CN101362805A - 黄芪多糖的提取和分子修饰方法 - Google Patents

Abstract

本发明为黄芪多糖的提取和分子修饰方法，属于中药多糖的制备和结构改造技术领域。用氯磺酸一吡啶法进行硫酸化分子修饰，以产物量和硫酸根取代度为指标，以反应温度、试剂配比和反应时间为因素，用正交试验优选出黄芪多糖氯磺酸一吡啶法修饰的最佳条件为反应温度95℃、氯磺酸与吡啶的配比1∶6、反应1h。取黄芪煎液第一次缓慢加入乙醇使终浓度达50％，去沉淀；上清液再加入乙醇使终浓度达60％，取沉淀得到粗多糖，黄芪多糖纯化后用优化的条件修饰，通过系列抗病毒和增强免疫活性比较，所得黄芪多糖经纯化和硫酸化修饰后其抗病毒和增强免疫活性最强。

Description

黄芪多糖的提取和分子修饰方法

一、技术领域

本发明为黄芪多糖(Astragalus polydsaccharide，APS)的提取和分子修饰方法，属于提高中药多糖结构改造研究领域。

二、背景技术

多糖是生物体内除蛋白质和核酸外又一类重要的生物大分子物质，具有抵抗感染、增强免疫、防治肿瘤和病毒性肝炎、类风湿症、艾滋病等免疫损伤或免疫缺损症和抗氧化等多方面的功能和生物活性。随着化学和生物学的快速发展和分离技术的提高，多糖的生物学功能，特别是作为生命物质参与生命的全部时间和空间功能，突破了多糖作为支持组织和能量来源的传统观念，发现其具有更广泛的生物学功效，特别是具有免疫增强、抗病毒等功效使得多糖物质成为人类及动植物医疗、保健、病虫害防治领域的重要成员。多糖的研究已成为天然药物研究和生命科学研究的热点之一。

在对多糖的结构及其活性的研究中，科技人员注意到以下问题：①自然界中存在的多糖并不都具有活性。②有些多糖由于结构或理化性质等障碍而不利于其生物学活性的发挥。③也有些多糖尽管药效良好，但同时也会产生一些不良反应，甚至毒副作用。④有些从天然生物体内分离的多糖活性较弱，有待进一步提高。因此，采取一定的方法对多糖结构进行适当修饰是解决以上问题的根本途径，通过结构修饰能提高或赋予多糖活性、降低某些多糖的毒副作用。

黄芪是补肾壮阳中药，其有效成分黄芪多糖具有显著的抗病毒和增强免疫作用。本研究室前期以黄芪为主药研制成功中药芪蓝抗毒饮。为进一步提高中药芪蓝抗毒饮的功效，本发明首次对黄芪多糖进行分子修饰，发现硫酸化修饰能进一步黄芪多糖的抗病毒和增强免疫活性；以筛选出硫酸化黄芪多糖替代芪蓝抗毒饮中的黄芪或加味后，方剂的抗病毒效果进一步增强。

三、发明内容

技术问题

本发明针对中药多糖生物活性低的问题，提供黄芪多糖的提取和分子修饰方法，达到寻找活性最强的黄芪多糖和进一步提高黄芪多糖的生物活性的目的。

技术方案

黄芪多糖的分子修饰方法，其特征在于，用氯磺酸—吡啶法对黄芪多糖进行硫酸化分子修饰，其修饰条件为反应温度95℃、氯磺酸与吡啶的质量配比为1:6、反应时间1h。

所用黄芪多糖的提取方法为分步醇沉法，取黄芪煎液第一次缓慢加入乙醇使终浓度达50％，去沉淀；上清液再加入乙醇使终浓度达60％，取沉淀得到粗多糖，纯化而得。

以筛选出的硫酸化黄芪多糖替代芪蓝抗毒饮中的黄芪或加味后，比较方剂的抗病毒和增强免疫效果。

有益效果

1、建立了黄芪多糖的硫酸化分子修饰方法，以产物量和硫酸根取代度为指标，以反应温度、试剂配比、反应时间为因素，通过正交实验优化了黄芪多糖硫酸化修饰的条件为反应温度95℃、氯磺酸与吡啶的配比1:6、反应时间1h。

2、比较了黄芪多糖硫酸化分子修饰前后的生物活性变化，证明硫酸化修饰能进一步提高后黄芪多糖的抗病毒和增强免疫活性。

3、比较了一步醇沉和分步醇沉法所得黄芪多糖经硫酸化分子修饰以后的活性变化，证明分步醇沉中以醇沉浓度为60％的效果最好，所得黄芪多糖经硫酸化修饰后其抗病毒和增强免疫活性最强。

