CN117825674A - 用于评估肝病预后的分子标志物及诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于评估肝病预后的分子标志物及诊断试剂盒，属于分子生物学技术领域。本发明提供了一种用于评估肝病预后的分子标志物，所述分子标志物包括血小板ADP抑制率。研究表明，慢性肝病及其进展阶段患者中，ADP抑制率与器官衰竭的发生呈正相关，与器官衰竭的严重程度呈正相关，并且，与28天死亡率呈正相关。可见，血小板ADP抑制率的大小与肝病预后的好坏具有相关性，血小板ADP抑制率越大，肝病预后不良程度越高，尤其是当血小板ADP抑制率大于30％时，肝病患者预后显著差于血小板ADP抑制率小于30％的肝病患者。因此，血小板ADP抑制率能够作为肝病预后评估的分子标志物，用于准确评估肝病(尤其是慢性肝病)的预后。
Description
技术领域
本发明涉及用于评估肝病预后的分子标志物及诊断试剂盒，属于分子生物学技术领域。
背景技术
慢性肝病是指病程超过了6个月以上的，表现为持续的肝功能异常或者间断反复的肝功能异常的肝病。常见的慢性肝病主要有乙型病毒性肝炎、酒精性肝炎、丙型病毒性肝炎以及自身免疫学肝病等。慢性肝病长期发展易进展为代偿期肝硬化、失代偿期肝硬化、急性肝衰竭、慢加急性肝衰竭以及慢性肝衰竭等终末期肝病。因此，及时对慢性肝病进行治疗进而控制其疾病进展，降低终末期肝病器官衰竭发生率，对慢性肝病患者十分重要。然而，当前，由于机制不明确，除了肝移植外，慢性肝病患者没有其他明确的治疗选择。肝病的预后主要指肝病患者经治疗后的疾病进展和生存状况。通过评估肝病的预后可以为医生和患者提供有关肝病发展趋势的信息，进而指导肝病治疗决策。因此，准确评估肝病预后是有效治疗慢性肝病进而控制其发展的关键。
现阶段，临床上主要通过对慢性肝病患者体内总胆红素(TBil)、国际标准化比值(INR)和血清肌酐(Cr)等分子标志物的水平进行检测以评估其慢性肝病的预后。但是，这些分子标志物仍存在缺陷。例如，总胆红素升高可以是多种疾病的表现，不仅限于慢性肝病，因此，它的升高并不能确定特定的肝病类型或病因；总胆红素升高通常是肝脏功能受损的后期表现，这意味着它在肝脏疾病的早期可能无法提供足够早期的风险提示；总胆红素水平受多种因素的干扰，包括溶血、胆道梗阻和药物的影响，这些因素可能导致总胆红素水平的波动，使其不够稳定；同时，总胆红素升高，在临床上对于治疗指导的作用微乎其微。而国际标准化比值(INR)和血清肌酐(Cr)在慢性肝病患者中的临床治疗指导意义更是尚不明确，无法将两者与慢性肝病的预后直接相关。
也有研究发现，患有晚期慢性肝病或肝硬化的患者常常伴有轻度至严重的血小板减少。并且，研究表明，在乙肝病毒感染相关的慢加急性肝衰竭患者体内，血小板计数存在一个快速下降的过程，这种血小板计数的快速降低不是由于血小板破坏、凋亡增加引起的，也和血小板生成(网织血小板、促血小板生成素)状态关系不大，推测是由于急性肝损伤后导致的血小板活化、肝血窦内皮损伤等引起的肝内血小板大量聚集、消耗血小板造成的。另外，研究发现，在急性和慢性肝功能衰竭患者体内，血小板计数也存在进一步下降的情况。然而，仅有血小板计数并不是肝病短期预后的独立风险因素，可见，血小板计数也并不能作为准确评估肝病预后的分子标志物。因此，亟需找到与慢性肝病预后关联性更强的分子标志物以评估慢性肝病的预后进而克服现有慢性肝病预后评估分子标志物存在的缺陷。
