CN107589246A - 一种纤维蛋白激活剂、其制备方法，包括该激活剂的试剂盒及采用该试剂盒的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纤维蛋白激活剂、该纤维蛋白激活剂的制备方法、包括该纤维蛋白激活剂的试剂盒及采用该试剂盒进行血小板聚集功能检测的方法，包括如下组分：30～100mmol/L pH＝7‑8的Tris‑HCl缓冲液、6～18mg/L的巴曲酶、150～250mg/L的1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺、20～60g/L的PEG8000、2～8g/L的多聚赖氨酸、6～16g/L的BSA、10～50g/L的海藻糖、0.03％～0.05％的Proclin300、6～16mg/L的抑肽酶、10～30mg/L的脑磷脂、6‑12g/L NaCl；本发明的纤维蛋白激活剂以蛋白交联试剂代替活化凝血因子，成本低。

Description

一种纤维蛋白激活剂、其制备方法，包括该激活剂的试剂盒及 采用该试剂盒的检测方法

技术领域

本发明涉及血小板检测技术领域，尤其涉及一种纤维蛋白激活剂，该纤维蛋白激活剂的制备方法、包括该纤维蛋白激活剂的试剂盒及采用该试剂盒进行血小板聚集功能检测的方法。

背景技术

血小板在生理性止血、维持血管壁完整性以及某些病理过程，如血栓形成、动脉粥样硬化、不稳定性心绞痛、肿瘤转移和炎症反应等过程中起着重要作用。大量研究表明，血小板的激活和聚集是体内血栓形成的始动因素，亦是血栓形成过程中最关键的成份之一。临床常见的危重急症如心性猝死、心肌梗死、脑卒中、肺梗死等均是血栓性疾病。因此，血小板功能检测对早期发现血栓风险以及血小板相关疾病的诊断和治疗有着重要的意义。

临床研究结果亦证实，应用阿司匹林、抵克力得、氯吡格雷、血小板糖蛋白IIb/IIIa受体拮抗剂(GPI)等抗血小板药物可显著减少动脉粥样硬化血栓风险，故抗血小板治疗在心脑血管病一级、二级预防中得到广泛应用，并取得了良好的效果。

但是，由于心脑血管疾病的临床情况复杂多样，标准抗血小板治疗方案并不适用于所有病人。部分病人即使接受了常规剂量抗血小板药物的治疗，仍然发生血栓事件，即患者对抗血小板治疗反应性不佳，临床将其称为“抗血小板药物抵抗”现象。临床治疗中，抗血小板药物抵抗的发生率约50％，后果较为严重，此类病人的主要心脑血管缺血事件(死亡、心肌梗死或卒中)的风险约为非抵抗病人的3-5倍。因此，早期识别并妥善处理抗血小板药物抵抗可在很大程度上改善心脑血管疾病患者的预后。国内外文献报道，血小板功能检测与临床血栓事件之间有很好的相关性，通过血小板聚集功能检测，可以获知病人对抗血小板治疗的反应性、预测病人的血栓风险，从而可有针对性地采取个体化抗血小板治疗，减少血栓事件并发症。

血栓弹性图(TEG)方法是目前临床上常用的能够量化检测血小板功能的方法。血栓弹力图是血栓弹力仪描绘出的特殊图形。其原理是体外模拟缓慢静脉血流，用传感器测定血栓形成的时间和强度，并由计算机绘制出血凝强度曲线。弹力仪的主要部件：自动调节恒温(37℃)的不锈钢盛血杯，插入杯中的不锈钢小圆柱体及可连接圆柱体的传感器。盛血杯安置在能以4°45′角度来回转动的反应池上，杯壁与圆柱体中间容放血液。当血液标本呈液态时，杯的来回转动不能带动圆柱体，通过传感器反映到描图纸上的信号是一条直线，当血液开始凝固时，杯与圆柱体之间因纤维蛋白黏附性而产生阻力，杯的转动带动圆柱体同时运动，随着纤维蛋白的增加，阻力也不断增大，杯带动圆柱体的运动也随之变化，此信号通过传感器描绘到描图纸上形成特有的血栓弹力图，用于判断血液凝结的速度和强度，进而判断血栓风险的大小。TEG的优点是采用全血检测，除检测血小板功能外，还可了解血栓溶解的情况，对血栓和出血风险均可进行评价。