4、以筛选出的硫酸化黄芪多糖sAPS₆₀替代芪蓝抗毒饮中的黄芪或加味后，方剂的抗病毒和增强免疫效果进一步增强。

与现有技术相比，本发明优点如下：

1、首次建立了黄芪多糖的硫酸化分子修饰方法，优化了黄芪多糖硫酸化分子修饰的条件。

2、首次比较了黄芪多糖硫酸化分子修饰前后的生物活性变化，证明硫酸化修饰能进一步提高后黄芪多糖的抗病毒和增强免疫活性。

3、首次比较了一步醇沉和分步醇沉法所得黄芪多糖经分子修饰后的活性变化，证明分步醇沉中醇沉浓度为60％时的效果最好，所得黄芪多糖经纯化和修饰后其抗病毒和增强免疫活性最强。

4、以筛选出的硫酸化黄芪多糖替代芪蓝抗毒饮中的黄芪或加味后，进一步提高了方剂的抗病毒效果。

四、具体实施方式

1.黄芪多糖的提取

取内蒙古黄芪4kg按1：8的比例加入水，用武火煮至沸腾后，再用文火煮1.0h，滤出药渣，药渣再按1：6的比例加入水，按同法再煎煮2次，合并3次滤液，加热浓缩至4kg(1g生药/mL)。

(1)一步醇沉法：取1kg药液一次缓慢加入乙醇使终浓度达70％，搅拌，静置沉淀24h，抽滤。取沉淀加入5倍体积的蒸馏水溶解，静置5h，3000r/min离心10min除去沉淀。上清液重复沉淀1次，取沉淀60℃干燥3d，得粗总黄芪多糖(APSt)。

(2)分步醇沉法：取3kg药液第一次缓慢加入乙醇使终浓度达30％，取沉淀；上清液再加入乙醇使终浓度达40％，取沉淀；上清液再加入乙醇使终浓度达50％，取沉淀；上清液再加入乙醇使终浓度达60％，取沉淀；上清液再加入乙醇使终浓度达70％，取沉淀；上清液再加入乙醇使终浓度达80％，取沉淀。分别得到各级分粗多糖，标记为APS₃₀、APS₄₀、APS₅₀、APS₆₀、APS₇₀和APS₈₀。

2.黄芪多糖的纯化

(1)三氯乙酸法去蛋白：称取各粗多糖14g，溶解于140mL蒸馏水中，60℃水浴加热使溶解完全。加入10％ NaOH调pH至7，加入3％三氯乙酸，使占药液体积的7.5％，4℃静置4h，3000r/min离心20min，取上清液。

(2)去色素：去蛋白所得多糖溶液加入1％活性炭，文火煮沸10min，冷却，抽滤去除沉淀，4℃过夜，3000r/min离心20min，除去沉淀。

(3)柱层析：将上一步多糖溶液浓缩至50mL上D₁₀₁柱(2.6×30cm)，用蒸馏水洗脱，至加乙醇无沉淀；收集洗脱液浓缩至小体积，上ADS-7柱(2.6×30cm)，用蒸馏水洗脱，至加乙醇无沉淀；收集洗脱液浓缩至小体积，上DEAE A-25柱，0.1M NaCl梯度洗脱，9min/管，蒽酮-浓硫酸法检测多糖；合并含糖管液，自来水透析48h，去离子水透析24h；浓缩，上Sephadex G-75柱，0.1M NaCl洗脱，流速19～20mL/h，分部收集，4ml/管，蒽酮—浓硫酸法检测多糖；合并含糖管溶液，浓缩，蒸馏水透析过夜，浓缩，加入95％乙醇，沉淀置60℃真空干燥，得各纯黄芪多糖。

3.黄芪多糖的硫酸化修饰

(1)修饰条件的优化：

将带有搅拌和冷凝装置的三颈烧瓶置冰盐水浴中，加入25mL无水吡啶，快速搅拌，充分冷却后，按表1设定的氯磺酸-吡啶体积比逐滴加入氯磺酸，于40min内加完。反应结束后，撤去冰盐水浴。共制备9种酯化试剂。

