JP3094165B2 - 抗凝固剤濃度測定方法 - Google Patents
抗凝固剤濃度測定方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/81—Protease inhibitors
- G01N2333/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- G—PHYSICS
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/974—Thrombin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
- G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- G01N2400/38—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence, e.g. gluco- or galactomannans, Konjac gum, Locust bean gum or Guar gum
- G01N2400/40—Glycosaminoglycans, i.e. GAG or mucopolysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate, hyaluronic acid, heparin, heparan sulfate, and related sulfated polysaccharides
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明の分野 本発明は、サンプル中の抗凝固剤濃度を測定する方法
に関する。
に関する。
本発明の背景 臨床において、抗凝固剤は、患者を血栓症，すなわち
血管中の血塊の生成または存在から保護するために使用
される。最も頻繁に使用される抗凝固剤アセチルサリチ
ル酸（アスピリン），クマリン誘導体およびヘパリンが
ある。
血管中の血塊の生成または存在から保護するために使用
される。最も頻繁に使用される抗凝固剤アセチルサリチ
ル酸（アスピリン），クマリン誘導体およびヘパリンが
ある。
トロンビンはフィブリノーゲンからフィブリンの形成
を触媒し、このためトロンビン濃度は血液もしくは血漿
の凝固に責任がある。しかしながら、ヘパリンの抗トロ
ンビンIIIへの結合により、それはトロンビンのタンパ
ク分解活性に対する非常に強力な阻害剤となる。それ
故、ヘパリンは血栓症の危険がある患者へしばしば投与
される。ヘパリン濃度の精密な調節が極めて重要であ
る。もしヘパリンの投与量が低すぎれば、血栓症または
塞栓の危険が存在し、他方投与量が多すぎれば出血を招
来し得る。この理由のため、患者血漿中の抗凝固性物質
濃度はある抗凝固性物質の投与を決定する。
を触媒し、このためトロンビン濃度は血液もしくは血漿
の凝固に責任がある。しかしながら、ヘパリンの抗トロ
ンビンIIIへの結合により、それはトロンビンのタンパ
ク分解活性に対する非常に強力な阻害剤となる。それ
故、ヘパリンは血栓症の危険がある患者へしばしば投与
される。ヘパリン濃度の精密な調節が極めて重要であ
る。もしヘパリンの投与量が低すぎれば、血栓症または
塞栓の危険が存在し、他方投与量が多すぎれば出血を招
来し得る。この理由のため、患者血漿中の抗凝固性物質
濃度はある抗凝固性物質の投与を決定する。
血漿中の抗凝固性物質の濃度を測定するための多数の
方法が開発されている。一方法は血液または血漿の凝固
活性を測定することを含む。特に、活性化された部分的
トロンボプラスチン時間およびトロンビン時間が測定さ
れる。しかしながらこれら方法は凝固因子の活性に依存
し、そしてフィブリン分解産物の存在によって付加的に
影響される。フィブリン分解産物は二つの理由で抗凝固
作用を有する。第１に、フラグメントＥは抗トロンビン
作用を有し、このためトロンビン時間を延長せしめる。
第２に、フィブリノーゲンのいくつかのフラグメントは
重合することができ、そのためフィブリン凝塊形成を遅
延または防止することができる。加えて、活性化された
部分的トロンボプラスチン時間測定は、ヘパリンと組合
せて投与されるグリセロールトリナイトレートによって
影響される。Pizzuli et al.,Hemmung der Heparin
wirkung durch Glyceroltrinitrat,Dtsch.Med.Wschr.
113,1837（1988）さらに、これらの方法は、、特にヘパ
リンの低もしくは高濃度の状況において非常に精密でな
いことが観察されている。Thromb.Res.８,413（197
6）． 血漿サンプル中のヘパリン濃度を測定するための他の
方法は、トロンビンおよびX a因子よりなる群から選ば
れたタンパク分解酵素を加え、該酵素に対する色素原物
質を加え、そして色素原物質から放出された色素を測定
することを含む。トロンビンおよび因子X aはヘパリン
の存在下抗トロンビンIIIによって一層急速に不活性化
されるから、これら酵素の残存色素原活性は存在するヘ
パリン量の関数である。Bartl et al.,米国特許No.4,
234,682および4,409,327;J.Clin.Chem.Clin.Biochem.1
5,239（1977）．しかしながらこれら方法は、ヘパリン
の低濃度に対する感度を同様に欠いている。Pieters e
t al.,The Limited Importance of Factor X a
Inhibition to the Anticoagulant Property of
Heparin in Thromboplastin−Activated Plasma,Blo
od 72,2048（1988）.Buchanan et al.,The Relativ
e Importance of Thrombin Inhibition and Fact
or X a Inhibition to the Antithrombotic Effe
cts of Heparin,Blood 86,198（1985）． なお他の方法は、過剰の因子X aを血漿と共にインキ
ュベートすることによってヘパリンの活性を測定するこ
とを含む。規定のインキュベーション時間後、リン脂
質、カルシウムイオンおよび種々の血漿タンパクが加え
られ、凝固時間が測定される。Yin E.,Method and C
ompositions for Heparin Assays,EPA0,217,768.し
かしながら技術文献において、抗因子X a活性の測定が
ヘパリンの臨床的力価に実際に相関するかどうかについ
て争いがある。Hember H.C.,Thrombosis and Haemos
tasis:Eds.Verstraete M.et al.,Leuven University
Press 1987,pp.17−36. 標準的ヘパリン、それに低分子量ヘパリン、グリコサ
ミノグリカン、硫酸デルマタン、および抗凝固活性を有
する他の阻害剤の比較的小濃度をモニターするために
は、活性な抗凝固物質のごく微量でさえも確実性をもっ
て検出できる方法が必要である。本発明の課題は、先行
技術方法を上廻る、感度および特異性に関する利点を提
供する、これら化合物のための試験システムを開発する
ことであった。
方法が開発されている。一方法は血液または血漿の凝固
活性を測定することを含む。特に、活性化された部分的
トロンボプラスチン時間およびトロンビン時間が測定さ
れる。しかしながらこれら方法は凝固因子の活性に依存
し、そしてフィブリン分解産物の存在によって付加的に
影響される。フィブリン分解産物は二つの理由で抗凝固
作用を有する。第１に、フラグメントＥは抗トロンビン
作用を有し、このためトロンビン時間を延長せしめる。
第２に、フィブリノーゲンのいくつかのフラグメントは
重合することができ、そのためフィブリン凝塊形成を遅
延または防止することができる。加えて、活性化された
部分的トロンボプラスチン時間測定は、ヘパリンと組合
せて投与されるグリセロールトリナイトレートによって
影響される。Pizzuli et al.,Hemmung der Heparin
wirkung durch Glyceroltrinitrat,Dtsch.Med.Wschr.
