CN109912712A - 一种抗犊牛大肠杆菌F41菌毛抗原高免卵黄抗体IgY的制备方法及应用 - Google Patents
一种抗犊牛大肠杆菌F41菌毛抗原高免卵黄抗体IgY的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及农业技术领域，具体地涉及一种抗犊牛大肠杆菌F41菌毛抗原高免卵黄抗体IgY的制备方法及应用；包括以下步骤：(1)致病菌的分离鉴定；(2)菌毛基因鉴定筛选；(3)菌毛抗原提取纯化；(4)卵黄无菌分离；(5)抗体纯化。本发明思路清晰，利用犊牛大肠杆菌F41菌毛为抗原，免疫产蛋鸡，使产蛋鸡产生抗菌毛的抗体，收集高免蛋分离卵黄，从卵黄中提取抗体即为高免卵黄抗体(IgY)，然后应用于犊牛大肠杆菌病的治疗和预防。
Description
技术领域
本发明涉及农业技术领域，特别是涉及一种抗犊牛大肠杆菌F41菌毛抗原高免卵黄抗体IgY的制备方法及应用。
背景技术
犊牛大肠杆菌是一种常发的细菌性传染病，犊牛发病后有较高的死亡率。致病性大肠杆菌血清型较多，给本病的预防带来困难，一般的治疗都选择抗生素，但是抗生素在治疗过程中往往会发生耐药性现象，或者造成犊牛肠道有益菌群的破坏而贻误治疗。尤其是禁抗令的颁布实施，使临床上能够应用的抗生素的种类越来越少，这又给犊牛大肠杆菌病的治疗带来困难。
动物一般在病原微生物(抗原)的刺激下，机体的特异性免疫应答一般可分为三个阶段：(1)感应阶段：是抗原处理、呈递和识别的阶段；(2)反应阶段：是B细胞、T细胞增殖分化，以及记忆细胞形成的阶段；(3)和效应阶段：效应T细胞、抗体和淋巴因子发挥免疫效应的阶段。如果某些病原体突破了第一道和第二道防线，即进入动物体并生长繁殖，引起感染。有的有症状，就是患病；有的没有症状，称作隐性感染。不论是哪一种情况，机体都经历了一次与病原体斗争的过程，这种专门针对某一种病原体(抗原)的识别和杀灭作用称为特异性免疫。譬如得过大肠杆菌病的动物对大肠杆菌有持久的免疫力，那是因为大肠杆菌刺激机体产生免疫应答，增加了巨噬细胞的吞噬功能，同时在体内还产生抗大肠杆菌的抗体。人体的免疫系统又能把大肠杆菌这个“敌人”的特征长期“记忆”下来，如果再有大肠杆菌进入，就会很快被识别、被消灭。能进行免疫应答的免疫细胞有很多种，最重要的是淋巴细胞。它又分成两种。两种细胞的发育成熟过程不一样，一种是在胸腺内发育成熟，称作T淋巴细胞，是在骨髓内发育成熟的为B淋巴细胞。B淋巴细胞受病原体刺激后，引起一系列变化，最终转化成为能产生抗体的浆细胞，所产生的抗体通过各种方式来消灭病原体，如溶解病原体，中和病原体产生的毒素，凝集病原体使之成为较大颗粒让吞噬细胞吞食消灭。浆细胞产生的抗体存在于机体的血液和体液中，这种免疫反应就称为体液免疫。
卵黄抗体IgY是指存在于禽蛋黄中的免疫球蛋白，是禽类为了保护其后代在新生期不受外界环境的病原微生物侵袭而产生的特殊抗病机制。近年来，国内外学者对IgY在动物腹泻防制方面进行了广泛研究，并证明了IgY能有效防制动物腹泻，且特异性IgY使用方便、无残留、不会导致细菌耐药性，应用前景广阔。抗动物大肠杆菌高免卵黄抗体IgY提取的纯度不够高；大肠杆菌血清型复杂多样，针对血清型的IgY对致病性的大肠杆菌覆盖性不高；接种后的动物易产生抗IgY动物大肠杆菌高免卵黄抗体的抗体，重复使用效果降低。
大肠杆菌致病主要通过黏附素(菌毛)吸附肠黏膜细胞，如果能够阻断大肠杆菌吸附宿主细胞就能够控制大肠杆菌对宿主的感染。由于大肠杆菌病对于养殖业会造成巨大经济损失，且目前全世界范围内养殖业的无抗生素养殖的流行趋势，国家对于养殖业抗生素使用的限制，耐药的超级细菌的迅速增加，挖掘出高纯度的可以治疗和预防临床犊牛感染大肠杆菌腹泻病的卵黄抗体IgY对于养殖业具有很大价值。
发明内容
本发明为了克服上述技术问题的不足，提供了一种抗犊牛大肠杆菌F41菌毛抗原高免卵黄抗体IgY的制备方法及应用，抗动物大肠杆菌高免卵黄抗体IgY能够高效、无副作用、无耐药性的治疗和预防动物大肠杆菌病。
解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明设计了一种抗犊牛大肠杆菌F41菌毛抗原高免卵黄抗体IgY的制备方法，包括以下步骤：
(1)致病菌的分离鉴定；
(2)菌毛基因鉴定筛选；
(3)菌毛抗原提取纯化；
(4)卵黄无菌分离；
(5)抗体纯化。
进一步地说，步骤(1)所述的致病菌的分离鉴定具体步骤为：
(a)将采集的犊牛腹泻粪便分别接种于普通琼脂培养基、麦康凯培养基和伊红美蓝培养基上，放在37℃恒温培养箱连续培养24h，选择单菌落进行染色镜检，然后进行纯化培养；
(b)选取分离获得的犊牛致病性大肠杆菌菌株，分别接种营养肉汤培基培养，制备含菌量为109CFU/mL的悬浮液后腹腔接种小鼠体内，每只小鼠接种0.2mL，共5只，再做一组空白对照组小鼠接种无菌营养肉汤，每只小鼠接种0.2mL，共5只，接种后隔离饲养观察5d，记录小鼠死亡情况。
