FI108775B - Menetelmä enterotoksigeenisten E. coli -bakteereiden ihmisessä aiheuttamaa suolistoinfektiota vastaan vaikuttavan rokotekoostumuksen tuottamiseksi - Google Patents

Description

1 108775

Menetelmä enterotoksigeenisten E. coll -bakteereiden Ihmisessä aiheuttamaa suolistoinfektiota vastaan vaikuttavan rokotekoostumuksen tuottamiseksi 5 Formaliinilla tapettujen, pesiytymistekijäantigeenia (CFA) ilmentävien E. coli-organismien valmistus ja käyttö ihmisissä enterotoksigeenisten E. coli-bakteereiden aiheuttamaa suolis-toinfektiota/ripulia vastaan vaikuttavaa rokottamista varten | 10 Oheisen keksinnön kohteena on formaliinilla tapettujen, pesiytymistekijäantigeenia (colonization-factor-antigen; CFA) ilmentävien E. coli-organismien preparointi ja käyttö ihmisissä enterotoksigeenisten E. coli-bakteeiden aiheuttamaa j suolistoinfektiota/ripulia vastaan vaikuttavaa rokottamista 15 varten.

Erityisesti, keksinnön kohteena on menetelmä ihmisessä enterotoksigeenisten E. coli-bakteereiden aiheuttamaa suolistoinfektiota torjuvan rokotekoostumuksen tuottamiseksi, sekä 20 menetelmä ihmisessä enterotoksigeenisten E. coli-bakteereiden aiheuttaman suolistoinfektion estämiseksi.

Enterotoksinogeenisen Escherichia coli-bakteerin (ETEC) aihe-

• > · I

,·/. uttama ripuli on huomattava terveysongelma erityisesti kehi- • · · '25 tysmaissa sekä näissä maissa matkustelevien henkilöiden kes-* ♦ · . kuudessa. Kehitysmaissa esiintyvään akuuttiin ripuliin koil la ·' distetuissa sairaalatutkimuksissa ja kliinisissä tutkimuksia- • ·* sa ETEC on tunnistettu 10-50 %:ssa tapauksista, keskiarvon * I · *.* · ollessa noin 20 % alle 5-vuotiaista lapsista ja hieman suu- 30 rempi vanhempien henkilöiden joukossa. Samoin ETEC on tunnis-·:··: tettu teollisuusmaista kehitysmaihin matkustaneissa henki- löissä esiintyvän akuutin ripulin aiheuttajaksi vähintään * · · kolmasosassa tai jopa puolessa kaikista ripulitapauksista.

35 ETEC:n aiheuttama sairaus vaihtelee lievästä ripulista, johon ·;· ei liity nestehukkaa, koleran kaltaiseen tautiin. Monet kehi- tysmaiden lapset sairastuvat ensimmäisen viiden elinvuotensa aikana joka vuosi 1-2 kertaa ETEC:n aiheuttamaan ripuliin. Vaikka suurin osa ETEC-infektioiden oireista on suhteellisen 2 108775 lieviä, niin kuitenkin ETEC aiheuttaa kehitysmaissa joka vuosi enemmän kuimiljardi ripulitapausta, joihin kuolee yli mil-joona lasta. Niinpä kaikilla sellaisilla toimenpiteillä, jotka vähentäisivät ETEC:n aiheuttamaa kuolleisuutta ja sai-5 rastumistiheyttä edes osittain, olisi suurta merkitystä julkisen terveydenhuollon kannalta.

Tällä hetkellä saatavana ei ole ihmisessä käyttökelpoista rokotetta ETEC-ripulia vastaan. Kuitenkin jokin aika sitten 10 kehitetyn, suun kautta otettavan kolerarokotteen laajoissa kenttäkokeissa todettiin, ettei tämän rokotteen B-alayksikkö-komponentti, joka ristireagoi immunologisesti ETEC:n lämpöla-biilin enterotoksiinin (LT) kanssa, tuottanut huomattavaa suojaa ainoastaan koleraa, vaan myöskin LT:tä tuottavan 15 ETEC:n aiheuttamaa ripulia vastaan. Suoja ETEC-infektiota vastaan oli erityisen selvä sellaista sairautta vastaan, johon sairauteen liittyi voimakasta, hengenvaarallista neste-hukkaa, ja joka sairaus saatiin vähenemään 86 % tällä rokotteella ensimmäisen kolmen kuukauden aikana immunoinnin jäl-20 keen.

SAIRAUDEN JA IMMUNITEETIN MEKANISMI. Jotta ETEC kykenisi ai- ·.·. heuttamaan sairauden, sen on kyettävä pesiytymään ohutsuoleen * * · · ja tuottamaan LT:ta ja/tai lämpöstabiilia enterotoksiinia *25 (ST, STa) . E. coli LT on rakenteeltaan ja toiminnaltaan sa-, mankaltäistä kuin koleratoksiini, sen koostuessa toksiiniak- tiivisesta A-alayksiköstä, joka on kiinnittynyt viiteen B-: ·' alayksikköön, jotka välittävät sitoutumista solukalvoresepto-’.· * reihin. ST-molekyyli on pieni polypeptidi, joka koostuu vain 30 19 aminohappojäännöksestä, ja joka kiihottaa guanylaattisyk- laasiaktiivisuutta suolistosoluissa. Toisin kuin LT, joka on ·***: vahva immunogeeni, ST ei ole immunogeeninen, ellei sitä ole konjugoitu kokeellisesti suurempaan kantajaproteiiniin. Pel-"·’ kästään ST:tä ja LT/ST:tä tuottavat kannat ovat ripulin huo- 35 mättäviä syitä endeemisillä alueilla, kun taas pelkkää LT:tä ·.·· tuottavat kannat aiheuttavat usein sairautta kehitysmaihin matkustavien henkilöiden keskuudessa. Enterotoksiiniprofii-liltaan erilaisten ETEC-kantojen osuus vaihtelee maasta toiseen.

40 : 108775 3

Monissa ETEC-kannoissa tarttumista suoliston limakalvoon välittävät antigeenisesti erilaiset ripsut (fimbria). Ihmiselle patogeenisistä kannoista on tunnistettu kolme pääasiallista tart-tujaa; niitä kutsutaan pesiytymistekijäantigeeneiksi CFA/I, 5 CFA/II ja CFA/IV (jotka käytettiin aikaisemmin nimitystä PCF8775). CFA/I on yksinkertainen homogeeninen ripsuantigeeni, kun taas CFA/II käsittää coli-pinta-antigeenit (CS-antigeenit) CS1, CS2 ja CS3 ja CFA/IV käsittää CS4-, CS5- ja CS6-antigee-nit. Vaikka näiden erilaisten pesiytymistekijoiden esiintyminen 10 vaihteleekin maantieteellisesti, niin kuitenkin antigeenejä CFA/I, CFA/II tai CFA/IV tavataan tavallisesti puolessa tai jopa kolmessa neljäsosassa niistä ETEC-bakteereista, jotka on eristetty kliinisesti merkittävää ripulia sairastaneista tapauksista. Todennäköisesti myös muita tarttujia tullaan kuiten-15 kin vielä tunnistamaan.

Endeemisillä alueilla ETEC-infektion suurimmat määrät todetaan nuorissa lapsissa. Niiden havaintojen, että sairastuvuus vähenee iän kasvaessa ja että oireettomien tapausten osuus on suu-20 rempi aikuisissa kuin lapsissa, perusteella voidaan päätellä, että ihmisessä voi kehittyä luonnostaan suojaava immuniteetti.

. .· Samoin matkustajissa, jotka oleskelevat pitkiä aikoja näissä ·,: suuren riskin maissa, kehittyy jonkinlaista vastustuskykyä ' ’ ETEC-ripulia vastaan. Edelleen eläimissä ja vapaaehtoisissa . 25 ihmisissä suoritetut kokeet ovat osoittaneet, että ETEC-infek-tio voi johtaa olennaiseen immuniteettiin homologisille orga-j ' nismeille altistumista vastaan.

Olemassa on näyttöä siitä, että sekä antibakteerinen että anti-. ' 30 toksinen immuniteetti myötävaikuttavat suojaukseen ETEC-ripulia ;vastaan. ETEC:ta vastaan kohdistuvan antibakteerisen immuniteetin voidaan katsoa johtuvan suureksi osaksi erilaisia pesiyty-mistekijäantigeeneja (CFA) vastaan vaikuttavasta immuniteetista, vaikka O-antigeenia vastaan vaikuttavilla vasta-aineilla : : 3 5 voi myöskin olla merkitystä suojauksessa homologisia O-ryhmiä käsittävää ETECrtä vastaan. Eläimissä anti-CFA-vasta-aineet ovat suojanneet altistumiselta homologisia CFA-antigeeneja il- | 4 108775 mentävälle ETECille. Samoin sekä eläimissä että vapaaehtoisissa ihmisissä suun kautta tai suoliston sisäisesti toteutettu immu-nointi antigeenejä CFA/I, CFA/II tai CFA/IV ilmentävillä ETEC-kannoilla on indusoinut suojaavan immuniteetin myöhemmin tapah-5 tuvaa homologisen CFA/CS-tekijän käsittävälle E. colirlle altistumista vastaan.

Luonnollisesti indusoitunut antitoksinen ETEC-immuniteetti kohdistuu vain LT:tä vastaan, koska luonnollinen ST ei ole immuno-10 geenistä. Anti-LT-immuunivaste kohdistuu pääasiassa molekyylin B-alayksikköosaa vastaan, joka B-alayksikköosa ristireagoi im-munologisesti koleratoksiinin B-alayksiköiden kanssa. Tämä selittää sen, miksi, kuten edellä on mainittu, suun kautta tapahtuva immunointi kolera-B-alayksiköllä saattaa indusoida suojan 15 ETEC-ripulia vastaan [1]; mielenkiintoista oli todeta, ettei suoja indusoitunut vain pelkkää LT:tä vaan myös LT/ST:tä tuottavia ETEC-kantoja vastaan [1]; tätä havaintoa tukivat myös ne havainnot, jotka oli tehty eläimissä joko kolera-B-alayksiköllä tai LT-B-alayksiköllä tapahtuneen immunoinnin jälkeen (julkai-20 sematon tulos).