113,1837（1988）さらに、これらの方法は、、特にヘパ
リンの低もしくは高濃度の状況において非常に精密でな
いことが観察されている。Thromb.Res.８,413（197
6）． 血漿サンプル中のヘパリン濃度を測定するための他の
方法は、トロンビンおよびX a因子よりなる群から選ば
れたタンパク分解酵素を加え、該酵素に対する色素原物
質を加え、そして色素原物質から放出された色素を測定
することを含む。トロンビンおよび因子X aはヘパリン
の存在下抗トロンビンIIIによって一層急速に不活性化
されるから、これら酵素の残存色素原活性は存在するヘ
パリン量の関数である。Bartl et al.,米国特許No.4,
234,682および4,409,327;J.Clin.Chem.Clin.Biochem.1
5,239（1977）．しかしながらこれら方法は、ヘパリン
の低濃度に対する感度を同様に欠いている。Pieters e
t al.,The Limited Importance of Factor X a
Inhibition to the Anticoagulant Property of
Heparin in Thromboplastin−Activated Plasma,Blo
od 72,2048（1988）.Buchanan et al.,The Relativ
e Importance of Thrombin Inhibition and Fact
or X a Inhibition to the Antithrombotic Effe
cts of Heparin,Blood 86,198（1985）． なお他の方法は、過剰の因子X aを血漿と共にインキ
ュベートすることによってヘパリンの活性を測定するこ
とを含む。規定のインキュベーション時間後、リン脂
質、カルシウムイオンおよび種々の血漿タンパクが加え
られ、凝固時間が測定される。Yin E.,Method and C
ompositions for Heparin Assays,EPA0,217,768.し
かしながら技術文献において、抗因子X a活性の測定が
ヘパリンの臨床的力価に実際に相関するかどうかについ
て争いがある。Hember H.C.,Thrombosis and Haemos
tasis:Eds.Verstraete M.et al.,Leuven University
Press 1987,pp.17−36. 標準的ヘパリン、それに低分子量ヘパリン、グリコサ
ミノグリカン、硫酸デルマタン、および抗凝固活性を有
する他の阻害剤の比較的小濃度をモニターするために
は、活性な抗凝固物質のごく微量でさえも確実性をもっ
て検出できる方法が必要である。本発明の課題は、先行
技術方法を上廻る、感度および特異性に関する利点を提
供する、これら化合物のための試験システムを開発する
ことであった。
本発明の概要 本発明によれば、上で論じた目的は、過剰量の（すな
わち患者サンプル中の濃度より上の）内因性システムの
精製した凝固因子と、凝固因子を安定化するのに充分な
量のカルシウムイオンと、反応を触媒するのに充分な量
のリン脂質と、そして弱いトロンビン阻害剤、例えば抗
トロンビンIIIの組合せを使用することによって達成さ
れる。これら反応剤は希釈した血漿サンプルと共にイン
キュベートされる。次に因子IX aおよびCaCl2を含む、
凝固カスケード賦活剤が混合物へ添加される。カスケー
ド賦活剤の作用より、痕跡量のトロンビンがゆっくり生
成される。助因子Ｖおよび因子VIIIは非活性形で存在す
るので、トロンビン生成は最初非常に遅く、そして非効
果的プロセスである。しかしながら、もし血漿サンプル
が抗凝固物質を含んでいるならば、その時反応混合物中
の弱いトロンビン阻害剤、すなわち抗トロンビンIII
は、活性抗凝固性物質によって強化され、それと共にト
ロンビン依存性反応が抑制される。これは一定時間内に
より少ないトロンビンが生成する結果へ導く。トロンビ
ン生成阻害とサンプル中の抗凝固活性物質の間の比例関
係は、サンプル中の抗凝固活性物質濃度の測定を許容す
る。ヒルジンまたは合成阻害剤のような多数の抗凝固剤
も、上に述べた試薬混合物中の抗トロンビンIIIをパス
することによってトロンビンを直接阻害する。それ故も
しこれら物質がアッセイされるならば、抗トロンビンII
Iを省略することができる。
わち患者サンプル中の濃度より上の）内因性システムの
精製した凝固因子と、凝固因子を安定化するのに充分な
量のカルシウムイオンと、反応を触媒するのに充分な量
のリン脂質と、そして弱いトロンビン阻害剤、例えば抗
トロンビンIIIの組合せを使用することによって達成さ
れる。これら反応剤は希釈した血漿サンプルと共にイン
キュベートされる。次に因子IX aおよびCaCl2を含む、
凝固カスケード賦活剤が混合物へ添加される。カスケー
ド賦活剤の作用より、痕跡量のトロンビンがゆっくり生
成される。助因子Ｖおよび因子VIIIは非活性形で存在す
るので、トロンビン生成は最初非常に遅く、そして非効
果的プロセスである。しかしながら、もし血漿サンプル
が抗凝固物質を含んでいるならば、その時反応混合物中
の弱いトロンビン阻害剤、すなわち抗トロンビンIII
は、活性抗凝固性物質によって強化され、それと共にト
ロンビン依存性反応が抑制される。これは一定時間内に
より少ないトロンビンが生成する結果へ導く。トロンビ
ン生成阻害とサンプル中の抗凝固活性物質の間の比例関
係は、サンプル中の抗凝固活性物質濃度の測定を許容す
る。ヒルジンまたは合成阻害剤のような多数の抗凝固剤
も、上に述べた試薬混合物中の抗トロンビンIIIをパス
することによってトロンビンを直接阻害する。それ故も
しこれら物質がアッセイされるならば、抗トロンビンII
Iを省略することができる。
本発明は、サンプルを希釈するのに充分な量の緩衝液
を加えること、前記サンプル中にトロンビンを生成させ
るのに充分な量の凝固因子試薬を前記サンプルと合併す
ること、トロンビンを検出する緩衝化試薬の充分な量を
加えること、そして前記サンプル中のトロンビン濃度を
ある抗凝固剤の既知濃度と相関させることにより前記サ
