CN101781372B - 一种党参多糖的硫酸化修饰方法 - Google Patents

Abstract

本发明为一种党参多糖的硫酸化修饰方法，属于中药多糖的结构改造技术领域。提取、纯化党参多糖，用氯磺酸-吡啶法进行硫酸化修饰，以产物量和取代度为指标，用L₉(3⁴)正交实验对试剂配比、反应温度和反应时间3因素进行优选，确定最佳修饰条件为氯磺酸与吡啶的质量比1∶6、反应温度80℃、反应时间3h，所得硫酸化党参多糖的产物量和取代度高、活性强。本发明能显著提高党参多糖的抗病毒活性。

Description

一种党参多糖的硫酸化修饰方法

一、技术领域

本发明一种党参多糖的硫酸化修饰方法，属于中药多糖的结构改造技术领域。

二、背景技术

多糖是生物体内除蛋白质和核酸外又一类重要的生物大分子物质，具有抵抗感染、增强免疫、抗氧化和防治肿瘤和病毒性肝炎、类风湿症、艾滋病等免疫损伤或免疫缺损症等多方面的功能和生物活性。随着化学和生物学的快速发展和分离技术的提高，多糖的生物学功能、特别是作为生命物质参与生命的全部时间和空间功能，突破了多糖作为支持组织和能量来源的传统观念，发现其具有更广泛的生物学功效，特别是具有免疫增强、抗病毒等功效使得多糖物质成为人类及动植物医疗、保健、病虫害防治领域的重要成员。多糖的研究已成为天然药物研究和生命科学研究的热点之一。

在对多糖的结构及其活性的研究中，科技人员注意到以下问题：①自然界中存在的多糖并不都具有活性。②有些多糖由于结构或理化性质等障碍而不利于其生物学活性的发挥。③也有些多糖尽管药效良好，但同时也会产生一些不良反应，甚至毒副作用。④有些从天然生物体内分离的多糖活性较弱，有待进一步提高。因此，采取一定的方法对多糖结构进行适当修饰是解决以上问题的根本途径，通过结构修饰能提高或赋予多糖活性、降低某些多糖的毒副作用。

党参为桔梗科党参属植物党参Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.的根，其味甘性平，无毒，具有补中益气，健脾益肺等功效，主治脾胃虚弱、气短心悸、热病伤津、虚喘咳嗽等症。现代药理学研究证实，党参具有抗肿瘤、增强免疫功能及抗氧化等多种生物学活性，其主要活性成分为党参多糖(Codonopsis pilosula polysaccharide，CPPS)，而党参多糖的抗病毒活性鲜见报道。根据文献和本研究室的前期工作证明，硫酸化修饰能够显著提高多糖的生物活性、尤其是抗病毒活性。本发明首次对党参多糖进行硫酸化修饰，建立了党参多糖的硫酸化修饰方法，优化了修饰条件，发现硫酸化修饰能显著党参多糖的抗病毒活性。

三、发明内容

技术问题本发明针对中药多糖生物活性低的问题，提供一种党参多糖的硫酸化修饰方法，达到显著提高党参多糖抗病毒活性的目的。

技术方案

一种党参多糖的硫酸化分子修饰方法，包括：提取、纯化党参多糖，用氯磺酸一吡啶法对党参多糖进行硫酸化修饰，其特征在于，修饰条件为氯磺酸与吡啶的质量比1∶6、反应温度80℃、反应时间3h。并筛选出一种活性最好的取代度为1.26的硫酸化党参多糖产品。

有益效果

1.建立了党参多糖的硫酸化修饰方法，通过正交实验优化了党参多糖的硫酸化修饰条件。

2.证明硫酸化修饰能够显著提高党参多糖的抗病毒活性，并筛选出一种抗病毒活性最好的硫酸化党参多糖。

与现有技术相比，本发明优点如下：

1.党参多糖的硫酸化修饰国内外未见报道，本发明提供了一种党参多糖的硫酸化修饰方法及其优化的修饰条件，填补了国内外研究的空白。

2.党参多糖的抗病毒活性未见报道，通过本发明的实施，证明天然党参多糖的抗病毒作用微弱，通过硫酸化修饰能够显著提高其抗病毒活性，并筛选出一种活性最好的硫酸化党参多糖(取代度为1.26)，在两种给药方式中的病毒抑制率最高(分别为76.5％～83.3％)，表明其抗病毒作用最强，可以作为研制新型抗病毒药物的材料。为研制新型抗病毒药物提供了材料和示范。

