SK280919B6

SK280919B6 - Spôsob výroby kompozitnej vakcíny proti črevnej infekcii spôsobenej enterotoxigénnymi baktériami e. coli u ľudí

Info

Publication number: SK280919B6
Application number: SK910-93A
Authority: SK
Inventors: Jan Holmgren; Ann-Mari Svennerholm
Original assignee: Jan Holmgren; Ann-Mari Svennerholm
Priority date: 1991-02-26
Filing date: 1992-02-25
Publication date: 2000-09-12
Also published as: BR9205677A; HU213924B; CZ281556B6; BG61683B1; RO109819B1; SE9100556D0; ES2123550T3; FI933728A0; NO933037L; US6558678B1; OA09865A; DK0573527T3; HUT67198A; CA2104877A1; WO1992014487A1; HU9302410D0; AU663864B2; EP0573527A1; DE69226944T2; NO307867B1

Abstract

Kmene E. coli vybrané z rôznych známych kmeňov, z ktorých každý má schopnosť expresie určitého typu antigénu s kolonizačným faktorom, sa kultivujú pri vhodných podmienkach do dosiahnutia vopred stanovenej hustoty v kvapalnom kultivačnom médiu a kultivácia sa uskutočňuje za silného miešania alebo s použitím prostriedkov na uskutočnenie extenzívnej aerácie, potom sa bakteriálna kultúra odoberie a resuspenduje vo fyziologickom roztoku, a potom sa k suspenzii za mierneho miešania pridáva formaldehyd na konečnú koncentráciu 0,2 M, potom sa suspenzia inkubuje pri intenzívnom miešaní pri teplote 37 °C počas 2 hodín, a potom sa inkubuje pri 4 °C počas 24 až 28 hodín, až po získanie formaldehydom usmrteného E. coli kmeňa, potom sa formaldehydom usmrtené E. coli baktérie zmiešajú s farmaceuticky prijateľným excipientom a/alebo riediacim roztokom.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu prípravy formaldehydom usmrteného organizmu E. coli s expresiou antigénu s kolonizačným faktorom (CFA) na očkovanie proti črevnej infekcii/diarea spôsobenej enterotoxigénnymi baktériami E. coli u ľudí.

Vynález sa týka najmä spôsobu výroby kompozitnej vakcíny proti črevnej infekcii spôsobenej enterotoxigénnymi baktériami E. coli u ľudí.

Doterajší stav techniky

Diarea spôsobená enterotoxigénnymi baktériami Escherichia coli (ETEC) predstavuje závažný zdravotnícky problém najmä v rozvojových krajinách a cestujúcim do týchto krajín. Pri nemocničných a klinických štúdiách akútnej diarea v rozvojových krajinách boli ETEC identifikované v 10-50 prípadoch, v priemere u 20 % detí mladších ako 5 rokov a o niečo viac v starších vekových skupinách. Podobne boli ETEC zistené ako pôvodcovia v najmenej jednej tretine, až jednej polovici prípadov akútnej diarea u osôb cestujúcich z priemyselne vyspelých krajín do rozvojových krajín.

Štádia nemoci spôsobenej ETEC sa prejavujú od mierneho priebehu diarea bez dehydratácie až po chorobu s príznakmi cholery. V prvých 5 rokoch života prekonajú mnohé deti v rozvojových krajinách každý rok 1-2 ochorenia diarea spôsobené ETEC. Hoci vo väčšine prípadov majú infekcie ETEC relatívne miemy priebeh, odhaduje sa, že medzi deťmi v rozvojových krajinách sa vyskytuje ročne miliarda ochorení diarea, ktoré spôsobuje jeden milión úmrtí. Preto každý zásah, ktorý by mohol aspoň čiastočne znížiť úmrtnosť na ETEC, mal by značný význam pre zdravie ľudí.

Žiadna vakcína na použitie proti ETEC diarea u ľudí nie je ešte k dispozícii. Pri rozsiahlych skúškach novovy vinutej orálnej vakcíny proti cholere sa však zistilo, že B-subjednotka tejto vakcíny, ktorá krížovo imunologický reaguje s teplotné labilným enterotoxínom (LT) ETEC, poskytovala značnú ochranu nielen proti cholere, ale i proti diarea spôsobenej ETEC, ktoré produkujú LT. Ochrana proti ETEC infekcii bola zameraná najmä proti ochoreniu spojenému s ťažkou, život ohrozujúcou dehydratáciou, ktorá bola na 86 % znížená vakcínou v priebehu prvých troch mesiacov po imunizácii.

Mechanizmus ochorenia a imunita. Na vyvolanie ochorenia musí byť ETEC schopné kolonizácie v tenkom čreve a produkovať LT a/alebo tepelne stabilný enterotoxín (ST, STa). LT pri E. coli je, pokiaľ ide o štruktúru a funkciu, podobný toxínu cholery skladajúceho sa z toxínovo aktívnej A-subjednotky pripojenej k 5 B-subjednotkám, ktoré sprostredkovávajú väzbu s receptormi bunkovej membrány. Molekula ST je malý polypeptid len s 19 zvyškami aminokyselín, ktorý stimuluje aktivitu guanylátcyklázy v črevných bunkách. Na rozdiel od LT, ktorý je silne imunogénny, ST je neimunogénny, pokiaľ bol experimentálne spojený s väčším proteínovým nosičom. Kmene produkujúce samotný ST a LT/ST sú dôležitými iniciátormi diarea v endemických oblastiach, zatiaľ čo kmene produkujúce len LT spôsobujú časté ochorenia cestujúcich do rozvojových krajín. Pomer kmeňov ETEC s rôznymi profilmi enterotoxínu sa v rôznych krajinách líšia.

Pri mnohých kmeňoch ETEC je adhézia k črevnej sliznici sprostredkovaná antigenicky odlišnou fimbriou. Pri kmeňoch patogénnych pre mužov sa zistili tri hlavné ad hézne faktory; uvádzané sú ako kolonizačné faktory antigénov CFA/I, CFA/Π a CFA/IV (predtým označované ako PCF8775). CFA/I je jednoduchý fimbriálny antigén, zatiaľ čo CFA/II obsahuje povrchové coli (CS) antigény CS1, CS2, a CS3 a CFA/IV obsahuje CS4, CS5 a C6 antigény. Hoci je prevaha týchto rôznych kolonizačných faktorov geograficky rôzna, je možné CFA/I, CFA/II alebo CFA/IV obyčajne nájsť v polovici až troch štvrtinách ETEC izolovaných prípadov s klinicky významným priebehom diarea. Je možné však s pravdepodobnosťou zistiť i ďalšie adhézne faktory.

Najvyššie hodnoty infekčných ETEC sú v endemických oblastiach pozorované u malých detí. Zistenie zníženého počtu ochorení s narastajúcim vekom a väčší pomer asymptomatických prípadov u dospelých ako u detí naznačuje, že sa môže vyvinúť prirodzene získaná ochranná imunita. Obdobne sa zvyšuje stupeň odolnosti proti ETEC diarea u cestujúcich s dlhším pobytom vo vysoko rizikových krajinách. Experimentálne pokusy na zvieratách a dobrovoľníkoch tiež ukázali, že ETEC infekcia môže podstatne zvýšiť imunitu proti napadnutiu homologickými organizmami.