ンプル中の前記抗凝固剤の濃度を決定することを含む、
サンプル中のある抗凝固剤の濃度を前記サンプル中のト
ロンビン生成阻害の関数として決定する方法に関する。
を加えること、前記サンプル中にトロンビンを生成させ
るのに充分な量の凝固因子試薬を前記サンプルと合併す
ること、トロンビンを検出する緩衝化試薬の充分な量を
加えること、そして前記サンプル中のトロンビン濃度を
ある抗凝固剤の既知濃度と相関させることにより前記サ
ンプル中の前記抗凝固剤の濃度を決定することを含む、
サンプル中のある抗凝固剤の濃度を前記サンプル中のト
ロンビン生成阻害の関数として決定する方法に関する。
前記方法中の前記凝固因子試薬は、サンプル中に存在
する凝固因子濃度より大きい凝固因子の与えられた量
と、前記因子を安定化するの充分な量のカルシウムイオ
ンと、反応を触媒するのに充分な量のリン脂質と、サン
プル中の血小板因子４を中和するのに充分な量の硫酸デ
キストランと、そして前記サンプル中のトロンビン生成
を抑制するのに充分な量の弱いトロンビン阻害剤とより
なる。前記方法において、抗凝固剤は、ヘパリン、α−
NAPAPおよび硫酸デルマタンよりなる群から選ばれる。
加えて前記方法において、弱いトロンビン阻害剤は、抗
トロンビンIII,ヘパリン助因子II、および抗凝固剤によ
って増強される、トロンビンの合成生理学的阻害剤より
なる群から選ばれる。
する凝固因子濃度より大きい凝固因子の与えられた量
と、前記因子を安定化するの充分な量のカルシウムイオ
ンと、反応を触媒するのに充分な量のリン脂質と、サン
プル中の血小板因子４を中和するのに充分な量の硫酸デ
キストランと、そして前記サンプル中のトロンビン生成
を抑制するのに充分な量の弱いトロンビン阻害剤とより
なる。前記方法において、抗凝固剤は、ヘパリン、α−
NAPAPおよび硫酸デルマタンよりなる群から選ばれる。
加えて前記方法において、弱いトロンビン阻害剤は、抗
トロンビンIII,ヘパリン助因子II、および抗凝固剤によ
って増強される、トロンビンの合成生理学的阻害剤より
なる群から選ばれる。
加えて、本発明は、前記凝固因子試薬が、サンプル中
に存在する凝固因子濃度より大きい与えられた量の凝固
因子と、前記因子を安定化するのに充分な量のカルシウ
ムイオンと、反応を触媒するのに充分な量のリン脂質
と、サンプル中の血小板因子４を中和するのに充分な量
の硫酸デキストランよりなる方法に関する。上記方法に
おいて、抗凝固剤はヒルジンと、トロンビン生理学的阻
害剤とよりなる群から選ばれる。
に存在する凝固因子濃度より大きい与えられた量の凝固
因子と、前記因子を安定化するのに充分な量のカルシウ
ムイオンと、反応を触媒するのに充分な量のリン脂質
と、サンプル中の血小板因子４を中和するのに充分な量
の硫酸デキストランよりなる方法に関する。上記方法に
おいて、抗凝固剤はヒルジンと、トロンビン生理学的阻
害剤とよりなる群から選ばれる。
なお加えて、本発明は、前記方法を実施するためのテ
ストキットに関する。
ストキットに関する。
図面の簡単な説明 第１図は、ヘパリン標準曲線を示す。
第２図は、低分子量ヘパリンのための標準曲線を示
す。
す。
第３図は、ヒルジン標準曲線を示す。
第４図は、固定吸光度アッセイのためのヘパリン標準
曲線を示す。
曲線を示す。
第５図は、凝固アッセイのためのヘパリン標準曲線を
示す。
示す。
第６図は、全血中の凝固アッセイのためのヘパリン標
準曲線を示す。
準曲線を示す。
第７図は、α−NAPAT標準曲線を示す。
第８図は、硫酸デルマタンのための標準曲線を示す。
本発明の詳細な説明 このアッセイは以下の原理に基づく。サンプル中に存
在する凝固因子濃度より大きい与えられた量の凝固因子
と、前記因子を安定するのに充分な量のカルシウムイオ
ンと、反応を触媒するのに充分な量のリン脂質と、サン
プル中の血小板因子４を中和するのに充分な量の硫酸デ
キストランと、そして前記サンプル中のトロンビン生成
を抑制するのに充分な量の弱いトロンビン阻害剤とで混
合物がつくられる。ヒルジンや合成トロンビン阻害剤の
ような抗凝固性物質については、凝固因子試薬中の弱い
阻害剤は省略できることに注意すべきである。この凝固
因子試薬混合物へ、混合物中の弱いトロンビン阻害剤を
増強するトロンビン阻害剤または抗凝固性化合物が添加
される。次に、それ以上のトロンビン生成を防止するた
めのカルシウムキレート剤の存在下、活性化された凝固
因子およびカルシウムイオンが添加され、当初は遅いト
ロンビン生成を招来する凝固カスケードを開始させる。
トロンビンの最初の痕跡量が因子ＶおよびVIIIを活性化
する。活性化された因子ＶおよびVIIIは活性化反応の巨
大な加速を生ぜしめ、そのためトロンビン生成速度は急
速に増加し、そして凝血すなわちフィブリノーゲンのフ
ィブリンへの転化が発生する。フィブリノーゲンを転化
するため、トロンビンの高濃度が必要であり、そしてこ
の反応は因子ＶおよびVIIIを活性化できるトロンビンの
最初の少痕跡量によっては開始されない。活性化された
因子ＶおよびVIIIは高濃度においてトロンビンの急速な
生成を誘発し、フィブリン／凝塊形成を招来し得る。
在する凝固因子濃度より大きい与えられた量の凝固因子
と、前記因子を安定するのに充分な量のカルシウムイオ
ンと、反応を触媒するのに充分な量のリン脂質と、サン
プル中の血小板因子４を中和するのに充分な量の硫酸デ
キストランと、そして前記サンプル中のトロンビン生成
を抑制するのに充分な量の弱いトロンビン阻害剤とで混
合物がつくられる。ヒルジンや合成トロンビン阻害剤の
ような抗凝固性物質については、凝固因子試薬中の弱い
阻害剤は省略できることに注意すべきである。この凝固
因子試薬混合物へ、混合物中の弱いトロンビン阻害剤を
増強するトロンビン阻害剤または抗凝固性化合物が添加
される。次に、それ以上のトロンビン生成を防止するた
めのカルシウムキレート剤の存在下、活性化された凝固
因子およびカルシウムイオンが添加され、当初は遅いト
ロンビン生成を招来する凝固カスケードを開始させる。
トロンビンの最初の痕跡量が因子ＶおよびVIIIを活性化