美国希莫斯科普公司在TEG方法的基础上研制出监测血小板抑制的方案(专利申请号：CN 200480012116.1)。在枸橼酸钠、肝素、水蛭素存在的环境下，采用蛇毒凝血酶(batroxabin)代替人凝血酶，使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，并加入ADP和凝血因子XIIIa激活血小板，测定最大血凝块强度。

申请号201210440139.9公开了“一种血小板聚集功能检测试剂盒及检测方法”，该血小板聚集功能检测试剂盒主要包括以下检测试剂：枸橼酸钠全血激活剂、纤维蛋白激活剂和血小板激活剂。所述纤维蛋白激活剂中含有：重组巴曲酶和XIIIA活化凝血因子。该试剂盒利用重组巴曲酶替代蛇毒凝血酶，在活化凝血因子的协同作用下，明显增强了激活纤维蛋白原的特异性，大大提升试剂的重复检测变异性、准确性及稳定性。

现有的血小板检测试剂盒中纤维蛋白激活剂均含有活化凝血因子。活化凝血因子从人血浆中提取，体外激活并进行纯化，获取难度大，获取量少，成本高。

发明内容

为了解决现有技术中纤维蛋白激活剂均含XIIIA活化凝血因子，试剂成本高的问题，本发明的目的是提供一种纤维蛋白激活剂。为此，本发明还将提供该纤维蛋白激活剂的制备方法。此外，本发明还提供一种包括该纤维蛋白激活剂的试剂盒及采用该试剂盒进行血小板聚集功能检测的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种纤维蛋白激活剂，包括如下组分：30～100mmol/L pH＝7-8的Tris-HCl缓冲液、6～18mg/L的巴曲酶、150～250mg/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、20～60g/L的PEG8000、2～8g/L的多聚赖氨酸、6～16g/L的BSA、10～50g/L的海藻糖、0.03％～0.05％的Proclin300、6～16mg/L的抑肽酶、10～30mg/L的脑磷脂、6-12g/L NaCl。

优选的是，包括如下组分：30mmol/L pH＝7.2的Tris-HCl缓冲液、6mg/L的巴曲酶、150mg/L的EDC、20g/L的PEG8000、2g/L的多聚赖氨酸、6g/L的BSA、10g/L的海藻糖、0.03％的Proclin300、6mg/L的抑肽酶、10mg/L的脑磷脂、6g/L NaCl。

优选的是，包括如下组分：50mmol/L pH＝7.4的Tris-HCl缓冲液、10mg/L的巴曲酶、200mg/L的EDC、40g/L的PEG8000、5g/L的多聚赖氨酸、10g/L的BSA、30g/L的海藻糖、0.05％的Proclin300、10mg/L的抑肽酶、20mg/L的脑磷脂、9g/L NaCl。

优选的是，包括如下组分：100mmol/L pH＝7.9的Tris-HCl缓冲液、18mg/L的巴曲酶、250mg/L的EDC、60g/L的PEG8000、8g/L的多聚赖氨酸、16g/L的BSA、50g/L的海藻糖、0.05％的Proclin300、16mg/L的抑肽酶、30mg/L的脑磷脂、12g/L NaCl。

