CN108822231A - 一种具有提高抗氧化活性的果胶多糖硫酸化修饰产物及其制备方法 - Google Patents

一种具有提高抗氧化活性的果胶多糖硫酸化修饰产物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明为一种果胶多糖增强抗氧化活性硫酸化修饰方法。采用氨基磺酸‑N,N‑二甲基甲酰胺法法进行硫酸化修饰，以硫酸化取代度为指标，用单因素考察硫化温度、硫化时间、DMF用量和氨基磺酸用量，得到不同取代度的硫酸化果胶多糖。本发明还涉及硫酸化果胶多糖在制药中应用，尤其在制备抗氧化药物中应用，包括在清除羟基自由基药物、超氧氧阴离子药物及Fe3+还原能力药物应用。本发明将人工合成不同取代度硫酸化果胶多糖用于体外抗氧化活性试验，为硫酸化果胶多糖在医药领域的应用提供参考依据。

Description

一种具有提高抗氧化活性的果胶多糖硫酸化修饰产物及其制 备方法
技术领域
本发明涉及一种果胶多糖，具体涉及一种具有提高抗氧化活性的果胶多糖硫酸化修饰产物及其制备方法。
背景技术
果胶是一种结构复杂的线性多糖，广泛分布于高等植物的各个部位，在细胞壁中的含量最多，其主要成分是D-半乳糖醛酸。果胶作为一种安全健康的天然食品添加剂，在食品工业、医药保健等方面有广泛应用。在酸奶、乳酪、奶油等奶制品中添加果胶可以使其更加粘稠和稳定；在果子酱中添加果胶后，其粘稠度降低，易于流动，解决了果子酱难以注入包装的问题；添加了果胶的糖果，其透明度更高，热量更低；果胶加在面粉中，与面筋中的麦醇溶蛋白相互作用，可以延长烘焙面包的保质期。在生物医学方面，果胶不仅能抗氧化、抗癌、抗炎、吸附重金属、降血脂，还能预防糖尿病、止血解毒、抗菌抗辐射、作为药物运输的载体等。
果胶虽然具有良好的生物活性，但因其分子量较大，在实际应用中效果不佳，导致果胶在医药领域中的应用存在很大的局限性。因此，人们更倾向于对果胶的一些结构进行人为的修饰，以得到某些具有特殊功能的果胶产品。研究表明，硫酸化修饰可增加其抗氧化活性，可作为抗凝血剂——肝素的替代物。本发明对果胶进行硫酸化修饰，确定其结构特征，比较研究了不同取代度硫酸化果胶多糖的抗氧化活性。有关果胶多糖硫酸化衍生物制备及抗氧化活性研究至今未见国内外文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供硫酸化果胶多糖的合成方法，并获得不同硫酸化取代度果胶多糖抗氧化作用结果。
本发明通过以下技术方案达到上述目的：
一种硫酸化果胶多糖，由以下方法合成：将100mg的柑橘果胶多糖于锥形瓶中，加入 50mL的DMF，于超声波清洗器振荡至溶解，用恒温磁力搅拌器搅拌升温，加入2.5g的氨基磺酸，控制温度，搅拌一段时间，冰水浴终止反应，调节pH值至中性，将反应液置于截留分子量为3000的透析袋中流水透析72h。旋转蒸发溶液，冷冻干燥，得硫酸化柑橘果胶。
本发明还要求保护所述的不同取代度的硫酸化多糖在制药中的应用。进一步地，不同取代度硫酸化果胶多糖在制备药物中的应用包括以下4个方面。
(1)硫酸化果胶多糖在制备清除羟基自由基药物中的应用，硫酸化果胶多糖有效浓度为3mg/mL，硫酸化取代度为0.25～0.81。
(2)硫酸化果胶多糖在制备清除超氧阴离子自由基药物中的应用，硫酸化果胶多糖有效浓度为3mg/mL，硫酸化取代度为0.25～0.81。
(3)硫酸化果胶多糖在制备清在清除还原能力药物中的应用，硫酸化果胶多糖有效浓度为3mg/mL，硫酸化取代度为0.25～0.81。
本发明的有益效果在于：将人工合成的硫酸化果胶多糖用于体外抗氧化活性实验，获得不同取代度的硫酸化果胶多糖抗氧化的实验结果，为硫酸化果胶多糖在医药领域的应用提供参考依据。
附图说明
图1为实施所述不同硫酸化温度对果胶多糖硫酸化取代度的影响
图2为实施所述不同硫酸化时间对果胶多糖硫酸化取代度的影响
图3为实施所述不同DMF用量对果胶多糖硫酸化取代度的影响
图4为实施所述不同氨基磺用量对果胶多糖硫酸化取代度的影响
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
1、果胶多糖硫酸化修饰
称量100mg柑橘果胶多糖于锥形瓶中，加入50mL DMF，于超声波清洗器振荡至溶解，用恒温磁力搅拌器搅拌升温，加入2.5g氨基磺酸，继续升温，搅拌反应一段时间，反应结束后，冰水浴终止反应，调节pH值至中性，将反应液置于截留分子量为3000的透析袋中流水透析72h，冷冻干燥得硫酸化柑橘果胶(MCP)。