进一步地说，步骤(2)所述的菌毛基因鉴定筛选的具体步骤为：取步骤(1)鉴定好的菌株接种至5mL LB液体培养基中，置于恒温摇床37℃培养24h；取培养好的菌液1.5mL至离心管中，14000r/min离心10min；离心后弃上清液，向沉淀加入15μL溶菌酶，所述的溶菌酶的浓度为50mg/mL，300μLTE缓冲液吹打菌泥沉淀至混匀，37℃水浴1h；加入50μL 10％SDS、10μL蛋白酶K，置于振荡器中混合均匀，所述的蛋白酶K的浓度为20mg/mL，60℃水浴2h，并每隔5min上下颠倒混匀；加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液；所述的酚/氯仿/异戊醇混合液的混合体积比为25:24:1，置于振荡器中混匀，14000r/min离心15min，取上清液置于新的离心管中；加入等体积氯仿/异戊醇，洗脱饱和酚，14000r/min离心10min；再加入10：1体积乙酸钠，2:1体积无水乙醇，置于摇床中1h；取出后14000r/min离心10min，弃上清，用预冷的75％酒精洗下沉淀，14000r/min再次离心10min，弃上清，室温下晾干离心管内酒精为止；向沉淀中加入50μLTE缓冲液，混合均匀后置于-20℃保存备用；
F41 PCR引物序列如下表所示：
所述的F41 PCR引物序列：
PCR反应体系：
| MgCl<sub>2</sub> | 2μL |
| RxnBuffer | 2μL |
| 上引物 | 1μL |
| 下引物 | 1μL |
| Taq酶 | 1μL |
| 大肠杆菌DNA模板 | 2μL |
| 总计 | 加ddH<sub>2</sub>O补齐30μL |
以提取的大肠杆菌DNA为模板，进行PCR反应，反应条件为：在95℃预变性10min，再变性35s，在57℃退火35s后72℃延伸35s，如此循环35次，在72℃延伸10min；反应结束后将PCR产物在2％琼脂糖凝胶下90V电泳30min后，EB染色15min，紫外线下观察结果，获得菌毛基因。
进一步地说，步骤(3)所述的菌毛抗原提取纯化的具体步骤为：
(a)TA克隆的构建
将F41的目的基因与18T-Vactor载体连接，14℃连接4h，反应体系10μL；
所述的反应体系包括：F41(4.5μL)、pMD18-T(0.5μL)和Solution I(5.0μL)；
(b)制备JM109/BL21感受态细胞
将JM109/BL21菌株接种于普通琼脂平板培养基中，37℃培养16h；挑取单个菌落接种到含有100mL LB液体培养基的1L三角瓶中，置于恒温摇床中37℃培养；期间检测菌液OD600值，当OD600达到0.4时，收获菌液；将菌液转移至无菌的一次性使用的预冷的EP管中；在冰上放置，直至菌液温度降至0℃为止；4100r/min离心菌液15min，弃上清；按照每50mL初始培养物加入30mL预冷的0.1mol/L氯化钙-氯化镁水溶液，重悬沉淀；4100r/min离心菌液15min，弃上清；按照每50mL初始培养物加入2mL预冷的0.1mol/L氯化钙水溶液，重悬沉淀；将制备好的JM109/BL21感受态细胞按每份90μL分装至一次性无菌离心管中于-80℃保存备用；
(c)连接产物的转化
将步骤(b)制备好的JM109感受态细胞从-80℃冰箱中取出，置于冰上，待感受态细胞融化后，将全部连接产物加入到感受态细胞中，再次置于冰上，冰浴30min；将离心管置于42℃水浴锅中热休克45s后，快速将离心管转移至冰上继续冰浴1min；向离心管中加入LB液体培养基900μL，置于恒温摇床37℃、140r/min震荡培养1h；培养后将离心管1500r/min离心1min，弃一半上清后，混合均匀，吸取50μL均匀涂布于X-Gal选择平板培养基中，37℃培养过夜；
(d)pMD-18T-F41重组质粒的提取
将步骤(c)转化后的JM109菌株接种于含有Amp抗性的LB液体培养基，置于空气摇床中37℃，200r/min震荡培养14h，培养好的菌液取1.5mL置于无菌的一次性离心管中，15000r/min离心5min，弃上清，向离心管中加入150μLP1溶液，上下颠倒直至溶液混匀使其沉淀完全溶解，向离心管中加入350μLP2溶液，上下颠倒混匀，使菌完全裂解；向离心管中加入350μLP3溶液，上下颠倒使其混匀，12000r/min，离心5min，向吸附柱加入350μL漂洗液，室温下静置5min，15000r/min，离心1min，弃废液，2000r/min，离心1min，后将吸附柱置于新的离心管，加入60μL洗脱缓冲液，室温下静置3min，15000r/min，离心2min，将提取质粒收集到离心管内，-20℃保存备用；
(e)pET-28a(+)重组质粒提取
向CP6吸附柱中加入2.5mL平衡液BL，10000r/min离心5min弃掉废液；取100mL已经培养好的pET-28a(+)菌液，加入离心管中，10000r/min离心5min收集菌泥，弃掉上清；向有菌体沉淀的离心管中加入P1溶液10mL，用涡旋振荡器重悬菌体沉淀；向离心管中加入10mLP2溶液，快速并温和的上下颠倒离心管3-5次，使菌体裂解充分并于室温下放置10min；向离心管中加入10mLP3溶液，上下颠倒离心管3-5次，使之充分混合，至溶液出现白色絮状分散沉淀后置于室温下10min，10000r/min离心15min直至白色沉淀全部降至离心管底部；将溶液小心全部倒入过滤器中，缓慢推动过滤器过滤溶液，将溶液收集在一个新的离心管中；向离心管中加入溶液体积约0.3倍的异丙醇，上下颠倒混匀，转移至吸附柱中10000r/min离心5min，弃掉废液；向吸附柱加入漂洗液10mL，10000r/min离心3min，弃掉废液；重复漂洗一次；向吸附柱中加入无水乙醇5mL，10000r/min离心10min，弃掉废液，室温下静置直至无水乙醇完全挥发；向吸附柱中加入洗脱缓冲液1.5mL，室温静置10min，120000r/min离心3min；洗脱下来的溶液置于新的离心管中，-20℃保存备用；
