CN103739733B - 一种抗鸭病毒性肝炎山豆根多糖及其分子修饰物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗鸭病毒性肝炎山豆根多糖及其分子修饰物，属于中兽药制备技术领域。提取了山豆根多糖不同醇沉部分，经反复临床试验筛选出抗鸭病毒性肝炎(DVH)活性部位，再用正交法确定氯磺酸-吡啶硫酸化修饰山豆根多糖活性部位的最佳条件为：反应温度95℃，反应时间2h，氯磺酸-吡啶配比1∶5，经红外光谱分析所得产物为山豆根多糖硫酸酯，其总糖含量达83.77％，硫酸根含量达39.33％，产物得率达117.33％。山豆根多糖硫酸酯抗DHV-1感染鸭胚肝细胞作用和对DVH的疗效显著强于山豆根多糖。本发明所获得的抗DVH山豆根多糖活性部位硫酸酯具有较高的糖和磷酸根含量，及较高产物得率，对DVH有良好疗效。

Description

一种抗鸭病毒性肝炎山豆根多糖及其分子修饰物

一、技术领域

本发明涉及一种抗鸭病毒性肝炎山豆根多糖及其分子修饰物，属于中兽药制备技术领域。

二、背景技术

鸭病毒性肝炎是鸭肝炎病毒(DHV)感染引起的一种传播迅速、高发病率、高致死性疫病。1949年首次分离到该病毒，目前已呈全世界范围分布。DHV主要存在DHV-1及其变异株、DuckAstrovirus以及DHV-3三个血清型，其中DHV-1型毒性最强、分布最广，主要侵染3周龄以内的雏鸭，病死率高于80％，甚至可高达100％，是严重危害养鸭业主要病原之一。

目前，世界范围内临床上还没有有效的抗DHV-1药物，主要通过对种鸭或雏鸭注射弱毒苗进行免疫防御。临床病例一旦出现，即造成难以挽回的损失。1958年Gerber等首先发现海藻多糖具有抗病毒作用，此后多种多糖及硫酸化多糖的抗病毒作用陆续被报道。近年来，本实验室也发现了黄芪、香菇、当归等多种中药多糖能显著抵抗新城疫、传染性法氏囊病等病毒的感染。中药化合物结构修饰是提高其水溶性和生物活性的主要手段之一。许多学者发现，中药多糖成分、皂苷等成分硫酸化或磷酸化修饰后，使其成酯化物，其水溶性普遍增加，免疫药理作用明显增强。

山豆根是一种经典的清热解毒用中药。现代药理学研究表明，山豆根多糖是其主要有效成分之一，具有良好的抗氧化作用。虽然有学者发现，经过硫酸化修饰的硫酸化山豆根多糖在体外对肝炎病毒表现出良好的抑制作用。但由于不同的药物对同一种病毒的作用并不一致，同一种药物对不同的病毒也表现出不同的作用。我们发现，按照不同的条件修饰中药多糖所获得的多糖成分修饰物也有所不同，其作用大相径庭。为研究有效的抗鸭病毒性肝炎药物，我们根据前期的预试验，将分离获得并经在体试验验证有效的山豆根多糖采用氯磺酸吡啶法进行了修饰，并采用正交试验比较优化了其制备工艺，以进一步提高其生物活性和生物利用率。

本发明首次将山豆根多糖抗鸭病毒性肝炎有效部位进行硫酸化分子修饰，并采用正交法优化了抗鸭病毒性肝炎山豆根多糖活性部位硫酸化分子修饰条件，发现硫酸化分子修饰能显著增加山豆根多糖抗鸭病毒性肝炎效果，提高其生物利用度，并获得较高的产物得率。

三、发明内容

技术问题本发明针对世界范围内临床上还没有有效的抗鸭病毒性肝炎药物问题，提供一种山豆根多糖抗鸭病毒性肝炎有效部位的硫酸化分子修饰方法，所获得的山豆根多糖硫酸酯(sBSRPS₆₅)总糖含量达83.77％，硫酸根含量为39.33％，产物得率达117.33％，且对鸭病毒性肝炎的治疗作用明显提高，可望最终应用于鸭病毒性肝炎的临床防治。