血栓弹力图(TEG)是用于评估凝血功能全貌以及血小板功能的检测手段。TEG及血栓弹力图-血小板图(TEG-PM)不仅反映了在凝血的不同层面之间，包括血浆成分(凝血蛋白)和细胞成分(血小板、红白细胞和微粒)之间的相互作用的累积效应，也能够测量作为对腺苷二磷酸(ADP)或花生四烯酸(AA)的反应呈现出的血小板活性。TEG及TEG-PM中，首先，ADP抑制率和AA抑制率是两个直观、易于测量的指标，可以在临床实践中方便地获得；其次，与传统血小板功能测试方法(如光聚集法)相比，TEG及TEG-PM能够提供更全面、更动态的ADP抑制率和AA抑制率等相关信息，以为医生提供及时、实时的患者血小板功能信息，进而有助于更准确地评估患者的出血和血栓风险，并且，有助于医生根据患者的实际情况调整抗血小板治疗方案。目前，尚无关于慢性肝病患者血小板功能能够作为慢性肝病预后评估的分子标志物的相关研究报道，更无关于通过TEG或TEG-PM测得的慢性肝病患者血小板功能能够作为慢性肝病预后评估的分子标志物的相关研究报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种用于评估肝病预后的分子标志物，所述分子标志物包括血小板ADP抑制率。
在本发明的一种实施方式中，所述分子标志物为通过血栓弹力图(TEG)和/或血栓弹力图-血小板图(TEG-PM)测得的血小板ADP抑制率。
在本发明的一种实施方式中，所述肝病包括慢性肝病和/或慢性肝病的进展阶段。
在本发明的一种实施方式中，所述慢性肝病的进展阶段包括终末期肝病；所述终末期肝病包括代偿期肝硬化、失代偿期肝硬化、急性肝衰竭、慢加急性肝衰竭和/或慢性肝衰竭。
在本发明的一种实施方式中，所述肝病预后包括肝病患者的器官衰竭发生率、器官衰竭严重程度和/或短期死亡率。
在本发明的一种实施方式中，所述器官衰竭包括肝衰竭、凝血功能衰竭、肾衰竭、中枢神经系统衰竭、循环衰竭和/或呼吸衰竭。
在本发明的一种实施方式中，所述短期死亡率是指患者入院后28天内的死亡率。
在本发明的一种实施方式中，当血小板ADP抑制率小于30％时，肝病患者的终末期肝病器官衰竭评分(Chronic Liver Failure-sequential Organ Failure AssessmentScore，CLIF-OF)为7分(四分位间距为6～8分)(低风险)，当血小板ADP抑制率为30～70％时，肝病患者的终末期肝病器官衰竭评分为8分(四分位间距为6～10分)(中风险)，当血小板ADP抑制率大于70％时，肝病患者的终末期肝病器官衰竭评分为10分(四分位间距为9～12分)(高风险)。终末期肝病患者的终末期肝病器官衰竭评分详情见表1。
在本发明的一种实施方式中，当血小板ADP抑制率小于30％时，肝病患者的短期存活率为98.3％(95％置信区间为96.3～100％)(低风险)，当血小板ADP抑制率为30～70％时，肝病患者的短期存活率为87.5％(95％置信区间为79.3～96.6％)(中风险)，当血小板ADP抑制率大于70％时，肝病患者的短期生存率为14.8％(95％置信区间为6.0～36.6％)(高风险)。
表1肝病患者的终末期肝病器官衰竭评分(CLIF-OF)详情
//区域描述了诊断器官功能衰竭的标准：
*因肝性脑病(HE)而接受机械通气(MV)而非由于呼吸衰竭的患者被视为出现脑功能衰竭(脑分数＝3)；
#在研究中纳入的其他接受机械通风的患者被视为出现呼吸衰竭(呼吸分数＝3)。
本发明还提供了检测待测样本中上述分子标志物的试剂在制备评估肝病预后的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述分子标志物为通过血栓弹力图(TEG)和/或血栓弹力图-血小板图(TEG-PM)测得的血小板ADP抑制率。
在本发明的一种实施方式中，所述肝病包括慢性肝病和/或慢性肝病的进展阶段。
在本发明的一种实施方式中，所述慢性肝病的进展阶段包括终末期肝病；所述终末期肝病包括代偿期肝硬化、失代偿期肝硬化、急性肝衰竭、慢加急性肝衰竭和/或慢性肝衰竭。
在本发明的一种实施方式中，所述肝病预后包括肝病患者的器官衰竭发生率、器官衰竭严重程度和/或短期死亡率。