其中，步骤(d)和步骤(e)中所述的P1溶液为：50mM葡萄糖、25mMTris-HCl和10mMEDTA组成的pH 8.0的混合溶液；
所述的P2溶液为：0.2N NaOH/1％SDS混合溶液；
所述的P3溶液为：pH4.8的5mol/LKAc溶液；
(f)重组质粒pMD-18T-F41和pET-28a(+)双酶切
重组质粒pMD-18T-F41和pET-28a(+)均进行HindⅢ、BamHⅠ双酶切，酶切后分别进行凝胶电泳，电泳后回收酶切产物；
(g)pMD-18T-F41和pET-28a(+)双酶切产物连接
通过T4连接酶将pMD-18T-F41和pET-28a(+)双酶切产物连接，连接反应体系为10μL，其中ddH2O(1μL)，pMD-18T-F41双酶切产物(3μL)，pET-28a(+)双酶切产物(3μL)，T4连接酶(1μL)，T4DNA连接缓冲液(2μL)；以上试剂混合后置于PCR管中37℃连接过夜；
(h)连接产物的转化
将制备好的BL21感受态细胞从-80℃冰箱中取出，置于冰上，待感受态细胞融化后，将全部连接产物加入到感受态细胞中，再次置于冰上，冰浴30min；将离心管置于42℃水浴锅中热休克45s后，快速将离心管转移至冰上继续冰浴1min；向离心管中加入LB液体培养基900μL，置于恒温摇床37℃、140r/min震荡培养1h；培养后将离心管1500r/min离心1min，弃一半上清后，均匀混匀，吸取50μL均匀涂布于X-Gal选择平板培养基中，37℃连续培养24h；
(i)菌毛F41蛋白样品的制备
取含有重组表达载体pET-28a-F41菌液接种于5ml含有Kam抗性的LB液体培养基，置于空气摇床37℃，220r/min培养16h；再将培养的菌液全部加入到含有Kam抗性的500mLLB液体培养基中，并进行诱导表达；将经诱导好的产物以10000r/min离心10min，用PBS缓冲液重复洗涤两次，用pH＝8.5的Tris-CI 30mL震荡重悬沉淀，并向其中加入1mg/mL溶菌酶使其充分反应1h；反应过后置于超声波细胞震碎仪中10min，进行细胞裂解；将裂解后的产物15000r/min离心15min，取上清-20℃保存备用；
(j)菌毛F41融合蛋白的纯化
取2ml Ni-NTAbeads，3500r/min离心10min，用结合缓冲液5mL重悬，重复2次；将制备好的蛋白样品2mL加入到上一步离心管中，室温下结合5h；3500r/min离心10min，弃掉上清，用漂洗缓冲液洗涤沉淀；5000r/min离心5min，用5mL洗脱缓冲液洗脱蛋白；4℃保存备用；所述的Ni-NTAbeads为以4％琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法耦联了四配位的氮川三乙酸，螯合镍离子Ni2+。
进一步地说，步骤(4)所述的卵黄无菌分离的具体步骤为：清水洗净鸡蛋后，用0.1％的新洁尔灭消毒，再用75％的酒精擦拭外壳，在紫外灯下照射并晾干；于无菌条件下打开蛋壳，小心分离蛋白，用灭菌滤纸吸取蛋黄表面的残留蛋清，用注射器刺破蛋黄膜，每枚蛋黄液取3ml，一共取蛋黄液20g，收集入离心管中。
进一步地说，步骤(5)所述的抗体纯化的具体步骤为：采用步骤(4)的蛋黄液加入20ml 0.1mol/L的pH为7.6的Tris-HCL(三氨基甲烷)缓冲液，混合均匀后加人PEG至其浓度为3.5％(W/V)并充分混合；8000r/min离心25min，取上清液再加人PEG至其终浓度为12％(W/V)并充分混合；12000r/min离心10min，弃去上清液，将沉淀物用10ml浓度为0.01mol/L的PBS溶液复溶，再加入PEG至终浓度为12％(W/V)，充分混合；12000r/min离心10min，弃去上清液，将沉淀物用2mlPBS溶液复溶。
本发明还提供了上述抗犊牛大肠杆菌F41菌毛抗原高免卵黄抗体IgY的应用，是应用于临床犊牛感染大肠杆菌腹泻病治疗和预防。
本发明的有益效果是：
本发明思路清晰，利用犊牛大肠杆菌F41菌毛为抗原，免疫产蛋鸡，使产蛋鸡产生抗菌毛的抗体，收集高免蛋分离卵黄，从卵黄中提取抗体即为高免卵黄抗体(IgY)，然后应用于犊牛大肠杆菌病的治疗和预防。经过物理和化学的方法进行高度提纯；通过针对大肠杆菌通用的菌毛制成IgY，对致病性大肠杆菌覆盖性提高；本发明方法制备的产品既可以治疗也可以预防。本发明抗动物大肠杆菌高免卵黄抗体IgY能够高效、无副作用、无耐药性的治疗动物大肠杆菌病，从而降低养殖的经济损失，提高畜禽养殖的经济效益，为人们提供更多健康无抗的动物产品。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1：
(1)致病菌的分离鉴定；具体步骤为：
(a)将采集的犊牛腹泻粪便分别接种于普通琼脂培养基、麦康凯培养基和伊红美蓝培养基上，放在37℃恒温培养箱连续培养24h，选择单菌落进行染色镜检，然后进行纯化培养；
(b)选取分离获得的犊牛致病性大肠杆菌菌株，分别接种营养肉汤培基培养，制备含菌量为109CFU/mL的悬浮液后腹腔接种小鼠体内，每只小鼠接种0.2mL，共5只，再做一组空白对照组小鼠接种无菌营养肉汤，每只小鼠接种0.2mL，共5只，接种后隔离饲养观察5d，记录小鼠死亡情况。