Tunnettua on myös se, että ihmisessä kliininen ETEC-sairaus saa •t ; aikaan merkittäviä antitoksisia sekä antibakteerisia immuuni-' vasteita suolistossa, mikä johtaa LT:ta sekä homologisia CFA-, 25 ja O-antigeeneja vastaan vaikuttavan spesifisen IgA-vasta-aine-tiitterin suurenemiseen suoliston huuhtelunesteessä [2], Sekä anti-enterotoksiini- että anti-pesiytymistekijävasta-aineet ’ kykenevät suojaamaan toisistaan riippumatta kokeellista ETEC-infektiota vastaan, ja kun niitä on läsnä yhdessä suolistossa, ;’ ’:30 näiden vasta-ainespesifisyyksien on todettu toimivan yhdessä synergistisesti suojauksessa ETEC-sairautta vastaan [3],

Toisin kuin anti-LT-immuniteetin hyvin vakiintunut suojaava toiminta ETEC-sairautta vastaan, anti-ST-immuniteetin merkitys : ; 35 suojauksessa on vielä selvittämättä. Vaikka luonnollisessa ti-lassa oleva ST ei olekaan immunogeenista, niin kuitenkin se saattaa johtaa ST:tä neutraloivien vasta-aineiden muodostumi- I 108775 5 seen, kun sitä käytetään kantajaproteiiniin kytkettynä. Tämän perusteella voidaan päätellä, että myös rokotteella indusoitu anti-ST-immuniteetti saattaa olla saavutettava tavoite. Kuitenkin tähän saakka testatuissa erilaisissa ST-kantaja-konjugaa-5 teissä, jotka on saatu joko kemiallisella kytkentätekniikalla tai yhdistelmä-DNA-tekniikalla, on säilynyt merkittävää, vaikkakin joskus heikentynyttä toksista aktiivisuutta. Tästä syystä viime aikoina on valmistettu useita synteettisesti muokattuja ST-peptidejä ST:n kaltaisten ei-toksisten epitooppien tunnista-! 10 miseksi. Samankaltaisia peptidejä koodaavia synteettisiä oligo- nukleotidejä on myös tehty ja se on fuusioitu koleran B-alayk-sikköä koodaavaan geeniin, ja kun näitä kimeerisiä geenejä on istutettu Vibrio cholerae-organismiin. ne ovat koodanneet täydellisesti ei-toksisen, ST:n ja B-alayksikön välisen fuusiopro-15 teiinin syntymistä suurina pitoisuuksina. Koe-eläinten immu-nointi tällaisilla kemiallisesti saaduilla tai geneettisesti tehdyillä ei-toksisilla, peptidin ja B-alayksikön välisillä konjugaateilla on johtanut anti-ST-vasta-ainevasteiden kehittymiseen, neutraloivan aktiivisuuden ollessa tähän saakka kuiten-20 kin vain heikko.

. ,· MAHDOLLISET ROKOTTEET. ETEC-bakteereiden tärkeimpiin suojaaviin ' antigeeneihin ja ETEC-infektioita vastaan vaikuttaviin varsi- ! ’ naisiin immuunimekanismeihin liittyvien tietojen perusteella ’ 25 voidaan vetää se johtopäätös, että tehokasta ETEC-rokotetta tulisi antaa suun kautta, ja että se johtaa sekä pesiytymistä vastustavien että antitoksisten immuunivasteiden kehittymiseen V · suolistossa. Niinpä rokotteen tulisi sisältää yhdistelmänä bakteerisolusta ja toksiinista peräisin olevia antigeenejä. Eri-':30 laisia mahdollisia, eläviä tai inaktivoituja ETEC-rokotteita on tarkasteltu näiden vaatimusten pohjalta.

··’ Elävät rokotteet. Tarkastelun kohteeksi voidaan ottaa elävät bakteerit, jotka ilmentävät tärkeimpiä CFA-antigeenejä ja tuot-:‘35 tavat B-alayksikköä tai jotakin samankaltaista enterotoksoidia, koska tällainen rokote saattaisi johtaa suoliston paikallisen immuunijärjestelmän pysyvään antigeeniseen stimuloitumiseen I 108775 6 suolessa tapahtuvan monistumisen seurauksena. Koska erilaiset pesiytyrnistekijät eivät kuitenkaan ilmenny tavallisesti samassa kannassa ja koska eri CFA-antigeeneja koodaavien geenien kloonaaminen samaan isäntäorganismiin ei ole ollut mahdollista, 5 niin tällaiset rokotteet perustuvat välttämättä, ainakin tällä hetkellä, useiden erilaisten kantojen seokseen. Tällaiseen rokotteeseen liittyy kuitenkin lukuisia ongelmia. Niistä voidaan mainita yhden rokotteeseen sisällytetyn kannan liian voimakas kasvu siten, että muut tukahtuvat; toksisuuden palautuminen sen 10 seurauksena, että toksiinia koodaavia plasmideja siirtyy kantaan; enterotoksoidin alhainen tuotanto in vivo-kasvun aikana; sekä rokotekantojen heikko hengissäpysyminen säilytyksen aikana. Tästä syystä suun kautta annettavia eläviä ETEC-rokotteita j ei ole vielä odotettavissa.

15 I Ei-elävät rokotteet. Tärkeimpiä rokotteeseen sisällytettäviä somaattisia antigeenejä ovat ne CFA:t, joita esiintyy runsaasti ETEC-kannoissa eri maantieteellisillä alueilla. Näistä antigeeneistä voidaan mainita CFA/I, CFA/II ja CFA/IV sekä mahdolli-20 sesti muutama muu, vielä määrittelemätön CFA. Puhdistettujen CFA-antigeenien valmistus voi kuitenkin olla suhteellisen kal-. .· lista, ja edelleen, suun kautta tapahtuneen antamisen jälkeen eristettyjen CFA-antigeenien on todettu hajoavan herkästi ihmi-.I * sen ruuansulatuskanavassa [4, 5].

! 25 | ; Käytännöllisempänä tapana muodostaa rokote saattaa olla valmis- taa tapettuja ETEC-bakteereeita, jotka ilmentävät pinnallaan : tärkeimpiä CFA-antigeeneja, ja yhdistää nämä organismit asian mukaiseen toksoidikomponenttiin. Rokotteen valmistukseen liit-*’:30 tyvistä huomattavista ratkaistavista ongelmista voidaan mainita (a) sellaisen toimenpiteen löytäminen, jolla toimenpiteellä rokotekannat voitaisiin tappaa turvallisesti siten, että eri-·’ laisten CFA-antigeenien antigeeniset ominaisuudet ja tarttumis-! ominaisuudet (hemagglutinoivat ominaisuudet) kuitenkin säilyvät :*35 (ihanteellisessa tapauksessa tämän toimenpiteen tulisi myös stabiloida CFA-antigeenit hajoamista vastaan ihmisen suolisto-ympäristössä) , ja (b) sellaisten olosuhteiden löytäminen, jois- I 108775 ' 7 j sa olosuhteissa päästään CFA-antigeenien voimakkaaseen ilmentymiseen bakteereiden pinnalla, kun niitä kasvatetaan nestemäisessä alustassa fermentorissa, suuressa mitassa tapahtuvan ro-kotetuotannon helpottamiseksi.

5

Hyvin tunnettu ja siitä syystä edullinen menetelmä bakteereiden inaktivoimiseksi siten, että niitä voidaan käyttää koko soluihin perustuvissa rokotteissa, on formaliinikäsittelyn käyttö. Tähän tarkoitukseen käytetään tavallisesti IM olevaa formalii-10 nipitoisuutta. Olemme todenneet, että CFArta ilmentävien ETEC-bakteereiden käsittely tavallisesti rokotteen valmistuksessa käytetyillä menetelmillä tappoi turvallisesti ETEC-organismit, mutta tämä käsittely tuhosi samalla suurimman osan CFA-antigee-nisisällöstä tai se tuhoutui kokonaan, mistä syystä nämä mene-15 telmät eivät sovi hyvin inaktivoitujen, mutta CFA-immunogeeni-syyttä vielä käsittävien ETEC-kantojen valmistamiseksi. Tämän mukaisesti Levine [6] on kuvannut Tacket:in et ai. rajallisen menestyksen, joka liittyi yhden kannan formaliinilla käsiteltyjen ETEC-organismien käyttöön IgA-vasta-ainetuotannon stimuloi-20 miseksi ja vapaaehtoisten henkilöiden suojaamiseksi. Rokote oli valmistettu E. coli-kannasta E1392-75-2A, joka on 06:H16-bio-.· tyypin A-kanta, joka ilmentää CS1- ja Cs3-ripsuja, muttei muo->, ; dosta LT:ta eikä ST:ta. Aikaisemmin elävänä, suun kautta annet- ! ’ tavana rokotteena käytettäessä vain yhdellä E1392-75-2A-kannan , , 25 annoksella saatiin merkittävä suoja vapaaehtoisissa serotyyppiä I 0139:H28 olevan LT+/ST+ ETEC-kannan kokeellista altistamista vastaan, joka kanta ilmentää CSl:tä ja CS3:ea. (Tutkimuslai-v · toksen U.S. Army Vaccine Production Facility of the Walter Reed Army Institute of Research, Forest Glen, Maryland, tutkijat ; ‘’:30 olivat inaktivoineet E1392-75-2A-bakteerit formaliinilla).

Tacket:in et ai. mukaan yhdeksälle vapaaehtoiselle annettiin kahden viikon välein kolme rokoteannosta (joista jokainen si- » ..I 10· · · · saisi 5x10 maktivoitua bakteeria) yhdessä NaHC03:n kanssa. Näistä yhdeksästä vapaaehtoisesta kahden seerumissa todettiin : 35 CFA-vasta-aineen merkittävää kohoamista, kun taas neljässä /·,; näistä yhdeksästä vapaaehtoisesta suoliston SIgA-anti-ripsu- > » vasta-aine oli kohonnut selvästi. Sitten toteutettiin pieni

J

I 108775 8 altistustutkimus, jossa neljä rokotetta saanutta henkilöä ja 10 vertailuhenkilöä altistettiin patogeeniselle ETEC-kannalle E24377A (0139:H28, CS1, CS3, LT+/ST+). Merkkejä suojauksesta ei todettu: ripulia esiintyi kahdessa rokotetussa henkilössä nel-5 jästä ja kuudessa vapaaehtoisessa kymmenestä.

Alalla ei olla kuvattu CFA-antigeenien ilmentymistä nestemäisessä alustassa. Tällaista ilmentymistä ei olla todellakaan pidetty tähän saakka mahdollisena, koska nestemäisen alustan 10 tiedetään tukahduttavan CFA-antigeenien ilmentymistä, ja sen sijaan indusoivan mannoosille herkkää tyyppiä 1 olevien karvojen ilmentymistä [7].