2、红外光谱分析
分别称取2mg的果胶多糖和硫酸化果胶多糖加入100mg干燥KBr于玛瑙研钵中，研磨均匀，压片。进行红外光谱扫描，扫描范围为4000～400cm-1。
3、硫酸化果胶多糖硫酸根含量的测定
称取3mg样品于试管中，加入3mL 1mol/L HCl，加塞，在100℃恒温水浴锅中水解6h，用蒸发皿将内容物60℃挥干，再用2mL去离子水复溶，得到样品水解液。取水解液0.4 mL，去离子水补至1.6mL，依次加入8％TCA溶液、BaCl2-明胶溶液各1.4mL，混匀后静置15min，360nm波长测定吸光值A1。
4、不同硫酸化温度对果胶多糖硫酸化取代度的影响
设置温度60℃、70℃～100℃，研究不同硫酸化温度对果胶多糖硫酸化取代度的影响，结果见图2。在60℃时MCP的取代度最高，达0.81。随着温度的升高，取代度逐渐降低。因此，硫酸化修饰果胶多糖的硫酸化温度为60℃。
5、不同硫酸化时间对果胶多糖硫酸化取代度的影响
设置反应温度1h、2h～5h，研究不同反应温度对果胶多糖硫酸化取代度的影响，结果见图3。硫酸化时间对取代度的影响不大，随着时间的延长，取代度略有降低，最适反应时间为1h。
6、不同DMF用量对果胶多糖硫酸化取代度的影响
设置DMF用量20mL、30mL～60mL，研究不同DMF用量对果胶多糖硫酸化取代度的影响，结果见图4。取代度随DMF用量增大而减小，因此，选用20mL的DMF。
7、不同氨基磺用量对果胶多糖硫酸化取代度的影响
设置氨基磺用量0.5、1.0～2.5g，研究不同氨基磺用量对果胶多糖硫酸化取代度的影响，结果见图4。氨基磺酸加量在0.5～1.5g时，取代度变化平缓，在2.0g时有最高峰，超过2.0 g时取代度有所降低。因此，硫酸化修饰果胶多糖的氨基磺用量为2.0g。
8、不同取代度硫酸化果胶多糖对羟基自由基清除作用
采用番红褪色法来检测样品对羟自由基(·OH)的清除作用。加入配制好的样品和试剂，摇匀后在37℃水浴反应30min，反应结束后，在519nm波长测定吸光值。
修饰前后的果胶对·OH均有一定的清除能力，且MCP的清除效果比CP有明显提高。取代度在0.25～0.46范围内，MCP对·OH的清除率随着取代度的递增而增大，在取代度为0.46时达到最大清除率41.11％，取代度大于0.46时，清除率变化趋于平缓。柑橘果胶本身的·OH的清除率在13％左右，修饰后清除率达28％～40％。
9、不同取代度硫酸化果胶多糖对超氧阴离子自由基清除作用
采用邻苯三酚自氧化法测定样品对超氧阴离子(O2-·)的清除能力。将配制好的样品和试剂一同放在25℃水浴中预热20min，精确量取4.5mL Tris-HCl溶液(50mmol/L，pH＝8.2) 于试管，依次加入0.2mL样品，40μL邻苯三酚(25mmo1/L)，迅速混匀后倒入比色皿，在波长319nm处测定吸光值，每30s测一次，共4min，根据吸光值的增值计算出氧化速率 Vt，以同浓度的Vc代替样品测定吸光值，作为阳性对照。
修饰前后的果胶均对O2-·有一定的清除能力。取代度为0.57时，MCP对O2-·的清除率达到最大值31.52％，相比CP(22.16％)提高了42.2％，说明适度的硫酸化有利于提高柑橘果胶的O2-·清除率。橘果胶本身的O2-·清除率比较低，在15％左右，修饰后可提高20％～40％。
10、不同取代度硫酸化果胶多糖对Fe3+还原能力作用
采用铁还原法来测定样品的还原性能力。量取0.5mL样品液于试管，依次加入0.5mL 的1％K3Fe(CN)6溶液与0.5mL PBS溶液(0.2mo1/L，pH＝6.7)，于50℃水浴反应20min后立即冷却，依次加入0.5mL 10％TCA溶液，0.5mL 0.1％FeCl3溶液和2.0mL去离子水，充分摇匀，静置10min，摇匀测定其吸光值A700，以同浓度的Vc代替样品测定吸光值，作为阳性对照。
修饰前后的果胶均对Fe3+有一定的还原能力。MCP在0.25～0.46和0.57～0.59的取代度范围内有较好的还原效果，取代度为0.58时，其还原能力达到最大值0.149，相比CP提高了34.2％；当取代度为最大值0.81时，其还原能力为最小值0.091，还原能力下降。