在本发明的一种实施方式中，所述器官衰竭包括肝衰竭、凝血功能衰竭、肾衰竭、中枢神经系统衰竭、循环衰竭和/或呼吸衰竭。
在本发明的一种实施方式中，所述短期死亡率是指患者入院后28天内的死亡率。
在本发明的一种实施方式中，当血小板ADP抑制率小于30％时，肝病患者的终末期肝病器官衰竭评分(Chronic Liver Failure-sequential Organ Failure AssessmentScore，CLIF-OF)为7分(四分位间距为6～8分)(低风险)，当血小板ADP抑制率为30～70％时，肝病患者的终末期肝病器官衰竭评分为8分(四分位间距为6～10分)(中风险)，当血小板ADP抑制率大于70％时，肝病患者的终末期肝病器官衰竭评分为10分(四分位间距为9～12分)(高风险)。
在本发明的一种实施方式中，当血小板ADP抑制率小于30％时，肝病患者的短期存活率为98.3％(95％置信区间为96.3～100％)(低风险)，当血小板ADP抑制率为30～70％时，肝病患者的短期存活率为87.5％(95％置信区间为79.3～96.6％)(中风险)，当血小板ADP抑制率大于70％时，肝病患者的短期生存率为14.8％(95％置信区间为6.0～36.6％)(高风险)。
在本发明的一种实施方式中，所述待测样本包括外周血全血。
本发明还提供了一种用于评估肝病预后的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括检测待测样本中上述分子标志物的试剂。
在本发明的一种实施方式中，所述诊断试剂盒包括用于通过血栓弹力图和/或血栓弹力图-血小板图检测待测样本中上述分子标志物的试剂。
在本发明的一种实施方式中，所述肝病包括慢性肝病和/或慢性肝病的进展阶段。
在本发明的一种实施方式中，所述慢性肝病的进展阶段包括终末期肝病；所述终末期肝病包括代偿期肝硬化、失代偿期肝硬化、急性肝衰竭、慢加急性肝衰竭和/或慢性肝衰竭。
在本发明的一种实施方式中，所述肝病预后包括肝病患者的器官衰竭发生率、器官衰竭严重程度和/或短期死亡率。
在本发明的一种实施方式中，所述器官衰竭包括肝衰竭、凝血功能衰竭、肾衰竭、中枢神经系统衰竭、循环衰竭和/或呼吸衰竭。
在本发明的一种实施方式中，所述短期死亡率是指患者入院后28天内的死亡率。
在本发明的一种实施方式中，当血小板ADP抑制率小于30％时，肝病患者的终末期肝病器官衰竭评分(Chronic Liver Failure-sequential Organ Failure AssessmentScore，CLIF-OF)为7分(四分位间距为6～8分)(低风险)，当血小板ADP抑制率为30～70％时，肝病患者的终末期肝病器官衰竭评分为8分(四分位间距为6～10分)(中风险)，当血小板ADP抑制率大于70％时，肝病患者的终末期肝病器官衰竭评分为10分(四分位间距为9～12分)(高风险)。
在本发明的一种实施方式中，当血小板ADP抑制率小于30％时，肝病患者的短期存活率为98.3％(95％置信区间为96.3～100％)(低风险)，当血小板ADP抑制率为30～70％时，肝病患者的短期存活率为87.5％(95％置信区间为79.3～96.6％)(中风险)，当血小板ADP抑制率大于70％时，肝病患者的短期生存率为14.8％(95％置信区间为6.0～36.6％)(高风险)。
在本发明的一种实施方式中，所述待测样本包括外周血全血。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种用于评估肝病预后的分子标志物，所述分子标志物包括血小板ADP抑制率。研究表明，慢性肝病及其进展阶段患者中，ADP抑制率与器官衰竭的发生呈正相关，ADP抑制率与器官衰竭的严重程度呈正相关，并且，ADP抑制率与28天死亡率呈正相关。可见，血小板ADP抑制率的大小与肝病预后的好坏具有相关性，血小板ADP抑制率越大，肝病预后不良程度越高，尤其是当血小板ADP抑制率大于30％时，肝病患者预后显著差于血小板ADP抑制率小于30％的肝病患者。因此，血小板ADP抑制率能够作为肝病预后评估的分子标志物，用于准确评估肝病(尤其是慢性肝病)的预后。