Alustavissa yrityksissä kehittää rokotteiden prototyyppejä, 15 jotka perustuvat erilaisia CFA-antigeeneja ja CS-proteiineja ilmentäviin ETEC-bakteereihin [8], oli käytettävä organismien kasvatusta kiinteillä agarmaljoilla, mikä on suuressa mitassa tapahtuvan rokotetuotannon vakava este. Oheisen keksinnön puitteissa on nyt kehitetty toimenpide, joka sallii CFA-antigeenien 20 yhtä hyvän ilmentymisen ETEC:n pinnalla nestemäisessä alustassa ravistelukasvatuksena toteutetun kasvatuksen aikana kuin CFA:lle edullisessa agarmaljakasvatuksessa vallitsevissa opti-\ maalisissa olosuhteissa, ja keksinnön puitteissa on myös osoi- ; ‘ tettu, että CFA ilmentyy voimakkaasti E. coli:n pinnalla fer- ”25 mentorikasvatuksen aikana vallitsevissa olosuhteissa. Keksin- ·' nössä on myös kuvattu toimenpide, jonka avulla nämä nestemäi-! sessä alustassa ja fermentorissa kasvatetut E. coli-bakteerit v : inaktivoidaan formaliinilla siten, että testatut ETEC-rokote- kannat saadaan tapetuiksi turvallisesti, ja joka samalla sekä ‘•‘30 säilöö että stabiloi bakteeripinnalla olevat CFA:t määrätyllä kvantitoitavalla tavalla.

Kuvion 1 selitys: Ruotsalaisille aikuisille vapaaehtoisille annettiin kolmena immunointina (ψ) ETEC-rokotteen prototyyppiä :'35 0., 14. ja 28. vuorokautena ja suoliston huuhtelunäytteitä ke- \ : rättiin välittömästi ennen immunointia ja sitten 9 vuorokautta toisen ja kolmannen immunoinnin jälkeen. Puhdistettuja CFA/I-, ί 108775 ί I 9 CFA/II- (CS1+CS3) ja CTB- (GM1-ELISA) antigeenejä vastaan vaikuttavat ELISA IgA-tiitterit määritettiin ja jaettiin kunkin näytteen kokonais-IgA-pitoisuudella.

5 Keksinnön yksi piirre kohdistuu menetelmään ihmisessä entero-toksigeenisten E. coli-bakteereiden aiheuttamaa suolistoinfektiota vastaan vaikuttavan rokotekoostumuksen tuottamiseksi. Tässä menetelmässä vähintään yhtä, erilaisten tunnettujen kantojen, joista kukin kykenee ilmentämään tietyntyyppisiä pesiy-10 tymistekijäantigeeneja, joukosta valittua E. coli-kantaa kasvatetaan sopivissa olosuhteissa nestemäisessä viljelyalustassa, jossa nämä tietyntyyppiset pesiytymistekijäantigeenit kykenevät ilmentymään voimakkaasti E. coli-bakteereiden pinnalla, ennal-tamäärättyyn tiheyteen, minkä jälkeen bakteeriviljelmä otetaan 15 talteen ja se suspendoidaan uudelleen suolaliuokseen, ja saa- S tuun suspensioon lisätään, samalla kevyesti sekoittaen, forma liinia 0,2 M olevaksi lopulliseksi pitoisuudeksi, mitä seuraa inkubointi 37 °C:n lämpötilassa samalla jatkuvasti sekoittaen noin 2 tunnin ajan, mitä seuraa inkubointi 4 °C:ssa 24-48 tun-20 nin ajan, jolloin tuloksena on formaliinilla tapettu E. coli-kanta, jossa mainittujen, tietyntyyppisten pesiytymistekijä-antigeenien antigeeniset ominaisuudet ja hemagglutinoivat omi-, naisuudet ovat säilyneet olennaisesti, minkä jälkeen nämä for-; ’ maliinilla tapetut E. coli-bakteerit sekoitetaan farmaseutti-'25 sesti hyväksyttävään täyteaineeseen ja/tai laimentimeen sopivaksi pitoisuudeksi.

I v * Keksinnön tämän piirteen eräässä suoritusmuodossa mainittu nes temäinen viljelyalusta käsittää 1 % (paino/tilavuus) kasamino-β0 happoja, 0,15 % (p/t) hiivauutetta, 0,4 mM MgS04, 0,04 mM MnCl2 sekä ionittomaksi tehtyä vettä, pH-arvon ollessa 7,4, ja viljely tapahtuu voimakkaasti sekoittaen tai käyttäen muuta sellaista tapaa, jolla päästään voimakkaaseen ilmastumiseen, noin 37 °C:n lämpötilassa vähintään 4-6 tunnin ajan, ennenkuin baktee-:'β5 rit otetaan talteen sentrifugoimalla tai suodattamalla tai muulla tavalla.

ί 108775 10

Keksinnön tämän piirteen toisessa suoritusmuodossa tietyntyyppisiä pesiytymistekijäantigeeneja ilmentävät kannat on valittu ihmisen suoliston pesiytymistekijäantigeenien CFA/I, CFA/II 5 (CS1, CS2, CS3) sekä CFA/IV (CS4, CS5, CS6) joukosta.

Keksinnön tämän piirteen muussa suoritusmuodossa lisätään vielä j happoa neutraloivaa puskuria sekä valinnaisesti ylimääräisiä j antigeenisiä komponentteja, jotka indusoivat immuniteettia esi- 10 merkiksi endotoksiineja vastaan.

Keksinnön toinen piirre kohdistuu menetelmään ihmisessä entero-toksigeenisten E. coli-bakteereiden aiheuttaman suolistoinfektion estämiseksi siten, että sopiva määrä rokotekoostumusta, 15 joka käsittää immunoivana komponenttinaan vähintään yhtä, erilaisten tunnettujen kantojen, joista kukin kykenee ilmentämään tietyntyyppisiä pesiytymistekijäantigeeneja, joukosta valittua inaktivoitua E. coli-kantaa. joissa kussakin kannassa näiden tietyntyyppisten pesiytymistekijäantigeenien antigeeniset omi-20 naisuudet ja hemagglutinoivat ominaisuudet ovat säilyneet olennaisesti, annetaan ihmiselle, jossa tällainen infektio halutaan , .· estää.

! ' Keksinnön tämän piirteen edullisen suoritusmuodon mukaisesti , 25 antaminen tapahtuu suun kautta.

> · %

Keksinnössä on kuvattu toimenpiteitä, joiden avulla, fermento-* ria käyttäen valittuja E. coli-bakteerikantoia voidaan kasvattaa suuriin tiheyksiin nestemäisessä väliaineessa bakteereiden ‘ 30 menettämättä kykyään ilmentää erilaisia CFA-antigeeneja, CFA/I, CFA/II ja CFA/IV mukaan lukien, minkä jälkeen bakteerit voidaan käsitellä siten, että organismit saadaan tapetuiksi turvallisesti CFA-antigeeneja kuitenkaan tuhoamatta. Näiden toimenpiteiden ansiosta tällaisia inaktivoituja E. coli-organismeia : 35 voidaan käyttää turvallisina, ei-elävinä, suun kautta annet-‘,· tavina, ihmisessä enterotoksigeenisten E. coli-bakteereiden

I I

aiheuttamaa suolistoinfektiota/ripulia vastaan vaikuttavana I 108775 11 rokotteena. Seuraavassa on esitetty esimerkkejä toimenpiteistä näiden bakteerirokotekomponenttien saamiseksi sekä menetelmistä, joilla saadaan selville niiden käyttökelpoisuus suoliston limakalvojen immunogeeneina.

5 1. Menetelmä, jolla päästään toivottujen, erityyppisten CFA-antigeenien (CFA/I, CFA/II ja CFA/IV) voimakkaaseen ilmentymiseen E. coli-organismien pinnalla nestemäisessä alustassa tapahtuvan kasvatuksen aikana, eikä, kuten aikaisemmin on esitet- 10 ty, vain agarmaljoilla tai muilla kiintellä alustoilla.

2. Tämän menetelmän onnistunut soveltaminen näiden CFA-antigee-nien voimakkaaksi ilmentämiseksi E. coli-bakteerin pinnalla, näitä bakteereita fermentorissa, nestemäisessä alustassa kasva- 15 tettaessa.

3. Toimenpide valikoitujen E. coli-organismien inaktivoimiseksi formaliinilla siten, että immunologinen reaktiivisuus spesifisten vasta-aineiden kanssa sekä erilaisten CFA-antigeenien hem- 20 agglutinoiva aktiivisuus säilyvät lähes täydellisesti.

4. Kokeet, jotka osoittavat, että kaniinien immunointi nestees- i sä kasvatetuilla, formaliinilla käsitellyillä E. coli-oraanis- ; ’ meillä johtaa spesifisten, erilaisia CFA-antigeeneja vastaan "25 vaikuttavien vasta-aineiden yhtä suurin tiittereihin kuin immu- ’ nointi vastaavilla elävillä, agarilla kasvatetuilla baktee-| ; ’/ reillä.

5. Kokeet, jotka osoittavat, että formaliinilla käsiteltyjen *’30 rokoteorganismien pinnalla olevat CFA:t ovat stabiilimpia kuin J‘: käsittelemättömien elävien bakteereiden pinnalla olevat CFA:t, kun organismeja inkuboidaaan happamassa puskurissa tai ihmisen *’ ruuansulatuskanavan nesteessä.

:'35 6. Tutkimukset, jotka osoittavat, että nesteessä kasvatettuja, i I 1 : formaliinilla inaktivoituja CFA-E. coli-organismeia voidaan antaa vapaaehtoisille ihmisille ilman merkittäviä sivuvaikutuk- ί 108775 12 siä suun kautta annettavana rokotteena, ja että kahden tai kolmen tällaisen rokoteannoksen antaminen stimuloi IgA-vasta-ai-neiden tuotantoa suoliston huuhtelunesteessä sekä rokotteen CFA-antigeenejä vastaan vaikuttavaa, spesifistä vasta-ainetta 5 erittävien solujen ilmaantumista kiertoon.

Esimerkit I Keksinnön puitteissa testattiin suuri lukumäärä ETEC-kantoja, 10 jotka ilmensivät antigeenejä CFA/I, CFA/II (mukaan lukien kannat, joissa ilmentyi pelkkä CS1, CS2 tai CS3 tai CS1+CS3 tai CS2+CS3) tai CFA/IV (kannat, joissa ilmentyi CS4+CS5 tai CS5+CS6). Nämä kannat olivat eri puolilta maailmaa saatuja kliinisiä eristeitä sekä laboratoriossa manipuloituja kantoja, 15 ja niiden joukossa oli kantoja, joissa enterotoksiinin tuotan-toprofiilit olivat erilaisia (LT+ST, tai pelkkä LT tai ST, sekä toksiinin suhteen negatiiviset johdannaiset). Koska seuraavissa esimerkeissä 1-5 kuvatut toimenpiteet on todettu testatussa määrin päteviksi erilaisille kannoille, jotka ilmentävät eri-20 tyyppisiä CFA-antigeeneja tai alatyyppejä ja joiden enterotok-siiniprofiilit ovat erilaisia, niin esimerkeissä kuvatut kokeet ja tulokset on rajoitettu muutamalla valitulla kannalla saatui-. hin edustaviin tuloksiin.