Claims (6)

1.一种不同取代度硫酸化果胶多糖制备，其特征在于，所述的硫酸化果胶多糖由以下方法合成：称取100mg的柑橘果胶于锥形瓶中，加入50mL的DMF，于超声波清洗器振荡至溶解，用恒温磁力搅拌器搅拌升温至80℃，加入2.5g的氨基磺酸，继续升温，并搅拌反应1h，反应结束后，冰水浴终止反应，调节pH为中性，装入透析袋(截留分子量3000)对流水透析3天，冷冻干燥得硫酸化柑橘果胶。
2.根据权利要求1所述的硫酸化柑橘果胶，其特征在于，硫酸化果胶多糖在制药用的应用。
3.根据权利要求1所述的硫酸化柑橘果胶，其特征在于，硫酸化果胶多糖在制备抗氧化药物中应用。
4.根据权利要求2所述的硫酸化柑橘果胶的应用，其特征在于，硫酸化果胶多糖在制备清除羟基自由基药物中的应用，硫酸化果胶多糖有效浓度为10mg/mL，硫酸化取代度为0.25～0.81。
5.根据权利要求2所述的硫酸化柑橘果胶的应用，其特征在于，硫酸化果胶多糖在制备清除超氧阴离子自由基药物中的应用，硫酸化果胶多糖有效浓度为10mg/mL，硫酸化取代度为0.25～0.81。
6.根据权利要求3所述的硫酸化柑橘果胶的应用，其特征在于，硫酸化果胶多糖在制备清在清除还原能力药物中的应用，硫酸化果胶多糖有效浓度为10mg/mL，硫酸化取代度为0.25～0.81。
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