附图说明
图1：实验流程图。
图2：慢性肝病患者器官功能衰竭与血小板功能之间的关系。图2中，A为器官功能衰竭和非器官功能衰竭患者之间ADP抑制率的差异；B为ADP抑制率与器官功能衰竭患者数量之间的相关性；C为AA抑制率与器官功能衰竭患者数量之间的相关性；D为器官功能衰竭和非器官功能衰竭患者之间AA抑制率的差异。
图3：器官功能衰竭和非器官功能衰竭患者之间ADP抑制率的密度分布曲线(肝衰竭)。
图4：器官功能衰竭和非器官功能衰竭患者之间ADP抑制率的密度分布曲线(凝血衰竭)。
图5：器官功能衰竭和非器官功能衰竭患者之间ADP抑制率的密度分布曲线(中枢神经系衰竭)。
图6：器官功能衰竭和非器官功能衰竭患者之间ADP抑制率的密度分布曲线(肾衰竭)。
图7：器官功能衰竭和非器官功能衰竭患者之间ADP抑制率的密度分布曲线(循环衰竭)。
图8：不同ADP抑制率患者的终末期肝病器官衰竭评分(Chronic liver failure-organ failure score system，CLIF-OF)评分分布。
图9：预测模型区分28天死亡率的能力。图9中，A为预测模型预测28天死亡率的能力的受试者工作特征曲线(ROC)；B为预测性评分系统的预测价值比较；C为28天生存曲线。图4使用了Z检验(Delong's方法)计算和比较了不同模型的auROC。
图10：预测模型区分90天死亡率的能力。图10中，A为预测模型预测90天死亡率的能力的受试者工作特征曲线(ROC)；B为预测性评分系统的预测价值比较；C为90天生存曲线。图5使用了Z检验(Delong's方法)计算和比较了不同模型的auROC。
图11：诊断精确性评估的参数。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实验例1：分子标志物的筛选和验证
1实验方法
1.1队列建设：本研究共纳入了260名患有慢性肝病的患者，这些患者来自南方医院及其增城分院(伦理委员会批准号：NFEC-2020-052；ClinicalTrials.gov注册号：NCT04675125)。收集了临床检验检测指标和预后指标，并在入院时、住院期间(住院后第3、7、14和21天)以及住院后第28和90天随访期间为所有纳入患者记录了详细的临床数据和结果，相关的知情同意已在患者或其法定代理人入组前获得。
1.2样本采集及血小板功能检测：采集每位患者的空腹血液，并放入含有相应抗凝剂的试管中。对于TEG普通杯测试(具体参见文献“Hartert.et al.KlinischeWochenschrift.1948.”)，需要一支含有柠檬酸钠抗凝剂的的柠檬酸钠试管用于采集患者外周血。另外，在TEG普通杯基础上，通过血栓弹力图-血小板映射(TEG-PM)进行血小板功能分析(具体参见文献“Craft RM,Chavez JJ,Bresee SJ,Wortham DC,Cohen E,CarrollRC.A novel modification of the Thrombelastograph assay,isolating plateletfunction,correlates with optical platelet aggregation.JLab Clin Med.2004；143(5):301-309.”)，需要一支含有肝素锂抗凝剂的肝素锂试管用于采集患者外周血。肝素化的血液样本用于TEG-PM检测，其中包括通过P2Y12受体通路对ADP的血小板反应以及通过环氧合酶通路对AA的血小板反应。