(2)菌毛基因鉴定筛选；具体步骤为：
取步骤(1)鉴定好的菌株接种至5mL LB液体培养基中，置于恒温摇床37℃培养24h；取培养好的菌液1.5mL至离心管中，14000r/min离心10min；离心后弃上清液，向沉淀加入15μL溶菌酶，所述的溶菌酶的浓度为50mg/mL，300μLTE缓冲液吹打菌泥沉淀至混匀，37℃水浴1h；加入50μL 10％SDS、10μL蛋白酶K，置于振荡器中混合均匀，所述的蛋白酶K的浓度为20mg/mL，60℃水浴2h，并每隔5min上下颠倒混匀；加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液；所述的酚/氯仿/异戊醇混合液的混合体积比为25:24:1，置于振荡器中混匀，14000r/min离心15min，取上清液置于新的离心管中；加入等体积氯仿/异戊醇，洗脱饱和酚，14000r/min离心10min；再加入10：1体积乙酸钠，2:1体积无水乙醇，置于摇床中1h；取出后14000r/min离心10min，弃上清，用预冷的75％酒精洗下沉淀，14000r/min再次离心10min，弃上清，室温下晾干离心管内酒精为止；向沉淀中加入50μLTE缓冲液，混合均匀后置于-20℃保存备用；
F41 PCR引物序列如下表所示：
PCR反应体系：
| MgCl<sub>2</sub> | 2μL |
| RxnBuffer | 2μL |
| 上引物 | 1μL |
| 下引物 | 1μL |
| Taq酶 | 1μL |
| 大肠杆菌DNA模板 | 2μL |
| 总计 | 加ddH<sub>2</sub>O补齐30μL |
以提取的大肠杆菌DNA为模板，进行PCR反应，反应条件为：在95℃预变性10min，再变性35s，在57℃退火35s后72℃延伸35s，如此循环35次，在72℃延伸10min；反应结束后将PCR产物在2％琼脂糖凝胶下90V电泳30min后，EB染色15min，紫外线下观察结果，获得菌毛基因。
(3)菌毛抗原提取纯化；具体步骤为：
(a)TA克隆的构建
将F41的目的基因与18T-Vactor载体连接，14℃连接4h，反应体系10μL；
所述的反应体系包括：F41(4.5μL)、pMD18-T(0.5μL)和Solution I(5.0μL)；
(b)制备JM109/BL21感受态细胞
将JM109/BL21菌株接种于普通琼脂平板培养基中，37℃培养16h；挑取单个菌落接种到含有100mL LB液体培养基的1L三角瓶中，置于恒温摇床中37℃培养；期间检测菌液OD600值，当OD600达到0.4时，收获菌液；将菌液转移至无菌的一次性使用的预冷的EP管中；在冰上放置，直至菌液温度降至0℃为止；4100r/min离心菌液15min，弃上清；按照每50mL初始培养物加入30mL预冷的0.1mol/L氯化钙-氯化镁水溶液，重悬沉淀；4100r/min离心菌液15min，弃上清；按照每50mL初始培养物加入2mL预冷的0.1mol/L氯化钙水溶液，重悬沉淀；将制备好的JM109/BL21感受态细胞按每份90μL分装至一次性无菌离心管中于-80℃保存备用；
(c)连接产物的转化
将步骤(b)制备好的JM109感受态细胞从-80℃冰箱中取出，置于冰上，待感受态细胞融化后，将全部连接产物加入到感受态细胞中，再次置于冰上，冰浴30min；将离心管置于42℃水浴锅中热休克45s后，快速将离心管转移至冰上继续冰浴1min；向离心管中加入LB液体培养基900μL，置于恒温摇床37℃、140r/min震荡培养1h；培养后将离心管1500r/min离心1min，弃一半上清后，混合均匀，吸取50μL均匀涂布于X-Gal选择平板培养基中，37℃培养过夜；
(d)pMD-18T-F41重组质粒的提取
将步骤(c)转化后的JM109菌株接种于含有Amp抗性的LB液体培养基，置于空气摇床中37℃，200r/min震荡培养14h，培养好的菌液取1.5mL置于无菌的一次性离心管中，15000r/min离心5min，弃上清，向离心管中加入150μLP1溶液，上下颠倒直至溶液混匀使其沉淀完全溶解，向离心管中加入350μLP2溶液，上下颠倒混匀，使菌完全裂解；向离心管中加入350μLP3溶液，上下颠倒使其混匀，12000r/min，离心5min，向吸附柱加入350μL漂洗液，室温下静置5min，15000r/min，离心1min，弃废液，2000r/min，离心1min，后将吸附柱置于新的离心管，加入60μL洗脱缓冲液，室温下静置3min，15000r/min，离心2min，将提取质粒收集到离心管内，-20℃保存备用；
(e)pET-28a(+)重组质粒提取
