CN109306009B - 一种抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种抗仔猪腹泻产毒大肠杆菌卵黄抗体的制备方法，属于抗体制备技术领域。本发明中抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体制备方法，通过采用已有的仔猪产毒大肠杆菌基因工程灭活疫苗及采用仔猪大肠杆菌性腹泻发病猪肠道分离物肠毒素及黏附性菌毛蛋白对SPF蛋鸡进行肌肉免疫，免疫过程中喂食专利屎肠球菌Anp01(Enterococcus faecium Anp01)CCTCC M 209019及中药组合物粉碎饲喂，作为免疫增强剂，收集2～6周的免疫传染性肠炎的鸡蛋，提取卵黄水提液，对卵黄水提液采用冻融法纯化获得卵黄抗体IgY。此抗体对仔猪产毒大肠杆菌引起腹泻的紧急治疗具有实用价值，对降低养猪业的经济损失，促进新型兽用生物药物开发具有重要意义。

Description

一种抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体的制备方法

技术领域

本发明属于抗体制备技术领域，涉及一种抗仔猪产毒大肠杆菌抗体，特别是指一种抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体的制备方法。

背景技术

仔猪腹泻是困扰规模化养猪生产的主要难题之一，给养猪业带来了巨大的经济损失。致病性大肠杆菌是造成新生仔猪和断奶仔猪腹泻的最重要的病原，其中产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenicescherichiacoil，etec)是最主要的致病菌，治疗采用抗菌药物，易使仔猪消化道正常菌群受到破坏或者产生耐药性菌株，治疗效果不佳。本申请的这种用于治疗仔猪大肠杆菌性腹泻的卵黄抗体制剂的制备方法，解决了现有技术中没有很好的药物治疗仔猪大肠杆菌性腹泻的技术问题。

发明内容

为了克服以上缺陷，本发明提出了一种抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体的制备方法。本申请采用已有的仔猪大肠杆菌病基因工程活疫苗及仔猪大肠杆菌性腹泻发病猪肠道分离物产肠毒素大肠杆菌、肠毒素及黏附性菌毛蛋白对SPF蛋鸡进行免疫，在免疫过程中通过喂食屎肠球菌Anp01(Enterococcus faecium Anp01)CCTCC M 209019及中药组合物，通过收集2～6周的免疫SPF鸡的鸡蛋，提取卵黄水提液，对卵黄水提液采用冻融法纯化获得卵黄抗体IgY。此抗体对仔猪大肠杆菌性引起的腹泻的紧急治疗具有实用价值，本申请解决了现有技术中没有很好的药物治疗仔猪大肠杆菌性腹泻的技术问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体的制备方法，依次包括如下步骤：

1)采用仔猪大肠杆菌K88、K99双价基因工程活疫苗免疫SPF蛋鸡；

2)采用仔猪大肠杆菌性腹泻发病猪肠道分离物，产肠毒素大肠杆菌、肠毒素及黏附性菌毛蛋白混合免疫原对SPF蛋鸡进行免疫；

3)在步骤2)中的SPF蛋鸡免疫过程中喂食屎肠球菌Anp01(Enterococcus faeciumAnp01)CCTCC M 209019及中药组合物，然后收集被免疫的鸡所产鸡蛋，从其蛋黄中提纯抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体IgY。

优选的，步骤1)中，所述SPF蛋鸡为20～30周龄。

优选的，步骤2)中，对SPF产蛋鸡进行免疫的步骤为：初次免疫前5日注射仔猪大肠杆菌病K88、K99双价基因工程活疫苗及混合免疫原进行免疫刺激，首免时注射1ml；2周后进行第二次免疫，分别注射仔猪大肠杆菌病K88、K99双价基因工程活疫苗及混合免疫原1ml；再隔2周进行第三次免疫，注射仔猪大肠杆菌病K88、K99双价基因工程活疫苗及混合免疫原2ml；再隔4周后进行第四次免疫，所述首免、第二次免疫、第三次免疫和第四次免疫均采用肌肉分点免疫。

优选的，步骤3)中，收集鸡蛋时间为步骤2)中首免后6～14周。

优选的，步骤3)中，提纯抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体采用聚乙二醇(PEG-6000)沉淀法，具体步骤为：依次分别用3.5％PEG-6000、8.5％PEG-6000、12％PEG-6000对卵黄抗体沉淀3次，最后用预冷的50％乙醇进一步沉淀，得到卵黄抗体提纯物。