‘25 Esimerkki 1 ·’ CFA-antigeenien ilmentyminen E. coli-oraanismien pinnalla fer- mentorissa, ravisteluviljelmänä nestemäisessä alustassa tapah- : tuneen kasvatuksen jälkeen 1 ;30 Aikaisemmin käytetyt toimenpiteet CFA-antigeenien ilmentämisek-si E. coli:n pinnalla ovat aina perustuneet organismien kasvatukseen kiinteillä pinnoilla, tavallisesti niinkutsutuilla CFA-agarmaljoilla [7], koska tiedettiin, että kasvattaminen nestemäisessä alustassa tukahdutti tavallisesti CFA-antigeenien il-35 mentymistä ja helpotti samalla tyyppiä 1 olevan (tavallisen) : karvan ilmentymistä E. coli-bakteereiden pinnalla. ETEC-rokot- teen suuressa mitassa tapahtuvan tuotannon helpottamiseksi kek- ! 108775 13 sinnön puitteissa on kehitetty toimenpiteitä, jotka tekevät mahdolliseksi erilaisten CFA-antigeenien voimakkaan ilmentymisen E. coli-bakteerin pinnalla myös nestemäisessä alustassa vallitsevissa kasvuolosuhteissa (ravisteluviljelmissä pulloissa 5 tai fermentorissa).

Useiden erilaisten tavallisesti käytettyjen bakteriologisten nestemäisten alustojen ja viljelyolosuhteiden epäonnistuneen | testaamisen jälkeen saimme kehitetyksi seuraavan toimenpiteen, 10 jolla CFA-antigeenejä voitiin ilmentää ja todeta toivottuina määrinä alunperin jokaisen mallikannan SBL101 (CFA/I), SBL102 ja SBL103 (molemmat CFA/II) pinnalla nestemäisessä alustassa kasvattamisen jälkeen. Sitten CS5:n ilmentämistä varten tarkoitetun alustan koostumusta hieman muuttamalla päästiin myös 15 CFA/IV-antigeenin hyvään ilmentymiseen muiden kantojen pinnalla. Eri kantojen jäädytetyistä siirrosviljelmistä (joita pidettiin glyserolissa -70 °C:ssa) otettiin platinasilmukalla pieni määrä, joka siirrostettiin CFA-agarmaljoille, joita inkuboitiin yön yli 37 °C:ssa. Maljalla olevista pesäkkeistä selvitettiin 20 asianmukaisen CFA:n ilmentyminen suorilla agglutinaatiokokeilla käyttäen antigeenejä CFA/I, CS1, CS2, CS3, CS4, CS5 ja CS6 vas-.taan vaikuttavia spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita. Nämä \ ; moniklonaaliset vasta-aineet on valmistettu hakijoiden labora-* toriossa. Sitten CFA-agarmaljoilla olevat bakteerit otettiin

I I

, ,25 talteen fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja täs-i ’, ; tä suspensiosta otettiin 5-10 xlO9 organismia, jotka lisättiin * *’ siirrosteena 400 ml:aan nestemäistä alustaa. Tämän CFA-alustan • ' koostumus oli seuraava: kasaminohappoja 1 % (p/t); hiivauute 0,15 % (p/t); MgS04 mM; MnCl2 0,04 mM; ionittomaksi tehtyä vet-30 tä H20, pH 7,4. Näitä pulloja inkuboitiin ravistellen nopeudel-; , : la 150 pyöritystä/min., noin 20 tunnin ajan 37 °C:ssa, minkä ajanjakson jälkeen suspensiosta tehdyn 1:10-laimennoksen optinen tiheys oli noin 0,25-0,5. Bakteerit otettiin talteen sent-, rifugoimalla +4 °C:n lämpötilassa, bakteerikasauma pestiin ker-i 35 taalleen PBS-liuoksella ja bakteerit kasautettiin jälleen sent-: rifugoimalla ja ne suspendoitiin uudestaan PBS-liuokseen sel laiseksi suspensioksi, josta tehdyn 1:10-laimennoksen optinen I 108775 14 tiheys oli 0,285. Tästä suspensiosta ja vertailun vuoksi CFA-agarmaljoilla viljeltyjen kantojen rinnakkaisviljelmistä talteenotettu j en bakteereiden suspensioista, jotka oli asetettu samaan optiseen tiheyteen, määritettiin laimennossarjana asian-5 mukaisen CFA:n ilmentyminen. Näissä analyyseissä käytettiin sekä suoraa agglutinointia monoklonaalisella anti-CFA-vasta-aineella että kvantitatiiviseen CFA-inhibitioon perustuvaa ELISA-menetelmää, joka oli kehitetty hakijoiden laboratoriossa.

10 Tulokset on koottu taulukkoon 2. Niistä nähdään, että suspensioissa, jotka saatiin sen jälkeen, kun organismeja oli kasvatettu pulloissa nestemäisessä alustassa, CFA-antigeenien ilmentyminen oli verrattavissa CFA-agarmaljoilla kasvatetuilla bak-| teereilla saavutettuun ilmentymiseen (kun bakteeripitoisuus oli 15 asetettu samansuuruiseksi).

Kannoissa SBL102 ja SBL103 läsnäolevat, erilaisia CFA/II CS-proteiineja koodaavat plasmidit koodasivat myös bakteerin vastustuskykyä ampisilliinille ja kanamysiinille. Tästä syystä 20 näitä kantoja viljeltiin rinnakkain nestemäisessä alustassa ja agarilla, joita oli täydennetty näillä antibiooteilla. Vaikka taulukossa 2 esitetyt arvot onkin saatu ilman antibiootteja, niin kuitenkin antibioottien läsnäollessa saadut arvot olivat käytännöllisesti katsoen identtisiä (ei esitetty). Samoin nes-25 temäisessä alustassa, jota käytettiin taulukossa 2 kuvatussa kokeessa, vallinneet kasvuolosuhteet osoittautuivat yhtä tyy-. dyttäviksi kuin kasvatus CFA-agarmaljoilla, jotka oli tarkoi- tettu useista muista testatuista kannoista peräisin olevien antigeenien CFA/I, CFA/II ja CFA/IV (käsittäen kunkin alaprote-30 iinin CS4, CS5 ja CS6) ilmentämistä varten; CS5:n optimaalista ilmentämistä varten sekä esiviljelyyn käytettyä CFA-agaria että • nestemäistä CFA-alustaa täydennettiin 0,15 % Bacto Bile Salts-suoloilla pitoisuudeksi 1,5 g/1 (Difco) .

, 35 Myöhemmissä kokeissa tätä toimenpidettä, jolla CFA-antigeenit saatiin ilmentymään voimakkaasti ETEC-organismien pinnalla nestemäisissä viljelmissä, sovellettiin fermentorissa, nestemäi- i 108775 15 sessä alustassa toteutettavaan kasvatukseen. Seuraavan toimenpiteen, joka on esitetty seuraavassa esimerkinomaisesti CFA/I-kannalle, mutta joka todettiin yhtä käyttökelpoiseksi myös muiden, CFA/II:ta tai CFA/IV:ää tuottavien kantojen tapaukses-5 sa, todettiin johtavan CFA:n samankaltaiseen ilmentymiseen bak-teereiden lukumäärää kohden kuin kasvatus CFA-agarilla tai ra-visteluviljelmissä.

| CFA-agarmaljoille siirrostettiin SBLIOl-kantaa (CFA/I) ja mal- 10 joja kasvatettiin 37 °C:ssa yön yli; siirrosteena käytettiin pakastettua siirrosviljelmää. Bakteerit otettiin talteen CFA-agarmal joilta fysiologisen suolaliuoksen avulla ja 5xl010 bakteeria lisättiin siirrosteena 4 litraan CFA-alustaa; siirrosteena voitaisiin myös käyttää bakteereiden log-vaiheessa ole-15 vaa, CFa-alustaan tehtyä ravisteluviljelmää. Sitten bakteereita kasvatettiin Bio-flo III-fermentorissa (New Brunswick Scientific Co, Edison, N.J., USA) 37 °C:ssa samalla voimakkaasti sekoittaen (800 pyöritystä/minuutti), pH-arvoa säätämättä. Jo 4-5 tunnin kuluttua fermentoriviljelmän aloituksesta viljelmän 20 optinen tiheys oli 4-5, eli suspension 1:10-laimennus oli 0,4-0,5. Optisen tiheyden ei todettu kasvavan jatkettaessa viljelyä fermentorissa 20 tunnin ajan. Näytteistä, jotka oli otettu fer-·, / mentorista eri ajanhetkillä viljelmän aloittamisen jälkeen - ja '·,· vertailun vuoksi saman bakteerisiirrosteen ravisteluviljelmis-'..25 tä (pulloissa) valmistetuista bakteerisuspensioista - määritet-tiin CFA/I:n ilmentyminen sen jälkeen, kun bakteeripitoisuus oli asetettu yhtäsuureksi eli arvoon 10 bakteeria/ml. Kuten ,\ taulukosta 3 nähdään, CFA/I:n ilmentyminen (bakteereiden lukumäärää kohden) oli optimaalista jo sen jälkeen, kun viljelyä , , 30 oli jatkettu 4-5 tuntia fermentorissa, ja se oli verrattavissa siihen CFA/I:n ilmentymiseen, joka todettiin pulloissa, ravis-teluviljelmänä 2 0 tunnin ajan kasvatettujen bakteereiden pin-: nalla.

'.35 I 108775 16

Esimerkki 2

Toimenpide E. coli-bakteereiden inaktivoimiseksi formaliinilla siten, että CFA-antigeenien immunoreaktiivisuus ja hemaggluti-noiva aktiivisuus säilyy 5

Erilaisia fysikaalisia ja kemiallisia inaktivointimenetelmiä, joista voidaan mainita käsittely formaliinilla erilaisissa olosuhteissa, testattiin epätyydyttävin tuloksin, ennenkuin tässä | esimerkissä kuvattu sopiva toimenpide löytyi. Tämä toimenpide, 10 joka käsittää lievän formaliinikäsittelyn eri lämpötiloissa useiden vuorokausien ajan, täytti sen vaatimuksen, että oletetut E. coli-rokoteoraanismit saatiin tapetuiksi täydellisesti aiheuttamatta niiden CFA-antigeenisisällössä tai -laadussa merkittävää häviötä. Tämä testattiin määrittämällä erilaisten CFA-15 antigeenien määrät bakteereiden pinnalla ennen formaliinikäsit-telyä ja käsittelyn jälkeen käyttäen kvantitatiiviseen CFA-in-hibitioon perustuvaa ELISA-määritystä, jossa käytettiin erilaisia CFA/CS-komponentteja vastaan vaikuttavia monoklonaalisia vasta-aineita, kuten esimerkissä 1 on kuvattu. Tämä menetelmä 20 tekee mahdolliseksi bakteeripinnalla olevien CFA-antigeenien täsmällisen määrittämisen. Asetettujen vaatimusten mukaan vähintään yhden kolmasosan CFA-antigeenisisällöstä tulisi olla säilynyt bakteerivalmisteessa tappamisen jälkeen eläviin lähtö-·,· organismeihin verrattuna, ja samoin hemagglutinoivan aktiivi-, 25 suuden tulisi olla säilynyt ilmaistavana tapetuissa bakteereis sa säilyneen CFA-antigeenisyyden lisäksi.

