CN110514851A - 血小板抑制率的检测方法和检测试剂盒 - Google Patents

血小板抑制率的检测方法和检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种血小板抑制率的检测方法，包括以下步骤：提供枸橼酸抗凝全血样本；取枸橼酸抗凝全血样本，与高岭土激活剂和凝血触发剂混合后形成第一混合物，经血栓弹力图仪检测获得最大凝血块强度；另取枸橼酸抗凝全血样本，与激活剂F和凝血酶抑制剂混合后形成第二混合物，经血栓弹力图仪检测获得纤维蛋白原诱导凝血块强度；另取所述枸橼酸抗凝全血样本，与第一激活剂、激活剂F和凝血酶抑制剂混合后形成第三混合物，经血栓弹力图仪检测获得第一激活剂激活的凝血块强度；所述第一激活剂包括二磷酸腺苷或花生四烯酸；计算出血小板抑制率。该检测方法仅需枸橼酸抗凝全血样本，步骤简单，避免全血样本浪费。本发明还提供了一种检测试剂盒。

Description

血小板抑制率的检测方法和检测试剂盒
技术领域
本发明涉及医疗检测领域，具体涉及一种血小板抑制率的检测方法和检测试剂盒。
背景技术
为了减少血栓、中风和心肌梗塞等病例的发生，可长期口服抗血小板及他汀类等抗栓药物预防血栓。例如阿司匹林作为一种血栓素A2抑制剂，是最为常见和经济的抗血小板药物；或二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)受体阻滞剂噻氯匹定(抵克力得)和氯吡格雷(波立维)等。服用这些药物后，通过检测血小板受抑制的程度，可以辅助判断抗血小板药物疗效。
传统的血栓弹力图法测定不同诱导剂诱导下的血小板抑制率往往需要同步检测枸橼酸抗凝全血样本和肝素抗凝全血样本，且分别进行测试步骤。例如包括分别采集并获得枸橼酸抗凝全血样本和肝素抗凝全血样本；其中，枸橼酸抗凝全血样本用于检测血小板的血栓弹力图最大幅度(MA)，获得由血小板和纤维蛋白原的共同作用诱导的最大凝血块强度MAThrombin(MAT)，而肝素抗凝全血样本用于检测纤维蛋白原诱导凝血块强度MAFibrin(MAF)，肝素抗凝全血样本还用于检测腺苷二磷酸诱导或花生四烯酸(arachidonic acid，AA)诱导的凝血块强度MAA(例如MAADP或MAAA)，从而获得血小板抑制率。整个方法步骤繁琐，对全血样本需要采集两种类型，需求量多，造成极大的浪费。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种血小板抑制率的检测方法和检测试剂盒，该检测方法仅需单独获得枸橼酸抗凝一种全血样本，可以极大地简化采血和测试步骤，大大提升血小板抑制率数据的效率，避免全血样本的浪费。
第一方面，本发明提供了一种血小板抑制率的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供枸橼酸抗凝全血样本；
取部分所述枸橼酸抗凝全血样本，与高岭土激活剂(Kaolin)和凝血触发剂混合后形成第一混合物，转移至第一反应杯中，经血栓弹力图仪检测后，获得最大凝血块强度(MAT)；
另取部分所述枸橼酸抗凝全血样本，与激活剂F和凝血酶抑制剂混合后形成第二混合物，转移至第二反应杯中，经血栓弹力图仪检测后，获得纤维蛋白原诱导凝血块强度(MAF)；
另取部分所述枸橼酸抗凝全血样本，与第一激活剂、所述激活剂F和所述凝血酶抑制剂混合后形成第三混合物，转移至第三反应杯中，经血栓弹力图仪检测后，获得所述第一激活剂激活的凝血块强度(MAA)；所述第一激活剂包括二磷酸腺苷(ADP)或花生四烯酸(AA)；
基于所述最大凝血块强度、所述纤维蛋白原诱导凝血块强度和所述第一激活剂激活的凝血块强度的数值计算得到血小板抑制率。
