BR112014005601B1

BR112014005601B1 - Vacina oral para a imunização contra a diarréia induzida pela etec

Info

Publication number: BR112014005601B1
Application number: BR112014005601-3A
Authority: BR
Inventors: Ann-Mari Svennerholm; Joshua Tobias; Nils Carlin; Jan Holmgren
Original assignee: Scandinavian Biopharma Holding Ab
Priority date: 2011-09-12
Filing date: 2011-09-12
Publication date: 2020-09-29
Also published as: CA2846354A1; US20200215173A1; US11052143B2; US10548961B2; US11918636B2; AU2011376755A1; US20150320850A1; AU2011376755B2; US20210330775A1; BR112014005601A2; CA2846354C; WO2013037397A1

Abstract

vacina oral para a imunização contra a diarréia induzida pela etec. uma vacina oral para a imunização contra diarréia induzida pelo etec, que compreende células de escherichia coli inativas que expressam um antígeno do fator de colonização de etec e adjuvante de proteína dmlt, em que a vacina preferivelmente compreende menos do que 1013 células por dose unitária.

Description

Campo Técnico

[0001] A presente invenção diz respeito ao campo de vacinas de célula inteira morta oral contra a diarréia induzida pela ETEC.

Fundamentos

[0002] A E. coli enterotoxigênica (ETEC) é uma das causas bacterianas mais frequente de diarréia em crianças nos países em desenvolvimento. A ETEC também é uma causa principal da diarréia dos viajantes. A doença usualmente ocorre a seguir da ingestão da ETEC e colonização da superfície mucósica intestinal. A colonização é facilitada pelos fatores de colonização específicos (CF) localizados na superfície das bactérias. A seguir da colonização, as bactérias produzem uma toxina instável ao calor (LT) e/ou uma toxina estável ao calor (ST) que deflagram a diarréia aquosa. O objetivo desta invenção é desenvolver uma vacina oral inativada contra a ETEC para o uso em crianças que vivem em áreas endêmicas assim como em viajantes ocidentais que vão para as áreas endêmicas de ETEC.

[0003] Uma vacina oral anteriormente desenvolvida que consiste de bactérias ETEC inativadas e subunidade B da toxina da cólera recombinante (CTB) foi mostrada ser segura e imunogênica em crianças que vivem em áreas endêmicas assim como em adultos ocidentais que viajam para áreas endêmicas para a ETEC. Esta vacina conferiu alguma proteção contra a diarréia moderada/severa em viajantes adultos; entretanto, a eficácia protetiva em crianças não foi significante.

[0004] Os inventores revisaram a informação obtida a partir de estudos da clínica desta Ia geração de vacina contra ETEC e concluíram que uma formulação de vacina que contém quantidades aumentadas de antígenos CF e com capacidade de neutralizar toxina aumentada deve fornecer melhor imunidade protetiva. Um problema com simplesmente aumentar a quantidade de antígenos CF é que o número muito grande de células em uma dose de vacina resulta em efeitos adversos tais como náusea e vômito, em particular em bebês.

[0005] Consequentemente, uma nova 2a geração, de vacina contra ETEC tetravalente foi desenvolvida, que contém quatro cepas da E. coli inativadas que super expressam, isto é níveis aumentados comparados com isolados clínicos de ETEC, dos CFs mais prevalecentes, isto é CFA/I, CS3, CS5 e CS6, e um novo “toxóide” de proteína híbrida rLTB/CTB (LCTBA) com imunogenicidade mais forte contra LT do que o toxóide rCTB usado na formulação anteriormente estudada. Um protótipo monovalente desta vacina de 2a geração foi recentemente estudado em um teste de fase clínica I e foi descoberto ser imunogênico, seguro e bem tolerado pelos indivíduos.

[0006] A LT da E. coli tem propriedades tanto enterotóxicas quanto adjuvantes. Entretanto, o uso da toxina LT como um adjuvante oral foi impedido pela sua enterotoxicidade. Para contornar este problema, um toxóide LT mutante duplo (dmlT), destituído de enterotoxicidade mas com propriedades adjuvantes retidas foi recentemente desenvolvido. A segurança da administração oral de um lote piloto de cGMP de dmlT foi documentado tanto em um estudo de toxicologia GLP pré-clínico e em um estudo clínico em andamento nos Estados Unidos.

[0007] Aqui, os inventores demonstram a eficácia de uma nova vacina de ETEC que compreende o adjuvante dmlT para realçar respostas imunes.

[0008] A vacina presentemente divulgada tem benefícios particulares com respeito à sua capacidade para evocar eficazmente respostas imunes (em particular, a diversos CFs simultaneamente) enquanto mantém a quantidade de células por dose unitária suficientemente baixa para evitar efeitos adversos. Números muito grandes de células levam aos efeitos adversos tais como náusea e vômito, em particular em indivíduos bebês.

[0009] Certos aspectos da presente invenção foram divulgados pelos inventores em uma publicação acadêmica anterior (Svennerholm AM. From cholera to enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) vaccine development. Indian J Med Res. Fev 2011; 133(2): 188-96. Review).

Definições

[00010] No contexto da presente divulgação, os termos abaixo têm os significados especificados. A abreviação ETEC refere-se às bactérias enterotoxigênicas de Escherichia coli.

[00011] O termo vacina de célula inteira mortarefere-se à vacina que contém bactérias inteiras (intactas) porém mostras (não vivas).

[00012] O termo dose unitáriarefere-se à combinação de constituintes intencionados para a administração a um único indivíduo em uma dada ocasião, tal como imunização primária ou imunização de reforço.

[00013] Os termos sinônimos LCTBA, proteína LCTBA e proteína híbrida LCTBAreferem-se a uma proteína híbrida entre a subunidade B da enterotoxina instável ao calor da E. coli (LTB) e a subunidade B da toxina do cólera (CTB). Sete aminoácidos na molécula de CTB foram substituídos pelos aminoácidos nas posições da molécula LTB. Para detalhes, ver Lebens et al. 1996 (Lebens M, Shahabi V, Backstrom M, et al. 1996. Synthesis of hybrid molecules between heat-labile enterotoxin and cholera toxin B subunits: potential for use in a broad spectrum vaccine. Infect Immun 64: 2144-2150).

[00014] O termo dmlTrefere-se a um mutante não tóxico da toxina LT da E. coli.Esta molécula foi mutada em duas posições diferentes; uma substituição de G no lugar de R na posição 192, e L no lugar de A na posição 211 e foi caracterizada por Norton et al. 2011 (Norton EB, Lawson LB, Freytag LC, Clements JD. Characterization of a mutant Escherichia coli heat- labile toxin, LT(R192G/L211 A), as a safe and effective oral adjuvant. Clin Vaccine Immunol. Abril de 2011; 18(4): 546-51).

[00015] O termo marcador de seleção não antibiótico refere-se aos marcadores de seleção genética para a seleção de plasmídeos que não requerem o uso de antibióticos no processo de seleção. Os exemplos incluem complementação de thyA.