优选的，步骤3)中，所述中药组合物的组成为：生黄芪10～20份、银花10～20份、柴胡5～15份、黄芩5～15份、板兰根10～20份、贯仲10～20份、苍术5～15份、生苡仁10～20份、防风5～15份、生甘草1～10份、藿香5～15份，粉碎过100～120目筛。

优选的，步骤3)中，所述中药组合物的组成为：生黄芪15份、银花15份、柴胡10份、黄芩10份、板兰根15份、贯仲15份、苍术10份、生苡仁15份、防风10份、生甘草5份、藿香10份，粉碎过110目筛。

优选的，步骤3)中，所述屎肠球菌Anp01(Enterococcus faecium Anp01)CCTCC M209019的添加量为饲料的0.1％。

优选的，步骤3)中，所述中药组合物的添加量为饲料的10％。

优选的，将步骤3)所述的鸡蛋，经75％酒精消毒后，用卵黄分离器分离蛋白，收集卵黄，弃卵黄膜，加卵黄液9倍体积的pH5.2酸化水稀释，充分搅拌，4℃冰箱中静置超过6h，在10000r/min4℃离心10min，收集上清液获得卵黄水提液；将所述卵黄水提液于-70℃冰箱中过夜，取出，解冻后10000r/min离心15min，弃去沉淀，收集上液，经0.22μm滤膜过滤后，获得抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体IgY。

本发明还提供了一种上述方法制备的抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体。

本发明中的中药组合物根据中兽医药和现代中医药学理论，以抗菌抑菌、清热燥湿、清肠止泻为原则，按照一定的重量份组方而成，所述中药组合物包括生黄芪、银花、柴胡、黄芩、板兰根、贯仲、苍术、生苡仁、防风、生甘草、藿香，各中药的药理如下：

生黄芪：性味甘、微温，归脾、肺经，为补气要药，兼有升阳、固表止汗、排脓生肌、利水消肿、安胎益血的作用。对于贫血、浮肿、体虚多汗、胎动不安、子宫脱垂、气血两亏、阴虚不足等都有卓著的疗效。

银花：性味甘、寒，归肺经、心经、胃经，清热解毒，炒炭凉血止血。

柴胡：性微寒、味苦、辛、归肝经、胆经，具疏肝利胆、疏气解郁、散火之功效。

黄芩：属清热燥湿中药，用于热病高热烦渴、肺热咳嗽、热盛迫血外溢的吐血、衄血、便血、崩漏，以及热毒疮疡等症。

板兰根：清热解毒、凉血消斑、利咽止痛，抗病原微生物、解毒。

贯仲：性苦、涩、微寒，有小毒，归肝经、胃经，杀虫、清热、解毒、凉血止血，主治风热感冒、温热癍疹、吐血、咳血、衄血、便血、崩漏、血痢、带下及钩、蛔、绦虫等肠寄生虫病。

苍术：味辛、苦，性温，归脾经、胃经、肝经，燥湿健脾、祛风湿、明目，主湿困脾胃、倦怠嗜卧、胞痞腹胀、食欲不振、哎吐泄泻、痰饮、湿肿、表证夹湿、头身重痛、痹证温性、肢节酸痛重着、痿襞、夜盲。

生苡仁：味甘淡，性微寒，归脾经、肺经、胃经，利水渗湿、利水消肿、清利湿热、健脾利湿、缓解拘挛、排脓消痈。

防风：味辛、甘，性微温，归膀胱、肺、脾、肝经，祛风解表、胜湿止痛、止痉，用于外感表证、风疹瘙痒、风湿痹痛、破伤风正、脾虚湿盛。

生甘草：味甘，性平，归心经、肺经、脾经、胃经，补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药。用于脾胃虚弱、倦怠乏力、心悸气短、咳嗽痰多、脘腹、四肢挛急疼痛、痈肿疮毒，缓解药物毒性、烈性。

藿香：味辛，性微温，归脾经、胃经、肺经，芳香化浊、和中止呕、发表解暑，用于湿浊中阻、脘痞呕吐、暑湿表证、湿温初起、发热倦怠、胸闷不舒、寒湿闭暑、腹痛吐泻、鼻渊头痛，还具有杀菌功能。

根据中兽医对腹泻的辩证分析，仔猪腹泻多为外邪、饮食、脏腑虚衰及功能失调所致，与湿盛、脾胃关系大。因此，本申请中银花、柴胡、黄芩、板蓝根、贯仲、生甘草清热解毒、疏气解郁，苍术、生苡仁、防风、生甘草健脾利湿，生黄芪升阳补气，藿香治疗腹痛吐泻，并有杀菌功效，生甘草调和诸药，各味中药配伍严谨、协同配合，能够清热止泻、健脾益气，增强仔猪的免疫力。

