CN101690821B - 一种鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗免疫保护剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗免疫保护剂，它由以下重量份的组分组成：中药多糖8份，中药皂苷1份，酪蛋白1份。其中中药多糖和中药皂苷是从以下重量份的中药原料中提取的：党参30份、白术20份、猪苓15份、泽泻15份、茯苓10份、车前草10份。本发明主要体现在特异的中药有效成分引导免疫原在特定的机体部位产生特定的免疫反应，也体现在整个疫苗的生产、加工、贮用过程中对免疫原特有的保护作用，它是首次将中药归经、免疫佐剂和免疫原保护剂合三为一的科学配方。

Description

一种鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗免疫保护剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种免疫保护剂，具体涉及一种专门针对鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗的免疫保护剂，及其制备方法。

背景技术

Morein首次提出免疫刺激复合物(ISCOM)，它是一个全新的免疫佐剂，由皂苷、胆固醇、磷脂等构成的直径为30-40nm的球形笼状颗粒(Cox JC，SjolanderA，Barr IG.ISCOMs and other saponin based adjuvants(J).Adv Drug Deiv Rev，1998，32(3)：247-271)。这种佐剂的特征在于通过皂苷高效地将免疫原递呈给单核巨噬细胞，为免疫应答奠定了强大的基础。

传统免疫佐剂是通过富集免疫原(如铝胶)、缓释免疫原(如油乳剂)、激活单核吞噬细胞递呈抗原(如卡介苗、细菌脂多糖)以及多种综合作用(如不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂)来实现对免疫原的强化免疫和改变免疫途径的佐剂作用。

近年来，中药免疫佐剂也层出不穷，比如蜂胶免疫佐剂、人参皂苷佐剂(ZL02110578.2)、当归多糖-内酯复合免疫佐剂(ZL 94115186.7)等等，它们都是利用中药有效成分激活机体免疫实来现免疫佐剂作用的。

但是，上述免疫佐剂在免疫原的加工制作过程中往往不能有效地保护免疫原的生物活性，特别是弱毒活疫苗类的免疫原，比如对弱毒活菌苗和弱毒活病毒苗的保护，因而只能局限在灭活疫苗类的免疫原中应用。

蛋白保护剂是在弱毒活疫苗类的免疫原干燥加工制作时必须添加的物质，比如氨基酸、葡糖糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、白蛋白、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮K30-35等，有时将它们配合在一起组成配方蛋白保护剂，比如：①、牛血清白蛋白10克、谷氨酸钠0.83克、磷酸二氢钾0.52克、磷酸氢二钠1.64克、蔗糖76.62克和无菌去离子水1000毫升，②、聚乙烯吡咯烷酮K30-351克、乳糖10克和无菌去离子水100毫升(王明俊等，兽医生物品学，中国农业出版社，1997年第1版，345)。这些蛋白保护剂添加到弱毒活疫苗类的免疫原溶液中，利用有限水化膜原理在弱毒活疫苗类的免疫原表面形成水化膜，保护了弱毒活疫苗类的免疫原活性蛋白的的三维立体构象和生物活性；在这类免疫原的干燥过程中，蛋白保护剂分子中的羟基、羧基等与弱毒活疫苗类的免疫原表面分子的官能团以氢键方式形成假性水化膜(傅里叶红外光谱表明，蛋白质和作为稳定剂的糖之间确实存在氢键)，保护了弱毒活疫苗类的免疫原的生物活性。但是，蛋白保护剂不具备免疫佐剂的功能。

本发明基于上述技术背景，提出一种新的免疫保护剂，具体是一种特别适用于鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗的免疫保护剂，首次发现了中药归经、免疫佐剂和蛋白保护剂合三为一的途径。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种新的免疫保护剂，它不仅利用中药归经的特点能够针对具体病原充分激活机体免疫，具有疫苗免疫佐剂作用，而且能够更加有效的保护免疫原的生物活性，具有免疫原保护作用。