♦ · i Tämä toimenpide ja sen käyttökelpoisuus on kuvattu yksityiskoh taisesti seuraavassa esimerkissä. Joko CFA/I- tai CFA/II-anti-30 geenejä ilmentäviä bakteereja kasvatettiin nestemäisessä alustassa ja ne suspendoitiin PBS-liuokseen käyttäen esimerkissä 1 ,: · kuvattuja samoja toimenpiteitä. Sitten formaliinia (HCHO) li-sättiin 0,2 M olevaksi lopulliseksi pitoisuudeksi bakteerisus-pensioon, suspensiota varovasti sekoittaen. Sitten suspensiota . 35 inkuboitiin sitä jatkuvasti sekoittaen 37 °C:ssa noin 2 tunnin ajan, minkä jälkeen se siirrettiin kylmähuoneeseen ja pidettiin ,'·· 4 °C:ssa vielä 24-48 tunnin ajan. Kun inkubointi formaliinin i I 108775 17 kanssa oli saatu päätökseen, suspensiosta otettiin näytteitä ja niistä määritettiin elinkelpoisten organismien puuttuminen viljelemällä sekä elatusalustassa että agarmaljoilla; agarmaljoja ja elatusalustapulloja tarkkailtiin joka päivä 14 vuorokauden 5 ajan. Toimenpide johti aina kaikkien testattujen IL*_coli-organismien täydelliseen kuolemiseen.

Sen jälkeen, kun formaliinikäsittely kylmässä oli suoritettu loppuun, bakteerisuspensioista analysoitiin niiden CFA-sisältö 10 määrittämällä vastaavien näytteiden hemagglutinoiva aktiivisuus [7], sekä kyky estää vastaavien monoklonaalisten vasta-aineiden sitoutuminen CFA ELISA-määrityksessä, joka on kuvattu viitteessä [9]. Vertailun vuoksi kuhunkin kokeeseen sisällytettiin vastaavan kannan käsittelemätön, juuri valmistettu viljelmä, jonka 15 bakteeripitoisuus oli asetettu samaksi kuin formaliinilla käsiteltyjen organismien tapauksessa. Kuten taulukosta 4 todetaan, hemagglutinoiva kyky oli säilynyt näissä formaliinilla käsitellyissä valmisteissa ja CFA-antigeenisyydestä oli säilynyt vähintään 50 % vastaavilla CFA ELISA-inhibitiokokeilla määritet-20 tynä. Lukuisissa peräkäisissä kokeissa varmistettiin ne tulokset, että formaliinilla käsitellyt bakteerit inhiboivat 50-pro-senttisesti vastaavien monoklonaalisten vasta-aineiden sitoutu-, mistä kiinteään faasiin sidottuun puhdistettuun CFA:hän pitoi- suuksina, jotka vastasivat 50-100 % käsittelemättömien baktee-‘..25 reiden pitoisuuksista.

| ·V; Esimerkki 3 1 Formaliinilla käsiteltyjen ja käsittelemättömien (elävien) ETEC-organismien pinnalla olevien CFA-antigeenien varastointi/-... 30 inkubointistabiilisuuden vertaaminen v ’ Muissa laboratorioissa tehdyt tutkimukset ovat osoittaneet, ;että käsittelemättömän CFA-ripsut ovat hyvin herkkiä mahahapol-;··· le [4,5]. Mahahapon neutraloiminen edeltäkäsin neutraaliin pH-.35 arvoon ei näyttänyt estävän sen haitallista vaikutusta ripsu-; ; proteiinin CFA-antigeenisyyteen [4]. Tätä taustaa vasten me vertasimme käsittelemättömien E. coli-bakteereiden pinnalla ja 18 108775 vastaavien, formaliinilla käsiteltyjen E. coli-bakteereiden pinnalla ilmentyneiden CFA-antigeenien antigeenisyyttä toisiinsa sen jälkeen, kun bakteereita oli inkuboitu happamassa ruuansulatuskanavan nesteessä ja tyhjäsuolinesteessä, vastaavasti.

5 Näytteitä inkuboitiin myös PBS-liuoksessa, jonka pH oli asetettu eri arvoihin.

Alustavissa kokeissa erilaisia käsittelemättömiä ja formaliinilla käsiteltyjä bakteerisuspensioita inkuboitiin eri pH-ar-10 voissa, jotka vaihtelivat alueella pH 3 - pH 11, 30 minuutin ajan 37 °C:n lämpötilassa, ennen pH-arvon palauttamista neutraaliksi. Inkubointi näissä pH-arvoissa ei vaikuttanut yhdessäkään tapauksessa käsittelemättömistä bakteereista eikä formaliinilla käsitellyistä ja tapetuista bakteereista saatujen 15 valmisteiden CFA-antigeenisyyteen. Myöhemmissä kokeissa verrattiin toisiinsa elävien bakteereiden ja formaliinilla inaktivoi-tujen bakteereiden inkubointia puskurissa, jonka pH-arvo oli 2, happamassa ruuansulatuskanavan nesteessä ja tyhjäsuolen nesteessä. Ruuansulatuskanavan nestettä ja tyhjäsuolen nestettä 20 kerättiin aikuisilta ruotsalaisilta Sahlgrenska-sairaalassa, joka sijaitsee Göteborgissa. Kuten taulukosta 5 nähdään, inkubointi puskurissa, jonka pH oli 2, tai inkubointi happamassa ruuansulatuskanavan nesteessä vaikutti vain marginaalisesti tai se ei vaikuttanut lainkaan formaliinilla käsiteltyihin baktee-,25 reihin, eikä CFA-antigeenisyyden todettu pienentyneen lainkaan j tyhjäsuolen nesteessä toteutetun inkuboinnin jälkeen. Toisaalta ,' käsittelemättömien elävien bakteereiden CFA-antigeenisyys oli useimmissa tapauksissa selvästi pienempi sekä puskurissa, jonka pH oli 2, inkuboinnin jälkeen että happamassa ruuansulatuskana-30 van nesteessä inkuboinnin jälkeen. Nämä analyysit osoittavat, että formaliinikäsittely suojaa CFA-ripsuja hajoamiselta maha-nesteessä.

35 f 19 1 08775

Esimerkki 4

Formaliinilla käsiteltyjen ETEC-organismien ja käsittelemättömien (elävien) ETEC-organismien pinnalla esiintyvien CFA-anti-geenien immunogeenisten ominaisuuksien vertaaminen 5

Formaliinilla käsiteltyjen ja käsittelemättömien (elävien), CFA-positiivisten E. coli-bakteereiden kykyä indusoida anti-CFA-vasta-ainevasteita verrattiin toisiinsa. Täysikasvuisille uusiseelantilaisille valkoisille kaneille, jotka painoivat 2-3 10 kg immunoinnin alkaessa, annettiin 3-5 ihonalaisena innjektiona vastaavat annokset (5xl08 - 2xl09 bakteeria) formaliinilla käsiteltyjä bakteereita tai käsittelemättömiä eläviä bakteereita; ensimmäiset injektiot annettiin Freund:in täydellisessä apuaineessa, toiset injektiot annettiin epätäydellisessä apuaineessa 15 ja myöhemmät injektiot annettiin ilman apuainetta. Formaliinilla käsitellyt bakteerit valmistettiin immunoinnin alkaessa, minkä jälkeen niitä säilytettiin +4 °C:ssa käyttöön saakka; elävät bakteerit valmistettiin juuri ennen käyttöä kunakin im-munointipäivänä. Formaliinilla käsiteltyjä bakteereita oli vil-20 jelty CFA-alustassa ja käsittelemättömiä eläviä bakteereita oli viljelty CFA-agarilla; sekä formaliinilla käsitellyt että käsittelemättömät bakteerit pestiin kahdesti PBS-liuoksella ennen immunointia.

'.· 25 Eläimistä otettiin verinäyte välittömästi ennen immunointia ja ·’: sitten 7-10 vuorokauden kuluttua viimeisestä immunoinnista.

i J ·*; Seerumit käsiteltiin ja ne pakastettiin annoksina -30 °C:n läm- • r. potilaan, jossa niitä pidettiin analyysiin saakka. Spesifiset vasta-ainevasteet immunoivan kannan CFA:ta vastaan määritettiin , , 30 käyttäen erilaisia ELISA-menetelmiä. ELISA-mikrotiitterilevyt pinnoitettiin puhdistetuilla CFA-antigeeneilla, eli antigee-; ‘ neilla CFA/I, CFA/II (CS1+CS3), CS2, CS4 tai CS5, liuotettuna : PBS-liuokseen 1-5 /ig/ml olevaksi lopulliseksi pitoisuudeksi, ;·'· inkuboimalla CFA-liuosta sisältäviä maljoja 37 °C:ssa yön yli. ,35 Sitten seerumin viisinkertainen laimennussarja titrattiin le-' ; vyillä tavalla, joka on kuvattu aikaisemmin [2,3]. Tiittereinä : määritettiin sen intrapoloidun laimennuksen käänteisluku, jonka I 108775 20 laimennuksen absorbanssi oli lukeman 0,3 verran suurempi kuin taustan absorbanssi, kun entsyymin oli annettu reagoida subs-traattinsa kanssa 20 minuutin ajan.

5 CFA-vasta-ainetaso ei ollut merkittävä yhdessäkään ennen immu-nointia otetussa verinäytteessä, eli CFA-tiitteri ei ollut yli 50. Toisaalta immunoinnin päättymisen jälkeen kaikissa seerumeissa vasta-ainetiitterit homologista CFArta vastaan vaihte-livat alueella 25 000 - 300 000 (Taulukko 6). Immunointi for-10 maliinilla käsitellyillä bakteereilla indusoi hyvin samankaltaiset tiitterit homologista CFArta vastaan kuin vastaavat käsittelemättömät organismit (Taulukko 6).