向CP6吸附柱中加入2.5mL平衡液BL，10000r/min离心5min弃掉废液；取100mL已经培养好的pET-28a(+)菌液，加入离心管中，10000r/min离心5min收集菌泥，弃掉上清；向有菌体沉淀的离心管中加入P1溶液10mL，用涡旋振荡器重悬菌体沉淀；向离心管中加入10mLP2溶液，快速并温和的上下颠倒离心管3-5次，使菌体裂解充分并于室温下放置10min；向离心管中加入10mLP3溶液，上下颠倒离心管3-5次，使之充分混合，至溶液出现白色絮状分散沉淀后置于室温下10min，10000r/min离心15min直至白色沉淀全部降至离心管底部；将溶液小心全部倒入过滤器中，缓慢推动过滤器过滤溶液，将溶液收集在一个新的离心管中；向离心管中加入溶液体积约0.3倍的异丙醇，上下颠倒混匀，转移至吸附柱中10000r/min离心5min，弃掉废液；向吸附柱加入漂洗液10mL，10000r/min离心3min，弃掉废液；重复漂洗一次；向吸附柱中加入无水乙醇5mL，10000r/min离心10min，弃掉废液，室温下静置直至无水乙醇完全挥发；向吸附柱中加入洗脱缓冲液1.5mL，室温静置10min，120000r/min离心3min；洗脱下来的溶液置于新的离心管中，-20℃保存备用；其中P1溶液为：50mM葡萄糖、25mMTris-HCl和10mM EDTA组成的pH 8.0的混合溶液；P2溶液为：0.2NNaOH/1％SDS混合溶液；P3溶液为：pH4.8的5mol/LKAc溶液；
(f)重组质粒pMD-18T-F41和pET-28a(+)双酶切
重组质粒pMD-18T-F41和pET-28a(+)均进行HindⅢ、BamHⅠ双酶切，酶切后分别进行凝胶电泳，电泳后回收酶切产物；
(g)pMD-18T-F41和pET-28a(+)双酶切产物连接
通过T4连接酶将pMD-18T-F41和pET-28a(+)双酶切产物连接，连接反应体系为10μL，其中ddH2O(1μL)，pMD-18T-F41双酶切产物(3μL)，pET-28a(+)双酶切产物(3μL)，T4连接酶(1μL)，T4DNA连接缓冲液(2μL)；以上试剂混合后置于PCR管中37℃连接过夜；
(h)连接产物的转化
将制备好的BL21感受态细胞从-80℃冰箱中取出，置于冰上，待感受态细胞融化后，将全部连接产物加入到感受态细胞中，再次置于冰上，冰浴30min；将离心管置于42℃水浴锅中热休克45s后，快速将离心管转移至冰上继续冰浴1min；向离心管中加入LB液体培养基900μL，置于恒温摇床37℃、140r/min震荡培养1h；培养后将离心管1500r/min离心1min，弃一半上清后，均匀混匀，吸取50μL均匀涂布于X-Gal选择平板培养基中，37℃连续培养24h；
(i)菌毛F41蛋白样品的制备
取含有重组表达载体pET-28a-F41菌液接种于5ml含有Kam抗性的LB液体培养基，置于空气摇床37℃，220r/min培养16h；再将培养的菌液全部加入到含有Kam抗性的500mLLB液体培养基中，并进行诱导表达；将经诱导好的产物以10000r/min离心10min，用PBS缓冲液重复洗涤两次，用pH＝8.5的Tris-CI 30mL震荡重悬沉淀，并向其中加入1mg/mL溶菌酶使其充分反应1h；反应过后置于超声波细胞震碎仪中10min，进行细胞裂解；将裂解后的产物15000r/min离心15min，取上清-20℃保存备用；
(j)菌毛F41融合蛋白的纯化
取2ml Ni-NTAbeads，3500r/min离心10min，用结合缓冲液5mL重悬，重复2次；将制备好的蛋白样品2mL加入到上一步离心管中，室温下结合5h；3500r/min离心10min，弃掉上清，用漂洗缓冲液洗涤沉淀；5000r/min离心5min，用5mL洗脱缓冲液洗脱蛋白；4℃保存备用；所述的Ni-NTAbeads为以4％琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法耦联了四配位的氮川三乙酸，螯合镍离子Ni2+。
(4)卵黄无菌分离；具体步骤为：
清水洗净鸡蛋后，用0.1％的新洁尔灭消毒，再用75％的酒精擦拭外壳，在紫外灯下照射并晾干；于无菌条件下打开蛋壳，小心分离蛋白，用灭菌滤纸吸取蛋黄表面的残留蛋清，用注射器刺破蛋黄膜，每枚蛋黄液取3ml，一共取蛋黄液20g，收集入离心管中。
(5)抗体纯化；具体步骤为：
采用步骤(4)的蛋黄液加入20ml 0.1mol/L的pH为7.6的Tris-HCL(三氨基甲烷)缓冲液，混合均匀后加人PEG至其浓度为3.5％(W/V)并充分混合；8000r/min离心25min，取上清液再加人PEG至其终浓度为12％(W/V)并充分混合；12000r/min离心10min，弃去上清液，将沉淀物用10ml浓度为0.01mol/L的PBS溶液复溶，再加入PEG至终浓度为12％(W/V)，充分混合；12000r/min离心10min，弃去上清液，将沉淀物用2mlPBS溶液复溶。
将上述抗犊牛大肠杆菌F41菌毛抗原高免卵黄抗体IgY应用于临床犊牛感染大肠杆菌腹泻病治疗和预防。还包括以下步骤：
(6)动物实验；
体外吸附与体外吸附抑制试验：
将新生犊牛剖杀后取其小肠，用1xPBS反复冲洗其内壁至冲出的液体清亮，将肠管一端结扎后注入EDTA缓冲液并扎紧另一端，放于预热的1xPBS里，于37℃孵育30min，期间不时的摇动或轻揉肠壁。将肠内容物移至离心管并反复吸吹，直至细胞悬液至均匀，3000r/min离心5min，去上清，沉淀用EDTA缓冲液重悬，再次离心，沉淀用Hank’s平衡液洗涤两次后重悬。将0.5ml分离制备的犊牛上皮细胞加入灭菌离心管中，再加入BL21菌液，混匀，于37℃孵育30min后，3000r/min离心5min，除去未黏附的大肠杆菌，再用Hank’s平衡液重新悬浮并反复漂洗两次，最后沉淀用1ml的Hank’s平衡液悬浮，取10μL滴于洁挣的载玻片上，自然干燥，火焰固定，革兰氏染色，油镜观察。取等量细菌悬液与制备的卵黄抗体于37℃作用30min后，与制备的小肠上皮细胞按1:1混合，放于37℃孵育30min，3000r/min离心5min，小心去上清，沉淀用Hank’s平衡液洗两次后用适量Hank’s平衡液悬浮、取10μL滴于洁净的载玻片上，自然干燥，火焰固定，革兰氏染色，油镜观察。
