CN103041388A - 仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂及其制备工艺 - Google Patents
仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂及其制备工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂,它由以下重量份的组分组成:糖萜素5.0~55.0,莨菪碱0.005~0.01,活菌益生素5.0~55.0和卵黄免疫球蛋白50.0~95.0。本发明的制剂具有更高的稳定性,对大肠杆菌的抑杀作用更加持久充分,抗感染效果更加显著,因此更能够达到防治仔猪大肠杆菌腹泻的目的。同时本发明的制剂是一种纯天然、无药残、无公害、无耐药性、无毒副作用的环保型绿色抗感染药物,又是现有各种不良抗生药物的优秀替代药品。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域,具体涉及一种仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂及其制备工艺。
背景技术
仔猪大肠杆菌腹泻发病急、病死率高达90%。仔猪一旦发病,就来不及治疗就大批死亡。青霉素发现80多年以来,陆续研发出了大量的抗生素和人工合成化学药品。这些药品的发明和应用,使临床常见的细菌性感染和病死率大幅下降,也包括仔猪大肠杆菌腹泻病。但是随着这些药物的频繁使用和长期大剂量地使用,细菌获得了耐药性,存在于细菌染色体、质粒和转座子中的耐药基因就可通过转化、转导、结合和转座等方式,将抗性能基因传播到其它敏感菌,使之成为抗药菌株,给人类进一步预防控制传染病带来了严重的威胁。我国畜牧业空前发展,畜产品总量多年来一直居于全球之首。其中,猪的年饲养量达10亿多头。由此刺激了兽药市场达到了前所未有的空前发展。兽药的主要用途是防治畜禽感染性疾病,约占60%以上,据估测年应用抗感染药物在1万吨以上。随着我国人口的不断增长,畜产品的质量进入国际市场,进一步加大了畜禽生产规模,赋予了兽药的进一步兴旺发展。可是,长期、大剂量地使用抗生素和人工合成化学药品致使动物体内产生了对药物有对抗作用的致病菌,进而污染了畜产品;同时这些兽药残留在畜禽产品中,通过食物链传给人,造成人类疾病。这些事实引起了人们的极度恐惶和高度重视。全球各国政府制定了一系列的在畜禽生产中禁用和限用抗生素和抗菌、抗病毒化学药品的政令,拒绝进口含药残和病原的畜产品,直接抑制了兽药市场的发展。目前应用于抗仔猪大肠杆菌腹泻的药品有各种大肠杆菌疫苗、抗生素、化学合成药品、中药及其制剂和免疫球蛋白及卵黄免疫球蛋白制剂以及其他抗感染的生物因子制剂。
(一)大肠杆菌疫苗
目前,主要有仔猪大肠杆菌病三价灭活疫苗、大肠杆菌K88、K99、987P三价基因疫苗、K88-ST1-LTB三价灭活疫苗、K88ac-ST1-LTB三价基因工程菌苗等。这些疫苗主要用于预防仔猪大肠埃希氏菌腹泻(仔猪黄痢和白痢),用于妊娠母猪免疫,使新生仔猪通过母乳获得被动免疫。但是,在许多情况下由于母猪体质和仔猪体弱等原因,导致被动免疫失败,而致仔猪大肠杆菌腹泻爆发。
(二)抗生素
这类抗感染药物主要是由细菌、真菌、放线菌等微生物所产生的代谢物,以及人工仿制合成或半合成的抗生物质。它们对病原微生物的抑制或杀灭作用强,抗菌谱广,疗效好,广泛地应用于人类和动物疾病防治。但是,它们毒副作用大,如天然青霉素(青霉素G)、半合成青霉素(氨苄青霉素、阿莫西林)、头孢菌素等极易发生过敏反应,链霉素、丁胺卡那霉素、庆大霉素、小诺霉素、卡那霉素等极易引起肾脏和第八对脑神经损害以及对胎儿和婴幼儿的致残作用,土霉素、四环素、金霉素、多粘菌素E、杆菌肽等造成肝、肾损害,林可霉素、氯霉素等对造血机能也有不良影响(详见中国药典)。
(三)化学合成药品
这类抗感染药物主要包括磺胺类、喹诺酮类、呋喃类等。它们抗菌谱广,性质稳定,疗效确切,使用简便。但是,具有毒副作用大,易残留于体内,造成肝、肾等组织不可逆的损害(详见中国药典)。
以上两类药物除了上述缺点外,它们共同的弊端还有干扰机体正常菌群,破坏机体微生态平衡,导致微生物菌群失调移位,造成二重感染和其它病变;再者,大剂量反复使用都可以导致耐药性,降低治疗效果,使其抗感染的敏感率下降至10-15%,并诱生出高致病性菌株。所以,世界各国纷纷制定了一系列政策,禁止在动物生产中使用这两类药物,延长它们对人类疾病的医疗寿命,但这只是个扬汤止沸的办法。
(四)中药及其制剂
中药属天然药物,具有无害优势的特点,扶正祛邪、整体调整和无耐药性,是抗菌素和化学合成药品无法比拟的,从而引起了西方发达国家的广泛重视。目前,市场上也有许多抗感染的中药制剂如板兰根冲剂、双黄连口服液、穿心莲注射液等。虽然这些药物抗菌谱广,但由于药效慢、作用弱、用量大、质量难以稳定以至使用不方便等因素,因此在临床应用上受到了极大的限制。
(五)免疫球蛋白和卵黄免疫球蛋白制剂
这类抗感染药物来自特制的动物卵黄和卵黄免疫球蛋白。它们作用速度快,疗效准确,特异性强,但抗菌面狭窄,对混合感染和继发感染无效,有时不得不用上述三类药物辅助治疗;再者,它们属活性蛋白质,必须低温保存,在贮运和使用过程中很容易变性失活,失去医疗价值。因此,这些抗感染制剂在药品市场上难以操作而失去了商品意义,进而影响到了临床应用。
(六)其他抗感染的生物因子制剂
比如干扰素、细胞因子等,由于价格昂贵,很难被临床广泛接受,至于在动物传染病中使用更难推行。
21世纪将是一个“绿色”的世纪。绿色产品的开发是我国政府针对健康、环境、资源等问题而采取的“组织行为”,是对全球经济和社会持续发展作出的贡献。绿色产品将成为消费的主导潮流。随着全球环保意识的增强,人们价值观念的转变,崇尚自然、注重安全、追求健康的思想将首先影响人们的消费行为。消费观念和消费行为的转变又直接影响国际贸易政策,使“绿色壁垒”成为新的主要贸易壁垒。各国政府,尤其是欧、美、日等发达国家对食品中的农药、兽药残留量以及其它有毒、有害物质含量标准的规定到了近乎苛求的地步。从1992年起,日本对进口畜禽实施新的“食品卫生检查制度”,其卫生检验标准大部分高于世界一般标准,并要求完全杜绝抗生素、磺胺等抗菌剂和农药的残留。德国、英国、法国、澳大利亚等国家也制定了各自的各类兽药在不同食品中的残留标准。所以,市场在强烈呼唤一种纯天然、无药残、无公害、无耐药性、无毒副作用的环保型绿色抗感染药物的诞生。