する。活性化された因子ＶおよびVIIIは活性化反応の巨
大な加速を生ぜしめ、そのためトロンビン生成速度は急
速に増加し、そして凝血すなわちフィブリノーゲンのフ
ィブリンへの転化が発生する。フィブリノーゲンを転化
するため、トロンビンの高濃度が必要であり、そしてこ
の反応は因子ＶおよびVIIIを活性化できるトロンビンの
最初の少痕跡量によっては開始されない。活性化された
因子ＶおよびVIIIは高濃度においてトロンビンの急速な
生成を誘発し、フィブリン／凝塊形成を招来し得る。
これらのトロンビンの最初の痕跡量は混合物中の弱い
トロンビン阻害剤によって僅かに阻害されるだけである
が、サンプル中の急速に作用するトロンビン阻害剤によ
り、または混合物中の弱いトロンビン阻害剤を増強する
ことによってもっと大きく阻害される。当初の遅いトロ
ンビン生成の阻害は、因子ＶおよびVIII活性化の遅延ま
たは阻止を発生させ、そのため多量のトロンビン生成は
延期されるかまたは防止される。
トロンビン阻害剤によって僅かに阻害されるだけである
が、サンプル中の急速に作用するトロンビン阻害剤によ
り、または混合物中の弱いトロンビン阻害剤を増強する
ことによってもっと大きく阻害される。当初の遅いトロ
ンビン生成の阻害は、因子ＶおよびVIII活性化の遅延ま
たは阻止を発生させ、そのため多量のトロンビン生成は
延期されるかまたは防止される。
反応混合物中に抗トロンビンIIIが存在する時、それ
は弱いトロンビン阻害剤であるため、トロンビン生成に
は小さい効果しか認められない。しかしながら混合物へ
抗トロンビンIIIが添加される時、系はヘパリン類に対
して感受性になるであろう。けだしこれら化合物はトロ
ンビン阻害剤として抗トロンビンIIIの力価に影響する
からである。ヘパリンが多く存在すればする程、抗トロ
ンビンIIIはより強力にトロンビンを阻害し、そのため
そのような場合、トロンビンの大量生成は遅延されるか
または防止される。
は弱いトロンビン阻害剤であるため、トロンビン生成に
は小さい効果しか認められない。しかしながら混合物へ
抗トロンビンIIIが添加される時、系はヘパリン類に対
して感受性になるであろう。けだしこれら化合物はトロ
ンビン阻害剤として抗トロンビンIIIの力価に影響する
からである。ヘパリンが多く存在すればする程、抗トロ
ンビンIIIはより強力にトロンビンを阻害し、そのため
そのような場合、トロンビンの大量生成は遅延されるか
または防止される。
やはり弱いトロンビン阻害剤であるヘパリン助因子II
が混合物中に存在する時、系は硫酸デルマタンに対し感
受性になるであろう。けだし、この化合物はヘパリン助
因子をトロンビンに対するより良い阻害剤にするからで
ある。
が混合物中に存在する時、系は硫酸デルマタンに対し感
受性になるであろう。けだし、この化合物はヘパリン助
因子をトロンビンに対するより良い阻害剤にするからで
ある。
過剰量の凝固因子、および標準化された量の抗トロン
ビンIII,リン脂質およびカルシウムイオンの使用と、同
時にサンプルの高希釈により、ヘパリンまたはヘパリン
様抗凝固剤に対する高い特異性および感度が達成され
る。凝固因子の高過剰はKMより数倍上の濃度を意味す
る。KMはいわゆるミハエリス定数（濃度であり）、そこ
では酵素反応速度はその最高に可能速度の50％である。
もしそのような過剰濃度が使用されるならば、反応速度
はその最高に近く、そして凝固因子濃度に存在しない。
患者の血漿サンプルの凝固因子および阻害剤を使用する
前に述べた方法とは対照的に、この方法はすべての必要
とする凝固因子を高度に過剰にしてコンスタントな濃度
で使用することを提案する。この理由のため、この測定
系においては個々の凝固因子の活性の事故的な動遙およ
びサンプル中のフィブリン分解産物および同様な因子の
存在は、もはや何の役割も果たさない。
ビンIII,リン脂質およびカルシウムイオンの使用と、同
時にサンプルの高希釈により、ヘパリンまたはヘパリン
様抗凝固剤に対する高い特異性および感度が達成され
る。凝固因子の高過剰はKMより数倍上の濃度を意味す
る。KMはいわゆるミハエリス定数（濃度であり）、そこ
では酵素反応速度はその最高に可能速度の50％である。
もしそのような過剰濃度が使用されるならば、反応速度
はその最高に近く、そして凝固因子濃度に存在しない。
患者の血漿サンプルの凝固因子および阻害剤を使用する
前に述べた方法とは対照的に、この方法はすべての必要
とする凝固因子を高度に過剰にしてコンスタントな濃度
で使用することを提案する。この理由のため、この測定
系においては個々の凝固因子の活性の事故的な動遙およ
びサンプル中のフィブリン分解産物および同様な因子の
存在は、もはや何の役割も果たさない。
凝固因子は文献に記載されている既知方法に従ってウ
シ血液から単離される。（因子X:Biochemistry 11,488
2（1972）；因子VIII:Biochemistry 19,401（1980）；
プロトロンビン:J.Biol.Chem.249,594（1974）；因子V:
J.Biol.Chem.254,508（1979）；因子IX:Biochemistry
12,4938（1973）；抗トロンビンIII:Br.J.Haematol.233
（1975））因子IX aは因子IXの活性化によって調製され
た。（Biochemistry 13,4508（1974））ウシ血液のみ
ならず、他の種の血液、特にヒト血液も凝固因子源とし
て適当であり、また組換え凝固因子も適当であることに
注目すべきである。凝固因子については広いそして好ま
しい範囲は以下の通りである。因子X,広い範囲10〜1000
nm,好ましい範囲30ないし300nm;因子VIII,広い範囲0.35
ないし2.5nm,好ましい範囲0.7ないし1.4nm;因子V,広い
範囲0.5〜20nm,好ましい範囲１〜2.5nm;プロトロンビン
（抗トロンビンIII），広い範囲,20〜1000nm,好ましい
範囲60〜400nm。ヘパリン助因子IIはそれぞれ以下の範
囲において使用し得る。ヘパリン助因子II,広い範囲20