四、具体实施方式

1.党参多糖的提取

用水煎-超声醇沉法。取党参饮片500g，粉碎，置于索式提取器中，用80％乙醇回流3次，至回流液接近无色，药渣加入20倍水中，80℃超声(功率80W，每次10min)预处理2次，再煎煮3次，第一次2h，第二次1h，第三次0.5h，合并三次滤液，浓缩至650mL。加95％乙醇使醇浓度达到80％，静至过夜，离心取沉淀，再用乙醇、丙酮洗涤，干燥，得到粗党参多糖。

2.党参多糖的纯化

(1)去蛋白：将粗党参多糖配成5％的水溶液，首先用反复冻融法(-20℃冷冻、室温下缓慢融化，5000rpm离心)除去部分蛋白。然后加入溶液体积1/5的三氯甲烷，随之加入三氯甲烷体积1/5的正丁醇，剧烈震荡20min，5000rpm离心20min，分去水层与有机层交界处的变性蛋白，反复处理6次。

(2)去色素：将去蛋白的多糖溶液加入1％活性炭，旋转蒸发仪处理10min，抽滤去除沉淀。

(3)柱层析：湿法装Sephadex G-75层析柱，用0.9％NaCl冲洗，平衡，过夜，取去色素的多糖溶液上样，开启恒流泵，用0.9％NaCl洗脱，流速控制在30mL/h，收集洗脱液，10mL/管，每隔4管用苯酚-硫酸法测定糖含量，绘制多糖洗脱曲线，合并含糖管洗脱液，适当浓缩，加入95％乙醇沉淀，干燥，得纯化的党参多糖。

3.党参多糖的硫酸化修饰

(1)修饰条件优化由于反应温度、试剂配比、反应时间是多糖硫酸酯化的主要影响因素，在预实验的基础上，以修饰反应温度(A)、氯磺酸与吡啶的体积比(B)和反应时间(C)为因素，按3因素3水平的L₉(3⁴)正交试验设计9种修饰条件(表1)。

表1L₉(3⁴)正交试验设计因素水平表

(2)酯化试剂制备将带有搅拌和冷凝装置的三颈烧瓶置冰盐水浴中，加入50mL无水吡啶，快速搅拌，充分冷却后，按表2设定的氯磺酸-吡啶体积比逐滴加入氯磺酸，于40min内加完。反应结束后，撤去冰盐水浴。共制备9种酯化试剂。

(3)修饰操作精密称取纯化的党参多糖(codonpsis pilosula polysccharide，CPPS)400mg加入装有酯化试剂的三颈烧瓶中，按表2设定的反应温度和反应时间分别搅拌反应。反应结束后冷却至室温，反应液加入预冷的100mL冰水中，用5mol/L的NaOH溶液中和至pH 7。加入3倍体积的无水乙醇，静置24h，取沉淀用自来水透析2d、蒸馏水透析1d，透析液冷冻干燥得硫酸化党参多糖(sulfated CPPS，sCPPS)，共得到9种sCPPSs，标注为sCPPS₁、sCPPS₂、sCPPS₃、sCPPS₄、sCPPS₅、sCPPS₆、sCPPS₇、sCPPS₈、sCPPS₉。

正交试验结果表明，在80℃、试剂配比1∶8、反应时间1h条件下的产物量最高，达728mg；在80℃、试剂配比为1∶6、反应时间3h条件下的产物取代度最高，达1.83。从产物量分析的R值和K值可见，各因素对产物量的影响为B＞A＞C，氯磺酸与吡啶的配比的影响最大，最佳修饰条件为A₃B₂C₃；从取代度分析的r值和k值可见，各因素对取代度的影响为C＞B＞A，反应时间对取代度的影响最大，最佳修饰条件为A₂B₂C₃(表2)。

表2L₉(3⁴)正交试验及统计结果

通过进一步分析3个因素对产物量和取代度的影响，确定最佳修饰条件为氯磺酸与吡啶配比为1∶6、反应温度80℃、反应时间3h。用优选的条件制备了3批硫酸化党参多糖，产物量分别为684、660和672mg，取代度分别为1.42、1.75和1.63，与正交试验结果的差异不显著，证明该条件为最佳条件。