本发明中，所述血栓弹力图仪的原理是体外模拟缓慢静脉血流，用传感器测定血栓形成的时间和强度，并由计算机绘制出血凝强度曲线。具体可以是：将一导丝相连的探针置入待检测样本中，装有待检测样本的反应杯以一定的角度顺逆时间交互转动，血栓形成后，粘合于探针表面，并与之一起转动，血栓强度越大，则探针运动幅度越大，通过与探针相连的细丝将探针的运动幅度记录下来，即可判断血液凝结的速度和强度，进而判断血栓风险的大小。其中，基于记录的最大幅度(或振幅)，即MA，可以反应血凝块最大强度。
本发明中，所述提供枸橼酸抗凝全血样本是指使用枸橼酸盐抗凝的全血样本。并且本发明实施方式中，仅需针对枸橼酸抗凝全血样本就可实现该全血样本的血小板聚集功能(ADP或AA途径)检测。
本发明中，所述血小板抑制率(Inhibition)具体是指：药物对血小板的抑制率。所述血小板抑制率的计算公式如式(1)所示，
可选地，所述凝血酶抑制剂包括：未分级肝素(un-fractionated heparin)、低分子肝素钙(low molecular weight heparin)、依诺肝素钠、达肝素钠、水蛭素、重组水蛭素、抗凝血酶III、抑肽酶、苯丙氨酰-脯氨酰-精氨酸氯甲基酮和(2R,4R)-4-甲基-1-[N-[(3-甲基-1,2,3,4-四氢-8-喹啉基)磺酰]-L-精氨酰]-2-哌啶甲酸中的一种或多种。
可选地，所述凝血触发剂包含钙离子，所述钙离子的含量为0.00001mM-500mM。例如，所述钙离子可以但不限于来自氯化钙。例如，本发明一实施方式中，所述凝血触发剂为氯化钙，所述氯化钙的含量为0.00001mM-500mM。
进一步地，可选地，所述凝血触发剂包含钙离子，所述钙离子的含量为0.01mM-100mM。
可选地，所述第二混合物和所述第三混合物中，所述凝血酶抑制剂的含量均为0.00001IU-50IU。
可选地，所述第一激活剂在所述第三混合物中的含量为36μM-72mM。
可选地，所述高岭土激活剂中的高岭土的含量为0.0000001％-50％。本发明中，高岭土激活剂测试枸橼酸抗凝全血，通过激活内源凝血途径，产生的凝血酶能激活所有血小板，用于测得MAT，是纤维蛋白与所有血小板聚集的凝血最大强度。
可选地，所述激活剂F包括类凝血酶和凝血因子；其中，类凝血酶包括蛇毒酶，所述凝血因子包括XIIIa凝血因子；所述激活剂F中，所述类凝血酶的含量为0.0000001IU-100IU；所述凝血因子的含量为0.000000001mg-100mg。
本发明中，激活剂F的类凝血酶，对肝素不敏感，可作用于纤维蛋白原，将其转变为纤维蛋白单体，随后在XIIIa凝血因子的作用下，纤维蛋白单体形成网状结构，经血栓弹力图仪测得的MA值主要为纯粹由纤维蛋白原产生的本底凝血强度MAF。
本发明中，当第一激活剂为二磷酸腺苷(ADP)，所述激活剂F与ADP联合使用，在凝血酶抑制剂作用下，ADP激活未被抗ADP药物抑制的血小板，经检测得到ADP激活的凝血块强度即MAADP。当第一激活剂为花生四烯酸(AA)，激活剂F与AA联合使用，在凝血酶抑制剂作用下，AA激活未被抗AA药物抑制的血小板，经检测得到AA激活的凝血块强度即MAAA。
进一步地，ADP诱导的血小板抑制率或AA诱导的血小板抑制率的计算公式如式(2)所示，
本发明第一方面所述的血小板抑制率的检测方法，仅需单独针对枸橼酸抗凝全血样本进行检测，就可以获得包括MAT、MAF和MAA等数据，并高效得到血小板抑制率，可以极大地简化采血和测试步骤，避免全血样本的浪费，获得的血小板抑制率可以辅助判断抗血小板药物疗效。