Descrição resumida das figuras

[00016] Figura 1: Ilustração do planejamento dos estudos de imunização em camundongos

[00017] Figura 2: Atividade adjuvante comparável de dmlT e toxina do cólera (CT) para resposta de anticorpo anti-CFA/I de IgA intestinal (fecal) para CFA/I que super expressa E. coli recombinante morta por formalina oralmente administrada. (V = lote clínico da vacina VI09, testado em dosagens diferentes sozinha e com dmlT 25 pg ou CT 15 pg)

[00018] Figura 3: A imunização oral em camundongos com vacina tetravalente contra ETEC (V) induz respostas de anticorpo de IgA fecal e do intestino delgado a todos os componentes da vacina, que são realçados ainda pela coadministração da vacina com adjuvante dmlT (V+dmlT). Respostas com aumento de Log 10 vezes em relação ao fíindo médio em camundongos não imunizados são mostrados. As respostas são de camundongos Balb/c exceto para CS6 que são de camundongos C57/BI.

[00019] Figura 4: Imunização oral em camundongos com vacina ETEC tetravalente (V) induz respostas de anticorpo IgA e IgG+IgM séricas fortes para todos os componentes de vacina, que são frequentemente realçados ainda pelo adjuvante dmlT (V+dmlT). * p<0,05; ** p<0,01 referem-se à diferença induzida pelo dmlT na resposta à vacina; (*) & (**) p<0,05 &<0,01 em um experimento repetido. As respostas são em camundongos Balb/c exceto para CS6 que são de camundongos C57/BI.

Sumário da Invenção

[00020] Em um primeiro aspecto é fornecida uma vacina oral para a imunização contra a diarréia induzida pela ETEC, que compreende células de Escherichia coli (E. coli) inativadas que expressam um antígeno do fator de colonização de ETEC, proteína LCTBA e proteína dmlT, em que a vacina preferivelmente compreende menos do que 10lj células por dose unitária.

[00021] A dita vacina pode compreender: a) A E. coli inativada que expressa CFA/I, preferivelmente compreendendo um plasmídeo recombinante que expressa o operon de CFA/I inteiro por exemplo, sob um promotor tac e tendo um marcador de seleção não antibiótico, o mais preferivelmente a cepa ETEX21; b) A E. coli inativada que expressa CS3, preferivelmente compreendendo um plasmídeo recombinante que expressa o operon de CS3 inteiro por exemplo, sob um promotor rns que por sua vez está sob o operador lac e tendo um marcador de seleção não antibiótico, o mais preferivelmente a cepa ETEX22; c) A E. coli inativada que expressa CS5, preferivelmente compreendendo um plasmídeo recombinante que expressa o operon CS5 inteiro por exemplo, sob um promotor tac e tendo um marcador de seleção não antibiótico, o mais preferivelmente a cepa ETEX23; e d) A E. coli inativada que expressa CS6, preferivelmente compreendendo um plasmídeo recombinante que expressa o operon CS6 inteiro sob por exemplo, um promotor tac e tendo um marcador de seleção não antibiótico, o mais preferivelmente a cepa ETEX24.

[00022] A vacina pode compreender por dose unitária: a) A E. coli inativada que expressa CFA/I em uma quantidade de 415 a 1245 pg (preferivelmente de 747 a 913 pg) de CFA/I; b) A E. coli inativada que expressa CS3 em uma quantidade de 1485 a 4455 pg (preferivelmente de 2673 A 3267 pg) de CS3; c) A E. coli inativada que expressa CS5 em uma quantidade de 255 a 765 pg (preferivelmente de 459 a 561 pg) de CS5; d) A E. coli inativada que expressa CS6 em uma quantidade de 60 a 180 pg (preferivelmente de 108 a 132 pg) de CS6; e e) A proteína LCTBA em uma quantidade de 500 a 1500 pg (preferivelmente de 900 a 1100 pg).

[00023] Preferivelmente, a vacina compreende por dose unitária 1 a 200 pg de dmlT, preferivelmente de 5 a 50 pg, mais preferivelmente de 8 a 30 Pg-

[00024] Preferivelmente, a vacina compreende por dose unitária menos do que 10 “ células bacterianas, mais preferivelmente menos do que 2x10 células bacterianas por dose unitária.

[00025] Preferivelmente, a vacina compreende células de E. coli que expressam CS6 que foram inativadas com um método que envolve o uso de fenol, preferivelmente em uma concentração de 0,6 a 2,0 por cento em peso em uma solução aquosa.

[00026] Em um segundo aspecto, é fornecida uma vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, para o uso em um procedimento que compreende a administração oral da vacina a um indivíduo a ser imunizado em pelo menos duas ocasiões separadas no tempo em pelo menos 3 dias. Preferivelmente, as ocasiões são separadas no tempo em 3 a 60 dias, mais preferivelmente de 5 a 21 dias, o mais preferivelmente, de 7 a 10 dias.

[00027] Também é divulgado um método para imunizar um indivíduo contra a diarréia induzida pela ETEC, que compreende administrar uma vacina da invenção ao indivíduo a ser imunizado em pelo menos duas ocasiões distintas separadas no tempo em pelo menos 3 dias. Preferivelmente, as ditas ocasiões são separadas no tempo em 360 dias, mais preferivelmente de 5 a 21 dias, o mais preferivelmente, de 7 a 10 dias.

Descrição detalhada

[00028] A presente invenção divulga uma vacina oral para a imunização contra a diarréia induzida pela ETEC, que compreende células de Escherichia coli inativadas que expressam um antígeno do fator de colonização ETEC, a proteína híbrida LCTBA e proteína dmlT. Preferivelmente, a vacina compreende menos do que 101' células por dose unitária.

[00029] Preferivelmente, a vacina compreende os componentes que seguem: a) E. coli inativada que expressa CFA/I; b) E. coli inativada que expressa CS3; c) E. coli inativada que expressa CS5; d) E. coli inativada que expressa CS6; e) proteína híbrida LCTBA; e f) adjuvante de proteína dmlT.

[00030] Mais preferivelmente, os componentes a) a d) são como especificados abaixo: a) a E. coli inativada que expressa CFA/I é de uma cepa que compreende um plasmídeo recombinante que expressa o operon CFA/I inteiro por exemplo, sob um promotor tac e tendo um marcador de seleção não antibiótico; b) a E. coli inativada que expressa CS3 é de uma cepa que compreende um plasmídeo recombinante que expressa o operon CS3 inteiro por exemplo, sob um promotor rns que está por sua vez sob o operador lac e tendo um marcador de seleção não antibiótico; c) a E. coli inativada que expressa CS5 é de uma cepa que compreende um plasmídeo recombinante que expressa o operon CS5 inteiro por exemplo, sob um promotor tac e tendo um marcador de seleção não antibiótico; e d) a E. coli inativada que expressa CS6 é de uma cepa que compreende um plasmídeo recombinante que expressa o operon CS6 inteiro por exemplo, sob um promotor tac e tendo um marcador de seleção não antibiótico.