上述分数为体积分数。

本发明的第二方面，提供一种上述纤维蛋白激活剂的制备方法，包括如下步骤：

S1，称取Tris盐于水中，加入浓HCl调节pH值至7～8；

S2，向S1中依次加入巴曲酶、EDC、PEG8000、多聚赖氨酸、BSA、海藻糖、Proclin300、抑肽酶、脑磷脂和NaCl，得到纤维蛋白激活剂，所述纤维蛋白激活剂中Tris-HCl缓冲液为30～100mmol/L，巴曲酶为6～18mg/L，EDC为150～250mg/L、PEG8000为20～60g/L、多聚赖氨酸为2～8g/L、BSA为6～16g/L、海藻糖为10～50g/L、Proclin300为0.03％～0.05％、抑肽酶为6～16mg/L、脑磷脂为10～30mg/L、NaCl为6～12g/L。

本发明的第三方面，提供一种血小板聚集功能检测试剂盒，包括枸橼酸钠全血激活剂、血小板激活剂和上述的纤维蛋白激活剂。

其中，所述枸橼酸钠全血激活剂包括高岭土试剂和CaCl₂试剂。

其中，所述高岭土试剂的浓度为0.033g/L，CaCl₂试剂的浓度为0.2mol/L。

其中，所述血小板激活剂为二磷酸腺苷或花生四烯酸。

本发明的第四方面，提供一种上述试剂盒检测血小板聚集功能的方法，包括如下步骤：

S1，分别采集含有抗血小板药物的枸橼酸钠抗凝全血和肝素抗凝全血；

S2，将枸橼酸钠抗凝全血注入含有枸橼酸钠全血激活剂的测定杯中，测得血块强度MA总；

S3，将肝素抗凝全血注入到含有纤维蛋白激活剂的测定杯中，测得血块强度MA_纤；

S4，将肝素抗凝全血注入到含有纤维蛋白激活剂和血小板激活剂的测定杯中，测得血块强度MA_x；

S5，根据下面的公式计算抗血小板药物的抑制率：抑制率＝100％-((MA_x-MA_纤)/(MA_总-MA_纤)×100)％。

该纤维蛋白激活剂在肝素抗凝环境下，通过其中的巴曲酶激活纤维蛋白原，然后以EDC、PEG8000、多聚赖氨酸、BSA、海藻糖、Proclin300、抑肽酶、脑磷脂和NaCl复配组成蛋白交联试剂，使纤维蛋白单体交联成结实的网状结构。在此过程中，血小板未被激活，测定的血块强度仅有纤维蛋白的贡献；当血小板激活剂加入时，相应膜受体通道被激活，此时测定的血块强度便含有纤维蛋白和血小板两者的贡献，两者相减的值即是血小板单独的贡献；当使用某些对应的抗血小板药物时，血小板对于血块强度的贡献便下降，衡量其下降的幅度便是药物的抑制率。通常，以血小板完全被激活时测得的血小板在血块强度中的贡献为无药物抑制的基准。在实际操作中，这一基准是通过枸橼酸钠全血激活剂来完成测试的。抑制率计算公式中MA_x为肝素抗凝全血加入本发明纤维蛋白激活剂和血小板激活剂后测得的血块强度，MA_纤为肝素抗凝全血只加入本发明纤维蛋白激活剂测得的血块强度，两者相减即为在抗血小板药物作用下，血小板在血块强度中的贡献值；MA_总为枸橼酸钠抗凝全血加入含有枸橼酸钠全血激活剂测得的血块强度，减去MA_纤即为无药物抑制下血小板在血块强度中的贡献值。

与现有技术相比，本发明实现的有益效果：本发明的纤维蛋白激活剂以蛋白交联试剂代替活化凝血因子，成本低；将包括本发明纤维蛋白激活剂的试剂盒用于检测血小板聚集功能，与已上市美国Haemoscope公司生产的血小板聚集功能检测试剂盒检测结果相符合，可以用于替代已上市美国Haemoscope公司生产的血小板聚集功能检测试剂盒，以降低成本。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式来进一步详细说明本发明：