技术方案

采用水煎醇沉法，收集不同醇沉部位山豆根多糖，经数次临床试验发现山豆根多糖乙醇浓度65％醇沉部分(BSRPS₆₅)对鸭病毒性肝炎有较理想的治疗效果，再用正交试验法对BSRPS₆₅的硫酸化分子修饰方法进行优化。经优化后的山豆根多糖抗鸭病毒性肝炎有效部位的硫酸化分子修饰方法为：将带有搅拌装置的三颈烧瓶置于冰中，加入无水吡啶20mL，剧烈搅拌，使之充分冷却，按氯磺酸-吡啶的配比为1∶5的比例将氯磺酸逐滴缓慢加入，冷却后于65～95℃水浴锅上融化成淡黄色液体。精密称取抗鸭病毒性肝炎山豆根多糖活性部位(BSRPS₆₅)300mg，加入酯化试剂，95℃反应2h。反应结束后立即加入100mL冰水，用饱和氢氧化钠溶液(20.0mol／L)调pH至7后放入透析袋中，用自来水流水透析2d、蒸馏水流水透析1d，将透析袋中的硫酸化多糖浓缩并冷冻干燥后得硫酸化山豆根多糖。经NicoletFT-IR200型傅立叶变换红外光谱仪分析为山豆根多糖硫酸酯(sBSRPS₆₅)。按此方法制备的山豆根多糖硫酸酯总糖含量达83.77％，硫酸根含量为39.33％，产物得率达117.33％，入水即溶。对体外培养的鸭胚肝细胞的毒性显著降低。

有益效果

病毒性疾病已经成为目前人类和动物健康的最大威胁之一，并造成了巨大的社会经济损失。近年来肆虐人类的禽流感、甲流、艾滋病、非典、流感、肠道病毒EV71型等等，肆虐动物的禽流感、新城疫、蓝耳病、圆环病毒2型、伪狂犬病、细小病毒病、鸭病毒性肝炎等等，都使人类和动物生命健康遭受了严重的威胁。病毒性疾病肆虐人畜的一个重要原因是人类对于这些烈性病毒目前尚没有临床特效的药物。曾今的抗流感病毒特效药“达菲”现在对H5N1、H7N9却不再那么有效。虽然三氮唑核苷、盐酸金刚乙胺、无环鸟苷等抗病毒药对病毒病也有一定的临床疗效，但是其引起的恶心、精神紊乱、腹泻、肝肾功能损伤、眩晕等等不良反应和药物残留，这些医源性、药源性疾病的不断增加使得人们开始拒绝这些抗病毒西药，转而选择毒副作用小的中草药，目前已有40％以上的消费者选择了中药或中西结合治疗。而在养殖业中，病毒性疾病仍然是目前养禽业危害最大的疫病之一，随着金刚烷胺、利巴韦林等抗病毒西药的全面被禁用，动物药品市场上治疗动物病毒病的西药出现了空档。由于世界范围内临床上尚还没有有效的抗DHV-1药物，主要通过对种鸭或雏鸭注射弱毒苗进行免疫防御。临床病例一旦出现3周龄以内的感染雏鸭，其病死率往往高于80％，甚至可高达100％，造成的损失难以估量。

山豆根多糖是山豆根的主要药效成分之一，具有良好的抗病毒、抗氧化等作用，对肝炎病毒体外感染肝细胞有良好的抑制作用。兽医临床试验也发现，山豆根对鸭病毒性肝炎有一定的疗效。为研制有效的抗鸭病毒性肝炎治疗用药，并提高其生物利用度，本发明采用氯磺酸-吡啶法硫酸化分子修饰山豆根多糖抗鸭病毒性肝炎有效部位，所形成的山豆根多糖硫酸酯不仅硫酸根和糖含量高，产物得率亦很高，临床试验发现其对鸭病毒性肝炎的疗效明显增强，且水溶性良好，制剂使用更为方便。