Existuje dôkaz, že tak bakteriálna, ako i antitoxická imunita prispievajú k ochrane proti ETEC diarea. Antibakteriálnu imunitu proti ETEC je možné do značnej miery pripísať imunite proti rôznym kolonizačným faktorom antigénov (CFA), aj keď protilátky proti O-antigénu môžu rovnako hrať úlohu pri ochrane proti ETEC rôznych homologických O-skupín. Pri zvieratách chránili proti napadnutiu ETEC s expresiou homologických CFA antigénov anti-CFA protilátky. Rovnako ako pri zvieratách, tak aj u dobrovoľníkov vyvolala orálna alebo intraintestinálna imunizácia s kmeňmi ETEC s expresiou CFA/I, CFA/II, CFA/IV ochrannú imunitu proti neskoršiemu napadnutiu E. coli nesúcich homologický CFA/CS faktor. Prirodzene, že vyvolaná antitoxická ETEC imunita pôsobí len proti LT, lebo natívna ST nie je imunogénna. Anti-LT imunitná reakcia j c namierená hlavne proti časti molekuly pozostávajúcej z B-subjednotky, ktorá krížovo imunologický reaguje s B-subjednotkou cholerového toxínu. To vysvetľuje prečo, ako už bolo uvedené, môže orálna imunizácia B-subjednotkou cholery vyvolať ochranu proti ETEC diarea ((1) Clemens J. et al: Cross-protection by subunit-whole celí cholera vaccine against diarrhea associated with heat-labile toxinproducing enterotoxigenic Escherichia coli: results of a large-scale field trial. J. Infect. Dis. 158: 372 - 377, 1988) intertestinálne bola ochrana vyvolaná nielen proti LT kmeňom, ale tiež proti LT/ST kmeňom (pozri (1)); tento nález bol tiež podporený nálezom pri zvieratách po imunizácii so subjednotkou cholery alebo LT B-subjednotky (nepublikované údaje).

Rovnako je známe, že u ľudí vyvoláva klinická ETEC nie veľmi významnú antitoxickú a antibakteriologickú odozvu v čreve, ktorej výsledkom je zvýšenie špecifického IgA protilátkového titru vo výplachu črevnej tekutiny pôsobiaceho proti LT a homologickému CFA a O-antigénom ((2) Stoll BJ a spol.: Local and systemic antibody responses to naturally aquired enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea in an endemic area. J. Infect. Dis. 153: 527 - 534, 1986). Obidve protilátky s anti-enterotoxínovým faktorom a antikolonizačným faktorom môžu nezávisle jedna od druhej chrániť proti pokusnej ETEC infekcii a pri ich súčasnej prítomnosti v čreve sa zistilo, že tieto protilátky pôsobia synergicky pri ochrane proti ETEC ochoreniu ((3) Ahrén C. a spol.: Synergistic protective effect of antibodies against Escherichia coli enterotoxín and colonization factor antigens. Infect Immun. 38: 74 - 79, 1982). Na rozdiel od veľmi dobre zabezpečenej ochrannej funkcie anti-LT imunity

SK 280919 Β6 proti ETEC nemoci zostáva ochranný význam anti-ST imunity nedefinovaný. Hoci ST vo svojom prirodzenom stave nie je imunogénny, môže vyvolať vznik ST neutralizačných protilátok, keď sa použije naviazaný na proteínový nosič. To naznačuje, že tiež anti-ST imunita vyvolaná vakcínou môže byť prijateľným výsledkom. No doteraz testované rôzne konjugáty ST-nosičov získané buď chemickým naviazaním, alebo rekombinantnou DNA technikou mali významnú, hoci niekedy zníženú toxickú aktivitu. Preto sa pripravilo niekoľko syntetických modifikovaných ST-peptidov v snahe zistiť netoxické epitopy vo vzťahu k ST. Syntetické oligonukleotidy kódujúce podobné peptidy sa rovnako pripravili a spojili s génom pre B-subjednotku cholery a po uložení do Vibrio cholerae kódovali tieto chimerické gény produkciu úplne netoxického spojeného proteínu ST-B-subjednotky. Imunizácia pokusných zvierat s takto chemicky odvodeným alebo génovým inžinierstvom pripraveným netoxickým konjugátom peptidovej B-subjednotky vyvolala reakciu anti-ST protilátok, ale zatiaľ len so slabou neutralizačnou aktivitou. Kandidáti vakcíny. Na základe týchto poznatkov o kľúčových ochranných protilátkach ETEC baktérií a o hlavnom imunologickom mechanizme pôsobiacom proti ETEC infekciám možno urobiť záver, že účinná ETEC vakcína by mala byť podávaná orálne a v ideálnom prípade vyvolávať tak anti-kolonizačnú, ako i antitoxickú imunitnú reakciu v čreve. Podľa toho by mala vakcína obsahovať kombináciu bakteriálnych antigénov odvodených od buniek a toxínov. Rozdielna životnosť neaktivovaných kandidátov vakcíny bola nedávno zvažovaná, pričom sa vychádzalo z uvedených predpokladov.

Živé vakcíny. Živé baktérie s expresiou hlavných CFA antigénov a produkujúce B-subjednotky alebo príbuzný enterotoxoid môžu byť brané do úvahy, lebo takáto vakcína vďaka multiplikácii v čreve môže zabezpečiť trvalú stimuláciu antigénu lokálneho črevného imunitného systému. Pretože však rôzne kolonizačné faktory nie sú normálne produkované v rovnakých kmeňoch a nebolo možné klonovať gény pre rôzne CFA antigény do toho istého hostiteľského organizmu, musí takáto vakcína - prinajmenšom v danej chvíli byť založená na zmesi niekoľkých rozličných kmeňov. Pri takomto prístupe k vakcíne však vzniká niekoľko problémov. Medzi nimi ide o riziko prerastania niektorých kmeňov zahrnutých do vakcíny a potlačovanie iných; návrat k toxicite prijatím píazmidov kódujúcich toxín; nízku produkciu enterotoxoidov v priebehu rastu in vivo a nízku trvanlivosť vakcíny v priebehu skladovania. Aktuálne orálne ETEC vakcíny nie sú preto zatiaľ v dohľade.

Neživé vakcíny. Najdôležitejšie somatické antigény, ktoré by mali byť zahrnuté do vakcíny, sú antigény CFA, ktoré prevládajú v ETEC kmeňoch v rôznych zemepisných oblastiach. Tieto antigény zahŕňajú CFA/I, CFA/II, CFA/IV a možno niekoľko ďalších antigénov CFA doteraz definovaných. No príprava čistých CFA antigénov môže byť pomerne nákladná, a ďalej sa po ústnom podaní ukázali izolované CFA antigény byť citlivé na degradáciu v ľudskom zažívacom črevnom trakte ((4) Levine MM a spol.: Fimbriae (Pili) adhesins as vaccines. In Protein-Carbohydrate Interaction in Biological Systems, str. 143 - 145, Academic Press, London a (5) Evans DG a spol.: Administration of purifíed colonization factor antigens (CFA/I, CFA/II) of enterotoxigenic Eschcrichia coli to volunteers. Response to challenge with virulent enterotoxigenic Escherichia coli. Gastroenterology 87:934 - 940, 1984).