本发明的有益效果为：本发明选择屎肠球菌和中药组合物作为免疫增强剂以制备抗仔猪产毒大肠杆菌性腹泻卵黄抗体，一方面该抗体具有靶向作用，对仔猪产毒大肠杆菌性引起的腹泻的紧急治疗具有实用价值，同时抗体中含有中药组合物，能够清热止泻、健脾益气，提高仔猪免疫力，两者协同增效，减少仔猪的腹泻发生率，而且不会对仔猪带来应激等不良影响；本发明使用SPF蛋鸡免疫，获得蛋黄更加纯净，没有传染疾病的可能性；同时也可运用该制剂对同群末感染的仔猪进行预防，从而对减少养猪业的经济损失，促进新型兽用生物药物开发具有重要意义，本发明的口服剂制备工艺简单，适合规模化生产及临床应用。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

一种抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体的制备方法，依次包括如下步骤：

1)采用仔猪大肠杆菌K88、K99双价基因工程活疫苗免疫20～30周龄的SPF蛋鸡；

2)采用仔猪大肠杆菌性腹泻发病猪肠道分离物，产肠毒素大肠杆菌、肠毒素及黏附性菌毛蛋白混合免疫原对SPF蛋鸡进行免疫：初次免疫前5日注射仔猪大肠杆菌病K88、K99双价基因工程活疫苗及混合免疫原进行免疫刺激，首免时注射1ml；2周后进行第二次免疫，分别注射仔猪大肠杆菌病K88、K99双价基因工程活疫苗及混合免疫原1ml；再隔2周进行第三次免疫，注射仔猪大肠杆菌病K88、K99双价基因工程活疫苗及混合免疫原2ml；再隔4周后进行第四次免疫，所述首免、第二次免疫、第三次免疫和第四次免疫均采用肌肉分点免疫；

3)在步骤2)中的SPF蛋鸡免疫过程中喂食添加量为饲料0.1％的屎肠球菌Anp01(EnterococcusfaeciumAnp01)CCTCCM209019及添加量为饲料10％的中药组合物：生黄芪10千克、银花10千克、柴胡5千克、黄芩5千克、板兰根10千克、贯仲10千克、苍术5千克、生苡仁10千克、防风5千克、生甘草1千克、藿香5千克，粉碎过100目筛，首免后6～14周收集被免疫的鸡所产鸡蛋，将鸡蛋经75％酒精消毒后，用卵黄分离器分离蛋白，收集卵黄，弃卵黄膜，加卵黄液9倍体积的pH5.2酸化水稀释，充分搅拌，4℃冰箱中静置超过6h，在10000r/min4℃离心10min，收集上清液获得卵黄水提液；将所述卵黄水提液于-70℃冰箱中过夜，取出，解冻后10000r/min离心15min，弃去沉淀，收集上液，经0.22μm滤膜过滤后，获得抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体IgY；然后采用聚乙二醇(PEG-6000)沉淀法提纯上述抗体，具体步骤为：依次分别用3.5％PEG-6000、8.5％PEG-6000、12％PEG-6000对卵黄抗体沉淀3次，最后用预冷的50％乙醇进一步沉淀，得到1号卵黄抗体提纯物。

实施例2：

所述中药组合物的组成为：生黄芪20千克、银花20千克、柴胡15千克、黄芩15千克、板兰根20千克、贯仲20千克、苍术15千克、生苡仁20千克、防风15千克、生甘草10千克、藿香15千克，粉碎过120目筛。

其他与实施例1相同，得2号卵黄抗体提纯物。

实施例3：

所述中药组合物的组成为：生黄芪15千克、银花15千克、柴胡10千克、黄芩10千克、板兰根15千克、贯仲15千克、苍术10千克、生苡仁15千克、防风10千克、生甘草5千克、藿香10千克，粉碎过110目筛。

其他与实施例1相同，得3号卵黄抗体提纯物。

实施例4：对产毒大肠杆菌卵黄抗体的治疗试验

1.试验材料

药品为按照本发明实施例3制备的3号卵黄抗体提纯物；试验对象为1日龄未吃初乳仔猪120头，设立攻毒治疗组、攻毒不治疗组、不攻毒治疗组、不攻毒不治疗组，每组30头。

2.治疗试验

2.1治疗方案

攻毒所用菌株为产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenicescherichiacoil，ETEC)，10倍稀释后直接口服；琼脂扩散试验测定实施例3制备的3号卵黄抗体提纯物效价为1∶64，口服饲喂，根据各组临床症状及死亡率来判断产肠毒素大肠杆菌卵黄抗体的治疗效果。