图1为本发明检测试剂盒检测阿司匹林对A2膜受体通道抑制率的血块强度叠加图；

图2为本发明检测试剂盒检测氯吡格雷对ADP膜受体通道抑制率的血块强度叠加图；

图3为美国Haemoscope公司生产的P1测试360μL正常人肝素抗凝全血的血块强度图；

图4为本发明的纤维蛋白激活剂测试360μL正常人肝素抗凝全血的血块强度图；

图5为美国Haemoscope公司生产的P1组分和P2组分测试360μL正常人肝素抗凝全血与美国Haemoscope公司生产的P1测试360μL正常人肝素抗凝全血的血块强度叠加图；

图6为本发明的纤维蛋白激活剂和ADP测试360μL正常人肝素抗凝全血与本发明的纤维蛋白激活剂测试360μL正常人肝素抗凝全血的血块强度叠加图；

图7为美国Haemoscope公司生产的P1组分和P3组分测试360μL正常人肝素抗凝全血与美国Haemoscope公司生产的P1测试360μL正常人肝素抗凝全血的血块强度叠加图；

图8为本发明的纤维蛋白激活剂和AA测试360μL正常人肝素抗凝全血与本发明的纤维蛋白激活剂测试360μL正常人肝素抗凝全血的血块强度叠加图。

具体实施方式

实施例1

一种纤维蛋白激活剂的制备方法，包括如下步骤：

S1，称取0.908g三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)放入250ml容量瓶，加入蒸馏水，采用浓HCl调节pH，加水至刻度线，混合均匀，配制30mmol/L Tris-HCl溶液，用pH计测得pH为7.2；

S2，吸取1ml Tris-HCl溶液复溶巴曲酶冻干粉，获得1g/L巴曲酶储备液；

S3，吸取1ml Tris-HCl溶液复溶抑肽酶冻干粉，获得1g/L抑肽酶储备液；

S4，称取10mg脑凝脂加入10ml Tris-HCl溶液中，研磨至乳状，肉眼观察无明显颗粒，获得1g/L脑凝脂储备液；

S5，称取37.5mgEDC，5.0g PEG8000，0.5g多聚赖氨酸，1.5g BSA，2.5g海藻糖，1.5gNaCl于250ml容量瓶中；

S6，分别吸取1.5mL巴曲酶储备液，1.5mL抑肽酶储备液，2.5mL脑凝脂储备液于S5的容量瓶中；

S7，吸取75μL Proclin300于S6的容量瓶中，并加Tris-HCl溶液至刻度线，混合均匀；

S8，每瓶50μL分装，冻干，获得纤维蛋白激活剂。

实施例2

一种纤维蛋白激活剂的制备方法，包括如下步骤：

S1，称取1.514g三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)放入250ml容量瓶，加入蒸馏水，采用浓HCl调节pH，加水至刻度线，混合均匀，配制50mmol/L Tris-HCl溶液，用pH计测得pH为7.4；

S2，吸取1ml Tris-HCl溶液复溶巴曲酶冻干粉，获得1g/L巴曲酶储备液；

S3，吸取1ml Tris-HCl溶液复溶抑肽酶冻干粉，获得1g/L抑肽酶储备液；

S4，称取10mg脑凝脂加入10ml Tris-HCl溶液中，研磨至乳状，肉眼观察无明显颗粒，获得1g/L脑凝脂储备液；

S5，称取50mgEDC，10.0g PEG8000，1.25g多聚赖氨酸，2.5g BSA，7.5g海藻糖，2.25g NaCl于250ml容量瓶中；

S6，分别吸取2.5mL巴曲酶储备液，2.5mL抑肽酶储备液，6.25mL脑凝脂储备液于S5的容量瓶中；

S7，吸取125μL Proclin300于S6的容量瓶中，并加Tris-HCl溶液至刻度线，混合均匀；

S8，每瓶50μL分装，冻干，获得纤维蛋白激活剂。

实施例3

一种纤维蛋白激活剂的制备方法，包括如下步骤：

S1，称取2.422g三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)放入250ml容量瓶，加入蒸馏水，采用浓HCl调节pH，加水至刻度线，混合均匀，配制80mmol/L Tris-HCl溶液，用pH计测得pH为7.9；