表1 L₉(3⁴)正交试验设计因素水平表

精确称取黄芪多糖400mg，分别加入到9种酯化试剂中，按表1设定的水浴温度和反应时间分别在水浴中搅拌反应。反应结束后冷却至室温，反应液加入预冷的100mL冰水中，用饱和的NaOH溶液中和至pH7.5。加入3倍体积的无水乙醇，静置24h，取沉淀用自来水透析2d、蒸馏水透析1d，透析液冷冻干燥得硫酸化黄芪多糖(sulfated APS，sAPS)。共得到9种sAPS(表2)。

用氯磺酸—吡啶法进行硫酸化修饰，以产物量和硫酸基取代度为指标，以反应温度、试剂配比和反应时间为因素，按L₉(3⁴)正交实验优化修饰条件。结果，最高硫酸基取代度的组合是A₃B₁C₃，为0.898；产物量较大的组合分别是A2B₁C₂、A₃B₁C₃、A₃B₃C₁，分别为271、252、245mg(表2)。综合考虑最佳条件为反应温度95℃、氯磺酸与吡啶的配比为1：6、反应时间1h。

表2 L₉(3⁴)正交试验结果

(2)黄芪多糖的硫酸化修饰：

鉴于APS₃₀的主要成分为淀粉，APS₇₀和APS₈₀的得率太低，这3种在进一步的研究中被舍弃。用优化的修饰条件分别对APS_t、APS₄₀、APS₅₀和APS₆₀进行硫酸化修饰，得4种硫酸化黄芪多糖(Sulfated APSs)sAPS_t、sAPS₄₀、sAPS₅₀和sAPS₆₀。各修饰多糖的硫酸基取代度和产物量见表3。

表3 各修饰多糖的硫酸基取代度和产物量

(3)硫酸化黄芪多糖的红外光谱鉴定：经溴化钾压片，用Nicolet FT-IR 360型傅立叶变换红外光谱仪记录红外光谱。结果，在sAPS的光谱图上除了有多糖的吸收特征外，在1733cm^-1处出现一个由于C＝O的伸缩振动新的吸收峰，而且还有2个特征性的吸收峰：一个在1235cm^-1处，为不对称S＝O伸缩振动吸收峰；另一个在812cm^-1处，为与C-O-SO₃基团有关的对称性C-O-S吸收峰。这两个特征性吸收峰证明了硫酸基已经和多糖结合成酯。

4.硫酸化黄芪多糖的生物活性比较

(1)sAPSs对IBDV感染CEF能力的影响：首先测定4种硫酸化黄芪多糖(sAPSt、sAPS₄₀、sAPS₅₀、sAPS₆₀和未修饰的黄芪多糖(APSt)对鸡胚成纤维细胞(CEF)最大安全浓度，在此基础上，将安全浓度范围内的各多糖分别与鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)加入到CEF的培养体系中，用MTT法比较各多糖对IBDV感染CEF能力的影响(A₅₇₀值的变化，当多糖组的A₅₇₀值显著大于病毒对照组时，表明多糖有显著的抗病毒作用)。结果，未修饰的APS_t只有最大浓度4.883μg·mL^-1时的A₅₇₀值显著大于病毒对照组(P<0.05)，修饰的sAPS₆₀的5个浓度组、sAPS₅₀的前4个浓度组、sAPS₄₀在2.441～0.61μg·mL^-1和sAPSt在4.883～2.441μg·mL^-1浓度范围内各组的A₅₇₀值显著大于病毒对照组(P<0.05)(表4)。表明它们在这些浓度显著促进CEF抵抗IBDV感染，且修饰的sAPS较未修饰的APS抗病毒活性显著增强。

表4 sAPSs对IBDV感染CEF能力的影响(A₅₇₀值)

注：同列数据标注不同字母者差异显著(P<0.05)。

(2)sAPSs对NDV感染CEF能力的影响：将安全浓度范围内的各多糖分别与鸡新城疫病毒(NDV)加入到CEF的培养体系中，用MTT法比较各多糖对NDV感染CEF能力的影响。结果，未修饰的APS_t的前4个浓度组的A₅₇₀值与病毒对照组的差异不显著，修饰的sAPS₆₀的5个浓度组、sAPS₅₀的前4个浓度组的A₅₇₀值显著大于病毒对照组(P<0.05)(表5)。表明它们在这些浓度显著促进CEF抵抗NDV感染，且修饰的sAPS较未修饰的APS抗病毒活性显著增强。

表5 sAPSs对NDV感染CEF能力的影响(A₅₇₀值)