[00031] Mais preferivelmente, os componentes a) a d) são como especificado abaixo (ver os Exemplos para a divulgação das cepas). a) a E. coli inativada que expressa CFA/I é da cepa ETEX21; b) a E. coli inativada que expressa CS3 é da cepa ETEX22; c) a E. coli inativada que expressa CS5 é da cepa ETEX23; e d) a E. coli inativada que expressa CS6 é da cepa ETEX24

[00032] A vacina pode compreender por dose unitária as quantidades que seguem dos componentes especificados: a) E. coli inativada que expressa CFA/I em uma quantidade de 200 a 2000 pg de CFA/I; b) E. coli inativada que expressa CS3 em uma quantidade de 500 a 10000 pg de CS3; c) E. coli inativada que expressa CS5 em uma quantidade de 100 a 2000 pg de CS5; d) E. coli inativada que expressa CS6 em uma quantidade de 20 a 600 pg de CS6; e e) proteína híbrida LCTBA em uma quantidade de 200 a 5000 Pg-

[00033] A vacina pode compreender por dose unitária as quantidades que seguem dos componentes especificados: a) E. coli inativada que expressa CFA/I em uma quantidade de 415 a 1245 pg de CFA/I; b) E. coli inativada que expressa CS3 em uma quantidade de 1485 a 4455 pg de CS3; c) E. coli inativada que expressa CS5 em uma quantidade de 255 a 765 pg de CS5; d) E. coli inativada que expressa CS6 em uma quantidade de 60 a 180 pg de CS6; e e) proteína híbrida LCTBA em uma quantidade de 500 a 1500 Fg-

[00034] O mais preferivelmente entretanto, as quantidades são como especificadas abaixo: a) E. coli inativada que expressa CFA/I em uma quantidade de 747 a 913 pg de CFA/I; b) E. coli inativada que expressa CS3 em uma quantidade de 2673 a 3267 pg de CS3; c) E. coli inativada que expressa CS5 em uma quantidade de 459 a 561 pgdeCS5; d) E. coli inativada que expressa CS6 em uma quantidade de 108 a 132 pg de CS6; e e) proteína híbrida LCTBA em uma quantidade de 900 a 1100 pg.

[00035] Preferivelmente, a vacina pode compreender de 1 a 200 pg da proteína de dmlT por dose unitária, mais preferivelmente de 5 a 50 pg e o mais preferivelmente de 8 a 30 pg.

[00036] Preferivelmente, a vacina compreende menos do que 10 células bacterianas por dose unitária. Mais preferivelmente, a vacina compreende menos do que 2 x IO11 células bacterianas por dose unitária. O mais preferivelmente, não há mais do que IO11 células bacterianas por dose unitária.

[00037] Preferivelmente, as células da E. coli que expressam CS6 da vacina foram inativadas com um método que envolve o uso de fenol. Em particular, a inativação pode ter sido realizada usando fenol em uma concentração de 0,6 a 2,0 por cento em peso em uma solução aquosa.

[00038] A vacina divulgada pode ser para o uso em um procedimento que compreende a administração oral da vacina a um indivíduo a ser imunizado em pelo menos duas ocasiões distintas separadas no tempo em pelo menos 3 dias. Preferivelmente, as ocasiões são separadas no tempo em 3 a 60 dias, mais preferivelmente 5 a 21 dias, o mais preferivelmente, 7 a 10 dias.

[00039] A vacina é preferivelmente administrada formulada em uma solução de bicarbonato de sódio para neutralizar a acidez gástrica na ingestão da vacina.

[00040] Todas as referências são por meio deste incorporadas por referência.

Exemplos Exemplo 1: Propriedades físicas, químicas e farmacêuticas e formulação Fundamentos Gerais

[00041] A vacina tetravalente consiste de quatro cepas da E. coli inativada recombinantes (ETEX 21-24) que expressam o CFs CFA/I, CS3, CS5, e CS6 + a proteína híbrida LCTBA. O componente LCTBA desta vacina é idêntica ao componente de LCTBA usado na vacina Protótipo recentemente testada no teste de fase I (estudo n°. OEV-120). O componente dm LT é idêntico ao lote usado no estudo de toxicologia animal e em um estudo de segurança/imunogenicidade de fase I clínica em andamento nos Estados Unidos.

E. coli inativada CFA/I, cepa ETEX 21

[00042] A E. coli cepa ETEX 21 foi desenvolvida usando um plasmídeo recombinante que expressa o operon CFA/I inteiro sob um promotor tac como descrito, com a diferença de que o marcador de seleção antibiótico (ampicilina) foi substituído com o gene que codifica a timidinilato sintetase (thyA)da V. cholerae(Tobias, J., Lebens, M., Bolin, L, Wiklund, G., Svennerholm, A.-M. 2008. Construction of non-toxic Escherichia coli and Vibrio cholerae strains expressing high and immunogenic levels of enterotoxigenic E. coli colonization factor I fimbriae. Vaccine 26: 2144- 2150). O hospedeiro bacteriano para este hospedeiro é uma E. coli CFA/I, 0:78, cepa K. A cepa foi originalmente isolada em 1985 a partir de um paciente em Dhaka, Bangladesh, que sofre de diarréia devido a uma infecção ETEC. Esta cepa foi usada como um componente da primeira geração de vacina contra ETEC e foi dada a pelo menos 2.000 voluntários. O(s) plasmídeo(s) que codifica(m) os genes nativos ST e CFA/I foram removidos pela seleção natural. Outra modificação foi feita pelo silenciamento do gene thyA no cromossoma pela inserção de um gene de resistência à canamicina no gene thyA. Além disso, em uma segunda rodada de deleção de cromossoma, o gene da canamicina foi deletado nos seus 200 primeiros nucleotídeos junto com 200 nucleotídeos do gene thyA tomando-o sensível à canamicina. A combinação do plasmídeo que expressa thyA e a cepa hospedeira deficiente em thyA possibilita a seleção isenta de antibiótico da cepa ETEX 21 recombinante.

Descrição detalhada do vetor de expressão para ETEX 21 da E. coli

[00043] O operon cfa foi amplificado pela reação da cadeia da polimerase (PCR) a partir da cepa ETEC do tipo selvagem No 325542. A amplificação foi realizada com um iniciador avançado 5'CGGTCTCGAATTCTGATGGAAGCTCAGGAGG3'(SEQ ID NO: 1) e um iniciador reverso 5CGGTCTCAAGCTTTCTAGAGTGTTTGACT ACTTG3 (SEQ ID NO: 2). O iniciador avançado foi homólogo à sequência de 22 pares de base a montante de cfaA e o iniciador reverso incorporado no códon de parada para cfaE. O fragmento resultante carregou os genes cfaABCE, todos os quais são necessários para a produção e montagem da fímbria CFA/I. O fragmento de PCR foi clonado em um vetor de expressão com base no plasmídeo pACYC177 com a origem pl5A de replicação. Depois da reposição adicional de marcadores de seleção antibióticos e da introdução de um gene thyAda V. cholerae o resultante foi eletroporado dentro da cepa hospedeira C600 AthyA da E. coli.

E. coli inativada CS3, cepa ETEX 22

[00044] A cepa ETEX 22 da E. coli foi desenvolvida usando um plasmídeo recombinante que expressa o operon CS3 inteiro sob um promotor rns que por sua vez está sob o operador lac. O sistema de seleção para este plasmídeo também está fundamentado no gene thyA da K cholerae. O hospedeiro bacteriano para esta construção é a mesma E. coli, CFA/I, 078, cepa K", como descrita para ETEX21. A combinação do plasmídeo que expressa thyA e a cepa hospedeira deficiente em thyA possibilitam a seleção isenta de antibiótico da cepa ETEX 22 recombinante.