Praktickejší spôsob konštrukcie vakcíny môže byť príprava usmrtených ETEC baktérií s expresiou najdôležitejších CFA antigénov na ich povrchu a kombinácia týchto organizmov s vhodnou toxoidnou zložkou. Závažné problémy prípravy vakcíny, ktoré je treba prekonať, by malo byť (a) zistenie spôsobu, ktorým by sa bezpečne usmrtili kmene vakcíny pri zachovaní antigénnych a adhéznych (hemaglutinačných) vlastností rôznych CFA antigénov (ideálne by mal tento postup stabilizovať CFA antigény proti degradácii v prostredí ľudského čreva) a (b) zistenie podmienok dovoľujúcich expresiu CFA antigénov na vysokej úrovni pri raste baktérií v kvapalnom prostredí vo fermentore z dôvodu uľahčenia vysokokapacitnej výroby vakcíny.

Dobre známe, a preto výhodné metódy inaktivácie baktérii na použitie do celobunkových vakcín by malo byť ošetrenie formaldehydom. Na tento účel sa používa formaldehyd s koncentráciou 1 mólu. Zistilo sa, že toto ošetrenie ETEC s expresiou CFA spolu s bežne používaným spôsobom prípravy vakcíny usmrtilo bezpečne ETEC organizmus, že to však zároveň zničilo väčšinu alebo celý obsah CFA antigénu, a preto sa tieto metódy príliš nehodili na prípravu inaktivovaných kmeňov ETEC so zachovanou imunogenitou ETEC. Na základe toho Levin ((6) Levine MM: Vaccines against enterotoxigenic Escherichia Coli infection. In Woodrow GC, Levine MM (eds): New generation vaccines. Marcel Dekker, Inc. New York 1990, str. 649 - 660) opísal čiastočný úspech Tacketa a spol. pri použití formaldehydom ošetrených ETEC organizmov jedného kmeňa na stimuláciu vytvorenia IgA protilátky a ochranu u ľudských dobrovoľníkov. Vakcína bola pripravená z kmeňa E. coli E1392-75-2A z A kmeňa biotypu 06:H16, ktorý potláča CS1 a CS3 fimbriae, no nevytvára LT Alebo ST. Keď sa predtým používal ako živá orálna vakcína, zabezpečila jedna dávka E1392-75-2A významnú ochranu u dobrovoľníkov proti pokusnému napadnutiu ĽT/ST* ETEC kmeňom sérotypu 0139:H28, ktorý potláča CSlna CS3. (Baktérie E1392-75-2A boli inaktivované vo formaldehyde výskumníkmi Výskumného ústavu Waltera Reeda vo Forest Glen, Maryland v zariadeniach na výrobu vakcín US armády). Tri dávky vakcíny (každá obsahujúca 5 x 10'° inaktivovaných baktérií) sNaHCO₃ boli podané Tacketom a spol. v dvojtýždňových intervaloch deviatim dobrovoľníkom. Zistil sa značný nárast CFA protilátky v sére pri dvoch z deviatich vakcín, pričom pri štyroch z deviatich sa zaznamenalo zistiteľné zvýšenie črevnej SIgA antifimbriálnej protilátky. Uskutočnil sa malý test, pri ktorom štyri z vakcín pri 10 kontrolách boli konfrontované s patogénnym ETEC kmeňom E24377A (0139:H28, CS1, CS3, LT⁴/LS⁺J. Nezistil sa žiadny dôkaz ochrany: diarea sa vyskytla pri dvoch zo štyroch vakcín a u šiestich z desiatich kontrol.

Pokiaľ ide o expresiu CFA antigénov v kvapalnom prostredí, neexistujú žiadne správy. V skutočnosti až doteraz takáto expresia nebola považovaná za možnú, lebo o kvapalnom prostredí je známe, že potláča expresiu CFA antigénov a namiesto toho vyvoláva expresiu manózo-senzitívneho typu 1 pili ((7) Evans DG a spol.: New surface-associated heat-labile colonization factor antigén (CFA/II) produced by enterotoxigenic Escherichia coli or serogroups 06 and 08. Infect.Imun.21:638 - 647,1978.)

Začiatočné snahy o vyvinutie prototypu vykcíny založenej na ETEC expresii rôznych CFA antigénov a CS proteínov ((8) Svennerholm a spol.: Development of oral vaccines against enterotoxigenic Escherichia coli diarhea. Vaccine 7: 196 - 198, 1989) spoliehali na metódu rastu organizmov na pevných agarových platniach, čo však značne bráni možnosti veľkokapacitnej výroby vakcín. Pri tomto vynáleze sa teraz vyvinul spôsob, ktorý dovoľuje rovnako kvalitnú expresiu CFA antigénov na ETEC v priebehu rastu v kvapalnom prostredí v pretrepávanej kultúre ako pri op

SK 280919 Β6 timálnych podmienkach pri podnecovaní rastu na agarových platniach a rovnako je ukázaná vysoká úroveň expresie CFA antigénov na E .coli v priebehu kultivačných podmienok vo fermentore. Opísaný je tiež spôsob, pri ktorom tieto E. coli pestované vo fermentore sú inaktivované formaldehydom takým postupom, ktorý zaisťuje bezpečné usmrtenie testovaných vakcínových kmeňov a súčasne tento spôsob uchováva a stabilizuje CFA antigény na povrchu baktérií definovaným a kvantitatívne určeným postupom.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Švédski dospelí dobrovoľníci dostali tri imunizačné (Ψ) s prototypom ETEC vakcíny v dňoch 0, 14, 28 a vzorky intestinálneho výplachu boli okamžite odobrané pred 9 dňami a po 9 dňoch po druhej a tretej imunizácii. ELISAIgA titre proti vyčisteným CFA/1, CFA/II, (CS1 + CS3) a CTB (GM1-ELISA) boli stanovené a rozdelené podľa celkovej IgA koncentrácie každej vzorky.

Podstata vynálezu

Jeden aspekt vynálezu sa týka spôsobu výroby vakcíny proti enterickej-črevnej infekcii spôsobenej enterotoxigénnymi E. coli baktériami u ľudí. Podľa spôsobu sa kultivuje na vysokej úrovni aspoň jeden kmeň E. coli vybraný z rôznych známych kmeňov, z ktorých každý má schopnosť expresie určitého typu antigénu s kolonizačným faktorom, sa kultivuje za vhodných podmienok na vopred určenú hustotu v kvapalnom kultivačnom médiu obsahujúcom 1 % hmotn./obj. kazamínových kyselín, 0,15 % hmotn./obj. kvasnicového extraktu, 0,4 mmólu MgSO₄, 0,04 mmólu MnCl₂ a deionizovanú vodu pri pH 7,4 4 a kultivácia sa uskutočňuje za silného miešania alebo inými prostriedkami na uskutočnenie extenzívneho prevzdušnenia, umožňujúcim expresiu uvedeného určitého typu antigénu s kolonizačným faktorom na povrchu E .coli baktérií, potom nasleduje odber a resuspendovanie bakteriálnej kultúry vo fyziologickom roztoku, potom sa do suspenzie pridá za mierneho miešania formaldehyd na konečnú koncentráciu 0,2 mólu formaldehydu s nasledujúcou inkubáciou pri pokračujúcom miešaní pri teplote 37 °C počas približne 2 hod. s nasledujúcou inkubáciou pri 40 °C počas 24 až 28 hodín za získania formaldehydom usmrteného E. coli kmeňa, ktorý má v podstate zachované antigénne a hemaglutinačné vlastnosti uvedeného určitého typu kolonizačného faktora antigénu, potom sa uvedené, formaldehydom usmrtené E. coli baktérie zmiešajú s farmaceutický prijateľným excipientom a/alebo rozpúšťadlom na vhodnú koncentráciu.