(3)sAPSs对雏鸡人工感染ND的疗效比较：18日龄蛋公鸡150只，随机均分为6组，每组25只。第1～4组为4个多糖治疗组，第5组为病毒对照组(攻毒不治疗)，第6组为空白对照组(不攻毒，不治疗)，隔离饲养。各多糖组、病毒对照组每只肌肉注射ND病毒0.5mL，攻毒6h后多糖治疗组开始分别饮水给药，1mL/只，每天1次，连续3d。每天记录各组死亡数，至攻毒后停止死亡时(D14)计算死亡率。结果，APS_t、sAPS₄₀、sAPS₅₀、sAPS₆₀组的死亡率均低于病毒对照组，其中sAPS₆₀组的死亡率显著低于病毒对照组(P<0.05)(表6)。说明sAPS₆₀治疗ND有明显的效果，sAPS₄₀和sAPS₅₀也有一定的效果。

表6 各组死亡数和死亡率

^*与病毒对照组相比差异显著(P<0.05)。

(4)sAPSs对新城疫疫苗免疫雏鸡血清抗体效价的影响：14日龄雏鸡200只，随机均分为10组，在用新城疫弱毒苗免疫的同时，6个试验组分别肌肉注射高、低剂量的3种修饰的硫酸化黄芪多糖(sAPSs)sAPS₄₀、sAPS₅₀和sAPS₆₀，2个多糖对照组注射高、低剂量的未修饰的黄芪多糖(APS_t)，无佐剂对照组注射等量生理盐水，每天1次，连续3d，空白对照隔离饲养。分别于免疫后第7、14、21、28d翼静脉采血测定血清抗体效价的变化；于免疫后第14、21、28和35d心脏采血，用MTT法测定T淋巴细胞增殖。

结果，免疫后14d，sAPS_40H、sAPS_50H和sAPS_50L组的ND-HI抗体效价显著大于无佐剂对照组和APS_t的高、低剂量组(P<0.05)；免疫后21d，sAPS_40H、sAPS_50H、sAPS_50L、sAPS_60H、sAPS_60L、APS_tH和APS_tL组的ND-HI抗体效价显著大于无佐剂对照组(P<0.05)，sAPS_60H组显著大于APStL组；免疫后28d，sAPS_50L和sAPS_60L组的ND-HI抗体效价显著大于无佐剂对照组和APSt的高、低剂量组(P<0.05)(表7)。表明3个修饰多糖在一定的剂量均能提高显著血清的NDV抗体效价，在一定的时间点的作用强于APS_t。

表7 各组血清ND-HI抗体效价的动态变化

注：同列数据标注不同字母者差异显著(P<0.05)，H高剂量，L低剂量，下表同。

(5)sAPSs对新城疫疫苗免疫雏鸡外周血淋巴细胞增殖的影响：试验设计同上，分别于免疫后第14、21、28和35d心脏采血，用MTT法测定T淋巴细胞增殖。结果，免疫后14d，sAPS_40H、sAPS_40L、sAPS_50L、sAPS_60H、sAPS_60L和APS_tL组的A₅₇₀值显著大于无佐剂对照组(P<0.05)，sAPS_40L和sAPS_60L组显著大于APS_t的高、低剂量组(P<0.05)；免疫后21d，sAPS_40L、sAPS_50L和sAPS_60L组的A₅₇₀值显著大于无佐剂对照组和APS_tH组(P<0.05)；免疫后28d，各多糖组的A₅₇₀值均显著大于无佐剂对照组(P<0.05)，sAPS_60L组显著大于APS_t的高、低剂量组(P<0.05)；免疫后35d，sAPS_50H和APS_tH组的A₅₇₀值显著大于无佐剂对照组(P<0.05)，sAPS_50H组显著大于APS_tL组(P<0.05)(表8)。表明3个修饰多糖在一定的时间点均能显著促进雏鸡外周血T淋巴细胞增殖，作用强于APS_t。

表8 外周血T淋巴细胞增殖的动态变化(A₅₇₀)

以上结果表明，3种修饰多糖均能显著提高新城疫血清抗体效价、促进T淋巴细胞增殖，作用强于未修饰多糖，并有一定的量效和时效关系，高剂量提高血清抗体效价、低剂量促进T淋巴细胞增殖的效果较好，综合评价以sAPS₆₀最好。

(6)sAPSs对法氏囊疫苗免疫雏鸡血清抗体效价的影响：14日龄雏鸡200只，随机均分为10组，6个试验组分别肌肉注射高、低剂量的3种修饰的硫酸化黄芪多糖(sAPSs)sAPS₄₀、sAPS₅₀和sAPS₆₀，2个多糖对照组注射高、低剂量的未修饰的黄芪多糖(APS_t)，无佐剂对照组注射等量生理盐水，每天1次，连续3d，在给药后4d用法氏囊苗免疫，两周后进行法氏囊苗二免。分别于一免后第7、14、21、28d翼静脉采血测定血清抗体效价。