与现有技术相比，本发明优点如下：

1.山豆根多糖硫酸化分子修饰的方法国内虽有报道[张玉，蒋小丰，张名洋，等.山豆根多糖硫酸化修饰及体外抗HBV活性测定[J].中国临床药学杂志，2011，20(3)：151-154]，但该文并没有对最佳修饰条件进行优化，其反应条件与本发明提供的条件大相径庭，且其提供的山豆根多糖为75％乙醇醇沉部位，虽对乙肝病毒感染体外培养的2215细胞有一定的抑制作用，但经临床试验验证，对鸭病毒性肝炎的临床疗效并不理想。而本发明提供了优化的山豆根多糖硫酸化分子修饰条件，且本发明所用山豆根多糖为抗鸭病毒性肝炎有效部位(BSRPS₆₅)，目前国内外尚未见相似研究。

2.通过本发明实施所获得的山豆根多糖硫酸酯糖含量达83.77％，硫酸根含量为39.33％，产物得率达117.33％，而且具有良好的水溶性，入水即溶，制剂使用方便。

3.通过本发明实施所获得的山豆根多糖硫酸酯不仅对鸭肝炎病毒DHV-1感染体外培养的鸭胚肝细胞作用显著优于未修饰山豆根多糖(BSRPS₆₅)，且对DHV-1攻毒感染鸭的治疗作用也优于未修饰的山豆根多糖(BSRPS₆₅)。

四、具体实施方式

1.山豆根多糖的提取及有效部位筛选

称取1000g山豆根，加10倍量水浸泡3h，加热煮沸1h，收集煎煮液，反复3次；合并收集的煎煮液，煮沸浓缩至1000mL，用高速离心机离心，取上清。缓慢向浓缩液中加入不同体积分数为95％的乙醇，使溶液中乙醇含量分别为50％、65％、75％、80％，静置过夜，分别离心收集沉淀。经流水透析后，真空浓缩，3000rpm／min，离心20min，上清再次加入不同体积分数95％乙醇沉淀，重复透析、浓缩、离心后，60℃真空干燥，碾碎，分别得到山豆根多糖不同醇沉部位BSRPS₅₀、BSRPS₆₅、BSRPS₇₅、BSRPS₈₀和总多糖BSRPSt。

3日龄非免樱桃谷鸭随机均分7组，每组31羽，分别为空白对照组、攻毒对照组和5个不同醇沉部位山豆根多糖组。除空白对照组外，其余6组鸭分别肌肉注射鸭肝炎病毒DHV-10.2mL／羽后，1h后各多糖组分别于饮水中添加多糖饮喂，5mg／羽.天，连续3天，每天观察记录各组鸭死亡情况，死亡鸭及时逐只剖检观察病变，剔除无病变雏鸭，待全群鸭停止死亡时，统计各组存活率。结果发现，山豆根多糖不同醇沉部位BSRPS₅₀、BSRPS₆₅、BSRPS₇₅、BSRPS₈₀和总多糖BSRPSt及攻毒对照组各组存活率依次为16.13％、35.48％、22.58％、16.13％、19.35％和0％。其中65％醇沉部位BSRPS₆₅的存活率显著高于攻毒对照组，并远高于其他醇沉部位。

2.山豆根多糖硫酸化分子修饰及条件优化

采用氯磺酸-吡啶法硫酸化分子修饰山豆根多糖(BSRPS₆₅)。根据单因素预试验结果，反应温度、试剂比例，反应时间对多糖硫酸化修饰的影响较大，采用正交试验设计方法，选取反应温度(A)、氯磺酸与吡啶的配比(B)和反应时间(C)为因素，确定三个水平，按照正交表L₉(3⁴)(表1)设计正交试验。