由于全血样本是临床医学研究最重要、最高频分析的样本类型，尤其在标志物研究方面具有无可替代的地位。尤其是当全血样本的提供量极其有限的前提下，增加全血样本量无疑给提供者带来无法预估的风险。然而传统的血栓弹力图血小板抑制率的检测方法，需要同步检测枸橼酸抗凝全血样本和肝素抗凝全血样本，大大增加了全血样本的使用量，造成极大的浪费。而本申请所述的血小板抑制率的检测方法仅需单独采集枸橼酸抗凝全血样本，无需采集肝素抗凝全血样本。
本发明中，所述高岭土激活剂、所述凝血触发剂、所述激活剂F、所述凝血酶抑制剂或所述第一激活剂都可以溶解在复溶剂中。
进一步地，可选地，所述复溶剂包括去离子水和防腐剂，所述复溶剂的pH为6.0-8.0。
进一步地，可选地，所述防腐剂可以但不限于包括NaN3、防腐剂Proclin-300、庆大霉素(gentamicin)和两性霉素(amphotericin B)中的一种或多种。
本发明一具体实施方式中，所述所述防腐剂可以为NaN3，或为两性霉素，或为Proclin-300，或为庆大霉素。
可选地，所述防腐剂在所述复溶剂中的质量溶度为0.0000001％-10％。
第二方面，本发明还提供了一种检测试剂盒，包括盒体、多个试剂瓶和用于固定所述试剂瓶的固定座；多个所述试剂瓶分别装有高岭土激活剂、凝血触发剂、激活剂F、凝血酶抑制剂和第一激活剂；其中，所述第一激活剂包括二磷酸腺苷或花生四烯酸；所述凝血触发剂包含钙离子。
可选地，所述检测试剂盒用于检测待全血样本的血小板抑制率，所述全血样本为枸橼酸抗凝全血样本。
可选地，所述检测试剂盒按照如本发明第一方面所述的检测方法进行检测。
本发明中，所述凝血触发剂可以但不限于包括氯化钙。
可选地，所述凝血酶抑制剂包括未分级肝素、低分子肝素钙、依诺肝素钠、达肝素钠、水蛭素、重组水蛭素、抗凝血酶III、抑肽酶、苯丙氨酰-脯氨酰-精氨酸氯甲基酮和(2R,4R)-4-甲基-1-[N-[(3-甲基-1,2,3,4-四氢-8-喹啉基)磺酰]-L-精氨酰]-2-哌啶甲酸中的一种或多种。
可选地，所述检测试剂盒还包括复溶剂，所述复溶剂包括去离子水和防腐剂，所述复溶剂的pH为6.0-8.0。所述复溶剂可以用于复溶所述检测试剂盒中的试剂瓶内的各种试剂。
进一步地，可选地，所述防腐剂可以但不限于包括NaN3。
可选地，所述激活剂F包括类凝血酶和凝血因子；其中，类凝血酶包括蛇毒酶，所述凝血因子包括XIIIa凝血因子。
可选地，所述激活剂F中，所述类凝血酶的含量为0.0000001IU-100IU；所述凝血因子的含量为0.000000001mg-100mg。
可选地，本发明多个所述试剂瓶内的试剂都是经过冷冻干燥后形成的冻干粉形式的试剂，可以大大延长所述试剂瓶内的试剂保存时效，减少试剂的活性损失。
进一步地，本发明所述检测试剂盒的多个所述试剂瓶内的各个试剂的浓度可以根据检测的需求进行调节。
本发明实施检查试剂盒是与血栓弹力图仪配套使用的，可以体外检测人全血的血小板聚集血块强度，计算血小板抑制率，用于评价患者服用阿司匹林及噻吩吡啶(或氯吡格雷、普拉格雷)类药物后的血小板功能。
本发明第二方面所述的检测试剂盒，结构组成精简，成本低，可用于大规模工业化生产；所述检测试剂盒可以有效检测出血小板抑制率，辅助临床上判断抗血小板药物疗效。
本发明一具体实施方式中，所述检测试剂盒中的各个试剂瓶中的试剂均按照标准化、医用级的生产流程制备，从原材料采购到试剂的合成，均经过层层检验。试剂的生产流程可以但不限于包括：生产计划制定、生产前置作业、试剂半成品调配、试剂半成品分装、试剂性能检验、试剂包装、包装检验和成品入库等。
本发明的优点将会在下面的说明书中部分阐明，一部分根据说明书是显而易见的，或者可以通过本发明实施例的实施而获知。