〜350nm,好ましい範囲,140nm。
シ血液から単離される。（因子X:Biochemistry 11,488
2（1972）；因子VIII:Biochemistry 19,401（1980）；
プロトロンビン:J.Biol.Chem.249,594（1974）；因子V:
J.Biol.Chem.254,508（1979）；因子IX:Biochemistry
12,4938（1973）；抗トロンビンIII:Br.J.Haematol.233
（1975））因子IX aは因子IXの活性化によって調製され
た。（Biochemistry 13,4508（1974））ウシ血液のみ
ならず、他の種の血液、特にヒト血液も凝固因子源とし
て適当であり、また組換え凝固因子も適当であることに
注目すべきである。凝固因子については広いそして好ま
しい範囲は以下の通りである。因子X,広い範囲10〜1000
nm,好ましい範囲30ないし300nm;因子VIII,広い範囲0.35
ないし2.5nm,好ましい範囲0.7ないし1.4nm;因子V,広い
範囲0.5〜20nm,好ましい範囲１〜2.5nm;プロトロンビン
（抗トロンビンIII），広い範囲,20〜1000nm,好ましい
範囲60〜400nm。ヘパリン助因子IIはそれぞれ以下の範
囲において使用し得る。ヘパリン助因子II,広い範囲20
〜350nm,好ましい範囲,140nm。
加えて、凝固因子試薬は凝固因子を安定化させるのに
充分な量のCaCl2を含む。CaCl2の広い範囲50〜100μM,
好ましい範囲100μＭが見出された。
充分な量のCaCl2を含む。CaCl2の広い範囲50〜100μM,
好ましい範囲100μＭが見出された。
リン脂質ミセルの生成のため、フォスファチジルセリ
ン、フォスファチジルコリンおよびコレステロールがク
ロロホルム溶液中種々の混合比で使用された。個のリン
脂質の所望の重量比で混合され、そして溶媒は窒素気流
によって蒸発された。脂質の濃度は２ないし６μM,好ま
しくは９μＭである。超音波により、リン脂質の安定な
懸濁液が確立され、そしてこれはリン脂質小粒源として
使用された。超音波処理時間は２時間であった。上述の
リン脂質間のモル比として、フォスファチジルセリン23
％，フォスファチジルコリン69％およびコレステロール
８％が使用された。リン脂質については、反応を触媒す
るのに有用な広い範囲は９〜250μＭであるが、好まし
い範囲は20〜50μＭである。
ン、フォスファチジルコリンおよびコレステロールがク
ロロホルム溶液中種々の混合比で使用された。個のリン
脂質の所望の重量比で混合され、そして溶媒は窒素気流
によって蒸発された。脂質の濃度は２ないし６μM,好ま
しくは９μＭである。超音波により、リン脂質の安定な
懸濁液が確立され、そしてこれはリン脂質小粒源として
使用された。超音波処理時間は２時間であった。上述の
リン脂質間のモル比として、フォスファチジルセリン23
％，フォスファチジルコリン69％およびコレステロール
８％が使用された。リン脂質については、反応を触媒す
るのに有用な広い範囲は９〜250μＭであるが、好まし
い範囲は20〜50μＭである。
加えて、アルブミンのような不活性のタンパクが、凝
固因子が反応容器へ付着するのを防止するために凝固因
子試薬へ添加される。不活性タンパク２〜20mg/mlの広
い範囲、しかし好ましくは10〜20mg/mlが使用されるこ
とが判明した。アルブミンは溶液中にタンパクの全量に
とどめるために必要である。凝固因子試薬中因子Ｖおよ
びVIIIの濃度は非常に低い。担体タンパクが添加されな
ければ、因子ＶおよびVIIIは容器壁へ付着し、そのため
活性が小さくなるであろう。担体タンパクとして役立つ
ため、任意の不活性タンパクが適当であり、その例は血
清アルブミンおよび卵アルブミンである。
固因子が反応容器へ付着するのを防止するために凝固因
子試薬へ添加される。不活性タンパク２〜20mg/mlの広
い範囲、しかし好ましくは10〜20mg/mlが使用されるこ
とが判明した。アルブミンは溶液中にタンパクの全量に
とどめるために必要である。凝固因子試薬中因子Ｖおよ
びVIIIの濃度は非常に低い。担体タンパクが添加されな
ければ、因子ＶおよびVIIIは容器壁へ付着し、そのため
活性が小さくなるであろう。担体タンパクとして役立つ
ため、任意の不活性タンパクが適当であり、その例は血
清アルブミンおよび卵アルブミンである。
加えて、サンプル中の血小板因子４の影響を阻害する
ため、凝固因子試薬へ硫酸デキストランが添加される。
硫酸デキストランの有用な広い範囲は0.33〜1.9μg/ml
であるが、好ましい量は約0.4〜1mg/mlであることが判
明した。硫酸デキストランは、血小板からそれらが活性
化される時に放出される血小板因子４を中和するために
必要である。血小板因子４はヘパリンを中和し、そして
血小板が活性化された場合、存在するヘパリンの一部ま
たは全量が中和されるであろう。硫酸デキストランは、
血小板因子４のこのヘパリン中和効果を防止する。硫酸
デキストランは1.6μg/ml以下では凝固反応を妨害しな
い。血小板因子４によるヘパリン中和を防止する任意の
他の化合物も使用することができる。
ため、凝固因子試薬へ硫酸デキストランが添加される。
硫酸デキストランの有用な広い範囲は0.33〜1.9μg/ml
であるが、好ましい量は約0.4〜1mg/mlであることが判
明した。硫酸デキストランは、血小板からそれらが活性
化される時に放出される血小板因子４を中和するために
必要である。血小板因子４はヘパリンを中和し、そして
血小板が活性化された場合、存在するヘパリンの一部ま
たは全量が中和されるであろう。硫酸デキストランは、
血小板因子４のこのヘパリン中和効果を防止する。硫酸
デキストランは1.6μg/ml以下では凝固反応を妨害しな
い。血小板因子４によるヘパリン中和を防止する任意の
他の化合物も使用することができる。
賦活剤試薬は凝固カスケードを開始せしめ、遅いトロ
ンビン生成を招来する。好ましい賦活剤は因子IX a,CaC
l2および不活性タンパクである。因子IX aは0.025〜40n