结果，一免后第7、14d，用琼脂扩散法测不出血清中IBD抗体效价。一免后21d(二免后7d)，sAPS_40L和sAPS_60L组的IBD抗体效价显著大于无佐剂对照组(P<0.05)，sAPS_60L的IBD抗体效价显著大于APS_t的高、低剂量组(P<0.05)；一免后28d(二免后14d)，所有硫酸化黄芪多糖高、低剂量组和APS_t高剂量组的IBD抗体效价均显著大于无佐剂对照组和APS_t低剂量组(P<0.05)(表9)。表明3个修饰多糖在一定的剂量均能显著提高血清的IBD抗体效价，在一定的时间点的作用强于APS_t。

表9 各组血清IBD抗体效价的动态变化

注：同列数据标注不同字母者差异显著(P<0.05)，H高剂量，L低剂量。

(7)sAPSs对法氏囊疫苗免疫雏鸡外周血淋巴细胞增殖的影响：试验设计同上，分别于一免后第7、14、21、28d心脏采血测定T淋巴细胞增殖。结果，一免后7d，sAPS_40H、sAPS_40L、sAPS_50L、sAPS_60H、sAPS_60L和APS_tL组的A₅₇₀值显著大于无佐剂对照组(P<0.05)，sAPS_40L和sAPS_60L组显著大于APS_t的高、低剂量组(P<0.05)；免疫后14d，sAPS_40L、sAPS_50L和sAPS_60L组的A₅₇₀值显著大于无佐剂对照组和APS_tH组(P<0.05)；免疫后21d，各多糖组的A₅₇₀值均显著大于无佐剂对照组(P<0.05)，sAPS_60L组显著大于APSt的高、低剂量组(P<0.05)；免疫后28d，sAPS_50H和APS_tH组的A₅₇₀值显著大于无佐剂对照组(P<0.05)，sAPS_50H组显著大于APS_tL组(P<0.05)(表10)。表明3个修饰多糖在一定的时间点均能显著促进雏鸡外周血T淋巴细胞增殖，作用强于APS_t。

表10 外周血T淋巴细胞增殖的动态变化(A₅₇₀)

以上结果表明，3种修饰多糖均能显著提高法氏囊血清抗体效价、促进T淋巴细胞增殖，作用强于未修饰多糖，并有一定的量效和时效关系，高剂量提高血清抗体效价、低剂量促进T淋巴细胞增殖的效果较好，综合评价以sAPS₆₀最好。

(8)sAPS₆₀替代芪蓝抗毒饮中黄芪或加味对雏鸡人工感染ND的疗效比较：22日龄蛋公鸡228只，随机分为5组，每组47只。第1～3组为芪蓝抗毒饮加味方(简称加味方)、芪蓝抗毒饮替代方(简称替代方)和芪蓝抗毒饮(简称原方)组，第4组为病毒对照组(攻毒不治疗)，第5组为空白对照组40只(不攻毒，不给药)，隔离饲养。各方剂组、病毒对照组每只肌肉注射0.5mLND病毒攻毒，攻毒6h后各方剂组开始饮水给药，1mL/只，每天1次，连续4天。每天观察死亡数，连续观察14天，计算死亡率。

结果，加味方组的死亡率最低，其次为替代方组，两组均显著低于病毒对照组(P<0.01)，明显低于原方组；病毒对照组的死亡率最高(表11)。说明加味方和替代方能提高芪蓝抗毒饮治疗ND的效果，加味方优于替代方。

表11 各组的死亡数和死亡率

注：^*显著低于病毒对照组(P<0.01)。

Claims (2)

1.黄芪多糖的分子修饰方法，其特征在于，用氯磺酸—吡啶法对黄芪多糖进行硫酸化分子修饰，其修饰条件为反应温度95℃、氯磺酸与吡啶的质量配比为1:6、反应时间1h。

2.根据权利要求1所述黄芪多糖的分子修饰方法，其特征在于，所用黄芪多糖的提取方法为分步醇沉法，取黄芪煎液第一次缓慢加入乙醇使终浓度达50％，去沉淀；上清液再加入乙醇使终浓度达60％，取沉淀得到粗多糖，纯化而得。