S2，吸取1ml Tris-HCl溶液复溶巴曲酶冻干粉，获得1g/L巴曲酶储备液；

S3，吸取1ml Tris-HCl溶液复溶抑肽酶冻干粉，获得1g/L抑肽酶储备液；

S4，称取10mg脑凝脂加入10ml Tris-HCl溶液中，研磨至乳状，肉眼观察无明显颗粒，获得1g/L脑凝脂储备液；

S5，称取62.5mgEDC，15g PEG8000，2.0g多聚赖氨酸，4.0g BSA，12.5g海藻糖，3.0gNaCl于250ml容量瓶中；

S6，分别吸取4.5mL巴曲酶储备液，4.0mL抑肽酶储备液，7.5mL脑凝脂储备液于S5的容量瓶中；

S7，吸取125μL Proclin300于S6的容量瓶中，并加Tris-HCl溶液至刻度线，混合均匀；

S8，每瓶50μL分装，冻干，获得纤维蛋白激活剂。

以实施例1-3任一方法制备的纤维蛋白激活剂为例，加入枸橼酸钠全血激活剂和血小板激活剂组成检测血小板聚集功能的试剂盒。枸橼酸钠全血激活剂包括kaolin(高岭土)试剂和CaCl₂试剂。血小板激活剂为二磷酸腺苷(ADP)或花生四烯酸(AA)。

