JP7011725B2 - 血小板活性化を伴わないヘパリンベースの血液サンプラー - Google Patents
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Description
a)血液ガス及び基礎代謝パネルパラメータの決定のための少なくとも1つの抗凝固剤、及び
b)少なくとも1つの抗血小板剤
と組み合わされる、in vitro方法によって解決される。
a)患者から血液サンプラーに血液を採取する工程
を含む、血液分析サンプルを調製する方法であって、
血液サンプラーが、BG及びBMPパラメータ分析の決定のための少なくとも1つの抗凝固剤と、少なくとも1つの抗血小板剤と、を含む、方法によっても解決される。
a)上記により得られた血液サンプル中のBG、BMPパラメータ及び/又は血小板数を決定する工程、
を含む、血液サンプル中の血液ガス及びBMPパラメータの決定並びに血小板計数のためのin vitro方法によって解決される。
a)BG及びBMPパラメータ分析のための少なくとも1つの抗凝固剤と、
b)少なくとも1つの抗血小板剤と、
を含む血液サンプラーによって解決される。
a)患者から血液サンプラーに血液を採取する工程
を含む、血液分析サンプルを調製する方法であって、
血液サンプラーが、血液ガス及びBMPパラメータ分析の決定のための少なくとも1つの抗凝固剤と、少なくとも1つの抗血小板剤と、を含む、方法に関する。血液分析サンプルは、好ましくは、例えば、約450mLの血液となり得る供血用に得た血液サンプルと比較して、比較的低い(すなわち小さい)量の血液を含む。好ましい実施形態では、患者から採取された血液サンプルは、約20μL~約10mL、好ましくは約35μL~約10mL、より好ましくは50μL~約5mL、更により好ましくは約0.5~約2mLを含有する。
a)上記方法により得られた血液サンプル中のBG、BMPパラメータ及び/又は血小板数を決定する工程、
を含む、血液サンプル中の血液ガス及びBMPパラメータ並びに血小板数を決定するためのin vitro方法にも関する。本発明の方法の1つの利点は、上記の全てのパラメータが1つのサンプルから測定できることである。好ましい実施形態では、本方法は、WBC数を決定する工程を更に含む。
a)上記のBG及びBMPパラメータ分析のための少なくとも1つの抗凝固剤と、
b)上記の少なくとも1つの抗血小板剤と、
を含む血液サンプラーに関する。
各実験は、1つの抗血小板薬候補を試験する1名の供血者からの血液を用いて、別々の日に実施した。各実験では、PICO70シリンジサンプラー(Radiometer Medical ApS)を、サンプル採取直前に準備した。「LiHep」(液体ヘパリン)条件については、PICO70サンプラーは金ボール及びヘパリンブリックのない空の状態とし、ヘパリンリチウム(Celsus Laboratories)及びヘパリンナトリウム(Celsus Laboratories)を含むバランスヘパリン水溶液(Celsus Laboratories)(最終ヘパリン濃度60IU/mL血液)15μlと試験薬剤の溶媒15μlとを添加した。「PicoSAM」条件については、未改変のPICO70サンプラー(金ボール及びヘパリンブリックを有する)を使用し、それぞれの試験薬剤の溶媒15μlを添加した。「LiHep xxx薬剤」条件については、PICO70サンプラーを、LiHepの場合に記載したように空にし、液体バランスヘパリン(最終ヘパリン濃度60IU/mL血液)15μlと、溶解した試験薬剤15μlとを添加した。「PicoSAM xxx薬剤」条件については、未改変のPICO70サンプラー(金ボール及びヘパリンブリックを有する)を使用し、溶解した試験薬剤15μlを添加した。試験された抗血小板薬候補及び対応する溶媒は、エプチフィバチドアセテート(Sigma、SML1042;生理食塩水に溶解、最終濃度5及び20μM)、MgSO4(Sigma、M7506;生理食塩水に溶解、最終濃度3及び12mM)、チロフィバン塩酸塩一水和物(Sigma、SML0246;1:200 DMSO生理食塩水溶液に溶解、最終濃度0.5及び1μM)、イロプロスト(Sigma、SML1651;1:1000又は1:10000でエタノール生理食塩水溶液に溶解、最終濃度10及び100nM(後で1μM))、チクロピジン塩酸塩(生理食塩水に溶液、最終濃度60及び600μM)、L-アルギニン(Sigma、A5006;生理食塩水に溶解、最終濃度600μM及び6mM)及びジピリダモール(Sigma,D9766;1:10又は1:100でDMSO生理食塩水溶液に溶解、最終濃度10及び100μM)であった。