本发明的目的还在于：提供所述免疫保护剂的制备方法。

所述发明目的通过以下技术方案实现：

提供一种鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗的免疫保护剂，由以下重量份的组分组成：中药多糖8份、中药皂苷1份、酪蛋白1份。

所述的中药多糖和中药皂苷均提取自以下重量份的中药原料：党参30份、白术20份、猪苓15份、泽泻15份、茯苓10份、车前草10份。

所述中药多糖是主要成分，它在水溶液中使免疫原优先水化，在干燥时利用多维网络空间氢键结构使免疫原外表形成假性水化膜，起到蛋白保护剂的作用；在动物体内通过每种中药多糖特有的归经方式增强免疫原的免疫效果，起到免疫佐剂作用；

所述中药皂苷是表面活性分子物质，它们都有亲水-亲脂的双亲功能，是疫苗保护剂的必须成分；也以特有的归经方式增强免疫原的免疫效果，起到免疫佐剂作用。

所述酪蛋白具有良好的蛋白保护功能，是常规的蛋白保护剂。

作为中药多糖和中药皂苷的来源，本发明所述的中药原料是运用中药归经的理论所选择的特定中药，并确定了特定的配比。由于五脏六腑在免疫功能中的作用不同，所以中药的归经不同对免疫功能的影响方式也不同。正确地应用中药归经理论，组建特异性的中药方剂是成功制备鸡传染性法氏囊弱毒苗保护剂的大前提，因为它影响着中药多糖和中药皂苷的种类。中医辩证认为鸡传染性法氏囊病是湿热肾虚证，治法宜清湿热、补肾气、以归肾经的中药为主药。本发明采用的中药中，白术、猪苓、泽泻、车前草为清湿热的中药；党参为补气的中药；猪苓、泽泻、车前草为归肾经的中药。

所述的中药多糖和中药皂苷的提取可以通过现有技术中的多种手段实现，例如可以按照以下方法提取：

中药多糖的提取：

按比例取所述中药原料，经水煎、浓缩、乙醇沉淀、洗涤沉淀物，再通过浓缩并干燥，即制得所述的中药多糖；或将前一方法中得到的水煎浓缩液经活性炭柱层析，然后用水-乙醇洗涤液洗涤，再浓缩并干燥，即制得所述的中药多糖(卢艳花，中药有效成分提取分离技术，化学工业出版社，2005年1月第1版，295-314)。

中药皂苷的提取：

按比例取所述中药原料，用乙醇或甲醇提取，回收溶剂，取残渣饼用水溶解或混悬制成水溶液，然后再做如下的双向萃取和纯化：

a、往制成的水溶液中加入石油醚或乙醚，将水溶液中的亲脂物质色素和油质回收，把中药皂苷留在水溶液中；

b、往a步制得的水溶液中加入亲水性较强的有机溶剂丁醇，溶液中亲水性较强的物质继续留在水溶液中，中药皂苷转移到有机溶剂萃取液中，收集有机溶剂萃取液，减压干燥，制得粗制的中药皂苷；

c、将b步制得的粗制中药皂苷溶于乙醇或甲醇中，再逐渐滴加乙醚、丙酮或乙醚-丙酮(1∶1体积比)的混合液，至中药皂苷从溶液中析出为止，去析出的中药皂苷干燥即可制得中药皂苷(卢艳花，中药有效成分提取分离技术，化学工业出版社，2005年1月第1版，172-194)。

本发明还提供所述的鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗保护剂的制备方法，包括以下步骤：将酪蛋白、中药多糖、中药皂苷按照所述比例混合，加无菌去离子水稀释4～6倍，匀浆，冷冻干燥或喷雾干燥，制成粉剂即为所述的鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗免疫保护剂。

本发明还提供所述免疫保护剂在制备鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗中的应用，其中，所述保护剂在制备得到的活疫苗中所占的重量比为4％～16％。

本发明所述的鸡传染性法氏囊弱毒苗保护剂中的中药多糖、中药皂苷既有免疫增强的作用，又有蛋白保护剂的作用，本发明利用它们实现了中药归经、免疫佐剂和免疫原保护剂合三为一的目的。