将带有搅拌装置的三颈烧瓶置于冰中，加入无水吡啶20mL，剧烈搅拌，使之充分冷却，按表1氯磺酸-吡啶的配比将氯磺酸逐滴缓慢加入，冷却后于65～95℃水浴锅上融化成淡黄色液体。称取抗鸭病毒性肝炎山豆根多糖活性部位(BSRPS₆₅)300mg，加入酯化试剂，按表1设计的反应温度和反应时间分别在恒温水浴振荡器上反应。反应结束后立即加入100mL冰水，用饱和氢氧化钠溶液(20.0mol／L)调pH至7后放入透析袋中，用自来水流水透析2d、蒸馏水流水透析1d，将透析袋中的硫酸化多糖浓缩并冷冻干燥后得硫酸化山豆根多糖。

表1因素和水平

从表2中可以看出，反应温度对产物量的影响最大，反应时间对糖含量的影响最大，氯磺酸-吡啶的配比对硫酸根含量的影响最大：反应温度为95℃时，产物量最多，因此山豆根多糖硫酸化的反应温度应该为95℃；反应时间为2h时，糖含量最高，因此山豆根多糖硫酸化的反应时间为2h；氯磺酸-吡啶的配比为1∶5时硫酸根含量最高，因此山豆根多糖硫酸化的氯磺酸-吡啶的配比为1∶5。综合分析，最佳组合为A₃B₁C₂.即调节反应体系反应温度95℃，氯磺酸-吡啶的比例为1∶5，反应时间3h为最佳。

表2L₉(3⁴)正交试验结果

按照最佳条件，再次用300mg山豆根多糖(BSRPS₆₅)进行硫酸化分子修饰，结果发现，其山豆根多糖含量为44.44％，硫酸根含量为39.33％，产物得率达117.33％，因此山豆根多糖硫酸酯总糖含量达83.77％。所获得的山豆根多糖硫酸酯分别用蒸馏水、PBS和细胞培养液溶解，加入后轻微振摇，均立刻溶解，溶液呈均质淡棕色，对光观察，无明显可视沉淀物。表明山豆根多糖(BSRPS₆₅)经过硫酸化分子修饰形成山豆根多糖硫酸酯(sBSRPS₆₅)后，水溶性显著增加，制剂使用更为方便。

3.山豆根多糖硫酸化分子修饰产物红外光谱分析

采用KBr压片法以NicoletFT-IR200型傅立叶变换红外光谱仪分析上述最佳条件修饰的山豆根多糖硫酸化分子修饰产物(见图1)，山豆根多糖(BSRPS₆₅)和山豆根多糖硫酸化修饰物(sBSRPS₆₅)均表现出了多糖的特异性吸收峰：两者在3600-3200cm^-1处出现的宽峰是由O-H伸缩振动引起的，在3020-2820cm^-1处的吸收峰是C-H伸缩振动引起的，1620cm^-1和1420cm^-1处左右是由COO^-的伸缩振动引起的，1400cm^-1左右均出现了C-H的变角振动区，1200-950cm^-1处出现的吸收峰群是C-O-C和C-O-H伸缩振动引起的。另外sBSRPS₆₅还表现出了硫酸酯的特异性吸收峰：在1248cm^-1处左右的吸收峰是由不对称S=O伸缩振动引起的，814cm^-1处左右是与C-O-SO₃相关的对称性C-O-S吸收峰。

附图说明图1淫羊藿总黄酮磷酸化分子修饰前后红外光谱

①为山豆根多糖(BSRPS₆₅)硫酸化分子修饰前红外光谱图，②为山豆根多糖(BSRPS₆₅)硫酸化分子修饰后红外光谱图。①和②红外吸收光谱基本一致，表明二者结构基本相似，未发生根本性改变。①和②在3600-3200cm^-1处出现的宽峰是由O-H伸缩振动引起的，在3020-2820cm^-1处的吸收峰是C-H伸缩振动引起的，1620cm^-1和1420cm^-1处左右是由COO^-的伸缩振动引起的，在1400cm^-1左右均出现了C-H的变角振动区，1200-950cm^-1处出现的吸收峰群是C-O-C和C-O-H伸缩振动引起的，这些均为多糖类化合物的一些特征性吸收峰。②除①的特征峰得到保留之外，在在1248cm^-1处左右的吸收峰是由不对称S=O伸缩振动引起的，814cm^-1处左右是与C-O-SO₃相关的对称性C-O-S吸收峰，这些均为硫酸酯的特异性吸收峰，证明修饰后的产物为山豆根多糖硫酸酯。