4.硫酸化党参多糖的抗病毒活性比较

根据取代度选择sCPPS₂、sCPPS₅、sCPPS₆和sCPPS₈为对象研究，以未修饰的CPPS对照，首先测定了它们对鸡胚成纤维细胞(CEF)的安全浓度，然后用MTT法比较它们鸡新城疫病毒(NDV)感染细胞能力的影响。

(1)sCPPSs对CEF的安全浓度

将各sCPPSs用三蒸水配制成1mg·mL^-1，然后用细胞维持液自50μg·mL^-1倍比稀释至0.049μg·mL^-1、CPPS自500μg·mL^-1倍比稀释至0.488μg·mL^-1共11个浓度；培养CEF，待细胞长成单层时，分组加入各浓度的多糖，100μL/孔，每个浓度重复4孔，37℃继续培养72h，按MTT法^[5]用酶联免疫检测仪测定570nm波长处的吸光值(A₅₇₀值)。选择A₅₇₀值不显著低于细胞对照组的多糖最大浓度作为该多糖的最大安全浓度。

结果，sCPPS₂、sCPPS₅、sCPPS₆在25μg·mL^-1、sCPPS₈在12.5μg·mL^-1、CPPS在125μg·mL^-1时A₅₇₀值不显著小于细胞对照组，因此这些浓度定为它们的最大安全浓度。为了便于同水平比较，将5种多糖的最大安全浓度统一假定为25μg·mL^-1

(2)sCPPSs对NDV感染细胞能力的影响

将5种多糖分别用细胞维持液自25μg·mL^-1倍比稀释至39.06μg·mL^-1共5个浓度，在96孔板中培养鸡胚成纤维细胞，待成细胞长成单层后，弃去营养液，以3种方式加入各浓度多糖和NDV，即先加多糖、4h后更换病毒；先加病毒、2h后更换多糖；多糖与病毒37℃孵育4h后加入。每孔100μL。同时设病毒对照和细胞对照孔。37℃、5％CO₂箱培养72h，按MTT法用酶联免疫检测仪测定细胞的A₅₇₀值。当多糖组的A₅₇₀值大于病毒对照组时，表明多糖有抗病毒作用。并按下式计算最高病毒抑制率：

比较各多糖的作用强度。结果如下：

①先加多糖后加病毒时，sCPPS₂和sCPPS₆在3.125μg·mL^-1时的A₅₇₀值显著大于病毒对照组(P＜0.05)，表明它们有显著的抗病毒作用；sCPPS₂和sCPPS₆的其余4个浓度、sCPPS₅在12.5～25μg·mL^-1、sCPPS₈在25和1.56～3.125μg·mL^-1、CPPS在1.56～3.125μg·mL^-1时的A₅₇₀值大于病毒对照组，表明它们有抗病毒作用(表3)。

各硫酸化党参多糖组的最高病毒抑制率均显著高于未修饰的党参多糖组(P＜0.05)，表明硫酸化修饰能显著提高党参多糖的抗病毒活性。各硫酸化多糖组相比，sCPPS₂和sCPPS₆组最高，显著高于sCPPS₅和sCPPS₈组，表明sCPPS₂和sCPPS₆的抗病毒活性最强(表3)。

表3先加多糖后加病毒时各组细胞的A₅₇₀值

注：^a-d同列数据标注不同字母者差异显著(P＜0.05)；^A-C同行数据标注不同字母者差异显著(P＜0.05)。以下2表同。

②先加病毒后加多糖时，sCPPS₂在12.5μg·mL^-1、sCPPS₅在6.25μg·mL^-1和25μg·mL^-1、sCPPS₆在3.125～6.25μg·mL^-1、sCPPS₈在12.5μg·mL^-1、CPPS在25μg·mL^-1时的A₅₇₀值显著大于病毒对照组(P＜0.05)，表明它们在这些浓度有显著的抗病毒作用。sCPPS₆的其余4个浓度、sCPPS₂、sCPPS₅和sCPPS₈的其他2个浓度的A₅₇₀值大于病毒对照组，表明它们有抗病毒作用(表4)。