Pri uskutočnení tejto časti vynálezu sa kultivácia vykonáva pri približne 37 °C počas najmenej 4 až 6 hodín pred uskutočnením odberu baktérií odstredením alebo filtráciou, alebo inými prostriedkami.

V ďalšom uskutočnení tohto poňatia vynálezu sú uvedené kmene s expresiou určitého typu antigénov s kolonizačným faktorom z ľudského čreva CFA/I, CFA/II, (CS1, CS2, CS3) a CFA/IV (CS4, CS5, CS6).

V ďalšom uskutočnení tejto časti vynálezu sa dodatočne pridáva kyselino-neutralizačný pufor a pripadne dodatočne antigénové zložky vyvolávajúce imunitu proti napríklad endotoxínom.

Výhodné uskutočnenie tejto časti vynálezu sa vyznačuje orálnym podávaním vakcíny.

Opísané sú postupy, kde pomocou fermentora je možné kultivovať v kvapalnom médiu na vysokú hustotu bakteriálne kmene E. coli bez straty schopnosti expresie rôznych antigénov CFA vrátane CFA/I, CFA/II a CFA/IV, ktoré potom môžu byť ošetrené prostriedkami, ktoré bezpečne usmrtia organizmy bez toho, aby prišlo k zničeniu CFA antigénov. Tieto postupy umožňujú použiť takto kultivované E. coli organizmy ako bezpečne nežijúce orálne vakcíny proti enterickej infekcii/diarea spôsobenej enterotoxigénnymi baktériami E. coli u ľudí. Postupy na získanie týchto bakteriálnych zložiek vakcíny a spôsoby používané na dôkaz ich užitočnosti ako črevné sliznicové imunogény obsahujúce nasledujúce:

1. Spôsob zabezpečenia vysokej úrovne expresie žiadaných rôznych typov CFA (CFA/I, CFA/II a CFA/IV) antigénov v organizmoch E. coli v priebehu ich rastu v kvapalnom prostredí skôr než na predtým opísaných agarových platniach alebo ďalších pevných médiách.

2. Úspešná adaptácia tohto spôsobu vysokej úrovne expresie týchto antigénov CFA na E. coli pestovaných v kvapalnom médiu vo fermentore.

3. Postup inaktivácie vybraných organizmov E. coli pomocou formaldehydu s takmer kompletným zachovaním imunologickej reaktivity so špeciálnymi protilátkami a hemaglutinačnej aktivity rôznych CFA antigénov.

4. Testy ukazujúce, že imunizácia králikov organizmami E. coli kultivovanými v kvapaline a ošetrenými formaldehydom spôsobuje vznik rovnako vysoko koncentrovaných titrov špecifických protilátok proti rôznym antigénom CFA, aké vznikajú pri imunizácii so zodpovedajúcimi žijúcimi baktériami kultivovanými na agare.

5. Testy ukazujúce, že antigény CFA na organizmoch vakcíny ošetrených formaldehydom majú vyššiu stabilitu ako antigény CFA na živých neošetrených baktériách, keď sú organizmy podrobené inkubácii v kyslom pufri alebo v šťavách ľudského črevného zažívacieho traktu.

6. Štúdie dokumentujúce, že CFA E. coli organizmy kultivované v kvapaline a inaktivované formaldehydom môžu byť podávané bez významnejšieho vedľajšieho účinku ľudským dobrovoľníkom ako orálna vakcína a že podaním dvoch alebo troch dávok tejto vakcíny sa stimuluje vznik IgA protilátok v tekutine črevného výplachu, ako i vznik špecifických buniek so sekrétom protilátok proti antigénom CFA vakcíny pri cirkulácii (cyklovaní).

Príklady uskutočnenia vynálezu

Testovalo sa veľké množstvo kmeňov s expresiou CFA/I, CFA/II (vrátane kmeňov s expresiou CS1, CS2, alebo samotného CS3, CS1 + CS3 alebo CS2 + CS3) alebo CFA/IV (kmene s expresiou CS4 + CS6 alebo CS5 + CS6). Tieto kmene obsahovali klinicky izolované kmene získané z rôznych častí sveta, ako i laboratórne manipulované kmene reprezentujúce rôzne vzorky produkcie enterotoxínov (LT + ST, ST samotný a toxín-negatívne deriváty). Pretože sú postupy opísané v nasledujúcich príkladoch 1 - 5, bolo zistené že rozsah testovania platí na rôzne kmene s rôznym typom alebo subtypom CFA a profily enterotoxínov, obmedzili sa pokusy a výsledky opísané v príkladoch na reprezentatívne výsledky dosiahnuté s menším množstvom vybraných kmeňov.

SK 280919 Β6

Príklad 1

Expresia antigénov CFA na E coli organizmoch po kultivácii v kvapalnom prostredí v pretrepávanej kultúre alebo fermentore.

Predtým používané postupy na expresiu antigénov CFA na E. coli boli vždy založené na kultivácii organizmov na pevnom povrchu, obyčajne na tzv. agarových platniach (7) lebo bolo známe, že rast v kvapalnom prostredí obyčajne potlačoval expresiu antigénov CFA pri súčasnom uľahčení expresie typu 1 (všeobecného) pili na baktériách E. coli. Na uľahčenie vysokej úrovne produkcie ETEC vakcíny sa vyvinuli postupy, ktoré umožňujú vysokú úroveň expresie rôznych CFA antigénov na povrchu E. coli, teda v podmienkach rastu v kvapalnom médiu (v pretrepávaných kultúrach v skúmavkách alebo vo fermentore).