附图说明
为更清楚地阐述本发明的内容，下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说明。
图1为本发明一实施例提供的血小板抑制率的检测方法的工艺流程图；
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
请参照图1，图1为本发明一实施方式提供的血小板抑制率的检测方法的工艺流程图，包括以下步骤：
S01、提供枸橼酸抗凝全血样本；
S02、取部分所述枸橼酸抗凝全血样本，与高岭土激活剂和凝血触发剂混合后形成第一混合物，转移至第一反应杯中，经血栓弹力图仪检测后，获得最大凝血块强度；
S03、另取部分所述枸橼酸抗凝全血样本，与激活剂F和凝血酶抑制剂混合后形成第二混合物，转移至第二反应杯中，经血栓弹力图仪检测后，获得纤维蛋白原诱导凝血块强度；
S04、另取部分所述枸橼酸抗凝全血样本，与第一激活剂、所述激活剂F和所述凝血酶抑制剂混合后形成第三混合物，转移至第三反应杯中，经血栓弹力图仪检测后，获得所述第一激活剂激活的凝血块强度；所述第一激活剂包括二磷酸腺苷或花生四烯酸；
S05、根据所述最大凝血块强度、所述纤维蛋白原诱导凝血块强度和所述第一激活剂激活的凝血块强度，计算得到血小板抑制率。
可选地，所述S02的过程还可以为：将高岭土激活剂和凝血触发剂混合后，转移至第一反应杯中，加入所述枸橼酸抗凝全血样本，充分混匀后得到第一混合物，经血栓弹力图仪检测后，获得最大凝血块强度。
或者，所述S02的过程还可以为：在第一反应杯中，加入高岭土激活剂和凝血触发剂，然后添加所述枸橼酸抗凝全血样本，充分混匀后得到第一混合物，经血栓弹力图仪检测后，获得最大凝血块强度。
可选地，所述S03的过程还可以为：将激活剂F和凝血酶抑制剂混合后，转移至第二反应杯中，加入部分所述枸橼酸抗凝全血样本，充分混匀后得到第二混合物，经血栓弹力图仪检测后，获得纤维蛋白原诱导凝血块强度。
或者，所述S03的过程还可以为：在第二反应杯中，加入激活剂F和凝血酶抑制剂，然后添加部分所述枸橼酸抗凝全血样本，充分混匀后得到第二混合物，经血栓弹力图仪检测后，获得纤维蛋白原诱导凝血块强度。
可选地，所述S04的过程还可以为：将第一激活剂、所述激活剂F和所述凝血酶抑制剂混合后，转移至第三反应杯中，加入部分所述枸橼酸抗凝全血样本，充分混匀后得到第三混合物，经血栓弹力图仪检测后，获得所述第一激活剂激活的凝血块强度。
或者，所述S04的过程还可以为：在第三反应杯中，加入第一激活剂、所述激活剂F和所述凝血酶抑制剂，然后添加部分所述枸橼酸抗凝全血样本，充分混匀后得到第三混合物，经血栓弹力图仪检测后，获得所述第一激活剂激活的凝血块强度。
下面分多个实施例对本发明实施例进行进一步的说明。
实施例1
一种ADP诱导的血小板抑制率的检测方法，包括：
提供枸橼酸抗凝全血样本，通过将外周静脉血装入至枸橼酸钠抗凝管中，恒温(37℃)混匀后使用，2h内应用血栓弹力图仪进行检查。
将高岭土激活剂和钙离子充分混合后，转移至第一反应杯中，加入360μL枸橼酸抗凝全血样本，充分混匀后形成第第一混合物，经血栓弹力图仪检测后，获得MAT；
将复溶剂分别对激活剂F、凝血酶抑制剂、ADP激活剂的冻干粉进行复溶，取10μL的激活剂F和凝血酶抑制剂的混合溶液，一并转移至第二反应杯中，再取360μL枸橼酸抗凝全血样本，充分混匀后形成第二混合物，经血栓弹力图仪检测后，获得MAF；
取10μL的激活剂F和凝血酶抑制剂的混合溶液，再加入10μLADP激活剂，一并转移至第三反应杯中，再取360μL枸橼酸抗凝全血样本，充分混匀后形成第三混合物，经血栓弹力图仪检测后，获得MAADP；