Esimerkki 5 15 Kokeet, joilla selvitetään formaliinikäsiteltyjen ETEC-baktee-reiden turvallisuus ja kyky stimuloida spesifisen IgA-vasta-aineen muodostuminen ihmisen suolistossa ETEC-rokotevalmiste, joka koostui formaliinilla tapetuista, 20 antigeenejä CFA/I, CS1, CS2 ja CS3 ilmentävistä bakteereista (eli kannoista SBL 101, SBL 102 ja SBL 103, jotka on mainittu taulukossa 1), valmistettiin Ruotsin kansallisessa bakteriologisessa laboratoriossa (National Bacteriological Laboratory) pienen mitan kliinisiä kokeita varten. Tätä rokotekomponenttia 25 annettiin yhdessä kolera B-alayksikön (CTB [1]) kanssa. Ruotsalaisissa aikuisissa vapaaehtoisissa toteutettiin tutkimus tämän yhdistelmä-CFA-ETEC-CTB-rokotteen turvallisuuden ja suolistossa paikallisen immunogeenisyyden selvittämiseksi. Myös vasta-ainevasteet seerumissa sekä ääreisveren lymfosyyttien 30 kyky tuottaa spesifisiä vasta-aineita määritettiin.

Kullekin vapaaehtoiselle annettiin suun kautta kolmena immu-nointina 1011 tapettua E. coli-oraanismia ja 1 mg CTBrtä kulloinkin kahden viikon välein. Rokote annettiin 150 mlrssa pus-• 35 kuroitua bikarbonaattiliuosta, käyttäen niitä samoja sitraatti-bikarbonatti-tabletteja (ACO, Tukholma, Ruotsi), joita käytettiin suun kautta annetussa kolerarokotteessa Bangladesh:in 21 1 08775 kenttäkokeissa [1]. Suolistonäytteitä ja seerumia kerättiin välittömästi ennen immunointeja ja sitten 9 vuorokauden kuluttua toisesta ja kolmannesta immunoinnista; ääreisveren lymfosyyttejä saatiin sinä päivänä, jolloin ensimmäinen immunointi 5 toteutettiin, ja sitten 7 vuorokautta ensimmäisen, toisen ja kolmannen immunoinnin jälkeen.

Suoliston IgA-vasta-ainevasteet useimpia tärkeitä suojaavia antigeenejä vastaan määritettiin suoliston huuhtelunesteestä 10 aikaisemmin kuvatulla tavalla [2]. Suoliston huuhteleminen toteutettiin antamalla vapaaehtoisten juoda isotonista suolaliuosta (tavallisesti 3-5 litraa), kunnes tuloksena oli vesiri-puli. Kerätty nestemäinen uloste suodatettiin harsokankaan läpi, sitä käsiteltiin erilaisilla entsyymi-inaktivaattoreilla, 15 se sentrifugoitiin ja väkevöitiin pakastekuivaamalla. Aikaisemmissa tutkimuksissa me olemme jo osoittaneet, että suoliston huuhteluneste on paikallisesti muodostuneiden, erittyneiden, suolistoon annettua antigeeniä vastaan vaikuttavien IgA-vasta-aineiden rikas lähde; suolistossa paikallisesti syntetisoitu-20 neet, erittyneet IgA-vasta-aineet ovat todennäköisesti erityisen tärkeitä suojaavassa immuniteetissa ETEC-ripulia vastaan. Paikallisesti suolistossa, esimerkiksi suun kautta annetun rokotteen vaikutuksesta stimuloituneet immunosyytit kulkeutuvat tavallisesti imunesteen kautta vereen ja ja palaavat sitten ta-.. 25 kaisin suolistoon, jossa ne kypsyvät pääasiassa IgA:ta erittä-• : viksi plasmasoluiksi. Näitä suolistosta peräisin olevia, vasta- ·’; ainetta erittäviä soluja (ASC-soluja) voidaan saada keräämällä ääreisveren lymfosyyttejä tietyllä ajanhetkellä varhain suun kautta tapahtuneen rokotuksen jälkeen - optimaalisesti 7. vuo-, 30 rokautena [10] - ja näiden solujen kyky tuottaa stimulointiin käytettyjä antigeenejä vastaan vaikuttavia, spesifisiä vasta-aineita voidaan määrittää. Lopuksi erityisen IgA-luokan seeru- mivasta-aineet voivat myöskin viitata, tosin vähäisemmässä mää- i ! rin, tällaisiin suolistossa esiintyviin vasteisiin.

35 26 vapaaehtoiselle annettiin kolme annosta rokotetta. Yhdessäkään tapauksessa ei todettu mitään paikallisia eikä systeemisiä ! ί 108775 f 22 haitallisia reaktioita, jotka olisi voitu yhdistää immunoin-tiin. 11 rokotetusta henkilöstä kerätyistä suoliston huuhtelu-nesteistä tutkittiin antigeenejä CTB/LT, CFA/I, CFA/II ja yhden immunoivan kannan O-antigeenia vastaan vaikuttavat vasta-aineet 5 [2]. Sitten määritettiin spesifiset ELISA IgA-tiitterit jaettu na kunkin näytteen kokonais-IgA-pitoisuudella. Kuten taulukosta 7 nähdään, merkittäviä IgA-vasta-ainevasteita todettiin antigeenejä CFA/I ja CFA/II vastaan sekä CTB:tä vastaan useimmissa j rokotetuissa henkilöissä. Vasteiden esiintymistiheys suolistos- 10 sa oli verrattavissa siihen esiintymistiheyteen, joka todettiin jo aikaisemmin CFA-positiivisen E. coli-bakteerin aiheuttamasta infektiosta toipuvien bangladeshiläisten keskuudessa. CFA/I:ta ja CFA/II:ta vastaan vaikuttavat vasta-ainevasteet olivat verrattavissa (kuvio 1) suuruutensa puolesta siihen vasteeseen, 15 joka on nähty jo aikaisemmin ETEC-sairaudesta toipuvissa bang-ladeshiläisissä. Vapaaehtoisissa todettiin myös selviä suolistossa esiintyviä IgA-vasta-ainevasteita rokotteen CTB-komponen-tille (kuvio 1) ja nämä vasteet olivat suuremmat kuin kliinisen ETEC-sairauden jälkeen todetut anti-LT-vasteet.

20 Näistä tuloksista nähdään, että ETEC-rokote kykeni indusoimaan paikallisesti suolistossa olennaisia CFA-vasta-ainevasteita; tällaisten vasteiden indusointi ihmisissä suun kautta annet- • tujen eristettyjen ripsujen avulla immunoimalla on ollut ai- ,.25 kaisemmin vaikeata [4,5]. Immunointi johti myös siihen, että useimpien rokotettujen henkilöiden vereen ilmaantui spesifisiä ASC-soluja, jotka määritettiin ELISPOT-määrityksellä [10] anti-·;·, geenejä CFA/I, CFA/II ja LT/CTB-vastaan (taulukko 7). Anti-CFA ASC-solujen suurentuneita määriä todettiin jo vain yhden roko-, ,30 teannoksen jälkeen. CFA-vasta-ainetta tuottavien solujen vasteet olivat vain vähän suuremmat toisen ja kolmannen annoksen ' jälkeen kuin ensimmäisen immunoinnin jälkeen, kun taas anti-; LT:tä tuottavien solujen optimaaliset lukumäärät todettiin toi-• sen immunoinnin jälkeen. Syntyneet anti-CFA-vasta-aineet kuu- \35 luivat pääasiassa IgA-luokkaan, mutta myös eräitä IgM:ää tuot- • ; tavia ASC-soluja todettiin; anti-CTB ASC-solut olivat pääasias- • Ί sa IgA-isotyyppiä, mutta myös eräitä IgG:tä tuottavia soluja 23 108775 tunnistettiin. Rokote sai myös aikaan merkittäviä seerumin vas-ta-ainevasteita sekä CFA- että CTB/LT-antigeeneja vastaan useimmissa vapaaehtoisissa (Taulukko 7).

5 10 i 15 20 25 . 30 ‘ ,35 i 108775 24

Mainitut julkaisut 1. Clemens J, Sack D, Harris JR, Chakraborty J, Noegy PK, Stanton B, Huda N, Khan MU, Kay BA, Khan MR, Ansaruzzaman 5 M, Yunus M, Rao MR, Svennerholm A-M, Holmgren J: Cross- protection by B-subunit-whole cell cholera vaccine against diarrhea associated with heat-labile toxin-producing enterotoxigenic Escherichia coli: results of a large-scale field trial. J. Infect. Dis. 158:372-377, 1988.

10 2. Stoll BJ, Svennerholm A-M, Gothefors L, Barua D, Huda S, Holmgren J: Local and systemic antibody responses to naturally acquired enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea in an endemic area. J. Infec. Dis. 153:527-534, 1986.

15 3. Ähren C, Svennerholm A-M: Synergistic protective effect of antibodies against Escherichia coli enterotoxin and colonization factor antigens. Infect. Immun. 38:74-79, 1982.

20 4. Levine MM, Morris JG, Losonsky G, Boedeker E, Rowe B:

Fimbriae (Pili) adhesins as vaccins. In Protein-Carbohydrate Interaction in Biological Systems, pp. 143-145, Academic Press, London, 1986.

,, 25 5. Evans DG, Graham DY, Evans DJ Jr, Opekun A: Administration ; of purified colonization factor antigens (CFA/I, CFA/II) of enterotoxigenic Escherichia coli to volunteers. Response to challenge with virulent enterotoxigenic Escherichia coli. Gastroenterology 87:934-940, 1984.

. 30 6. Levine MM: Vaccines against enterotoxigenic Escherichia coli infection. In Woodrow GC, Levine MM (toimittajat): New ; generation vaccines. Marcel Dekker, Inc, New York 1990, p.

649-660.

‘35 25 1 0 8 775 7. Evans DG, Evans DJ Jr: New surface-associated heat-labile colonization factor antigen (CFA/II) produced by enterotoxigenic Escherichia coli or serogroups 06 and 08. Infect. Immun. 21:638-647, 1978.

5 8. Svennerholm A-M, Holmgren J, Sack DA: Development of oral vaccines against enterotoxigenic Eschericia coli diarrhoea. Vaccine 7:196-198, 1098.

10 9. Lopez-Vidal Y, Klemm P, Svennerholm A-M: Monoklonal anti bodies against different epitopes on colonization factor antigen I of enterotoxin-producing Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 26:1976-1972, 1988.

15 10. Czerkinsky C, Svennerholm A-M, Quiding M, Jonsson R, Holm- ! gren J: Antibody-producing cells in peripheral blood and salivary glynds in humans. Infect. Immun. (in press) 1991.