发明内容
本发明的目的是克服已有技术的缺点,提出一种仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂,该制剂具有更高的稳定性,对大肠杆菌的抑杀作用更加持久充分,抗感染效果更加显著,而且是一种纯天然、无药残、无公害、无耐药性、无毒副作用的环保型绿色抗感染药物。
本发明还提供所述制剂的制备方法。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现:
提供一种仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂,它由以下重量份的组分组成:糖萜素5.0~55.0,莨菪碱0.005~0.01,活菌益生素5.0~55.0,卵黄免疫球蛋白50.0~95.0。
本发明优选的仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂由以下重量份的组分组成:
糖萜素10.0~20.0,莨菪碱0.008~0.01,活菌益生素20.0~35.0,卵黄免疫球蛋白60.0~90.0。
本发明最优选的仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂由以下重量份的组分组成:
糖萜素15.0,莨菪碱0.008,活菌益生素25.0,卵黄免疫球蛋白60.0。
所述的糖萜素中,按重量百分比计,糖类含量≥30%,三萜皂甙含量≥30%;所述的糖萜素可以是各种从植物中提取的糖类和三萜皂甙组成的纯天然植物提取物;本发明优选的糖萜素中,糖类和三萜皂甙都是从以下重量份的中药材中提取的:白术30~50,苍术20~40,木香15~20,泽泻10~15。
所述的糖类提取方法可以是现有技术中的多种方法,也可以是本发明所优选的以下提取方法:
a、按重量份比例取白术30~50、苍术20~40、木香15~20和泽泻10~15后切碎、洗净,用冷水浸泡2小时至药心充分浸透,再加入中药总重量12倍的水,加热至沸腾后在90℃的情况下,在热回流浓缩工艺下煎煮180分钟同时浓缩得到浓缩药液I;
b、将步骤a制备的浓缩药液,经10000转/分离心20分钟,弃去沉淀物,获得上清液并经负压浓缩,使其形成干物质为25%的浓缩药液II;
c、将步骤b得到的浓缩药液II加4-8倍(体积)的95%的乙醇,静置过夜,弃去上清液,沉淀物除去乙醇后加水溶解并通过100KD滤膜过滤,除去杂蛋白、内毒素等大分子杂质,收集滤过液再通过1KD纳滤膜过滤,除去有机小分子和无机分子及离子等杂质,被截留的物质稀释后逆向水流透析24小时,然后取出浓缩至相对密度为1.01~1.18克/毫升,再加5倍体积的99%乙醇沉淀,搅拌,静置过夜,3000-5000转/分离心20分钟;沉淀物除去乙醇并经过喷雾干燥,即可制得。
所述的三萜皂甙提取方法可以是现有技术中的多种方法,也可以是本发明所优选的以下提取方法:
i.按重量份比例取白术30~50、苍术20~40、木香15~20和泽泻10~15后切碎、洗净,用乙醇或甲醇提取,回收溶剂,取残渣饼用水溶解或混悬制成水溶液;
ii、往步骤i制成的水溶液中加入石油醚或乙醚,将水溶液中的亲脂物质色素和油质回收,把三萜皂甙留在水溶液中;
iii、往ii步制得的水溶液中加入亲水性较强的有机溶剂丁醇,溶液中亲水性较强的物质继续留在水溶液中,三萜皂甙转移到有机溶剂萃取液中,收集有机溶剂萃取液,减压干燥,制得粗制的三萜皂甙;
iv、将iii步制得的粗制三萜皂甙溶于乙醇或甲醇中,再逐渐滴加乙醚、丙酮或乙醚-丙酮(体积比1:1)的混合液,至三萜皂甙从溶液中析出为止,将析出的三萜皂甙干燥即可制得。
本发明制剂组分中,莨菪碱可以是现有的各种以莨菪碱为主要成分的产品;本发明优选从洋金花中提取的莨菪碱。
本发明优选的莨菪碱可以通过多种方法从洋金花中提取,优选的提取方法如下:按重量份计,取洋金花1份,用30份pH2~3的乙醇渗滤,取渗滤液回收蒸干溶剂,把醇浸膏加水热溶,调整pH值至2~3,滤过,取酸溶液,加入石油醚脱脂,再次获取酸水溶液,氨水调pH值至10,用氯仿萃取,将氯仿萃取液取出,回收氯仿,取萃取余液加于阳离子交换树脂柱上,先以水洗脱除杂,再用0.5%~15%酸液洗脱,收集洗脱液,加碱中和,经脱盐处理,即得莨菪碱。
本发明制剂中的卵黄免疫球蛋白可以是现有技术中经过仔猪大肠埃希氏菌病三价灭活疫苗(ETEC K88K99987P)(中华人民共和国兽用生物制品质量标准〖二00一年版〗第40页)多次强化免疫蛋鸡后得到的高免鸡蛋中提纯制备的。本发明的卵黄免疫球蛋白优选按照以下方法制得:
1)按照常规方法制备仔猪大肠埃希氏菌高免鸡蛋
1.1)无特定病原体蛋鸡在洁净养殖场隔离饲养;
1.2)对步骤1.1)饲养的蛋鸡进行3次免疫,每次给每只鸡注射仔猪大肠埃希氏菌病三价灭活疫苗(ETEC K88K99987P),注射量分别为0.5~1.0头份、0.5~1.5头份和1.0~2.0头份,每次免疫间隔一周时间;
1.3)第三次免疫后21天,收集鸡蛋,对卵黄中的卵黄免疫球蛋白进行免疫学检测,ETECK88K99987P的卵黄免疫球蛋白的微量凝集效价为1:64~1:128以上后,此鸡蛋即为仔猪大肠埃希氏菌高免鸡蛋,收集贮存在16℃条件下备用,如果检测不合格,按照第三次免疫剂量重新免疫,直至检测合格;
2)按照常规方法采集鸡蛋、分离卵黄并提纯卵黄免疫球蛋白。
本发明提供的仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂,是在现代分子免疫学、现代内分泌神经学和中医学相结合的基础上,利用分子间氢键结构理论和受体学说,把糖萜素、莨菪碱、活菌益生素和卵黄免疫球蛋白四者混合以后经过低温干燥而得。
本发明配方中,糖萜素是主要成分之一,是富含羟基的一种物质,相互间可以构建多维网络空间氢键结构,在活菌益生素和卵黄免疫球蛋白表面形成假性水化膜。氢键假性水化膜的存在直接影响了活菌益生素和卵黄免疫球蛋白分子的外表结构、构象、性质与功能等。通过这种多维网络空间氢键假性水化膜实现糖萜素对活菌益生素和卵黄免疫球蛋白的保护作用,主要体现在提高了活菌益生素和卵黄免疫球蛋白抵抗高温、紫外线等诱导变性的性能;糖萜素在动物体内还通过特有的方式增强免疫原的免疫效果,起到免疫增强剂的作用。研究证明,糖萜素在本发明的制剂配方中的用量应在5.0~55.0。本发明采用的中药配方提取的制备的糖萜素,由于采用了传统中医药“辩证施治”的理论,将健脾君药的白术、燥湿臣药的苍术、祛湿辅药的泽泻和理气使药的木香配伍组成药方制得,因而在具备蛋白保护剂作用的基础上,更有增强本制剂治疗大肠杆菌病引起的腹泻作用。