Descrição detalhada do vetor de expressão para ETEX 22 da E. coli

[00045] O operon inteiro que codifica a fímbria CS3 foi clonado a partir da cepa SBL 107 da E. coli como um fragmento HindIII dentro do vetor de clonagem pBluescript II SK+. O operon foi depois subclonado dentro de um vetor de expressão feito de encomenda, pNC-4 construído em uma origem pl5A de replicação, que contém o gene lacl’, o gene thyAda Vibrio cholerae, o operador lac e a jusante deste o gene rns da E. coli. O gene ms ativa os genes CS1, CS2 e CS3. A expressão de rns é controlada pelo operon lac possibilitando assim a indução da expressão de CS3 pela adição de Isopropil- β-D-galactopiranosideo (IPTG).

E. coli inativada CS5, cepa ETEX 23

[00046] A cepa ETEX 23 da E. coli foi desenvolvida usando um plasmídeo recombinante que expressa o operon CS5 inteiro sob um promotor tac. O sistema de seleção para este plasmídeo também está fundamentado no gene thyAde V. cholerae. O hospedeiro bacteriano para esta construção é o mesmo E. coli, CFA/I, 078, cepa K’, como descrito para ETEX 21 e ETEX 22. A combinação do gene thyA que expressa plasmídeo e a cepa hospedeira deficiente em thyA possibilita a seleção isenta de antibiótico da cepa ETEX 23 recombinante

Descrição detalhada do vetor de expressão para ETEX 23 da E. coli

[00047] A PCR foi primeiro aplicada para amplificar um fragmento de DNA que carrega o operon inteiro de CS5, isto é csfA, csfB, csfC, csfE, csfF, e csfD, da cepa ETEC E17018/A do tipo selvagem (CS5+, CS6+, ST+). O DNA padrão foi preparado tomando-se uma colônia fresca de E17018/A de uma placa de CFA ágar e colocando em suspensão as células bacterianas em 100 pi de H2O. A suspensão foi fervida em um banho de água por 5 min e subsequentemente girado na velocidade total em uma centrífuga de bancada por 5 min. Uma alíquota de um pl do sobrenadante resultante foi usada como padrão de DNA na PCR. A amplificação foi realizada usando os iniciadores avançado (5’- CGGTCTCGAATTCTGCCAGAAAAGTTCATGCAG) (SEQ ID NO: 3) e reverso (5’- CGGTCTCAAGCTTCACCCTGACGGACAAAGATT) (SEQ ID NO: 4) (Eurofms MWG operon, Ebersberg, Alemanha), e o Sistema de PCR Expand High Fidelity (Roche Diagnostics GmbH). O iniciador avançado é homólogo à sequência de 314 pares de base a montante de CSfA e carrega sítios de restrição para EcoRI e Eco3H, ao passo que o iniciador reverso, que é homólogo à sequência de 490 pares de base a jusante de CSfD, carrega sítios de restrição para HindIII e Eco31I, na extremidade 5’. As condições de PCR foram como segue: 95 °C por 5 min, 31 ciclos de 94 °C por 15 s, 58 °C por 30 s e 68 °C por 5 min e 30 s, com uma extensão final de 7 min a 72 °C. A reação da PCR conteve 10 mM de cada dNTPs, 25 pmoles de cada iniciador, e cerca de 5 unidades da Enzima Expand High Fidelity. O fragmento de 7022 pares de base resultante carrega os genes csfABCDEF, todos dos quais são necessários para a produção e montagem de CS5.

[00048] Em segundo lugar, o plasmídeo pif(MT)-CFA/I-thyA-15Aori foi restringido com EcoRI e HindIII, resultando em um fragmento de 3838 pares de base que contém Laclq-thyA-15Aori.

[00049] Em terceiro lugar, ambos os fragmentos acima preparados foram depois ligados usando a T4 DNA ligase (New England Biolabs, In vitro Sweden AB, Stockholm, Suécia), resultando no plT-CS5-thyA-15Aori (10860 pares de base).

[00050] Em quarto lugar, o plasmídeo pJT-CS5-thyA-15Aori construído foi depois eletroporado na cepa C600 da E. coli dependente de timina (SBL/Crucell Vaccines). Um clone C600 recombinante que expressa CS5 foi selecionado com base na independência da timina.

E. coli inativada CS6, cepa ETEX 24

[00051] A cepa ETEX 24 da E. colifoi desenvolvida usando um plasmídeo recombinante que expressa o operon CS6 inteiro sob um promotor tac. O sistema de seleção para este plasmídeo também está fundamentado no gene thyAde V. cholerae. O hospedeiro bacteriano para esta construção é uma cepa C600 da E. coli Kl2, anteriormente usado como um placebo em numerosos testes clínicos Dukoral* e ETEC. Esta cepa foi modificada pelo silenciamento do gene thyA no cromossoma e inserindo um gene de resistência à canamicina na cepa thyA. Esta cepa foi usada como hospedeiro para a cepa SBL109, estudada em um teste clínico anterior como um componente da “Vacina contra ETEC Protótipo No 2” (estudo n2 OEV-120; EudraCT: 2009-015741-23). Em uma segunda rodada de deleção cromossômica o gene da canamicina foi deletado nos seus primeiros 200 nucleotídeos junto com 200 nucleotídeos do gene thyA tomando-o sensível à canamicina. A combinação do plasmídeo que expressa thyA e a cepa hospedeira deficiente em thyA possibilita a seleção isenta de antibiótico da cepa ETEX 24 recombinante.

Descrição detalhada do vetor de expressão para a ETEX 24 da E. coli

[00052] A PCR foi primeiro aplicada para amplificar os genes do operon de CS6 inteiro, isto é cssA, cssB, cssC, e cssD, da cepa GB35 de ETEC (CS6+, LT+). O DNA padrão foi preparado a partir de colônias recém cultivadas tiradas das placas de CFA como descrito acima. Alíquotas de um pl do sobrenadante resultante foram usadas como padrão de DNA na PCR. A amplificação foi realizada usando iniciadores avançado e reverso (Nicklasson et al, 2006; Eurofins MWG operon, Ebersberg, Alemanha), e o Expand High Fidelity PCR System (Roche Diagnostics GmbH). O iniciador avançado (5’- CGGTCTCGAATTCCA CTCACCAATAAAAGCRTCAATACG) (SEQ ID NO: 5), que está a montante do cssA carrega os sítios de restrição para Eco31I e EcoRI, ao passo que o iniciador reverso (5’- CGGTCTCAAGCTTAACATTGTTT ATTTACAACAGATAATTGTTTG) (SEQ ID NO: 6), que está a montante do cssD, carrega os sítios de restrição para Eco31I e HindIII, na extremidade 5’. As condições de PCR foram como segue: 95 °C por 5 min, 32 ciclos de 94 °C por 15 s, 58 °C por 30 s e 68 °C por 3,5 min, com uma extensão final de 7 min a 72 °C. A reação de PCR conteve 10 mM de cada dNTPs, 25 pmoles de cada iniciador, e cerca de 5 unidades da Enzima Expand High Fidelity. O fragmento amplificado foi depois digerido com Eco31I, que resulta em um fragmento flanqueado com os sítios EcoRI e HindII.