Po neúspešnom vyskúšaní niekoľkých rôznych všeobecne používaných bakteriologických kvapalných médií a podmienok kultivácie sme došli k nasledujúcemu postupu na dosiahnutie a preukázanie požadovaných úrovní expresie antigénov CFA, na zo začiatku každom z modelových kmeňov SBL101 (CFA/I), SBL102 a SBL103 (obidva CFA/II) po kultivácii v kvapalnom prostredí. Potom s miernou obmenou v zložení média na expresiu CS5 sme tiež dosiahli dobrú expresiu CFA/IV na iných kmeňoch. Zo zmrazených očkovacích šarží rôznych kmeňov (uchovávaných v glyceríne pri -70 °C) boli platinové slučkové úlomky očkované na CFA agarových platniach, ktoré boli inokulované cez noc pri 37 °C. Kolónie na platniach boli riadené k expresii vhodného CFA pri priamych aglutinačných testoch so špecifickými monoklonálnymi protilátkami proti CFA/I, CS1, CS2, CS3, CS4, CS5 a CS6. Tieto monoklonálne protilátky sa pripravili v laboratóriách prihlasovateľov. Baktérie na CFA agarových platniach boli potom odobrané fosfátovým pufrovaným fyziologickým roztokom (PBS) a 5-10 x 10’ organizmov sa pridalo do tejto suspenzie ako inokulum do 400 ml kvapalného média. Zloženie tohto CFA média bolo: kyselina kazamínová 1 % hmotn./obj., kvasnicový extrakt 0,15 % hmotn./obj., MgSO₄ 0,4 mmólu, MnCl₂ 0,04 mmólu, H₂O deionizovaná, pH 7,4. Skúmavky sa inkubovali na trepačke pri 150 ot./min. počas cca 20 hodín pri 37 °C, pri tomto čase bola optická hustota pri 1 : 10 zriedení suspenzie cca 0,25 - 0,5. Baktérie sa odoberali odstredenim pri +4 °C, bakteriálna peleta sa jeden raz preprala s PBS, baktérie sedimentovali odstredenim a resuspendovali sa v PBS za vzniku suspenzie, ktorá pri zriedení 1:10 mala hustotu 0,285. Táto suspenzia a na porovnanie ďalšia suspenzia baktérií odoberaných z paralelných kultúr kmeňov na CFA agarových platniach, upravené na rovnakú optickú hustotu, sa testovali s postupným zriedením na expresiu vhodného CFA. Obidva spôsoby, t. j. priama aglutinácia s monoklonálnymi protilátkami a kvantitatívna CFA inhibícia ELISA vyvinutá v laboratóriu prihlasovateľov sa použili na tieto analýzy.

Výsledky sú sumarizované v tab. 2. Ukazujú, že suspenzia získaná po kultivácii organizmu v skúmavkách v kvapalnom médiu mala porovnateľnú expresiu CFA antigénov (keď bola upravená na rovnakú koncentráciu baktérií) ako baktérie kultivované na CFA agarových platniach.

Plazmidy kmeňa SBL102 a SBL103 kódujúce rôzne CFA/II CS proteíny tiež kódovali bakteriálnu rezistenciu proti ampicilínu a kanamycínu. Preto sa uskutočnila paralelná kultivácia týchto kmeňov v kvapalnom prostredí a na agare za pridania týchto antibiotík. Hoci hodnoty v tab. 2 sú hodnoty získané pri absencii antibiotík, hodnoty získané v prítomnosti antibiotík boli prakticky identické (neznázor nené). Podobne podmienky kultivácie v kvapalnom médiu používané na pokusy opísané v tabuľke 2 sa ukázali rovnako uspokojivé ako kultivácia na CFA agarových platniach na expresiu CFA/I, CFA/II a CFA/IV (každý zo subproteínov CS4, CS5 a CS6) z rôznych iných testovaných kmeňov; na optimálnu expresiu CS5 sa k CFA agaru použitom na predkultiváciu i ku kvapalnému CFA médiu sa pridalo 0,15 % Bacto-žlčových solí 1,5 g/1 (Difco).

V nasledujúcich pokusoch sa tento pokus pre vysokú úroveň expresie CFA antigénov na ETEC v kvapalných kultúrach prispôsobil na kultiváciu v kvapalnom prostredí fermentora. V nasledujúcom postupe doloženom ďalej príkladmi pre kmeň CFA/I, ktorý sa ale osvedčil ako rovnako účinný na produkciu CFA/II alebo CFA/I, sa zistila podobná expresia CFA na počet baktérií ako pri kultivácii na CFA agare alebo na pretrepávaných kultúrach.

CFA agarové platne sa inokulovali kmeňom SBL101 (CFA/I) a kultivovali pri teplote 37 °C cez noc; zmrazené inokulované šarže baktérii sa použili ako inokulum. Baktérie sa odobrali z agarových platní fyziologickým roztokom a 5 x 10¹⁰ baktérií sa pridalo ako inokulum do 4 litrov CFA média; ako inokulum je možné použiť i exponenciálnu fázu pretrepávanej kultúry baktérií v CFA médiu. Baktérie sa potom kultivovali pri 37 °C vo fermentore Bio-flo III (New Brunswick Scientific Co. Edison, N. J., USA) pri silnom miešaní (800 ot./min.) bez úpravy pH. Už po 4 - 5 hodinách po začatí kultivácie vo fermentore bola optická hustota 4 - 5, t. j. pri zriedení 1:10 suspenzie bola 0,4 - 0,5. Po kontinuálnej kultivácii vo fermentore po 20 hodinách sa nepozorovalo žiadne zvýšenie optickej hustoty. Vzorky odobraté z fermentora v rôznych intervaloch po začatí kultivácie - a na porovnanie suspenzia baktérií pripravená z pretrepávanej kultivácie (v skúmavkách) rovnakého bakteriálneho inokula - sa testovali na expresiu CFA/I po úprave na ?

tú istú koncentráciu baktérií, t. j. 10¹⁰ baktérií na ml. Ako je * znázornené v tab. 3 expresia CFA/I bola optimálna už po 4 - 5 hodinách kultivácie vo fermentore a porovnateľná s expresiou CFA/I pri kultivácii baktérií na trepačke v skúmavkách po 20 hodinách.

Príklad 2

Postup inaktivácie E. coli baktérií formaldehydom so zachovaním imunoreaktivify CFA, ako i hemaglutinačnej aktivity.

Skôr než bol zistený vhodný spôsob opísaný v tomto príklade, testovali sa rôzne fyzikálne a chemické inaktivačné metódy, vrátane ošetrenia formaldehydom za rôznych podmienok s neuspokojivými výsledkami. Tento postup, ktorý zahŕňa mierne spracovanie formaldehydom pri rôznych teplotách počas niekoľko dní, splnil kritéria dosiahnutia úplného usmrtenia predpokladaných organizmov vakcíny E. coli bez spôsobenia vážnych strát na obsahu alebo kvalite ich CFA antigénov. Testovalo sa to stanovením množstva rôznych CFA antigénov baktérií pred a po spracovaní formaldehydom s použitím kvantitatívnej CFA inhibície ELISA založenej na monoklonálnych protilátkach proti rôznym zložkám CFA/CS antigénov, ako je opísané v príklade 1. Tento spôsob umožňuje presné určenie CFA antigénov na povrchu baktérií. Vytýčené požiadavky zahŕňali podmienku, že po usmrtení by mal bakteriálny prípravok zachovať najmenej jednu tretinu obsahu CFA antigénov v porovnaní so žijúcimi organizmami na začiatku, a tiež zachovať zistiteľnú hemoglutinačnú aktivitu na podporu zachovania CFA antigenicity.

Nasledujúci príklad opisuje postup a jeho užitočnosť s ďalšími podrobnosťami. Baktérie s expresiou CFA/I alebo

CFA/II antigénov sa kultivovali v kvapalnom prostredí a suspendovali v PBS s použitím toho istého postupu, ako je opísaný v príklade 1. Potom sa pridával do suspenzie za mierneho miešania bakteriálnej suspenzie formaldehyd (HCHO) až na konečnú koncentráciu 0,2 mólu formaldehydu. Suspenzia sa potom inkubovala za stáleho miešania pri 37 °C počas cca 2 hodín, potom sa preniesla do studenej miestnosti a udržiavala sa pri 4 °C počas ďalších 24 až 48 hodín. Po dokončení inkubácie s formaldehydom sa subvzorky odstránili a testovali na nedostatok živých organizmov pri kultivácii tak na živnej pôde, ako i na agarových platniach; agarové platne skúmaviek so živnou pôdou sa sledovali počas 14 dní. Výsledkom postupu bolo dôsledné, úplné usmrtenie všetkých testovaných E. coli organizmov.