乳鼠感染模型的建立：
将乳鼠随机分组，各组采用不同剂量的活菌经肠道攻击，选择乳鼠72h内100％腹泻和死亡的攻击量(LD100)，建立乳鼠的感染模型。将乳鼠随机分两组，用已确定的活菌剂量经口攻击，0.1ml/只，约12h后动物发生腹泻，治疗组口服给予抗体2mg，间隔12h重复给予，共5次，观察3天，对照组按相同时间给予等量生理盐水，观察各组动物的存活情况。
(7)抗体安检及校验；
采用ELISA方法进行。
具体方法为：用制备的抗原包被聚苯乙烯微量滴定板，3％牛血清白蛋白封闭，PBS-Tween洗涤后，将待检IgY作倍比稀释加入孔中，在37℃孵育1h，洗涤后加1：3000生物素化的鼠抗鸡IgG，在37℃保持1h，洗涤后加入1：200Avidin-HRP(抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶)，在37℃保持0.5h，以新鲜配制的OPD底物溶液显色，2M H2SO4作终止液。用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定光密度OD值。
IgY抗体的纯度及回收率的检测：
采用SDS-PAGE方法进行。
具体方法为：用含巯基乙醇的样本处理液处理待检IgY抗体及加硫酸铵沉淀后的上清，同时处理标准的IgY作对照。采用8％分离胶，5％浓缩胶，恒压60V电泳，当溴酚蓝指示带达到分离胶时，加大电压至100V，电泳完毕取出凝胶，进行考马斯亮蓝染色，进行双波长薄层扫描，分析卵黄抗体IgY纯度。
采用间接ELISA法和琼脂扩散实验(AGP)，按常规操作步骤进行。取灭活菌体稀释成108～109CFU/ml包被酶标板；1％BSA-PBST封闭；兔抗鸡IgG工作浓度为1∶320；以四甲基联苯胺(TMB)底物溶液显色，2mol/L硫酸终止反应。酶联免疫检测仪在450nm波长下测定吸光值。AGP实验琼脂板中间孔孔径4mm，外周孔孔径及孔距均为3mm，48h判定结果。以能出现沉淀线的卵黄原液最大稀释倍数为其琼脂扩散效价。
本发明利用犊牛大肠杆菌F41菌毛为抗原，免疫产蛋鸡，使产蛋鸡产生抗菌毛的抗体，收集高免蛋分离卵黄，从卵黄中提取抗体，然后应用于犊牛大肠杆菌病的治疗和预防。经过物理和化学的方法进行高度提纯；通过针对大肠杆菌通用的菌毛制成IgY，对致病性大肠杆菌覆盖性提高；本发明方法制备的产品既可以治疗也可以预防。本发明抗动物大肠杆菌高免卵黄抗体IgY能够高效、无副作用、无耐药性的治疗动物大肠杆菌病，从而降低养殖的经济损失，提高畜禽养殖的经济效益，为人们提供更多健康无抗的动物产品。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质上对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 内蒙古民族大学
<120> 一种抗犊牛大肠杆菌F41菌毛抗原高免卵黄抗体IgY的制备方法及应用
<130> 20190228
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
ggcgaattcg cggcagtatc tggttcagt 29
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
agtctcgagc tgcagaaaca ccagatcca 29
<210> 3
<211> 837
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 3
ggcggcagta tctggttcag tgatggctgc tgattggacg gaaggtcaac caggtgacat 60
tattattggt ggtgaaatta catcaccatc tgttaaatgg ctatggaaga ctggagaggg 120
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Claims (7)
1.一种抗犊牛大肠杆菌F41菌毛抗原高免卵黄抗体IgY的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)致病菌的分离鉴定；
(2)菌毛基因鉴定筛选；
(3)菌毛抗原提取纯化；
(4)卵黄无菌分离；
(5)抗体纯化。
2.根据权利要求1所述的抗犊牛大肠杆菌F41菌毛抗原高免卵黄抗体IgY的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的致病菌的分离鉴定具体步骤为：
(a)将采集的犊牛腹泻粪便分别接种于普通琼脂培养基、麦康凯培养基和伊红美蓝培养基上，放在37℃恒温培养箱连续培养24h，选择单菌落进行染色镜检，然后进行纯化培养；
(b)选取分离获得的犊牛致病性大肠杆菌菌株，分别接种营养肉汤培基培养，制备含菌量为109CFU/mL的悬浮液后腹腔接种小鼠体内，每只小鼠接种0.2mL，共5只，再做一组空白对照组小鼠接种无菌营养肉汤，每只小鼠接种0.2mL，共5只，接种后隔离饲养观察5d，记录小鼠死亡情况。