Mの範囲で添加することができるが、しかし約１−5nMが
好ましい。凝固カスケードは因子XI aまたは因子XII a
の添加によって引金することができることに留意すべき
である。この場合には、凝固因子試薬は、約50nMの濃度
範囲で因子IXまたは因子XI複合体を含まなければならな
い。有用であると判明したCaCl2の広い範囲は５〜10mM
であるが、約８〜33mMの間が好ましい。試薬中の不活性
タンパクの広い範囲は0.4ないし20mg/mlであるが、0.1
〜1mg/mlの間が好ましい。
ンビン生成を招来する。好ましい賦活剤は因子IX a,CaC
l2および不活性タンパクである。因子IX aは0.025〜40n
Mの範囲で添加することができるが、しかし約１−5nMが
好ましい。凝固カスケードは因子XI aまたは因子XII a
の添加によって引金することができることに留意すべき
である。この場合には、凝固因子試薬は、約50nMの濃度
範囲で因子IXまたは因子XI複合体を含まなければならな
い。有用であると判明したCaCl2の広い範囲は５〜10mM
であるが、約８〜33mMの間が好ましい。試薬中の不活性
タンパクの広い範囲は0.4ないし20mg/mlであるが、0.1
〜1mg/mlの間が好ましい。
検出試薬は色素原性、発色原性、螢光原性または電磁
性化合物を含んでいる。もし検出試薬が色素原性であれ
ば、基質試薬はS2238（カビ）である。この基質試薬の
量は0.5ないし1mmの範囲であるが、0.5mmが好ましい。
基質試薬はそれ以上のトロンビン発生を防止するため、
EDTAのようなカルシウムキレート剤を含んでいる。カル
シウムキレート剤の広い範囲はCaCl2の過剰であるが、
好ましくは10mM以上である。基質試薬は、凝固因子が反
応容器へ付着するのを防止するのに充分な量の不活性タ
ンパクを含んでいる。この試薬中の不活性タンパクは広
くは0.4ないし20mg/mlの範囲であるが、約0.5〜5mg/ml
が好ましい。
性化合物を含んでいる。もし検出試薬が色素原性であれ
ば、基質試薬はS2238（カビ）である。この基質試薬の
量は0.5ないし1mmの範囲であるが、0.5mmが好ましい。
基質試薬はそれ以上のトロンビン発生を防止するため、
EDTAのようなカルシウムキレート剤を含んでいる。カル
シウムキレート剤の広い範囲はCaCl2の過剰であるが、
好ましくは10mM以上である。基質試薬は、凝固因子が反
応容器へ付着するのを防止するのに充分な量の不活性タ
ンパクを含んでいる。この試薬中の不活性タンパクは広
くは0.4ないし20mg/mlの範囲であるが、約0.5〜5mg/ml
が好ましい。
抗凝固剤の色素原性基質測定のための典型的試薬が以
下のように調製された。（すべての溶液は175mM NaCl,
50mMトリス−HCl,pH7.9中に調製された。） 凝固因子試薬： 因子X30nM,因子VIII0.7M,因子V1.4nM,プロトロンビン
70nM,抗トロンビンIII70nM,リン脂質９μm,CaCl20.1mM,
アルブミン20mg/ml,硫酸デキストラン0.4μg/ml 賦活剤試薬： 因子IX a1.6nM,CaCl215mM,アルブミン0.5mg/ml 基質試薬： アルブミン0.5mg/ml,EDTA36mM,基質S2238（Kabi Vit
rum Co.）0.875mM トロンビンに対する他の原素色物質も使用できること
に留意すべきである。必要な濃度は物質の動力学的定数
に依存する。
下のように調製された。（すべての溶液は175mM NaCl,
50mMトリス−HCl,pH7.9中に調製された。） 凝固因子試薬： 因子X30nM,因子VIII0.7M,因子V1.4nM,プロトロンビン
70nM,抗トロンビンIII70nM,リン脂質９μm,CaCl20.1mM,
アルブミン20mg/ml,硫酸デキストラン0.4μg/ml 賦活剤試薬： 因子IX a1.6nM,CaCl215mM,アルブミン0.5mg/ml 基質試薬： アルブミン0.5mg/ml,EDTA36mM,基質S2238（Kabi Vit
rum Co.）0.875mM トロンビンに対する他の原素色物質も使用できること
に留意すべきである。必要な濃度は物質の動力学的定数
に依存する。
このプロセスは凝固テストのように実施することがで
きるが、しかしながらフィブリノーゲンが添加される。
フィブリノーゲンはヒトまたはウシでよく、そして４〜
10mg/mlの範囲、しかし好ましくは約5mg/mlで添加され
る。この変法は全血に本発明方法を適用する時に特に有
利である。さらに、トロンビン生成速度をエンドポイン
トとして使用することができる。
きるが、しかしながらフィブリノーゲンが添加される。
フィブリノーゲンはヒトまたはウシでよく、そして４〜
10mg/mlの範囲、しかし好ましくは約5mg/mlで添加され
る。この変法は全血に本発明方法を適用する時に特に有
利である。さらに、トロンビン生成速度をエンドポイン
トとして使用することができる。
同じプロセスは、ヒルジンまたは合成プロテアーゼ阻
害剤のような、トロンビンに対する、またはトロンビン
生成を招来するプロセスに向けた他の抗凝固活性物質を
測定するためにも使用できる。
害剤のような、トロンビンに対する、またはトロンビン
生成を招来するプロセスに向けた他の抗凝固活性物質を
測定するためにも使用できる。
実施例１−色素原物質法による未分画ヘパリンの測定 上に記載した凝固因子試薬混合物200μと、あらか
じめ生理食塩水100部中１部に希釈した血漿100μとを
混合した。上に記載した賦活剤試薬200μの添加によ
って反応を開始させ、混合物を37℃で５分間インキュベ
ートした。次に上に記載した検出試薬200μの溶液を
加えた。生成したトロンビンを分光光度計で405nmにお
いて測定した。その前にヘパリン（Liquemin,ホフマン
−ラロシュ，バーゼル）の既知量を血漿を加え、第１図
の投与量依存曲線を得た。
じめ生理食塩水100部中１部に希釈した血漿100μとを
混合した。上に記載した賦活剤試薬200μの添加によ
って反応を開始させ、混合物を37℃で５分間インキュベ