实施例4

一、AA激活途径血小板聚集功能检测试剂盒

枸橼酸钠全血激活剂：kaolin试剂和CaCl₂试剂；

血小板激活剂：花生四烯酸36mmol/L

S1，称取花生四烯酸(AA)2.192g，溶于200ml生理盐水；

S2，每瓶100ul分装，冻干。

纤维蛋白激活剂：实施例1制备的纤维蛋白激活剂。

二、用上述检测试剂盒检测阿司匹林对A2膜受体通道的抑制率

检测步骤：

1、分别采集含有服用阿司匹林药物的同一患者的枸橼酸钠抗凝全血和肝素抗凝全血。

2、打开弹力图仪，进入程序、标准、备样操作。

3、装载空白测试杯；

4、吸取20μL0.2mol/L CaCl₂注入测试杯；

5、吸取1ml枸橼酸钠抗凝的全血进入kaolin激活剂试管，温和翻转5次混合均匀，激活3-5分钟；

6、吸取340μL Kaolin处理过的血样注入含有CaCl₂的测试杯中；

7、将恒温槽推上去并将检测杆推到检测位置；

8、单击软件工具栏上的开始按钮开始检测；

9、吸取10μL已经准备好的纤维蛋白激活试剂到另2个空白测试杯中；

10、吸取360μL肝素化的全血注入其中一个含纤维蛋白激活剂测试杯中，反复吸取试杯中的血样3次使之混合；

11、将恒温槽推上去并将检测杆推到检测位置；

12、单击软件工具栏上的开始按钮开始检测；

13、吸取10ul AA试剂加入另一个含有纤维蛋白激活剂的测试杯中；

14、吸取360ul肝素化的全血注入含纤维蛋白激活剂和AA试剂的测试杯中，反复吸取试杯中的血样3次使之混合；

15、将恒温槽推上去并将检测杆推到检测位置；

16、单击软件工具栏上的开始按钮开始检测；

17、完成测试后，可得到血块强度MA_总，MA_纤和MA_AA，图1为血块强度叠加图；

18、根据下面的公式计算AA抑制率。

抑制率＝100％-((MA_AA-MA_纤)/(MA_总-MA_纤)×100)％，本实施例测得的阿司匹林对血小板A2膜受体通道的抑制率为92.4％，有药效。

三、抑制率和药效的对应表

表1

抑制率(AA)％	药效
		≤50％	抑制效果差
>50％	药物有效，抑制效果好

实施例5

一、ADP激活途径血小板聚集功能检测试剂盒

枸橼酸钠全血激活剂：kaolin试剂和CaCl₂试剂；

血小板激活剂：二磷酸腺苷100umol/L

S1，称取ADP 8.54mg，溶于200ml生理盐水；

S2，每瓶100ul分装，冻干。

纤维蛋白激活剂：实施例2制备的纤维蛋白激活剂。

二、用上述检测试剂盒检测氯吡格雷对ADP膜受体通道的抑制率

检测步骤：

1、分别采集含有服用氯吡格雷药物的同一患者的枸橼酸钠抗凝全血和肝素抗凝全血。

2、打开弹力图仪，进入程序、标准、备样操作。

3、装载空白测试杯；

4、吸取20ul 0.2mol/L CaCl2注入测试杯；

5、吸取1ml枸橼酸钠抗凝的全血进入kaolin激活剂试管，温和翻转5次混合均匀，激活3-5分钟；

6、吸取340ul Kaolin处理过的血样注入含有CaCl₂的测试杯中；

7、将恒温槽推上去并将检测杆推到检测位置；

8、单击软件工具栏上的开始按钮开始检测；

9、吸取10ul已经准备好的纤维蛋白激活试剂到另2个空白测试杯中；

10、吸取360ul肝素化的全血注入其中一个含纤维蛋白激活剂测试杯中，反复吸取试杯中的血样3次使之混合；

11、将恒温槽推上去并将检测杆推到检测位置；

12、单击软件工具栏上的开始按钮开始检测；

13、吸取10ul ADP试剂加入另一个含有纤维蛋白激活剂的测试杯中；

14、吸取360ul肝素化的全血注入含纤维蛋白激活剂和ADP试剂的测试杯中，反复吸取试杯中的血样3次使之混合；

15、将恒温槽推上去并将检测杆推到检测位置；

16、单击软件工具栏上的开始按钮开始检测；

17、完成测试后，可得到血块强度MA_总，MA_纤和MA_ADP，图2为血块强度叠加图；

18、根据下面的公式计算ADP抑制率。

抑制率＝100％-((MA_ADP-MA_纤)/(MA_总-MA_纤)×100)％，本实施例测得的氯吡格雷对ADP膜受体通道的抑制率87.6％，有药效。

三、抑制率和药效的对应表

表2

抑制率(AA)％	药效
		≤50％	抑制效果差
>50％	药物有效，抑制效果好

实施例6

与已上市美国Haemoscope公司生产的血小板聚集功能检测试剂盒比较，评价本发明涉及的试剂盒的重复性、稳定性。

1、重复性：为了证明本发明涉及的纤维蛋白激活剂的重复性，用已上市的美国Haemoscope公司生产的P1组分作为对照试剂，其主要含蛇毒凝血酶和XIIIA因子。

取正常人的肝素抗凝全血，用实施例2中的纤维蛋白激活剂重复检测血块强度(MA_纤)三次，同时用对照试剂P1组分检测血块强度(MA_纤)三次，统计各自的变异系数(CV)。本发明的纤维蛋白激活剂与P1的作用类似，不同的是本发明的纤维蛋白激活剂中不含XIIIA因子。

美国Haemoscope公司P1组分试剂测得的血块强度(MA_纤)分别为10.5mm,11.2mm和12.8mm，CV为10.25％。本发明的纤维蛋白激活剂测得的血块强度(MA_纤)分别为10.1mm,10.8mm和11.4mm，CV为6.04％。从结果可以看出，本发明的纤维蛋白激活剂CV值很低，重复性好。