本发明所述免疫保护剂的重要特征也体现在对中药归经理论的有针对性的运用上。中药归经已被几千年的实践所证实。从实践是检验真理的唯一标准来看，中药归经是科学论断，毋容置疑，并日益被科学实验所证实。现代的中西医结合研究和临床实践逐步证实了中医之肺为免疫屏障，脾促进免疫功能，肾为免疫治本，肝助免疫活动，心参与和调节免疫，将免疫的脏腑理论和西医的免疫理论有机地沟通起来，正确地指导中药在免疫学中的科学实验和临床应用。

中医强调整体观，认为动物机体的生理功能和病理状态是各种内外因子综合作用的结果，因此在医疗实践和科学实验中特别要重视中药组方。本发明所述的保护剂中的中药多糖和中药皂苷是从所述的特定中药方剂中提纯的，该特定中药方剂体现了中药作用于免疫的具体原理，因而从中提出的中药多糖和中药皂苷也具有特别的针对性。

与现有技术相比，本发明的免疫保护剂具有以下有益效果：

1.具有蛋白保护剂作用

本发明所述的鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗保护剂是利用富含羟基的中药多糖、亲水亲脂的中药皂苷和能特异结合免疫原的酪蛋白这三种必须材料，构建多维网络空间氢键结构，在免疫原表面形成假性水化膜，通过这种多维网络空间氢键假性水化膜实现一种鸡传染性法氏囊弱毒苗保护剂对免疫原的保护作用。在这三种必须材料中，中药多糖依免疫原以氢键(键能42KJ/mol)粘结在一起形成多维网络空间，为免疫原搭建了大厦居所；酪蛋白以氢键安置在多维网络空间内，它的可变区等待免疫原的入住；中药皂苷的亲水基团以氢键和中药多糖的羟基结合，亲脂基团以疏水键和免疫原的疏水基团结合，将免疫原牢牢固定在中药多糖多维网络空间内；这样形成了稳定、坚固的多维网络空间氢键假性水化膜，更好地保护免疫原免受外界环境的破坏。当免疫原在加工制作、干燥和贮运时，中药多糖形成的多维网络空间首先接受外界热能而水并无序地运动起来，但是由于多维网络空间的结构特点，致使中药多糖分子上的羟基在失水时能即刻与免疫原表面的氨基和羟基等直接形成氢键，导致了整个分子运动趋于零。这种多维网络空间氢键假性水化膜钝化了免疫原对外界热能和微环境失水的感应，减轻了免疫原分子内部次生键的振动和肽链的延伸，保持了免疫原的三位构象和生物活性。所以，本发明的鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗保护剂具有蛋白保护剂的特征，使用本发明的保护剂可以使疫苗具有更好的耐热、耐储存等性能。相关效果实验如下：

鸡传染性法氏囊保护剂弱毒活疫苗的抗热(耐热)试验：

分别取本发明实施例5制备的疫苗免疫保护剂弱毒活疫苗(A)和常规市售的蔗糖牛乳保护剂鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗(B)各5瓶，于37℃放置7日，然后进行病毒含量测定。

将参试疫苗用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，以绒毛尿囊膜途径接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，观察168小时，计算半数致死量，与放置前相比，疫苗的病毒含量结果如下表1。

表1.37℃处理前后不同类型保护剂制造的鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗病毒含量

实验表明，用本发明疫苗保护剂制造的鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗对鸡传染性法氏囊弱毒有良好的保护作用，抗热性能突出。在低温下保存时，本发明保护剂鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗病毒含量10^-4.00ELD₅₀/羽份，而现有技术的蔗糖牛乳保护剂鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗病毒含量10^-3.50ELD₅₀/羽份，ELD₅₀/羽份高出了10^-0.50ELD₅₀/羽份；在37℃放置7日的抗热试验中，用本发明保护剂制造的鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗病毒含量10^-3.50ELD₅₀/羽份，而现有技术的蔗糖牛乳保护剂鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗病毒含量10^-2.17ELD₅₀/羽份，ELD₅₀/羽份急剧下降了10^-1.33ELD₅₀/羽份。这个结果充分展示了，本发明的鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗保护剂对鸡传染性法氏囊弱毒的保护能力比现有的保护剂有显著增强。