[00053] Em segundo lugar, o plasmídeo pJT-CS2-Cm anteriormente construído (que contém o marcador de cloranfenicol cat) foi restrito com EcoRI e HindIII. O fragmento que contém o plasmídeo inteiro no operon CS2, isto é pJT-Cm-ACS2 foi depois extraído em gel (usando o kit apropriado da Qiagene).

[00054] Em terceiro lugar, o fragmento de PCR e o fragmento extraído em gel das seções anteriores foram depois ligados usando T4 DNA ligase (New England Biolabs, In vitro Sweden AB, Stockholm, Suécia), e resultou em um plasmídeo de 8077 pares de base, pJT-CS6-Cm, que abriga o operon CS6 localizado a jusante do promotor tac induzido por IPTG.

[00055] Em quarto lugar, o plasmídeo pJT-CS6-Cm foi depois clivado com as enzimas de restrição Avril e Xhol, resultando em um fragmento 6992 pares de base que contém laclq, promotor tec, e o operon CS6, isto é pJT- CS6-ΔCm. Este fragmento foi depois extraído em gel (usando o kit apropriado da Qiagene).

[00056] Em quinto lugar, a preparação de ThyA: O plasmídeo pNC-4 WC foi usado em uma reação de PCR para amplificar o thyA. O iniciador avançado, (5’-CGGTCTCCCTAGGCCTCCTTACCTATGGT GATC) (SEQ ID NO: 7) é homólogo a uma sequência partindo de 98 pares de base a montante de thyA e carrega os sítios de restrição para Eco31I e Avrll, ao passo que o iniciador reverso (5’- CGGTCTCCTCGAGCGACTCTAGACCTAACCG) (SEQ ID NO: 8), que é homólogo a uma sequência terminando com 75 pares de base a jusante de thyA, e carrega os sítios de restrição para Eco31I e Xhol, na extremidade 5’. As condições de PCR foram como segue: 95 °C por 5 min, 31 ciclos de 94 °C por 15 s, 58 °C por 30 s e 72 °C por 50 s, com uma extensão final de 7 min a 72 °C. O fragmento de 1065 pares de base resultante que contém thyA, foi depois extraído do gel e clivado com Xhol e Avrll.

[00057] Em sexto lugar, o fragmento preparado de thyA e o fragmento pJT-CS6-ACm, ambos tendo os sítios flanqueadores para Xhol e AwII foram depois ligados, e resultou em um plasmídeo de 8057 pares de base, chamado de pri-CS6-thyA-15Aori.

[00058] Finalmente, o plasmídeo construído pJT-CS6-thyA-15Aori (8057 pares de base) foi depois eletroporado dentro da cepa C600 da E. coli dependente de timina. Um clone C600 recombinante que expressa CS6 foi depois selecionado com base na independência da timina.

Proteína LCTBA

[00059] LCTBA é uma proteína híbrida entre a subunidade B da enterotoxina E. coli instável ao calor (LTB) e a subunidade B da toxina do cólera (CTB). Sete aminoácidos na molécula de CTB foram substituídos pelos aminoácidos nas posições correspondentes da molécula de LTB (Lebens M, Shahabi V, Bãckstrõm M, et al. 1996. Synthesis of hybrid molecules between heat-labile enterotoxin and cholera toxin B subunits: potential for use in a broad spectrum vaccine. Infect Immun 64: 2144-2150). O DNA que codifica LCTBA foi clonado em um plasmídeo sob um promotor tac. O LCTBA usado neste estudo teve a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9. O plasmídeo tem o gene thyA da E. coli e é expressado em uma cepa da V. cholerae que é deletada no seu gene thyA,possibilitando a seleção isenta de antibiótico deste plasmídeo. A cepa do V. cholerae que hospeda o plasmídeo é um desenvolvimento adicional da cepa que contém o rCTB213 que codifica o plasmídeo JS1569. A mudança é a deleção do gene thyA, assim as características genéticas são ActxA, AthyA,Akan. A proteína LCTBA foi recentemente avaliada quanto à segurança e imunogenicidade em dosagens de 1 mg e 4 mg junto com bactérias SBL109 inativadas no estudo OEV-120. Este estudo revelou que a proteína de LCTBA foi segura e fortemente imunogênica em ambos os níveis de dosagem (ver abaixo).

Adjuvante da proteína dmlT (R192G/L21 IA)

[00060] Inicialmente, um toxóide LT mutante (“mlT,” LT(R192G)) foi construído pela substituição de arginina com glicina na posição 192 da subunidade A (Norton EB, Lawson LB, Freytag LC, Clements JD. Characterization of a mutant Escherichia coli heat-labile toxin, LT(R192G/L211 A), as a safe and effective oral adjuvant. Clin Vaccine Immunol. Abril de 2011; 18(4): 546-51). Esta modificação genética eliminou a capacidade da subunidade A para ser ativada pela clivagem da tripsina e enormemente reduziu a atividade enzimática e biológica da toxina. Atenuação adicional foi realizada pela adição de uma segunda substituição, leucina para alanina na posição 211. O toxóide mutante duplo não induziu nenhum acúmulo de fluido detectável quando dado aos camundongos pela via intragástrica, enquanto retém imunogenicidade e adjuvanticidade.

Estabilidade da Vacina de Teste

[00061] Preparações a granel monovalentes das cepas ETEX 21-24 da E. coli armazenadas a 4 °C e 20 °C são testadas em um estudo de estabilidade em andamento. As preparações a granel monovalentes até agora têm sido mostradas serem estáveis por pelo menos 3 meses, o estudo continuará por 48 meses.

[00062] A proteína híbrida LCTBA purificada a partir de uma cultura em fermentador de 500 litros, também é individualizada para um estudo de estabilidade em andamento. A preparação é armazenada a 4 °C e 25 °C durante um período de 48 meses. O mesmo material também é armazenado a - 65 °C com propósito de referência. Até agora, a proteína foi mostrada ser estável por pelo menos 24 meses, independente da temperatura de armazenagem.

[00063] O dm LT adjuvante é incluído em um estudo de estabilidade de 30 meses em andamento. Os frascos liofílizados são armazenados a -20 °C.

A proteína mostrou ser estável por pelo menos 24 meses.

[00064] Um estudo de estabilidade da vacina Tetravalente completa, armazenada a 4 °C e 20 °C está em andamento. As análises QC indicam que a vacina é estável por pelo menos 3 meses. O estudo continuará por 48 meses. Formulação Vacina ETEC Oral Tetravalente

[00065] A vacina foi produzida pela Unitech Biopharma, Matfors, Suécia

[00066] A ETEX21, ETEX22 e ETEX23 foram inativadas usando tratamento com formalina. Para a ETEX24 fenol foi usado para a inativação, visto que o tratamento com formalina destruiu o antígeno CS6.

[00067] Em resumo, um fermentador de 500 litros foi inoculado com uma cepa da E. coli que super expressa o antígeno CS6 (ETEX 24). Depois da indução da expressão pelo IPTG a fermentação foi continuada por 8 horas. As bactérias foram colhidas e lavadas em um ultrafiltro de 500 kD e finalmente dispensada a uma concentração de 20 x 109 bactérias/ml. Fenol foi adicionado a uma concentração final de 0,8 % (p/v) e a suspensão foi mantida a 20 °C por 40 horas sob agitação constante. A suspensão foi lavada em uma membrana de ultrafiltração de 500 kD em solução salina tamponada com fosfato e armazenada a 4 °C.