抗体用法用量：每天喂两次，连喂三天，连续观察7天。

2.2治愈标准

腹泻症状停止且随后排出粪便正常，仔猪食欲恢复正常，且精神状态、饮水等活动均正常。

2.3结果分析

试验结果表明：1)不攻毒不治疗组和不攻毒治疗仔猪生长正常，未出现腹泻症状，饲喂卵黄抗体与否对其生长没有影响；2)攻毒治疗组和攻毒不治疗组仔猪均出现严重的腹泻症状，表现为黄色水泻，仔猪迅速消瘦，攻毒不治疗组仔猪三天内全部死亡，而攻毒治疗组仔猪腹泻症状则明显减轻，粪便由水泻变为软粪，并逐渐成形，一周后逐渐恢复，未出现死亡情况。

本发明中制备的卵黄抗体制剂为鸡的免疫球蛋自，能够特异性的中和产毒大肠杆菌致病菌，同时，添加的屎肠球菌和中药组合物对仔猪消化系统有营养和修复作用；可用于治疗临床上由产毒大肠杆菌感染导致的仔猪腹泻，对于末感染的仔猪可以起到预防作用；临床试验表明，使用本发明制备的产品可以减少仔猪腹泻的发病率，提高猪场的经济效益；本发明制备成本低，无残留，适合大规模生产和推广。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，依次包括如下步骤：

1)采用仔猪大肠杆菌K88、K99双价基因工程活疫苗免疫SPF蛋鸡；

2)采用仔猪大肠杆菌性腹泻发病猪肠道分离物，产肠毒素大肠杆菌、肠毒素及黏附性菌毛蛋白混合免疫原对SPF蛋鸡进行免疫；

3)在步骤2)中的SPF蛋鸡免疫过程中喂食屎肠球菌Anp01(Enterococcus faeciumAnp01)CCTCCM209019及中药组合物，然后收集被免疫的鸡所产鸡蛋，从其蛋黄中提纯抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体IgY；

所述步骤2)中，对SPF产蛋鸡进行免疫的步骤为：初次免疫前5日注射仔猪大肠杆菌病K88、K99双价基因工程活疫苗及混合免疫原进行免疫刺激，首免时注射1ml；2周后进行第二次免疫，分别注射仔猪大肠杆菌病K88、K99双价基因工程活疫苗及混合免疫原1ml；再隔2周进行第三次免疫，注射仔猪大肠杆菌病K88、K99双价基因工程活疫苗及混合免疫原2ml；再隔4周后进行第四次免疫，所述首免、第二次免疫、第三次免疫和第四次免疫均采用肌肉分点免疫；

步骤3)中，收集鸡蛋时间为步骤2)中首免后6～14周；

步骤3)中，提纯抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体采用聚乙二醇PEG-6000沉淀法，具体步骤为：依次分别用3.5％PEG-6000、8.5％PEG-6000、12％PEG-6000对卵黄抗体沉淀3次，最后用预冷的50％乙醇进一步沉淀，得到卵黄抗体提纯物；

步骤3)中，所述中药组合物的组成为：生黄芪10～20份、银花10～20份、柴胡5～15份、黄芩5～15份、板兰根10～20份、贯仲10～20份、苍术5～15份、生苡仁10～20份、防风5～15份、生甘草1～10份、藿香5～15份，粉碎过100～120目筛；

步骤3)中，所述屎肠球菌Anp01(Enterococcusfaecium Anp01)CCTCCM209019的添加量为饲料的0.1％，所述中药组合物的添加量为饲料的10％；

将步骤3)所述的鸡蛋，经75％酒精消毒后，用卵黄分离器分离蛋白，收集卵黄，弃卵黄膜，加卵黄液9倍体积的pH5.2酸化水稀释，充分搅拌，4℃冰箱中静置超过6h，在10000r/min4℃离心10min，收集上清液获得卵黄水提液；将所述卵黄水提液于-70℃冰箱中过夜，取出，解冻后10000r/min离心15min，弃去沉淀，收集上液，经0.22μm滤膜过滤后，获得抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体IgY。

2.如权利要求1所述的一种抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述SPF蛋鸡为20～30周龄。

3.如权利要求1所述的一种抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述中药组合物的组成为：生黄芪15份、银花15份、柴胡10份、黄芩10份、板兰根15份、贯仲15份、苍术10份、生苡仁15份、防风10份、生甘草5份、藿香10份，粉碎过110目筛。

4.如权利要求1-3任一项所述方法制备的抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体。