莨菪碱是本发明配方中的第三个主要成分,它是本发明配方中的特效成分,调节肠道蠕动频率加强药物作用效果。研究证明,莨菪碱在本发明的制剂配方中的用量应在0.005~0.01。
活菌益生素是本发明配方中的第四个主要成分,它在本发明配方中起到辅助功效,调整肠道微生态菌群。研究证明,活菌益生素在本发明的制剂配方中的用量应在5.0~55.0。常规的活菌益生素可以是乳酸菌益生菌类制剂。
卵黄免疫球蛋白是本发明配方中的第二个主要成分。它是本发明配方中的特效成分,直接针对病原微生物起到抑杀作用。研究证明,卵黄免疫球蛋白在本发明的制剂配方中的用量应在50.0~98.0。
本发明还提供所述的仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂的制备方法,包括以下步骤:按照重量份比例计,将糖萜素5.0~55.0,莨菪碱0.005~0.01,活菌益生素5.0~55.0,卵黄免疫球蛋白50.0~95.0混合,加无菌去离子水稀释,经匀浆、乳化、过滤后,采用冷冻干燥或低温喷雾干燥,即制成。
所述的仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂的制备方法,优选包括以下步骤:按照重量份比例计,将糖萜素5.0~55.0、卵黄免疫球蛋白55.0~95.0和莨菪碱0.005~0.01混合,加无菌去离子水稀释,使每毫升溶液中ETEC K88K99987P的卵黄免疫球蛋白的微量凝集效价达到≥1:512以上,然后置于真空冷冻干燥机中,在-40℃下冷冻干燥2~8小时,而后每小时升温3℃左右,经12~18小时的真空干燥至25℃完成干燥,密封,在25℃环境中保持3~5小时,即为冻干剂成品。
本发明所述的仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂的质量标准如下:
【物理性状】本品为棕色海绵状疏松团块或粉状。
【安全检验】取冻干的瓶装本制剂,用生理盐水还原稀释至每毫升1头份,选体重18~22克小白鼠5只,各内服本制剂稀释液0.2毫升,体重1.5~2.0公斤家兔2只,各内服本制剂稀释液10毫升,体重350~400克豚鼠2只,各内服本制剂稀释液5毫升,观测10日,均应健活。
【效力检验】用体重2~4公斤同来源无猪大肠杆菌K88K99987P卵黄免疫球蛋白的猪7头,分2组:第一组4头,按每头1头份口服本制剂稀释液(同安全检验项),同时口服仔猪大肠埃希氏菌1毫升,2~3亿个菌1毫升。第二组3头,仅口服仔猪大肠埃希氏菌1毫升,2~3亿个菌1毫升作为对照。
对照猪应于口服仔猪大肠埃希氏菌后2~8小时内体温上升,随之呈现典型的仔猪大肠杆菌性腹泻症状,并于1~3日内至少有2头死于急性仔猪大肠杆菌性腹泻病。第一组的4头猪,观测5~10日,至少健活3头为合格。
【效价测定】供试样品卵黄免疫球蛋白的制备:精密量取制剂稀释液(同安全检验项)1毫升,放入离心管中,再加氯仿4ml,充分混匀,静置1小时后,5000转/分、离心30分钟,取上清液即得。
用微量凝集法(MAT法)检验ETEC K88、K99、987P的卵黄免疫球蛋白效价应≧1:128。
MAT法:ETEC K88、K99、987P标准凝集抗原制备:应用LB培养基培养K88、K99、987P标准菌株,收获菌液进行计数后灭活,用灭菌生理盐水反复洗涤3次(3000rpm离心5分钟),最后一次离心获得的菌体沉淀,按照菌体计数结果稀释为20亿菌体/mL,作为标准凝集抗原进行微量凝集实验。
供试样品按下表稀释并操作。
振荡微量凝集板,使待测样品与标准抗原均匀混合,然后将微量凝集板置于37℃作用4-6小时后观察结果。
结果判定,以50%菌体凝集的卵黄免疫球蛋白最高稀释倍数为该菌毛卵黄免疫球蛋白的效价。
【乳酸菌含量】应不小于10亿/头份。
【作用和用途】用于治疗仔猪黄白痢及保健。
【用法和用量】
1、保健用量用做辅助初乳使用。初生仔猪1小时内口服本制剂稀释液(同安全检验项)1~2头份。
2、治疗剂量每头1头份,首次用量可加倍,1日2~3次,3日1个疗程。
【贮藏】室温,阴凉,干燥,通风,有效期36月。
与现有技术相比,本发明的仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂具有以下几方面有益效果:
一、稳定性显著提高,更便于制剂的加工、储存和运输
本发明制剂是糖萜素和卵黄免疫球蛋白及活菌益生素通过分子间力(主要是范德华力及氢键等)有机结合的新产品。卵黄免疫球蛋白和活菌益生素与糖萜素三者结构关联、功能互补,相得益彰。本发明专利制剂中,所述糖萜素是利用富含羟基的一种物质,它们相互间可以构建多维网络空间氢键结构,在卵黄免疫球蛋白和活菌益生素表面形成假性水化膜。氢键假性水化膜的存在直接影响了卵黄免疫球蛋白分子和活菌益生素的外表结构、构象、性质与功能等。通过这种多维网络空间氢键结构假性水化膜实现糖萜素对卵黄免疫球蛋白和活菌益生素的保护作用,主要体现在提高了卵黄免疫球蛋白和活菌益生素抵抗高温诱导变性的性能。糖萜素以氢键(hydrogenbonding)粘结在一起形成多维网络空间,为卵黄免疫球蛋白和活菌益生素搭建了大厦居所,卵黄免疫球蛋白和活菌益生素以氢键安置在多维网络空间内,这样形成了稳定、坚固的多维网络空间氢键假性水化膜,很好地保护卵黄免疫球蛋白和活菌益生素免受外界因素的破坏。当卵黄免疫球蛋白和活菌益生素在加工制作、干燥和贮运时,糖萜素形成的多维网络空间首先接受外界热能等因子的作用而无序地运动起来,但是由于多维网络空间的结构特点,致使糖萜素分子上的羟基在失水时能即刻与卵黄免疫球蛋白和活菌益生素表面的氨基和羟基等直接形成氢键,导致了整个分子运动趋于零,减轻了卵黄免疫球蛋白分子和活菌益生素内部次生键的振动和肽链的延伸,保持了卵黄免疫球蛋白的三位构象和活菌益生素的生物活性。所以,糖萜素具有保护剂的特征,在制剂的加工过程中克服了卵黄免疫球蛋白和活菌益生素必须在低温环境中保存、运输和使用的缺点,因此最有效地拓展了卵黄免疫球蛋白和活菌益生素在临床实际中的应用范围,极大地增强了抗体制剂的市场潜在能力。本发明制剂中糖萜素对卵黄免疫球蛋白及乳酸菌益生菌的稳定性的改善效果有以下实验为证:
【糖萜素保护卵黄免疫球蛋白热变性实验】:
(一)方法
1检验方法:微量凝集实验(MAT)法
卵黄免疫球蛋白溶液制备:将高免鸡蛋消毒,破壳,分离卵黄,精密量取卵黄1g,放入离心管中,加灭菌生理盐水1ml,混匀;再加氯仿4ml,充分震荡混匀,静置1小时后,5000转/分、离心30分钟,取上清液即得卵黄免疫球蛋白溶液。
ETEC K88、K99、987P标准凝集抗原制备:应用LB培养基培养K88、K99、987P标准菌株,收获菌液进行计数后灭活,用灭菌生理盐水反复洗涤3次(3000rpm离心5分钟),最后一次离心获得的菌体沉淀,按照菌体计数结果稀释为30亿菌体/mL,作为标准凝集抗原进行微量凝集实验。
供试样品卵黄免疫球蛋白溶液按表1稀释并操作。
表1供试样品卵黄免疫球蛋白溶液的稀释操作表
振荡微量凝集板,使待测样品与标准抗原均匀混合,然后将微量凝集板置于37℃作用4-6小时后观察结果。
结果判定,以50%菌体凝集的抗体最高稀释倍数为该菌毛抗体的效价。
2卵黄免疫球蛋白制备
将K88、K99、987P大肠杆菌灭活苗首免113日龄的海兰褐蛋鸡300只,肌肉注射,每只0.5ml;隔7日二免,肌肉注射,每只0.5ml;再隔7日三免,肌肉注射,每只1.0ml。三免后21天开始取蛋进行卵黄免疫球蛋白与K88、K99、987P抗原的微量凝集试验(MAT),当多克隆卵黄免疫球蛋白MAT效价达到6时(MAT效价㏒2表示,以下相同),即为高免蛋。收集高免蛋,消毒,破壳,分离,取得高免卵黄,依酸化水——超滤法一体化技术,通过脱脂、沉淀、冷冻干燥制得卵黄免疫球蛋白,经MAT测定,每毫升含200mg卵黄免疫球蛋白时,多克隆卵黄免疫球蛋白的MAT效价为9。
3卵黄免疫球蛋白热性能的测定
①不同浓度卵黄免疫球蛋白溶液的MAT效价测定
取卵黄免疫球蛋白溶于生理盐水制成每毫升含为5mg、10mg、20mg、30mg、40mg和50mg的系列卵黄免疫球蛋白溶液,并与K88、K99、987P抗原进行MAT。
②卵黄免疫球蛋白溶液在75℃条件下加热不同时间后的MAT效价
为了进一步搞清卵黄免疫球蛋白热变性与加热时间的关系,我们在上述实验的基础上,将卵黄免疫球蛋白稀释于生理盐水制成5mg/ml的溶液,在75℃条件下水浴加热0、5、10、15、20、25、30、35、40、45min后,立即投入冰水中冷却,然后与K88、K99、987P抗原进行MAT。
4糖萜素对多克隆卵黄免疫球蛋白热性能的改变
①糖萜素在生理盐水中对卵黄免疫球蛋白热性能的影响
取本发明实施例1中制备的糖萜素溶于生理盐水稀释的5mg/ml的卵黄免疫球蛋白溶液中,使糖萜素浓度至80mg/ml;再取5mg/ml的卵黄免疫球蛋白溶液做对照,分别在75℃条件下加热0、15、30、45min后,即刻放入冰水中冷却,然后与K88、K99、987P抗原进行试MAT。
②糖萜素偶联特异卵黄免疫球蛋白制剂中的卵黄免疫球蛋白热性能变化
将本发明实施例1制备的糖萜素与卵黄免疫球蛋白按本发明实施例1配方混合,匀浆后,分装于西林瓶,置于真空冷冻干燥机中干燥。真空冷冻条件:1、预冷至-40℃;2、在-40℃下冷冻干燥2~8小时,而后每小时升温3℃左右,经12~18小时的真空干燥至25℃;3、加盖,密封,在25℃环境中保持3~5小时,即制得仔猪大肠杆菌卵黄免疫球蛋白制剂。精确称量本制剂,用生理盐水稀释为5mg/ml,在75℃条件下加热0、15、30min后,与K88、K99、987P抗原进行MAT。
(二)结果与分析
1卵黄免疫球蛋白提取物的热性能状况
①不同浓度卵黄免疫球蛋白溶液及其在75℃条件下加热30min后的MAT效价
卵黄免疫球蛋白溶液中卵黄免疫球蛋白浓度愈高,其MAT效价愈高,每毫升生理盐水中卵黄免疫球蛋白含量在5-50mg时,每增加1mg卵黄免疫球蛋白,MAT效价增加0.09以上,呈强正相关(R=0.971)。将不同浓度的溶液在75℃条件下加热30min时,其相应的MAT效价下降2~3,也就是说卵黄免疫球蛋白的生物活性下降75.0~87.5%以上,同时也可看出卵黄免疫球蛋白浓度愈高对热的抵抗作用越大。具体结果见表2。
表2不同卵黄免疫球蛋白溶液及其在75℃加热30min后的MAT效价(㏒2)
②卵黄免疫球蛋白浓度为5mg/ml时,在75℃条件下加热不同时间后的MAT效价
在75℃条件下,将卵黄免疫球蛋白浓度为5mg/ml的生理盐水溶液,加热0-45min,其卵黄免疫球蛋白的MAT效价大幅度下降,即加热时间每延长1min,卵黄免疫球蛋白的MAT效价下降0.07,两者呈强负相关(R=-0.976),见表3。
表3卵黄免疫球蛋白浓度为5mg/ml在75℃加热不同时间的MAT效价(㏒2)
2糖萜素对卵黄免疫球蛋白热性能的影响
①糖萜素在生理盐水中对卵黄免疫球蛋白热性能的影响
将卵黄免疫球蛋白分别溶于生理盐水和80mg/ml的糖萜素混合溶液,使卵黄免疫球蛋白的浓度至5mg/ml,在75℃条件下加热0-30min后,卵黄免疫球蛋白的溶液中,卵黄免疫球蛋白的MAT效价迅速下降;卵黄免疫球蛋白的糖萜素生理盐水溶液中,MAT效价没有变化。结果表明,卵黄免疫球蛋白生理盐水溶液中加入糖萜素,打破了在生理盐水溶液中的热变性规律,有效地保护了卵黄免疫球蛋白的生物活性。所以,糖萜素在生理盐水中对卵黄免疫球蛋白具有十分显著的抗热变性作用,见表4。
表4卵黄免疫球蛋白在糖萜素溶液和生理盐水中的热性能结果比较
②本发明的仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白制剂中的卵黄免疫球蛋白热性能状况
将本发明实施例1制备的仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白制剂A和现有技术中普通的仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白B(即单纯的卵黄免疫球蛋白)配制成5mg/ml浓度的生理盐水溶液,在75℃条件下加热0、15、30min后,检测MAT效价3,结果显示加热对本发明制剂中的卵黄免疫球蛋白的生物活性没有任何改变。这说明本发明的制剂中,糖萜素对卵黄免疫球蛋白有良好的抗热变性作用。详细结果如表5。
