания dPT, когда для лучшей имитации природных условий с плазмой сначала смешивали TFPI. Аналогично, введение фукоидана мышам приводило к лучшей в некоторой степени эффективности, чем введение PPS, хотя не установленная соответствующая фармакокинетика может влиять на исход кровотечения.

Стоит отметить, что такое поведение не наблюдалось для всех тестируемыми NASP. Например, NAH проявлял лишь слабую активность в отношении нейтрализации TFPI (фиг.4-6) и не ускорял времени свертывания гемофильной плазмы в отсутствие добавления TFPI (данные не представлены). Более того, три NASP, которые не показали собственной антикоагулянтной активности в концентрациях вплоть до 5000 нМ (фиг.2; De-N-S-AH, De-N-SH, и NA-De-O-SH), не проявляли никакой активности в отношении нейтрализации TFPI, таким образом, не ускоряли времени свертывания в плазме Hem A (данные не представлены).

Степень улучшения гемостаза, наблюдавшаяся для NASP, оказалась клинически значимой. Улучшение времени свертывания плазмы Hem A при оптимальных концентрациях фукоидана было сравнимо с добавлением FVIIa в количестве приблизительно 5 нМ (пример 6), который обладает доказанной эффективностью в отношении нормализации гемостаза у пациентов (Bishop et al. (2004) Nat. Rev. Drug Discov. 3:684-694; Carcao et al. (2004) Blood Rev. 18:101-113; Roberts et al. (2004) Anesthesiology 100: 722-730; Lee et al. (2004) Int. Anesthesiol. Clin. 42:59-76; и Brummel et al. (2004) J. Thromb. Haemost. 2:1735-1744). Кроме того, польза введения NASP в отношении выживаемости у мышей была значительной (пример 7). Ускорение свертываемости с помощью фукоидана в анализе dPT более выражено в гемофильной плазме человека, чем в плазме мыши (данные не представлены).

Понятной оценкой для возможного клинического расширения применения NASP для коагулопатий будет терапевтический индекс. Конкретно, индекс между улучшением гемостаза и переходом в антикоагулянтный эффект. По результатам анализов свертываемости в плазме человека для соединений, таких как PPS или фукоидан, интервал концентраций между "активностью" анти-TFPI или ускорением свертывания при dPT и потерей такой эффективности и запуском цепи антикоагуляции составлял ≥50 раз. Как упомянуто выше для исследований на мышах, индекс у мышей может составлять по меньшей мере десять раз. Более того, как класс гепариноподобные сульфатированные полисахариды в основном являются хорошо переносимыми.

В заключение, системное введение отдельных NASP может представлять собой уникальный подход для регуляции гемостаза при коагулопатиях. Пентозанполисульфат и фукоидан, в частности, ингибировали активность TFPI и улучшали свертываемость в человеческой плазме, дефицитной по факторам VII, VIII и IX. Таким образом, введение NASP приводило к улучшению гемостаза и может представлять собой относительно недорогостоящую, безопасную и удобную альтернативу или дополнение к используемым в настоящее время способам лечения факторами свертывания.

Несмотря на то, что предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения были проиллюстрированы и описаны, следует понимать, что различные изменения могут быть в них осуществлены без отклонения от сущности и объемов настоящего изобретения.

Claims (19)

1. Применение неантикоагулянтного сульфатированного полисахарида (NASP) для лечения индивидуума, нуждающегося в повышении свертываемости крови.

2. Применение по п.1, где указанный NASP выбран из группы, состоящей из N-ацетилгепарина (NAH), N-ацетил-де-О-сульфатированного гепарина (NA-de-o-SH), де-N-сульфатированного гепарина (De-NSH), де-N-сульфатированного ацетилированного гепарина (De-NSAH), оксидированного йодной кислотой гепарина (РОН), химически сульфатированного ламинарина (CSL), химически сульфатированной альгиновой кислоты (CSAA), химически сульфатированного пектина (CSP), декстрансульфата (DXS), олигосахаридов, полученных из гепарина (HDO), пентозанполисульфата (PPS) и фукоидана.