4.山豆根多糖硫酸酯对鸭肝炎病毒DHV-1感染体外培养鸭胚肝细胞的抑制作用研究

取14-16日龄鸭胚，无菌条件下取出肝脏。将取出的鸭胚肝脏去胆囊，用D-Hank′s清洗2次，剪碎后用D-Hank′s清洗3次。加入0.25％胰蛋白酶，37℃消化8～15min，吸掉胰蛋白酶，用D-Hank′s清洗3次，加入含1％青霉素钾、1％硫酸链霉素、1％L-谷氨酰胺、10％小牛血清的DMEM培养基。计数使细胞浓度在0.8×10⁶-1.2×10⁶个／mL范围内，置37℃、5％CO₂培养箱内培养，待细胞形成完整单层后，弃去细胞培养液，用D-Hank`s液洗2次待用。

将BSRPS₆₅、sBSRPS₆₅用细胞维持液分别从最大安全浓度(BSRPS₆₅和sBSRPS₆₅的最大安全浓度分别为4000μg／mL和15.625μg／mL)连续倍比稀释5个浓度。在鸭胚肝细胞单层中每孔各加入病毒70μL，培养2h后弃去病毒液，用D-Hank’s反复清洗3遍，弃去清洗液，分别加入70μL稀释后受试药物，每药各浓度重复5孔。同时设细胞对照(CC)和病毒对照(VC)，置38℃5％CO₂培养箱内培养，当VC组出现明显病变时，用MTT法检测^[15]，读取A₅₇₀值。同时计算病毒抑制率=(A_{570.药+病毒}-_A570.VC)／(A_570.CC-A_570.VC)×100％。以A₅₇₀值和病毒抑制率综合分析药物的抗病毒作用。结果见表3。BSRPS₆₅在2000～250μg／mL时，其A₅₇₀值显著高于病毒对照组，在这几个浓度内，BSRPS₆₅均表现出了显著的抗DHV-1感染作用。sBSRPS₆₅在安全浓度范围的5个浓度A₅₇₀值均显著高于病毒对照组，均表现出抗DHV-1感染作用。sBSRPS₆₅的病毒抑制率为39.32％～58.25％，BSRPS₆₅在其最大安全浓度时并未表现病毒抑制的作用，其余四个浓度的抑制率为20.27％～53.38％，sBSRPS₆₅对DHV-1的抑制率明显高于BSRPS₆₅。

表3BSRPS₆₅和sBSRPS₆₅体外抗DHV-1作用的A₅₇₀值和病毒抑制率

注：同列数据标不同字母者差异显者(P<0.05)。

5.山豆根多糖硫酸酯对鸭肝炎病毒DHV-1攻毒感染雏鸭的治疗作用研究

将240只4日龄樱桃谷鸭随机均分成4组：第1组为BSRPS₆₅治疗组，60只；第2组为sBSRPS₆₅治疗组，60只；第3组为病毒对照(VC)组，60只；第4组为空白对照(BC)组(隔离饲养)，30只。将1-3组的雏鸭肌肉注射DHV-1病毒0.2mL攻毒。攻毒后立即按如下方案于饮水中混饮给药：BSRPS₆₅治疗组4mg/只.天；sBSRPS₆₅治疗组2mg/只.天；每天1次，连续5d。于攻毒后的急性期(4h和8h)和稳定期(54h)各组随机采取5只鸭采血，并用肝素抗凝，用real-timePCR测定血液病毒含量。每天观察各组鸭的临床症状及死亡情况，记录各组死亡数，死亡鸭及时逐只剖检观察病变，剔除无病变雏鸭，待全群鸭停止死亡时，统计各组死亡率(剔除采血雏鸭)，存活的鸭全面扑杀。