表5本发明的仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白制剂A和现有技术普通仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白B在75℃条件下加热不同时间后MAT效价(㏒2)结果及其分析表
(三)结论与讨论
在75℃条件下加热,卵黄免疫球蛋白特别容易发生热变性,从而导致失活。这个事实再次在本实验中得到了进一步的验证。在此基础上,我们研制的糖萜素有效地阻止了卵黄免疫球蛋白在75℃加热条件下的热变性,确保了卵黄免疫球蛋白的生物活性。利用糖萜素通过偶联卵黄免疫球蛋白加工工艺精制而成的仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白制剂,具有强大的抗热变性功能,有效地解决了卵黄免疫球蛋白制剂在加工、贮存、运输和使用时的热变性瓶颈技术难题,为卵黄免疫球蛋白制剂的大规模工业化生产和市场化运营奠定了扎实的技术基础。
【糖萜素保护活菌益生素抗热变性实验】:
(一)方法
①将本发明实施例1制备的制剂和活菌益生素(亚芯(南京)生物科技有限公司提供的乳酸菌益生菌制剂)同时置入40℃的环境中,高热处理30天,然后检测处理样品的乳酸菌活菌数。
②采用食品安全国家标准GB4789.35-2010食品微生物学检验——乳酸菌检验方法,对处理前样品和经过①处理后的相应样品进行乳酸菌活菌计数。
(二)结果
本发明实施例1的制剂未经高热处理每克样品乳酸菌活菌数61.2±5.1亿个,经高热处理后每克样品乳酸菌活菌数45.6±4.8亿个;但是乳酸菌益生菌制剂未经高热处理乳酸菌活菌数61.3±4.8亿个,经过高热处理后未见出乳酸活菌。见表6。
表6热处理对乳酸菌的影响表单位:亿个/克
(三)结论
在40℃的环境中经过高热处理30天,本发明专利制剂中乳酸菌活菌数由每克61.2亿个降低到45.6亿个,只降低了25%;但是乳酸菌益生菌制剂中的乳酸菌则全部失活。这充分证明了本制剂可以有效地抵抗热因子对乳酸菌的破坏作用,即通过糖贴素与乳酸菌的偶联复合有效地保护了乳酸菌在热环境中生存状态,提高了乳酸菌的抗热能力。
二、对大肠杆菌的抑杀作用更加持久充分
本发明制剂中的莨菪碱在仔猪肠道内可以与肠壁的乙酰胆碱受体相结合,适度降低肠道蠕动频率,使卵黄免疫球蛋白在仔猪消化道的作用时间延长,因此能充分与肠道中的大肠杆菌相互作用,有效抑杀大肠杆菌达到防治仔猪大肠杆菌腹泻的目的,有以下实验为证:
本发明制剂中莨菪碱延长本制剂中卵黄免疫球蛋白在仔猪消化道的作用时间的实验:
(一)试验动物
初生未哺初乳健康仔猪,品种为杜×大×长三元杂交商品猪。
(二)方法
1投药设计及取样
选初生仔猪12头,分为2组,每组5只。1组在10小时龄时每头仔猪通过口腔饲喂4ml浓度为100mg/ml的本发明实施例1的制剂,2组在10小时龄时每头仔猪通过口腔饲喂4ml浓度为100mg/ml的单纯卵黄免疫球蛋白;分别测定饲喂后0、4、6、8、12小时取试验仔猪的胃、十二脂肠、空肠、回肠、大肠的内容物样品,分别测定其中的纯化卵黄免疫球蛋白的ELISA效价。
2ELISA测定
1)试剂配制
①包被缓冲液(0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液)
Na2CO3(无水)1.50g
NaHCO32.98g
用无离子水定容至1000ml
②洗涤液(pH7.4的磷酸盐缓冲液-吐温20Tween-20)
NaH2PO40.2g NaCl8.0g
Na2HPO412H2O2.9g KCl0.2g
Tween-200.5ml(若不加为PBS液)用无离子水定容至1000ml
③稀释液用洗涤液配制1%的胎牛血清清蛋白溶液。
④pH5.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液
甲液:柠檬酸19.2g用无离子水定容至1000ml
乙液:Na2HPO412H2O71.39g用无离子水定容至1000ml
用时取甲液28.0ml乙液22.0ml用无离子水定容至100ml
⑤底物试剂取邻苯二胺10mg溶于25ml pH5.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液中,加入30%H2O20.4ml,充分混匀。(使用时临时配制,不能长时间放置)
⑥终止液(2mol/L H2SO4)浓H2SO4(95~98%)22.2ml缓慢溶于水中,并不停的搅拌散热,以免短时间内产生大量的热而引起爆炸。冷却后定容至200ml。
⑦终止液2M H2SO4溶液(浓硫酸22.2ml,无菌去离子水177.8ml)
⑧兔抗鸡IgG过氧化物酶(rb Anti-Chicken IgG A9046)由Sigma公司提供。
⑨兔抗鸡IgG抗制备采购多克隆IgY纯品(I4881-10mg,Chicken-IgG,美国sigma公司)并制备其油苗,抗原含量0.5mg/ml,给兔子免疫三次,每次间隔时间一周,三次免疫后一周时采集血清,用双向琼脂扩散测兔抗鸡IgG抗效价达到1:4(抗原含量0.125mg/ml),置于-20℃保存。
2)ELISA效价测定方法
①包被致敏平板取洗净干燥的聚苯乙烯板,用包被液将兔抗鸡IgG抗至30ug/ml,150ul/孔,盖好,置4℃过夜。
②洗涤封闭次日,倒去孔内Ag溶液,用洗涤液洗3~4次,每次3~4min,甩干。加入10%脱脂奶粉溶液(脱脂奶粉用pH7.4的PBS液配制),每孔加满,37℃作用1小时。
③洗涤,加入待检样品倒去孔内封闭液,用洗涤液洗3~4次,每次3~4min,甩干。将样品用稀释液做不同倍数稀释。150ul/孔,37℃作用1小时。
④洗涤,加入酶标兔抗鸡IgG过氧化物酶倒去孔内溶液,用洗涤液洗3~4次,每次3~4min,甩干。加入1:800的兔抗鸡IgG过氧化物酶,150ul/孔,37℃作用1小时。
⑤洗涤,加入底物试剂倒去孔内溶液,用洗涤液洗3~4次,每次3~4min,甩干。加入加入底物试剂,150ul/孔,37℃作用10~15min。置于暗处,同时注意颜色变化,至阳性孔颜色都出现,而且比较明显,不能反应过度。
⑥终止反应显色反应结束后,马上加入终止液,100ul/孔,终止反应。
⑦测定打开仪器以后,先稍微预热一下,然后以空气为空白,在492nm测量并记录样品和对照孔吸光值。
⑧结果分析OD测/OD阴≥2.1为阳性