3.根据权利要求1所述的抗犊牛大肠杆菌F41菌毛抗原高免卵黄抗体IgY的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的菌毛基因鉴定筛选的具体步骤为：取步骤(1)鉴定好的菌株接种至5mL LB液体培养基中，置于恒温摇床37℃培养24h；取培养好的菌液1.5mL至离心管中，14000r/min离心10min；离心后弃上清液，向沉淀加入15μL溶菌酶，所述的溶菌酶的浓度为50mg/mL，300μLTE缓冲液吹打菌泥沉淀至混匀，37℃水浴1h；加入50μL 10％SDS、10μL蛋白酶K，置于振荡器中混合均匀，所述的蛋白酶K的浓度为20mg/mL，60℃水浴2h，并每隔5min上下颠倒混匀；加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液；所述的酚/氯仿/异戊醇混合液的混合体积比为25:24:1，置于振荡器中混匀，14000r/min离心15min，取上清液置于新的离心管中；加入等体积氯仿/异戊醇，洗脱饱和酚，14000r/min离心10min；再加入10：1体积乙酸钠，2:1体积无水乙醇，置于摇床中1h；取出后14000r/min离心10min，弃上清，用预冷的75％酒精洗下沉淀，14000r/min再次离心10min，弃上清，室温下晾干离心管内酒精为止；向沉淀中加入50μLTE缓冲液，混合均匀后置于-20℃保存备用；
F41 PCR引物序列如下表所示：
PCR反应体系：
以提取的大肠杆菌DNA为模板，进行PCR反应，反应条件为：在95℃预变性10min，再变性35s，在57℃退火35s后72℃延伸35s，如此循环35次，在72℃延伸10min；反应结束后将PCR产物在2％琼脂糖凝胶下90V电泳30min后，EB染色15min，紫外线下观察结果，获得菌毛基因。
4.根据权利要求1所述的抗犊牛大肠杆菌F41菌毛抗原高免卵黄抗体IgY的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的菌毛抗原提取纯化的具体步骤为：
(a)TA克隆的构建
将F41的目的基因与18T-Vactor载体连接，14℃连接4h，反应体系10μL；
所述的反应体系包括：F41(4.5μL)、pMD18-T(0.5μL)和Solution I(5.0μL)；
(b)制备JM109/BL21感受态细胞
将JM109/BL21菌株接种于普通琼脂平板培养基中，37℃培养16h；挑取单个菌落接种到含有100mL LB液体培养基的1L三角瓶中，置于恒温摇床中37℃培养；期间检测菌液OD600值，当OD600达到0.4时，收获菌液；将菌液转移至无菌的一次性使用的预冷的EP管中；在冰上放置，直至菌液温度降至0℃为止；4100r/min离心菌液15min，弃上清；按照每50mL初始培养物加入30mL预冷的0.1mol/L氯化钙-氯化镁水溶液，重悬沉淀；4100r/min离心菌液15min，弃上清；按照每50mL初始培养物加入2mL预冷的0.1mol/L氯化钙水溶液，重悬沉淀；将制备好的JM109/BL21感受态细胞按每份90μL分装至一次性无菌离心管中于-80℃保存备用；
(c)连接产物的转化
将步骤(b)制备好的JM109感受态细胞从-80℃冰箱中取出，置于冰上，待感受态细胞融化后，将全部连接产物加入到感受态细胞中，再次置于冰上，冰浴30min；将离心管置于42℃水浴锅中热休克45s后，快速将离心管转移至冰上继续冰浴1min；向离心管中加入LB液体培养基900μL，置于恒温摇床37℃、140r/min震荡培养1h；培养后将离心管1500r/min离心1min，弃一半上清后，混合均匀，吸取50μL均匀涂布于X-Gal选择平板培养基中，37℃培养过夜；
(d)pMD-18T-F41重组质粒的提取
将步骤(c)转化后的JM109菌株接种于含有Amp抗性的LB液体培养基，置于空气摇床中37℃，200r/min震荡培养14h，培养好的菌液取1.5mL置于无菌的一次性离心管中，15000r/min离心5min，弃上清，向离心管中加入150μLP1溶液，上下颠倒直至溶液混匀使其沉淀完全溶解，向离心管中加入350μLP2溶液，上下颠倒混匀，使菌完全裂解；向离心管中加入350μLP3溶液，上下颠倒使其混匀，12000r/min，离心5min，向吸附柱加入350μL漂洗液，室温下静置5min，15000r/min，离心1min，弃废液，2000r/min，离心1min，后将吸附柱置于新的离心管，加入60μL洗脱缓冲液，室温下静置3min，15000r/min，离心2min，将提取质粒收集到离心管内，-20℃保存备用；
(e)pET-28a(+)重组质粒提取
向CP6吸附柱中加入2.5mL平衡液BL，10000r/min离心5min弃掉废液；取100mL已经培养好的pET-28a(+)菌液，加入离心管中，10000r/min离心5min收集菌泥，弃掉上清；向有菌体沉淀的离心管中加入P1溶液10mL，用涡旋振荡器重悬菌体沉淀；向离心管中加入10mLP2溶液，快速并温和的上下颠倒离心管3-5次，使菌体裂解充分并于室温下放置10min；向离心管中加入10mLP3溶液，上下颠倒离心管3-5次，使之充分混合，至溶液出现白色絮状分散沉淀后置于室温下10min，10000r/min离心15min直至白色沉淀全部降至离心管底部；将溶液小心全部倒入过滤器中，缓慢推动过滤器过滤溶液，将溶液收集在一个新的离心管中；向离心管中加入溶液体积约0.3倍的异丙醇，上下颠倒混匀，转移至吸附柱中10000r/min离心5min，弃掉废液；向吸附柱加入漂洗液10mL，10000r/min离心3min，弃掉废液；重复漂洗一次；向吸附柱中加入无水乙醇5mL，10000r/min离心10min，弃掉废液，室温下静置直至无水乙醇完全挥发；向吸附柱中加入洗脱缓冲液1.5mL，室温静置10min，120000r/min离心3min；洗脱下来的溶液置于新的离心管中，-20℃保存备用；