2.具有增强免疫的免疫佐剂作用

本发明保护剂的主要成分是中药提取物中药多糖和中药皂苷，这些物质能够保护免疫器官、增加免疫器官重量、增强单核吞噬细胞功能、增强T细胞功能、增强B细胞功能、增强NK细胞功能、增加补体含量和增强补体活性、诱生IL-1、IL-2、IFN、CSF、TNF等细胞因子，有效地激发和调节免疫功能。所以，本发明保护剂必然体现出增强免疫的免疫保护剂特征。

3.具有中药归经的特殊药理作用

本发明鸡传染性法氏囊弱毒苗免疫保护剂首先利用中药多糖分子多维网络空间继承了传统免疫佐剂富集和缓释免疫原的特点，同时通过激活单核吞噬细胞实现类似弗氏佐剂的特点；其次也利用中药皂苷递呈免疫原的作用而继承了免疫刺激复合物(ISCOM)的特点。但本发明免疫保护剂不是简单地继承了已有免疫佐剂的药理特点，而是在中医经络理论的指导下，应用中药归经的临床实践，赋予免疫保护剂显著的中医药理作用特色，从不同的角度强化了免疫原的免疫性能：有的从肺经出发强化单核吞噬细胞的吞噬和递呈抗原作用，有的从脾经出发直接刺激T细胞和B细胞功能，有的从肾、肝、心经出发通过各种神经因子、激素因子和免疫因子在神经-内分泌-免疫三大系统间调节免疫功能，有的应用综合归经原理全面调动机体的免疫功能。

上述几点有益效果综合作用下，本发明所述的鸡传染性法氏囊弱毒活疫活疫苗免疫保护剂体现在临床应用中的防治效果比现有技术也有了显著的提高，具体效果可以参见以下实验：

实验1.本发明鸡传染性法氏囊免疫保护剂弱毒活疫苗的免疫增强效果实验

1、取20日龄的SPF鸡雏20只，分别放置到2个消毒处理过的隔离器中。其中，一组用本发明实施例4制备的鸡传染性法氏囊免疫保护剂弱毒活疫苗接种免疫，另一组用常规鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗接种免疫。具体方法是，每只SPF鸡雏滴鼻弱毒苗1羽份。

2、接种免疫后5天、7天、14天、21天、28天采集SPF鸡雏血清样品，样品均冷冻保存。

3、抗体检测：对血清样品进行ELISA滴度测定，结果见下表2。

表2.不同保护剂的鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗免疫鸡后的血清中抗IBDV-IgY的ELISA滴度结果

通过试验进行生物统计分析，建立了实施例4的弱毒活疫苗和常规弱毒活疫苗的抗IBDV-IgY的ELISA滴度与免疫后天数的线性数学模型(见图1)：

①、本发明免疫保护剂的弱毒活疫苗(制备方法如实施例4)免疫鸡后血清中抗IBDV-IgY的ELISA滴度与天数的数学模型为：

y＝222.59x+2884.50(R＜0.9731)

②、现有技术的常规鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗免疫鸡后血清中抗IBDV-IgY的ELISA滴度与天数的数学模型为：

y＝127.52x+3268.80(R＜0.9466)

本发明免疫保护剂的弱毒活疫苗每天增加222.59个ELISA滴度，而常规鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗每天只增加127.52个ELISA滴度，本发明保护剂的弱毒活疫苗高出常规鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗95.07个ELISA滴度，显示出了本发明鸡传染性法氏囊弱毒苗免疫保护剂强化了鸡传染性法氏囊疫活疫苗的免疫效果，展示出了本发明免疫保护剂的佐剂作用。

实验2.本发明免疫保护剂制备的鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗在临床预防中的应用效果实验