(三)结果
在10小时龄仔猪分别通过口腔饲喂5ml浓度为100mg/ml的本发明实施例1的制剂和单纯的卵黄免疫球蛋白,分别测定饲喂后0、4、6、8、12小时卵黄免疫球蛋白在胃肠道中的分布结果见表7。
表7本发明实施例1的制剂/单纯卵黄免疫球蛋白在消化道中的检出情况表
表7结果证明,单纯的卵黄免疫球蛋白在仔猪口服后6小时可以在胃中和肠道各段检出,8小时在胃中和肠道各段就检不出卵黄免疫球蛋白。但是,本发明实施例1的制剂中的卵黄免疫球蛋白在仔猪口服后8小时可以在胃中和肠道各段检出,12小时还可在肠道各段检出。这说明由于本发明制剂中的莨菪碱对消化道的作用,减弱了由大肠杆菌毒素引起的肠道痉挛性蠕动,致使本发明制剂中的卵黄免疫球蛋白在肠道中的作用时间延长。因此卵黄免疫球蛋白能充分与肠道中的大肠杆菌相互作用,有效抑杀大肠杆菌达到防治仔猪大肠杆菌腹泻的目的。
三、抗感染效果显著而全面
本发明制剂是将特异性免疫的卵黄免疫球蛋白、非特异性免疫的糖萜素和调整肠道微生态环境的活菌益生素完美地结合起来而形成的高新产品。糖萜素能够保护免疫器官、增加免疫器官重量、增强单核吞噬细胞功能、增强T细胞功能、增强B细胞功能、增强NK细胞功能、增加补体含量和增强补体活性、诱生IL-1、IL-2、IFN、CSF、TNF等细胞因子;卵黄免疫球蛋白专项抑杀病原微生物;活菌益生素可以调整肠道微生态环境。所以,该制剂既针对原发病原微生物感染,又针对继发和混合病原微生物感染;既杀灭病原微生物,又激发自身免疫力和整体抗病的功能;既标本兼治,又快速持久。因此,本制剂全面地体现了中医学理论和现代免疫学原理的结合,是一种有效激发和调节机体免疫功能的全新高效的抗感染药物。本发明制剂对大肠杆菌的显著的抗感染效果有以下实验为证:
仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂治疗实验
1)受试猪情况
受试猪群为产后5~30日龄的仔猪群,品种不受限制,饲养在曾经流行过大肠杆菌病感染的老疫区。
2)仔猪大肠杆菌病诊断和治疗判定标准
①仔猪感染大肠杆菌病后,临床上主要表现为仔猪腹泻。因此,以仔猪粪便含水量不同形成不同形状的粪便为判定依据,确定仔猪腹泻评分,见表8:
表8、仔猪腹泻评分标准
②仔猪腹泻疗效判定标准见表9。
表9、仔猪腹泻疗效判定标准
3)实验及观察方法
在仔猪大肠杆菌病感染的老疫区的猪场,将发病仔猪分为4组,即本发明实施例1制备的本制剂组(A)、卵黄免疫球蛋白组(B)、恩诺沙星组(C)和香连散组(D)。在仔猪发生大肠杆菌病下痢后各组按相应的实验药物说明书进行治疗,在治疗期间对发病仔猪行进跟踪观察,确定治疗效果,并统计痊愈数、有效数和无效数,按以下方法计算出各组的治愈头数和治愈率:
治愈头数=痊愈数+有效数
治愈率=(痊愈数+有效数)/发病数×100%
实验结果显示,使用本发明实施例1的仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂治疗仔猪大肠杆菌腹泻比其它常用药物提高治愈率8%以上。详见下表10:
表10本发明仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂和其他常用药物治疗仔猪大肠杆菌腹泻的效果及其分析统计表
**与其它3组相比,差异极显著(P<0.01)。
具体实施方式
下面通过具体实施例来进一步说明本发明的特征。
实施例1:
本制剂是针对的传染病原微生物是仔猪大肠杆菌(ETEC K88K99987P)的仔猪大肠杆菌病冻干卵黄免疫球蛋白生物制剂,成分和重量份数如下:
其中,糖萜素提取自以下重量份比例的复方植物:白术40、苍术30、木香20和泽泻10;莨菪碱提取自洋金花;活菌益生素选择乳酸菌益生菌制剂(购自亚芯(南京)生物科技有限公司)。
本实施例制剂通过以下方法制备:
一、制备糖萜素
(一)糖类提取:
a、按重量份比例取白术40、苍术30、木香20和泽泻10后切碎、洗净,用冷水浸泡2小时至药心充分浸透,再加入中药总重量12倍的水,加热至沸腾后在90℃的情况下,在热回流浓缩工艺下煎煮180分钟同时浓缩得到浓缩药液I;
b、将步骤a制备的浓缩药液,经10000转/分离心20分钟,弃去沉淀物,获得上清液并经负压浓缩,使其形成干物质为25%的浓缩药液II;
c、将步骤b得到的浓缩药液II加5倍体积的95%的乙醇,静置过夜,弃去上清液,沉淀物除去乙醇后加水溶解并通过100KD滤膜过滤,除去杂蛋白、内毒素等大分子杂质,收集滤过液再通过1KD纳滤膜过滤,除去有机小分子和无机分子及离子等杂质,被截留的物质稀释后逆向水流透析24小时,然后取出浓缩至相对密度为1.01~1.18克/毫升,再加5倍体积的99%乙醇沉淀,搅拌,静置过夜,3000-5000转/分离心20分钟;沉淀物除去乙醇并经过喷雾干燥,即制得糖类。
(二)三萜皂甙提取:
i.按重量份比例取白术40、苍术30、木香20和泽泻10后切碎、洗净,用乙醇或甲醇提取,回收溶剂,取残渣饼用水溶解或混悬制成水溶液,然后再做如下的双向萃取和纯化:
ii、往制成的水溶液中加入石油醚或乙醚,将水溶液中的亲脂物质色素和油质回收,把三萜皂甙留在水溶液中;
iii、往ii步制得的水溶液中加入亲水性较强的有机溶剂丁醇,溶液中亲水性较强的物质继续留在水溶液中,三萜皂甙转移到有机溶剂萃取液中,收集有机溶剂萃取液,减压干燥,制得粗制的三萜皂甙;
iv、将iii步制得的粗制三萜皂甙溶于乙醇或甲醇中,再逐渐滴加乙醚、丙酮或乙醚-丙酮(体积比1:1)的混合液,至三萜皂甙从溶液中析出为止,将析出的三萜皂甙干燥即制得三萜皂甙。
(三)将步骤(一)和步骤(二)制得的糖和三萜皂甙混合制得糖萜素,使其中糖类重量百分比≥30%,三萜皂甙重量百分比≥30%。
二、制备莨菪碱
从洋金花中提取莨菪碱,提取方法如下:取洋金花1份,用30份pH2~3的乙醇渗滤,取渗滤液回收蒸干溶剂,把醇浸膏加水热溶,调整pH值2~3,滤过,取酸溶液,加入石油醚脱脂,再次获取酸水溶液,氨水调取pH值10,用氯仿萃取,将氯仿萃取液取出,回收氯仿,取萃取余液加于阳离子交换树脂柱上,先以水洗脱除杂,再用0.5%~15%酸液洗脱,收集洗脱液,加碱中和,经脱盐处理,即得莨菪碱。
三、制备卵黄免疫球蛋白,步骤如下:
1)按照常规方法制备仔猪大肠埃希氏菌高免鸡蛋
1.1)无特定病原体蛋鸡在洁净养殖场隔离饲养;