Po ukončenom formaldehydovom ošetrení za chladu boli bakteriálne suspenzie analyzované na obsah CFA pomocou štúdia hemaglutinačnej aktivity príslušných vzoriek (pozri (7)) a na schopnosť inhibovať viazanie zodpovedajúcich monoklonálnych protilátok pri CFA ELISA, ako je uvedené v publikácii ((9) Lopez-Vidal Z. a spol.: Monoclonal antibodies against different epitopes on colonization factor antigén I of enterotoxin-producing Escherichia coli. J. Clin Mikrobiol. 26: 1967 - 1972, 1988). Na porovnanie bola začlenená do každého pokusu neošetrená čerstvo pripravená kultúra príslušného kmeňa upravená na rovnakú bakteriálnu koncentráciu ako formaldehydom ošetrené organizmy. Ako ukazuje tab. 4, zachovali si prípravky spracované formaldehydom hemaglutinačnú schopnosť a mali najmenej 50 % antigenecitu, ako bolo stanovené v príslušných CFA ELISA inhibičných testoch. Tieto výsledky, ktoré potvrdzujú, že baktérie ošetrené formaldehydom inhibovali viazanie zodpovedajúcich monoklonálnych protilátok na tuhú fázu naviazaného CFA pri 50 % koncentráciách, zodpovedajú 50 - 100 % koncentráciám pri neošetrených baktériách, boli overené na značnom počte po sebe nasledujúcich experimentov.

Príklad 3

Porovnanie skladovacej/inkubačnej stability antigénov CFA na formaldehydom ošetrených a formaldehydom neošetrených (živých) ETEC organizmoch.

Štúdie z iných laboratórií ukázali, že izolované neošetrené fimbrie sú veľmi citlivé na žalúdočnú kyselinu (4, 5). Predchádzajúca neutralizácia žalúdočnej kyseliny na neutrálne pH sa nejavila ako dostatočná na to, aby sa zabránilo jej škodlivému účinku na CFA antigenicitu fimbriálneho proteínu (4). Proti tomuto známemu stavu sa porovnala antigenicita CFA antigénov s expresiou na neošetrených baktériách E. coli a na zodpovedajúcich E. coli ošetrených formaldehydom po inkubácii v kyslých šťavách črevno-zažívacieho traktu a príslušných lačníkových šťavách. Vzorky sa tiež ínkubovali v PBS s úpravou na rôzne hodnoty pH.

Pri začiatočných pokusoch sa pred úpravou na neutrálne pH inkubovali rôzne neošetrené a formaldehydom ošetrené bakteriálne suspenzie pri rôznych pH, od pH 3 do pH 11 počas 30 minút pri 37 °C. V žiadnom prípade neovplyvnila inkubácia pri týchto pH CFA antigenicitu tak pri neošetrených, ako i pri formaldehydom ošetrených, usmrtených bakteriálnych prípravkoch. V nasledujúcich pokusoch sa porovnala inkubácia živých a formaldehydom inaktivovaných baktérii v pufri pri pH 2 v šťave črevno-zažívacieho traktu a v lačníkovej šťave. Šťava črevno-zažívacieho traktu a lačníkové šťavy sa odobrali od dospelých Švédov v Sahlgrenskej nemocnici v Gôteborgu. Ako ukazuje tab. 5, baktérie ošetrené formaldehydom boli len okrajovo alebo neboli vôbec ovplyvnené inkubáciou v pufri pri pH 2 alebo v šťave z črevno-zažívacieho traktu a žiadne zníženie CFA antigenicity sa nepozorovalo po inkubácii v lačníkovej šťave. CFA antigenicita neošetrených živých baktérií bola na druhej strane v mnohých prípadoch zjavne redukovaná tak po inkubácii v pufri pri pH 2, ako aj v kyslej šťave črevno-zažívacieho traktu. Tieto analýzy ukazujú, že ošetrenie formaldehydom chráni CFA fimbrie pred degradáciou v zažívacej šťave.

Príklad 4

Porovnanie imunogénnych vlastností CFA antigénov na formaldehydom ošetrených a neošetrených (živých) ETEC.

Porovnávala sa schopnosť formaldehydom ošetrených a neošetrených (živých) CFA pozitívnych baktérií E. coli vyvolávať anti-CFA protilátkovú reakciu. Dospelým novozélandským králikom vážiacim 2 - 3 kg sa na začiatku imunizácie podalo 3 - 5 podkožných injekcií so zodpovedajúcimi dávkami (5 x 10⁸ - 2 x 10’ baktérií) formaldehydom ošetrených a neošetrených, živých baktérií; začiatočné injekcie sa podali s kompletným Freundovým adjuvansom a nasledujúca imunizácia sa uskutočnila bez adjuvansu. Formaldehydom ošetrené baktérie sa pripravili pred imunizáciou, potom sa skladovali pri 40 °C až do vlastného použitia; živé baktérie sa pripravili čerstvé každý deň pri uskutočnení imunizácie. Baktérie ošetrené, formaldehydom sa kultivovali v CFA médiu a neošetrené, živé baktérie na agare; tak formaldehydom ošetrené ako i neošetrené baktérie sa pred imunizáciou prepláchli dvakrát v PBS.

Zvieratám sa odobrala krv bezprostredne pred začiatkom imunizácie, a potom 7. -10. deň po poslednej injekcii. Séra sa pripravili a zmrazili po častiach pri -30 °C až do analýzy. Reakcie špecifických protilátok imunizačného kmeňa na CFA sa stanovovali s použitím rôznych metód ELISA. Mikrotitračné misky ELISA sa pokryli vyčistenými CFA antigénmi, t. j. CFA/I, CFA/II (CS1 + CS3), CS2, CS4 alebo CS5 rozpustené v PBS na konečnú koncentráciu 1 - 5 Tg/ml pri inkubácii misiek CFA roztokom cez noc pri 37 °C. Potom päťnásobne zriedené roztoky séra sa potom titrovali na platniach, ako už bolo opísané (pozri (2, 3)). Titre sa stanovili ako recipročná hodnota intrapolovaného zriedenia s absorbanciou 0,3 nad pozadím pri reakcii enzýmu s jeho substrátom počas 20 minút.

Žiadny z predimunizačných odberov krvi nemal významnú hladinu CFA protilátok, t. j. CFA titrov prevyšujúcich 50. Na druhej strane, po dokončenej imunizácii mali všetky séra protilátkové titre proti homologickému CFA s hodnotami medzi 25 000 a 300 000 (tab. 6). Imunizácia baktériami ošetrenými formaldehydom vyvolala veľmi podobné titre proti homologickým CFA ako pri neošetrených organizmoch (tab. 6).