根据式(2)的公式，计算得到ADP诱导的血小板抑制率。
实施例2
一种AA诱导的血小板抑制率的检测方法，包括：
提供枸橼酸抗凝全血样本，通过将外周静脉血装入至枸橼酸钠抗凝管中，恒温(37℃)混匀后使用，2h内应用血栓弹力图仪进行检测。
取高岭土激活剂和钙离子后，充分混合后，转移至第一反应杯中，再取360μL枸橼酸抗凝全血样本，充分混匀后形成第一混合物，经血栓弹力图仪检测后，获得MAT；
将复溶剂分别对激活剂F、凝血酶抑制剂、AA激活剂的冻干粉进行复溶，取10μL的激活剂F和凝血酶抑制剂的混合溶液混合后，转移至第二反应杯中，再取360μL枸橼酸抗凝全血样本，充分混匀后形成第二混合物，经血栓弹力图仪检测后，获得MAF；
取10μL的激活剂F和凝血酶抑制剂的混合溶液，再加入10μLAA激活剂，转移至第三反应杯中，再取360μL枸橼酸抗凝全血样本，充分混匀后形成第三混合物，经血栓弹力图仪检测后，获得MAAA；
根据式(2)的公式，计算得到AA诱导的血小板抑制率。
实施例3
一种ADP及AA诱导的血小板抑制率的检测方法，包括：
提供枸橼酸抗凝全血样本，通过将外周静脉血装入至枸橼酸钠抗凝管中，恒温(37℃)混匀后使用，2h内应用血栓弹力图仪进行检测。
取高岭土激活剂和钙离子后，充分混合后，转移至第一反应杯中，再取360μL枸橼酸抗凝全血样本并加入，充分混匀后形成第一混合物，经血栓弹力图仪检测后，获得MAT；
将复溶剂分别对激活剂F、凝血酶抑制剂的冻干粉进行复溶，取10μL的激活剂F和凝血酶抑制剂的混合溶液，转移至第二反应杯中，再加入360μL枸橼酸抗凝全血样本，充分混匀后形成第二混合物，经血栓弹力图仪检测后，获得MAF；
取10μL的激活剂F和凝血酶抑制剂的混合溶液，再加入10μLADP激活剂，转移至第三反应杯中，再加入360μL枸橼酸抗凝全血样本，充分混匀后形成第三混合物，经血栓弹力图仪检测后，获得MAADP；
取10μL的激活剂F和凝血酶抑制剂的混合溶液，再加入10μLAA激活剂，转移至第四反应杯中，再加入360μL枸橼酸抗凝全血样本，充分混匀后形成第四混合物，经血栓弹力图仪检测后，获得MAAA；
根据式(2)的公式，计算得到ADP及AA诱导的血小板抑制率。
本发明实施例所述方法可以高效快捷的检测出ADP及AA诱导的血小板抑制率，且整个检测过程中仅使用枸橼酸抗凝全血样本，就可以获得包括MAT、MAF和MAA等数据，并高效得到血小板抑制率，可以极大地简化采血和测试步骤，避免全血样本的浪费，获得的血小板抑制率可以辅助判断抗血小板药物疗效。由于现有技术中，抗血小板二磷酸腺苷(ADP)受体药物(如氯吡格雷)、抗AA药物(如阿司匹林)抑制环氧化酶催化花生四烯酸(AA)生成血栓素A2(TXA2)，从而抑制血小板活化；抗ADP及抗AA药物已逐渐成为减少冠心病，尤其是急性冠状动脉综合征(Acute Coronary Syndrome，ACS)及减少冠状动脉介入治疗(PercutaneousCoronary Intervention，PCI)术后血栓事件的通用方法收集。然而，仍有一部分患者存在“血小板药物抵抗”(Platelet Drug Resistance)，必须对服用了上述药物患者的血小板抑制程度进行检测，辅助临床医生判断抗血小板药物疗效。因此，本发明实施例所述方法具有重要的应用前景，尤其是在围手术期，当全血样本的提供量极其有限的前提下，本发明实施例所述方法的一方面可以精准地获得药物诱导的血小板抑制率，另一方面还可以有效防治全血样本的浪费，减轻检测成本，以及对检测对象的损伤。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种血小板抑制率的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供枸橼酸抗凝全血样本；