ートした。次に上に記載した検出試薬200μの溶液を
加えた。生成したトロンビンを分光光度計で405nmにお
いて測定した。その前にヘパリン（Liquemin,ホフマン
−ラロシュ，バーゼル）の既知量を血漿を加え、第１図
の投与量依存曲線を得た。
トロンビンの量の測定である加水分解速度は、希釈し
ない血漿サンプル中ヘパリン1U/mlが存在するとき50％
阻害された。このテストの有効性を検証するため、ヘパ
リン投与を受けている患者の血漿を２方法でテストし
た。第１に、それは古典的なAPTTテストによって測定さ
れ、凝固時間55.1秒が得られた。この散はヘパリン0.91
U/mlに相当する。第２に、患者の血漿を100倍希釈し、
色素原アッセイで測定した。0.662A/分の加水分解速度
が得られ、これはヘパリン0.89U/mlに相当した。第１図
を見よ。
ない血漿サンプル中ヘパリン1U/mlが存在するとき50％
阻害された。このテストの有効性を検証するため、ヘパ
リン投与を受けている患者の血漿を２方法でテストし
た。第１に、それは古典的なAPTTテストによって測定さ
れ、凝固時間55.1秒が得られた。この散はヘパリン0.91
U/mlに相当する。第２に、患者の血漿を100倍希釈し、
色素原アッセイで測定した。0.662A/分の加水分解速度
が得られ、これはヘパリン0.89U/mlに相当した。第１図
を見よ。
実施例２−低分子量ヘパリンの測定 血漿中の低分子量ヘパリン（Fragmin,Kabi,ミュンヘ
ン）の量を測定するため、実施例１に示した色素原基質
法を使用した。食塩水で100倍に希釈した血漿を、Fragm
in,（Kabi）の指示量と混合した。これらサンプルは実
施例１に記載したのと同じ方法でテストされた。
ン）の量を測定するため、実施例１に示した色素原基質
法を使用した。食塩水で100倍に希釈した血漿を、Fragm
in,（Kabi）の指示量と混合した。これらサンプルは実
施例１に記載したのと同じ方法でテストされた。
血漿サンプルmlあたり低分子量ヘパリン６抗F X a単
位（U/ml）存在する時、トロンビン生成は50％阻害され
たことが判明した。第２図を見よ。
位（U/ml）存在する時、トロンビン生成は50％阻害され
たことが判明した。第２図を見よ。
実施例３−ヒルジンの測定 ヒルジンの測定のため、ヒルジン（シグマ、バイオケ
ミカルズ、セントルイス）の増加量を持った血漿サンプ
ルが調製された。血漿サンプルは生理食塩水で100倍希
釈され、実施例１記載のようにテストされた。
ミカルズ、セントルイス）の増加量を持った血漿サンプ
ルが調製された。血漿サンプルは生理食塩水で100倍希
釈され、実施例１記載のようにテストされた。
血漿中ヒルジン50U/mlが存在する時、トロンビン生成
は50％阻害される。第３図を見よ。
は50％阻害される。第３図を見よ。
実施例４−固定吸光度技術によるヘパリンの測定 測定を簡単化するため（ピペッティング工程を省
略）、色素原物質（Chromozym TH,ベーリンガーマンハ
イム）を70μＭの濃度に修飾凝固因子試薬へ加えた。こ
の試薬400μを既知量のヘパリンを含む10倍希釈血漿
サンプル100μと混合した。修飾した賦活試薬200μ
の添加によって反応を開始させた。
略）、色素原物質（Chromozym TH,ベーリンガーマンハ
イム）を70μＭの濃度に修飾凝固因子試薬へ加えた。こ
の試薬400μを既知量のヘパリンを含む10倍希釈血漿
サンプル100μと混合した。修飾した賦活試薬200μ
の添加によって反応を開始させた。
凝固因子試薬： 因子X50nM,因子VIII1.25μM,プロトロンビン125nM,因
子V2.5nM,抗トロンビンIII125nM,リン脂質15μM,CaCl
20.1mM,アルブミン20mg/ml,Chromozym TH（ベーリンガ
ーマンハイム）70μＭ 賦活剤試薬： 因子IX a2.5nM,CaCl215mM,アルブミン0.5mg/ml 色素原基質からのパラニトロアニリンの遊離を分光光
度計で追跡し、吸光増加0.1（吸光単位）に達する時間
を決定した。
子V2.5nM,抗トロンビンIII125nM,リン脂質15μM,CaCl
20.1mM,アルブミン20mg/ml,Chromozym TH（ベーリンガ
ーマンハイム）70μＭ 賦活剤試薬： 因子IX a2.5nM,CaCl215mM,アルブミン0.5mg/ml 色素原基質からのパラニトロアニリンの遊離を分光光
度計で追跡し、吸光増加0.1（吸光単位）に達する時間
を決定した。
第４図は、吸光増加0.1へ達する時間は血漿中に存在
するヘパリンの量に依存することを示している。
するヘパリンの量に依存することを示している。
実施例５−凝固アッセイによるヘパリンの測定 実施例１に記載した凝固因子および凝固カスケード
は、凝固テストを使用するヘパリンの測定にも同様に使
用することができる。この実施例においては、5mg/ml濃
度のフィブリノーゲン（カビ）溶液が使用される。増加
量のヘパリンを含有する血漿サンプルが調製され、生理
食塩水で10倍希釈された。サンプル100μを凝固因子
試薬100μと混合した。反応は賦活試薬100μの添加
により開始され、37℃における５分間インキュベーショ
ン後、フィブリノーゲン100μが溶液へ添加され、凝
固時間が測定された。血漿サンプル中にヘパリンが多く
存在すればするほど凝固時間が増加することを示す投与
量応答曲線が得られる。第５図を見よ。
は、凝固テストを使用するヘパリンの測定にも同様に使
用することができる。この実施例においては、5mg/ml濃
度のフィブリノーゲン（カビ）溶液が使用される。増加
量のヘパリンを含有する血漿サンプルが調製され、生理
食塩水で10倍希釈された。サンプル100μを凝固因子
試薬100μと混合した。反応は賦活試薬100μの添加
により開始され、37℃における５分間インキュベーショ
ン後、フィブリノーゲン100μが溶液へ添加され、凝
固時間が測定された。血漿サンプル中にヘパリンが多く
存在すればするほど凝固時間が増加することを示す投与
量応答曲線が得られる。第５図を見よ。