Príklad 5

Testy formaldehydom ošetrených ETEC na bezpečnosť a schopnosť stimulácie tvorby špecifických IgA protilátok v ľudskom čreve.

Prípravok ETEC vakcíny pozostávajúci z baktérií usmrtených formaldehydom s expresiou CFA/I, CS1, CS2 a CS3 (t. j. kmeňov SBL101, SBL102 a SBL103 uvedených v tab. 1) sa pripravil v Národnom bakteriologickom laboratóriu vo Švédsku na klinické skúšky v malom rozsahu. Táto zložka vakcíny sa podávala spoločne s B-subjednotkou cholery (CTB/1). Uskutočnila sa štúdia na dospelých švédskych dobrovoľníkoch na testovanie tejto kombinovanej CTA-ETC-CTB vakcíny na bezpečnosť a imuno

SK 280919 Β6 genitu umiestnenej v čreve. Rovnako sa stanovila reakcia protilátok v sére, ako aj produkcie špecifických protilátok v sére, ako i produkcia špecifických protilátok periférnymi krvnými lymfocytmi.

Každý z dobrovoľníkov dostal tri orálne imunizácie s 10¹¹ usmrtených organizmov E. coli a 1 mg CTB oddelene po 14 dňoch. Vakcína sa podávala v 150 ml pufrovanom hydrouhličitanovom roztoku s použitím rovnakých citranhydrouhličitanových tabliet (ACO, Stockholm, Švédsko) ako na orálnu cholerovú vakcínu v terénnych skúškach v Bangladéši (pozri (1)). Črevné vzorky a séra sa odobrali bezprostredne pred, a potom 9. deň po druhej a tretej imunizácii; periférne krvné lymfocyty sa získali v prvý deň imunizácie, a potom 7. deň po prvej, druhej a tretej imunizácii.

Reakcie črevných IgA protilátok na najdôležitejšie ochranné antigény sa skúmali v črevnom výplachu, ako bolo už opísané (pozri 2). Črevné výplachy sa robili tak, že dobrovoľníci vypili izotonický slaný roztok (obyčajne 3 - 5 litrov), až sa vyvolala vodová diarea. Odobratá tekutá stolica sa filtrovala cez gázu, spracovala rôznymi enzýmovými inaktivátormi, odstredila a zahustila lyofilizáciou. V predchádzajúcich štúdiách sa ukázalo, že črevný výplach je bohatým zdrojom lokálne v sekréte produkovaných IgA protilátok proti črevne aplikovaným antigénom; v sekréte produkované IgA protilátky syntetizované lokálne v čreve majú pravdepodobne veľký význam pri ochrannej imunite proti ETEC diarea. Lokálne v čreve stimulované imunocity, napríklad pri orálnej vakcíne, obyčajne migrujú cez lymfu do krvi, a potom sa vracajú do čreva, kde dorastajú do plazmových buniek vylučujúcich hlavne IgA. Pri odbere periférnych krvných lymfocytov v určenom čase, hneď po orálnej vakcinácii - optimálne 7 deň ((10) Czerkinski C. a spol. : Antibody-producing cells in peripheral blood and salivary glands in humans. Infect. Immun (v tlači) 1991) tieto črevné protilátky vylučujúce bunky (ASCs) sa môžu získať a analyzovať na produkciu špecifických protilátok k antigénom použitým na stimuláciu. Nakoniec v menšom rozsahu môžu sérové protilátky špecifickej IgA triedy tiež indikovať takéto imunitné črevné reakcie.

Dvadsiatim šiestim dobrovoľníkom sa podali tri dávky vakcíny. V žiadnom prípade sa nevyskytli akékoľvek lokálne alebo systemické nepriaznivé reakcie, ktoré by sa mohli spájať s uvedenou imunizáciou. Črevné výplachy, ktoré sa odobrali z 11 vakcín, sa skúmali na protilátky k CTB/LT, CFA/I, CFA/II a O-antigén jedného z imunizujúcich kmeňov (pozri (2)). Stanovili sa špecifické ELISA titre, rozdelené podľa celkového obsahu IgA každej vzorky. Ako vyplýva z tab. 7, pri väčšine vakcín sa pozorovali významné reakcie IgA protilátok na CFA/I a CFA/II, a tiež na CTB. Frekvencia reakcií v čreve bola porovnateľná so skôr pozorovanou frekvenciou v Bangladéši pri zotavovaní z infekcie spôsobenej CFA-pozitívnymi E. coli. Miera reakcií protilátok na CFA/I a CFA/II bola porovnateľná s mierami skôr pozorovanými u rekonvalescentov zotavujúcich sa z ETEC ochorenia v Bangladéši. Dobrovoľníci rovnako reagovali s markantnou črevnou IgA reakciou protilátok na CTB zložku vakcíny (obr. 1) a tieto reakcie boli vyššie ako anti-LT reakcie pozorované po klinickom ETEC ochorení.

Tieto výsledky ukazujú, že ETEC vakcína bola schopná miestne v čreve vyvolať podstatné CFA protilátkovej reakcie; tieto reakcie boli skôr ťažko vyvolateľné u ľudí orálnou imunizáciou izolovanými fimbriami (pozri (4), (5)). Výsledkom imunizácie bol tiež vznik špecifických ASC protilátok v krvi, ako sa zistilo pri testoch ELISPOT (pozri (10)) na CFA/I, CFA/II, LT/CTB pri väčšine vakcín (tab. 7). Reakcia buniek produkujúcich CFA protilátky boli len o málo vyššie po druhej a tretej dávke ako po začiatočnej imunizácii, pričom optimálne množstvo buniek produkujúcich anti-LT sa zistilo po druhej imunizácii. Tvorené anti-CFA protilátky boli prevažne triedy IgA, no niektoré IgM produkujúce ASC protilátky boli tiež nájdené; anti-CTB ASC protilátky boli prevažne izotypu IgA, ale niektoré bunky produkujúce IgG boli rovnako zistené. Vakcína tiež podnietila významnú reakciu sérových protilátok na CFA antigény, ako i CTB/LT u väčšiny dobrovoľníkov (tab. 7).

Tabuľka 1

Vlastnosti kmeňov E. coli použitých v citovaných príkladoch

Označemekme&a	CFA. typ	Toxín modd	Säotyp	Zdroj
SBL101	CFA/I	st+ľt	078:H12	Kmefl 325542
				Getetay.SE
SBLI02	CFA/Π	st-.lt·	O139:H28	60R936
	(csi)			MMcComtell
				CoHndale, UK
SBL103	CFA/Π	ST*;LT·		58R61
	(CS2+CS3)			B>i4

Tabuľka 2

Expresia CFA antigénov na baktériách E. coli po kultivácii v kvapalnom CFA médiu v porovnaní s kultiváciou na CFA agarových platniach

Špecifický CFA títo*) > moDoidootlnynn protilátkami

Kmeá (CFA typ)	Podmienky kolttYfcie	Aghitiaáda	EUSA ihhibicU
SBL101	Kvapalina	1/32	1/40
(CFA/1)
	Agar	1/32	1/50
SBL102	Kvapalín*	1/32	1/200
(CFAflt
CS1)	Agrr	1/32	1/200
SBL103	Kvapalina	1/1«*)	1/200W
CFA/Π;
CS2+CS3)	Agir	1/16	1/230

a) po úprave všetkých kultúr na 1O¹⁰ baktérií/ml

b) testované s anti-CS2 MAb

Tabuľka 3

Expresia CFA antigénov na baktériách E. coli, kmeň SBL101 po kultivácii v kvapalnom médiu vo fermentore a v trepačke

Špecifický CFA liter )

Čas kultivácie (hod.)	Kultúra vo fennentore	Kultúra v trepačke
2	1/80	N.T.
3	1/160	1/80
4	1/200	N.T.
5	1/250	N.T.
7	1/250	1/250
9	1/250	N.T.
2δ	íaa	1/2?0...-

SK 280919 Β6

a) po úprave bakteriálnej kultúry na 1O¹⁰ organizmov/ml a pri použití metódy ELISA na inhibíciu CFA/I /9/.