2、稳定性

为了证明本发明涉及的纤维蛋白激活剂的稳定性，将本发明制得的纤维蛋白激活剂做37℃加速试验，用已上市的美国Haemoscope公司生产的血小板聚集试剂盒作为对照试剂盒，其组分含有P1、P2和P3，其中P1组分主要含蛇毒凝血酶和XIIIA因子。

将实施例2中制得的纤维蛋白激活剂分别放置在2-8℃和37℃条件下储存7天，分别测试20份服用氯吡格雷药物的患者的枸橼酸钠抗凝全血和肝素抗凝全血，测试步骤如上所述。测试得到血块强度MA_总值，MA_纤和MA_ADP，根据上述公式计算ADP抑制率，并与Haemoscope对照试剂盒进行比较，测试结果如表3所示。

表3

从表3中可以看出，37℃加速试验测得的结果与2-8℃测试结果及Haemoscope公司的测试结果在±20％的浮动范围内，符合性较好。

将实施例2中制得的纤维蛋白激活剂分别放置在2-8℃和37℃条件下储存7天，分别测试20份服用阿司匹林药物的患者的枸橼酸钠抗凝全血和肝素抗凝全血，测试步骤如上所述。测试得到血块强度MA_总值，MA_纤和MA_AA，根据上述公式计算AA抑制率，并与Haemoscope对照试剂盒进行比较，测试结果如表4所示。

表4

从表4中可以看出，37℃加速试验测得的结果与2-8℃测试结果及Haemoscope公司测试结果在±20％的浮动范围内，符合性较好。

实施例7

为证实本发明所述纤维蛋白激活剂的优越性，用已上市美国Haemoscope公司生产的血小板聚集功能检测试剂盒作为对照试剂盒，其组分含有P1、P2和P3，其中P1组分主要含蛇毒凝血酶和因子XIIIa。

A、第一组对比测试：

对照组：测试360μL正常人肝素抗凝全血加入美国Haemoscope公司生产的P1(按其试剂说明书操作)，测得血块强度如图3，MA_纤＝4.8mm；

本发明组：测试360μL正常人肝素抗凝全血加入本发明的纤维蛋白激活剂，测得血块强度如图4，MA_纤＝5.1mm。

B、第二组对比测试：

对照组：测试360μL正常人肝素抗凝全血中加入美国Haemoscope公司生产的P1组分和P2组分(ADP)(按其试剂说明书操作)，测得与第一组对比测试的叠加图如图5，MA_ADP＝41.5mm；

本发明组：测试360μL正常人肝素抗凝全血中加入本发明的纤维蛋白激活剂和ADP，测得与第一组对比测试的叠加图如图6，MA_ADP＝43.7mm。

C、第三组对比测试：

对照组：测试360μL正常人肝素抗凝全血中加入美国Haemoscope公司生产的P1组分和P3组分(AA)(按其试剂说明书操作)，测得与第一组对比测试的叠加图如图7，MA_AA＝39.8mm；

本发明组：测试360μL正常人肝素抗凝全血中加入本发明的纤维蛋白激活剂和AA，测得与第一组对比测试的叠加图如图8，MA_AA＝40.2mm。

从三组对比测试数据和图中可以看出，加入纤维蛋白激活剂、ADP或AA，本发明组和对照组测试数据和曲线形状均相符合。因此，本发明的试剂盒可以替代Haemoscope公司生产的试剂盒，来检测血小板的聚集功能。

上述的具体实施方式只是示例性的，是为了更好地使本领域技术人员能够理解本专利，不能理解为是对本专利包括范围的限制；只要是根据本专利所揭示精神的所作的任何等同变更或修饰，均落入本专利包括的范围。

Claims (10)