EDTA管(K2EDTAがスプレーコーティングされたBDバキュテイナー、10ml)及びPICO70シリンジサンプラーの全ての条件の2連サンプルを、封止VTC(ベント機能付きチップキャップ)を使用して、翼状針を介して静脈血を採取し、他の方法では自動吸引のPICO70サンプラーに1.5mLの静脈全血を充填することによって充填した。採取後直ちにサンプラーを8回反転させて、サンプルの適切な抗凝固を確実とした。血液サンプルは、サンプル採取後15分間、手で穏やかに混合(金ボールなしのサンプラー)するか、又はSAMミキサー(Radiometer Medical ApS)で混合した。混合したサンプルを、直ちに10%ホルマリン溶液(血液のホルマリン中に1:1希釈)で少なくとも10分間固定し、更に血小板希釈液に1:10で希釈して、赤血球(RBC)を溶血し、血球計を使用して手動血小板数を評価した。単一血小板(凝集していない)の手動血小板数、血小板凝集体の数及び可能であれば血小板凝集体のサイズ(凝集体中の血小板の数)を、10x及び20x位相差空気対物レンズを有するLeica750顕微鏡を使用して、血球計内の血小板を計数することによって、各サンプル2連で定量化した。単一血小板数を、液体ヘパリン及び又は溶解した薬剤溶液での希釈について調節して、単一血小板濃度を計算した。
実施例1に記載したように、採取し、混合し、及び10%ホルマリン溶液で固定した静脈血サンプルを使用して、スライドガラス上に湿式マウントを調製し、カバーガラスで覆った。次いで、固定された血液細胞の湿式マウントサンプルを、40x位相差空気対物レンズを使用してLeica 750顕微鏡で撮像した。ヘパリン添加血中の凝集血小板に対して、EDTA抗凝固処理血中及びヘパリン添加血(例えば、エプチフィバチド)中の非凝集単一血小板が、大量のRBCの間に見られる。
静脈血サンプルを、実施例1に記載のように採取及び混合し、染色された湿式マウント画像を作成するために使用した。血液サンプルを染色及び溶血剤(それぞれメチレンブルー及びデオキシコール酸)と混合し、水浴中で47℃にて30秒間インキュベートした。次いで、染色及び溶血した血液サンプルを、スライドガラス上の湿式マウントサンプルに調製し、カバーガラスで覆った。次いで、40xの空気対物レンズを明視野モードで使用して、染色されたサンプルの画像をLeica 750顕微鏡で取得した。画像処理ソフトウェア(FIJI、ImageJ)を使用して、画像から代表的な染色WBCの関心領域(ROI)を選択した。
手動血小板数
実施例1に記載のようにサンプルを調製した。
上記のように採取し、15分後に混合した血液サンプルを、自動血液分析器(Horiba、ABX Pentra 60C+)(ABX)を用いて、WBC濃度を含む5分画の全血球計算(CBC)、血小板濃度、平均血小板容積(MPV)、好中球、リンパ球、単球、好酸球及び好塩基球の濃度及び割合、RBC濃度、ヘマトクリット値、ヘモグロビン濃度、RBC記述パラメータ(MCV、MCH、MCHC、RDW)について評価した。数名の供血者からサンプルを調製した。測定した血小板濃度を使用して、イロプロストヘパリンサンプル(PICO70サンプラー内)及びEDTA抗凝固処理サンプルと比較した。フローシステムの剪断力により弱く凝集された血小板は、ある程度脱凝集され得るが、ABX分析器は、血小板が凝集している場合には血小板濃度を過小評価する可能性がある。対照として、血小板凝集体のないEDTAサンプルを、自動ABX血小板濃度の測定の基準測定値として使用する。