1.3统计分析：分类变量的绝对频数和百分比进行了报告。定量变量报告为中位数和四分位距，或另有说明。使用Fisher精确检验进行分类变量的比较，使用Mann-Whitney检验进行连续变量的比较。使用Kaplan-Meier方法描述了生存函数。通过双变量分析(Pearson相关系数(R))确定与28天死亡率相关的因素。在双变量分析中显示出统计学显著相关的因素，被选为初始多变量分析的因素。使用Cox回归模型选择最佳的预测子集，评估拟合特性。
统计分析使用SPSS22.0(IBM Corp.，Armonk，N.Y，USA)、R软件3.6.0(RFoundation for Statistical Computing，Vienna，Austria)和GraphPadPrism 9软件(CA，USA)进行。
2实验实施流程
连续入组符合纳排要求的病人(纳排标准见表2，入组流程见图1)，在入组首日给患者免费行TEG-PM检查，并完整收集各个器官损伤或衰竭相关数据(肝脏、凝血、肾脏、中枢神经系统、呼吸及循环)、生物样本(血浆、血清、尿液、细胞沉淀等)，完整录入电子病历系统；采用曲线下面积、最大选择检验法等方法，验证血小板ADP抑制率对慢性肝病的的4周预后能力。
表2纳排标准
3实验结果及分析
血栓弹力图中血小板功能ADP抑制率在慢性肝病患者预后的预测能力中的应用的结果分析见图2～10和表3(图3～7中，因呼吸衰竭患者仅有2例，故在此不展示密度分布曲线图)。
图2中的A～B和图3～7展示了有器官衰竭和无器官衰竭患者之间ADP抑制率的差异，以及，ADP抑制率与器官衰竭数量和CLIF-OF评分之间的相关性。将患者是否合并器官衰竭(肝脏、凝血功能、中枢神经系统、肾脏、呼吸系统、循环系统)进行分组(图2中的A～B)，可以发现，除了发生率极低的呼吸系统衰竭，ADP抑制率在器官衰竭组皆明显高于非器官衰竭组；同理，图3～6的密度曲线图，也能表明器官衰竭组高ADP抑制率的发生率高于非器官衰竭组。此结果表明，ADP抑制率与器官衰竭的发生呈正相关，并且，肝病患者的ADP抑制率与肝病的疾病严重程度(CTP、MELD-Na、MELD、CLIF-C-AD、CLIF-C-OF、CLIF-C-ACLF评分均为判断肝病严重程度的评分)呈正相关，暗示ADP抑制率可能作为预测慢性肝病患者器官衰竭的指标。相比之下，TEG-PM中另一个能反映血小板功能的参数，AA抑制率与器官衰竭之间的相关性不如ADP抑制率与慢性肝病患者器官衰竭之间的相关性强(图2中的C～D)。
图8展示了CLIF-OF评分在不同ADP抑制率患者人群中的散点图分布。从图8中可以观察到，随着ADP抑制率的增加，CLIF-OF评分逐步上升。这进一步强调了ADP抑制率与慢性肝病患者器官衰竭的严重程度密切相关，有助于区分慢性肝病患者器官衰竭的验证程度。
单变量分析结果见表3。为避免与实验室检验数据发生共线性，器官衰竭和疾病严重程度评分未纳入多变量分析模型。模型中包括p值小于0.05的变量(包括总胆红素、肌酐、国际标准化比值、白细胞计数、血小板计数、钠、腹水、细菌感染、脑病、AA抑制率和ADP抑制率)。表3中的多变量分析结果显示，总胆红素(危险比(HR)为1.004，95％置信区间(CI)为1.002～1.006，p<0.001)、脑病(HR为1.695，95％CI为1.303～2.204，p<0.001)和ADP抑制率(HR为1.049，95％CI为1.036～1.062，p<0.001)独立预测了28天内无需移植的死亡率。这其中，多因素回归分析的结果也提示AA抑制率不是28天病死率的独立预测危险因素。