【受试病鸡情况】

受试鸡群为2-12周龄的雏鸡和育成鸡群，没有品种限制，饲养在曾经流行过鸡传染性法氏囊病病毒感染的老疫区。

【疾病诊断标准】

发病鸡以法氏囊肿大、出血为特征并兼有以下一种或两种症状：

1、精神不振，厌食，间歇性腹泻拉水状白色粪便，震颤，脱水，高度虚脱；

2、皮下及胸肌和腿肌出血，腺胃和肌胃间出血，肾小管尿酸盐沉积。

【实验及观察方法】

在鸡传染性法氏囊病毒感染的老疫区的鸡场，将雏鸡分为三组，即本发明实施例4制备的鸡传染性法氏囊弱活疫苗免疫组(A)、常规鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗免疫组(B)和非免疫组(C)。然后，在雏鸡14日龄和28日龄时，A、B组分别使用相应的疫苗免疫，C组使用生理盐水，方法是疫苗组每只雏鸡滴鼻1羽份，生理盐水组每只雏鸡滴鼻0.2毫升生理盐水。然后饲养到70日龄，整个饲养期间对死亡的雏鸡行进剖解，确定死亡是否由鸡传染性法氏囊病毒引起，并将因鸡传染性法氏囊病毒死亡雏鸡数统计，计算出死亡率，再按以下方法计算出疫苗免疫保护率：

疫苗免疫保护率＝(免疫数-死亡数)/免疫数×100％

【实验结果】

实验结束后统计实验结果得知，本发明免疫保护剂制备的鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗免疫组的免疫保护率97.54％，死亡率2.46％；而常规鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗苗免疫组的免疫保护率92.65％，死亡率7.35％；生理盐水组的雏鸡由鸡传染性法氏囊病毒引起死亡，死亡率95.43％，只有24只雏鸡抵抗了鸡传染性法氏囊弱毒感染而存活下来。通过应用生物统计学分别对三个实验组的保护率进行两两t检验，充分表明它们相互之间都存在极显著差异(u＞2.58，p＜0.01)，因此证明了本发明免疫保护剂制备的鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗的免疫保护效果优于常规鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗。实验结果见表3。

表3.各实验组的免疫保护效果比较

注：表中“**”均表示与同指标的其他组数据比较具有高度显著性差异。

附图说明

图1是本发明免疫保护剂的鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗和常规鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗免疫鸡后血清中的抗IBDV-IgY的ELISA滴度统计图。

具体实施方式

下面通过具体实施例来进一步说明本发明的特征。

实施例1.制取中药多糖

从以下重量的中药材中提取中药多糖：

党参30公斤、白术20公斤、猪苓15公斤、泽泻15公斤、茯苓10公斤、车前草10公斤。

提取方法如下：

a、将所述的中药方剂原料切碎、洗净后，用冷水浸泡2小时至药心充分浸透，再加入原料重量的12倍的水，加热至沸腾后在90℃的情况下，在热回流浓缩工艺下煎煮180分钟同时浓缩得到浓缩药液。

b、将a制备的浓缩药液，再通过10000转/分离心20分钟，弃去沉淀物，获得上清液并经负压浓缩，使其形成干物质为25％的浓缩药液。

c、将b的浓缩药液加4-8倍的95％的乙醇，静置过夜，弃去乙醇上清液，沉淀物水浴加热除去乙醇或负压蒸馏除去乙醇，然后加水溶解并通过100KD滤膜过滤，除去杂蛋白、内毒素等大分子杂质，收集滤过液再通过1KD纳滤膜过滤，除去有机小分子和无机分子及离子等杂质，被截留的物质稀释后逆向水流透析24小时；取出浓缩至少量体积，加5倍量99％乙醇沉淀，搅拌，静置过夜，3000-5000转/分离心20分钟；沉淀物除去乙醇并经过喷雾干燥，即为本发明的中药多糖。