[00068] O ELISA de inibição para quantificar a quantidade de antígeno CS6 foi feito em material fresco antes da inativação e o material inativado lavado. Surpreendentemente, a inativação com fenol não apenas reteve a imunorreatividade CS6, mas de fato a aumentou substancialmente (dados não mostrados).

[00069] Durante o procedimento de inativação as amostras foram tiradas antes da inativação depois de 1,2, 18 e 40 horas de inativação para testar quanto a viabilidade. Em resumo, as amostras tiradas foram lavadas pela centrifugação e recolocadas em suspensão no volume original em PBS depois do que as diluições foram feitas em PBS e plaqueadas no Fator de Colonização Ágar (CFA ágar). As placas foram incubadas a 37 °C e contadas no dia seguinte.

dmlT adjuvante opcional (onde relevante) proteína liofilizada: 1 mg por frasco

[00070] Para o uso, a proteína foi reconstituída com 1 ml de água estéril. A solução foi diluída ainda para 10 pg ou 25 pg em 1 ml de solução salina. A proteína dmlT foi fabricada na Pilot Bioproduction Facility, Walter Reed Army Institute of Research in Forest Glen, MD. USA.

Pó de tampão de bicarbonato de sódio

[00071] O tampão deve ser usado para neutralizar a acidez gástrica na ingestão da vacina. O tampão também é usado como placebo no estudo. O pó secado é fornecido em sachês à prova de umidade (5,6 g/sachê). Pó tampão de Bicarbonato de Sódio: Hidrogeno carbonato de sódio 3.600 mg Acido cítrico, anidro 1.450 mg Carbonato de sódio 400 mg Sabor de framboesa 70 mg Sacarina sódica 30 mg

[00072] Para o uso, o tampão de carbonato é dissolvido em 150 ml de água potável.

[00073] O tampão de hidrogeno carbonato de sódio foi produzido pela Recip AB na Suécia.

Exemplo 2: Eficácia Pré-Clínica Imunogenicidade de vacina ETEC tetravalente realçada em camundongos e efeito adjuvante de dmlT

[00074] Estudos pré-clínicos extensivos em camundongos foram empreendidos para avaliar a imunogenicidade das versões diferentes da nova vacina ETEC oral, a vacina Protótipo monovalente e a vacina Tetravalente final, especialmente a capacidade para gerar anticorpos IgA no intestino depois da imunização oral/intragástrica e o efeito de coadministração do adjuvante dmlT sobre as respostas imunes.

[00075] Estas vacinas, dadas sozinhas ou juntas com dmlT em doses de até cerca de 1 x 109 bactérias e 25 pg de dmlT por rodada de imunização foram testadas em camundongos depois de duas ou três rodadas de imunizações orais quanto a possíveis reações adversas e quanto à sua capacidade para induzir respostas de anticorpo séricas e intestinais-mucósicas aos componentes de vacina diferentes.

[00076] Imunizações de camundongo e coleta de amostra. Grupos de camundongos Balb/C e C57 Bl/6 fêmeas (Charles River; 6 a 8 semanas de idade; 5 camundongos/grupo) foram usados para as imunizações orais (intragástricas). A todos os camundongos foram dadas duas doses dois dias separadamente em 0,3 ml de solução a 3 % de bicarbonato de sódio intragastricamente através de um cateter de alimentação de bebê (primeira rodada de imunização), seguidas duas semanas mais tarde por duas imunizações idênticas dois dias separadamente em uma segunda rodada de imunização. As sangrias foram realizadas antes da primeira imunização e duas emanas depois da última imunização, tempos nos quais as pelotas fecais (FPs) também foram coletadas e os extratos preparados como descrito anteriormente (Nygren E, Holmgren J, Attridge SR. Murine antibody responses following systemic or mucosal immunization with viable ou inactivated Vibrio cholerae. Vaccine 2008; 26: 6784-90). Além disso, no último ponto de tempo quando os camundongos foram sacrificados, eles foram perfúndidos com uma solução de heparina-PBS para remover o sangue dos tecidos, e o tecido do intestino delgado coletado e extraído com uma solução a 2 % (p/v) de solução de Saponina-PBS (o método Perfext) como descrito anteriormente Villavedra M, Carol H, Hjulstrom M, Holmgren J, Czerkinsky C. “PERFEXT’: a direct method for quantitative assessment of cytokine production in vivo at the local level. Res Immunol 1997; 148: 257-66).

[00077] ELISAs. Os títulos de anticorpo IgG+IgM e IgA foram determinados em soros, extratos fecais e intestinais, pelo ELISA, como descrito anteriormente (Rudin A, Svennerholm A-M. Colonization factor antigens (CFAs) of enterotoxigenic Escherichia coli can prime and boost immune responses against heterologous CFAs. Microb Pathog 1994; 16: 131- 9). CS6, para o uso como antígeno de revestimento (na concentração final de 0,7 pg/ml) nos ELISAs relevantes, foi purificado a partir da cepa que super expressa TOP1O-CS6 descrita anteriormente (Tobias J, Lebens M, Kãllgârd S, Nicklasson M, Svennerholm A-M. Vaccine 2008; 26: 5373-80)., pela precipitação sequencial com sulfato de amónio e filtração em gel. Os soros de camundongos individuais foram testados usando placas microtituladoras de baixa ligação (Greiner), e as amostras foram inicialmente diluídas 1/100 seguido pelas diluições de três vezes em série. Os extratos de pelota fecal e extratos de tecido do intestino delgado foram testados em placas microtituladoras de alta ligação (Greiner) em diluições em série de 3 vezes a partir de uma diluição de partida de 1/3. Os títulos de anticorpo foram calculados como as recíprocas das diluições de amostra que deram uma absorbância de A450 de 0,4 acima do valor de fundo. Nas amostras de extrato fecal e intestinal, a IgA total também foi medida pelo ELISA como descrito (Nygren E, Holmgren J, Attridge SR. Vaccine 2008; 26: 6784-90), e os valores de anticorpo IgA específicos de antígeno foram expressados como unidades de título de IgA por pg de IgA total.

Sumário dos resultados

[00078] Os resultados no sumário mostraram que: 1) as vacinas, tanto quando dadas sozinhas quanto quando combinadas com dmlT, foram bem toleradas; 2) as vacinas também induziram respostas de anticorpo séricas assim como intestinais fortes para cada um dos antígenos incluídos nas vacinas, que excedem as respostas obtidas com as preparações de vacina que correspondem à vacina ETEC oral de primeira geração anterior; e 3) a coadministração de dmlT aumentou (adjuvantou) especialmente as respostas de anticorpo intestinais e menos pronunciado também a sérica a cada um dos antígenos nas vacinas. Estas descobertas são ilustradas pelos resultados mostrados nas Figuras 2 a 4.