1.一种纤维蛋白激活剂，其特征在于，包括如下组分：30～100mmol/L pH＝7-8的Tris-HCl缓冲液、6～18mg/L的巴曲酶、150～250mg/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、20～60g/L的PEG8000、2～8g/L的多聚赖氨酸、6～16g/L的BSA、10～50g/L的海藻糖、0.03％～0.05％的Proclin300、6～16mg/L的抑肽酶、10～30mg/L的脑磷脂、6-12g/L NaCl。

2.如权利要求1所述的纤维蛋白激活剂，其特征在于，包括如下组分：30mmol/L pH＝7.2的Tris-HCl缓冲液、7mg/L的巴曲酶、150mg/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、25g/L的PEG8000、3g/L的多聚赖氨酸、6g/L的BSA、10g/L的海藻糖、0.03％的Proclin300、8mg/L的抑肽酶、12mg/L的脑磷脂、6g/L NaCl。

3.如权利要求1所述的纤维蛋白激活剂，其特征在于，包括如下组分：50mmol/L pH＝7.4的Tris-HCl缓冲液、10mg/L的巴曲酶、200mg/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、40g/L的PEG8000、5g/L的多聚赖氨酸、10g/L的BSA、30g/L的海藻糖、0.05％的Proclin300、10mg/L的抑肽酶、20mg/L的脑磷脂、9g/L NaCl。

4.如权利要求1所述的纤维蛋白激活剂，其特征在于，包括如下组分：80mmol/L pH＝7.9的Tris-HCl缓冲液、16mg/L的巴曲酶、250mg/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、60g/L的PEG8000、8g/L的多聚赖氨酸、15g/L的BSA、45g/L的海藻糖、0.05％的Proclin300、15mg/L的抑肽酶、30mg/L的脑磷脂、12g/L NaCl。

5.一种权利要求1-4任一项所述纤维蛋白激活剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，称取Tris盐溶于水中，加入浓HCl调节pH值至7-8；

S2，向S1中依次加入巴曲酶、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、PEG8000、多聚赖氨酸、BSA、海藻糖、Proclin300、抑肽酶、脑磷脂和NaCl，得到纤维蛋白激活剂，所述纤维蛋白激活剂中Tris-HCl缓冲液为30～100mmol/L，pH＝7-8，巴曲酶为6～18mg/L，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺为150～250mg/L、PEG8000为20～60g/L、多聚赖氨酸为2～8g/L、BSA为6～16g/L、海藻糖为10～50g/L、Proclin300为0.03％～0.05％、抑肽酶为6～16mg/L、脑磷脂为10～30mg/L、NaCl为6-12g/L。

6.一种血小板聚集功能检测试剂盒，包括枸橼酸钠全血激活剂和血小板激活剂，其特征在于，还包括权利要求1-5任一项所述的纤维蛋白激活剂。

7.如权利要求6所述的血小板聚集功能检测试剂盒，其特征在于，所述枸橼酸钠全血激活剂包括高岭土试剂和CaCl₂试剂。

8.如权利要求7所述的血小板聚集功能检测试剂盒，其特征在于，所述高岭土试剂的浓度为0.033g/L，CaCl₂试剂的浓度为0.2mol/L。

9.如权利要求6所述的血小板聚集功能检测试剂盒，其特征在于，所述血小板激活剂为二磷酸腺苷或花生四烯酸。

10.一种采用权利要求6-9任一项所述的试剂盒检测血小板聚集功能的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，分别采集含有抗血小板药物的枸橼酸钠抗凝全血和肝素抗凝全血；

S2，将枸橼酸钠抗凝全血注入含有枸橼酸钠全血激活剂的测定杯中，测得血块强度MA总；

S3，将肝素抗凝全血注入到含有纤维蛋白激活剂的测定杯中，测得血块强度MA_纤；

S4，将肝素抗凝全血注入到含有纤维蛋白激活剂和血小板激活剂的测定杯中，测得血块强度MA_x；

S5，根据下面的公式计算抗血小板药物的抑制率：抑制率＝100％-((MA_x-MA_纤)/(MA_总-MA_纤)×100)％。