实施例2.制取中药皂苷

过程如下：

将实施例1所述的中药方剂原料切碎、洗净后，用乙醇或甲醇提取，回收溶剂，取残渣饼用水溶解或混悬制成水溶液，然后再做如下的双向萃取和纯化：

a、往水溶液中加入石油醚或乙醚，将水溶液中的亲脂物质色素和油质回收，把中药皂苷留在水溶液中；

b、往a步制得的水溶液中加入亲水性较强的有机溶剂丁醇，溶液中亲水性较强的物质继续留在水溶液中，中药皂苷转移到有机溶剂萃取液中，收集有机溶剂萃取液，减压干燥，制得粗制中药皂苷；

c、将b步制得的粗制中药皂苷溶于乙醇或甲醇中，再逐渐滴加乙醚、丙酮或乙醚-丙酮(1∶1体积比)的混合液，至中药皂苷从溶液中析出为止，去析出的中药皂苷干燥即可制得本发明的中药皂苷。

实施例3.合成本发明的鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗免疫保护剂

将实施例1制备的中药多糖、实施例2制备的中药皂苷以及市购的酪蛋白按照以下比例混合：中药多糖8公斤、中药皂苷1公斤、酪蛋白1公斤，然后加5倍的无菌去离子水稀释，10000转/分钟高速切割匀浆，然后冷冻或喷雾干燥，制成粉剂，即为本发明的鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗免疫保护剂。

实施例4.本发明免疫保护剂在鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗制备中的应用

用鸡传染性法氏囊病病毒(中等毒力B87株)接种SPF鸡胚，收获感染鸡胚，研磨，加入本发明鸡传染性法氏囊弱毒苗免疫保护剂(例如实施例3合成的免疫保护剂)，经冷冻真空干燥制成。用于预防雏鸡的传染性法氏囊病。

具体步骤如下：

(一)鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗半成品的制作

选择符合标准的鸡传染性囊病中等毒力B87株，按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》操作标准，用10～12日龄SPF鸡胚进行繁殖，制作鸡传染性法氏囊弱毒苗半成品，经各项检验合格后备用。(《中华人民共和国兽用生物制品规程》，二000年版，231-232)。

(二)配苗及分装

将检验合格的鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗半成品，加入鸡传染性法氏囊弱毒苗免疫保护剂制成乳剂，使鸡传染性法氏囊弱毒苗免疫保护剂最终含量为4～16％，定量分装。

(三)冻干

分装后迅速进行冷冻真空干燥按《中国兽药典》进行。

(四)成品检验

物理性状：本品为微红色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

无菌检验：按《中国兽药典》进行，应无菌生长。如有细菌生长应作杂菌计数(按《中国兽药典》进行)，并做病原性鉴定(按《中国兽药典》进行)和禽沙门氏菌检验按《中国兽药典》进行，应符合规定，每羽份含非病原菌应不超过1个。

支原体检验：按《中国兽药典》进行，应无支原体生长。

外源病毒检验：按《中国兽药典》进行，应符合规定。

鉴别检验：将本品用灭菌生理盐水稀释至10^3.0ELD₅₀/0.1ml，与等量抗鸡传染性法氏囊病特异性血清混合，经室温或37℃中和60分钟后，以绒毛尿囊膜途径接种10～12日龄SPF鸡胚5个，每胚接种0.2ml，同时设病毒对照5个，每胚接种病毒液0.1ml含10^3.0ELD₅₀/0.1ml，同条件培养观察168小时。中和组鸡胚应全部健活，对照组鸡胚应3/5以上死亡，鸡胚尿液对鸡红细胞凝集试验(HA)阴性。

安全试验：用7～14日龄易感雏鸡20只，其中10只，每只点眼或口服10个使用剂量的疫苗，另10只不接种作对照，两组分别饲养。观察14日，均应健活。试验结束后，剖检免疫组和对照组鸡。法氏囊应无明显变化(色泽、弹性及大小等)，如有非特异性死亡，两组总和不应超过3只，且免疫组死亡数应不超过对照组。

效力检验：下列方法任择其一。

1、病毒含量测定：将本品用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，以绒毛尿囊膜途径接种10～12日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，观察168小时，计算ELD₅₀，每羽份病毒含量应＞1000ELD₅₀。