各実験について、1名の供血者からの血液を用いて別々の日に実施した。各実験では、3つのPICO70シリンジサンプラー(Radiometer Medical ApS)(改変なし、金ボール及びヘパリンブリックを収容)を準備した。1つのPICO70を未改変で使用し(Ctrl)、1つのPICO70に15μlの溶解抗血小板薬を充填して、示された血液サンプル中最終濃度に達した。第3のPICO70サンプラーに15μlの溶媒(試験した抗血小板薬を溶解するために使用される特定の溶媒:基準サンプル)を充填した。静脈血サンプルを、翼状針及び封止されたベント機能付きチップキャップ(VTC)を介してPICO70シリンジサンプラーに採取し、自動吸引式PICO70サンプラーに1.5mlの全血を充填した。採取後直ちにサンプラーを8回反転させて、サンプルの適切なヘパリン化を確実とした。この血液サンプルをSAMミキサー(Radiometer Medical ApS)で混合し、血液採取後15分間の均質かつ再現可能な混合を確保するために金コーティングした鋼製ボールを血液サンプル中で動かし、ABL90血液ガス分析器(Radiometer Medical ApS)で分析した。血液サンプルの均質混合を測定中維持するためにサンプルを穏やかに手動反転し、サンプルを交互に(Ctr、基準サンプル、薬剤サンプル)各々5回測定(5連の測定)した。全ての計算値を表3に記載する。その後、血液サンプルを遠心分離して血漿画分を分離した。全サンプルの血漿を、ABL90装置で交互に3連で測定し、血漿中の遊離ヘモグロビン濃度を評価した。評価は、全血液サンプルにおける赤血球(RBC)の不確定な溶血の可溶性を示す。溶血されたサンプルは、例えば、K+濃度の測定値に対する干渉を示す。
本明細書は、以下の発明の態様を包含する。
[1] 血液ガス及び基礎代謝パネル(BMP)パラメータ分析並びに血小板計数に好適な血液サンプルを調製するためのin vitro方法であって、血液が、
a)血液ガス及び基礎代謝パネルパラメータの決定のための少なくとも1つの抗凝固剤、及び
b)少なくとも1つの抗血小板剤
と組み合わされる、in vitro方法。
[2] a)患者から血液を血液サンプラーに採取する工程
を含む、血液分析サンプルを調製する方法であって、前記血液サンプラーが、血液ガス及びBMPパラメータ分析の決定のための少なくとも1つの抗凝固剤と、少なくとも1つの抗血小板剤と、を含む、方法。
[3] a)[1]又は[2]に記載の方法によって得られた血液サンプル中の血液ガス、BMPパラメータ及び/又は血小板数を決定する工程を含む、血液サンプル中の血液ガス及びBMPパラメータ並びに血小板数を決定するためのin vitro方法。
[4] 前記少なくとも1つの抗凝固剤がヘパリンである、[1]~[3]のいずれかに記載の方法。
[5] 前記少なくとも1つの抗血小板剤が、糖タンパク質IIb/IIIa阻害剤、ADP受容体/P2Y12阻害剤、プロスタグランジン類似体、COX阻害剤、トロンボキサン阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、クロリクロメン、ジタゾール、ボラパキサル、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される、[1]~[4]のいずれかに記載の方法。
[6] 前記少なくとも1つの抗血小板剤が、糖タンパク質IIb/IIIa阻害剤及びプロスタグランジン類似体からなる群から選択される、[1]~[5]のいずれかに記載の方法。
[7] 前記少なくとも1つの抗血小板剤が、
i)アブシキマブ、エプチフィバチド、オルボフィバン、ロトラフィバン、ロキシフィバン、シブラフィバン、及びチロフィバン若しくはこれらの塩からなる群から選択される糖タンパク質IIb/IIIa阻害剤;又は
ii)ベラプロスト、イロプロスト、プロスタサイクリン、エポプロステノール、トレプロスチニル若しくはこれらの塩からなる群から選択されるプロスタグランジン類似体
である、[1]~[6]のいずれかに記載の方法。
[8] 前記少なくとも1つの抗血小板剤が、エプチフィバチド、チロフィバン、イロプロスト、これらの塩、又はこれらの組み合わせを含む、[1]~[7]のいずれかに記載の方法。
[9] 前記少なくとも1つの抗血小板剤が、イロプロストを含む、[1]~[8]のいずれかに記載の方法。
[10] 前記方法が、前記血液サンプルを混合する更なる工程を含む、[1]~[9]のいずれかに記載の方法。
[11] 血液ガス及びBMPパラメータの決定のための少なくとも1つの抗凝固剤と、血液ガス及びBMP分析並びに血小板計数用血液サンプルの調製のための少なくとも1つの抗血小板剤と、の使用。
[12] 血液ガス及びBMPパラメータ分析の決定のための少なくとも1つの抗凝固剤と、血液ガス、BMPパラメータ及び/又は血小板数の分析のための少なくとも1つの抗血小板剤と、を含む、血液サンプラーの使用。