结果见表4。VC组的死亡率为100％；BSRPS₆₅治疗组的死亡率为66.67％，显著低于VC组；sBSRPS₆₅治疗组的死亡率为57.78％，显著低于VC组；BSRPS₆₅治疗组较sBSRPS₆₅治疗组低8.89个百分点，二者间没有显著性差异。说明山豆根多糖(BSRPS₆₅)对鸭病毒性肝炎有较好的疗效，硫酸化分子修饰后所获得的山豆根多糖硫酸酯(sBSRPS₆₅)的治疗效果优于未修饰的山豆根多糖(BSRPS₆₅)。

表4BSRPS₆₅和sBSRPS₆₅对感染DHAV雏鸭死亡率的影响

注：同列数据标不同字母者差异显著(p<0.05)。

／：BC组没有死亡，停止死亡时间无法计算。

Claims (4)

1.一种抗鸭病毒性肝炎山豆根多糖硫酸化分子修饰的方法，采用氯磺酸-吡啶法硫酸化分子修饰山豆根多糖，其特征在于：

(1)采用水煎醇沉法，收集了5个不同醇沉部位的山豆根多糖添加于饮水中治疗鸭肝炎病毒DHV-1攻毒鸭，数次临床试验发现5个醇沉部位的山豆根多糖均对鸭病毒性肝炎具有一定的治疗作用，以山豆根多糖65％醇沉部分BSRPS₆₅对鸭病毒性肝炎的治疗效果较理想；

(2)抗鸭病毒性肝炎山豆根多糖硫酸化分子修饰的方法：将带有搅拌装置的三颈烧瓶置于冰中，加入无水吡啶20mL，使之充分冷却，按氯磺酸：吡啶为1∶5～9的比例逐滴缓慢加入氯磺酸，剧烈搅拌，冷却后置水浴锅上融化成淡黄色液体；称取山豆根多糖65％醇沉部分BSRPS₆₅300mg，加至上述淡黄色液体中，于65～95℃水浴锅上反应1～3h；反应结束后立即加入100mL冰水，用20.0mol·L^-1氢氧化钠溶液调pH至7后放入透析袋中，再用自来水流水透析2d、蒸馏水流水透析1d，将透析袋中的液体浓缩并冷冻干燥后即得硫酸化山豆根多糖。

2.根据权利要求1所述的一种抗鸭病毒性肝炎山豆根多糖硫酸化分子修饰的方法，其特征在于，硫酸化分子修饰山豆根多糖的最佳条件为：反应温度95℃、反应时间2h、氯磺酸-吡啶的配比为1∶5；在最佳条件下硫酸化分子修饰山豆根多糖65％醇沉部分BSRPS₆₅，其产物中硫酸化山豆根多糖总糖含量为83.77％，硫酸根含量为39.33％，产物得率为117.33％。

3.根据权利要求2所述的一种抗鸭病毒性肝炎山豆根多糖硫酸化分子修饰的方法，其特征在于：在最佳条件下硫酸化分子修饰山豆根多糖65％醇沉部分BSRPS₆₅，其产物硫酸化山豆根多糖的红外光谱图基本形状与修饰前一致，未发生根本性改变，均具有多糖特征吸收峰，除多糖母体特征峰得到保留之外，在1248cm^-1处出现的吸收峰是由不对称S＝O伸缩振动引起的，在814cm^-1处左右出现了C-O-SO₃相关的对称性C-O-S吸收峰，表明硫酸化分子修饰山豆根多糖65％醇沉部分BSRPS₆₅的产物为山豆根多糖硫酸酯；

且上述最佳条件下制备的硫酸化山豆根多糖对鸭肝炎病毒DHV-1感染体外培养的鸭胚肝细胞具有良好的抑制作用，对鸭肝炎病毒DHV-1攻毒感染引起的鸭病毒性肝炎具有良好的治疗作用，且其作用均优于未修饰的山豆根多糖。

4.权利要求1-3任一项所述的方法在制备抗鸭病毒性肝炎药物中的应用。