3. Применение по п.2, где указанный NASP представляет собой NAH.

4. Применение по п.2, где указанный NASP представляет собой PPS.

5. Применение по п.2, где указанный NASP представляет собой фукоидан.

6. Применение по п.2, где указанный NASP представляет собой фрагмент фукоидана, который уменьшает время свертывания в анализе dPT.

7. Применение по любому из пп.1-6, где NASP вводят в дозе от приблизительно 0,06 до 2,0 мг/кг.

8. Применение по п.1, где индивидуум страдает коагулопатией, выбранной из группы, состоящей из хронической или острой коагулопатии, врожденного нарушения свертываемости крови вследствие дефицита фактора крови и приобретенного нарушения свертываемости.

9. Применение по п.8, где дефицит фактора крови представляет собой дефицит одного или нескольких факторов, выбранных из группы, состоящей из фактора V, фактора VII, фактора VIII, фактора IX, фактора XI, фактора XII, фактора XIII и фактора фон Виллебранда.

10. Применение по п.1, где необходимостью повышения свертываемости крови является предшествующее введение антикоагулянта, или хирургическая операция, или другая инвазивная процедура.

11. Применение по п.1, где индивидууму дополнительно вводят фактор VIII и фактор VIIIa.

12. Применение по п.10, где антикоагулянт выбран из группы, состоящей из гепарина, производного кумарина, такого как варфарин или дикумарол, ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), антитромбина III, волчаночного антикоагулянта, антикоагулянтного пептида нематод (NAPc2), фактора VIIa (фактор VIIai) с заблокированным активным центром, ингибиторов фактора IXa, ингибиторов фактора Ха, включая фондапаринукс, идрапаринукс, DX-9065a и разаксабан (DPC906), ингибиторов факторов Va и VIlla, включая активированный протеин С (АРС) и растворимый тромбомодулин, ингибиторов тромбина, включая гирудин, бивалирудин, аргатробан и ксимелагатран, и антител, которые связываются с фактором свертывания.

13. Применение по п.12, где антикоагулянт представляет собой антитело, которое связывается с фактором свертывания, выбранным из группы, состоящей из фактора V, фактора VII, фактора VIII, фактора IX, фактора X, фактора XIII, фактора II, фактора XI, фактора XII, фактора фон Виллебранда, прекалликреина и высокомолекулярного кининогена (HMWK).

14. Применение неантикоагулянтного сульфатированного полисахарида (NASP) для ингибирования у индивидуума активности TFPI.

15. Применение неантикоагулянтного сульфатированного полисахарида (NASP) для ингибирования активности TFPI в крови или плазме.

16. Способ лечения индивидуума, нуждающегося в повышении свертываемости крови, предусматривающий введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества композиции, содержащей неантикоагулянтный сульфатированный полисахарид (NASP).

17. Способ ингибирования активности TFPI у индивидуума, где способ включает введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества композиции, содержащей неантикоагулянтный сульфатированный полисахарид (NASP).

18. Способ ингибирования активности TFPI в крови или плазме, где способ включает объединение крови или плазмы с неантикоагулянтным сульфатированным полисахаридом (NASP) для ингибирования указанной активности TFPI.

19. Способ измерения увеличения времени свертываемости крови посредством неантикоагулянтного сульфатированного полисахарида (NASP) в образце крови, где способ включает:
a) объединение образца крови с композицией, содержащей указанный NASP,
b) измерение времени свертываемости в указанном образце крови,
c) сравнение времени свертываемости в указанном образце крови со временем свертываемости в соответствующем образце крови, необработанным NASP, где уменьшение времени свертываемости образца крови, обработанного NASP, является указанием на увеличение времени свертывания крови.

Images