其中，步骤(d)和步骤(e)中所述的P1溶液为：50mM葡萄糖、25mMTris-HCl和10mM EDTA组成的pH 8.0的混合溶液；
所述的P2溶液为：0.2N NaOH/1％SDS混合溶液；
所述的P3溶液为：pH4.8的5mol/LKAc溶液；
(f)重组质粒pMD-18T-F41和pET-28a(+)双酶切
重组质粒pMD-18T-F41和pET-28a(+)均进行HindⅢ、BamHⅠ双酶切，酶切后分别进行凝胶电泳，电泳后回收酶切产物；
(g)pMD-18T-F41和pET-28a(+)双酶切产物连接
通过T4连接酶将pMD-18T-F41和pET-28a(+)双酶切产物连接，连接反应体系为10μL，其中ddH2O(1μL)，pMD-18T-F41双酶切产物(3μL)，pET-28a(+)双酶切产物(3μL)，T4连接酶(1μL)，T4DNA连接缓冲液(2μL)；以上试剂混合后置于PCR管中37℃连接过夜；
(h)连接产物的转化
将制备好的BL21感受态细胞从-80℃冰箱中取出，置于冰上，待感受态细胞融化后，将全部连接产物加入到感受态细胞中，再次置于冰上，冰浴30min；将离心管置于42℃水浴锅中热休克45s后，快速将离心管转移至冰上继续冰浴1min；向离心管中加入LB液体培养基900μL，置于恒温摇床37℃、140r/min震荡培养1h；培养后将离心管1500r/min离心1min，弃一半上清后，均匀混匀，吸取50μL均匀涂布于X-Gal选择平板培养基中，37℃连续培养24h；
(i)菌毛F41蛋白样品的制备
取含有重组表达载体pET-28a-F41菌液接种于5ml含有Kam抗性的LB液体培养基，置于空气摇床37℃，220r/min培养16h；再将培养的菌液全部加入到含有Kam抗性的500mL LB液体培养基中，并进行诱导表达；将经诱导好的产物以10000r/min离心10min，用PBS缓冲液重复洗涤两次，用pH＝8.5的Tris-CI 30mL震荡重悬沉淀，并向其中加入1mg/mL溶菌酶使其充分反应1h；反应过后置于超声波细胞震碎仪中10min，进行细胞裂解；将裂解后的产物15000r/min离心15min，取上清-20℃保存备用；
(j)菌毛F41融合蛋白的纯化
取2ml Ni-NTAbeads，3500r/min离心10min，用结合缓冲液5mL重悬，重复2次；将制备好的蛋白样品2mL加入到上一步离心管中，室温下结合5h；3500r/min离心10min，弃掉上清，用漂洗缓冲液洗涤沉淀；5000r/min离心5min，用5mL洗脱缓冲液洗脱蛋白；4℃保存备用；所述的Ni-NTAbeads为以4％琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法耦联了四配位的氮川三乙酸，螯合镍离子Ni2+。
5.根据权利要求1所述的抗犊牛大肠杆菌F41菌毛抗原高免卵黄抗体IgY的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述的卵黄无菌分离的具体步骤为：清水洗净鸡蛋后，用0.1％的新洁尔灭消毒，再用75％的酒精擦拭外壳，在紫外灯下照射并晾干；于无菌条件下打开蛋壳，小心分离蛋白，用灭菌滤纸吸取蛋黄表面的残留蛋清，用注射器刺破蛋黄膜，每枚蛋黄液取3ml，一共取蛋黄液20g，收集入离心管中。
6.根据权利要求1所述的抗犊牛大肠杆菌F41菌毛抗原高免卵黄抗体IgY的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述的抗体纯化的具体步骤为：采用步骤(4)的蛋黄液加入20ml0.1mol/L的pH为7.6的Tris-HCL(三氨基甲烷)缓冲液，混合均匀后加人PEG至其浓度为3.5％(W/V)并充分混合；8000r/min离心25min，取上清液再加人PEG至其终浓度为12％(W/V)并充分混合；12000r/min离心10min，弃去上清液，将沉淀物用10ml浓度为0.01mol/L的PBS溶液复溶，再加入PEG至终浓度为12％(W/V)，充分混合；12000r/min离心10min，弃去上清液，将沉淀物用2mlPBS溶液复溶。
7.一种如权利要求1-6任一项所述的抗犊牛大肠杆菌F41菌毛抗原高免卵黄抗体IgY的应用，其特征在于，应用于临床犊牛感染大肠杆菌腹泻病治疗和预防。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111235144A (zh) * | 2020-03-02 | 2020-06-05 | 山东省农业科学院农产品研究所 | 肠道集聚性大肠杆菌dna提取方法及其标准品的应用 |
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