実施例６−全血中のヘパリンの測定 次第に増加する量のヘパリン（Liquemin,ホフマンラ
ロシュ）を含んだクエン酸添加全血のサンプルが調製さ
れた。これらサンプルは生理食塩水中10倍希釈され、実
施例５に記載と同じにテストされた。凝固時間の測定は
Kollerによるマニュアルフック技術（Hiaekeltechnik）
によって実施された。ここでも投与量応答曲線が見られ
た。第６図を見よ。
ロシュ）を含んだクエン酸添加全血のサンプルが調製さ
れた。これらサンプルは生理食塩水中10倍希釈され、実
施例５に記載と同じにテストされた。凝固時間の測定は
Kollerによるマニュアルフック技術（Hiaekeltechnik）
によって実施された。ここでも投与量応答曲線が見られ
た。第６図を見よ。
実施例７−α−NAPAPの測定 α−NAPAP（Ｎ−（α−ナフタレンスルホニルグリシ
ル）−４−アミジノ−DL−フェニルアラミンピペリジ
ン、シグマバイオケミカルズ、セントルイス）の測定の
ため、増加量のα−NAPANを含む血漿サンプルが調製さ
れ、実施例１と同じ方法でテストが実施された。以下の
応答曲線が得られた。第７図を見よ。
ル）−４−アミジノ−DL−フェニルアラミンピペリジ
ン、シグマバイオケミカルズ、セントルイス）の測定の
ため、増加量のα−NAPANを含む血漿サンプルが調製さ
れ、実施例１と同じ方法でテストが実施された。以下の
応答曲線が得られた。第７図を見よ。
実施例８−硫酸デルマタンの測定 硫酸デルマタン（シグマバイオケミカルズ、セントル
イス）の測定のため、実施例１に記載した凝固因子試薬
を修飾した。抗トロンビンIIIはヘパリン助因子II（140
nM）（ダイアグノスチカ、スタゴ、フランス）で置きか
えた。硫酸デルマタンの増加量を有する血漿サンプルが
調製され、実施例１と同じ方法でテストが実施された。
ここでも投与量応答曲線が得られた。第８図を見よ。
イス）の測定のため、実施例１に記載した凝固因子試薬
を修飾した。抗トロンビンIIIはヘパリン助因子II（140
nM）（ダイアグノスチカ、スタゴ、フランス）で置きか
えた。硫酸デルマタンの増加量を有する血漿サンプルが
調製され、実施例１と同じ方法でテストが実施された。
ここでも投与量応答曲線が得られた。第８図を見よ。
本明細書および実施例は例証であり、本発明の限定で
はないこと、および本発明の精神および範囲内の他の具
体例はそれ自体当業者に示唆されることを理解すべきで
ある。
はないこと、および本発明の精神および範囲内の他の具
体例はそれ自体当業者に示唆されることを理解すべきで
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 コルデ，ハンスユルゲン ドイツ連邦共和国デー8012、オットブル ン、ガーデンシュトラーセ４ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/56 G01N 33/53
Claims (12)
- 【請求項１】サンプル中の抗凝固剤の濃度を前記サンプ
ル中のトロンビン生成阻害の関数として測定する方法で
あって、 a.前記サンプルを希釈するのに充分な量の緩衝液を添加
すること、 b.前記サンプルを、前記サンプル中にトロンビンを生成
させるのに充分な量の凝固因子試薬を混合すること、 c.凝固カスケードを開始させるのに充分な量の賦活剤試
薬を添加すること、 d.トロンビンを検出するための充分な量の緩衝化された
検出試薬を添加すること、 e.前記サンプル中のトロンビンの濃度を測定すること、 f.前記サンプル中のトロンビン濃度を抗凝固剤の既知量
と相関させ、前記サンプル中の抗凝固剤の濃度を決定す
ること、 よりなる前記方法。 - 【請求項２】前記凝固因子試薬は、サンプル中に存在す
る前記凝固因子の濃度より大きい与えられた量の凝固因
子と、前記因子を安定化するのに充分な量のカルシウム
イオンと、反応を触媒するのに充分な量のリン脂質と、
前記サンプル中の血小板因子４を中和するのに充分な量
の硫酸デキストランと、前記サンプル中のトロンビン生
成を抑制するのに充分な量の弱いトロンビン阻害剤とよ
りなる請求項１の方法。 - 【請求項３】前記抗凝固剤は、ヘパリン、α−NAPAPお
よび硫酸デルマタンよりなる群から選ばれる請求項２の
方法。 - 【請求項４】前記弱いトロンビン阻害剤は、抗トロンビ
ンIII,ヘパリン助因子II、または抗凝固剤によって増強
される合成もしくは生理トロンビン阻害剤からなる群か
ら選ばれる請求項３の方法。 - 【請求項５】前記凝固因子試薬は、サンプル中に存在す
る前記凝固因子の濃度より大きい与えられた量の凝固因
子と、前記因子を安定化するのに充分な量のカルシウム
イオンと、反応を触媒するのに充分な量のリン脂質と、
前記サンプル中の血小板因子４を中和するのに充分な量
の硫酸デキストランとよりなる請求項１の方法。 - 【請求項６】前記抗凝固剤は、ヒルジンおよび合成もし
くは生理的トロンビン阻害剤よりなる群から選ばれる請
求項５の方法。 - 【請求項７】前記凝固因子は、因子X,因子VIII,因子V,
因子II,因子IXまたは因子IX−因子XI複合体よりなる群
から選ばれる請求項１の方法。 - 【請求項８】前記賦活剤試薬は、凝固カスケードを活性
化するのに充分な量の因子IX a,CaCl2および不活性タン
パクを含んでいる請求項１の方法。 - 【請求項９】前記緩衝化検出試薬は、色素原性、発光原
性、螢光原性または電磁性である請求項１の方法。 - 【請求項１０】前記緩衝検出試薬はフィブリノーゲンで
ある請求項１の方法。 - 【請求項１１】a.前記凝固因子試薬を含んでいる第１の
容器と、 b.前記賦活剤試薬を含んでいる第２の容器と、 c.前記緩衝化検出試薬を含んでいる第３の容器 からなる請求項１の方法を実施するためのキット。 - 【請求項１２】a.前記凝固因子試薬および緩衝化検出試
薬を含んでいる第１の容器と、 b.賦活剤試薬を含んでいる第２の容器 からなる請求項１の方法を実施するためのキット。
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