Tabuľka 4

Porovnanie imunoreaktivity a hemaglutinačnej aktivity CFA antigénov na formaldehydom ošetrených a neošetrených (živých) baktériách E. coli

Kmeň Prípravok*) Špecifický Hemaftlutinačná (CFA/CStyp) CFAtiteŕ) aktivita⁰)

Tabuľka 6

Reakcia CFA antigénu na formaldehydom ošetrené a neošetrené (živé) CFA pozitívne E. coli

ELISA titer

Inmnizicii protilátka formalinom neošetrení

Kmeň proti ošetrené takt baktérie (CFA/CSftktory)

SBLI01 (CFA/I) CFA/I

000 (62 000-93 000) 50 000 (30 000-100000)

	CFA/I
SBL101	F	1/81		+
(CFA/1)	L	1/81		+
		CS1
SBL102	F	1/243		+
(CS1)	L	1/243		+
		CS2
SBL103	F	1/81	1/54	+
(CS2-+CS3)	X.	1/81	1/81	+

000 (39 000-100 000)

000 (23 000-30 000)

SBL1O2(CS1) CS1

SBL103 (CS2+CS3) CS2

247425 (CSI+CS3) CS1+CS3	250000	270 000(150000-300000)
E11881E(CS4+CS6)CS4	40000 30 000	50 000 (30 000.70000)
E17018A(CS5+€S6)CS5	25000 25000	40 000 (20000-70000)

a) F = formaldehydom inaktivované baktérie

L = živé, neošetrené baktérie

b) Testované pri ELISA CFA inhibícii so sériou trojnásobného zriedenia bakteriálnej suspenzie s 1O¹⁰ baktérií/ml: dané titre sú posledné zriedené roztoky spôsobujúce c 50 % inhibíciu reakcie získanej pri absencii baktérií

c) Testované zmiešaním 50 μΐ nezdedenej bakteriálnej suspenzie s 1 % ľudských erytrocytov v prítomnosti 1 % hmotn./obj. D-manózy.

Tabuľka 5

Porovnanie stability CFA antigénov na formaldehydom ošetrených a neošetrených (živých) baktériách E. coli po inkubácii v ľudských črevno-zažívacích sekrétoch a pri kyslom pH

SBL101 SBL103 tnkubovinév F*) L*) F L F L a králikom boli dané 3 podkožné imunizácie každá s 5 x x 10⁸ až 2 x 10’ baktérií.

Tabuľka 7

Frekvencia dôležitých reakcií IgA protilátok v črevnom výplachu v periférnych lymfocytoch a v sére po imunizácii s 3 orálnymi dávkami prototypu ETEC vakcíny

Frekvencii reakcií v

Reakcia protilátok IgA s·:	čreve	krvi ASC	sére
CFA/I	9/11 (82%)	16/19(79%)	8/12(75%)
CFA/Π	8/11(73%)	16/19(84%)	6/12(50%)
CTB/LT	9/11(82%)	19/19(89%)	11/12(92%)

Špecifický CFA titer*>)(% zediovené CFA antigenidty⁰)

PBS. pH 7J U100	1/200	1/150	1/250	1/25	1/80
PBS. pH 2	1/75	1/80	1/100	1/9	1/15	1/8
	(75%)	(40%)	(70%)	(4%)	(60%)	(100%)
Kys.firev.	1/50	1/40	1/125	1/27	1/25	1/8
Šťava	(50%)	(20%)	(85%)	(12%)	(100%)	(10%)
Le&dková	1/100	1/200	1/150	1/250	1/25	1/25
šťava	(100%)	(100%)	(100%)	(100%)	(100%)	(35%)

a) F= formaldehydom inaktivované baktérie

L= živé, neošetrené baktérie

b) testované pri ELISA CFA inhibícii, použitím vhodného anti-CFA alebo anti-CS MAbs (pozri tab. 3)

c) V porovnaní s inkubáciou v PBS pH 7,2.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob výroby kompozitnej vakcíny proti črevnej infekcii spôsobenej enterotoxigénnymi baktériami E. coli u ľudí, vyznačujúci sa tým, že najmenej jeden kmeň vybraný z rôznych známych kmeňov, z ktorých každý má schopnosť expresie určitého typu antigénu s kolonizačným faktorom, sa kultivuje pri vhodných podmienkach do dosiahnutia vopred stanovenej hustoty v kvapalnom kultivačnom médiu obsahujúcom 1 % hmotn./obj. kazamínových kyselín, 0,15 % hmotn./obj. kvasnicového extraktu, 0,4 mmólu MgSO₄, 0,04 mmólu MnCl₂ a deionizovanú vodu pri pH 7,4 a kultivácia sa uskutočňuje za silného miešania alebo s použitím prostriedkov na uskutočnenie extenzívnej aerácie, umožňujúcom vysokú úroveň expresie uvedeného typu antigénu s kolonizačným faktorom na povrchu baktérií E. coli, potom sa bakteriálna kultúra odoberie a resuspenduje vo fyziologickom roztoku, a potom sa k suspenzii za mierneho miešania pridáva formaldehyd na konečnú koncentráciu 0,2 mólu formaldehydu, potom sa suspenzia inkubuje pri intenzívnom miešaní pri teplote 37 °C počas 2 hodín, a potom sa inkubuje pri 4 °C počas 24 až 28 hodín, až po získanie formaldehydom usmrteného E coli kmeňa pri podstatnom zachovaní antigénnych a hemaglutinačných vlastnosti uvedeného určitého antigénu s kolonizačným faktorom, potom sa formaldehydom usmrtené E. coli baktérie zmiešajú s farmaceutický prijateľným excipientom a/alebo riediacim roztokom na dosiahnutie primeranej koncentrácie.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že kultivácia sa uskutočňuje pri 37 °C počas najmenej 4 až 6 hodín pred odberom baktérií pomocou odstredenia alebo filtráciou, alebo inými prostriedkami.
3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa t ý m , že kmeň s expresiou určitého typu antigénu s kolonizačným faktorom je vybraný z ľudských antigénov s kolonizačným faktorom CFA/I, CFA/II, (CS1, CS2, CS3) a CFA/IV (CS4, CS5, CS6).
4. Spôsob podľa nároku 1, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že sa dodatočne pridá kyslý-neutralizačný pufor a podľa voľby dodatočné antigénne zložky vyvolávajúce imunitu proti napríklad endotoxínom.