20 . 25 i > > j , 30 35 I * 108775

i I

! I

i I

•rl j

in I

H O W I

W CM d ·> P> :(0 I

X ^ Ph H H I

3 IT) H - rl I

3 m - o) a) o) I

w CM &> C rH TS I

; -H co 0 » G <0 CD |

I (ö O vo Ο Ό I

j c (l) CO J3 co U G H G | -Η O-P<DOO-HlOCD| g il CU «SH K4J| 0 :cö cö :0 O O co d |

PI WO voSO iciK I

G I

α) I

•r~i I

vo O I

m -P I

C -H I

(0 D I

O CO I

1 > CM CM I

•H > H « VO I

ιΗ -P EC ·· H I

O O ·· O W I

Ο O CO co ·· I

0) h vo I

. WOO O I

H I

G I

CD I

•n I

>i , I

-P I I

+J -H -H I

Q) C Ή I

‘ : if ‘d E"1 E-* E"1 !

>1 ·Η "H iJ J J I

:co Μ Ή ” I

i X X O + . + I

OPR R R I

I :(0 R 01 W CO w I

en I

in - I

•H CO I

CD ψ I

x -H H H CD I

! p O H H —» Η + I

O) I O — H cm I

g <>,< rilW CC0| -H W > W [P O (P CD |

in u-po o·— o —· I

CD I

CO I

h en I

; tn I

O -H I

* d in I

X P G > H CM CO I

3 -H CO +j O O O I

H C G -h H H HI

3 -π a n pi J pi I

id (0 CO -H CQ CQ CQ I

R S WOW W W I

in o m ο in

H H CM CM

108775 γΗ n Μ Λ (ΰ ·η L u H Q) :<0 -H I Q) wo ι +j C0 -ι—t I v φ η ι 15 w (Ο ι X} •h g c ι :(0 5-1¾ Ιο η (0 :<0 I "o

α) cr> -Μ ι S

-M (Ö I -M I Η υι ι ο 0 ι c Φ rij c :ί0 'Η -° I m G a ο * 00001¾ cj c ι h o o oo o ro | to R ίο <i ,0 'a· m cm cm (N oj | -g H G -·» — | 3 I—I d) -H -H H .G H H HH H H j 5 <0 φ P Φ PJ G I “ G 01 φ e W-H ι

G M -P 'g l E

•H G -p (0 I .TO

a -p ·* ' ι o.

(0 -h φ ι * ™ G > -P -P ι 3

03 φ οι ι w g ι E

T3 (0 < 5 , £ IL

-h ^ a > I G lm φ O -H -H <01,1 G (0 (0 -P g CM CM CM CM VO VO | -{n (DC G -H g g m ro cn tn HH| ^ 0)3 Φ W H .p -- ^ | “ £ *H O^tH rH rH rH rH rH rH j ^ ,¾ 4J ·γΙΗ tjio | ,

(0 (ö <H (0 < G l 'H

G P -H (0 I o . .· 1 U M c I °

H Φ ¢0 I JJ

. : h > an ι .-£ , ‘: o ω m ι -g υ g ι Jq .

''· · φ ! .« «

:·.·. w * j H H

G :(0 -P I 's ö

; ’,'. φ -ι—ι Φ I ? H

; , · G QJ 1 -h a H G , -p l ΰ s • g φ I 43 l <5 .' >, (fl 3 3 Φ Φ Φ l^rn +J Ai > W -P P -P P ^ ^ I "Id r»

Cg UI Ό UI G UI (0 W (0 | 5 V

Q)4J (OH φ tyi Φ&ι Φ O' I ^ L

g(0 W O G (0 G (0 Π (0 | - 'L

H > I § £

··:. ^ S ! 3 S

G M 1 - -(0

nm 'CC

cm ~| h ! $ £

φ m -h ui ι x L

m Φ (ö Q υ ι 3 m : θ' -p o ι £ m o -h w > - — — ι .tl ,* -P g > ~ H ΗΓΟΙ^Π

,* G H -p H H (MH CO H CO I r -S

3 (0 (0 (0 I o o -- 0--01¾¾

H I I .p C H < H < HrtJ+I^S

' · 3 < <d G a J a ja J a cm I Ä maa (Oucqu mu bum i ehuu « h w ^ ui — ω^υ ι π ό ID O LO O IT) o

H H CM CM CO

i 108775

(O

I—I rH

i «3

C

C

•H <·.

α -h I

-P I

— to I

H (0 I

\ > I

< (G I c <0 ft (d 'ωί υ +j . 'Si to I fj 5 ta fi I i > r-l > rH>, >1 >1 >1 | 2 3

0 0) -P P> -P -P | 2 -P

t—I *. -I-+J +J+J -P | “ 10 PI (0 Ή Q) Q)Q) Q) I 3 i aatn -η-ρ-ρ-ρο-ροιΗρ ! co to > -η o -h -n m ή m I -P a) <0 ra 3 P CO p p CN P CM | ft G -i—i -H rH :cO :(0 :nj —. s<0 —«. | w

(Ö -H P 0) :(Ö H :(0 :<0 Η :(0 H j C

S CrH a> -p e e 0 n '5° ™ co) -ρω I o

(0 +J -P -Η ·Η ·Η -H -H lm "P

X Ui -H > Q) 0)0) 0) |03+J

H -H -P t0 | -H

u > VK 1 ω -s 0) (d I 1 S i

Q) P fU I -S

-P ^ i . c X Λ O lii . (0 -n _ · n 1 Λ S 1 i 1 «3 a) i m > . m ω -h g i ·§ ph

· o fö MH rH | H O

U -P -Ηβ) . i ^ tfl 10 -r I .p, >1

. a . 0) H I j? 4J

·,·, W rH G ft-H | i -P

ta <u to > i £ a) ’ c Q) -H OOOOOO I pp 0):(0,¾ ρονοοιηιηιηιηι'Γ]-Η ,· G 10 H OC0H(NCMCMCMCM|Gp.

-H to :ta -p ^ ^ ^ ^ ^ I

; · g 0) -f—| C ΗΗΗΗιΗΗΗ|®}:(βθ) * ’ >ι ω ω I Tt S ·—i -P -H G S I 3 G :<a 0) P I n · :(0 o) g ω ω I M h h

60)¾ (P lcgrH

rH -p g I % >· -.(0 •H to 4-> I rf rt g • . a) (0 i Ä -h h G G > I .. e 0) o) ω i c to +j -H (0 ta I m *P Q) : : c to ^ to i s c c a) to -h i S <e a) « a) -h e -p i 3 ^ g

CP P 33 C I i P I

o -h o +j i g i :E, o < , , ,* -P -P 0) >i-P i ^ „ to

«GG+JrH I c 2 H

... . G(0Q)G 0)· (ΝΠ^ΙΛΙ^σιΟι^οΡΙ

H I g 0) TH(0 <N|^hW

3 <! p -p h x i w

· «J IP 0) O -H -H I

H a MH -P > (0 Ira m o m o H rH n] i 108775

i :(0 +J

•H >, ω . >, -H q ω

Φ O O

C E O P

0) -H -h -P

Ό ’P -P >i -H > -H k O Ä 0)

-r—i +-* -H

' > C 0) •P G O -h 0)

m Φ -H

S T3 -P S

Φ -H 'H Λ H o P o -h * -h Φ in 5 1/3 +> VI o\° Λ C +>

| <U-H C H

i cl,·^ o •S m +* -h (0

I M P , +> -P

c ι ·° ω +> * o

Q) (0 o I tj ·ρ Pt110 "H

Όβ ω i £ p -p φ “

Sd · P i -S <u φ m c d +> -P3 1 m Φ Φ in -p ρω liJ-P'^ca •h (0 h -h i .. Λί ω q o]

> p O’ > ++ ++ + + I 2 (0 Φ 4-> P

HP O’-Η I -Η λ 0) ω •H (1) (0·Η I -P ·-+> ·Η

+>> S -P 1 m c 2 ? P

M 0),¾ i .2 φ Λ > φ rt (O K (0 I ·Φ :(0 -Γ-» (0 0) i in i ^ +J P (0 +> ρω 1 - -P M -¾ ίο -h i m 2 S :

>0) i ; m ® « Λ +J

1 -h p I -g x 2 ω o ω i .£ £ ω (0 a

Cd) <ί H | "Jr (0 P 0) +1

•H -p Xl fOincOl^rHOJdCoXO

~ V X -H M w | Φ H Eu O

?) P(0G P O H H I .. ·· ·Ρ 4J +J H

00 H Λ -H G <13 I 11 < (0 d (0 θ’ΐχ:Φ+) i , en ή ρ g <o tr -h -h c +> i p· h a (0 c (OHO) -H -H H H H j ld[0 -P03

S O P 4-1 -H HH H "3* H H j T" W -P G G -P

m n m -H+3 < oooo CQ cm cm oi coooi +1 Wq) QJd

£ Q) ωΐ Pm CJ 'w CO W l 'P (0 -P T3 g P

• jj 03 <c O HH HH O H H | Crj i—1 (0 -H Ή l/l rt w ,¾ a ip 1 m Hf ^ φ 'p •IH (0 W U I Ä ^P H°

:(0 Λ I t! > S Φ -P

c ω i i ^ 3 f ® öp 03 m -h i^+ji+Jioa Ό -H H l-PlAH^nj ’.: d >< o ' 4-> ? S V :2 dHu ® i τ; p _]·λ h g *. ω h > ι,Ξφ'Ρρ.ω -HO)· Ή I ^ a S -P :(0

> JJ GJ 03 I'Jj^'-lOOrH

-H -H +> I § C (0 > ud I.’ -h in ^ +> i o "p to λ -P :(0 C -h I 'p O p +j (0 ω ;·; ·Η ω Ph hP Ph i-P Ρμι4|·Η·ηΦχ3ΗΙ/) ;· rt -H :<0 I 'πί -P Φ O H 03 ,·;·. o)(0> « 1 c 'S v2 ϋ!