与六种常见的预测评分系统相比(CTP、MELD-Na、MELD、CLIF-C-AD、CLIF-C-OF、CLIF-C-ACLF)，单独的ADP抑制率在预测28天死亡率方面显示出显著更高的准确性，其auROC值最高(0.914，图9中的A～G)。然而，在预测90天死亡率方面，ADP抑制率的预测能力较其他通用预测评分系统较差(0.795，图10中的A～G)。为了评估ADP抑制率对无需移植死亡率的影响，根据ROC曲线分析确定的最佳ADP抑制率30％截断值，将患者分为两组。入院时ADP抑制率大于30％的患者28天死亡的累积发生率显著高于水平较低的患者(35.8％对1.7％；p<0.001；图9中的H)。两组之间的90天死亡率也存在统计学差异(40.0％对9.8％；p<0.001；图10中的H)。
根据ROC曲线下面积，结合约登指数，确定了各个评分的CUT-OFF值以后，还对其他用于诊断精确性评估的参数的统计分析，例如真阳(True positive)、假阳(Falsepositive)、真阴(True negative)、假阴(False negative)、敏感性(Sensitivity)、特异性(Specificity)、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)，阳性似然比(LR+)和阴性似然比(LR-)，分析结果见图11。从图11可以看出，ADP抑制率在多个指标中表现优越，除了真阳略低于MELD评分，在其他参数，如阳性似然比、阴性似然比等方面，ADP抑制率均表现出色，超过了剩下的4个评分量表(CLIF-CAD评分ROC曲线下面积小于0.7，故没纳入分析)。这也提示，可能单一指标-ADP抑制率，对疾病的短期预判上能起到更准确、快速且便捷的作用。
综上可知，ADP抑制率可作为预测肝病患者器官衰竭发生率、器官衰竭严重程度和短期死亡率的有效标志物，有助于临床医生制定更有效的治疗计划和评估预后。
表3前瞻性队列中28天死亡风险因素的单因素和多因素分析.
注：比较28天内存活和28天内死亡患者的风险因素。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种用于评估肝病预后的分子标志物，其特征在于，所述分子标志物包括血小板ADP抑制率。
2.如权利要求1所述的分子标志物，其特征在于，所述分子标志物为通过血栓弹力图测得的血小板ADP抑制率。
3.如权利要求1或2所述的分子标志物，其特征在于，所述肝病包括慢性肝病和/或慢性肝病的进展阶段。
4.如权利要求1～3任一项所述的分子标志物，其特征在于，所述肝病预后包括肝病患者的器官衰竭发生率、器官衰竭严重程度和/或短期死亡率。
5.如权利要求4所述的分子标志物，其特征在于，所述器官衰竭包括肝衰竭、凝血功能衰竭、肾衰竭、中枢神经系统衰竭、循环衰竭和/或呼吸衰竭。
6.检测待测样本中权利要求1～5任一项所述的分子标志物的试剂在制备评估肝病预后的产品中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述分子标志物为通过血栓弹力图测得的血小板ADP抑制率。
8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述肝病包括慢性肝病和/或慢性肝病的进展阶段。
9.一种用于评估肝病预后的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒包括检测待测样本中权利要求1～5任一项所述的分子标志物的试剂。
10.如权利要求9所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒包括用于通过血栓弹力图检测待测样本中权利要求1～5任一项所述的分子标志物的试剂。
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