[00079] Na figura 2, um experimento exemplificante é mostrado onde grupos de camundongos Balb/c (5 animais por grupo) foram imunizados em duas rodadas com a vacina Protótipo monovalente em doses diferentes sozinha ou junto com 15 microgramas de toxina do cólera (CT) ou 25 microgramas de dmlT por rodada, e respostas de IgA anti-CFA/I nos extratos fecais examinados 10 dias depois da última imunização. As doses de vacina dadas por rodada (divididas na metade nos dois dias consecutivos) correspondeu a 1 x 109 bactérias mortas com formalina + 5 microgramas de LCTBA (“V”), um quinto (“V:5”) ou um vinte e cinco avos (“V:25”) desta dose; já um outro grupo foi imunizado com a dose mais alta da preparação de vacina de célula inteira em qualquer LCTBA adicionado junto com dmlT (“V a granel+dmlT”). Os resultados mostram que a vacina em uma maneira dependente da dose por si só induziu uma resposta anti-CFA/I de IgA intestinal-fecal, que foi significantemente aumentada/adjuvantada ainda pela coadministração de vacina com dmlT, e também que o efeito adjuvante de dmlT foi o mais pronunciado para as doses de vacina mais baixas, foi totalmente comparável com aquele de CT, e não dependeu da presença de LCTBA na vacina.

[00080] As Figuras 3 e 4 mostram resultados de um outro experimento exemplificante em que a vacina ETEC Tetravalente, sozinha ou junta com dmlT, foi administrada em três rodadas intragastricamente aos camundongos Balb/c e C57/BI, e respostas de anticorpo intestinais (Figura 3) foram medidas 10 a 12 dias depois da última imunização e os anticorpos séricos 10 dias depois da conclusão da segunda rodada de imunização (Figura 4). A dose de vacina usada por rodada correspondei a 1 x 109 bactérias inativadas (isto é 2,5 x 10 bactérias de cada cepa) e 10 microgramas de LCTBA, e a dose de dmlT por rodada foi de 25 microgramas. Um grupo de camundongos não imunizados serviu como controles. Os resultados mostram que a vacina mesmo sem nenhum adjuvante em comparação com os controles deu origem a 2 a 50 vezes as respostas de IgA fecal ou do intestino delgado a cada um dos antígenos componentes de vacina, e também que estas respostas foram ainda mais significantemente aumentadas quando a vacina foi administrada junto com o adjuvante dmlT (Figura 3). Similarmente, a imunização apenas com a vacina induziu respostas de anticorpo sérico significantes a cada um dos antígenos testados, tanto de IgA quanto ainda mais pronunciado de isótipos de IgG+IgM; estas respostas na maioria dos casos foram realçadas ainda pelo componente dmlT embora o aumento nem sempre fosse estatisticamente significante (Figura 4). Os resultados mostram as respostas em camundongos Balb/c exceto para as respostas anti-CS6 que são de camundongos C57/BI; a razão para isto é que tanto estes quanto outros experimentos similares têm mostrado que a resposta a CS6 é mais forte em camundongos C57/BI (ref Tobias et al 2011) enquanto que a resposta aos outros componentes é similar ou marginalmente mais alta em camundongos Balb/c.

[00081] Neutralização de toxina LT com soro contra LCTBA e CTB

[00082] A proteína híbrida LCTBA é esperada gerar anticorpos com uma capacidade de neutralização de toxina LT mais alta quando comparada com CTB. A neutralização da toxina foi estudada usando toxina LT purificada em ensaio de célula IL-adrenal. Em resumo, coelhos foram imunizados s.c. nos dias 0, 13, e 28 com 30 pg de LCTBA ou CTB. Os soros foram coletados duas semanas após a última imunização. A neutralização da toxina foi medida pela incubação de uma concentração fixa de toxina LT tratada com tripsina (1 ng/ml) com diluições em série de soro. A toxina remanescente, não neutralizada pelo soro foi medida usando o ensaio de célula IL-adrenal. Os soros de coelhos imunizados com a proteína híbrida LCTBA mostraram uma capacidade neutralizante de toxina mais forte quando comparados com os soros de coelhos imunizados com CTB (Tabela X).

[00083] Tabela X. Neutralização da toxina LT da E. coli com soro de coelho contra a proteína híbrida LCTBA e CTB, respectivamente, como medido usando o ensaio de célula adrenal.

Exemplo 3: Toxicologia

[00084] Segurança e imunogenicidade pré-clínica de dmlT em ratos

[00085] No suporte de um estudo dmlT de Fase-I, um estudo de toxicologia concordante de GLP intitulado “Estudo de Toxicologia de GLP em Dose Oral Repetida em Ratos Sprague-Dawley de dmlT” foi conduzido pela Spring Valley Laboratories Inc., Woodbine, Mariland, USA. Em resumo, grupos de ratos (numerados de 1 a 4) recebeu uma ou duas doses pela gavagem gástrica de: 0,9 % de Solução salina (controle, gr 1), 50 pg (gr 2), 100 pg (gr 3), ou 200 pg de dmlT (gr4). Não houve nenhuma mudança adversa relacionada com o artigo de teste na mortalidade, pesos corporais, pesos de órgão, razões em peso de órgão para peso corporal ou observações clínicas. A observação histopatológica também não detectou nenhum efeito relacionado com o tratamento definitivo em nenhum dos grupos. A globulina (grupos 2, 3 e 4 fêmeas) e proteína total (grupo 3 e 4 fêmeas) aumentadas e albumina/globulina diminuídas (grupos 2, 3 e 4 fêmeas) em 8 horas sugeriu um leve aumento nas alfa globulinas da fase aguda. Entretanto no Dia 17, descobertas similares não foram observadas indicando a natureza transitória da mudança. Nenhuma outra mudança relacionada com o tratamento nos parâmetros de patologia clínica foram evidentes.

[00086] A resposta imune também foi avaliada nestes animais pela determinação dos níveis de IgG anti-LTB pelo ELISA em quatro semanas depois da dosagem do Dia 0. Todos os animais que receberam dm LT (em qualquer nível de dose) montaram respostas IgG séricas significantes para LTB; enquanto que todos os animais que receberam o controle de solução salina foram negativos.

Toxicologia da vacina Tetravalente ± adjuvante de dmlT em camundongos

[00087] Um estudo de toxicidade de dose repetida da vacina Tetravalente com e sem dm LT foi conduzida pela Visionar AB, Uppsala, Suécia (Visionar Preclinical Study Report VP 10-34-01). O camundongo foi escolhido como animal experimental visto que a maioria da pesquisa pré- clínica mais no princípio da vacina foi realizada em camundongos. No total, 90 camundongos machos e 90 camundongos fêmeas (cepa C57BL/6J), foram usados no estudo. Aos animais foram dadas administrações orais ajustadas ao peso em duas ocasiões com a vacina tetravalente ± 5 pg ou 25 pg de dmlT/dose em uma dose baixa e uma alta que correspondem a 5 e 25 vezes a dose clínica/kg de peso corporal. Nos estudos de GLP pré-clínicos iniciais, a vacina de protótipo monovalente de ETEC em uma alta dose (100x a dose clínica/kg de peso corporal) foi descoberta ser segura e foi portanto incluída neste estudo como um comparador. Os animais foram divididos em seis grupos e tratados com solução salina tamponada com fosfato (PBS), doses ajustadas com o peso de Artigos de Controle e Teste como descrito na Tabela 6. As preparações foram administradas em volumes de 250 pl pela gavagem oral em duas ocasiões diferentes com uma semana entre elas. Uma semana depois da última administração os animais foram sacrificados e as amostras foram tiradas para a química do sangue, histopatologia e sorologia. Artigo de Controle: Vacina Protótipo Monovalente E. coli SBL109: 600 pg de CFA/I em aprox. 30 x 109 bactérias inativadas Proteína híbrida LCTBA: 1 mg Solução salina tamponada com fosfato: q.s. ad 6,0 ml Artigo de Teste: Vacina Tetravalente E. coli ETEX21 859 pg CFA/I em aprox. 20 x 109 bactérias inativadas E. coli ETEX22 3,851 pg CS3 em aprox. 20 x 109 bactérias inativadas E. coli ETEX23 1,100 pg CS5 em aprox. 20 x 109 bactérias inativadas E. coli ETEX24 120 pg CS6 em aprox. 20 x 109 bactérias inativadas Proteína híbrida LCTBA: 1 mg Solução salina tamponada com fosfato: q.s. ad 8,0 ml Tabela 6. Descrição de grupos de estudo. As vacinas foram dadas como doses aj ustadas com o peso