[13] a)血液ガス及びBMPパラメータ分析のための少なくとも1つの抗凝固剤と、
b)少なくとも1つの抗血小板剤と、
を含む血液サンプラー。
[14] 血液ガス及びBMPパラメータ分析のための前記少なくとも1つの抗凝固剤がヘパリンであり、及び/又は前記少なくとも1つの抗血小板剤が、糖タンパク質IIb/IIIa阻害剤、ADP受容体/P2Y12阻害剤、プロスタグランジン類似体、COX阻害剤、トロンボキサン阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、クロリクロメン、ジタゾール、ボラパキサル、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される、[13]に記載の血液サンプラー。
[15] 前記少なくとも1つの抗血小板剤が、糖タンパク質IIb/IIIa阻害剤及びプロスタグランジン類似体からなる群から選択される、[13]又は[14]に記載の血液サンプラー。
[16] 前記少なくとも1つの抗血小板剤が、エプチフィバチド、チロフィバン、イロプロスト、これらの塩、又はこれらの組み合わせを含む、[13]~[15]のいずれかに記載の血液サンプラー。
[17] 前記少なくとも1つの抗血小板剤が、イロプロストを含む、[13]~[16]のいずれかに記載の血液サンプラー。
[18] 前記血液サンプラーが撹拌要素を含む、[13]~[17]のいずれかに記載の血液サンプラー。
[19] 前記撹拌要素が、球形要素又は丸みを帯びた端部を有する円筒形要素である、[18]に記載の血液サンプラー。
[20] 前記血液サンプラーが、血液ガス及びBMPパラメータの決定のための前記少なくとも1つの抗凝固剤及び/又は少なくとも1つの抗血小板剤を含む少なくとも1つの更なる要素を含む、[13]~[19]のいずれかに記載の血液サンプラー。
Claims (8)
- 単一の血液サンプル中の血液ガスパラメータ、基礎代謝パネル(BMP)パラメータ及び/又は血小板数を決定するためのin vitro方法であって、
a)ヘパリン及びプロスタグランジン類似体から選択される少なくとも1つの抗血小板剤を含む血液サンプラーを提供する工程、ここで血液サンプラーはMgSO4、EDTA又はクエン酸塩を含まない;
b)血液を血液サンプラーに提供して単一の血液サンプルを調製する工程;
c)単一の血液サンプルを混合する工程;及び
d)単一の血液サンプル中の血液ガスパラメータ、BMPパラメータ、及び/又は血小板数を決定する工程、
を含む、in vitro方法。 - 前記少なくとも1つの抗血小板剤が、ベラプロスト、イロプロスト、プロスタサイクリン、エポプロステノール、トレプロスチニル又はこれらの塩からなる群から選択されるプロスタグランジン類似体である、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの抗血小板剤が、イロプロストを含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 20μL~10mLの血液を含む単一の血液サンプルの調製により単一の血液サンプル中の血液ガスパラメータ、基礎代謝パネル(BMP)パラメータ及び/又は血小板数の決定において使用するための血液サンプラーであり、
a)ヘパリンと、
b)プロスタグランジン類似体から選択される少なくとも1つの抗血小板剤と、
を含み、MgSO4、EDTA又はクエン酸塩を含まない、シリンジ、毛細管、又は試験管である、血液サンプラー。 - 前記少なくとも1つの抗血小板剤が、ベラプロスト、イロプロスト、プロスタサイクリン、エポプロステノール、トレプロスチニル又はこれらの塩からなる群から選択されるプロスタグランジン類似体である、請求項4に記載の血液サンプラー。
- 前記少なくとも1つの抗血小板剤が、イロプロストを含む、請求項4又は5に記載の血液サンプラー。
- 前記血液サンプラーが撹拌要素を含む、請求項4~6のいずれか一項に記載の血液サンプラー。
- 前記撹拌要素が、球形要素又は丸みを帯びた端部を有する円筒形要素である、請求項7に記載の血液サンプラー。
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