1.2)对步骤1.1)饲养的蛋鸡进行3次免疫,每次给每只鸡注射仔猪大肠埃希氏菌病三价灭活疫苗(ETEC K88K99987P),注射量分别为0.5~1.0头份、0.5~1.5头份和1.0~2.0头份,每次免疫间隔一周时间;
1.3)第三次免疫后21天,收集鸡蛋,对卵黄中的卵黄免疫球蛋白进行免疫学检测,ETECK88K99987P的卵黄免疫球蛋白的微量凝集效价为1:64~1:128以上后,此鸡蛋即为仔猪大肠埃希氏菌高免鸡蛋,收集贮存在16℃条件下备用,如果检测不合格,按照第三次免疫剂量重新免疫,直至检测合格;
2)按照常规方法采集鸡蛋、分离卵黄并提纯卵黄免疫球蛋白。
四、制备仔猪大肠杆菌病冻干卵黄免疫球蛋白生物制剂
按照重量份比例计,步骤一制备的糖萜素、步骤二制备的莨菪碱、步骤三制备的卵黄免疫球蛋白和市售的乳酸菌益生菌生物制剂混合,加无菌去离子水稀释,使每毫升溶液中ETECK88K99987P的卵黄免疫球蛋白的微量凝集效价达到≥1:512以上,然后置于真空冷冻干燥机中,在-40℃下冷冻干燥2~8小时,而后每小时升温3℃左右,经12~18小时的真空干燥至25℃完成干燥,密封,在25℃环境中保持3~5小时,即为成品。
质量标准如下:
【物理性状】本品为棕色海绵状疏松团块或粉状。
【安全检验】取冻干的瓶装本制剂,用生理盐水还原稀释至每毫升1头份,选体重18~22克小白鼠5只,各内服本制剂稀释液0.2毫升,体重1.5~2.0公斤家兔2只,各内服本制剂稀释液10毫升,体重350~400克豚鼠2只,各内服本制剂稀释液5毫升,观测10日,均应健活。
【效力检验】用体重2~4公斤同来源无猪大肠杆菌K88K99987P卵黄免疫球蛋白的猪7头,分2组:第一组4头,按每头1头份口服本制剂稀释液(同安全检验项),同时口服仔猪大肠埃希氏菌1毫升,2~3亿个菌1毫升。第二组3头,仅口服仔猪大肠埃希氏菌1毫升,2~3亿个菌1毫升作为对照。
对照猪应于口服仔猪大肠埃希氏菌后2~8小时内体温上升,随之呈现典型的仔猪大肠杆菌性腹泻症状,并于1~3日内至少有2头死于急性仔猪大肠杆菌性腹泻病。第一组的4头猪,观测5~10日,至少健活3头为合格。
【效价测定】供试样品卵黄免疫球蛋白的制备:精密量取制剂稀释液(同安全检验项)1毫升,放入离心管中,再加氯仿4ml,充分混匀,静置1小时后,5000转/分、离心30分钟,取上清液即得。
用微量凝集法(MAT法)检验ETEC K88、K99、987P的卵黄免疫球蛋白效价应≧1:128。
MAT法:ETEC K88、K99、987P标准凝集抗原制备:应用LB培养基培养K88、K99、987P标准菌株,收获菌液进行计数后灭活,用灭菌生理盐水反复洗涤3次(3000rpm离心5分钟),最后一次离心获得的菌体沉淀,按照菌体计数结果稀释为20亿菌体/mL,作为标准凝集抗原进行微量凝集实验。
供试样品按下表稀释并操作。
振荡微量凝集板,使待测样品与标准抗原均匀混合,然后将微量凝集板置于37℃作用4-6小时后观察结果。
结果判定,以50%菌体凝集的卵黄免疫球蛋白最高稀释倍数为该菌毛卵黄免疫球蛋白的效价。
【乳酸菌含量】应不小于10亿/头份。
【作用和用途】用于治疗仔猪黄白痢及保健。
【用法和用量】
1、保健用量用做辅助初乳使用。初生仔猪1小时内口服本制剂稀释液(同安全检验项)1~2头份。
2、治疗剂量每头1头份,首次用量可加倍,1日2~3次,3日1个疗程。
【贮藏】室温,阴凉,干燥,通风,有效期36月。
实施例2:
本制剂针对的传染病原微生物是仔猪大肠杆菌(ETEC K88K99987P)。
本实施例的仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂的成分和重量份数如下:
制备方法基本同实施例1,其中区别仅在于:糖萜素中的糖类和三萜皂甙均提取自以下重量份比例的中药:白术30、苍术40、木香15和泽泻15;活菌益生素选择乳酸菌益生菌制剂(购自青岛星星协力生物工程有限公司)。
质量标准同实施例1。
实施例3:
本制剂针对的传染病原微生物是仔猪大肠杆菌(ETEC K88K99987P)。
本实施例的仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂的成分和重量份数如下:
制备方法基本同实施例1,其中区别仅在于:糖萜素中的糖类和三萜皂甙均提取自以下重量份比例的中药:白术50、苍术20、木香15和泽泻15。
质量标准同实施例1。
实施例4:
本制剂针对的传染病原微生物是仔猪大肠杆菌(ETEC K88K99987P)。
本实施例的仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂的成分和重量份数如下:
制备方法基本同实施例1,其中区别仅在于:糖萜素中的糖类和三萜皂甙均提取自以下重量份比例的中药:白术30、苍术20、木香15和泽泻10;活菌益生素选择乳酸菌益生菌制剂(购自大连新领军商贸有限公司)。
质量标准同实施例1。
实施例5:
本制剂针对的传染病原微生物是仔猪大肠杆菌(ETEC K88K99987P)。
本实施例的仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂的成分和重量份数如下:
制备方法基本同实施例1,其中区别仅在于:糖萜素中的糖类和三萜皂甙均提取自以下重量份比例的中药:白术50、苍术40、木香20和泽泻15。
质量标准同实施例1。
实施例6:
本制剂针对的传染病原微生物是仔猪大肠杆菌(ETEC K88K99987P)。
本实施例的仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白制剂的成分和重量份数如下:
本实施例中的糖萜素是现有市售产品,可来自以下供应商:
有北京邦士富生物科技有限公司(电话010-59741700),上海牧农生物科技有限公司(电话021-61373406),安格瑞得(中国)生物技术有限公司(电话0371-65607365)等。
本实施例中的莨菪碱是现有市售产品,可来自以下供应商:
有北京梅尔森医药技术开发有限公司(电话010-80485714),苏州亚科化学试剂股份有限公司(电话0512-81665519),四川省中药标准中心(电话028-85377358)等。
本实施例中的乳酸菌益生菌生物制剂是现有的市售产品,可以来自以下供应商:
亚芯(南京)生物科技有限公司(电话010-83835618),大连新领军商贸有限公司(电话0411-82808588-2111),青岛星星协力生物工程有限公司(电话0532-82287252)等。
其他原料及制备方法同实施例1。
质量标准同实施例1。
Claims (10)
1.一种仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂,它由以下重量份的组分组成:糖萜素5.0~55.0,莨菪碱0.005~0.01,活菌益生素5.0~55.0,卵黄免疫球蛋白50.0~95.0。
2.权利要求1所述的仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂,其特征在于,它由以下重量份的组分组成:糖萜素10.0~20.0,莨菪碱0.008~0.01,活菌益生素20.0~35.0,卵黄免疫球蛋白60.0~90.0。
3.权利要求1或2所述的任意一种仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂,其特征在于,所述的糖萜素中,按重量百分比计,糖类含量≥30%,三萜皂甙含量≥30%;所述的糖类和三萜皂甙都是从以下重量份的中药材中提取的:白术30~50,苍术20~40,木香15~20,泽泻10~15。
4.权利要求3所述的仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂,其特征在于,所述的糖类按照以下提取方法得到:
a、按重量份比例取白术30~50、苍术20~40、木香15~20和泽泻10~15后切碎、洗净,用冷水浸泡2小时至药心充分浸透,再加入中药总重量12倍的水,加热至沸腾后在90℃的情况下,在热回流浓缩工艺下煎煮180分钟同时浓缩得到浓缩药液I;
b、将步骤a制备的浓缩药液,经10000转/分离心20分钟,弃去沉淀物,获得上清液并经负压浓缩,使其形成干物质为25%的浓缩药液II;
c、将步骤b得到的浓缩药液II加4-8倍体积的95%的乙醇,静置过夜,弃去上清液,沉淀物除去乙醇后加水溶解并通过100KD滤膜过滤,除去杂蛋白、内毒素等大分子杂质,收集滤过液再通过1KD纳滤膜过滤,除去有机小分子和无机分子及离子等杂质,被截留的物质稀释后逆向水流透析24小时,然后取出浓缩至相对密度为1.01~1.18克/毫升,再加5倍体积的99%乙醇沉淀,搅拌,静置过夜,3000-5000转/分离心20分钟;沉淀物除去乙醇并经过喷雾干燥,即可制得。
5.权利要求3所述的仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂,其特征在于,所述的三萜皂甙按照以下提取方法得到:
i.按重量份比例取白术30~50、苍术20~40、木香15~20和泽泻10~15后切碎、洗净,用乙醇或甲醇提取,回收溶剂,取残渣饼用水溶解或混悬制成水溶液;
ii、往步骤i制成的水溶液中加入石油醚或乙醚,将水溶液中的亲脂物质色素和油质回收,把三萜皂甙留在水溶液中;
iii、往ii步制得的水溶液中加入亲水性较强的有机溶剂丁醇,溶液中亲水性较强的物质继续留在水溶液中,三萜皂甙转移到有机溶剂萃取液中,收集有机溶剂萃取液,减压干燥,制得粗制的三萜皂甙;
iv、将iii步制得的粗制三萜皂甙溶于乙醇或甲醇中,再逐渐滴加乙醚、丙酮或乙醚-丙酮等体积比的混合液,至三萜皂甙从溶液中析出为止,将析出的三萜皂甙干燥即可制得。
6.权利要求1所述的仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂,其特征在于,所述的莨菪碱是从洋金花中提取的莨菪碱。
7.权利要求6所述的仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂,其特征在于,所述的从洋金花中提取莨菪碱的方法如下:按重量份计,取洋金花1份,用30份pH2~3的乙醇渗滤,取渗滤液回收蒸干溶剂,把醇浸膏加水热溶,调整pH值至2~3,滤过,取酸溶液,加入石油醚脱脂,再次获取酸水溶液,氨水调pH值至10,用氯仿萃取,将氯仿萃取液取出,回收氯仿,取萃取余液加于阳离子交换树脂柱上,先以水洗脱除杂,再用0.5%~15%酸液洗脱,收集洗脱液,加碱中和,经脱盐处理,即得莨菪碱。
8.权利要求1所述的仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂,其特征在于,所述的卵黄免疫球蛋白是按照以下方法制得的:
1)按照常规方法制备仔猪大肠埃希氏菌高免鸡蛋
1.1)无特定病原体蛋鸡在洁净养殖场隔离饲养;
1.2)对步骤1.1)饲养的蛋鸡进行3次免疫,每次给每只鸡注射仔猪大肠埃希氏菌病三价灭活疫苗(ETEC K88K99987P),注射量分别为0.5~1.0头份、0.5~1.5头份和1.0~2.0头份,每次免疫间隔一周时间;
1.3)第三次免疫后21天,收集鸡蛋,对卵黄中的卵黄免疫球蛋白进行免疫学检测,ETECK88K99987P的卵黄免疫球蛋白的微量凝集效价为1:64~1:128以上后,此鸡蛋即为仔猪大肠埃希氏菌高免鸡蛋,收集贮存在16℃条件下备用,如果检测不合格,按照第三次免疫剂量重新免疫,直至检测合格;
2)按照常规方法采集鸡蛋、分离卵黄并提纯卵黄免疫球蛋白。
9.权利要求1所述的仔猪大肠杆菌病卵黄免疫球蛋白生物制剂的制备方法,包括以下步骤:按照重量份比例计,将糖萜素5.0~55.0,莨菪碱0.005~0.01,活菌益生素5.0~55.0,卵黄免疫球蛋白50.0~95.0混合,加无菌去离子水稀释,经匀浆、乳化、过滤后,采用冷冻干燥或低温喷雾干燥,即制成。
10.权利要求9所述的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:按照重量份比例计,将糖萜素5.0~55.0、卵黄免疫球蛋白55.0~95.0和莨菪碱0.005~0.01混合,加无菌去离子水稀释,使每毫升溶液中ETEC K88K99987P的卵黄免疫球蛋白的微量凝集效价达到≥1:512以上,然后置于真空冷冻干燥机中,在-40℃下冷冻干燥2~8小时,而后每小时升温3℃左右,经12~18小时的真空干燥至25℃完成干燥,密封,在25℃环境中保持3~5小时,即为成品。
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