[00088] Embora umas poucas diferenças estatisticamente significantes fossem encontradas entre grupos de camundongos machos com respeito a WBC, RBC, HCT, HGB, e PLT, as diferenças foram pequenas e provavelmente de nenhuma significância biológica. Nenhuma diferença biológica foi observada entre grupos tratados com vacina de fêmeas. Entre os grupos de machos, os animais tratados com vacina completa a 25x a dose clínica mostraram concentrações mais altas de albumina e potássio do que os animais tratados com Comparador. Os animais tratados com vacina tetravalente na dose clínica de 5x + dmlT mostrou concentração sérica de ALAT mais alta do que os animais tratados com PBS. Visto que não houve nenhum efeito compatível com os parâmetros químicos clínicos analisados entre machos e fêmeas e as diferenças entre os grupos foram pequenos pode- se concluir que, apesar de estatisticamente significante, as diferenças observadas provavelmente não tem nenhuma significância biológica. As respostas imunes para CFA/I e LCTBA foram de acordo com os estudos mais no princípio.

[00089] Em conclusão, em comparação aos animais tratados com PBS, as vacinas em altas doses afetaram a situação de saúde geral dos animais apenas levemente. Entretanto, nenhuma das observações patológicas, de química clínica ou hematológicas maiores foram encontradas. A vacina de Protótipo monovalente em 100x a dose clínica e a vacina Tetravalente em uma dose de 25x a dose clínica + dmlT causaram efeitos similares na situação de saúde geral.

Exemplo 4: Administração de vacina aos seres humanos

[00090] A vacina deve ser administrada apenas pela via oral.

[00091] Quatro grupos com 30 voluntários suecos adultos em cada um serão administrados com vacina Tetravalente, vacina Tetravalente + 10 pg de dmlT, vacina Tetravalente + 25 pg de dmlT ou placebo. • Indivíduos escolhidos aleatoriamente para o grupo apenas de vacina: O conteúdo de um frasco de vacina é misturado com 150 ml de solução tampão de bicarbonato reconstituída antes da administração. • Indivíduos escolhidos aleatoriamente para receber vacina adjuvantada: O conteúdo de um frasco de vacina e um frasco de adjuvante (10 pg ou 25 pg) são misturados com 150 ml de solução tampão de bicarbonato reconstituída antes da administração. • Receptores de placebo: Apenas 150 ml de solução tampão de bicarbonato reconstituída.

[00092] Para manter o caráter cego do estudo, os itens de teste (vacina ± adjuvante) e placebo serão preparados por uma enfermeira em caráter não cego que não tem nenhum contato com os participantes do estudo. Uma enfermeira em caráter cego depois administrará a dose.

Claims

1. Vacina oral para a imunização contra a diarréia induzida pela ETEC, caracterizada pelo fato de que compreende células de Escherichia coli (E. coli) inativadas que expressam: antígenos do fator de colonização ETEC compreendendo: E. coli inativada que expressa fator de colonização A/I (CFA/I) em uma quantidade de 415 a 1245pg; E. coli inativada que expressa antígeno de superfície Coli 3 (CS3) em uma quantidade de 1485 a 4455pg; E. coli inativada que expressa antígeno de superfície Coli 5 (CS5) em uma quantidade de 255 a 765pg; E. coli inativada que expressa antígeno de superfície Coli 6 (CS6) em uma quantidade de 60 a 180pg; uma proteína híbrida compreendendo uma subunidade-B da enterotoxina lábil ao calor de E. coli (LTB) e uma subunidade-B da toxina da cólera (CTB) (proteína LCTBA); e proteína lábil ao calor mutante dupla (dmlT), em que a vacina compreende menos do que 1013 células por dose unitária e a dita vacina é formulada para administração oral.

2. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende por dose unitária 1 a 200 pg de dmlT.

3. Vacina de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende por dose unitária de 5 a 50 pg de dmlT.

4. Vacina de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende por dose unitária de 8 a 30 pg de dmlT.

5. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende menos do que 1012 células bacterianas por dose unitária.

6. Vacina de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que compreende menos do que 2 x 1011 células bacterianas por dose unitária.

7. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: a) a E. coli inativada que expressa CFA/I é de uma cepa que compreende um plasmídeo recombinante que expressa o operon CFA/I inteiro sob um promotor tac e tendo um marcador de seleção não antibiótico; b) a E. coli inativada que expressa CS3 é de uma cepa que compreende um plasmídeo recombinante que expressa o operon de CS3 inteiro sob um promotor rns que por sua vez está sob o operador lac e tendo um marcador de seleção não antibiótico; c) a E. coli inativada que expressa CS5 é de uma cepa que compreende um plasmídeo recombinante que expressa o operon CS5 inteiro sob um promotor tac e tendo um marcador de seleção não antibiótico; e d) a E. coli inativada que expressa CS6 é de uma cepa que compreende um plasmídeo recombinante que expressa o operon CS6 inteiro sob um promotor tac e tendo um marcador de seleção não antibiótico.

8. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende por dose unitária proteína LCTBA em uma quantidade de 500 a 1500pg.

9. Vacina de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende por dose unitária: a) E. coli inativada que expressa CFA/I em uma quantidade de 747 a 913 pg de CFA/I; b) E. coli inativada que expressa CS3 em uma quantidade de 2673 a 3267 pg de CS3; c) E. coli inativada que expressa CS5 em uma quantidade de 459 a 561 pg de CS5; d) E. coli inativada que expressa CS6 em uma quantidade de 8 a 132 pig de CS6; e e) proteína de LCTBA em uma quantidade de 900 a 1100 pg.

10. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a vacina compreende células de E. coli que expressam CS6 que foram inativadas com um método que envolve o uso de fenol.

11. Vacina de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a inativação foi realizada usando fenol em uma concentração de 0,6 a 2,0 por cento em peso em uma solução aquosa.

12. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que é para o uso em um procedimento que compreende a administração oral da vacina a um indivíduo a ser imunizado em pelo menos duas ocasiões distintas separadas no tempo por pelo menos 3 dias.

13. Vacina de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que as ocasiões são separadas no tempo por 3 a 60 dias, preferivelmente de 5 a 21 dias, o mais preferivelmente de 7 a 10 dias.