各硫酸化党参多糖组的最高病毒抑制率均显著高于未修饰的党参多糖组(P＜0.05)，表明硫酸化修饰能显著提高党参多糖的抗病毒活性。各硫酸化多糖组相比，sCPPS₈组最高，显著高于其余3组，表明sCPPS₈的抗病毒活性最强(表4)。

表4先加病毒后加多糖时各组的细胞A₅₇₀值

③多糖与病毒感作后加时，sCPPS₂和sCPPS₅在6.25～25μg·mL^-1、sCPPS₆和sCPPS₈的5个浓度、CPPS在3.125～6.25μg·mL^-1时的A₅₇₀值显著大于病毒对照组(P＜0.05)，表明它们在这些浓度有显著的抗病毒作用。sCPPS₂和sCPPS₅的其余2个浓度的A₅₇₀值大于病毒对照组，表明它们有抗病毒作用(表5)。

各硫酸化党参多糖组的最高病毒抑制率均显著高于未修饰的党参多糖组(P＜0.05)，表明硫酸化修饰能显著提高党参多糖的抗病毒活性。各硫酸化多糖组相比，sCPPS₆和sCPPS₈组最高，显著高于其余2组，表明sCPPS₆和sCPPS₈的抗病毒活性最强(表5)。

表5多糖和病毒感作后加时各组的细胞A₅₇₀值

以上三种给药方式的结果均显示，天然党参多糖的抗病毒作用微弱，通过硫酸化修饰能显著提高其抗病毒活性；6号硫酸化党参多糖(取代度为1.26)在两种给药方式中的病毒抑制率最高(分别为76.5％～83.3％)，表明其抗病毒作用最强，可以作为研制新型抗病毒药物的材料。

Claims (1)

1.一种取代度为1.26的硫酸化党参多糖在制备抗鸡新城疫病毒的药物中的应用，其特征在于所述的硫酸化党参多糖是采用包括下述步骤的方法制备的：

1)提取党参多糖：

用水煎-超声醇沉法：取党参饮片500g，粉碎，置于索式提取器中，用80％乙醇回流3次，至回流液接近无色，药渣加入20倍水中，80℃超声，功率80W，每次10min，预处理2次，再煎煮3次，第一次2h，第二次1h，第三次0.5h，合并三次滤液，浓缩至650mL，加95％乙醇使醇浓度达到80％，静置过夜，离心取沉淀，再用乙醇、丙酮洗涤，干燥，得到粗党参多糖；

2)纯化党参多糖：

2.1)去蛋白：将粗党参多糖配成5％的水溶液，首先用反复冻融法，-20℃冷冻、室温下缓慢融化，5000rpm离心，除去部分蛋白，然后加入溶液体积1/5的三氯甲烷，随之加入三氯甲烷体积1/5的正丁醇，剧烈震荡20min，5000rpm离心20min，分去水层与有机层交界处的变性蛋白，反复处理6次；

2.2)去色素：将去蛋白的多糖溶液加入1％活性炭，旋转蒸发仪处理10min，抽滤去除沉淀；

2.3)柱层析：湿法装Sephadex G-75层析柱，用0.9％NaCl冲洗，平衡，过夜，取去色素的多糖溶液上样，开启恒流泵，用0.9％NaCl洗脱，流速控制在30mL/h，收集洗脱液，10mL/管，每隔4管用苯酚-硫酸法测定糖含量，绘制多糖洗脱曲线，合并含糖管洗脱液，适当浓缩，加入95％乙醇沉淀，干燥，得纯化的党参多糖；

3)党参多糖的硫酸化修饰

3.1)酯化试剂制备：将带有搅拌和冷凝装置的三颈烧瓶置冰盐水浴中，加入50mL无水吡啶，快速搅拌，充分冷却后，按氯磺酸-吡啶体积比1∶8逐滴加入氯磺酸，于40min内加完，反应结束后，撤去冰盐水浴；

3.2)修饰操作：精密称取纯化的党参多糖400mg加入装有酯化试剂的三颈烧瓶中，反应温度为80℃，反应时间为1h，搅拌反应；反应结束后冷却至室温，反应液加入预冷的100mL冰水中，用5mol/L的NaOH溶液中和至pH 7，加入3倍体积的无水乙醇，静置24h，取沉淀用自来水透析2d、蒸馏水透析1d，透析液冷冻干燥得硫酸化党参多糖；产物量达728mg；取代度达1.26。