2、对雏鸡的保护力测定：用2～4周龄易感雏鸡20只，其中10只，每只点眼或口服1/5个使用剂量的疫苗，另10只作对照，隔离饲养。20日后，取全部免疫鸡连同对照鸡5只，每只点眼接种BC6-85株(含10个BID)，72小时后剖杀所有鸡，检查法氏囊，攻毒对照组囊病变率应在80％以上，免疫组法氏囊应当80％以上无病变，健康对照组5只法氏囊不应有任何变化。

剩余水分测定：按《中国兽药典》进行，应符合规定。

真空度测定：按《中国兽药典》进行，应符合规定。

(五)作用与用途

用于预防雏鸡的传染性法氏囊病。

(六)用法及用量

可用于各品种雏鸡，依据母源抗体水平，宜在14～28日龄时使用。

按瓶签注明的羽份，可采用点眼、口服、注射途径接种。

Claims (5)

1.一种鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗免疫保护剂，其特征在于：它由以下重量份的组分组成：中药多糖8份、中药皂苷1份、酪蛋白1份；

所述的中药多糖和中药皂苷均提取自以下重量份的中药原料：党参30份、白术20份、猪苓15份、泽泻15份、茯苓10份、车前草10份。

2.权利要求1所述的鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗免疫保护剂，其特征在于，所述的中药多糖是按照以下方法提取的：

1)按比例取所述中药原料并将所述中药原料切碎、洗净后，用冷水浸泡2小时至药心充分浸透，再加入原料重量的12倍的水，加热至沸腾后在90℃的情况下，在热回流浓缩工艺下煎煮180分钟同时浓缩得到浓缩药液；

2)将步骤1)制备的浓缩药液，再通过10000转/分离心20分钟，弃去沉淀物，获得上清液并经负压浓缩，使其形成干物质为25％的浓缩药液；

3)将步骤2)得到的浓缩药液加4-8倍的95％的乙醇，静置过夜，弃去乙醇上清液，沉淀物水浴加热除去乙醇或负压蒸馏除去乙醇，然后加水溶解并通过100KD滤膜过滤，除去杂蛋白、内毒素等大分子杂质，收集滤过液再通过1KD纳滤膜过滤，除去有机小分子和无机分子及离子等杂质，被截留的物质稀释后逆向水流透析24小时；取出浓缩至少量体积，加5倍量99％乙醇沉淀，搅拌，静置过夜，3000-5000转/分离心20分钟；沉淀物除去乙醇并经过喷雾干燥，即为中药多糖。

3.权利要求1所述的鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗免疫保护剂，其特征在于，所述的中药皂苷是按照以下方法提取的：

按比例取所述中药原料，用乙醇或甲醇提取，回收溶剂，取残渣并用水溶解或混悬制成水溶液，然后再做如下的双向萃取和纯化：

a、往制成的水溶液中加入石油醚或乙醚，将水溶液中的亲脂物质色素和油质回收，把中药皂苷留在水溶液中；

b、往a步制得的水溶液中加入亲水性较强的有机溶剂丁醇，溶液中亲水性较强的物质继续留在水溶液中，中药皂苷转移到有机溶剂萃取液中，收集有机溶剂萃取液，减压干燥，制得粗制的中药皂苷；

c、将b步制得的粗制中药皂苷溶于乙醇或甲醇中，再逐渐滴加乙醚、丙酮或体积比为1∶1的乙醚-丙酮混合液，至中药皂苷从溶液中析出为止，取析出的中药皂苷干燥即可制得中药皂苷。

4.权利要求1所述的鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗免疫保护剂的制备方法，包括以下步骤：将酪蛋白、中药多糖、中药皂苷按照所述比例混合，加无菌去 离子水稀释4～6倍，匀浆，冷冻干燥或喷雾干燥，制成粉剂即为所述的鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗保护剂。

5.权利要求1所述的鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗免疫保护剂在制备鸡传染性法氏囊弱毒活疫苗中的应用，其特征在于：所述保护剂在制备得到的疫苗中所占的重量比为4％～16％。 

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