取部分所述枸橼酸抗凝全血样本，与高岭土激活剂和凝血触发剂混合后形成第一混合物，转移至第一反应杯中，经血栓弹力图仪检测后，获得最大凝血块强度；
另取部分所述枸橼酸抗凝全血样本，与激活剂F和凝血酶抑制剂混合后形成第二混合物，转移至第二反应杯中，经血栓弹力图仪检测后，获得纤维蛋白原诱导凝血块强度；
另取部分所述枸橼酸抗凝全血样本，与第一激活剂、所述激活剂F和所述凝血酶抑制剂混合后形成第三混合物，转移至第三反应杯中，经血栓弹力图仪检测后，获得所述第一激活剂激活的凝血块强度；所述第一激活剂包括二磷酸腺苷或花生四烯酸；
根据所述最大凝血块强度、所述纤维蛋白原诱导凝血块强度和所述第一激活剂激活的凝血块强度，计算得到血小板抑制率。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述凝血酶抑制剂包括：未分级肝素、低分子肝素钙、依诺肝素钠、达肝素钠、水蛭素、重组水蛭素、抗凝血酶III、抑肽酶、苯丙氨酰-脯氨酰-精氨酸氯甲基酮和(2R,4R)-4-甲基-1-[N-[(3-甲基-1,2,3,4-四氢-8-喹啉基)磺酰]-L-精氨酰]-2-哌啶甲酸中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述凝血触发剂包含钙离子；所述钙离子的含量为0.00001mM-500mM。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述第二混合物和所述第三混合物中，所述凝血酶抑制剂的含量均为0.00001IU-50IU。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述激活剂F包括类凝血酶和凝血因子；其中，类凝血酶包括蛇毒酶，所述凝血因子包括XIIIa凝血因子；所述激活剂F中，所述类凝血酶的含量为0.0000001IU-100IU；所述凝血因子的含量为0.000000001mg-100mg。
6.一种检测试剂盒，其特征在于，包括盒体、多个试剂瓶和用于固定所述试剂瓶的固定座；多个所述试剂瓶分别装有高岭土激活剂、凝血触发剂、激活剂F、凝血酶抑制剂和第一激活剂；其中，所述第一激活剂包括二磷酸腺苷或花生四烯酸；所述凝血触发剂包含钙离子。
7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒用于检测待全血样本的血小板抑制率，所述全血样本为枸橼酸抗凝全血样本。
8.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述凝血酶抑制剂包括未分级肝素、低分子肝素钙、依诺肝素钠、达肝素钠、水蛭素、重组水蛭素、抗凝血酶III、抑肽酶、苯丙氨酰-脯氨酰-精氨酸氯甲基酮和(2R,4R)-4-甲基-1-[N-[(3-甲基-1,2,3,4-四氢-8-喹啉基)磺酰]-L-精氨酰]-2-哌啶甲酸中的一种或多种。
9.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒按照如权利要求1-5任意一项所述的检测方法进行检测。
10.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括复溶剂，所述复溶剂包括去离子水和防腐剂，所述复溶剂的pH为6.0-8.0。
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