: P H :(0 I P XX X g H

O H iH |P-H«(Ö(0O

C -p Φ I(0'S’QA7'H^ PC'-" i_2c^-p-pc , , g -H I . ·ΗΞ O -h -h ... g -h c i ^ i o τι o ω

, ’ -H H -H I C ^ H 1¾ O

(0 -H I .5 IP - Φ o

I : : g g e H -h u 5 2 w S

Φ P :0 -H I h K- ° ‘P K- S

•HO-P O I >-» 01 >1 (Ö ’"· C4-I+J Q 1 g t! 2 ^ Ή ^

03:(0 > | g +> d P -P I

»QJCfi > |P<UdC03Q

..... cnoJQ) -P ^ΐ(!τ-ρωα-Ρ * ’ O -h c H I Hl 'P 'P Φ ·Ρ ' -P -H 03 CO ^ COI||POgp:(0 . . M C ε -P -P U H H (N HOI 11 :(0 -P -h KO -o dPS+> (0^ o·^ o— o+ι g®

:,it »HIiH-H HriJ HH HCNl Sa< I S-P

3 c ή in ca piip pico picoi

·; rt (P :<0 :(0 (OO PQU MO B U I

Ε^οω^ «H (O'- (O'— co'— i ra xi o in o in o m o

H H CM (N H

I , 108775 ! i s

H I

0) (0 -H

-P -m -P

P S

-H :(0 <0 to to

:(0 0) -H

« -h <o

(U -P

(0 +j *

H -P -PI

I—I ·ι-Ι *H i<3 (OP ι P ft

CO) I Q> CJ

C I CU I

-H c — ·—- l -P Ή a (0 o\° o\o o\o j « -p

> o m I (0 C

G(0 co co o co ο cm m ι Λ (0

0) c I

Ό (0 PII .f' H H'-' H H —' \ -P (0

-H X Ο\ο n I :(0 -H

<U o5 ' W I g U1

p G .. U j :0 -H

(D +J in I — I -P (0 Φ (0 ·>, -h °\° o\° I -p « +J H C -P o\o I =(0 2 « G 5? C in in ιηο in o | g g

(00) .ft) (0 CM H O CM O (M O I (DC

ΰ G c ^ '-Ή ^1-1 I 1-1 <° 1(0 Π W j| HH — Hw Hw| (D-H ·

•H p ° S I +J 0) C

rH P r< & , +J (0 -H

O P PI -H I -Η -H

o pq Π — i to c -P

g W r o\o I :to (D C

. φ £ o <N> o I X :(0 -H

Wo) I m o\o r* in o I -p o -H ^ cm σι cm cm cm ο | - +J X!

G g , S "·" '"'H ^1-1 I *P >i P

φ rj t~q| r j H H '— H— H — I :(0 :(0 X

n -H m I > X C

>i m W I :(0 -H

-P (0 s*. CJ I Ή (0 O HC g1 — I a> H g (DP S- -H o\o I I—I p +J -P -P o o o\o m o\° o I n ·· p

•h+j . c m o cm moi C -P

0)(0 .-«(CHrHOHin HO| i-Q W -P

:(0 p in ^'^(-'"'.co Sd I H(D

p (PI , H H '— H — i—I '— I ·» hQ -p

(D I +J W P

(0 > -Q I -H (D

(H c ·Η I P (0 -P

H C <D P I (D H · 0

•H -H <D <U | (D H ^-+J

C X X -P I -P <0 m , -H -H H -P I X >

, , -H (D :(0 -H I (0 P O OJ

1 ; H p ·ι—i *H -s I Λ -P « ' . (0 (D -P — — <Λ° I 0) t" e <D G 1 ° °\° °\° O I +j p p

·.. P+J-H < OO O O O | p p H W

O « C IP CM CO Ο H1 O (M O I o 0) p ft <4-1 (0 C to I O M — '—''i— CM ''.Hi Ή ft(0 ( Λ·Η Ji —- H '— |0-P' : * 0)10 C< l>C(0 . . p -Η Λ (D Pm i ·Η O O (/1 ;,· pHpH CU I 4-> 0 (fl (ft 0)Oft^° -HI ^ -H +J Φ •H o C H <4-1 -H —. o\o I (0 P (0 ω

. Η -H PI -H +j O o\o o\o O I C -H M M

•H· CQ 0)COin Ο 00|·ΗΧ)'— 0 •h w (0 ^ Q) p h r' in in o hoj -h p jo o) raidi ^ ^m sh j (04h(0-h

(0--.0) N W · H w I H c 4J H

: +J c O I H -H -H I

0) -H > I -H I (D ΙΛ

•Hp I C < C CQ

C > (0 j *H Pm Ή (Xt (D :(0 1 j *H U (0 •HrH® IC : ca)a w(0 I to >i to c 0)^ cm pftCI^-P-P^ irt(D (0 -H - +J(0 φ I PH 0)+1 ·: O'Cw -p (^cm (0,c h I o <d jo -p O-H-H0) C H O I <H +J (> (0

X -P -H (0 -H KW PC P I „ -H I P

·* «cgg o (¾¾ 0)(0 o) I n ω Λ p p (0 :o (0 X) c > a) :(0 a) I r :<o < a) H I +) ft p ' - (0 (0 +> -f-1 +j I PmWS> p<P>a x cow pctowioi

«J IP :(0 (0 C PQ PQ P (0 fl) >i <U I

HUgW H WPP KMC tl C I n O

in o in o m o

H H CM CM H

108775

<β I

•H I

-Ρ O I I

-Η Ο Ο — I £ • Η Ο Ο Ο ι Μ -Ρ Ο Ο Ο Ο ι Ρ 0 0 0,¾ ω ο ο ι η Ο Ο I ο ο I χ ft η Ο r- t- ι £ I · Olli < o O O O I ι

t, O O O I

ζ_) O O O O I 00

If) I Ο _ I Ο Η Ο Ο ι ι-Ι

φ -Ρ ΓΟ ^ ro (Μ I X

:(0 γΗ +J -H w ' — j if) •Η 0) :<c Ρ Ο ι > +Jg(DO ΟΟ Ο ι ·Η :π3 +J :0 Φ Ο ΟΟ Ο ι 01 rH -Ρ -Ρ -Ρ O O O I |Η 0) ω -Ρ X ο I :<0 :φ :π3 (0 ο Γ^ο ο | ι/ϊ -Ρ W 6 Λ m CMif) ^ι-Η :κ) Ρ I ω

•Ρ I

g -Ρ ι C

:0 -Ρ ~ ο ~ I Ρ jj Ή Ο Ο Ο ι ^ JJ ·Η Ο Ο Ο ι 3 ·,(ϋ -Ρ Ο ο ι ^

g I ο I

φ ι< ΟΟΟ I (C

rH W CD ρ ro I -Ρ Q) H III ι ΙΛ jj O O O j ·Ρ 4j w m ο ο ο ι o

-H rH Ο Ο Ο ι TO

ω <-* , ι :ro -P -P CM O) ro

C >i-P O ro (N ι (CS

•H rH ·Η " s—* s—*' I *H

, (0 -HHIt O I -P

ΓΓ -|—1 ι—I φ φ O O O O OO 00| c iÖ-P<U Ο Ο Ο Ο ΟΟ 00| Ή :(rt g-H+JOOO ο ο O O I o o p tn x ο ι c >, OitdfOt-'rooinooinin, 3 4j (P.irl.Qr^ocNCM-tfrocNCMi g rH I fi

d) I -P

-p 1 -ρ ι (0

w ι -P

:(0 ι “

. v (0 ι -P

-Ρ I (0 • 1 <d 1C ι h , ·; rH - m Q) ι (0

rH Φ 3 Φ H ro I G

•H C -P 0 "·» CO I 0 ' C -P ifl -P i< H (N U if)|i!

,, -H (0(0+JpHCOCO + CO CO ι -P

-H I > C U U U H U U I

i * rH (¾ (¾ CO I If)

I ’ , . (β c -p <0 u I I

. g (ο ω x to ι ro

i : p(0<00(0 I

! : . O +j > ΤΊ-Ρ ι C

• * <4H CO I -P

(Ö I -1-) ρ > ' Ή

φ ι -P

a) ro ι 9J

-p -P 1 S

ifl ·ρ -—. ι P

(0 0) —4 VO CO I (0

; > p (0-P ro r-» CO CO I

aid) 4-):(0^. COroU CJ I Φ

C Φ C-rH U CO + + I H

•P -P (0 *P -V. + u 't If) I H

(0^ Ai^CHCN + CO COI-P

. «1(0 Φ P CO CO H U U I 5 · ; (0Λ (O-puuuco'-' '--ι cio 0-PI > I ^ U l-p-p

M ill ή -p CO — W <n ι -Ρ P

. , i< dj H O U H <N CO rH 001 G Φ 3 > 0 C O O O in <X> Η 1 Φ Φ

rH I u 3 <! H H H CM CO O I W -P

3 <! g IP PI PI PI t-' h n~ l «ft· gucQCQPQ^H hi

Eh U W HHC0COC0OJW W i m in ο in ο in ο H H cm (M ro 108775 3 I 0)

O -P

<H O

g -p >1 I—I id

I—I

C Ή Φ Φ μ in

Φ M

> o

Ui C I

•P C I

Φ (0 I

P o\o | :td (0 Φ o\° o\° j :rd iH Ui oi | h Ui in o cr» |

«.3 -H ID —- I

td -P E w ^ 1

Ui Φ G DJ 1

Ui c P Dl DJ H I

•H G Φ H H "v. I

p (ti CO Φ --- H j

r-1 >i W CO 10 H I

Φ (0 Φ I

+J +J Ä I

X -P ‘P I

p p -P I

3 (ö to I

•C m ·ρ I

O E 1

PC >* I

tn d -»-> (0 -— -—- -— 1

-H p C tn o\° o\o o\° I

H tn -h tn 1 0 -H -H OI (Ti j p (0 tn p θ' 00 co 1 tn h Φ 1-1 w -— ' t (H O 1 tn·· C C tn οι σι σι 1 CD Φ Φ I rH H ι-t j

Q) -H P U "s. ^ I

Λ, ie -m Φ en VO iO en |

S -H -H td > < H H H

-p & -p I

tn >1 5 1

•t-H >i O I

g -P *0 I

>1 O O I

-p -p 2 *

C O E I

•H C I

•P Pj P « I

Ui Φ id r-- 1 , ,· Φ e Φ tn o\° o\° o\° j

0) -P tn I

etu tn O dj n dj 1

r ' · · Φ-P (C -P CO Is M I

i-P t> tn — — -*—· 1 -ho -p 1 ’ ., Φ Ai rH H H H j o O H H H j . tn g e -------1 rt 1 en en co σ 1 > u 1 i Φ w 1 : , · G Ei 1 ! ... -p w e 1 te) Φ 1 1 (0 Φ 1 td tn A! 1 P Ui rH +j 1 tn -h :<ο Φ 1 rd g ·π Φ 1

> C -P I

I P C Ui I

C φ -h rt 1 en φ e > 1 h tn e φ ·· 1 •h e Φ 1 C td O -HH 1

Φ -n e td rH I

p- -p p I -h „ I

; > :<d g ίΰφ hEhi O ;id tn g -PC HHj| « 4J tn ή tn φ 1 1¾ -p ·η tdo<:<«i 3 -HOC >Ö^^EH| H A! -P 3 I -H UUUi

3 P >1 -P < -P I

«d φ >1 φ e 1

Eh S tn -P m td 1

ID O ID O ID

H H DJ DJ

Claims (4)

1. 33 1 08775